ES2290976T3 - D-proteina ligada y metodo para identificar compuestos que modulan la actividad de receptores. - Google Patents

D-proteina ligada y metodo para identificar compuestos que modulan la actividad de receptores. Download PDF

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Abstract

SE DESCRIBE UNA D PROTEINA LIGADA REPRESENTADA POR LA FORMULA: R-L-R'' EN LA QUE: R Y R'' SON D PEPTIDOS (SECUENCIAS DE RESIDUOS DE AMINOACIDOS QUE CONTIENEN ESENCIALMENTE EN D AMINOACIDOS), AL MENOS UNO DE R Y R'' TIENEN UNA LONGITUD DE AL MENOS 50 AMINOACIDOS Y L REPRESENTA UNA UNION PARA LA LIGACION DE R A R'', SIENDO L SELECCIONADO ENTRE EL GRUPO QUE CONSISTE EN UNIDADES DE UNION TIOL ESTER Y SELENOL ESTER. TAMBIEN SE DESCRIBE UN METODO PARA LA IDENTIFICACION DE COMPUESTOS QUE MODULAN LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR QUE COMPRENDE: (A) LA PUESTA EN CONTACTO DE AL MENOS UN COMPUESTO PROCEDENTE DE UNA LIBRERIA QUIMICA CON UN D RECEPTOR Y (B) LA DETERMINACION DE LA CAPACIDAD DE DICHOS COMPUESTOS PARA MODULAR LA ACTIVIDAD DE DICHO RECEPTOR D; EN EL QUE DICHO COMPUESTO SE SABE QUE INHIBE DICHA ACTIVIDAD DEL D RECEPTOR ANTES DE DICHA PUESTA EN CONTACTO.

Description

D-proteína ligada y método para identificar compuestos que modulan la actividad de receptores.
Campo técnico
La presente invención se refiere a proteínas que incorporan restos D-aminoacídicos. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para identificar compuestos candidatos a partir de una biblioteca química usando una D-proteína que consiste esencialmente en D-aminoácidos y a métodos para usar dichas proteínas.
Antecedentes
La biosfera es intrínsecamente quiral; cada clase de macromoléculas biológicas está formada por moléculas monoméricas de quiralidad uniforme (Mason, Chirality 3:223, 1991) y las interacciones bioquímicas de las macromoléculas biológicas son intrínsecamente quirales.
Las enzimas, por ejemplo, actúan invariablemente sólo sobre un enantiómero de un sustrato quiral, o generan sólo un diastereómero a partir de un sustrato proquiral. Fersht, en "Enzyme Structure and Mechanism", W.H. Freeman and Company, San Francisco, 1977, pág. 75-81. Esta especificidad puede relacionarse con la estructura quiral de la molécula de enzima, incluyendo el plegamiento tridimensional del esqueleto polipeptídico y la orientación de las cadenas laterales de aminoácidos en la molécula de proteína plegada. Fersht, supra. Hasta la fecha, en la naturaleza sólo se han descrito L-enzimas; esto deja a la descripción de las D-enzimas y sus propiedades, que incluyen la estructura plegada, la actividad enzimática y la especificidad quiral, como cuestiones sin explorar.
Recientemente, Zawadzke et al., J. Am. Chem. Soc., 114:4002-4003, 1992, describieron la preparación de un pequeño polipéptido de 45 restos aminoacídicos (D-rubrodoxina) usando D-aminoácidos. La L-rubrodoxina se encuentra en clostridios y es la proteína de hierro-azufre más sencilla. Se cree que funciona en el transporte de electrones. Sin embargo, carece de actividad enzimática demostrada.
Antes de la presente invención, la mayor L-proteína que se sabía que se sintetizaba químicamente de una manera por etapas convencional es la hormona de liberación de preprogonadotropina (PreproGnRH). La PreproGnRH tiene 93 restos aminoacídicos (Milton et al., Biochemistry, (1992) 31:8800). La PreproGnRH inhibe la liberación de prolactina.
Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada en el plano. Para describir un compuesto ópticamente activo, se usan los prefijos D y L o R y S para indicar la configuración absoluta de la molécula alrededor de su centro o centros quirales. Los prefijos (+) y (-) o d y l se emplean para designar el signo de rotación de la luz polarizada en el plano por el compuesto, significando (-) o l que el compuesto es levorrotatorio. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrorrotatorio. Para una estructura química dada, estos compuestos, denominados estereoisómeros, son idénticos con la excepción de que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico también puede denominarse enantiómero, y una mezcla de estos isómeros a menudo se denomina mezcla enantiomérica o racémica.
La propiedad de la actividad óptica se debe a la asimetría molecular alrededor de átomos de carbono que están unidos a cuatro átomos o moléculas diferentes. Cuando sólo hay un átomo de carbono asimétrico, o centro quiral como se denomina algunas veces, hay dos posibles estereoisómeros. Cuando hay n carbonos asimétricos o centros quirales, el número de posibles estereoisómeros aumenta a 2^{n}. De esta manera, una molécula con tres centros quirales tendría ocho estereoisómeros posibles.
Aunque las diferencias estructurales entre los estereoisómeros son sutiles y de pequeñas consecuencias en las reacciones químicas normales, pueden ser grandes cuando están implicados sistemas biológicos, es decir, si los compuestos se utilizan en reacciones catalizadas por enzimas. De esta manera, los L-aminoácidos se metabolizan fácilmente en los seres humanos, pero los correspondientes D-análogos no, y sólo la D-glucosa puede fosforilarse y procesarse para dar glucógeno o degradarse por las rutas glicolítica y oxidativa del metabolismo intermedio. De forma similar, los beta bloqueantes, feromonas, prostaglandinas, esteroides, agentes aromatizantes y de fragancia, agentes farmacéuticos, pesticidas, herbicidas y muchos otros compuestos presentan una estereoespecificidad crítica. En el campo de los pesticidas, Tessier [Chemistry and Industry, Mar. 19, 1984, pág. 199] ha demostrado que sólo dos de los ochos estereoisómeros de deltrametrin, un insecticida piretroide, tienen alguna actividad biológica. Puede realizarse la misma afirmación en relación con la concentración de bioactividad en un solo isómero acerca de muchos otros pesticidas, incluyendo los fenoxipropionatos y derivados de halopropionato, conteniendo cada uno un centro quiral y existiendo en forma de dos isómeros ópticos.
La pureza estereoquímica tiene una importancia igual en el campo de los agentes farmacéuticos, donde 12 de los 20 fármacos más prescritos presentan quiralidad. Se proporciona un caso puntual por el naproxeno, o ácido (+)-S-2-(6-metoxi-2-naftil)-propiónico, que es uno de los dos miembros más importantes de una clase de ácidos 2-aril-propiónicos con actividad anti-inflamatoria no esteroidea, usado, por ejemplo, en el tratamiento de la artritis. En este caso, se sabe que el enantiómero S(+) del fármaco es 28 veces más potente terapéuticamente que su homólogo R(-). Se proporciona otro ejemplo de agentes farmacéuticos quirales por la familia de beta-bloqueantes, al considerarse la forma L del propanolol 100 veces más potente que el enantiómero D.
La síntesis de compuestos quirales por técnicas de síntesis orgánica convencionales generalmente conduce a una mezcla racémica que, en el agregado, puede tener una bioactividad específica relativamente baja, ya que algunos de los estereoisómeros de la mezcla probablemente son biológica o funcionalmente inactivos. Como resultado, deben usarse mayores cantidades del material para obtener una dosis eficaz, y los costes de fabricación aumentan debido a la co-producción de ingredientes estereoquímicamente "incorrectos" y, por lo tanto, inactivos.
En algunos casos, ciertos isómeros pueden ser realmente perjudiciales en lugar de simplemente inertes. Por ejemplo, el enantiómero D de la talidomida era un agente sedante seguro y eficaz cuando se prescribía para el control de las náuseas matutinas durante el embarazo. Sin embargo, se descubrió que su homólogo L-talidomida era un potente mutágeno.
Se dispone de métodos para la síntesis estereoselectiva que generalmente implican etapas de síntesis química y de aislamiento que son largas, complejas y costosas. Además, un esquema sintético capaz de producir un enantiómero específico no puede aplicarse de una forma general para obtener otros compuestos ópticamente activos. Lo que se necesita es una estrategia generalizada para la resolución de mezclas racémicas producidas por reacciones química habituales, y se han usado varias estrategias.
Una estrategia usada ampliamente ha sido la precipitación selectiva de compuestos deseados a partir de mezclas racémicas. Véase, por ejemplo Yoshioka et al. [Patente de Estados Unidos Nº 3.879.451], Paven et al. [Patente de Estados Unidos Nº 4.257.976], Halmos [Patente de Estados Unidos Nº 4.151.198] y Kameswaran [Patente de Estados Unidos Nº 4.454.344].
Los procedimientos anteriores resolvían satisfactoriamente mezclas racémicas porque el tratamiento de las mezclas con reactivos ópticamente puros producía diastereómeros que, a diferencia de los compuestos racémicos iniciales, tienen diferentes propiedades físicas. De esta manera, puede emplearse cristalización fraccionada u otros medios físicos para separar compuestos diastereoméricos.
La separación de diastereómeros también puede realizarse por cromatografía. Por ejemplo, Pollock et al. [J. Gas Chromatogr. 3: 174 (1965)] han resuelto aminoácidos diastereoméricos por cromatografía de gases. Mikes et al. [J. Chromatogr. 112:205 (1976)] han usado cromatografía líquida para resolver dipéptidos diastereoméricos. En la mayoría de los casos, los reactivos ópticamente puros han estado en la fase estacionaria durante la separación cromatográfica, pero también pueden usarse en los eluyentes. Hare et al. [Patente de Estados Unidos Nº 4.290.893] han usado cromatografía líquida para resolver mezclas racémicas que se trataban con eluyentes acuosos que contenían reactivos ópticamente puros y cationes metálicos; la resolución se producía porque los complejos diastereoméricos resultantes tenían diferentes coeficientes de reparto en el sistema cromatográfico.
Todos los métodos descritos en este punto se han basado en la disponibilidad de reactivos ópticamente puros adecuados, pero estos reactivos a menudo no están disponibles o, si lo están, su uso es prohibitivamente caro. En una estrategia alternativa se han creado técnicas de resolución enzimática. Se han usado muchas clases diferentes de enzimas para la resolución de estereoisómeros en una escala preparativa, incluyendo hidrolasas (especialmente las lipasas y esterasas tales como quimotripsina); liasas y oxidorreductasas (por ejemplo, aminoácido oxidasas y alcohol reductasas). En términos generales, las enzimas para uso en resoluciones idealmente deberían presentar una amplia especificidad de sustrato, de forma que serán capaces de catalizar reacciones de una amplia serie de sustratos "no naturales", y un alto grado de estereoselectividad para catalizar la reacción de un isómero con la exclusión
de otros.
Las hidrolasas (por ejemplo lipasas y esterasas) se encuentran entre las enzimas más atractivas para uso en resoluciones, porque no requieren cofactores caros, y algunas de ellas presentan una tolerancia razonable a disolventes orgánicos. Además, la química quiral a menudo incluye alcoholes, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas y aminas con carbonos quirales, y las carboxil hidrolasas son elecciones preferidas como catalizadores estereoselectivos para reacciones de estas especies. Por ejemplo, se ha aplicado un tratamiento enzimático a la resolución de mezclas racémicas de ésteres de aminoácidos. Stauffer [Patente de Estados Unidos Nº 3.963.573] y Bauer [Patente de Estados Unidos Nº 4.262.092].
La separación de productos de reacción de enzimas se ha facilitado por la unión de la enzima a un soporte sólido que podría retirarse por centrifugación o empaquetarse en una columna a través de la cual se pasaron las mezclas racémicas.
También se han explorado enzimas con respecto a la resolución de clases de compuestos distintos de los aminoácidos descritos anteriormente. La lipasa inmovilizada principalmente resuelve mezclas por hidrólisis enzimática o transesterificación. En el caso de una reacción de hidrólisis bifásica, las diferentes propiedades de solubilidad de los ácidos y ésteres implicados requerían la dispersión y agitación de mezclas que contenían la enzima inmovilizada en la fase sólida, un tampón acuoso y la fase orgánica inmiscible con agua que contenía el disolvente y el reactivo - - un proceso relativamente ineficaz.
Se han aplicado enzimas a la resolución de isómeros ópticos de insecticidas. Por ejemplo, Mitsuda et al. [Publicación de Solicitud de Patente Europea Nº 0 080 827 A2] pusieron en contacto un éster de ácido acético racémico con esterasas estereoselectivas de origen microbiano y animal en sistema bifásicos (es decir, dispersión acuosa/orgánica). En un trabajo relacionado sobre piretroides purificados ópticamente, Mitsuda et al [Patente de Estados Unidos Nº 4.607.013] emplearon esterasas microbianas. Klibanov et al. [Patente de Estados Unidos Nº 4.601.987] resolvieron ácidos 2-halopropiónicos racémicos por medio de reacciones de esterificación catalizadas por lipasa realizadas en medios orgánicos.
También pueden proporcionarse otros ejemplos de resolución mediada por enzimas del estado de la técnica aplicados a la producción de agentes farmacéuticos ópticamente purificados. Sih [Patente de Estados Unidos Nº 4.584.270] ha descrito medios enzimáticos para la producción de ácido (R)-4-amino-3-hidroxibutírico ópticamente puro, un intermedio clave en la preparación de L-carnitina.
Hasta hace poco, sólo podían describirse L-enzimas naturales, y esto deja a las supuestas propiedades de las D-enzimas, incluyendo sus estructuras plegadas, la actividad enzimática y la especificidad quiral, como cuestiones sin explorar. Lo que se necesitaba era un progreso suficiente en la síntesis química de proteínas para hacer que fuera posible la síntesis total del enantiómero D de enzimas enteras en una cantidad suficiente como para formar cristales y realizar otras funciones.
Un artículo en Science 1992, vol 256, nº 5054, páginas 221-225, describe la unión de la proteasa de HIV (virus de la inmunodeficiencia humana, VIH) para formar un análogo activo.
Un artículo de Science 1992, vol 256, nº 5062, páginas 1445-1448 (publicado el 5 de junio de 1992) describe la síntesis química de una D-enzima, una D-proteasa de HIV.
Un artículo de Science 1992, vol 256, nº 5062, páginas 1403-1404 (publicado el 5 de junio de 1992) es una discusión de los resultados del artículo indicado en el párrafo anterior.
En la técnica se conocen métodos para seleccionar en bibliotecas químicas compuestos farmacéuticamente útiles usando L-receptores.
Breve compendio de la invención
La presente invención se refiere a un método para identificar compuestos candidatos a partir de una biblioteca de candidatos, siendo el candidato un agonista quiral o un antagonista quiral de un L-receptor de proteína, comprendiendo el método:
a) seleccionar la biblioteca química poniendo en contacto la biblioteca química con un receptor de D-proteína que es la versión D del receptor de L-proteína o una D-proteína que tiene un sitio de unión a receptor que es la versión D del sitio de unión del receptor de L-proteína y
b) identificar uno o más compuestos de la biblioteca química que tengan actividad agonista o antagonista con respecto al receptor de D-proteína o la D-proteína que tiene un sitio de unión a receptor,
donde la expresión "D-proteína" significa una proteína en la que todos los restos aminoacídicos quirales tienen una quiralidad D y la expresión "proteína L" significa una proteína en la que todos los restos aminoacídicos quirales tienen quiralidad L y
donde el agonista o antagonista quiral candidato del receptor de L-proteína es el enantiómero del compuesto obtenido en la etapa b).
En las reivindicaciones adjuntas se indican otras características del método.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos que constituyen una parte de esta descripción:
la figura 1 ilustra la caracterización de peso molecular de los enantiómeros enzimáticos D y L de la proteasa de HIV-1 como se describe en el ejemplo 2 usando espectroscopía de masas de nebulización iónica reconstruida. El peso molecular se expresa en daltons, y se muestra como un pico del porcentaje (%) de intensidad relativa de los espectros medidos. La figura 1A ilustra los datos de peso molecular obtenidos con la L-enzima, y la figura 1B ilustra los datos obtenidos con la D-enzima.
La figura 2 ilustra la actividad enzimática comparativa de los enantiómeros D y L de la enzima PR de HIV con respecto a los enantiómeros D y L de un sustrato fluorogénico quiral descrito en el ejemplo 3. La figura 2A muestra la L-enzima con el L-sustrato; la figura 2B muestra la L-enzima con el D-sustrato; la figura 2C muestra la D-enzima con el L-sustrato; y la figura 2D muestra la D-enzima con el D-sustrato. Los datos se expresan como actividad, medida en unidades arbitrarias de intensidad de fluorescencia, durante un tiempo de reacción medido en minutos.
Las figuras 3A y 3B ilustran diagramas de cintas del esqueleto polipeptídico de la molécula de la proteasa homodimérica de HIV-1 tanto en conformación L como en conformación D, mostrados en la figura 3B y en la figura 3A respectivamente. Las flechas indican la dirección del polipéptido en la dirección desde el extremo amino al extremo carboxi.
La figura 4 ilustra una representación esquemática de la estrategia de unión de segmentos químicos empleada para la síntesis total de análogos de proteasa D- y L-[Aba^{67}, ^{95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1.
La figura 5 ilustra una representación esquemática de las tácticas de ensamblaje de cadena en fase sólida optimizadas empleadas en la síntesis de los segmentos peptídicos funcionalizados. Las reacciones de desprotección y acoplamiento están separadas por una etapa de lavado de un solo flujo.
La figura 6 ilustra un cromatograma compuesto que muestra dos segmentos D-[\alphaCOSH]HIV-1 PR(1-51) y D-[N^{\alpha}-BrCH_{2}CO]HIV-1 (53-99) desprotegidos funcionalizados purificados y el producto de unión final (48 horas) D-[Aba^{67},^{95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1 PR (en negrita) procesado en una columna Vydac 218TP5415 eluida por gradiente (40-55% de B), a un caudal de 1 mililitro por minuto.
La figura 7 ilustra los rendimientos de la reacción por etapas para la síntesis de los análogos de proteasa D- y L-[Aba^{67},^{95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1.
Las figuras 8A, 8B, 8C y 8D ilustran los espectros de masas de nebulización iónica de los monómeros de [(NHCH_{2}
COSH_{2}CO)^{51-52}HIV-1 PR purificada por HPLC.
Las figuras 9A, 9B, 9C y 9D ilustran las mediciones por HPLC de fase inversa de los productos de unión D- y L-[Aba^{67}, ^{95}(CO-S)^{51-52}]HIV-1 PR.
Las figuras 10A y 10B ilustran el espectro de dicroismo circular ultravioleta lejano de los análogos de proteasa D- y L-[Aba^{67}, ^{95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1.
La figura 11 ilustra la actividad enzimática de los enantiómeros de [Aba^{67},^{95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1 PR sobre isómeros D y L del sustrato Ac-Thr-Ile-Nle-Nle-Gln-Arg.amida.
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Descripción detallada de la invención A. Definiciones
Resto Aminoacídico: un aminoácido formado por digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Los restos aminoacídicos descritos en este documento están en la forma estereoisomérica "L" o "D". NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxi de un polipéptido. Manteniendo la nomenclatura convencional de polipéptidos (descrita en J. Biol. Chem., 243; 3552-59 (1969) y adoptada en 37 C.F.R. 1, 882 (b) (2)), se muestran las abreviaturas de restos aminoacídicos en la siguiente tabla de correspondencia:
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Los símbolos anteriores se emplean tanto para los L-aminoácidos como para los D-aminoácidos. El símbolo Xaa se emplea para cualquier resto aminoacídico desconocido o distinto de los anteriores. Sin embargo, el símbolo Xaa se emplea frecuentemente en este documento para designar el ácido L- o D-\alpha-amino-n-butírico (aba), un reemplazo isostérico para restos de Cys.
Debe tenerse en cuenta que todas las secuencias de restos aminoacídicos representadas en este documento por fórmulas tienen la orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de extremo amino a extremo carboxi. Además, la frase "resto aminoacídico" se define en sentido amplio para incluir los aminoácidos indicados en la tabla de correspondencia y aminoácidos modificados y poco habituales, tales como los indicados en 37 C.F.R. 1.822(b)(4), e incorporados en este documento como referencia. Además, debe indicarse que una raya al principio o al final de una secuencia de restos aminoacídicos indica un enlace peptídico con otra secuencia de uno o más restos aminoacídicos o un enlace covalente con un grupo amino terminal tal como NH_{2} o acetilo o con un grupo carboxi terminal tal como COOH.
Mezcla Racémica: una mezcla racémica se usa en este documento para hacer referencia a una mezcla de al menos un primer y segundo estereoisómeros en cualquier proporción. En este contexto, el término "resolución", como se usa en este documento, hará referencia a la separación de una primera mezcla racémica en una segunda y tercera mezclas, donde las proporciones de los dos estereoisómeros en la segunda y tercera mezclas son diferentes de la de la primera mezcla racémica, siendo la proporción mayor en una y necesariamente menor en la otra.
B. Composiciones de D-proteína
La presente invención contempla una D-proteína que comprende una molécula que tiene una secuencia de restos aminoacídicos que define un polipéptido. Una D-proteína tiene una secuencia de restos aminoacídicos consistente esencialmente en D-aminoácidos.
La expresión "D-aminoácido" no indica la dirección de rotación específica de la molécula, porque es bien conocido que algunos aminoácidos son dextrorrotatorios mientras que otros son levorrotatorios. En su lugar, las expresiones indican una configuración absoluta por convención con respecto a los dos posibles estereoisómeros del gliceraldehído, D-gliceraldehído y L-gliceraldehído. Véase, por ejemplo, Lehninger en "Biochemistry", Worth Publishers, Inc., New York, 1970, pág. 76-78. De esta manera, todos los estereoisómeros que están relacionados estereoquímicamente con el L-gliceraldehído se denominan L, y los relacionados con el D-gliceraldehído se denominan D, independientemente de la dirección de rotación de la luz polarizada en el plano que proporciona el isómero.
En el caso de la treonina e isoleucina, hay dos centros estereoquímicos, es decir, los átomos C\alpha y los átomos C\beta de los aminoácidos. La D-treonina y la D-isoleucina empleadas en este documento tienen estereoquímicas en los dos átomos C\alpha de los aminoácidos opuestas a la estereoquímica de la L-treonina y la L-isoleucina, es decir, la D-treonina y la D-isoleucina son imágenes especulares completas de la L-treonina y la L-isoleucina respectivamente.
La glicina es el único aminoácido aquiral que se produce comúnmente. Por consiguiente, cuando una proteína o enzima se denomina en este documento D- o L-proteína o enzima, se entiende que esencialmente todos los restos aminoacídicos quirales que constituyen dicha proteína o enzima tiene la quiralidad indicada. La presencia de restos aminoacídicos aquirales tales como glicina dentro de una proteína o enzima no afecta a la denominación de su quiralidad, como se emplea en este documento.
Todos los aminoácidos quirales presentes en una proteína descrita en la naturaleza son L-aminoácidos. De esta manera, las proteínas que tienen sólo aminoácidos quirales de configuración D en su secuencia de restos aminoacídicos (denominadas D-proteínas) se desconocen en la naturaleza.
Las D-proteínas usadas en la presente invención pueden tener una secuencia de restos aminoacídicos que corresponde, y preferiblemente es idéntica, a la secuencia de restos aminoacídicos de una proteína conocida o "natural". Por "natural" se entiende una secuencia presente en una proteína aislada a partir de la naturaleza sin intervenciones mediadas por un laboratorio dirigidas a alterar la secuencia de la proteína. Por "conocida" se entiende una proteína natural o una proteína que es el producto de un proceso de modificación de secuencia que altera la secuencia de aminoácidos para producir una proteína con propiedades conocidas.
Muchas proteínas descritas en la bibliografía científica, demasiado numerosas como para mencionarse en este documento, han sido el objeto de mutación de su secuencia de restos aminoacídicos naturales de tal forma que ya no corresponden en la secuencia de restos aminoacídicos con la secuencia de un aislado natural, pero retienen la actividad original. De esta manera, en otra realización, la invención contempla el uso de D-proteínas que tienen secuencias de restos aminoacídicos que corresponden a proteínas conocidas.
Para los fines de esta invención, es útil distinguir especificidades de unión de sustrato-proteína quirales y
aquirales.
Especificidad quiral se refiere a la selectividad de proteínas para unirse a uno solo de dos estereoisómeros. Especificidad aquiral se refiere a la capacidad de la proteína de unirse a un sustrato que no presenta una estructura asimétrica dependiente del reconocimiento con la proteína, es decir, el reconocimiento y la unión con el sustrato de la proteína no depende de la presencia de una estructura asimétrica en la región de unión al sustrato de la proteína. Dicho de otra manera y en el contexto de la presente invención en relación con la selectividad enantiomérica de una D-proteína, un sustrato aquiral puede unirse a la D- o L-proteína porque no están presentes estructuras asimétricas en el sustrato aquiral de las que dependa la unión. Por el contrario, un sustrato quiral puede unirse sólo a uno u otro de un par de D- y L-proteína porque la asimetría estructural del sustrato está implicada en la unión.
Muchas proteínas y enzimas presentan especificidad quiral, incluyendo la enzima proteasa de HIV-1 que se describe más adelante. De forma similar, hay muchas proteínas y enzimas que presentan especificidad aquiral, incluyendo la superóxido dismutasa y la anhidrasa carbónica.
Una D-proteína usada en esta invención puede tener cualquier tamaño (longitud de aminoácidos) y puede comprender múltiples subunidades.
En una D-proteína de múltiples subunidades todas las subunidades de la proteína tienen configuración D.
C. Síntesis de D-Proteínas
Una D-proteína usada en la presente invención puede prepararse por cualquier medio disponible para un especialista en las técnicas relacionadas con los polipéptidos. El método preciso empleado para sintetizar el polipéptido no se considera esencial para la estructura básica de una D-proteína usada en esta invención, y por lo tanto no debe considerarse limitante, particularmente ya que la tecnología desarrolla nuevas formas de sintetizar y ensamblar polipéptidos.
Las rutas preferidas de síntesis de polipéptidos incluyen:
1. Síntesis química convencional, por ejemplo, síntesis por etapas, y
2. Ensamblaje de bloques de construcción de polipéptidos por unión química.
Actualmente se considera poco práctico emplear métodos de síntesis química convencionales (por etapas) para producir polipéptidos con más de 100 restos aminoacídicos. Por otra parte, pueden emplearse métodos de unión química para ensamblar polipéptidos varias veces mayores. Por consiguiente, para D-proteínas mayores de 100 restos aminoacídicos, actualmente las técnicas de unión química o enzimática son el único medio práctico para obtener estos productos. En este documento se describe una estrategia de unión para preparar cantidades de 10-100 miligramos de las enzimas D- y L-proteasa de HIV-1.
Aunque actualmente no está disponible, un aparato de síntesis de proteínas fabricado que usa D-proteínas puede solucionar el problema de incorporar D-aminoácidos en la maquinaria de traducción de proteínas, haciendo posible la síntesis de D-proteínas usando la expresión de ADN recombinante de ARN mensajero y D-aminoácidos.
Síntesis por Etapas Convencional
Se prefieren técnicas de química sintética, tales como la adición por etapas de aminoácidos en una síntesis de tipo Merrifield en fase sólida por razones de pureza, especificidad antigénica, ausencia de productos secundarios indeseados, facilidad de producción y similares. Puede encontrarse un excelente resumen de las muchas técnicas disponibles para sintetizar L-proteínas y enzimas en Steward et al., en "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky et al., en "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, Segunda Edición, 1976 y Meienhofer, en "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, pág. 46, Academic Press (New York), 1983; y Kent, Ann. Rev. Biochem., 57:957, 1988, para la síntesis de péptidos en fase sólida, y Schroder et al., en "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 para la síntesis en solución clásica, incorporándose todas estas citas en este documento como referencia. En los textos anteriores se describen grupos protectores apropiados útiles en esta síntesis y por Mcomie, en "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York 1973, que se incorpora en este documento como referencia.
En general, los métodos de síntesis en fase sólida contemplados comprenden la adición secuencial de uno o más restos aminoacídicos o restos aminoacídicos protegidos convenientemente a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, el grupo amino o carboxi del primer resto aminoacídico se protege por un grupo protector que puede retirarse selectivamente adecuado. Se utiliza un grupo protector que puede retirarse selectivamente diferente para aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo tal como lisina.
Para la síntesis de D-proteínas, se utilizan D-aminoácidos o D-aminoácidos protegidos en lugar de los L-aminoácidos convencionales. Los D-aminoácidos adecuados para la síntesis de polipéptidos están disponibles en el mercado en el Peptide Institute (Osaka, Japón); Peptides International (Louisville, KY); Bachem Bioscience (Philadelphia, PA); y Bachem California (Torrance, CA).
Usando una síntesis en fase sólida como ilustrativa, el D-aminoácido protegido o derivatizado se une a un soporte sólido inerte a través de su grupo amino o carboxilo desprotegido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo después se retira selectivamente y se administra el siguiente D-aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) protegido convenientemente y se hace reaccionar en condiciones adecuadas para formar el enlace amida con el resto ya unido al soporte sólido. Después se retira el grupo protector del grupo amino o carboxilo de este resto D-aminoacídico recién añadido y posteriormente se añade el siguiente D-aminoácido (protegido convenientemente), y así sucesivamente. Después de haber unido todos los D-aminoácidos deseados en la secuencia apropiada, se retiran secuencial o conjuntamente todos los grupos protectores terminales o laterales que queden (y el soporte sólido) para producir el polipéptido final.
Técnicas de Unión
La unión química de polipéptidos se ha descrito recientemente por Kent en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 07/865.368, presentada el 8 de abril de 1992. Esta técnica se prefiere para D-proteínas que tienen una longitud de 100 restos aminoacídicos o mayor. En este procedimiento, primero se sintetizan dos polipéptidos que contienen extremos adaptados para la unión química. Después de la síntesis química por etapas y de la escisión de su resina en fase sólida respectiva, los dos polipéptidos se mezclan y se hacen reaccionar para unir los extremos adaptados y formar un polipéptido lineal mayor compuesto por los dos polipéptidos.
Se detalla una síntesis por etapas ilustrativa de una D-enzima en el ejemplo 1, que describe la síntesis de una diversidad de D-proteasas de HIV-1. El ejemplo 5 describe una síntesis de tipo de unión ilustrativa de análogos de proteasa D- y L-[Aba^{67},^{95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1. El análogo de proteasa D-[Aba^{67},^{95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1 del ejemplo 5 es funcionalmente equivalente a la D-proteasa de HIV-1 del ejemplo 1.
Puede aplicarse una síntesis similar a la preparación de D-superóxido dismutasa, anhidrasa carbónica o cualquiera de las otras D-enzimas descritas en este documento.
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D. Métodos para la Selección de Bibliotecas Químicas
Los medios más comunes para identificar compuestos farmacéuticamente útiles implican la selección de bibliotecas químicas. La minuciosidad de esta selección puede mejorarse notablemente empleando tanto L-proteínas como D-proteínas.
Las bibliotecas de productos naturales aisladas de fuentes naturales pueden consistir en varios cientos de miles de compuestos. También pueden prepararse bibliotecas químicas por síntesis quiral de enantiómeros particulares o por síntesis no quiral de racematos. En la búsqueda de nuevos candidatos de fármaco, estas bibliotecas pueden someterse a selección para identificar compuestos activos en un ensayo particular. En muchos casos, la molécula diana es un agonista o antagonista de un receptor de proteína o de una proteína que tiene un sitio de unión a receptor y la búsqueda se dirige a la identificación de candidatos de fármaco que puedan servir como dicho agonista o antagonista. Una vez identificado un compuesto candidato como agonista o antagonista, pueden diseñarse análogos de estos compuestos candidatos y sintetizarse para mejorar su actividad y otras propiedades deseables.
En muchos casos, la especificidad quiral es un atributo necesario de los agonistas y antagonistas activos. Sin embargo, en este documento se describe que la especificidad quiral de los agonistas y antagonistas depende de la quiralidad del receptor de proteína o el sitio de unión a receptor. Por consiguiente, el receptor o el sitio de unión a receptor a menudo pueden distinguir entre enantiómeros activos o inactivos de un agonista o antagonista dado. Los elementos componentes de una biblioteca de productos naturales a menudo presentan quiralidad aleatoria y no llevan ninguna relación intrínseca con el receptor o el sitio de unión a receptor. Por consiguiente, si sólo está presente un enantiómero dentro de una biblioteca, la quiralidad de dicho enantiómero tiene la misma probabilidad de ser la del enantiómero erróneo (inactivo) que la del enantiómero correcto (activo) con respecto a cualquier enzima diana dada. Si la biblioteca se somete a selección sólo frente a la configuración (L) nativa de un receptor o sitio de unión al receptor diana, y si los elementos de la biblioteca son no racematos, es decir, si son quirales, existe una probabilidad significativa (50/50) de que la biblioteca incluya sólo el enantiómero inactivo.
La presente invención enseña que la selección de una biblioteca de productos naturales frente a un L-receptor o proteína que tiene que sitio de unión a receptor y su versión D correspondiente, puede doblar aproximadamente el número de compuestos candidatos identificados a partir de dicha biblioteca.
Cualquier compuesto candidato identificado como activo frente a un D-receptor o sitio de unión a receptor pueden ser inactivo con respecto a la versión L correspondiente. Sin embargo, el análisis estructural de un compuesto candidato activo con respecto a la versión D predice la estructura de un compuesto candidato activo con respecto a la versión L correspondiente, es decir, los enantiómeros de los compuestos considerados activos con respecto a una versión D probablemente tendrán una actividad correspondiente con respecto a la versión L correspondiente.
Por consiguiente, el número de compuestos candidatos identificados positivamente a partir de una biblioteca química o de productos naturales puede aumentar significativamente si la biblioteca se selecciona tanto frente a la versión L como a la versión D del receptor de proteína o la proteína que tiene un sitio de unión a receptor.
Entre los receptores de proteína frente a los cuales puede realizarse la selección de forma útil de bibliotecas de productos naturales y/o químicas se incluyen los siguientes: GPIIb-IIIa y LFA-1, Ruoslahti et al., Science, 238: 491-497 (1987); CSAT, Horwitz et al., J. Cell Biol., 101:2134 (1985); VLA-2, Nieuwenhuis et al. Nature, 318:470 (1985); Receptor del Complemento CR3, Wright et al., PNAS, 84:1965 (1987); Receptor del Complemento CR2, Nemerow et al., J. Virol., 55: 3476 (1985); Receptor de Células T CD4, Guyader et al., Nature, 320:662 (1987); Receptor de FRP, Yu et al., Nature, 330:765 (1987); Receptor de Apolipoproteína, Yamada et al., J. Clin. Invest., 80:507 (1987); Receptor de Interleuquina, Dower et al., Immunology Today, 8:46 (1987); Receptor de Fc, Anderson et al., J. Immunol., 138:2254 (1987); Receptor de Somatostatina, Kim et al., J. Biol. Chem., 262:470 (1987); Receptor de PDGF, Keating et al., J. Biol. Chem., 252; 7932 (1987); y Receptor de Transferrina, Kohgo et al., Blood, 70:1955 (1987).
Otras proteínas que tienen sitios de unión que pueden someterse a selección de acuerdo con el método de la presente invención incluyen el sitio de unión al receptor de insulina de la insulina, el sitio de unión al receptor de reovirus en la proteína hemaglutinina viral, el sitio de unión al receptor de fibrinógeno en el fibrinógeno A alfa, los sitios de unión al receptor de hormonas tiroideas \alpha y \beta, el sitio de unión al receptor LDL en Apo E, el sitio de unión al lípido A, el sitio de unión a lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) en Apo AI, y el sitio de unión al receptor de integrina Mac-1 en el fibrinógeno D-30.
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Ejemplos
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la síntesis y uso de D-proteínas en la forma de D-enzimas.
1. Síntesis por Etapas Convencional de la Proteasa L y D-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 (PR de HIV-1)
Los avances en la síntesis química total de proteínas hizo posible la producción reproducible de la proteasa L-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 (PR de HIV-1) cristalina homogénea. Véase, por ejemplo, Kent, Annu. Rev. Biochem., 57:957, (1988); Wlodawer et al., Science, 245:616 (1989); y Miller et al., Science, 246; 1149 (1989).
La proteasa de HIV-1 (PR de HIV-1) es una enzima codificada por el virus que corta cadenas polipeptídicas con alta especificidad y que es esencial para la replicación de viriones activos. Kohl et al., Proc. Natl. Acad, Sci., U.S.A., 85:4686, 1988. La molécula de PR de HIV de 21.500 daltons está constituida por dos cadenas polipeptídicas idénticas de 99 aminoácidos.
La síntesis química total de la proteasa D-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 se realizó como se describe más adelante, y se compararon las propiedades (estructura covalente, propiedades físicas, dicroismo circular y actividad enzimática) de las formas enantioméricas D y L de esta enzima proteasa de HIV-1.
Para este fin, en síntesis químicas separadas, se prepararon las cadenas polipeptídicas protegidas correspondientes a las secuencias L y D del monómero de 99-aa de la proteasa [Aba^{67,95}]HIV-1 por síntesis química total. Aba es ácido L o D-\alpha-amino-n-butírico y se usa como un reemplazo isostérico de restos Cys en las posiciones 67 y 95 en la cadena polipeptídica del monómero de PR de HIV. Este mismo reemplazo isostérico se usó en el trabajo de Wlodawer et al., supra y Miller et al., supra, conduciendo a las estructuras correctas originales de PR de HIV.
La síntesis química se realizó de una manera por etapas convencional. Las cadenas polipeptídicas de 99-aa se ensamblaron a partir de L-aminoácidos protegidos y D-aminoácidos protegidos, respectivamente. Los derivados de D- y L-aminoácidos t-Boc se obtuvieron en el Peptide Institute (Osaka, Japón) y Peptides International (Louisville, KY), con la excepción de: Boc-L-Aba, Boc-L-Asn(Xan), Boc-D-Ile y Boc-D-His(Bom), obtenidos en Bachem Bioscience (Philadelphia, PA); Boc-D-Asn(Xan), Boc-D-Asp (OcHex) y Boc-D-Glu(OcHex), obtenidos en Bachem California (Torrance, CA); Boc-D-Lys(CIZ), cristalizado en la sal TBA, obtenido en el Peptide Institute, y D-Aba (Sigma, St. Louis, MO) que se convirtió en Boc-D-Aba y se aisló como la sal DCHA. Otros grupos protectores de cadenas laterales que se usaron fueron: Arg(Tos), Tyr(BrZ), L-His(Tos), D-His(Bom) y Thr(BzL). El contenido de enantiómero L de las preparaciones de Boc-D-aminoácido estaba comprendido entre 0,01 y 0,08% [especificaciones de los fabricantes]. El ensamblaje de las cadenas por etapas se realizó de una forma automatizada en un sintetizador Applied Biosystems 430A (escala de 0,2 mmol con D- o L-Boc-Phe-OCH_{2}-Pam-resina). Cada ciclo de adición de aminoácidos implicaba: N^{\alpha}-desprotección, TFA puro (100%) [lavados de flujo de 2 x 30 segundos, más tratamiento por lotes de 1 minuto]; lavado de flujo con DMF [1x22 seg, 1x38 seg]; acoplamiento [1x10 minutos] con neutralización simultánea in situ [Boc-aminoácido (2,25 mmol) preactivado por reacción con HBTU (2,22 mmol) y DIEA (6,4 mmol) en DMF durante 2 minutos]. Se ha demostrado que el método de neutralización in situ produce niveles insignificantes de racemización. Henklein et al., en "Innovation & Perspectives in Solid Phase Synthesis", R. Epton Ed., SPPC Ltd., Birmingham, U.K. 1992. Los péptidos ensamblados se desprotegieron y se escindieron de la resina en 9:1 de HF/p-cresol (estaban presentes resorcinol y tiocresol cuando se incluyó His(Bom) en la secuencia) después de la eliminación del grupo Boc y el grupo formilo de Trp (con etanolamina).
Los productos D y L, después de la desprotección, se trataron individualmente y posteriormente se prepararon enzimas sintéticas por plegamiento de los polímeros polipeptídicos en desnaturalizante como se describe por Wlodawer et al., supra, y Miller et al., supra. Para este fin, después de la desprotección y escisión, los productos peptídicos brutos se precipitaron con éter y se disolvieron con hidrocloruro de guanidina 6 M en un tampón NaHCO_{3}, pH 8,0, antes del enriquecimiento de RP HPLC (HPLC de fase inversa) en C18 semipreparativa y del plegamiento por diálisis en glicerol al 10%, tampón NaH_{2}PO_{4} 25 mM, pH 7,0. Después de la concentración a alto vacío en una solución en glicerol, las enzimas se cuantificaron por análisis de aminoácidos y se almacenaron a 4ºC.
El rendimiento total para la síntesis de la proteasa L-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 (PR de HIV-1) fue de aproximadamente 2 miligramos o 0,09%.
El rendimiento total para la síntesis de la proteasa D-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 (PR de HIV-1) fue indeterminante debido a que era menor de 2 miligramos.
2. Análisis Estructural de la Proteasa L- y D-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 (PR de HIV-1)
Se analizaron diversas características estructurales del monómero de 99-aa de la D-enzima, proteasa D-[Aba^{67,95}]HIV-1, y se compararon con las características estructurales del isómero L. Por ejemplo, la HPLC de fase inversa analítica proporcionó tiempos de retención idénticos para las dos cadenas polipeptídicas sintéticas.
Se sometieron muestras de monómeros de proteasa [Aba^{67,95}]HIV-1 sintetizados químicamente y plegados preparadas en el ejemplo 1 en tampón MES pH 6,5/glicerol al 10% a desalinización por HPLC de fase inversa. Los picos de proteína recogidos se analizaron por separado por espectrometría de masas de nebulización iónica como se describe por Bruins et al., Anal. Chem. 59:2642 (1987). En las condiciones usadas, (acetonitrilo al 50%, agua al 50%, TFA al 0,1%) la enzima se desnaturaliza. En los espectros de masas reconstruidos mostrados, los datos de m/z de partida se han sometido a un filtro digital de paso alto, y después se han clasificado para producir todas las especies moleculares parentales entre 10 kDa y 11 kDa. Este procedimiento de reconstrucción reduce matemáticamente los estados de carga múltiple observados para una especie molecular dada a una sola masa molecular.
Por medio de la espectroscopía de masas de nebulización iónica reconstruida, la masa molecular del monómero observada de la L-enzima fue de 10.748 \pm 4 daltons (Da), y la masa de la D-enzima fue de 10.751\pm3 Da. Masa calculada: (monoisotópica) 10.748,0 Da; (media) 10.754,7 Da.
De esta manera, los dos productos (monómeros de D- y L-enzima) tenían el mismo peso molecular, dentro de la incertidumbre experimental, cuando se midieron por espectrometría de masas de nebulización iónica. Los datos de espectrometría de masas de nebulización iónica se muestran en las figuras 1A y 1B.
La secuencia de aminoácidos completa del monómero de 99-aa de la D-enzima se determinó por lectura espectrométrica de masas de tiempo de vuelo de desorción láser asistida por matriz (espectrómetro de masas Modelo API-III, P. E. SCIEX Inc., Thornhill, Toronto, Canadá) y se demostró que era igual a la de la L-enzima. De esta manera, las dos moléculas de enzima sintéticas tienen una estructura covalente idéntica.
Por otra parte, se revelaron diferencias entre las dos moléculas en diversas interacciones quirales. Se tomaron espectros de dicroismo circular (CD) de los enantiómeros D y L individuales de la proteasa de HIV-1 en el intervalo de 260-195 nm en una solución acuosa a pH 5,5 que contenía glicerol al 5% a 25ºC usando una celda de cuarzo con longitud de trayectoria de 1 mm en un espectrómetro Aviv CD. Los espectros CD (dicroismo circular) revelaron rotaciones ópticas iguales y opuestas, como era de esperar para las moléculas de proteína enantioméricas.
3. Propiedades enzimáticas de la proteasa L- y D-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 (RP de HIV-1) anterior
Se avaluaron las propiedades enzimáticas de la proteína enantiomérica compuesta por D-aminoácidos y se compararon con el isómero L usando un ensayo fluorogénico que empleaba un análogo hexapeptídico de un sitio de escisión GAG natural como sustrato, como se describe por Toth et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36:544 (1990).
Los ensayos fluorogénicos se realizaron con alícuotas de 15 \mul (correspondiente a 1,75 (\pm10%) \mug de proteína) de cada enantiómero de enzima en glicerol al 10%, tampón MES 10 mM pH 6,5, añadidas a una solución de D- o L-sustrato fluorogénico 50 mM en el tampón MES. El sustrato para la enzima tenía la secuencia 2-aminobenzoil-Thr-Ile-Nle-Phe(p-NO2)-Gln-Arg.amida (SEC ID Nº 2). El sustrato se sintetizó con derivados de D- o L-aminoácidos para proporcionar las formas enantioméricas apropiadas.
Los resultados del ensayo fluorogénico se muestran en las figuras 2A, 2B, 2C y 2D. En el ensayo fluorogénico se usaron alícuotas que contenían cantidades iguales (determinadas por el análisis de aminoácidos) de las preparaciones enzimáticas plegadas purificadas. El aumento de fluorescencia se registró en un registrador de gráficos continuo. Los datos ilustran que las dos moléculas enzimáticas sintéticas eran igualmente activas, pero revelaron una especificidad quiral recíproca, ya que la L-enzima escindía sólo el L-sustrato mientras que la D-enzima escindía sólo el D-sustrato correspondiente.
En un estudio similar, se evaluaron los enantiómeros D y L del inhibidor seudopeptídico MVT101 (Ac-Thr-Ile-Nle-psi [CH_{2}NH]-Nle-Gln-Arg.amida) (SEC ID Nº 1) preparado como se describe por Miller et al., Science, 246:1149 (1989) con respecto a su efecto sobre la D- y L-proteasa de HIV. Los resultados de los estudios usando el inhibidor se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1 Los inhibidores quirales muestran especificidad quiral recíproca frente a D- y L-PR de HIV^{a}
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Los inhibidores quirales fueron eficaces sólo contra el enantiómero correspondiente de la enzima, es decir, L-MVT101 inhibía la L-PR de HIV, pero no reacción catalizada por la D-PR de HIV, y D-MVT101 inhibía la D-PR de HIV pero no tenia ningún efecto sobre la reacción catalizada por la L-enzima. De forma interesante, el inhibidor aquiral azul de Evans, que muestra cinéticas de inhibición mixtas, era un potente inhibidor de los dos enantiómeros de la enzima (Tabla 1).
La proteasa de HIV-1 existe como un homodímero; es decir, una sola molécula enzimática está constituida por dos cadenas polipeptídicas idénticas plegadas de 99 restos. Wlodawer et al., Science, 245:113 (1989); y Miller et al., Science, 246;1149 (1989). La PR de HIV es muy activa, mostrando un aumento de la velocidad de aproximadamente 10^{10} veces con respecto a la hidrólisis de enlaces peptídicos no catalizada. Kent et al., en "Viral Proteinases as Therapeutic Targets", Wimmer et al., Eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1989, pág. 223-230; y Richards et al., FEBS Lett., 247:113 (1989). Es una enzima muy específica que escinde péptidos así como proteínas (Kent et al., supra; y Kröusslich, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:807, 1989) y su especificidad se determina por las interacciones de la molécula enzimática plegada tridimensionalmente que forma un complejo con seis restos aminoacídicos consecutivos en la cadena polipeptídica del sustrato. Miller et al., Science, 246;1149 (1989); y Kent et al., supra.
Como ocurre con todas las enzimas, la PR de HIV debe su especificidad y actividad catalítica a la estructura tridimensional precisa formada por plegamiento especifico de la cadena polipeptídica, y a las interacciones geométricas precisas en los complejos específicos formados con los sustratos. Fersht, en "Enzyme Structure and Mechanism", W.H. Freeman and Company, San Francisco, 1977, pág. 75-81. Por lo tanto, las especificidades quirales reciprocas observadas demuestran que las formas plegadas de las moléculas de D- y L-enzima son imágenes especulares entre sí en todos los elementos de la estructura tridimensional responsable de la actividad enzimática. La naturaleza extensiva de estas interacciones implica que las dos moléculas enzimáticas son imágenes especulares en todos los aspectos (21), lo cual es coherente con los espectros CD iguales y opuestos que se han observado. Más notablemente, la forma plegada del esqueleto polipeptídico (es decir, ignorando las cadenas laterales) es por sí misma una entidad quiral que debe existir en forma de imagen especular en los dos enantiómeros de la proteína mostrados en las figuras 3A y 3B.
El diagrama de cintas de las proteasas L- y D-(Aba67,95,167,195)HIV-1 mostrado en la figura 3 se basa en las coordenadas cristalográficas de rayos X de la enzima sintetizada químicamente cuando forma un complejo con un inhibidor peptídico derivado de sustrato (el inhibidor no se muestra) como se describe por Miller et al., Science, 246:1149 (1989). Este modelo se generó realizando una transformación de imágenes especulares de los datos de la L-enzima.
Las estructuras de "esqueleto" de cinta tridimensionales plegadas son imágenes especulares no superponibles y contienen numerosos elementos quirales. Éstos se encuentran en la estructura secundaria y supersecundaria, en la estructura terciaria y en la estructura cuaternaria como se ilustra en las figuras 3A y 3B. Debe tenerse en cuenta, por ejemplo, la relación de los solapamientos entre sí; la relación de los segmentos helicoidales en las cadenas b vecinas; el bucle característico (de giro hacia la derecha en la proteasa L) de las cadenas \beta antiparalelas en cada solapamiento descrito por Richardson et al., en "Protein Folding", Gierasch et al., Eds., American Association of the Advancement of Science, Washington, D.C., 1990, pág. 5-17.; y la terminación de los segmentos helicoidales. Como el único elemento quiral introducido en las cadenas polipeptídicas sintetizadas químicamente es la estereoquímica en los átomos C\alpha de los aminoácidos (y los átomos C\beta de Thr, Ile), los datos presentados en este documento exigen que todos los aspectos estereoquímicos de la molécula enzimática plegada, desde la estructura secundaria a la cuaternaria, se determinan simplemente por la estereoquímica del esqueleto polipeptídico. De esta manera, las presentes propiedades quirales recíprocas de los enantiómeros de la enzima sintetizados químicamente es una demostración fundamental de que la estructura plegada/tridimensional final y las actividades biológicas consiguientes de esta molécula enzimática homodimérica de 21500 daltons se determinan completamente por la secuencia de aminoácidos.
Las L- y D-enzimas en este estudio nunca han visto condiciones biosintéticas y, por lo tanto, nunca han estado en contacto con factores bioquímicos de ningún tipo. De forma interesante, la molécula enzimática homodimérica sencilla estudiada aquí se forma rápidamente (tanto el plegamiento como el ensamblaje) y de una forma precisa incluso a las concentraciones relativamente bajas usadas en las condiciones de ensayo, así como en condiciones de plegamiento de diálisis frente a desnaturalizante más normales. Los resultados descritos en este documento son una evidencia concluyente de que sea cual sea su papel propuesto, no se requieren factores biosintéticos para la formación de la forma plegada funcional y ensamblada, correcta, de la proteína.
Las propiedades quirales reciprocas observadas de las moléculas enzimáticas de imagen especular descritas en este documento refuerza y generaliza la naturaleza quiral de las interacciones bioquímicas de las proteínas. Las propiedades quirales de las propias moléculas de proteína, que dan lugar a este comportamiento, sólo reciben una ligera atención en los textos bioquímicos. Ahora se puede afirmar, basándose en las pruebas experimentales, que los enantiómeros de las proteínas presentarán especificidad quiral recíproca en sus interacciones químicas, incluyendo la catálisis.
La observación de que los dos enantiómeros de la PR de HIV se veían afectados igualmente por el inhibidor aquiral azul de Evans proporciona varias implicaciones significativas. En primer lugar, el enantiómero no natural de una enzima que funciona sobre un sustrato aquiral y produce un producto aquiral será totalmente funcional in vivo. Este aspecto proporciona posibles aplicaciones terapéuticas importantes. Son ejemplos la anhidrasa carbónica y la superóxido dismutasa. Es de esperar que las D-enzimas tengan larga duración in vivo (en una biosfera de L-proteínas), ya que serán resistentes a las proteasas naturales que, en general, atacarán solo a las proteínas constituidas por L-aminoácidos. Las D-proteínas son comparativamente menos inmunogénicas que las L-proteínas porque los polipéptidos largos constituidos totalmente por D-aminoácidos no se procesan y se presentan tan eficazmente por el sistema inmune como los polipéptidos constituidos por L-aminoácidos.
Las moléculas de D-proteína tienen otras posibles aplicaciones prácticas. Por ejemplo, los enantiómeros de enzimas tienen utilidad como catalizadores quirales en la producción selectiva de un enantiómero puro de un agente químico definido. La síntesis química enantioméricamente pura tiene aplicaciones en la producción de agentes farmacéuticos para seres humanos. Además, los enantiómeros de proteínas pueden contribuir a la adquisición de datos de fases en cristalografía de rayos X como se describe por Mackay, Nature, 342:133 (1989). Los cristales centrosimétricos formados por la cocristalización de un par de D- y L-proteínas tendrían fases muy simplificadas, y proporcionaría datos estructurales de rayos X más fiables. En el momento actual, las D-enzimas y las D-proteínas en general sólo se pueden obtener por síntesis química total. Durante la síntesis ribosómica de cadenas polipeptídicas, incluso en los sistema de traducción in vitro, no se incorporarán D-aminoácidos en polipéptidos en crecimiento. Ellman et al., Science, 255:197 (1992).
4. Discusión de los Ejemplos 1-3
Aquí se preparan formas D y L de la proteasa de HIV-1 por síntesis química total. Las dos proteínas tienen estructuras covalentes idénticas. Sin embargo, los enantiómeros de la proteína/enzima plegada muestran especificidad quiral recíproca sobre sustratos peptídicos. Es decir, cada enantiómero de la enzima corta sólo el enantiómero del sustrato correspondiente. También fue evidente una especificidad quiral recíproca en el efecto de los inhibidores enantioméricos de las enzimas proteasas de HIV-1 preparadas aquí. Estos datos demuestran que las formas plegadas de las moléculas de D- y L-enzima sintetizadas químicamente son imágenes especulares entre sí en todos los elementos de la estructura tridimensional. Las proteínas enantioméricas presentan especificidad quiral recíproca en todos los aspectos de sus interacciones bioquímicas, retienen la actividad enzimática y proporcionan una amplia serie de composiciones útiles como se describe en este documento.
5. Síntesis y unión de análogos de proteasa D- y L-[Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1
La figura 4 ilustra una representación esquemática de la estrategia empleada para la síntesis total de los análogos de proteasa D y L-[Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1. Pueden obtenerse D- y L-aminoácidos protegidos en el Peptide Institute (Osaka, Japan), Peptides International (Louisville, KY), Bachem Bioscience (Philadelphia, PA) y Bachem California (Torrance, CA) y tenían una proporción < 0,03% del enantiómero opuesto. Los segmentos peptídicos no protegidos, funcionalizados, purificados por HPLC, ensamblados por una síntesis en fase sólida por etapas, se hacen reaccionar en presencia de GuHCl 6 M para formar los productos de D- y L-[(NHCH_{2}COSCH_{2} CO)^{51-52}]HIV-1 PR de 99 restos unidos. (Schnölzer et al., (1992) Science 256, 221-225). El área recuadrada de la figura 4 representa la estructura del análogo tioéster del enlace peptídico Gly^{51}-Gly^{52} en el sitio en el que se produjo la unión. El tioéster sirve como enlace entre los dos D-péptidos, es decir, el sitio de unión. También puede emplearse un enlace éster de selenol para unir los dos D-péptidos.
Dos segmentos peptídicos grandes, es decir [\alphaCOSH]HIV-1 PR(1-51) y [N^{\alpha}-BrCH_{2}CO]HIV-1 PR(53-99) se ensamblan, como se ilustra en la figura 5, en síntesis separadas por medio de un protocolo SPPS automatizado muy optimizado usando la química Boc realizada en un biosintetizador ABI 430A modificado. (Kent et al., "Innovation & Perspectives in Solid-Phase Synthesis", (1992) Ed. Epton, R. SPPC Ltd. Birmingham, U.K.). El protocolo comprendía la eliminación del grupo Na-Boc con TFA no diluido (total de 2 minutos) seguido de un lavado con flujo de DMF para dar la sal de TFA-péptido-resina, y una sola etapa de acoplamiento de 10 minutos usando Boc-aminoácidos activados con HBTU y neutralización in situ con DIEA en DMF. Las reacciones de desprotección y acoplamiento se separan por una etapa de lavado de flujo. Después de la purificación, los monómeros se pliegan por separado por diálisis en presencia de inhibidor D- y L-MVT-101, respectivamente, para producir las enzimas homodiméricas. En la figura 4 se proporcionan los rendimientos en miligramos de cada producto.
El péptido [\alphaCOSH]HIV-1 PR(1-51) puede ensamblarse sobre 4-[a(Boc-Gly-S)bencil]fenoxiacetamidometil-resina. El péptido [N^{\alpha}-BrCH_{2}CO]HIV-1 PR [53-99] puede prepararse por bromoacetilación de [Aba^{67,95}]HIV-1 PR (53-99)-OCH_{2} péptido Pam-resina (Yamashiro et al., (1988) Int. J. Peptide Protein Res. 31, 322-334). Todos los péptidos se escinden y desprotegen por tratamiento con alto HF.
Después de una purificación por HPLC de fase inversa preparativa (Vydac 218TP101550 - 5x25 cm, TFA al 0,1%/CH_{3}CH y 30-50 ml/min), los segmentos peptídicos funcionalizado se hacen reaccionar en presencia de GuHCl 6 M (tampón fosfato 0,1 M, pH 5,3) durante 48 horas para formar los monómeros de D- y L-[(NHCH^{2}COSCH_{2}CO)^{51-52}]
HIV-1 PR unidos. La figura 6 ilustra un cromatograma compuesto que muestra los dos segmentos desprotegidos funcionalizados purificados y el producto de la reacción de unión final (48 horas) (en negrita) procesado en una columna Vydac 218TP5415 eluida con TFA al 0,1% (tampón A) y TFA al 0,9%/CH_{3}CN, 1:9 (tampón B), a un caudal de 1 ml/min.
Después de la purificación por HPLC de fase inversa, los productos pueden plegarse por separado por diálisis en tampón fosfato 25 milimolar, pH 5,5, en presencia de un exceso de 10 veces de inhibidor D- o L- [MVT-101] (Ac-Thr-Ile-Nle-\psi-[CH_{2}NH]-Nle-Gln-Arg.NH_{2}) (SEC ID Nº 1) para producir las enzimas homodiméricas. (Miller et al., (1989) Science 246, 1149). En la figura 7 se proporcionan los rendimientos de la reacción por etapas para la síntesis de los análogos de proteasa D- y L-[Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1.
El rendimiento total con respecto la síntesis del análogo de proteasa D-[Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1 fue de 48 miligramos o 3,0%.
El rendimiento total con respecto a la síntesis del análogo de proteasa L-[Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1 fue de 47 miligramos o 2,5%.
6. Caracterización Física de los Productos de Unión, Análogos de Proteasa D- y L-[Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1
En las figuras 8A, 8B, 8C y 8D se ilustra la espectrometría de masas de nebulización iónica de los productos unidos purificados por HPLC. La espectrometría de masas de nebulización iónica revela una sola especie molecular en cada caso con masas moleculares observadas de 10768,9 \pm 1,4 daltons (enantiómero D) y 10769,4 \pm 0,9 daltons (enantiómero L) [Calculado: 10763,9 daltons (monoisotópico) y 10770,8 daltons (promedio)]. También se detectaron cantidades minoritarias de subproductos de deshidratación. Las secuencias de los monómeros también se examinaron por una nueva técnica de secuenciación con marcadores de peso molecular (Protein Ladder) utilizando una lectura espectrométrica de masas de desorción láser de una etapa. Las figuras 8A y 8C ilustran picos marcados que representan una sola especie molecular que difiere en el número de protones en exceso. Las masas moleculares observadas del producto unido son 10768,9 \pm 1,4 daltons (enantiómero D) y 10769,4 \pm 0,9 daltons (enantiómero L) [calculado: 10763,9 daltons (monoisotópico) y 10770,8 daltons (promedio)]. Las figuras 8B y 8D ilustran los espectros de masas reconstruidos en los que los datos de partida mostrados en las figuras 8A y 8C se han reducido a un solo estado de carga. Todos los puntos de datos de las figuras 8A y 8C se incluyen en los cálculos y no se realiza ningún filtrado matemático. Para mayor claridad se muestran las regiones de masas de 10 a 11 kD.
Las figuras 9A a D ilustran las mediciones de HPLC de fase inversa de productos de unión de D- y L-[Aba^{67,95},(CO-S)^{51-52}]HIV-1 PR. Los productos unidos en GuHCl 6 M revelan un solo pico en cada caso. Las figuras 9A y 9C ilustran los monómeros ligados purificados en GuHCl 6 M. Las figuras 9B y 9D ilustran las enzimas homodiméricas plegadas en presencia de inhibidor D o L-[MVT-101], respectivamente, en tampón fosfato sódico 25 milimolar, pH 5,5. Debe tenerse en cuenta que, después del plegamiento, se ven varios productos de autolisis minoritarios en las preparaciones de proteasa D y L-[Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1. A aproximadamente 27 minutos, también se ven productos proteolíticos minoritarios del péptido inhibidor MVT-101. Parece ser que incluso en presencia de un gran exceso de inhibidor, la enzima aún está sometida a un grado minoritario de autolisis. Las muestras se procesaron en una columna Vydac 218TP5415 eluida con TFA al 0,1% (tampón A) y TFA al 0,9%/CH_{3}CN, 1:9 (tampón B) a una caudal de 1 ml/min.
Las figuras 10A y 10B ilustran los espectros de dicroismo circular ultravioleta lejano de las preparaciones de D- y L-proteasa plegadas. Los espectros se registraron en tampón fosfato sódico 25 milimolar, pH 5,5 (0,4 mg/ml de proteasa en presencia de inhibidor) a 25ºC en una célula de cuarzo con una longitud de trayectoria de 1 milímetro. Cada preparación tiene una magnitud igual, pero de signo opuesto, como es de esperar por las proteínas de imágenes especulares. (Corigliano-Murphy et al., (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 225; y Zawadzke et al., (1992) J. Am. Chem. Soc. 114, 4002).
7. Caracterización de la Actividad Enzimática de los Productos de Unión, Análogos de Proteasa D- y L-[Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1
La figura 11 ilustra la actividad enzimática de los enantiómeros de D- y L-[Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1 PR que puede determinarse por su acción sobre los isómeros D y L del sustrato hexapeptídico Ac-Thr-Ile-Nle-Nle-Gln-Arg.amida (un análogo del sitio de procesamiento viral GAG p24/p15). La D-enzima escinde únicamente el D-sustrato y es inactiva sobre el L-sustrato, mientras que la L-enzima muestra una actividad completa hacia el L-sustrato, pero es inactiva hacia el D-sustrato. Esta especificidad quiral recíproca también es evidente en el efecto de inhibidores quirales. Como se muestra en la tabla, D- y L-[MVT-101] inhibe la escisión de sustratos fluorogénicos quirales por los análogos de D- y L-PR de HIV-1 respectivamente, pero no tiene ningún efecto sobre la acción del enantiómero opuesto. De manera interesante, el inhibidor aquiral, azul de Evans, que muestra cinética de inhibición mixta, inhibe los dos enantiómeros de la enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA Los inhibidores quirales muestran especificidad quiral recíproca contra D- y L-[Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1 PR
4 
\newpage
Las D- y L-enzimas se ensayaron por separado por el método de ensayo fluorogénico usando el sustrato quiral correspondiente, en presencia de una concentración de inhibidor 5 x CI_{50}. Los ensayos fluorogénicos se realizaron con alícuotas de 15 \mul (correspondientes a 1,75 (\pm 10%) mg de proteína) de cada enantiómero de enzima en tampón MES 100 milimolar, pH 6,5, añadido a una solución de D- o L-sustrato fluorogénico 50 mM en el tampón MES. La secuencia del sustrato era 2 aminobenzoil-Thr-Ile-Nle-Phe(p-NO_{2})-Gln-Arg.amida (SEC ID Nº 2): se sintetizó con derivados de D- o L-aminoácidos para proporcionar las formas enantioméricas apropiadas. El inhibidor azul de Evans es un inhibidor no peptídico, aquiral, competitivo-no competitivo mixto de la enzima PR de VHI-1.
La actividad enzimática de los enantiómeros de [Aba^{67,95}(CO-S)^{51-52}]_{2}HIV-1 PR con respecto a los isómeros D y L del sustrato Ac-Thr-Ile-Nle-Nle-Gln-Arg.amida (SEC ID Nº 3) puede medirse como se indica a continuación. El sustrato (1 mg/ml) se trata con enzima (0,1 mg/ml) a pH 6,5 (tampón MES, 100 mM) durante 30 minutos a 37ºC. Después se cromatografía una alícuota de la mezcla de reacción (columna de RP HPLC Vydac 218TP5415) con un gradiente lineal de 0-40% de tampón B (TFA al 0,09%/CH_{3}CN, 1:9) en tampón A (TFA al 0,1%) durante 20 minutos (caudal 1 ml/min, A^{214nm}). Los productos peptídicos se identifican por MS de nebulización iónica como (H)-Nle-Gln-Arg.amida (m/z:415,0 - elución temprana) y Ac-Thr-Ile-Nle-(OH) (m/z: 388,0 - elución tardía). Las impurezas minoritarias presentes en las preparaciones de sustrato debidas a los péptidos no purificados no se escinden. El panel A ilustra sólo el D-sustrato, el panel B ilustra sólo el L-sustrato; el panel C ilustra el D-sustrato más la D-enzima; el panel D ilustra el D-sustrato más la L-enzima; el panel E ilustra el L-sustrato y la L-enzima; y el panel F ilustra el L-sustrato más la D-enzima.
8. Discusión de los Ejemplos 4-7
La enzima proteasa de HIV-1 existe como una estructura homodimérica. Es una enzima muy específica y esta especificidad y su actividad catalítica dependen de la estructura tridimensional precisa que se forma entre el dímero plegado y seis restos de la molécula de sustrato. Por lo tanto, las especificidades recíprocas observadas demuestran que las formas plegadas de las moléculas de D- y L-enzima son imágenes especulares entre sí en todos los elementos de la estructura tridimensional responsable de su actividad enzimática. Esto es coherente con sus espectros CD observados.
La estructura tridimensional de una molécula de enzima plegada contiene numerosos elementos quirales en la estructura secundaria y supersecundaria, en la estructura terciaria y en la estructura cuaternaria, como se ilustra en la figura 3. Como la única diferencia entre las cadenas polipeptídicas D y L sintéticas es la estereoquímica de los átomos de carbono a (y los átomos c^{\delta} de Ile y Thr) de los aminoácidos, se concluye que la estereoquímica del esqueleto determina todos los aspectos de la estructura superior en esta proteína.
Las observaciones de la especificidad quiral recíproca en la actividad enzimática de las D- y L-proteasas de HIV-1 descritas en este documento sirven para generalizar y subrayar la naturaleza quiral de las interacciones bioquímicas de las proteínas. Las grandes cantidades de enantiomorfos de D- y L-enzima de alta pureza preparados usando el método de unión química permitirán una evaluación experimental minuciosa del uso de D- y L-proteínas en cristalografía de rayos X.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
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(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
The Scripps Research Institute
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 10666 North Torrey Pines Road
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92037
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 619-554-2937
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: 619-554-6312
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES DE D-ENZIMA Y MÉTODOS PARA SU USO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco Flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release Nº1.0, Versión Nº1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-JUN-1993
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/894.817
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 08-JUN-1992
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- N-acetilo
\hskip6.5cm
/nota- "Un grupo N-acetilo está localizado en el extremo amino del {}\hskip6.5cm péptido". 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- Nle
\hskip6.5cm
/nota- "El aminoácido modificado, Nle, está presente en esta posición" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- Nle
\hskip6.5cm
/nota- "El aminoácido modificado, Nle, está presente en esta posición" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: (3^4)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- psiCH2NH
\hskip6.5cm
/nota- "El enlace peptídico escindible entre estos aminoácidos se ha {}\hskip6.5cm reemplazado por un análogo reducido psiCH2NH" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- Amida
\hskip6.5cm
/nota- "Se localiza una amida en el extremo carboxilo del péptido" 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID Nº1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ile Xaa Xaa Gln Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Un grupo 2-aminobenzoílo está localizado en el extremo amino {}\hskip4.5cm del péptido"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- Nle
\hskip6.5cm
/nota- "El aminoácido modificado, Nle está presente en esta posición" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- Phe-pNO2
\hskip6.5cm
/nota- "El aminoácido modificado Phe-pNO2 está presente en esta {}\hskip6.5cm posición" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- Amida
\hskip6.5cm
/nota- "Una amida está localizada en el extremo carboxi del péptido" 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ile Xaa Xaa Gln Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- Ac
\hskip6.5cm
/nota- "Un grupo acetilo, Ac, está localizado en el extremo amino del {}\hskip6.5cm péptido". 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- Nle
\hskip6.5cm
/nota- "El aminoácido modificado, Nle, está presente en esta posición" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- Nle
\hskip6.5cm
/nota- "El aminoácido modificado, Nle, está presente en esta posición" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador- Amida
\hskip6.5cm
/nota- "Una amida está localizada en el extremo carboxi del péptido" 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ile Xaa Xaa Gln Arg}

Claims (6)

1. Un método para identificar compuestos candidatos de una biblioteca química, siendo el candidato un agonista quiral o un antagonista quiral de un receptor de L-proteína, comprendiendo el método:
a) seleccionar la biblioteca química poniendo en contacto la biblioteca química con un receptor de D-proteína que es la versión D del receptor de L-proteína o una D-proteína que tiene un sitio de unión a receptor que es la versión D del sitio de unión del receptor de L-proteína y
b) identificar uno o más compuestos de la biblioteca química que tengan actividad agonista o antagonista con respecto al receptor de D-proteína o la D-proteína que tiene un sitio de unión a receptor,
donde la expresión "D-proteína" significa una proteína en la que todos los restos aminoacídicos quirales tienen una quiralidad D y la expresión "proteína L" significa una proteína en la que todos los restos aminoacídicos quirales tienen quiralidad L y
donde el agonista o antagonista quiral candidato del receptor de L-proteína es el enantiómero del compuesto obtenido en la etapa b).
2. El método de la reivindicación 1, donde el receptor de la D-proteína se selecciona entre el grupo compuesto por GPIIb-IIIa, LFA-1, CSAT, VLA-2, receptor del complemento CR3, receptor del complemento CR2, receptor de células T CD4, receptor de FRP, receptor de apolipoproteína, receptor de interleuquina, receptor de Fc, receptor de somatostatina, receptor de PDGF y receptor de transferrina.
3, El método de la reivindicación 1, donde la D-proteína que tiene un sitio de unión a receptor se selecciona entre el grupo compuesto por insulina que tiene un sitio de unión al receptor de insulina, proteína hemaglutinina viral que tiene un sitio de unión al receptor de reovirus, fibrinógeno A alfa que tiene un sitio de unión al receptor de fibrinógeno, fibrinógeno D-30 que tiene un sitio de unión al receptor de integrina Mac-1, receptores de hormonas tiroideas que tienen sitios de unión \alpha y \beta, Apo E que tiene un sitio de unión al receptor LDL, lípido A, y Apo AI que tiene un sitio de unión al receptor de la lecitina-colesterol aciltransferasa.
4. El método de la reivindicación 1, que incluye aislar una biblioteca química y donde la biblioteca química incluye compuestos naturales.
5. El método de la reivindicación 1, que incluye preparar una biblioteca química y donde la biblioteca química incluye compuestos sintetizados.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además:
poner en contacto los enantiómeros con un receptor de L-proteína o una L-proteína que tiene un sitio de unión a receptor que corresponde al receptor de la D-proteína o la D-proteína que tiene un sitio de unión a receptor, respectivamente; e
identificar uno o más de los enantiómeros que tienen actividad agonista o antagonista con respecto al receptor de la L-proteína, o la L-proteína que tiene un sitio de unión a receptor.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde en la etapa a) el método comprende poner en contacto la biblioteca química con el receptor de la D-proteína y el receptor de la L-proteína correspondiente o con la D-proteína que tiene un sitio de unión a receptor y la L-proteína correspondiente que tiene un sitio de unión a receptor, y en la etapa b) el método comprende identificar uno o más compuestos de la biblioteca química que tienen actividad agonista o antagonista con respecto al receptor de la D-proteína o al receptor de la L-proteína correspondiente o con respecto a la D-proteína que tiene un sitio de unión a receptor o la L-proteína correspondiente que tiene un sitio de unión a receptor.
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