ES2289754T3 - Sistema de alta eficacia para la liberacion de compuestos especificos de tejido que utiliza una proteina de fusion estreptavidina-proteina a. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA SUMINISTRAR TOXINAS O ACIDOS NUCLEICOS A TIPOS DE CELULAS ESPECIFICOS Y A LOS COMPLEJOS PARA LA PUESTA EN PRACTICA DEL METODO. SEGUN LA INVENCION, UN ANTICUERPO QUE RECONOCE UN ANTIGENO EN LA SUPERFICIE DE UNA CELULA ESTA UNIDO DE FORMA NO COVALENTE AL CENTRO DE UNION DEL ANTICUERPO DE UNA PROTEINA DE FUSION ST-PA; UN ACIDO NUCLEICO O UNA TOXINA BIOTINILADOS SE UNEN AL CENTRO DE UNION DE LA BIOTINA. EN UNA REALIZACION ALTERNATIVA, LA TOXINA O ACIDO NUCLEICO PUEDEN ESTAR UNIDOS A UNA TERCERA MOLECULA BIOTINILADA, UN ADAPTADOR, QUE SE UNE AL CENTRO DE UNION DE LA BIOTINA.
Description
Sistema de alta eficacia para la liberación de
compuestos específicos de tejido que utiliza una proteína de fusión
estreptavidina-proteína A.
La presente invención se refiere a métodos y
composiciones que se pueden utilizar para introducir toxinas y
ácidos nucleicos en el citoplasma o núcleo de una célula eucariota,
particularmente una célula de un vertebrado superior. La presente
invención permite la liberación eficiente y específica de las
toxinas y ácidos nucleicos en células que se unen a un anticuerpo.
La presente invención se refiere en particular a la utilización de
una proteína de fusión de secuencias de estreptavidina y proteína A
para formar un complejo no covalente de una toxina o un ácido
nucleico y un anticuerpo.
La presente invención da a conocer un
procedimiento de tratamiento de una enfermedad humana mediante la
introducción de toxinas o nucleótidos antisentido en células
humanas, por ejemplo, células tumorales, in vivo o ex
vivo. La presente invención también da a conocer métodos para
realizar investigación biológica y métodos útiles en la producción
de productos biológicos mediante la introducción de moléculas de ADN
de cadena doble exógenas en células cultivadas.
La introducción selectiva de compuestos en el
citoplasma o el núcleo de células específicas ha sido una técnica
valiosa en la investigación biológica y médica y en la práctica
médica. El marcaje específico de citotoxinas en las células se ha
realizado mediante la formación de complejos de toxinas con
proteínas de unión celulares que se pueden unir preferentemente a
células marcadas. Las proteínas del complejo de unión celular pueden
ser anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o
ligandos de proteínas, por ejemplo, factores de crecimiento, que
reconocen los correspondientes antígenos o receptores de superficie.
Los complejos de toxina y anticuerpo se han denominado
inmunotoxinas.
De forma conveniente, la toxina y la proteína de
unión celular del complejo se han unido de forma covalente mediante
unión química o fusión génica. Las inmunotoxinas convencionales se
han realizado mediante la unión química de un componente toxina a
un anticuerpo, habitualmente un anticuerpo monoclonal, con un
reactivo de reticulación heterobifuncional que es no específico.
Por consiguiente, este método produce un producto heterogéneo en el
que algunas moléculas de toxinas bloquean la capacidad del
anticuerpo para unirse al antígeno mediante la unión a la parte
F(ab) del anticuerpo. Adicionalmente, la química de
acoplamiento puede destruir parcialmente la actividad de las
toxinas.
Muchos de los problemas asociados con la
conjugación química se han superado mediante la generación de
toxinas de fusión de cadena única utilizando tecnología de ADN
recombinante. Sin embargo, esta tecnología requiere una nueva
toxina recombinante para cada célula diana. La actividad biológica
de cada nueva toxina recombinante es impredecible.
Se han desarrollado técnicas alternativas en las
que la citotoxina está unida de forma no covalente al anticuerpo o
al ligando. Una de dichas técnicas explota la interacción específica
entre la proteína A de Staphylococcal aureus e
inmunoglobulinas para generar complejos de anticuerpos con dos
especificidades. Según esta técnica, la proteína A forma complejos
con anticuerpos de dos especificidades diferentes: un anticuerpo
específico de toxina y un anticuerpo específico de la superficie
celular. Dichos complejos se han utilizado para liberar toxina de
ricina en células diana (Laky y otros, 1986/1987, Immunology Letters
14:127-132). En un segundo sistema de marcaje de
inmunotoxinas, los anticuerpos de cadena única se fusionan con
estreptavidina que tiene una afinidad de unión fuerte y específica
para la biotina. Utilizando esta construcción, la toxina biotinilada
se liberó en una célula diana (Dubel, y otros, 1995, Journal of
Immunological Methods, 178:201-209).
Recientemente, Sano y otros describieron una
proteína de fusión que consistía en estreptavidina y uno o dos
dominios de unión a inmunoglobulina G (IgG) de la proteína A en
Escherichia coli. (Patente de Estados Unidos 5.328.985,
concedida el 12 de julio de 1994, que se incorpora en su totalidad
en la presente invención como referencia). La proteína de fusión
estreptavidina-proteína A (ST-PA)
tiene biotina funcional y sitios de unión a IgG. Sano además
describió complejos de la proteína de fusión
estreptavidina-proteína A, un anticuerpo monoclonal
para BSA, y peroxidasa de rábano picante biotinilada.
Sano también describió un método de marcaje de
células utilizando la proteína de fusión ST-PA. Las
células se incubaron con un anticuerpo para un antígeno de la
superficie celular, Thy-1. El complejo proteína
quimérica-marcador biotinilado se añadió
posteriormente a la suspensión celular. Esta técnica se utilizó para
liberar FITC biotinilado a la superficie de las células que tenían
antígeno Thy-1 en su superficie. Sin embargo, Sano
no describió ni sugirió la utilización de la proteína de fusión
ST-PA para liberar compuestos en el citoplasma o
núcleos de células específicas.
Las inmunotoxinas parecen entrar en la célula
mediante la endocitosis mediada por un receptor (Pastan y otros,
1986, Cell 47: 1-44 y Pirker y otros, 1987,
Lymphokines 14: 361-382). A la unión de la parte de
anticuerpo del complejo de inmunotoxina al receptor superficial le
sigue, en primer lugar, el agrupamiento del complejo en huecos
recubiertos y, a continuación, la internalización del complejo en
endosomas o receptosomas en el interior de la célula (Middlebrook y
otros, 1994, Microbiol. Rev., 48: 199-221; Morris y
otros, 1985, Infect. Immun. 50: 721-727; Fitzgerald
y otros, 1980, Cell 21: 867-873). Durante el
desplazamiento en la célula, el complejo puede transportarse a
través de diferentes compartimentos intracelulares que varían en pH
y la actividad de enzimas proteolíticas antes de que las toxinas se
desplacen a través de una membrana intracelular y en el citoplasma
de la célula donde pueden provocar la muerte celular.
Una segunda área que se ha desarrollado se
refiere a métodos para la introducción de ácidos nucleicos en
células. Los métodos más ampliamente utilizados utilizan fosfato
cálcico o DEAE-dextrano para provocar la captación
de ácidos nucleicos. Estos métodos parecen implicar las etapas de
unión del ADN a la superficie celular, entrar en el citoplasma
mediante endocitosis, y la posterior transferencia en el núcleo.
Maniatis, Laboratory Cloning Manual, volumen 2, 16.30. Dependiendo
del tipo de célula, hasta un 20% de una población de células
cultivadas pueden captar ADN utilizando fosfato cálcico o
DEAE-dextrano.
La electroporación es un método de transfección
alternativo en el que se aplica un campo eléctrico para abrir poros
en la membrana plasmática de la célula. El ADN parece entrar en la
célula a través de estos poros.
Los liposomas también se han utilizado para
introducir ácidos nucleicos en las células. Según esta técnica, las
vesículas de bicapa lipídica artificiales que contienen lípidos
catiónicos y neutros median la transferencia de ADN o ARN en las
células. El mecanismo de transfección mediada por liposomas no está
bien comprendido, pero parece que los grupos fosfatos cargados
negativamente en el ADN se unen a la superficie cargada
positivamente del liposoma, y que la carga positiva residual se une
a los residuos de ácido siálico cargados negativamente en la
superficie celular.
Sano no utilizó el complejo para introducir
ácidos nucleicos en la célula. Sano y otros describieron complejos
de ADN-anticuerpo con la proteína de fusión
ST-PA mediante la incorporación de una única
molécula de biotina en un extremo de un plásmido pUC 19
linealizado, a diferencia de los métodos de transfección de ácidos
nucleicos en la célula que se han descrito anteriormente.
La presente invención se refiere a la liberación
de toxinas o ácidos nucleicos en tipos específicos de células y a
los complejos para realizar el método. Según la presente invención,
un anticuerpo que reconoce un antígeno de la superficie celular no
está unido de forma covalente al sitio de unión a anticuerpo de una
proteína de fusión ST-PA; una toxina o un ácido
nucleico biotinilados están unidos al sitio de unión a biotina. En
una realización alternativa, la toxina o el ácido nucleico pueden
estar unidos a una tercera molécula biotinilada, un adaptador, que
está unido al sitio de unión a biotina.
En una realización de la presente invención, se
libera un ácido nucleico en un tipo de célula específica. El ácido
nucleico puede ser un ácido nucleico de cadena única biotinilado
unido al sitio de unión a biotina de la proteína de fusión
ST-PA. En una realización alternativa, el ácido
nucleico puede ser un ácido nucleico de doble cadena que forma una
cadena triple complementaria con un ácido nucleico de cadena única
biotinilado, que a su vez está unido al sitio de unión a
biotina.
El método de la presente invención se refiere a
las etapas de formar un complejo entre una proteína de fusión de
estreptavidina-proteína A; un anticuerpo, que es
específico para una proteína de la superficie celular, que
experimenta endocitosis después de la unión con el anticuerpo; y
cierto material marcado, por ejemplo, un producto génico de
resistencia a múltiples fármacos (mdr) biotinilado, profármaco,
toxina o ácido nucleico; aislar el complejo de la toxina que no
está unida al sitio de unión a biotina; y exponer la célula diana al
complejo, de manera que el material marcado entra en la célula.
Tal como se utiliza en la presente
invención,
toxina se refiere a holotoxinas, toxinas
modificadas, subunidades catalíticas de toxinas, o cualquier enzima
que no está presente normalmente en una célula que, bajo condiciones
definidas, provoca la muerte de la célula. Una toxina biotinilada
se refiere a una toxina que está directamente biotinilada o bien,
que está unida a un adaptador biotinilado.
El término "anticuerpo" se refiere a
cualquier molécula que contiene uno o más dominios funcionales de
unión a antígeno y un dominio Fc que se une específicamente a la
proteína A.
Figura 1A. Representación esquemática de la
unión de inmunotoxina o toxina recombinante al correspondiente
antígeno o receptor superficial en la superficie celular.
Figura 1B. Representación esquemática de la
unión de complejo de estreptavidina-proteína
A/macromolécula biotinilada al correspondiente antígeno o receptor
superficial en la superficie celular.
Figura 2. Comparación de la liberación de
biotina-\beta galactosidasa en células A431 de un
complejo ST-PA/mAB
anti-EGFR/biotina-\beta
galactosidasa y un complejo
ST-TGF/biotina-\beta
galactosidasa.
Figura 3. Análisis en el transcurso del tiempo
de la tinción en células con \beta galactosidasa después de la
transferencia de \beta galactosidasa en las células.
Figura 4A. Líneas celulares y moléculas de la
superficie celular marcadas mediante el complejo
ST-PA-biotina-\beta
galactosidasa-anticuerpo.
Figura 4B. Transferencia de
ST-PA/mAB/biotina-\beta
galactosidasa en células humanas, en la que mAB es específico para
las moléculas de la superficie celular HLA-DR, CD33
o CD34.
Figura 5. Representación esquemática de la
construcción del vector de expresión de pAT-\beta
galactosidasa para formar el ADN de cadena triple con
poli(dT) oligonucleótido biotinilado.
Figura 6A. Homología de aminoácidos entre
fibronectina (SEC ID No: 1) y estreptavidina (SEC ID No: 2). En
negrita se indican los residuos homólogos. Los dominios RGD y RYD de
cada proteína se encuentran subrayados. La secuencia mostrada para
fibronectina empieza en el residuo 1481 y la secuencia de
estreptavidina empieza en el residuo 49.
Figura 6B. Cebadores de oligonucleótido DES (SEC
ID No: 3) y DER (SEC ID No: 4) diseñados para modificar la
secuencia RYD del gen de estreptavidina.
Figura 6C. Representación esquemática de la
metodología a utilizar en la modificación de la secuencia RYD de
estreptavidina.
La presente invención da a conocer un método de
liberación específica de material marcado, por ejemplo, toxinas,
profármacos, productos génicos de mdr, o ácidos nucleicos en células
mediante un complejo del material marcado, un anticuerpo específico
para un antígeno de la superficie celular en la célula, donde dicho
antígeno se endocitosa cuando las células se exponen a una
concentración eficaz del anticuerpo, y una proteína de fusión
ST-PA.
La proteína de fusión
estreptavidina-proteína A (ST-PA) se
une de forma no covalente al anticuerpo específico de la célula en
el sitio de unión a anticuerpo y al material marcado biotinilado en
el sitio de unión a biotina. La manera y el método mediante el cual
se biotinila el material marcado no son críticos; la presente
invención incluye la utilización de cualquiera y todos los métodos
y reactivos.
En una realización, la presente invención da a
conocer un método para la destrucción específica de células, por
ejemplo, la destrucción de células tumorales en un huésped o ex
vivo en cultivos a corto y largo plazo. Se puede seleccionar
una toxina del grupo que consiste en: timidina quinasa,
endonucleasa, ARNasa, toxina alfa, ricina, abrina, exotoxina A de
Pseudomonas, toxina de la difteria, saporina, momordina,
gelonina, proteína antivírica de la fitolaca,
alfa-sarcina y toxina del cólera. La toxina se
biotinila y se forma el complejo de PA-ST/Ab/toxina
biotinilada. A continuación, se puede administrar una cantidad
eficaz del complejo al huésped o al sistema de cultivo ex
vivo.
En una realización alternativa, la presente
invención da a conocer un método de utilización de un anticuerpo
para una célula para introducir en la célula un profármaco
citotóxico, es decir, un compuesto no tóxico que es convertido por
una enzima, normalmente presente en la célula, en un compuesto
citotóxico. La realización contempla la utilización de un complejo
de la proteína quimérica ST-PA con un anticuerpo
monoclonal selectivo del tumor y un profármaco. Entre los
compuestos adecuados como profármacos se incluyen, a modo de
ejemplo, un glutamil derivado de un agente alquilante mostaza de
ácido benzoico ("mustard alkylating agent"), derivados fosfato
de etopósido o mitomicina C y derivado
fenoxi-acetamida de doxorubicina.
Una realización adicional de la presente
invención contempla un complejo para la liberación de ácido nucleico
de cadena única en las células. Tal como se utiliza en la presente
invención, el término "ácido nucleico de cadena única" se
refiere a ácidos nucleicos tanto naturales como no naturales. El
ácido nucleico a liberar se puede biotinilar utilizando cualquiera
de los métodos actualmente disponibles, tales como la incorporación
aleatoria, reacciones de extensión utilizando ADN polimerasa, y PCR
con cebadores biotinilados. Dichos ácidos nucleicos se pueden
utilizar para destruir específicamente ARNms a los que son
complementarios.
Una realización adicional de la presente
invención se refiere a la introducción en una célula de ADN de
cadena doble que puede integrarse en el genoma de la célula o
replicarse episomalmente y que se puede transcribir. La
incorporación directa de biotina en un ADN de cadena doble puede
interferir con la replicación y la transcripción del ADN. Para
superar estos problemas, el ADN de cadena doble a liberar en la
célula se modifica para incluir una secuencia que puede formar una
región de ácido nucleico de cadena triple con un ácido nucleico de
cadena única.
Se han descrito formaciones de ADN de cadena
triple y habitualmente consisten en las triadas de nucleótidos
T-A-T y
C-G-C. La tercera cadena de la
cadena triple ocupa el hueco principal de una hélice de ADN de forma
A y forma pares de bases de Hoogsteen con el ADN de cadena doble
homopolimérico. Alternativamente, una cadena triple se puede formar
con ADN de cadena doble. Tal como se utiliza en la presente
invención, el término "cadena triple" se refiere a una
estructura formada por el emparejamiento de bases de Hoogsteen entre
un ADN de cadena doble y un ácido nucleico de cadena única.
En esta realización, el complejo contiene ADN de
cadena doble Hoogsteen emparejado con un ácido nucleico de cadena
única, el cual está biotinilado y forma un complejo con el complejo
ST-PA/mAb. El ADN de cadena doble puede ser una ADN
de cadena doble lineal, el cual es adecuado para la recombinación en
el genoma de una célula o, alternativamente, la cadena doble puede
ser un ADN circular o circular superenrollado, el cual se puede
replicar episomalmente.
Esta realización de la presente invención se
puede utilizar bajo cualquier circunstancia en la que se desee
introducir ADN clonado en una célula, por ejemplo, para expresar un
producto o para alterar el fenotipo de la célula, para investigar
la función de cualquier gen clonado.
Una realización adicional de la presente
invención comprende un complejo de un anticuerpo para una proteína
de la superficie celular hallado en una célula que presenta
antígenos, la proteína de fusión ST-PA y una
proteína biotinilada de una bacteria o virus patológicos, donde
dicho complejo se puede utilizar para localizar el antígeno para
células que presentan antígenos y, de este modo, aumentar la
respuesta inmune de células T positivas CD4 en relación con la de
otros linfocitos.
Los complejos de la presente invención se pueden
formar mezclando simplemente ST-PA, un anticuerpo
monoclonal, y el material biotinilado en las proporciones
adecuadas. Los componentes se pueden mezclar en cualquier orden.
La proteína de fusión ST-PA
forma tetrámeros que se unen hasta con cuatro moléculas biotiniladas
y cuatro moléculas IgG, que son cada una bivalente. Sin limitarse a
ninguna teoría, se cree que la unión octovalente de los complejos
de la presente invención a la superficie celular provoca que los
complejos tengan una unión y unas propiedades de internalización
superiores en comparación con otras inmunotoxinas y complejos
inmunofarmacéuticos.
La estreptavidina bloqueada por biotina es capaz
de interaccionar específicamente con superficies celulares a través
de una secuencia Arg-Tyr-Asp
presente en la proteína (el "sitio RYD"). Este sitio es
diferente del hueco de unión a biotina de la proteína y tiene una
elevada homología con el dominio de unión de la célula que contiene
RGD de fibronectina que media las interacciones
fibronectina-superficie celular (Alon y otros,
1993, Europ. J. Cell Biol. 60: 1-11). Los estudios
han sugerido que la estreptavidina actúa como un mimético próximo
de la fibronectina (Alon y otros, 1993, Europ. J. Cell Biol. 60:
1-11).
Los dominios RYD y RGD conservados de la
fibronectina y la estreptavidina funcionan como secuencias de
reconocimiento universales para las interacciones con muchos
receptores unidos a membrana. En una realización de la presente
invención, el componente estreptavidina del complejo se puede
modificar para alterar el sitio RYD. Tal como se utiliza en la
presente invención, el término "secuencia RYD modificada"
incluye cualquier alteración al sitio RYD o la región flanqueante
que elimina la interacción de la estreptavidina con las proteínas de
la superficie celular del tipo del sitio de unión sin biotina. Una
de dichas modificaciones es la sustitución de ácido aspártico por
ácido glutá-
mico.
mico.
El plásmido, pTSAPA-2, descrito
en la Patente de Estados Unidos 5.328.985, concedida en 12 de julio
de 1994, transporta el gen quimérico de estreptavidina y proteína A
(región E y D). La expresión y purificación de la fusión génica de
ST-PA se llevó a cabo según los métodos que se
indican a continuación.
Se transformó un lisógeno de la cepa bacteriana
BL21 (DE3) (pLysS) con el vector de expresión de la fusión
estreptavidina-proteína A pTSAPA-2.
La cepa transformada se desarrolló a 37ºC en medio LB complementado
con ampicilina 50 \mug/ml, cloramfenicol 34 \mug/ml y glucosa
al 0,2%. Cuando la absorbancia a 600 nm del cultivo estaba entre
0,8 y 1,0 de DO, se añadieron 100 mM de isopropil
\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) disuelto en agua hasta una concentración final de 0,4 mM
para inducir el gen T7 de ARN polimerasa situado bajo el promotor
lac UV5. Después de la inducción, las células se incubaron a
37ºC con agitación durante 2 horas.
La purificación de la proteína quimérica de
fusión estreptavidina-proteína A se llevó a cabo a
4ºC o sobre hielo a menos que se indique lo contrario. El cultivo
(100 ml) de BL21 (DE3) (pLysS) (pTSAPA-2) incubado
durante 2 horas después de la inducción se centrifugó a 2.900 x g
durante 15 minutos. El residuo celular se suspendió en 10 ml de
EDTA 2 mM, Tris-Cl 30 mM (pH 8,0), Triton
X-100 al 0,1%, PMSF 0,5 mM para lisar las células y
el lisado se guardó a -70ºC hasta que se utilizó. Al lisado celular
descongelado, se añadieron PMSF, leupeptina y pepstatina A hasta
las concentraciones finales de 0,5 mM, 1 \muM y 1 \muM,
respectivamente. A continuación, el lisado se trató con 10
\mug/ml de desoxirribonucleasa I y 10 \mug/ml de ribonucleasa A
en presencia de MgSO_{4} 12 mM a temperatura ambiente durante 20
minutos. La mezcla se centrifugó a 39.000 x g durante 15 minutos y
el residuo se disolvió en 100 ml de clorhidrato de guanidina 7 M
durante toda la noche a 4ºC con agitación. Después de que el
residuo se disolviera, la proteína se dializó a continuación contra
NaCl 150 mM, Tris-Cl 50 mM (pH 7,5), Tween 20 al
0,05%, PMSF 0,1 mM, leupeptina 1 \muM, pepstatina A 1 \muM,
NaN_{3} al 0,02%. Para conseguir la extracción lenta del
clorhidrato de guanidina, la bolsa de diálisis que contenía la
solución de proteínas se dejó durante toda la noche en la solución
de diálisis (\sim1000 ml) sin agitación, seguido de 3 cambios de
la solución de diálisis y diálisis con agitación a 4ºC. El dialisado
se centrifugó a 39.000 x g durante 15 minutos y el sobrenadante se
aplicó a una columna de flujo rápido IgG Sefarosa 6 (1,2 x 1,1 cm)
lavada previamente con 5-10 volúmenes del lecho de
tampón TST. A continuación, la columna se equilibró con
2-3 volúmenes del lecho de cada uno de los
siguientes: 1) Ácido acético 0,5 M, pH 3,4 (pH ajustado con
NH_{4}CH_{3}COOH (NH_{4}Ac); 2) NaCl 150 mM,
Tris-Cl 50 mM (pH 7,5), Tween 20 al 0,05% (tampón
TST); 3) Ácido acético 0,5 M, pH 3,4; y 4) TST. La muestra se aplicó
a la columna y la proteína no unida se extrajo mediante el lavado
de la columna con: 1) 10 volúmenes del lecho de TST, y 2) 2
volúmenes del lecho de NH_{4}Ac 5 mM, pH 5,0. La elución se
realizó con Ácido acético 0,5 M, pH 3,4. El eluato se recogió en
fracciones de 1-2 ml, y las fracciones que tenían la
DO más elevada a 280 se dializaron contra NaCl 1 mM, carbonato
sódico 50 mM (pH 11,0). El dialisado se aclaró mediante
centrifugación a 39.000 x g durante 15 minutos, y se aplicó a una
columna de 2-iminobiotina agarosa (1,2 x 1,2 cm)
previamente equilibrada con NaCl 1M, carbonato sódico 50 mM (pH
11,0). Después de extraer las proteínas no unidas con la misma
solución, las proteínas unidas se eluyeron con urea 6 M, acetato
amónico 50 mM (pH 4,0). Las proteínas eluidas se dializaron contra
una solución salina tamponada con Tris [TBS; NaCl 150 mM,
Tris-Cl 20 mM (pH 7,5)] que contenía NaN_{3} al
0,02% y el dialisado se guardó a 4ºC después de la filtración a
través de un filtro de 0,22 \mum (Millex-GV,
Millipore).
Se incubó a temperatura ambiente durante como
mínimo 10 minutos una mezcla de \sim2 \mug de anticuerpo,
\sim28 \mug de proteína de fusión y \sim2 unidades de
\beta-galactosidasa biotinilada. Después de esta
incubación, el complejo estaba listo para utilizar.
Tinción con
\beta-galactosidasa: (tinción
X-GAL)
La tinción con
\beta-galactosidasa de células que se adhieren a
la placa se realizó según Sanes y otros, 1986, EMBO J. 5:
3133-3142.
El protocolo de Molecular Probes, Inc. se
utilizó para detectar la expresión del gen
lacZ-\beta-Galactosidasa
en células que crecieron en suspensión.
Los protocolos anteriores se utilizaron para
determinar si el complejo que contiene el anticuerpo acoplado a la
proteína de fusión y la enzima \beta-Galactosidasa
biotinilada se transdujo de manera satisfactoria en el célula de
elección. Si la transducción era completa, las células eran azules
después de incubación durante toda la noche.
La estreptavidina bloqueada por biotina se une
específicamente (Kd = 3 x 10^{8} M) a las superficies celulares,
presumiblemente mediante una secuencia que contiene RYD que es
diferente del hueco de unión a biotina de la proteína.
Se espera que la alternancia del dominio
(secuencia) RYD con otros residuos de aminoácidos elimine la unión
de superficie específica de tipo sin biotina de una gran variedad de
células.
Una manera de modificar la secuencia RYD sería
cambiar la secuencia RYD por RYE. El cambio de la secuencia RYD por
RYE se puede conseguir mediante la introducción de una mutación
puntual utilizando las etapas secuenciales de la PCR. Esto se puede
conseguir mediante el diseño de dos cebadores, DES (SEC ID No: 1) y
DER (SEC ID No: 2) (Ver figura 5) y la utilización del vector de
expresión pTSAPA-2 como plantilla del gen de
estreptavidina. En primer lugar, la PCR se lleva a cabo utilizando
dos parejas de cebadores: promotor T7/DER y finalizador T7/DES. En
segundo lugar, los dos fragmentos de ADN amplificados se purifican a
continuación y se agrupan en una muestra. A continuación, se
realiza un segundo ciclo de PCR utilizando los productos purificados
agrupados del primer ciclo como plantillas y los cebadores promotor
T7 y finalizador T7. La secuencia RYE mutada en el componente del
gen de estreptavidina se confirma mediante el análisis de secuencia
del producto del segundo ciclo de PCR.
A efectos de estudiar la capacidad de
ST-PA para liberar compuestos en una célula, la
liberación de este complejo se comparó con la de un complejo en el
que la estreptavidina central estaba unida de forma covalente al
receptor TGF\alpha.
pTSA-TGF\alpha, un vector de
expresión para
estreptavidina-TGF-\alpha
(ST-TGF) se construyó mediante la sustitución del
gen de la proteína A en pTSAPA-2 por un gen de
TGF-\alpha humano maduro (aminoácidos
1-50).
Para demostrar la capacidad de las proteínas de
fusión ST-PA y ST-TGF\alpha para
liberar proteína biotinilada en tipos de células específicas, la
\beta-galactosidasa biotinilada formó complejos
con el componente estreptavidina de la proteína de fusión. La
liberación de \beta-galactosidasa en células A431
se cuantificó utilizando técnicas de tinción conocidas y análisis
FACS.
ST-PA/biotina
\beta-galactosidasa formó complejos con mAb
anti-EGFR y el complejo resultante se incubó a
continuación con células epidermoides humanas A431 que sobreexpresan
el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).
Alternativamente, ST-TGF se mezcló con biotina
\beta-galactosidasa y el complejo resultante se
administró a células A431.
Tal como se muestra en la figura 2, la proteína
de fusión ST-PA liberó de manera eficaz biotina
\beta-galactosidasa en células A431 a través de
EGFR en su superficie (células positivas > 99%). La proteína de
fusión ST-TGF\alpha también mostró una liberación
eficaz de biotina \beta-galactosidasa en células
A431 (células positivas > 99%). Sorprendentemente, la cantidad
de biotina \beta-galactosidasa liberada en cada
célula por la proteína de fusión ST-TGF\alpha era
inferior a la observada en el sistema de liberación
ST-PA (la actividad de fluorescencia promedio
observada fue 214 y 2402, respectivamente).
La liberación de eficacia muy elevada por la
proteína de fusión ST-PA de biotina
\beta-galactosidasa en células A431 puede ser
debido a los cuatro sitios de unión para biotina e IgG contenidos en
cada tetrámero de ST-PA (Figura 1B). En un
experimento con el tiempo mostrado en la Figura 3, más del 99% de
las células mostraron una tinción positiva para
\beta-galactosidasa hasta 2 días después de la
transferencia de biotina \beta-galactosidasa en
la célula.
El procedimiento experimental aplicado en el
estudio de la liberación de biotina
\beta-galactosidasa en células A431 también se
utilizó para estudiar la liberación del complejo
anticuerpo/ST-PA/\beta-galactosidasa
biotinilada en otros tipos de células. El estudio utilizó
anticuerpos que reconocen varias moléculas diferentes de la
superficie celular. Las líneas celulares y las moléculas de la
superficie celular utilizadas en este experimento se resumen en la
Figura 4A. Tal como se muestra en la figura 4B, el complejo
ST-PA/mAb era altamente eficaz (células positivas
>99%) en la transferencia de
\beta-galactosidasa en los tipos de células
humanas ensayadas mediante las moléculas HLA-DR,
CD33 y CD34 presentes en la superficie de estas células.
Aunque la biotina se puede incorporar en el ADN
(por ejemplo, plásmidos de expresión), la incorporación aleatoria
de biotina en el ADN puede dar lugar a una pérdida de actividad
transcripcional. A efectos de mantener la actividad transcripcional
del ADN a introducir en la célula, se desarrolló un nuevo sistema de
transferencia de genes que utiliza un vector de expresión de pAT
que tiene una extensión poli(dA)/poli(dT) en dirección
descendente del cassette de expresión (figura 5). Según este
sistema de transferencia, el ADN a liberar en la célula se clona en
el vector de expresión. El vector de expresión de pAT forma ADN de
cadena triple con un poli(dT) oligonucleótido biotinilado
que se une al sitio de unión a biotina de la proteína de fusión
ST-PA. El anticuerpo unido al sitio de unión a
anticuerpo de la proteína de fusión ST-PA marca las
células en las que el ADN va a liberarse.
El protocolo para la formación de ADN de cadena
triple y la transferencia de ADN del gen de
\beta-galactosidasa a las células se indica a
continuación. El gen de la \beta-galactosidasa se
clona en el cassette de expresión del vector de expresión de pAT
(figura 5). La mezcla de 4 \mug del vector de expresión
pAT-\beta-galactosidasa y 20 pmol
de poli(dT) oligonucleótido biotinilado (Promega) en tampón
TMN (10 mM de Tris, pH 8,0, 10 mM de MgCl_{2}, 50 mM de NaCl) se
incuba a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la proteína de fusión
ST-PA (0,5 \mug) y mAB (1,0 \mug) se añaden a
la mezcla y la mezcla resultante se incuba a temperatura ambiente
durante 30 minutos. El complejo ADN de triple
cadena-ST-PA-mAb se
añade a las células (1 x 10^{6}) y se incuba a 37ºC durante 48
horas. La actividad de la \beta-galactosidasa se
detecta mediante FACS.
Sano, T. y Cantor, C.R.
1991. A streptavidin-protein A chimera that
allows one-step production of a variety of specific
antibody conjugates. Bio/Technol. 9:
1378-1381.
Pastan, I. y FitzGerald, D.
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Science. 254: 1173-1177.
Goshorn, S.C., Svensson, H.P.,
Kerr, D.E., Somerville, J.E., Senter, P.D. y
Fell, H.P. 1993. Genetic construction, expression,
and characterization of a single chain anticarcinoma antibody fused
to b-lactamase. Cancer Res. 53:
2123-2127.
Siegall, C.B., Xu, Y.-H.,
Chaudhary, V.K., Adhya, S., FitzGerald, D. y
Pastan, I. 1989. Cytotoxic activities of a fusion
protein comprised of TGF\alpha and pseudomonas exotoxin. FASEB
J. 3: 2647-2652.
Ghetie, M.-A., Laky, M.,
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Ito, T., Smith, C.L. y
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Alon R., E. Bayer, M.
Wilchek, 1993, Cell Adhesion to streptavidin via
RGD-dependent integrins, European Journal of
Cell Biology 60: 1-11.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Meruelo, Daniel
\hskip4cmOhno, Kouichi
\hskip4cmLevin, Brandi
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Sistema de alta eficacia para la liberación de compuestos específicos de tejido que utiliza una proteína de fusión estreptavidina-proteína A.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Pennie y Edmonds
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Avenue of the Americas, 1155
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 10036-2711
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/REPRESENTANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Poissant, Brian M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 28,462
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE INFORME/EXPEDIENTE: 8105-007
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (212) 790-9090
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (212) 869-8864
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 66441 PENNIE
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
Gly Asp Ser Pro Ala}
\sac{Ser Ser Lys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg
Tyr Asp Ser Ala Pro}
\sac{Ala Thr Asp Gly Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTTACGAAA GCGCCCCG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGCAATGC TTTCG
\hfill15
Claims (23)
1. Complejo para transferir un material marcado
a una célula, que comprende:
(a) una proteína de fusión de
estreptavidina-proteína A que tiene un sitio de
unión a anticuerpo y un sitio de unión a biotina;
(b) un anticuerpo, unido al sitio de unión a
anticuerpo, en el que el anticuerpo es específico para una proteína
de la superficie celular, y en el que la proteína de la superficie
celular experimenta endocitosis después de la unión con el
anticuerpo; y
(c) un material marcado biotinilado, unido al
sitio de unión a biotina, cuyo complejo es capaz de transferir
dicho material marcado a una célula cuando entra en contacto con la
célula después de formar dicho complejo.
2. Complejo, según la reivindicación 1, en el
que el material marcado se selecciona entre el grupo que consiste
en una toxina, un profármaco, un producto génico de MDR, un ácido
nucleico de cadena única, un ácido nucleico de cadena doble, o un a
proteína de una bacteria o un virus patológicos.
3. Complejo, según la reivindicación 2, en el
que el material marcado es una toxina.
4. Complejo, según la reivindicación 3, en el
que la toxina se selecciona del grupo que consiste en:
- (a)
- timidina quinasa;
- (b)
- endonucleasa;
- (c)
- ARNasa;
- (d)
- toxina alfa;
- (e)
- ricina;
- (f)
- abrina;
- (g)
- exotoxina A de Pseudomonas;
- (h)
- toxina de la difteria;
- (i)
- saporina;
- (j)
- momordina;
- (k)
- gelonina;
- (l)
- proteína antivírica de la fitolaca;
- (m)
- alfa-sarcina; y
- (n)
- toxina del cólera.
5. Complejo, según la reivindicación 2, en el
que el material marcado es un profármaco.
6. Complejo, según la reivindicación 2, en el
que el material marcado es un producto génico de MDR.
7. Complejo, según la reivindicación 2, en el
que el material marcado es un ácido nucleico de cadena única.
8. Complejo, según la reivindicación 2, que
comprende además un ácido nucleico de cadena única biotinilado, que
tiene una parte de homopurina u homopirimidina, unido al sitio de
unión a biotina; y en el que el material marcado es un ácido
nucleico de cadena doble que comprende un ADN de cadena doble que
forma una estructura de cadena triple con el ácido nucleico de
cadena única biotinilado.
9. Complejo, según la reivindicación 2, en el
que el material marcado es una proteína de una bacteria o un virus
patológicos.
10. Complejo, según las reivindicaciones 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9, en el que existen cuatro sitios de unión a
anticuerpo y cuatro sitios de unión a biotina.
11. Complejo, según las reivindicaciones 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9, en el que el componente estreptavidina de
dicha proteína de fusión estreptavidina-proteína A
tiene una secuencia RYD modificada.
12. Complejo, según las reivindicaciones 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9, que comprende además un anticuerpo que se une
al receptor de transferina.
13. Complejo, según las reivindicaciones 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7 u 8, en el que el anticuerpo reconoce un antígeno de
superficie seleccionado del grupo de
- (a)
- HLA DR;
- (b)
- CD33;
- (c)
- CD34; y
- (d)
- receptor EGF.
14. Complejo, según las reivindicaciones 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
IgG.
15. Composición farmacéutica, que comprende:
(a) el complejo según las reivindicaciones 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9, y
(b) un portador farmacéuticamente aceptable,
donde dicha composición está sustancialmente libre de toxina no
unida a la proteína de fusión
estreptavidina-proteína A.
16. Método para transferir toxinas en una
célula, que comprende las etapas de:
(a) formar un complejo que comprende
- (i)
- una proteína de fusión de estreptavidina-proteína A que tiene un sitio de unión a anticuerpo y un sitio de unión a biotina;
- (ii)
- un anticuerpo, unido al sitio de unión a anticuerpo, en el que el anticuerpo es específico para una proteína de la superficie celular, y en el que la proteína de la superficie celular experimenta endocitosis después de la unión con el anticuerpo; y
- (iii)
- una toxina biotinilada, unida al sitio de unión a biotina;
(b) aislar el complejo de la toxina que no está
unida al sitio de unión a biotina, y
(c) exponer el complejo aislado a una célula, de
manera que la toxina entra en la célula.
17. Método para transferir material marcado en
una célula, que comprende las etapas de:
(a) formar un complejo que comprende
- (i)
- una proteína de fusión de estreptavidina-proteína A que tiene un sitio de unión a anticuerpo y un sitio de unión a biotina;
- (ii)
- un anticuerpo, unido al sitio de unión a anticuerpo, en el que el anticuerpo es específico para una proteína de la superficie celular, y en el que la proteína de la superficie celular experimenta endocitosis después de la unión con el anticuerpo; y
- (iii)
- material marcado biotinilado, unido al sitio de unión a biotina;
(b) exponer el complejo aislado a una célula, de
manera que el material marcado entra en la célula;
en el que el material marcado se
selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico de cadena
única, un producto génico de MDR y un
profármaco.
18. Método, según la reivindicación 17, en el
que el material marcado es un ácido nucleico de cadena doble, en el
que un ácido nucleico de cadena única biotinilado está unido al
sitio de unión a biotina, y que comprende además un ADN de cadena
doble que forma una estructura de cadena triple con el ácido
nucleico de cadena única biotinilado.
19. Método, según la reivindicación 16, 17 ó 18,
en el que el complejo tiene cuatro sitios de unión a anticuerpo y
cuatro sitios de unión a biotina.
20. Método, según la reivindicación 16, 17 ó 18,
en el que el componente estreptavidina de dicha proteína de fusión
estreptavidina-proteína A tiene una secuencia RYD
modificada.
21. Método, según la reivindicación 16, 17 ó 18,
en el que el complejo comprende además un anticuerpo que se une al
receptor de transferina.
22. Método, según la reivindicación 16, 17 ó 18,
en el que el anticuerpo reconoce un antígeno de superficie
seleccionado del grupo de
- (a)
- HLA DR;
- (b)
- CD33;
- (c)
- CD34; y
- (d)
- receptor EGF.
23. Método, según la reivindicación 16, 17 ó 18,
en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| US08/566,421 US6497881B1 (en) | 1995-11-30 | 1995-11-30 | High efficiency tissue specific compound delivery system using streptavidin-protein a fusion protein |
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