JP2000502885A - ストレプトアビジン―プロテインａ融合タンパク質を用いた高効率の組織特異的化合物送達系 - Google Patents

ストレプトアビジン―プロテインａ融合タンパク質を用いた高効率の組織特異的化合物送達系

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、毒素または核酸を特定の細胞型内へ送達する方法、及び該方法を実施するための複合体に関する。本発明によれば、細胞表面抗原を認識する抗体がST-PA融合タンパク質の抗体結合部位に非共有結合で結合され、ビオチン化毒素またはビオチン化核酸がビオチン結合部位に結合されている。別の態様では、毒素または核酸は、ビオチン結合部位に結合する第三のビオチン化分子（アダプター）に結合させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質を用いた 高効率の組織特異的化合物送達系 １．緒言 本発明は、真核細胞、特に高等脊椎動物の細胞の細胞質または核に毒素およ び核酸を導入するのに用いうる方法および組成物に関する。本発明は、抗体と結 合している毒素および核酸の細胞への有効かつ特異的な送達を可能にする。本発 明は、特に、毒素または核酸と抗体との非共有結合性複合体を形成するための、 ストレプトアビジン配列とプロテインＡ配列との融合タンパク質の使用に関する 。 本発明は、in vivo またはex vivo にて毒素またはアンチセンスヌクレオチ ドをヒト細胞（例えば、腫瘍細胞）へ導入することによる、ヒト疾患の治療方法 を提供する。本発明は、さらに、外因性の二重らせんＤＮＡ分子を培養細胞に導 入することによる、生物学的研究を行う方法および生物学的産物の製造に有用な 方法も提供する。 ２．発明の背景 特定の細胞の細胞質または核への化合物の選択的導入は、生物学的および医 学的研究ならびに医学的実践における有効な技術である。細胞性毒素の細胞特異 的ターゲッティングは、毒素を細胞結合性タンパク質（好ましくは標的細胞に結 合することが可能なもの）と複合化することによって達成されている。この複合 体の細胞結合性タンパク質は、対応する表面抗原または受容体を認識する抗体（ 特にモノクローナル抗体）またはタンパク質リガンド（例えば、増殖因子）であ りうる。毒素と抗体との複合体はイムノトキシンと呼ばれている。 従来では、複合体の毒素と細胞結合性タンパク質とは、化学的結合または遺 伝子融合を介する共有結合により連結されていた。慣用のイムノトキシンは、非 特異性の異種二官能性(heterobifunctional)架橋試薬を用いて毒素成分を抗体（ 典型的には、モノクローナル抗体）に化学的に連結することによって得られる。 したがって、この方法によれば、幾つかの毒素分子が抗体のF(ab)部分に連結す ることによって該抗体の抗原結合能を障害している異成分性の産物が得られる。 し たがって、この結合化学は毒素の活性を部分的に破壊することが可能である。 化学的共役に伴う問題の多くは、組み換えＤＮＡ技術を用いて一本鎖の融合 毒素を作製することによって克服してきた。しかしながら、この技術には、それ ぞれの標的細胞に対する新規な組み換え毒素が必要である。新規な組み換え毒素 の各々の生物学的活性は予測不可能である。 別の技術が開発されており、そこでは、細胞毒素が抗体またはリガンドに非 共有結合によって結合している。そのような技術の１つは、Staphylococcalaure usプロテインＡと免疫グロブリンとの間の特異的な相互作用を利用して、２種の 特異性を有する抗体複合体を生ずる。この技術によれば、プロテインＡは２種の 異なる特異性を有する抗体、すなわち、毒素特異的抗体および細胞表面特異的抗 体と複合化する。このような複合体は、リシン毒素を標的細胞へ送達するのに用 いられている(Laky ら、1986／1987,Immunology Letters 14:127-132)。第２の イムノトキシン・ターゲッティング系では、一本鎖の抗体を、ビオチンに対して 強く特異的な結合親和性を有するストレプトアビジンと融合させる。この構築体 を用いて、ビオチン化した毒素を標的細胞へ送達する(Dubel ら、1995,Journal of Immunological Methods,178:201-209)。 近年、Sano らは、ストレプトアビジンとEscherichia coli中のプロテインＡ の１つまたは２つの免疫グロブリンＧ（IgG）結合性ドメインとから構成される 融合タンパク質を記載した(米国特許第5,328,985 号、1994年７月12日発行；こ の特許は引用によりその全体を本明細書に組み込む)。このストレプトアビジン プロテインＡ（ST-PA）融合タンパク質は、機能性のビオチンおよびIgG結合部位 を有する。Sanoは、さらに、ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質 と、BSA に対するモノクローナル抗体と、ビオチン化セイヨウワサビ・ペルオキ シダーゼとの複合体を記載した。 Sanoはさらに、ST-PA 融合タンパク質を用いて細胞を標識する方法も記載し た。細胞は、細胞表面抗原Thy-1 に対する抗体と共にインキュベートした。次に 、キメラタンパク質−ビオチン化マーカー複合体を細胞懸濁液に添加した。この 技術は、表面上にThy-1 抗原を有する細胞の表面にビオチン化FITCを送達するの に用いた。しかしながら、Sanoは、化合物を特定の細胞の細胞質また は核へ送達するのにST-PA 融合タンパク質を用いることについては記載も示唆も していなかった。 イムノトキシンは、受容体介在性エンドサイトーシスにより細胞に侵入する と思われる(Pastan ら,1986,Cell,47:1-44およびPirkerら,1987,Lymphokines14: 361-382)。イムノトキシン複合体の抗体部分が表面受容体へ結合した後、まず、 被覆ピットへの該複合体のクラスター化(clustering)、次いで、細胞内のエンド ソームまたレセプトソームへの該複合体のインターナリゼーション(internaliza tion)が起こる(Middlebrookら,1994,Microbiol,Rev.48:199-221;Morrisら,1985, Infect.Immun.50:721-727；Fitzgeraldら,1980,Cell,21:867-873)。細胞に到達 する際、複合体は、毒素が細胞内膜を通って（該複合体が細胞の死滅を引き起こ す可能性のある）細胞質へと移動する前に、pHおよびタンパク質分解酵素活性が 様々に異なる各種の細胞内区画を通って輸送されてもよい。 開発されている第２の分野は、核酸を細胞に導入するための方法に関する。 最も広く用いられている方法は、リン酸カルシウムまたはDEAE−デキストランを 用いて、核酸の取込みを促進するものである。これらの方法は、細胞表面へのＤ ＮＡの付着、エンドサイトーシスによる細胞質への侵入、および続いて行われる 核への輸送の各工程を含むと思われる。Maniatis,Laboratory CloningManual,第 ２巻,16.30。細胞型に応じて、培養細胞数の最大20％までがリン酸カルシウムま たはDEAE-デキストランを用いてＤＮＡを取り込むことができる。 エレクトロポレーションは、もう１つのトランスフェクション法であり、そ の方法では、電場をかけて細胞膜に孔をあける。ＤＮＡは、これらの孔を通って 細胞に侵入すると思われる。 核酸を細胞に導入するのにリポソームも用いられている。この技術によれば 、カチオン性および中性の脂質を含有する人工的な脂質二重層の小胞が、細胞へ のＤＮＡまたはＲＮＡの輸送を媒介する。このリポソーム媒介性トランスフェク ションの機構は十分には理解されていないが、ＤＮＡ上の負電荷を帯びたリン酸 基が、リポソームの陽電荷を帯びた表面に結合し、残りの陽電荷が細胞表面の負 電荷を帯びたシアル酸残基と結合すると思われる。 Sanoは、核酸を細胞に導入するのに上記複合体を用いなかった。Sanoらは単 一のビオチン分子を線状化pUC19プラスミドの１端部に組み込むことによる、ST- PA融合タンパク質を有するＤＮＡ−抗体複合体を記載していた。これは、上記の 核酸を細胞にトランスフェクトする方法とは異なる。 ３．発明の概要 本発明は、毒素または核酸を特定の細胞型内へ送達する方法、及び該方法を実 施するための複合体に関する。本発明によれば、細胞表面抗原を認識する抗体が ST-PA融合タンパク質の抗体結合部位に非共有結合で結合され、ビオチン化毒素 またはビオチン化核酸がビオチン結合部位に結合されている。別の態様では、毒 素または核酸は、ビオチン結合部位に結合する第三のビオチン化分子（アダプタ ー）に結合させることができる。 本発明の一態様では、核酸は特定の細胞型に送達される。核酸は、ST-PA融合 タンパク質のビオチン結合部位に結合するビオチン化一本鎖核酸でありうる。別 の態様では、核酸は、ビオチン化一本鎖核酸と共に相補的な三重らせんを形成す る二重らせん核酸であってもよく、これもビオチン結合部位と結合する。 本発明の方法は、ストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質と、細胞 表面タンパク質に特異的な抗体（該細胞表面タンパク質は、該抗体と結合した後 でエンドサイトーシスを受けるものである）と、ある標的物質（例えば、ビオチ ン化多剤耐性(mdr)遺伝子産物、プロドラッグ、毒素または核酸）との間で複合 体を形成する工程；該複合体を、ビオチン結合部位に結合していない毒素から単 離する工程；並びに標的細胞を該複合体と接触させて該標的物質を細胞内へ取り 込ませる工程に関する。 ３．１． 定義： 本明細書において用いられる毒素は、完全毒素(holotoxins)、改変毒素、毒 素の触媒サブユニット、または通常は細胞中に存在しない、特定の条件下で細胞 の死滅を引き起こす任意の酵素をいう。ビオチン化毒素は、直接的にビオチン化 されている毒素、またはビオチン化アダプターに結合している毒素をいう。 「抗体」という用語は、１種以上の機能性抗原結合性ドメインおよびプロテ インＡに特異的に結合するFcドメインを含有する任意の分子をいう。 ４．図面の簡単な説明 図１Ａ：細胞表面上にある対応する表面抗原または受容体に結合しているイ ムノトキシンまたは組み換え毒素の略図である。 図１Ｂ：細胞表面上にある対応する表面抗原または受容体に結合しているス トレプトアビジン−プロテインＡ／ビオチン化高分子複合体の略図である。 図２：ST-PA／抗EGFR mAB／ビオチン−βガラクトシダーゼ複合体およびST-T GF／ビオチン−βガラクトシダーゼ複合体の、A431細胞へのビオチン−βガラス トシダーゼの送達の比較である。 図３：βガラクトシダーゼが細胞中に輸送された後の、細胞βガラクトシダ ーゼ染色の経時的分析である 図４Ａ：細胞系、およびST-PA−ビオチン−βガラクトシダーゼ−抗体複合体 により標的とされる細胞表面分子である。 図４Ｂ：ST-PA−mAb−ビオチン−βガラクトシダーゼのヒト細胞への輸送で あり、そこにおいて、mAbはHLA-DR、CD33またはCD34細胞表面分子に対して特異 的である。 図５：ビオチン化ポリ(dT)オリゴヌクレオチドを用いて三重らせんＤＮＡを 形成するための、pAT-βガラクトシダーゼ発現ベクター構築体の略図である。 図６Ａ：フィブロネクチン（配列番号１）とストレプロアビジン（配列番号 ２）との間のアミノ酸相同性である。太字体は相同な残基を示す。各タンパク質 のRGDおよびRYDドメインに下線を引いてある。フィブロネクチンについて示す配 列は、残基1481から始まり、ストレプトアビジンの配列は残基49から始まる。 図６Ｂ：ストレプトアビジン遺伝子のRYD配列を改変するように設計した、オ リゴヌクレオチドプライマーDES（配列番号３）およびDER（配列番号４）である 。 図６Ｃ：ストレプトアビジンのRYD配列を改変するのに用いる方法論の略 図である。 ５．好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、標的物質（例えば、毒素、プロドラッグ、mdr遺伝子産物、または 核酸）と、細胞が有効濃度の該抗体にさらされた場合にエンドサイトーシスによ って取り込まれる該細胞上の細胞表面抗原に特異的な抗体と、ST-PA融合タンパ ク質との複合体によって、該標的物質を細胞へ特異的に送達する方法を提供する 。 ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質（ST-PA）は、抗体結合部 位において細胞特異的抗体と非共有結合によって結合し、そしてビオチン結合部 位においてビオチン化標的物質と非共有結合によって結合する。標的物質がビオ チン化される様式および方法は重要ではない。本発明は、そのような方法および 試薬のいずれか、または全部を用いることを包含する。 １つの実施態様において、本発明は、細胞を特異的に破壊するための方法（ 例えば、短期培養または長期培養における宿主中またはex vivoでの腫瘍細胞の 破壊）を提供する。毒素は、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リボヌク レアーゼ、αトキシン、リシン、アブリン、PsuedomonasエキソトキシンＡ、ジ フテリア毒素、サポリン、モモルディン(momordin)、ゲロニン(gelonin)、アメ リカヤマゴボウ(pokeweed)抗ウイスル性タンパク質、α−サルシンおよびコレラ 毒素からなる群から選ばれうる。毒素はビオチン化し、PA-ST／Ab／ビオチン化 毒素の複合体を形成する。次いで、有効量の該複合体を宿主内またはex vivo培 養系に投与することができる。 別の実施熊様において、本発明は、細胞傷害性プロドラッグ、すなわち、酵 素（通常は細胞中に存在する酵素）によって細胞傷害性化合物へと変換される非 毒性化合物を細胞に導入するのに、該細胞に対する抗体を用いる方法を提供する 。この実施態様は、ST-PAキメラタンパク質の、腫瘍選択性モノクローナル抗体 およびプロドラッグとの複合体を用いることを意図する。プロドラッグとして好 適な化合物は、例として、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体 、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、およびドキソルビシンの フ ェノキシアセトアミド誘導体が挙げられる。 本発明のさらにもう１つの実施態様は、一本鎖核酸を細胞に送達するための 複合体を意図する。本明細書において用いられる「一本鎖の核酸」という用語は 、天然に存在する核酸または天然に存在しない核酸をいう。送達すべき核酸は、 ランダムな組み込み、ＤＮＡポリメラーゼを用いる伸長反応、およびビオチン化 プライマーを用いるＰＣＲなどの現在利用可能な方法のいずれかを用いてビオチ ン化することが可能である。そのような核酸は、該核酸が相補的であるｍＲＮＡ を特異的に破壊するのに用いうる。 本発明のさらにもう１つの実施態様は、細胞のゲノムに組み込み可能である か、もしくはエピソームによって複製可能である二重らせんＤＮＡ、および転写 可能な二重らせんＤＮＡの、細胞への導入に関するものである。ビオチンを二重 らせんＤＮＡに直接組み込むことにより、該ＤＮＡの複製および転写の両方が阻 止される可能性がある。これらの問題を克服するために、細胞に送達されるべき 二重らせんＤＮＡは、一本鎖核酸を用いて三重らせん核酸の領域を形成しうる配 列を含有するように改変される。 三重らせんＤＮＡの形成は記載されており、典型的には、Ｔ−Ａ−Ｔおよび Ｃ−Ｇ−Ｃのヌクレオチドの三つ組からなる。三重らせんＤＮＡの第３の鎖は、 Ａ字型ＤＮＡへリックスの大きな窪みを占めており、ホモポリマー性二重らせん ＤＮＡとフーグスティーン型塩基対を形成する。あるいはまた、三重らせんは、 二重らせんＤＮＡを用いて形成してもよい。本明細書で用いられる「三重らせん (triplex)」という用語は、二重らせんＤＮＡと一本鎖核酸との間のフーグステ ィーン型塩基対によって形成される構造をいう。 この実施態様では、複合体は、一本鎖核酸とフーグスティーン型の対を形成 している二重らせんＤＮＡを含有し、これはビオチン化し、ST-PA／mAb複合体と 複合体化する。この二重らせんＤＮＡは、線状の二重らせんＤＮＡであってもよ く、これは、細胞のゲノムへの組み換えには好適である。あるいは、その二重ら せんは、環状またはスーパーコイル型環状ＤＮＡであってもよく、これはエピソ ームによって複製しうる。 本発明のこの実施態様は、クローニングしたＤＮＡを細胞に導入するのに望 ましいあらゆる条件下（例えば、産物を発現するのに望ましい条件下、または細 胞の表現型を変えるのに望ましい条件下）で用いて、クローニングした任意の遺 伝子の機能を調べることが可能である。 本発明のさらにもう１つの実施態様は、抗原提示細胞上に見出される細胞表 面タンパク質に対する抗体と、ST-PA融合タンパク質と、病原性細菌またはウイ ルスのビオチン化タンパク質との複合体を含み、そのような複合体は、抗原提示 細胞に対して抗原を局在化し、その結果、CD4陽性Ｔ細胞の免疫応答を他のリン パ球と比較して増強するのに使用可能である。 本発明の複合体は、単に、ST-PAと、モノクローナル抗体と、ビオチン化物質 とを適当な比率で混合することによって形成することが可能である。これらの成 分は任意の順番で混合することが可能である。 ST-PA融合タンパク質は、最大４つのビオチン化分子および４つのIgG分子を 結合する四量体を形成し、該四量体はそれぞれ２価である。理論上の限定がない 限り、細胞表面へのこの本発明の複合体の８価の結合により、該複合体は、他の イムノトキシンおよび免疫医薬複合体と比較して優れた結合およびインターナリ ゼーション特性を有するようになる。 ビオチンでブロックされたストレプトアビジンは、タンパク質中に存在するA rg-Tyr-Asp配列（「RYD部位」）を介して細胞表面と特異的に相互作用する能力 を有する。この部位は、タンパク質のビオチン結合性クレフトとは異なり、フィ ブロネクチンのRGD含有細胞結合性ドメイン（フィブロネクチン−細胞表面相互 作用を仲介する）と高い相同性を有する(Alonら,1993,Europ,J.Cell Biol.60:1- 11)。研究から、ストレプトアビジンがフィブロネクチンの類似した擬似体とし て作用することが示唆される(Alonら,1993,Europ.J.Cell Biol.60:1-11)。 フィブロネクチンおよびストレプトアビジンの保存されたRYDおよびRGDドメ インは、多くの膜結合受容体との相互作用の普遍的な認識配列として作用する。 本発明の１つの実施態様において、複合体のストレプトアビジン成分は、RYD部 位を変えるように改変することが可能である。本明細書において用いられる「改 変RYD配列」という用語は、ストレプトアビジンと細胞表面タンパク質との非ビ オチン結合部位関連相互作用をなくす、RYD部位またはフランキング領域に ついてのあらゆる改変を包含する。そのような改変の１つは、アスパラギン酸を グルタミン酸で置換することである。 ６．実施例： ６．１ 材料及び方法 米国特許第5,328,985号（1994年７月12日発行）に記載されたプラスミドpTSAP A-2は、ストレプトアビジンとプロテインＡのキメラ遺伝子を担持するものであ る(領域Ｅ及びＤ)。ST-PAの遺伝子融合体の発現と精製を、以下の方法に従って 行なった。融合タンパク質の調製 ： 細菌株溶原菌BL21(DE3)(pLysS)を、pTSAPA-2ストレプトアビジン-プロテイン Ａ融合体発現ベクターによって形質転換した。形質転換株を、37℃にて50μg/ml のアンピシリン、34μg/mlのクロラムフェニコール及び0.2％グルコースを補給 したLB培地中で増殖させた。培養物の600 nm における吸光度が0.8〜1.0 ODにな ったところで、水に溶解した100 mMイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド( IPTG)を0.4 mM の最終濃度となるよう添加し、lac UV5プロモーターの下流に位 置するT7ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を誘発した。誘発後、細胞を37℃で振盪しな がら２時間インキュベートした。 ストレプトアビジン−プロテインＡ融合キメラタンパク質の精製を、特に記載 しない限り４℃または氷上にて行なった。誘発後に２時間インキュベートしたBL 21(DE3)(pLysS)(pTSAPA-2)の培養物(100 ml)を、2,900×gにて15分間遠心分離し た。細胞ペレットを10ml の2mM EDTA、30 mM Tris-Cl(pH8.0)、0.1％ TritonX-1 00、0.5 mM PMSFに懸濁し、細胞を溶菌し、該溶菌液を−70℃で使用時まで保存 した。解凍した細胞溶菌液へ、PMSF、ロイペプチン、及びペプスタチンＡをそれ ぞれ0.5 mM、１μM、及び１μMの最終濃度となるよう添加した。次いで溶菌液を 、12 mM MgSO4の存在下、室温にて20分間10μg/ml のデオキシリボヌクレアーゼ Ｉ及び10μg/ml のリボヌクレアーゼＡで処理した。混合物を39,000×gで15分間 遠心分離し、ペレットを100 ml の７Ｍ塩酸グアニジンに一晩４℃で 攪拌しながら溶解させた。ペレットを溶解させた後、次いでタンパク質を150 mM NaCL、50 mM Tris-Cl(pH7.5)、0.05％ Tween 20、0.1 mM PMSF、１μＭロイペプ チン、１μＭペプスタチンＡ、0.02％ NaN3で透析した。塩酸グアニジンをゆっ くりと除去するため、タンパク質溶液を含む透析バッグを攪拌せずに一晩透析溶 液(dialysis solution)(〜1,000 ml)中に放置し、次いで透析溶液を３回取り替 え、攪拌しながら４℃で透析を行なった。透析物(dialysate)を39,000×gで15分 間遠心分離し、上清を、予め５〜10床容積のTST緩衝液で洗浄しておいたIgＧ Se pharose 6 Fast Flowカラム(1.2×1.1cm)にかけた。該カラムは、次いで1)0.5Ｍ 酢酸、pH3.4［pHはNH4CH3COOH(NH4Ac)にて調整］；2)150 mM NaC1、50mM Tris-C l(pH 7.5)、0.05％ Tween 20(TST緩衝液)；3)0.5Ｍ酢酸、pH 3.4；及び4)TSTの それぞれ２〜３床容積で平衡化した。サンプルをカラムにかけ、1)10床容積のTS T、及び2)２床容積の５mM NH4Ac、pH 5.0でカラムを洗浄することによって未結 合タンパク質を除去した。溶離は0.5Ｍ酢酸、pH 3.4を用いて行なった。溶出液 を１〜２mlのフラクション毎に回収し、280 nmにおけるODが最も高いフラクショ ンを１Ｍ NaCl、50 mM炭酸ナトリウム(pH 11.0)で透析した。透析物を39,000×g で15分間遠心分離することによって清澄にし、予め１Ｍ NaCl、50 mM炭酸ナトリ ウム(pH 11.0)で平衡化した2-イミノビオチンアガロースカラム(1.2×1.2 cm)に かけた。同一の溶液で未結合タンパク質を除去した後、結合タンパク質を６Ｍ尿 素、50 mM酢酸アンモニウム(pH 4.0)で溶離させた。溶離させたタンパク質を、0 .02％ NaN3を含むTris緩衝化食塩水[TBS; 150 mM NaCl、20mM Tris-Cl(pH 7.5)] で透析し、透析物を0.22μmフィルター(Millex-GV、Millipore)で濾過した後、 ４℃で保存した。ST-PA/mAb/ ビオチン化β-ガラクトシダーゼ複合体の形成 ： 約２μｇの抗体、約28μｇの融合タンパク質、及び約２単位のビオチン化β- ガラクトシダーゼの混合物を、室温で少なくとも10分間インキュベートした。イ ンキュベート後、複合体はそのままで使用可能である。β-ガラクトシダーゼ染色 ：（X-GAL染色） プレートに付着している細胞のβ-ガラクトシダーゼ染色を、Sanes,ら, 1986, EMBO J．5:3133-3142に従って行なった。 Molecular Probes，Inc.のプロトコールを使用して、懸濁液中で増殖する細胞 におけるlacZβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を検出した。 上記のプロトコールを使用して、融合タンパク質に結合させた抗体とビオチン 化β-ガラクトシダーゼ酵素とを含む複合体が、選択した細胞にうまく導入され たかどうか判定した。導入が完了していれば、細胞は一晩インキュベートすると 青くなる。 ２）ストレプトアビジンタンパク質RYD配列の改変 ビオチンでブロックしたストレプトアビジンは、おそらく、タンパク質のビオ チン結合性クレフトとは異なるRYD含有配列を介して細胞表面に特異的に結合す る(Kd＝３×108Ｍ)。 RYDドメイン(配列)を別のアミノ酸残基に変えることにより、様々な細胞のビ オチンに関係しない特異的な表面結合を排除できるものと期待される。 RYD配列を改変する一つの方法は、RYD配列をRYEに変えることである。RYD配列 のRYEへの変更は、逐次PCR法を使用して点突然変異を導入することによって達成 可能である。これは、２つのプライマー、即ち、DES(配列番号１)及びDER(配列 番号２)(図５参照)を設訃し、pTSAPA-2発現ベクターをストレプトアビジン遺伝 子の鋳型として用いることにより達成することができる。まず、２対のプライマ ー（即ち、T7プロモーター/DER及びT7ターミネータ/DES）を用いてPCRを行なう 。次に、これら２つの増幅ＤＮＡ断片を精製し、プールして１つのサンプルとす る。次いで、プールした第一ラウンドの精製産物を鋳型として用い、T7プロモー タープライマー及びT7ターミネータープライマーを用いてPCRの第２ラウンドを 行なう。ストレプトアビジン遺伝子成分の突然変異RYE配列は、PCRの第二ラウン ドの産物を配列分析することによって確認する。 ３）ビオチン-β-ガラクトシダーゼのA431細胞への送達 化合物を細胞へ送達するST-PAの能力を調べるため、この複合体の送達を、コ アとなるストレプトアビジンがTGFα受容体に共有結合で結合している複合体の 場合と比較した。 ストレプトアビジン-TGF-α(ST-TGF)の発現ベクターであるpTSA-TGFαは、pTS APA-2におけるプロテインＡの遺伝子を成熟ヒトTGF-α遺伝子（アミノ酸１〜50 個）で置換することにより構築した。 ビオチン化タンパク質を特定の細胞型へ送達するST-PA及びST-TGFα融合タン パク質の能力を証明するため、ビオチン化β-ガラクトシダーゼを該融合タンパ ク質のストレプトアビジン成分と複合させた。β-ガラクトシダーゼのA431細胞 への送達は、公知の染色法及びFACS分析を使用して定量した。 ST-PA／ビオチンβ-ガラクトシダーゼを抗EGFR mAbと複合させ、次いで得られ た複合体を上皮増殖因子受容体(EGFR)を過剰発現するA431ヒト類表皮細胞とイン キュベートした。あるいは、ST-TGFをビオチン-β-ガラクトシダーゼと混合し、 得られた複合体をA431細胞へ投与した。 図２に示すように、ST-PA融合タンパク質は、A431細胞の表面にあるEGFRを介 してビオチン-β-ガラクトシダーゼをA431細胞へ効率よく送達した(陽性細胞＞9 9％)。ST-TGFα融合タンパク質も、ビオチン-β-ガラクトシダーゼのA431細胞へ の効率的な送達を示した(陽性細胞＞99％)。驚くことに、ST-TGFα融合タンパク 質によって各細胞へ送達されるビオチン-β-ガラクトシダーゼの量は、ST-PA送 達系で観察される量よりも少なかった(観察された平均蛍光活性は、それぞれ214 と2402であった)。 ST-PA融合タンパク質によるビオチン-β-ガラクトシダーゼのA431細胞への高 効率の送達は、各ST-PA四量体に含まれるビオチンとIgＧに対する４つの結合部 位に起因する可能性がある(図１Ｂ参照)。図３に示す経時実験より、99％よりも 多くの細胞が、ビオチン-β-ガラクトシダーゼを細胞へ輸送した２日後までにβ -ガラクトシダーゼに対して陽性染色になることが証明された。 ４）特異性の異なるmAbを用いたビオチンβ-ガラクトシダーゼの細胞への送達 ビオチンβ-ガラクトシダーゼのA431細胞への送達を調べる際に用いた実験手順 を、抗体／ST-PA／ビオチン化β-ガラクトシダーゼ複合体の他の細胞型への送 達を調査するのにも使用した。この調査には、複数の異なる細胞表面分子を認識 すろ抗体を利用した。本実験に使用した細胞系及び細胞表面分子を図４Ａにまと める。図４Ｂに示すように、ST-PA/mAb複合体は、試験したヒト細胞型へ、これ らの細胞表面に存在するHLA-DR、CD33及びCD34分子を介してβ-ガラクトシダー ゼを非常に効率よく輸送した(陽性細胞＞99％)。 ５）pAT-β-ガラクトシダーゼ発現べクター ビオチンはＤＮＡへ組み込ませることが可能であるものの(例えば、発現プラ スミド)、ビオチンをＤＮＡへランダムに組み込ませると転写活性が失われる可 能性がある。細胞へ導入すべきＤＮＡの転写活性を保つために、新規な遺伝子輸 送系を開発した。該遺伝子輸送系は、発現カセットの下流にポリ(dA)／ポリ(dT) 域(tract)を有するpAT-発現べクターを使用するものである(図５参照)。この輸 送系によれば、細胞へ送達すべきＤＮＡを発現ベクターにクローニングする。pA T-発現ベクターは、ST-PA融合タンパク質のビオチン結合部位に結合するビオチ ン化ポリ(dT)オリゴヌクレオチドと共に三重らせんＤＮＡを形成する。ST-PA融 合タンパク質の抗体結合部位に結合する抗体は、ＤＮＡを送達すべき細胞を標的 とする。 三重らせんＤＮＡの形成及びβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の細胞へのＤＮＡ輸 送についてのプロトコールは、以下の通りである。β-ガラクトシダーゼ遺伝子 をpAT-発現ベクターの発現カセットにクローニングする(図５参照)。４μｇのpA T-β-ガラクトシダーゼ発現ベクター及び20 pmolのビオチン化ポリ(dT)オリゴヌ クレオチド(Promega)をTMN緩衝液(10 mM Tris、pH 8.0、10 mM MgCl2、50 mMNaC l)に溶解した混合物を、37℃で１時間インキュベートする。次いでST-PA融合タ ンパク質(0.5μg)及びmAb(1.0μg)を混合物に添加し、得られた混合物を室温で3 0分間インキュベートする。三重らせんＤＮＡ-ST-PA-mAb複合体を細胞(１×106 個)に添加し、37℃で48時間インキュベートする。β-ガラクトシダーゼ活性をFA CSによって検出する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 レヴィン，ブランディ，エイ. アメリカ合衆国 11374 ニューヨーク州, レゴ パーク，64ティーエイチ アベニュ ー 98―19

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．毒素を細胞内へ輸送するための複合体であって、 (a)抗体結合部位及びビオチン結合部位を有するストレプトアビジン−プロ テインＡ融合タンパク質、 (b)前記抗体結合部位に結合された抗体 (但し、該抗体は細胞表面タンパク 質に特異的であり、該細胞表面タンパク質は該抗体と結合した後でエン ドサイトーシスを受けるものである)、及び (c)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化毒素 を含んでなる前記複合体。 ２．前記毒素が (a)チミジンキナーゼ、 (b)エンドヌクレアーゼ、 (c)リボヌクレアーゼ、 (d)αトキシン (e)リシン、 (f)アブリン、 (g)シュードモナス(Pseudomonas)エキソトキシンＡ、 (h)ジフテリア毒素 (i)サポリン、 (j)モモルディン(momordin)、 (k)ゲロニン(gelonin)、 (l)アメリカヤマゴボウ(pokeweed)抗ウイルス性タンパク質、 (m)α-サルシン(sarcin)、及び (n)コレラ毒素 からなる群より選択されるものである請求項１記載の複合体。 ３．プロドラッグを細胞内へ輸送するための複合体であって、 (a)抗体結合部位及びビオチン結合部位を有するストレプトアビジン-プロテ インＡ融合タンパク質、 (b)前記抗体結合部位に結合された抗体 (但し、該抗体は細胞表面タンパク 質に特異的であり、該細胞表面タンパク質は該抗体と結合した後でエン ドサイトーシスを受けるものである)、及び (c)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化プロドラッグ を含んでなる前記複合体。 ４．MDR遺伝子産物を細胞内へ輸送するための複合体であって、 (a)抗体結合部位及びビオチン結合部位を有するストレプトアビジン-プロテ インＡ融合タンパク質、 (b)前記抗体結合部位に結合された抗体 (但し、該抗体は細胞表面タンパク 質に特異的であり、該細胞表面タンパク質は該抗体と結合した後でエン ドサイトーシスを受けるものである)、及び (c)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化MDR遺伝子産物 を含んでなる前記複合体。 ５．一本鎖核酸を細胞内へ輸送するための複合体であって、 (a)抗体結合部位及びビオチン結合部位を有するストレプトアビジン-プロテ インＡ融合タンパク質、 (b)前記抗体結合部位に結合された抗体 (但し、該抗体は細胞表面タンパク 質に特異的であり、該細胞表面タンパク質は該抗体と結合した後でエン ドサイトーシスを受けるものである)、及び (c)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化一本鎖核酸 を含んでなる前記複合体。 ６．二重らせん核酸を細胞内へ輸送するための複合体であって、 (a)抗体結合部位及びビオチン結合部位を有するストレプトアビジン-プロテ インＡ融合タンパク質、 (b)前記抗体結合部位に結合された抗体 (但し、該抗体は細胞表面タンパク 質に特異的であり、該細胞表面タンパク質は該抗体と結合した後でエン ドサイトーシスを受けるものである)、 (c)前記ビオチン結合部位に結合された、ホモプリンまたはホモピリミジン 部分を有するビオチン化一本鎖核酸、及び (d)前記ビオチン化一本鎖核酸と共に三重らせん構造を形成する二本鎖ＤＮ Ａ を含んでなる前記複合体。 ７．病原性細菌またはウイルスのタンパク質を細胞内へ輸送するための複合体で あって、 (a)抗体結合部位及びビオチン結合部位を有するストレプトアビジン-プロテ インＡ融合タンパク質、 (b)前記抗体結合部位に結合された抗体 (但し、該抗体は細胞表面タンパク 質を提示する細胞抗原に特異的であり、該細胞表面タンパク質は該抗体 と結合した後でエンドサイトーシスを受けるものである)、及び (c)前記ビオチン結合部位に結合された病原性細菌またはウイルスのビオチ ン化タンパク質 を含んでなる前記複合体。 ８．抗体結合部位が４箇所存在し、ビオチン結合部位が４箇所存在する、請求項 １、３、４、５、６または７に記載の複合体。 ９．前記ストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質のストレプトアビジ ン成分が改変されたRYD配列を有するものである請求項１、３、４、５、６ または７に記載の複合体。 10．トランスフェリン受容体に結合する抗体をさらに含む、請求項１、３、４、 ５、６または７に記載の複合体。 11．前記抗体が (a)HLA-DR、 (b)CD33、 (c)CD34、及び (d)EGF受容体 からなる群より選ばれる表面抗原を認識するものである請求項１、３、４、 ５または６のいずれか一項に記載の複合体。 12．前記抗体がIgG抗体である請求項１、３、４、５、６または７に記載の複 合体。 13．(a)請求項１、３、４、５、６または７に記載の複合体、及び (b)製剤学上許容し得る担体 を含む医薬組成物であって、ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパ ク質に結合されていない毒素を実質的に含まない前記組成物。 14．毒素を細胞内へ輸送するための方法であって、 (a)i)抗体結合部位及びビオチン結合部位を有するストレプトアビジン-プロ テインＡ融合タンパク質、 ii)前記抗体結合部位に結合された抗体 (但し、該抗体は細胞表面タンパ ク質に特異的であり、該細胞表面タンパク質は該抗体と結合した後で エンドサイトーシスを受けるものである)、及び iii)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化毒素 を含んでなる複合体を形成する工程、 (b)該複合体を、前記ビオチン結合部位に結合していない毒素から単離する 工程、並びに (c)毒素を細胞内へ取り込ませるために該単離した複合体を細胞と接触させ る工程 を含む前記方法。 15．物質を細胞内へ輸送するための方法であって、 (a)i)抗体結合部位及びビオチン結合部位を有するストレプトアビジン-プロ テインＡ融合タンパク質、 ii)前記抗体結合部位に結合された抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパ ク質に特異的であり、該細胞表面タンパク質は該抗体と結合した後で エンドサイトーシスを受けるものである)、及び iii)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化物質 を含んでなる複合体を形成する工程、並びに (b)該物質を細胞内へ取り込ませために該複合体を細胞と接触させる工程 を含み、前記物質が一本鎖核酸、MDR遺伝子産物及びプロドラッグからな る群より選択されるものである前記方法。 16．二本鎖ＤＮＡを細胞内へ輸送するための方法であって、 (a)i)抗体結合部位及びビオチン結合部位を有するストレプトアビジン-プロ テインＡ融合タンパク質、 ii)前記抗体結合部位に結合された抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパ ク質に特異的であり、該細胞表面タンパク質は該抗体と結合した後で エンドサイトーシスを受けるものである)、 iii)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化一本鎖核酸、及び iv)前記ビオチン化一本鎖核酸と共に三重らせん構造を形成する二本鎖Ｄ ＮＡ を含んでなる複合体を形成する工程、並びに (b)二本鎖ＤＮＡを細胞内へ取り込ませるために該複合体を細胞と接触させ る工程 を含む前記方法。 17．前記複合体が４つの抗体結合部位と４つのビオチン結合部位を有するもので ある請求項14、15または16に記載の方法。 18．前記ストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質のストレプトアビジ ン成分が改変されたRYD配列を有するものである請求項14、15または16に記 載の方法。 19．前記複合体がトランスフェリン受容体に結合する抗体をさらに含むものであ る請求項14、15または16に記載の方法。 20．前記抗体が (a)HLA-DR、 (b)CD33、 (c)CD34、及び (d)EGF受容体 からなる群より選ばれる表面抗原を認識するものである請求項14、15また は16に記載の方法。 21．前記抗体がIgＧ抗体である請求項14、15または16に記載の方法。
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