JPH08501207A

JPH08501207A - Ｄ−酵素組成物およびそれらの使用方法

Info

Publication number: JPH08501207A
Application number: JP6501660A
Authority: JP
Inventors: ブライアンヘンリーケント，ステファン; シャーロットフローレンスミルトン，サスキア; セシルデリスルミルトン，レイモンド
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1992-06-05
Filing date: 1993-06-07
Publication date: 1996-02-13
Also published as: CA2137378A1; US20030113881A1; US20040086988A1; ATE178650T1; AU721228B2; DE69324362D1; ES2290976T3; ATE366744T1; DE69334152T2; US7118856B2; US6548279B1; WO1993025667A1; EP0647266A1; AU678768B2; DE69334152D1; EP0882737B1; US6040133A; US7135279B2; EP0647266B1; AU3756497A

Abstract

(57)【要約】酵素反応の触媒作用ができるポリペプチドを定義するアミノ酸残基配列を含んでなるＤ−酵素組成物が開示される。該Ｄ−酵素は実質的にＤ−アミノ酸からなるアミノ残基配列を有する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称Ｄ−酵素組成物およびそれらの使用方法技術分野本発明は、Ｄ−アミノ酸残基を組み込んだタンパク質に関する。さらに詳しくは、本発明は実質的にＤ−アミノ酸から成る酵素的に活性なタンパク質およびそのようなタンパク質を用いる方法に関する。発明の背景生物圏は、本来キラル（chiral）である。生体巨大分子（高分子）は、同一のキラリティーのモノマ分子から成り、（Mason，Chirality３巻，２２３頁，１９９１年），そして、生体巨大分子の生化学的相互作用も本来キラルである。たとえば、酵素は必ずキラル基質の１つのエナンシオマー（鏡像異性体）にのみ働くか、またはプロキラル基質から１つのジアステレオマーのみを生成する。 Fersht“Enzylne Stracture and Mechanism，酵素構造および機構”W．H．Freem anand Company，ダブリュ．エッチ．フリーマン社サンフランシスコ市，１９７７年，７５−８１頁を参照。この特異性は、フォールドされた（折りたたまれた）タンパク質分子中、ポリペブチド骨格（バックボーン）の３次元的フオールディング（折りたたみ）およびアミノ酸側鎖の配向を含む酵素分子のキラール構造に関連づけることができる。Fersht上記参照。今日まで、Ｌ−酵素のみが自然界で知られている。フォールド構造、酵素活性およびキラール特異性を含むＤ−酵素とそれらの性質を知ることは、未開発の問題として残されている。最近、Zawadzke等，J，Am，chem，Soc．１１４巻，４００２−４００３頁，１９９２年は、Ｄ−アミノ酸を用いる小さい４５アミノ酸残基のポリペブチド（Ｄ −rubrodoxin）の合成を報告した。Ｌ−rubrodoxin（ルブロドキシン）は、クロストリデーィア（clostridia）に見い出だされ、そして最も簡単な鉄−硫黄タンパク質である。それは、電子伝達に関与すると信じられている。しかしながら、それは証明された酵素活性を欠く。本発明より以前に、通常の段階的方法で化学的に合成されたのが知られている最大のＬ−タンパク質は、プレプロゴナドロピン（preprogonadotropin）放出ホルモン（PreproGnRH）である。PrepreGnRHは、９３アミノ酸残基を有する（Milt on等，Biochemistry，３１巻，８８００頁，１９９２年。PreproGnRHは、プロラクチン（prolaction）放出を阻害する。多くの有機化合物は、光学活性な形で存在する。すなわち、それらは面偏光の平面を回転する能力を有する。光学活性な化合物を記述するのに、接頭語ＤおよびＬ、またはＲおよびＳが分子のキラール中心に関しての絶対配置（absolute c onfiguratiorl）を示すのに用いられる。接頭語（＋）および（−）またはｄおよびｌが化合物による面偏光の回転の符号を示すのに用いられる。（−）またはｌは、化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄと接頭語がつけられた化合物は、右旋性である。与えられた化学構造に関して、これらの化合物は立体異性体と称されるが、それらは互いに鏡像であること以外、同一である。１つの特定の立体異性体は、エナンシオマーとも呼ばれ、そしてこのような異性体の混合物は、しばしばエナンシオメリック（enantiomeric）またはラセミ混合物と呼ばれる。光学活性の性質は、４つの異なった原子または分子に結合された炭素原子のまわりの分子不斉によるものである。不斉炭素原子（または不斉中心ともしばしは呼ばれるが）が１つのみであるとき、２つの可能な立体異性体がある。不斉炭素または不斉中心がｎ個ある場合、可能な立体異性体の数は２ⁿに増加する。こうして、３つの不斉中心の分子は、８つの可能な立体異性体を持つだろう。立体異性体間での構造上の違いは微妙なものであり、そして通常の化学反応ではほとんどとるに足らないが、生体系が関与するとき、すなわち化合物が酵素− 触媒反応に利用されるなら、それらは重要である。こうして、Ｌ−アミノ酸は人体内で容易に代謝されるが、対応するＤ−類似体は代謝されず、そしてＤ−グルコースのみがリン酸化され、そして中間代謝の解糖酸化（glycolytic,oxidative ）経路によってグリコーゲンに変換されたり、分解されたりできる。同様に、ベータブロッカー、フェロモン、プロスタグランディン、ステロイド、風昧剤、芳香剤、薬品、農薬、除草剤そして他の多くの化合物が決定的な立体特異性を示す。農薬の分野で、Tessier(Chemistry and Industry，３月号，１９巻，１９９頁，１９８４年）は、ピレスロイド系殺虫剤であるデルタメシリン（deltamettrin ）の８つの立体異性体のうち、２つのみが生物活性を有することを示した。単一の異性体中、生物活性濃度に関して同じようなことが、他の多くの農薬について言うことができるが、これらはフェノキシプロピオネートそしてハロプロピオネート誘導体類を含み、各々は１つのキラール中心を有し、そして２つの光学異性体として存在する。薬品の分野でも、立体化学的純度は等しく重要であり、もっとも処方されている２０の薬の内１２がキラリティーを示す。適切な例は、ナプロキセン（naprox en），（＋）−Ｓ−２（−メトキジ−２−ナフチル）−プロピオン酸に見られる。これは、たとえば、関節炎の治療に用いられる非ステロイド抗炎症作用を有する一群の２−アリル−プロピオン酸の２つの最も重要なメンバーのうちの１つである。この場合、薬剤のＳ（＋）エナンシオマーは、Ｒ（−）の対応エナンシオマーより治療的に２８倍も効力がある。キラール薬品の別の例は、ベターブロッカーのファミリーに見られる。プロプラロール（propranolol）のＬ−体は、Ｄ −エナンシオマーよりも１００倍効力があることが知られている。標準的有機合成手法によるキラール化合物の合成は、一般にラセミ混合物を生成し、それは集合体として比較的低い特異的生物活性を有する。混合物中の立体異性体のある部分は、生物的にまた機能的に不活性でありがちだからである。その結果、有効な投与量を得るためにより多量の材料を用いなければならず、そして製造コストが立体化学的に「正しくない」それ故、不活性な成分を共に製造するため増加する。いくつかの例では、ある異性体は単に不活性であるよりむしろ実際に有害でさえある。たとえば、タリドマイド（thalidomide）のＤ−エナシオマーは、妊娠の間、つわりを抑制するのに処方されると、安全で効果的な鎮静剤であった。しかしながら、そのＬ−タリドマイドエナシオマーは、強力な変異原物質であることが発見された。一般に、長く、複雑で高価な化学合成と単離工程を含む立体選択的合成方法は、知られている。さらに、１つの特定のエナシオマーを製造できる合成ルートは、他の光学活性化合物を得る一般的な方法には応用できない。必要なのは、通常の化学反応で製造されたラセミ混合物の分割に対する一般化したアプローチであり、そしていくつかのアプローチが用いられてきた。広く用いられているアプローチは、ラセミ混合物から望ましい化合物を選択的に沈殿することである。たとえば、Yoshioka等（米国特許３，８７９，４５１），Paven等（米国特許４，２５７，９７６），Halmos（米国特許４，１５１，１９８）そしてKameswaren（米国特許４，４５４，３４４）を参照。上記の方法は、ラセミ混合物を成功裏に分割した。というのは、混合物を光学的に純粋な試薬と処理すると、当初のラセミ化合物と違って、異なった物理性質を持つジヤステレオマーを生成したからである。こうして、分別結晶またはその他の物理的手法がジアステレオメリック化合物を分離するのに用いることができる。ジアステレオマーの分離は、クロマトグラフィーによってもまた実行できる。たとえば、Pollock等（J.Gas Chromatogr．３巻，１７４頁，１９６５年）は、ジアステレオメリックなアミノ酸をガスクロマトグラフィーで分割した。Mike s等（J.Chromatogr．１１２巻，２０５頁，１９７６年）は、ジアステレオメリックなジプペプチドを分割するのに液体クロマトグラフィーを用いた。ほとんどの場合、クロマト分離の間、光学的に純粋な試薬は固定相にあったが、それらは溶出剤中にもまた用いてもよい。Hara等（米国特許４，２９０，８９３）は、光学的に純粋な試薬および金属カチオンを含む水性溶出剤で処理されたラセミ混合物を分割するために液体クロマトグラフィを用いた。クロマトグラフ系で結果としてできるジアステレオメリックな錯体が、異なった分配係数を有するので分割が起こった。ここまで記載した全ての方法は、適切な光学的に純粋な試薬の入手に依存している。しかし、このような試薬は、しばしば入手できないかまたはそれらは使用するにはあまりにも高価すぎる。代替のアプローチとして、酵素的な分割手法か開発されてきた。多くの異なった種類の酵素が、合成的なスケールで立体異性体を分割するのに用いられてきた。これらは、加水分解酵素（特に、キモトリプジンのようなリパーゼそしてエステラーゼ）、リアーゼそしてオキシドレダクターゼ（たとえばアミノ酸オキシダーゼそしてアルコールレダクターゼ）を含む。一般に、分割に用いる酵素は、理想的には広い基質特異性を示すべきである。そうすると、広範囲の非天然型（アンナチュラル）な基質の反応の触媒作用をすることができ、そして１つの異性体の反応の、他を排除して、触媒作用をする高度の立体特異性が達成される。加水分解酵素（たとえば、リパーゼそしてエステラーゼ）は、高価な補因子（コファクター）を必要とせず、そして幾つかは有機溶媒に対してかなりの耐性を示すので、分割に使用するのにより魅力的な酵素の部類である。加えて、キラール化学は、キラール炭素を持つアルコール、カルボン酸、エステル、アミドそしてアミンを利用し、そしてカルボキシル基加水分解酵素は、このような種の反応に使う立体選択的触媒として望ましい選択である。たとえば、酵素処理がアミノ酸エステルのラセミ混合物の分割に応用されてきた。 Stauffer（米国特許３，９６３，５７３）およびBauer（米国特許４，２６２，０９２）を参照。酵素を遠心分離によって除去できるかまたはラセミ混合物が通されるカラムに充填できる固相支技体にくっつけることによって、酵素から反応生成物を分離することが容易になされてきた。酵素は、上記のアミノ酸以外の化合物類の分割にも試みられてきた。固定化リパーゼは、原則として、酵素的加水分解またはエステル転移反応により混合物を分割する。２相の加水分解反応の場合、関与する酸とエステルの異なった溶解性質のため、固定化された固体相の酵素、水性緩衝液そして溶媒と反応剤を含む水と混和しない有機相を含む混合物を分散、撹拌する必要があった。これは、比較的非効率的な工程である。酵素は、殺虫剤の光学異性体の分割に応用されてきた。たとえば、Mitsuda等（Eur.Patent Appl'n.Publ.ＮＯ．００８０８２７Ａ２、欧州特許公開）は、２相系（すなわち、水／有機分散系）でラセミの酢酸エステルと微生物および動物由来の立体選択的エステラーゼを接触させた。光学的に精製したピレスロイドについて関連する仕事で、Mits uda等（米国特許４，６０７，０１３）は、微生物エステラーゼを使用した。Kli barlov等（米国特許４，６０１，９８７）は、ラセミ２−ハロプロビオン酸を有機溶媒中で実施されたリパーゼ触媒エステル化反応によって分割した。光学的に精製された薬品の製造に応用された、先端的技術の酵素仲介分割の別の例も提供される。Ｌ−カルニチン製造の重要な中間体である光学的純粋な（Ｒ）−４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸の合成のための酵素的手法をＳｉｈ（米国特許４，５８４，２７０）は開示した。最近まで、天然に存在するＬ−酵素のみが知られており、そしてフォールド構造、酵素活性そしてキラール特異性を含むＤ−酵素の予想される特性が探求されていない問題として残っていた。要求されたことは、タンパク質の化学合成の分野で、結晶を形成するおよびその他の機能を発揮するのに充分な量の全体酵素のＤ−エナンシオマーを全合成することを可能にするのに足る進歩であった。発明の要約Ｄ−酵素と名付けられた新しい型の酵素が、キラール基質の反応の触媒作用をする能力を有することが発見された。したがって、本明細書に記載されるのは、酵素反応の触媒作用ができるポリペプチドを定義するアミノ酸残基配列を含んでなり、該アミノ酸残基は実質的にＤ−アミノ酸からなることを特徴とするＤ−酵素である。酵素反応は、アキラール（achiral）基質特異性またはキラール基質特異性を持つことができる。好適なアキラール基質特異的Ｄ−酵素は、スーパーオキシドジスムターゼまたはカルボニックアンヒドラーゼである。好適なキラール基質特異的Ｄ−酵素は、ＨＩＶ−１プロテアーゼである。本発明は、また次の工程から成ることを特徴とするキラル純粋な化学物質を製造する方法をも意図する。ａ）水性混合物中、第１の立体異性体基質と、該第１立体異性体基質を特異的にキラールな反応生成物に変換するＤ−酵素を反応させ、該反応は反応生成物を生成するのに充分な時間および反応条件で起こり、そしてｂ）前記混合物からキラールな反応生成物を単離し、それによってキラル純粋な化学物質を生成する。代替的な実施態様で、前記水性混合物は、少なくとも第１および第２の立体異性体を有する基質のラセミ混合物または部分的ラセミ混合物からなっていてもよいし、またその基質の第１立体異性体だけからなっていてもよい。本発明のＤ−酵素は、当業者に明らかな広い様々な恩典および利点を提供する。Ｄ−酵素は、試薬等級の工業薬品および薬学的に純粋な薬品として用いるキラル純粋な化学物質を効率的に製造する手段を提供する。加えて、Ｄ−酵素は、Ｌ −酵素の片われと共に、Ｘ線回折デ−タを用いる結晶学的構造を決定するためのラセミ結晶を生成するのに共結晶化混合物で使用することができる。さらに、Ｄ −酵素は、元来、天然Ｌ−アミノ酸特異的プロテアーゼによるタンパク質分解に耐性があるので、アキラールな基質特異性を有する治療上で投与されたＤ−酵素は、対応するＬ−酵素の代わりに利用することができ、そして血液または消化器官のようなタンバク質分解環境で延長された半減期を享受できる。こうして、治療的酵素の有効性が増加される。本発明のＤ−酵素は、天然物ライブラリー（library)のスクリ−ニングに用いることもできる。特に、Ｄ−酵素は、１つの天然物ライブラリー内で、キラール阻害剤を同定するために用いることができる。ある場合、天然物ライブラリーは、Ｄ−酵素に関して活性を有するが、対応するＬ−酵素に関して活性を有しないキラール阻害剤を含むかもしれない。同定されたキラール阻害剤のエナンシオマーの合成は、それから対応するＬ−酵素の阻害剤の合成へと導く。図面の簡単な説明本発明の開示の一部分を構成する図面は、次のとおりである。図１は、再構成イオンスプレ質量分析計（reconstructed ion spray mass spe ctroscopy）を用いる実施例２に記載するＨＩＶ−１プロテアーゼのＤ−およびＬ−酵素エナンシオマーの分子量決定を示す。分子量は、ダルトン単位で表され、そして実測スペクトルの相対強度のパーセント（％）のビークとして示されている。図１ＡはＬ−酵素で得られた分子量デ−タを示し、そして図１ＢはＤ−酵素で得られたデータを示す。図２は、実施例３に記載されるように、ＨＩＶＰＲ酵素Ｄ−およびＬ−エナンシオマーのキラール蛍光性（fluorogenic）基質のＤおよびＬ−エナンジオマーに対する比較酵素活性を示す。図２Ａは、Ｌ−基質とＬ−酵素、図２ＢはＤ−基質とＬ−酵素、図２ＣはＬ− 基質とＤ−酵素、そして図２ＤはＤ−基質とＤ−酵素を示す。データは、反応時間（分）を通して蛍光強度の随意の単位で測定された活性で表されている。図３は、Ｌ−そしてＤ−立体配座（夫々図面の左および右部分に示される）でのホモジメリック（同一二量体）ＨＩＶ−１プロテアーゼ分子のポリペプチド骨格をリボン表示したものを示す。矢印は、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端への方向を表す。図４は、Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］。ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体の全合成に用いる化学的セグメント連結反応（ligation）戦略を模式的に示す。図５は、官能基化されたペプチドセグメントを合成するのに用いる最適化した固相鎖組立て技法を模式的に示す。脱保護基反応およびカップリング反応は、単一のフローウオッショ（flow Wash,流し洗浄）段階で分けられる。図６は、２つの精製した、官能基化された、保護されていないＤ−［αＣＯＳＨ］ＨＩＶ−ＩＰＲ（１−５１）およびＤ−［Ｎ^a−ＢｒＣＨ₂ＣＯ］ＨＩＶ−１（５３−９９）セグメント、そして最終（４８時間）Ｄ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ −Ｓ）^51-52］₂ＨＩＶ−ＩＰＲ連結反応生成物（太線）を、流出速度１ｍｌ／分で、勾配溶出（４０−５５％Ｂ）したＶｙｄａｃ２１８ＴＰ５４１５カラムにかけたものを示す合成クロマトグラムである。図７は、Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］ ₂ ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体の合成での各段階反応収率を示す。図８は、ＨＰＬＣで精製した［（ＮＨＣＨ₂ＣＯＳＣＨ₂ＣＯ）^51-52ＨＩＶ− １ＰＲモノマーのイオンスプレイ質量スペクトルを示す。図９は、Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］ＨＩＶ−１ＰＲ連結反応生成物の逆相ＨＰＬＣ測定を示す。図１０は、Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］。ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体の遠紫外ＣＤ（円二色性）スペクトルを示す。図１１は、［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］₂ＨＩＶ−１ＰＲエナンシオマーの基質Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ・アミドのＤ −およびＬ−異性体に対する酵素活性を示す。発明の詳細な説明Ａ．定義アミノ酸残基ポリペプチドのペプチド結合での化学消化（加水分解）によって形成されるアミノ酸を指す。本明細中に記載されるアミノ酸残基は「Ｌ」または「Ｄ」立体異性体形のいずれかである。「ＮＨ₂」は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を指す。「ＣＯＯＨ」はポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基を指す。標準的ポリペプチド命名法（J．Biol．Chem，２４３巻，３５５２−５９頁，１９６９年に記載され、そして３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．米国特許法施行規則１、８２２（ｂ）（２）条に採用された）に従って、アミノ酸残基の省略記号は下記の対応表に示される。上記の記号は、Ｌ−そしてＤ−のアミノ酸残基両方に用いる。記号Ｘａａは、いかなる不明のまたはその他のアミノ酸残基に対して用いられる。しかしながら、符号Ｘａａは、本明細書中しばしばシステイン残基のイソステリック（活性中心に作用する）置換であるＬ−またはＤ−α−アミノ−ｎ−酪酸（ａｂａ）を指すのに用いられる。本明細書中、式で表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端への慣習的な方向において、左から右への配向を有していることに留意すべきである。加えて、「アミノ酸残基」なる用語は、前記対応表に挙げられたアミノ酸および修飾された、そしてありふれていないアミノ酸、たとえば３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２（ｂ）（４）（米国特許法施行規則）に挙げられ、文献として本明細書中に取入れられるものを含むように広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始めまたは終わりにおけるダッシュ（−）は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基のざらなる配列へペプチド結合されているか、またはＮＨ₂またはアセチル基のようなアミノ末端基またはＣＯＯＨのようなカルボキシ末端基へ共有結合されていることを示す。ラセミ混合物：ラセミ混合物は、本明細書中、少なくともいかなる割合での第１および第２立体異性体から成る混合物を指すように用いられる。この意味において、本明細書中用いる「分割」なる用語は、第１のラセミ混合物を第２そして第３の混合物に分離することを意昧する。そして、そこで第２および第３の混合物中の２つの立体異性体の割合は、第１ラセミ混合物の割合と異なっており、その割合は、１つの混合物でより大きく、そして必然的に他の混合物でより小さい。Ｂ．Ｄ−酵素組成物本発明は、酵素反応の触媒作用ができるポリペプチトを定義するアミノ酸残基配列を有する分子を含んで成る（から成る）Ｄ−酵素に関する。Ｄ−酵素は、実質的にＤ−アミノ酸から成るアミノ酸残基配列を有する。「Ｄ−アミノ酸」なる用語は、分子の比旋光度の方向を意昧しない。何故なら、あるアミノ酸は右旋性であり、ところが他のアミノ酸は左旋性であることがよく知られているからである。むしろ、その用語は、グリセルアルデヒドの可能な２つの立体異性体（Ｄ−グリセルアルデヒドおよびＬ−グリセルアルデヒド）と比較する慣習による絶対配置を表す。たとえば、Lehninger“Biochemisty，生化学”Worth Publishers，Ｉncウォース出版社，ニューヨーク市１９７０年，７６−７８頁を参照。こうして、異性体によって示される面偏光の回転の方向に拘わらず、立体化学的にＬ−グリセルアルデヒドに関係づけられる全ての立体異性体にはＬ−が割当てられ、そしてＤ−グリセルアルデヒドに関係づけられるものにはＤ−が割当てられる。トレオニンおよびイソロイシンの場合は、２つの立体化学的中心、すなわちアミノ酸Ｃα原子およびＣβ原子がある。本明細書中、採用されるＤ−トレオニンおよびＤ−イソロイシンは、両方のアミノ酸Ｃα原子においてＬ−トレオニンおよびＬ−イソロイシンの立体化学と反対の立体化学を有する。すなわちＤ−トレオニンおよびＤ−イソロイシンは、Ｌ−トレオニンおよびＬ−イソロイシンのそれぞれ完全な鏡像体である。グリシンだけが普通存在するアキラールなアミノ酸である。したがって、タンパク質または酵素が本明細書中Ｄ−またはＬ−タンパク質または酵素として示されたとき、このようなタンパク質または酵素から成る実質的に全てのキラールアミノ酸残基は、このように示されたキラリティーを有することを意昧する。タンバク質または酵素内にたとえばグリシンのようなアキラールなアミノ酸残基が存在することは、本明細書中用い得るキラリティーの割り当てに影響を与えない。天然界に知られているタンパク質の中の全てのキラールなアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。したがって、そのアミノ酸残基配列の中にＤ−配置キラールアミノ酸のみを有する（Ｄ−タンパク質と呼ばれる）タンパク質は、自然界において知られていない。１つの実施態様では、Ｄ−酵素が知られたまたは「天然」酵素のアミノ酸残基配列と対応する、そして好ましくは一致するアミノ酸残基配列を持つことが好適である。「天然」とは、酵素の配列を変更するように向けられた実験室的仲介の干渉なしに自然界から単離された酵素上に存在する配列を意昧する。「知られた」とは、天然酵素かまたは公知の酵素特性を有する酵素を作るためにアミノ酸配列を変更する配列修飾工程の産生物である酵素のいずれかを意昧する。科学文献に記載された多くの酵素は、ここでいちいち列挙するには数多すぎるが、それらがアミノ酸配列に於いてもはや天然の単離体の配列に対応しないがまだ酵素活性を保持するように天然アミノ酸残基配列の変異の対象となってきた。このように、別の実施態様に於いて本発明は、公知の酵素に対応するアミノ酸配列を有するＤ−酵素を意図する。Ｄ−酵素は、様々な酵素特性のいずれを持つこともできる。その酵素活性とは、１つまたはそれ以上の反応生成物を生成するために１つまたはそれ以上の基質間の反応の活性化エネルギーを減少させる能力を広義に意昧すると生化学の分野で、一般的に理解されている。本発明の目的のために、酵素基質特異性をキラールとアキラールとに区別することは有用である。キラール特異性とは、２つの立体異性体の１つだけの反応の触媒作用をする酵素の特異性を指す。アキラール特異性とは、酵素に対して認識依存不斉構造を呈しない基質と反応する酵素の能力を指す。すなわち、酵素−基質認識および触媒作用は、酵素の基質結合領域の中の不斉構造の存在に依存しない。言い換え、そして本発明がＤ−酵素のエナンシオマー選択性に関連する意味合いでは、アキラール基質はＤ−またはＬ−酵素のいずれでも触媒作用を受けることができる。何故なら、酵素結合および触媒作用が依存するアキラール基質には、不斉構造が存在しないからである。対照的に、キラール基質は、Ｄ−そしてＬ−酵素の一方または他方のみによって触媒作用を受ける。これは、基質の構造不斉が結合と触媒作用に関わるからである。キラールおよびアキラール反応生成物についてさらに区別をすることができる。たとえば、アキラール基質はキラールまたはアキラールな反応生成物に変換できる。もし、アキラール基質がキラール反応生成物に変換されるなら、反応生成物のキラリティーは酵素のキラリティーに、すなわちＬ−かＤ−酵素かに依存するだろう。同様に、キラール基質もキラールまたはアキラール反応生成物に変換される。好適なそして例示的な酵素、ＨＩＶ−プロテアーゼを含む多くの酵素はキラール特異性を発揮する。同様に、スーパーオキシドジスムターゼおよびカルボニックアンヒドラーゼを含むアキラール特異性を示す多くの酵素がある。したがって、１つの実施態様で、本発明は、キラール基質を反応生成物に変換する（反応の触媒作用をする）が、該キラール基質のエナンシオマー（立体異性体）は変換しないキラール特異性を有するＤ−酵素を意図する。１つの例として、本明細書中に記載されるのは、Ｄ−基質のみと反応し、そしてＬ−基質とは反応しないＨＩＶ−１プロテアーゼである。別の実施態様では、本発明は、Ｄ−酵素および対応するＬ−酵素両方ともアキラール基質を反応生成物に変換するアキラール特異性を有するＤ−酵素を意図する。１つの例は、スーパオキシドジスムターゼによって触媒作用を受けるスーパオキシドラジカルへの反応である。別の例は、カルボニックアンヒドラーゼによって触媒作用を受ける反応である。本発明のＤ−酵素は、いかなるサイズ（アミノ酸の鎖長）でもよく、そして、多くの同定された酵素で知られているように、多重サブユニットから成ることができる。多重サブユニットＤ−酵素は、全てＤ−タンパク質サブユニットから成る。酵素または単一のタンパク質サブユニット酵素を構成するタンパク質サブユニットは、サイズが広い範囲にわたる。典型的な酵素サブユニットは、鎖長で８０−５００アミノ酸残基である。しかし、約５０アミノ酸残基から４０００アミノ酸残基以上のより短いおよびより長いタンパク質も知られている。本発明は、１つの実施態様で、一般的にキラール有機酸、アルコール、アミン、エステル、アミド、ニトリル、ヒダントインおよびその他のキラール化合物のまたは立体選択的合成ラセミ混合物の分割のための工程にＤ−酵素を使用することに関し、その中でキラール前躯体（precursor）の１つの異性体を化学的に区別される光学活性な化合物に変換する反応の立体選択的な触媒作用をする能力のある酵素が用いられる。酵素は、合成されるまたは分割を受ける分子が結合できる不斉、かつ触媒的活性な部位（サイト）を含む限り、立体選択的触媒の役割によく適する。これらの酵素活性部位は、それら自身不斉であるから、与えられたラセミ基質の２つのエナンシオマーが相違して作用を受けることを許容し、そしてアキラールな前躯体からキラール生成物が生成されることを許容する。たとえば、エステルおよびアミドの化学官能基の加水分解または縮合の効果的に触媒作用をする多くの酵素が存在する。これらの酵素の全てではないが、多くは加水分解酵素または脱離酵素（リアーゼ）として知られる２つの主要なクラスのいずれかに属する。これは、“The Recommendations of the Commissio on Bi ochemical Nomenclature，Elsevier, Amsterdam, the Nomenclatur and Classif ication of Enzymes１７−２２頁，１９７２年；生化学命名法に関する委員会の推薦、酵素の命名法および分類、エルセヴイア社アムステルダム”に定義されている。本明細書中に用いる一連の番号に続く「Ｅ．Ｃ．」なる用語は、この委員会推薦に従う酵素の同定を提供する。本発明の実施に有用な酵素のタイプは、限定はされないが下記のカテゴリーの反応の触媒作用をする酵素を含む。酸とアルコールを生成するエステルの加水分解；酸とアルコールからエステルの生成（すなわち、エステル化反応）；エステル転移反応、すなわち異なったエステルおよび異なったアルコールとまたは酸を生成するエステルのアルコールまたは酸との反応：アミノ基転移反応（たとえば、α−ケト酸とアミノ酸との反応；酸およびアミンを生成するアミドの加水分解（ペプチド結合およびＮ−アシル化合物を含む）；酸そしてアミン（またはアミノ酸）からアミドの生成反応（ペプチドを含む）；カルバモイルアミノ酸そしてアミノ酸を生成するアミノ酸ヒダントインの加水分解；そして対応するアミドとカルボン酸を生成するニトリルの加水分解（そして特に、アミノニトリルのアミノアミドとアミノ酸への加水分解）。このような酵素の特定の例は、次の酵素を含むが、これらに限定されない。トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、レニン、ペプシン、パパイン、カルボキジペプチダーゼ、アミノペプチターゼ、ペニシリンおよびセファロスポリンアジラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、コレステロールエステラーゼ、そして哺乳類膵リパーゼおよびペプチダーゼ。好適なエステラーゼは、高い立体選択性および広い基質範囲のため、キモトリプシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．１）を含む。他のエステラーゼは、限定されないが、カルボキシルエスラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．１）、カルボキシペプチダーゼＡ（Ｅ．Ｃ．３．４．１７．１），アセチルコリンエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７）、ペプシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２３．１），トリプシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．４）そしてパパイン（Ｅ．Ｃ．３．４．２２．２）を含む。本発明に有用な天然の酵素および発表された修飾酵素についてのアミノ酸残基配列は、一般に発表文献およびコンピュ−ターデータベースから入手できる。好適なそして広く用いられているタンパク質配列のデータベースは、Geneseg， Ge nBank，EMBL， Swiss− Prot， PIRおよびGenPeptを含むが、これら全てはIente lligenetic（インテリジネテック）社（マウンテンビュー市，カリフォルニア州）から商業的に入手可能である。本発明に使用するのに適した多くの酵素についての完全な三次元構造は、Brookhaven Protein Data Bank（ブルックヘブンプロテインデータバンク），Brookhaven National Laboratories，Upton，ＮＹ（ブルックヘブン国立研究所，アップトン，ニューヨーク州）から入手できる。このデータベースに含まれる例示的なタンパク質を夫々のProtein Data Bank（プロティンデータバンク）コード（ＰＤＢ番号）とともに示すと、以下のようである。（１ｈｖｐ）：ｈｉｖ−１プロテアーゼ基質銘体；（２ｈｖｐ）：ｈｉｖ−１プロテアーゼ：（３ｈｖｐ）：（ａｂａ＝＝６７，９５＝＝）−ｈｉｖ−１プロテアーゼ，ｓｆ２単離体；（４ｈｖｐ）：ｈｉｖ−１プロテアーゼ阻害剤錯体，ｎ−ａｃｅｔｙｌ−※ｔｈｒ−※ｉｌｅ−※ｎｌｅ−ｐｓｉ（ｃｈ２−ｎｈ）− ※ｎｌｅ−※ｇｌｎ−※ａｒｇａｍｉｄｅ（ｍｖｔ−１０１）（ＳＥＱＩＤＮＯ，１）；（２ｃｙｐ）；シトクロムＣペルオキシダーゼ（ｅ．ｃ．１．１１．１．５）；（ｉｇｐｌ）：グルタチオンペルオキジダーゼ（ｅ．ｃ．１．１１．１．９）；（４ｃａｔ）：カタラーゼ（ｅ．ｃ．１．１１．１．６）；（７ｃａｔ）：カタラーゼ（ｅ．ｃ．１．１１．１．６）；（８ｃａｔ）：カタラーゼ（ｅ．ｃ．１．１１．１．６）；そして（２ｓｏｄ）：銅、亜鉛スーパーオキジドジスムターゼ（ｅ．ｃ．１．１５．１．１）。特に好適なものは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）類の抗酸化剤酵素である。ＳＯＤ酵素が好気生物体に広範囲に分布されるているので、ＳＯＤの多くの単離体は多くの種について報告されてきた。最近、文献調査によると、哺乳類、非哺乳類、細菌、酵母および植物に２６の異なったＳＯＤ酵素の配列が記載されている。これらは、下記のＳＯＤを含む。ヒトＥＣ−ＳＯＤ（Hjalmarsso n等，Proc．Natl．Acad，Sci．ＵＳＡ，８４巻，６３４０−６３４４頁１９８７年），ヒトＳＯＤ(Sherman等，Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ，８０巻，５４６５ −５４６９頁そしてSchneider等，Cell，５４巻，３６３−３６８頁，１９８８年）、ウシＳＯＤ（Steinman等，J.Biol．Chem．，２４９巻，７３２６−７３３８頁，１９７４年），ウマＳＯＤ（Lerch等，J.Biol．Chem．，２５６巻，１１５４５−１１５５１頁，１９８１年），マウスＳＯＤ（Getzoff等，Proteins：S truct．Func．Genet．５巻，３２２−３３６頁１９８９年），ブタＳＯＤ（Schi ninａ等，FEBS Lett，１８６巻，２６７−２７０頁１９８５年），ウサギＳＯＤ（Reinecke等，Biol．Chem．３６９巻，７１５−７２５頁，１９８８年），羊ＳＯＤ（Schinina等，FEBS Lett．，２０７巻，７− １０頁１９８６年），ラットＳＯＤ（Steffens等，Z．Physiol．Chem．，３６７巻，１０１７−１０２４頁，１９８６年），ショウジョウバエＳＯＤ（Nucleic Acids Res．，１７巻，２１３３−２１３３頁，１９８９年），アフリカツメガエルＳＯＤ（Eur．J．Biochem．１９８９年），ブルセラ菌ＳＯＤ（Beck等Bioch emistry ，２９巻，３７２−３７６頁，１９９０年），カウロバクター菌（caulo bacter）ＳＯＤ（Steinman等 J．Biol．Chem．，２６０巻，９５５９−９５６６頁１９８５年），フォートバクテリウム（photobacterium）ＳＯＤ（Steffens 等，Ｚ．Physiol．Chem．，３６４巻，６７５−６９０頁，１９８３年），往血吸虫ＳＯＤ（Simorda等，Exp．Parasitol．６７巻，７３−８４頁，１９８８年），酵母ＳＯＤ（Steinman等，J．Biol．Chem．２５５巻，６７５８−６７６５頁，１９８０年），カリフラワーＳＯＤ（Steffens等，Biol．Chem．Hoppe−Sey ler．３６７巻，１００７−１０１６頁，１９８６年），キャベツＳＯＤ（Steff ens等．Physiol．Chem．３６７巻，１００７−１０１６頁，１９８６年），トウモロコシＳＯＤ（Cannon等，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ，８４巻，１７９−１８３頁，１９８７年），エンドウＳＯＤ（Scioli等，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ，８５巻７６６１−７６６５頁，１９８８年），ホウレンソウＳＯＤ（Kitagawa等，J．Biochem．，９９巻，１２８９−１２９８頁，１９８６年），トマトＳＯＤ（Plant．Mol．Biol．,１１巻，６０９− ６２３頁，１９８８年）。これら色々のＳＯＤのいずれも本発明のＤ−酵素としで使用するのに適する。カルボニックアンハイドラーゼＣは、Ｄ−酵素の調製に適切な別の好適な酵素である。カルボニックアンハイドラーゼＣは、二酸炭素と水を組合わせ重炭酸塩および水素イオンを生成する反応の触媒作用をする。カルボニックアンハイドラーゼＣの配列は、Henderson等Biochim．Biophys．Res．Comm．，５２巻，１３８８頁，１９７３年，Lin等J．Biol．Chem．，２４９巻，２３２９頁１９７４年に記載されている。キラール基質と反応し、そしてそのため本発明のＤ−酵素として有用なその他の光学特異的酵素は、米国特許５，０７７，２１７、５，０５７，４２７、４，８００，１６２および４，７９５，７０４に広く収載されてきた。これらの文献は、特に参考文献として本明細書に組入れられる。Ｃ．Ｄ−酵素の合成本発明のＤ−酵素は、ポリペプチドの分野の当業者が利用できるいかなる手段によっても合成できる。ポリペプチドを合成するのに用いる正確な方法は、本発明のＤ−酵素の基本構造に重要とは考えられない。そして、そのため、特に技術が進歩し、ポリペプチドを合成し、そして組立てる新しい手法が出てくるので、該方法は限定的であるとは考えられない。ポリペプチド合成の好適な手段は、（１）たとえば、段階的合成のような通常の化学合成そして（２）ポリペプチド組立てブロックの化学連結による組立てを含む。１００以上のアミノ酸残基を有するポリペプチドを製造するのに、通常の化学（段階的）合成方法を採用することは現在、実用的ではないと考えられている。他方、それより数倍大きいポリペプチドを組立てるのに化学連結が用いられている。したがって、１００アミノ酸残基以上のＤ−酵素のために、化学的または酵素的連結がこのような生成物を作る現在ある唯一つの実用的な手段である。本明細書中、記載するのは、１０−１００ｍｇの量のＤ−およびＬ−ＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素を合成する連結戦略（liga tion strategy）である。現在は利用できないが、Ｄ−タンバク質を用いる製造されたタンパク質合成装置（apparati）は、蛋白翻訳機構にＤ−アミノ酸を組込む問題を解決するだろう。それによって、メッセンジャ−ＲＮＡおよびＤ−アミノ酸の組換えＤＮＡ発現を用いるＤ−酵素の合成が可能になる。通常の段階的合成たとえば、固相Merrifield−型合成において、アミノ酸の段階的付加のような合成化学的手法が純度、抗原特異性、望ましくない副成物を伴わないこと、製造の容易さ等の理由から好適である。Ｌ−タンバク質および酵素を合成するのに利用できる多くの手法について優れた総説が、次の文献に見いだされる。Steward等“Solid PhasePeptide Synthesi s固相ぺプチド合成”，W．H．Freeman Co．，ダブリュ・エッチフリーマン社，サンフランシスコ市，１９６９年，Bodanszky等“Peptide Synthesisペプチド合成”，JohnWiley ＆ Sons，Second Edition，ジョンウイリーアンドサンズ社第２版１９７６年，Meienhofer“Hormonal Proteins and Peptides ホルモン性タンパク質およびペプチド”，第２巻４６頁，Acadenic Press（New York）、アカデミックプレス社（ニューヨーク市）１９８３年，．Kent Ann Rew Biochem ，５７巻，９５７頁，１９８８年固相ペブチド合成のために，そして Schroder等“The Peptidesペプチド”１巻，Academic Press（New York）１９６５年，ペブチドアカデミックプレス社（ニューヨーク市）古典的な溶液合成にために”。これら文献の各々は、参考文献として本明細書中に組入れられる。このような合成で用いることのできる適当な保護基は、上記の文献、そしてMcOmie “Protectice Groupsin Organic Chemistry 有機化学における保護基，”Plenum Press，New York，プレナム出版，ニューヨーク市，１９７３年に記載されている。後者の文献も参考文献として、本明細書中に組入れられる。一般的に、意図する固相合成法は、成長するペプチド鎖に１つまたはそれ以上のアミノ酸残基または適当に保護されたアミノ酸残基を逐次的に付加することからなる。通常、第１のアミノ酸残基のアミノ基かカルボキシル基のいずれかが適当な選択的に除去できる保護基によって保護される。リジンのような反応性側鎖を含むアミノ酸については、異なって選択的に除去できる保護基が利用される。Ｄ−酵素の合成には、通常のＬ−アミノ酸よりはＤ−アミノ酸または保護されたＤ−アミノ酸が利用される。ポリペプチド合成に適するＤ−アミノ酸は、Pept ide Institute（Osaka，Japan）蛋白研究所（大阪，日本）； Peptide Internationcl（Louisvillｅ，ＫＹ）ペプチドインターナショナル（ルイスウ゛イル市，ケンタッキー州）；Bachem Bioscience（Philadelphia，ＰＡ）バーケムバイオサイエンス（フィラデルフィア市，ペンシルベニア州）； Bachem California（Torrance，ＣＡ）バーケムカリフォルニア（トーランス市，カリフォルニア州）から商業的に入手できる。固相合成を例にとると、保護されたまたは誘導体化されたＤ−アミノ酸は、その保護されていないカルボキシル基またはアミノ基で不活性な固体支持体に取付けられる。アミノ基またはカルボキシル基の保護基は、それから選択的に除去され、そして適当に保護された補完的な基（アミノ基またはカルボキジル基）を鎖長に有する次のＤ−アミノ酸が、固体支持体に既に取付けられた残基とアミド結合を形成するのに適切な条件下、混合され、そして反応される。アミノ基またはカルボキシル基の保護基は、この新しく付加されたＤ−アミノ酸残基から取り除かれ、そして次のＤ−アミノ酸（適当に保護された）が添加され、そして同じように繰返される。全ての所望のＤ−アミノ酸が適切な配列に連結された後で、残っているいかなる末端そして側鎖保護基（そして固体支持体）も逐次的または同時に取り除かれ、最終ペプチドを与える。連結方法ポリペプチドの化学連結法は、最近Kentによる米国特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．０７／８６５，３６８，１９９２年４月８日出願に記載されている。その開示は、参考文献として本明細書中に組入れられる。１００アミノ酸残基またはそれ以上の鎖長を有するＤ−酵素について、この手法は好適である。この方法で、２つのポリペプチドが先ず合成され、そして化学連結に適合する末端を含む。段階的化学合成、そして夫々固相樹脂から開裂した後、２つのポリペプチドは混合され、適合する末端を接合するべく反応させられ、そして２つのポリペプチドから成るより大きな直線状ポリペプチドが生成する。様々なＤ−ＨＩＶ−１プロテアーゼの合成を記載する実施例１に、Ｄ−酵素の例示的な段階合成が詳しく書かれている。実施例５は、Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］₂ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体の連結型合成例を開示する。実施例５のＤ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ− Ｓ）^51-52］₂ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体は、実施例１のＤ−ＨＩＶ−１プロテアーゼと機能的に等価である。同様な合成が、Ｄ−スーパーオキジドジスムターゼ，カルボニックアンハイドラーゼまたは本明細書中記載される他のＤ−酵素のいずれの合成にも応用できる。Ｄ．スクリーン化学ライブラリの方法薬学的に有用な化合物を同定する最も普通の方法は、化学ライブラリをスクリーニングすることである。このようなスクリーニングの徹底性は、Ｌ−酵素およびＤ−酵素の両方を利用ずることにより一段と増す。自然界から単離された天然物ライブラリは、幾十万の化合物から成る。化学ライブラリは、特定エナンシオマーのキラール合成またはラセミ体のノンキラール合成によって作られる。新しい薬品候補を探求して、このようなライブラリーが特定のアッセイに活性を示す化合物を同定するためにスクリーンされる。多く（の例で、標的分子は酵素または酵素系であり、そして探索はこのような酵素または酵素系の特定の阻害剤またはコファクターとして働くことができる薬品候補を同定することに向けられる。ひとたび、候補化合物が特定の治療的に関係する酵素の阻害剤として同定されると、このような候補化合物の類似体が、活性と他の望ましい性質を改善するためにデザインそして合成される。多くの場合、キラール特異性が、活性基質、補因子および阻害剤の必然的な属性である。しかしながら、本明細書中、基質、コファクターおよび阻害剤のキラール特異性は、標的酵素のキラリティーに、依存することを開示する。したがって、標的酵素は、しばしば与えられた基質、補因子および阻害剤の活性および不活性エナンシオマーを識別できる。天然物ライブラリーの成分要素は、しばしばランダムなキラリティーを示し、そして標的酵素に本来の関係を有する傾向がある。したがって、もしライブラリー内に単一のエナンシオマーが存在するなら、このようなエナンシオマーのキラリティーは、与えられた標的酵素に対して正しい（活性）なエナンシオマーであると同程度に間違った（不活性な）エナンシオマーでありそうである。もしライブラリーが標的酵素の自然型の（Ｌ）−配置のみに対してスクリーンされ、そしてライブラリーの構成要素がラセミ体でないと（すなわち、それらがキラールである）、ライブラリーが不活性なエナンシオマーのみを包含するというかなりのチャンス（５０／５０）がある。天然物ライブラリーをＬ−酵素と対応するＤ−酵素両方に対してスクリーニングすることがこのようなライブラリーから同定される候補化合物の数をほぼ倍増できることを、本発明は教示する。Ｄ−酵素に対して活性であると同定されたいかなる候補化合物も、対応するＬ −酵素に関して不活性であるだろう。しかしながら、Ｄ−酵素に関して活性である候補化合物の構造分析は、対応するＬ−酵素に関して活性である候補化合物の構造を予言する。すなわち、Ｄ−酵素に関して活性があると見いだされた化合物のエナンシオマーは、対応するＬ−酵素に関して対応する活性を有することが期待できる。したがって、もしライブラリーが酵素のＬ−およびＤ−型の両方に対してスクリーンされたら、化学品または天然物ライブラリーから肯定的に同定される候補化合物の数は、かなり増加される。たとえば、Ｌ−およびＤ−ＨＩＶプロテアーゼ両方のプロテアーゼ活性の阻害に関して天然物ライブラリーをスクリーニングすると活性ある阻害剤として同定された候補薬品の数が顕著に増加するはずである。上記の概念は、受容体活性、すなわちタンパク質受容体に関してアンタゴンスト（拮抗薬）またはアゴニスト（作動薬）に関しての天然物のライブラリーをスクリーニングすることに等しくあてはまる。天然物そして／または化学ライブラリーが有用的にスクリーニングされるタンバク質受容体の中には、次のものが含まれる；ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａおよびＬＦＡ−１，Ruoslahti等Science，２３８巻，４９１−４９７頁，１９８７年；ＣＳＡＴ，Horwitz等J．Cell Biol．１０１巻２１３４頁，１９８５年；ＶＬＡ−２，Nieuwenhuis等Nature，３１８巻，４７０頁，１９８５年；ＣＲ３Complement Receptor，Wright等，ＰＮＡＳ，８４巻，１９６５頁，１９８７年；ＣＲ２ Complement Receptor，Nemerow等J．V ivol．５５巻，３４７６頁，１９８５年；ＣＤ４Ｔ細胞受容体Guyader等，Natur e，３２０巻，６６２頁１９８７年；ＦＲＰ受容体Yu等，Nature，３３０巻，７６５頁，１９８７年；アポリポタンパク質受容体，Yamada等J．Clin．Invest，８０巻，５７０頁，１９８７年；インターロイキン受容体，Dower等Immunology Today，８巻，４６頁，１９８７年；Ｆｃ受容体，Anderson等，J．Immunol．１３８巻，２２５４頁，１９８７年；ソマトスタチン受容体Kim等J．Biol．Chem．２６２巻，４７０頁，１９８７年；ＰＤＧＦ受容体Keating等J．Biol．Chem．２５２巻，７９３２頁，１９８７年；そしてトランスフェリン受容体，Kohgo等Blood，７０巻，１９５５頁，１９８７年。本発明の方法に従って、スクリーンされうる結合部位を有するその他のタンパク質は、次の受容体を含む。インシュリンについて、インシュリン受容体結合部位，firal hemaglutininタンパク質について、レオウィルス受容体部位、フィブリノーゲンＡアルファ（figrinogen A alpha）についてのフィブリノーゲン受容体部位、甲状腺ホルモン受容体部位αそして、βアポＥ（Apo E）についてＬＤＬ受容体結合部位、アポＡＩ（Apo AI）について脂質Ａ（lipid Ａ）結合部位，レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（LCAT）結合部位，そして、フィブリノーゲンＤ−３０についてのＭａｃ−１インテグリン受容体結合部位等である。Ｅ．キラール純粋な化合物を製造する方法別の実施態様において、本発明のＤ−酵素をキラール純粋な化学物質の製造に用いる方法を本発明は意図する。本明細書中、用いられるキラール純粋な化合物とは、実質的にその立体異性体を含まない分子を指す。本方法は、様々な方法で実施することができる。基質のラセミ混合物に対して、Ｄ−酵素を反応させ、そのラセミ混合物中に基質異性体の内の１つを残し、そして他の基質異性体を生成物に変換することによって、単一のキラール純粋な化学物質を製造することができる。この方法において、望ましいキラール純粋な化合物は反応性生成物で有り得るし、または、Ｄ−酵素の作用によって汚染する異性体を含まない、ラセミ混合物中に未反応のまま残された基質異性体であり得る。このようにして、この実施態様では、本発明は、次の工程（ステップ）から成るキラール純粋な化学物質を製造する方法を意図する：（ａ）水性混合物中で、第１立体異性体をキラールな反応性生物に特異的に変換するＤ−酵素と、第１立体異性体を反応させ、そして（ｂ）前記混合物からキラール反応生成物を単離し、それによってキラール純粋な化学物質を生成させる。この実施態様の別の形では、前記水性混合物は少なくとも第１および第２の立体異性体を有するラセミ混合物から成る。反応は、Ｄ−酵素と基質を混合し、そして酵素触媒反応を進行させるために、反応混合物を適切な反応条件にさらすことによって開始される。Ｄ−酵素にとって、これらの条件は、触媒作用を受けるべき特定の反応化学およびその下で酵素が活性である条件に依存する。Ｄ−酵素のための反応条件は、好ましくは、対応するＬ−酵素による異性体の基質の対応する反応のために最適に用いられるものと同じである。好ましい反応条件は、所望の反応に対して最大の酵素活性、そして最小の望ましくない副反応等をもたらす温度、そして水性緩衝液である。単離工程は、（ａ）工程で生成された反応混合物からキラール純粋な化学物質を分割するために提供されるいかなる化学操作方法によっても達成することができる。例示的な単離操作方法は、化学者のよく知るところであり、そして溶媒抽出、クロマトグラフィー、選択的結晶化、蒸留などを含む。関連ある実施態様として、本発明は、次の工程から成るキラール純粋な化学物質を製造する方法を意図する：（ａ）水性混合物中、少なくとも第１および第２の立体異性体を有するラセミ混合物と、第１の立体異性体を反応生成物に特異的に変換するＤ−酵素とを反応させ、そして（ｂ）前記混合物から第２の立体異性体を単離し、それによってキラール純粋な化学物質を生成する。この反応は、実質的に全ての第１の立体異性体をキラール反応生成物に変換するのに充分な時間および反応条件の下で実施される。この後者の実施態様において、当初のラセミ混合物から望ましくない立体異性体を取り除くことによって、キラール純粋な化学物質が分割され、そして残っている未反応の立体異性体゛が単離されてキラール純粋な化学物質を与える。Ｄ−酵素を用いるキラール純粋な化学物質の化学合成は、均一または不均一な水性反応環境で実施することができるし、またＤ−酵素が固相にある酵素反応器において、または溶媒またはＤ−酵素が反応体または生成物のいずれかから分離されてしまう膜反応器中で実施することができる。このような固相酵素反応器および膜酵素反応器さらにそれらの使用方法については、米国特許５，０７７，２１７、５，０５７，４２７、４，８００，１６２および４，７９５，７０４に詳し．く記載されている。これらの文献は、特に参考文献として本明細書中に組入れられる。Ｆ．ラセミ混合物の共結晶化の方法１つの実施態様において、本発明はタンパク質の三次元構造を決定するための結晶のＸ線回折パターンを形成するために、Ｄ−酵素を使用することを意図する。結晶化したタンパク質を製造し、そしてＸ線結晶学的な技術によって結晶構造を分析する方法は、周知である。たとえば、Stout等“X-Ray Structure Determi nation：A PracticalGuide，Ｘ線構造決定，実用的ガイド”， Macomillan，New York，マクミラン社ニユーヨーク市，１９６８年そして、Mill er J．Mol．Biol，２０４巻，２１１−２１２頁，１９８８年等の教示を参照のこと。これらの文献は、本明細書中、参考文献として組込まれる。好適な実施態様において、本発明は、実施例１に記載するように、合成されたＤ−およびＬ−ＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素の共結晶化を意図する。Miller等（上述）に記載されている蒸気拡散結晶成長方法によって得られる結晶は、結晶中ＨＩＶ−１プロテアーゼのエナンシオメリック型（Ｄ −そしてＬ−）が存在するため、ラセミ結晶を形成し、通常のＸ線回折方法を用いてＨＩＶ−１プロテアーゼの三次元構造を解くのに使用される。このような結晶構造は、さらに、たとえばプロテアーゼの阻害によってＨＩＶ −１感染の治療のために有用なＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤のモデルとするのに有用でもある。Ｄ−およびＬ−ＨＩＶ−１プロテアーゼ調製液の共結晶化は、高精度のＸ線回折研究のための中心対称（Centrosymmetric）結晶を生成することができる。これは、エイズ治療法のためのドラッグデザイン研究において、広範囲な有用性を見いだすデータを提供する筈である。この目的のために、１００ｍｇの量で、合成品の抽出、精製、そしてフォールディングの間に自已分解を併発することなしに、酵素の各々のエナンシオモルフ（enantiomorph）を作ることが必要である。本発明者らは、保護されていないペプチドセグメント、そしてそれはＧｌｙ⁵¹− Ｇｌｙ⁵²間の自然型ペプチド結合の置換として、チオエステルを含むものであるが、それらの方向性化学連結（directedchemical ligation）によって合成される１つのＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体が完全な活性を有することを見いだした。このセグメント縮合戦略は、それらの合成の間に酵素による自已消化の可能性をほとんどさける。Ｇ．治療方法本発明は、投与されるべき治療組成物中、Ｌ−酵素が通常活性成分である所の治療方法において、治療的に有効量のＤ−酵素を哺乳類またはヒトに投与することを含む治療方法を意図する。対応するＬ−酵素をＤ−酵素によって置換することにより、治療的酵素は本明細書中、記載したＤ−酵素の恩典を獲得する。これらは、プロテアーゼに対する耐性による有効的な半減期の増加および減少した免疫認識を含む。本発明のＤ−酵素として、治療方法に用いる酵素は、治療的応用を提供するそして、アキラールな基質を有する既知の一次アミノ酸残基配列から成る酵素のどのような数からも誘導することができる。特に、抗酸化剤酵素は、有効治療的半減期を増加するというＤ−酵素の形であるための恩典を受ける治療的適用を有する。抗酸化剤は、抗炎症剤として作用する。既知の構造の薬学的に重要な抗酸化剤酵素は、スーパーキシドジスムターゼ、カタラーゼおよびグルタチオンパーオキジダーゼである。これらの酵素は、虚血後負傷の防止および炎症疾患の制御に関与する。Wilsman等、 “Superoxide and Superoxide Dismutase inChemistry，Biology and Medicine スーパオキシドおよびスーパオキシドジスムターゼ化学、生物学および薬品”Ro tilio，Ed，ElsevierScience，Amsterdam Publishers１９８６年、ロティリオ編エルセビィアサイエンス、アムステルダム出版。ＳＯＤの場合に例証されるように、これらの酵素は増加した循環半減期から思典を受けるだろう。１．スーパオキシドジスムターゼスーパオキシドラジカルの分子酵素および過酸化水素への変換の触媒作用するＳＯＤ酵素は酸素を利用する生物体で遍在する。ＳＯＤ酵素の不均化（dismutation ）反応は、遊離ラジカルによる組織損傷を防止するのに重要である。実際、変形性関節症を含む炎症疾患を軽減するのにヒト細胞内ＳＯＤ（ＨＳＯＤ）が有効であることはヒトでの臨床試験によって立証された。Wilsman、“Superoxide and SuperoxideDismutase in Chemistry，Biol ogy and Medicineスーパオキシドおよびスーパオキシドジスムターゼ、化学、生物学および薬品、エルセビィア社”，Elsevier，５００−５頁，１９８６年を参照。加えて、ＳＯＤ酵素はウィルス感染に治療的可能性を有することを動物実験が示唆している。Oda等、Science，２４４巻，９７４−６頁，１９８９年を参照。ＳＯＤ酵素は、アロキサン糖尿病（Grankvist等 Nature，２９４巻，１５８頁，１９８１年）を予防しそしてある種の癌の転移（ヨーロッパ特許出願０３３２４６４）を防止するのに関係があるとされてきた。したがって、１つの実施態様で、生体内または生体外で、酸素遊離ラジカルによって引き起こされる組織損傷を軽減する方法が本発明のＤ−スーパオキシドジスムターゼ（Ｄ−ＳＯＤ）酵素を用い、本発明によって意図される。ヒト組換えＳＯＤは、実験モデルで再濯流（reperfusion）の直前に循環系に注入されたとき、虚血組織を保護できる。Ambrosio等Circulation７５巻，２８２頁，１９８７年。グルコサミノグルカンで覆われた組織である内皮への傷害が虚血／再濯流傷害の主な結果である。これはバリア−（barrier）機能の損失による浮腫形成を起こし、そして内皮に対する血小板付着を促進する。ＳＯＤの保護作用は、スーパオキシドアニオンの捕集による。分解により強力な細胞毒性酸化剤を生成するため毒性であるパーオキシニトリルの形成を防ぐことにより、ＳＯＤは生体内でも内皮を保護できる。Beckman等、Proc，Nat l．Acad．Sci．USA ８７巻，１６２０−１６２４頁，１９９０年。スーパオキシドアニオンが関与する虚血後傷害は心臓、腸、肝臓、膵臓、皮膚、骨格筋、腎臓に観察されたが、他の器官にも多分起こるであろう。McCord，Fed．Proc．４６巻，２４０２−２４０６頁，１９８７年。化学的にアルブミンに連結または共役されたＳＯＤは、増加された「生体内」半減期、すなわちより遅いクリアランスを示す。このような共役されたＳＯＤは、虚血後再濯流による不整流を阻止することに関して共役していないＳＯＤよりも優れていることが示された。Watana be等、Biochem，Pharmacol．３８巻，３４７７−３４８３頁，１９８９年。Ｌ− ＳＯＤの半減期より大きい半減期を有するＤ−ＳＯＤ製剤は、虚血後の傷害を予防したりまたは軽減するためにＳＯＤを使用しやすくする。ＳＯＤはまた変形性関節炎およびリュウマチ性関節炎のようないくつかの炎症疾患に有効であることが証明された。関節外の内炎症プロセス（たとえば、鍵炎、鍵鞘炎、滑液包炎、外土顆炎、関節周囲炎）において局部的にＳＯＤを浸潤すると有効であることも証明された。ＳＯＤ投与による改善は、Peyronie病およびDupuytren拘縮においても観察された。Wilsman Rotil io編、“Superoxide and Superoxide Dismutase inChemistry，Biology and Me dicineスーパオキシードおよびスーパオキシードジスムターゼ、化学、生物学および薬品”，Elsevier１９８６年、エルセビィア社。これらの炎症疾患と同様に呼吸性困難症候（respiratory distress syndrome）に対しても増加した半減期を有する細胞表面を標的にしたＳＯＤは有用な薬であろう。臓器移植もこのような改善されたＳＯＤから思典を受けるであろう。さらに加えて、組織を標的としたＳＯＤは抗癌の放射線および化学療法の毒性二次効果を軽減するはずである。薬（抗生物質および抗癌剤）に誘起された腎炎もまたより効力のあるＳＯＤによって軽減できる。上記の治療応用面で、Ｄ−ＳＯＤはＬ−ＳＯＤを置換しそれを凌駕するであろう。こうして、本発明は、治療的有効量のＤ−ＳＯＤ酵素を含む生理学的に耐えられる組成物を哺乳動物に所望の効果を達成するよう計算され予め決定された量で投与することからなる哺乳動物における生体内でスーパオキシドラジカルを捕捉する方法を意図する。たとえば、自已免疫病、関節性炎症等の間または多量の細胞死および酸化剤の放出を起こす虚血組織に血液または血小板を再び導入する再灌流手法の間（たとえば外科手術の間または後で、創傷、血栓、または移植臓器または感染が起こった後で）のように炎症によって誘発された組織損傷を示すヒト患者にスーパオキシドラジカルを捕捉するための薬剤として用いるとき、約３０００Ｕ／ｍｇの特異活性を有するＤ−ＳＯＤ酵素は、ヒト成人あたり１〜５０ｍｇ、好ましくは５〜２０ｍｇ，デリバー（deliver）するのに充分な量で投与される。好ましい投与量は、代替的には約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ，好ましくは約１．０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは少なくとも約２μｇ／ｍｌそして通常５〜１０μｇ／ｍｌの血清濃度を達成するのに充分な量と言い換えることができる。治療用組成物に用いるスーバオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性をもつＤ− ＳＯＤ酵素は、典型的にはタンバク質１ｍｇあたり約２００〜５０００ユニット（Ｕ）の酵素活性を有する。ＳＯＤ活性のための酵素アッセイはよく知られている、そしてＤ−酵素中のＳＯＤ活性を標準化するための好適なアッセイはMcCord等によって記載されているものである（J.Biol.Chem ．２４４巻，６０４９頁，１９６９年）。たとえばリュウマチ性関節炎、腱炎、滑液包炎などのような炎症状態を治療するために約１〜２０ｍｇの投与量、好ましくは約４〜８ｍｇがヒト成人あたり、１週間、関節内に投与される。ある場合には、患者の体重１ｋｇあたり２０ｍｇもの量が投与することができる。再灌流または心筋損傷を治療するためには、体重ｋｇあたり５ｍｇの投与量が好ましく、静脈内に投与される。Ｄ−ＳＯＤ酵素を含む治療的組成物は、関節炎の場合には、通常的にたとえば単位容量（ユニットドース）の注入によって静脈内にまたは関節内に（ｉａ）投与される。本発明の治療組成物に関して用いるとき、「単位容量」という用語は患者に対する単一の用量形態として適している物理的に別々の単位を指す。各々の単位は必要な希釈剤（すなわち担体またはビークル）と共働して望ましい治療効果を与えるよう計算された予め定められた量の活性物質を含む。本組成物は投薬製剤に適合する様式でそして治療的に有効な量で投与される。投与されるべき量は治療されるべき患者、活性成分を利用する患者の免疫系の能力、そして望ましい治療効果の度合に依存する。投与されるのに要する活性成分の正確な量は医師の判断によりそして各々の患者に対して特有である。しかしながら、全身投与のための適当な投与量範囲は本発明書中開示され、そして投与経路に依存する。最初の投与そして２度目からの注射のための適当な投与計画もまた変わり得る。しかし、最初の投与とそれに続く注射またはその池の投与法により同一投与量を１時間またはそれ以上の時間の間隔で繰返し投与することが典型的である。代替的には、生体内治療のために定められた範囲での血中濃度を維持するのに充分な連続的静脈注入が考えられる。治療的Ｄ−ＳＯＤを用いる本方法およびそのために有用なＳＯＤを含む組成物に直接的に応用できる別の例示的なＳＯＤの治療的適用は、米国特許５，０８４，３９０、５，００６，３３３、そして４，６５６，０３４に記載されている。これらの文献は参考文献として特に本明細書中に組入れられる。Ｄ−ＳＯＤについて前述した改善された治療方法と全く同様に、多くのさもなければ満足すべき酵素薬剤は生体内においてそれらの寿命が短いために限られた治療用途しか見い出されないことが予想される。こうして、提案された薬剤の有用な寿命を延長する簡便的な方法が望まれている。そしてそれは本発明に従うＤ−酵素の製剤によって提供される。本明細書中の方法は、少なくとも変更されていない薬剤の活性と比較できる生物活性を有する酵素薬剤のＤ−酵素の変形を調製することを許す。Ｈ．治療組成物本明細書中に記載される化合物および基（たとえばＤ−アミノ酸残基）多くはお互いに平衡状態にあるいくつかの形態、特にかわり得るようにプロトン化された形態を有する。当業者が理解するように、本明細書中、化合物または基の１つの形態を表記することはお互いに平衡状態にあるそれらのすべての形態を包含することを意図する。本明細書中、「μＭ」はマイクロモル、「μｌ」はマイクロリットル、そして「μｇ」はマイクログラムを意昧する。本発明の治療組成物は、生理学的に耐えうる担体とともに本明細書中記載されるように、活性成分としてそれらに溶解または分散されたＤ−酵素を含む。本明細書中、「薬学的に許容できる」、「生理学的に耐え得る」そしてそれらの文法的な変形は、組成物、担体、希釈剤そして試薬に関する限り、交換可能的に用いられ、そして物質が吐き気、めまい、胸やけ等のような望ましくない生理学的影響を与えることなしに哺乳動物に投与することができるということを表す。その中に溶解または分散された活性成分を含有する薬理学的組成物を調製することは当該分野でよく知られている。典型的には、これらの組成物は液状溶液または懸濁液のいずれかの注射可能なものとして調製される。しかしながら、液状の溶液または懸濁液に適する使用前は固体形態も調製することができる。製剤は乳化されることもできる。活性成分は、薬学的に許容されそして活性成分と適合する賦形剤と混合することができる。適当な賦形剤はたとえば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノーフレなどおよびそれらの混合物である。加えて、所望ならば、組成物は活性成分の有効性を増す補助的な物質たとえばウェッティング（wetting）剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量を含むことができる。本発明の治療組成物は、成分の薬学的に許容される塩をその中に含むことができる。薬学的に許容される塩類はたとえば、塩酸、リン酸のような無機酸または酢酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸とから形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基とともに形成される）を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩類はたとえば、苛性ソーダ、苛性カリ、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄のような無機塩基そしてたとえばイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基から誘導されることもできる。生理学的に耐え得る担体は当該分野でよく知られている。液状担体の例は、活性成分および水の他に物質を含まないか、またはたとえば生理学的ｐＨ値におけるリン酸ナトリウム、たとえばリン酸塩−緩衝食塩水のような生理学的食塩水またはその両方のような緩衝液を含む滅菌された水性溶液である。さらに加えて、水性担体は１つ以上の緩衝塩と同様にたとえば食塩そして塩化カリウム、デキストロース、ポリエチレングリコールそして他の溶質のような塩類を含むこともできる。液状組成物は水に加えておよび水を除外して液相も含むことができる。これらの付加的な液相の例は、グリセリンたとえば綿実油のような植物油そして水−油乳濁液である。治療組成物は治療されるべき標的組織に触媒量の酵素をデリバーするのに充分な量の本発明のＤ−酵素を含有する。典型的には、これは全治療組成物重量あたりＤ−酵素として少なくとも０．１重量％、そしてさらに好ましくは少なくとも１重量％の量である。重量％とは全体の組成物に対するタンパク質の重量による割合である。こうして、たとえば、０．１重量％は全組成物１００ｇあたり０．１ｇのＤ−酵素である。実施例下記の実施例は本発明の範囲を限定することなく例示することを意図する。実施例１ＬおよびＤ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵，¹⁶⁷，¹⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＨＩＶ− １ＰＲ）の通常型段階的合成タンバク質の全化学的合成の進歩によって、均質な結晶形Ｌ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵ ，¹⁶⁷，¹⁹⁵］ＨＩＶ−１ブロテアーゼ（ＨＩＶ−１ＰＲ）の反復可能な製造が可能となった。たとえば、Kent，Annu．Rev．Biochem．５７巻，９５７頁，１９８８年，Wlodawer等，SCience．，２４５巻，６１６頁，１９８９年，およびMil ler等Science．，２４６巻，１１４９頁，１９８９年を参照。ＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＨＩＶ−１ＰＲ）は、高い特異性でポリペプチド鎖を切り、そして活性なビリオン（ウィルス粒子）の複製に不可欠なウィルスにコードされた酵素である。Kohl等Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A，８５，巻，４６８６頁，１９８８年を参照。２１，５００ダルトンのＨＩＶ−ＰＲ分子は２つの同一な９９のアミノ酸ポリペプチド鎖からなる。Ｄ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵，¹⁶⁷，¹⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼの全化学合成は、下記のように実施され、そしてこのＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素のＤ−およびＬ− エナンシオメリック形の特性（共有構造、物理的性質、二色性、酵素活性）が比較された。この目的のために、別々の化学合成で、［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼ９９−ａａモノマのＬ−およびＤ−配列に対応する保護されたポリペプチド鎖が全化学合成で製造された。ＡｂａはＬ−またはＤ−ａ−アミノ−ｎ −酪酸で、ＨＩＶＰＲモノマポリペプチド鎖６７および９５位のＣｙｓ（ジステイン）に対するisosteric置換として用いられる。この同一のisosteric置換が Wlodawer等、上述、およびMiller等、上述の研究にも用いられ、ＨＩＶＰＲ当初の正しい構造を導いた。化学合成は、通常の段階式で実施された。９９−ａａポリペプチド鎖は保護されたＬ−アミノ酸および保護されたＤ−アミノ酸からそれぞれ組立てられた。ｔ −ＢｏｃＤ−およびＬ−アミノ酸誘導体はthe Peptide Institute（Osaka, Ja pan），タンパク研究所、大阪、日本そしてPeptidesInternational（Louisville ，KY）ペプチドインターナショナル（ルイスビル市、ケンタッキー州）から入手した。ただし、Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｂａ，Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｘａｎ），Ｂｏｃ− Ｄ−ｌｌｅおよびＢｏｃ−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）はBachem Bioscience（Philade lphia，PA），バーケムバイオサイエンス（フィラデルフイア市，ペンシルベニア州）から入手した。Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｘａｎ），Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）およびＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）は、Bachem California (Torrance，ＣＡ，バーケムカリフォルニアトーランス市，カリフォルニア州）から入手した。Ｂｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）はthe PeptideInstituteから入手したＴＢＡ塩から結晶化した。Ｄ−Ａｂａ（Sigma，St．Louis，Mo：シグマ社、セントルーイス市、ミズリ−州）はＢｏｃ−Ｄ−Ａｂａに変換されそしてＤＣＨＡ塩として単離された。使用された他の側鎖保護基はＡｒｇ（Ｔｏｓ），Ｔｙｒ（ＢｒＺ），Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ），）−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）そしてＴｈｒ（ＢｚＬ）であった。Ｂｏｃ−Ｄ−アミノ酸調製物のＬ− エナンジオマー含有量は０．０１と０．０８％の間（製造者の規格）であった。段階的鎖長の合成は、Applied Biosystems（アブライドバイオシステムズ）４３０Ａ合成機（Ｄ−またはＬ＝−Ｂｏｃ−Ｐ）ｈｅ−ＯＣＨ₂−Ｐａｍ−樹脂と０．２ミリモルのスケールで）機械支援方式で実施された。アミノ酸付加の各々のサイクルは次の工程を含む。Ｎ^a−保護基化、ニート（１００％）ＴＦＡ（２×３０秒洗し洗浄、加えて１分間バッチごとの処理］、ＤＭＦ流し洗浄［１×２２秒，１×３８秒］、同時の液中での中和［ＤＭＦ中２分間ＨＢＴＶ（２．２２ミリモル）およびＤＩＥＡ（６．４ミリモル）との反応で予め活性化したＢｏｃ−アミノ酸（２．２５ミリモル）］を伴うカップリング（１×１０分）。液中（in situ）の中和方法は、無視してよいレベルのラセミ化を結果としてもたらすことが示されていた。Henkle in等“Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis固相合成における新技術および展望”R.Epton編，SPPC Ltd．，Birmin gham U．K．１９９２年，バーミンガム，英国を参照。組立てられたペピチドは９：１ＨＦ／Ｐ−クレゾール中、Ｔｒｐ（エタノールアミンと）からＢｏｃ基およびフォルミル基を除去した後、脱保護基化されそして樹脂から開裂された（レゾルシノールおよびチオクレソールが、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）が配列に含まれたとき存在した）。脱保護基の後、Ｄ−およびＬ−生成物は別々に後処理され、そして合成酵素は Wlodawer等、上述そしてMiller等、上述に記載されているように変性剤からポリペプチドポリマーをフォールドすることにより調製した。この目的のために、脱保護基および開裂の後、粗ペプチド生成物はエーテルで沈殿され、そして半合成スケールのＣ₁₈ＲＰＨＰＬＣでの濃縮および１０％グリセリン、２５ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄緩衝液ｐＨ７．０で透析によるフォールディングの前に、ｐＨ８．０ＮａＨＣＯ₃緩衝液中、６Ｍキニジン塩酸塩と溶解した。グリセリン溶液中高真空度で濃縮した後、酵素はアミノ酸分析で定量され、そして４℃で貯蔵された。Ｌ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵，¹⁶⁷，¹⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＨＩＶ−１ＰＲ）合成の総収量は約２ミリグラムまたは０．０９％であった。Ｄ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵，¹⁶⁷，¹⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＨＩＶ−１ＰＲ）合成の総収量は２ミリグラム以下であったので決定されなかった。実施例２上記Ｌ−およびＤ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵，¹⁶⁷，¹⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＨＩＶ−１ＰＲ）の構造分析Ｄ−酵素９９−ａａモノマ、Ｄ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼは、種々の構造特性について分析され、そしてＬ−異性体の構造特性と比較された。たとえば分析用の逆相ＨＰＬＣは、２つのポリペプチド鎖について同一の時間を与えた。実施例１でｐＨ６．５ＭＥＳ緩衝液／１０％グリセリン中、調製された、精製され、フォールドされた化学合成［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼモノマ試料は、逆相ＨＰＬＣによって脱塩を受けた。集められたタンバク質ピークは各々、別々にBruins等Anal．Chem．５９巻，２６４２頁，１９８７年に記載されるイオンスプレイ質量分析計で分析された。使用した条件（５０％アセトニトリル、５０％水、０．１％ＴＦＡ）で酵素は変性している。示される再構成された質量スペクトルで、生のｍ／Ｚデータはハイパスディジタルフィルタ（high pass digital filter）で処理され、それから１０ＫＤａと１１ＫＤａの間にすべての親分子種を与えるように分けられる。この再構成手法は、与えられた分子種に対して観測される多重荷重状態を単一の分子質量に数学的に減らす。再構成イオンスプレイ質量分析計で測ると、Ｌ−酵素の実測モノマ分子質量は１０，７４８±４ダルトン（Ｄａ）であり、そしてＤ−素の質量は１０，７５１ ±３ダルトン（Ｄａ）であった。計算質量は単一同位体（monoisotopic）で１０，７４８．０Ｄａで平均値１０，７５４．７Ｄａであった。こうして、２つの生成物（Ｄ−およびＬ−酵素モノマ）はイオンスプレイ質量分析計で測定されたとき、実験的不確定性内で同一の分子量を有した。イオン質量スペクトロメトリーデータは図１に示される。Ｄ−酵素９９−ａａモノマの完全なアミノ酸配列は、マトリックス支援レーザ脱着飛行時間質量スペクトロメトリック読出し、（ＡＰＩ−ＩＩＩ質量分析計、Ｐ．Ｅ．ＳＣＩＥＸ社，ソーンヒル，トロント市，カナダ）によって決定されそしてＬ−酵素の質量と同一と示された。こうして、２つの合成酵素分子は同一の共有構造を有した。一方、２つの分子の相違は、種々のギラール相互作用で明らかになった。Ｄ− およびＬ−ＨＩＶ−１プロテアーゼエナンシオマの個別の円二色性（ＣＤ）スペクトルは、ＡｖｉｖＣＤスペクトロメータ上、１ｍｍ通路長石英セルを用いて２５℃、５％グリセリンを含むｐＨ５．５水性溶液２６０−１９５ｎｍの範囲で測定した。ＣＤスペクトルはエナンシオメリックなタンパク質分子で予期するように、等しくそして反対符号の旋光を呈した。実施例３Ｌ−およびＤ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵，¹⁶⁷，¹⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼＨＩＶ−１ＰＲ酵素特性Ｄ−アミノ酸からなるエナンシオメリックなタンパク質の酵素特性は、Toths 等Int．J．Peptide Protein Res．３６巻，５４４頁，１９９０年に記載されているように、天然のＧＡＧ開裂部位を持つヘキサペプチド類似体を基質として用いる蛍光アッセイを用いて、評価しそしてＬ−酵素と比較した。１０％グリセリン，ＭＥＳ緩衝液中５０ｍＭＤ−またはＬ−蛍光性基質の溶液に１００ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５を加えたもの中、各々の酵素エナンシオマ（１．７５±１０％μｇタンパク質に対応）１５μｌアリコットで蛍光アッセイは実施された。酵素に対しての基質は、２−アミノベンゾイル−Ｔｈｒ−ｌｌｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ₂）−Ｇｌｎ−Ａｒｇ．アミド（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）の配列を有した。基質はＤ−またはＬ −アミノ酸誘導体のいずれかで合成され、適当なエナンシオメリック形を与えた。蛍光アッセイの結果は図２に示される。精製され、フオールドされた酵素調製物の等量（アミノ酸分析で決定）を含むアリコットが蛍光アッセイに用いられた。蛍光の増加は連続的チャート記録機に記録された。データは２つの合成酵素分子が等しく活性であることを示すが、Ｌ−酵素はＬ−基質のみを開裂するが、一方Ｄ−酵素は対応するＤ−基質のみを開裂するという補完的キラール特異性（re ciprocal chiral specificity）を明らかにした。同様の研究において、Miller等，Science，２４６巻，１１４９頁，１９８９年の記載に従って調製した疑似ペプチド阻害剤、ＭＶＴ１０１（Ａｃ−Ｔｈｒ− Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−ｐｓｉ［ＣＨ₂ＮＨ］−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ．アミド）（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）が、Ｄ− およびＬ−ＨＩＶプロテアーゼに対しての効果について評価された。阻害剤を用いるこの研究の結果を表１に示す。ａ．Ｄ−およびＬ−酵素は５×ＩＣ５０濃度の阻害剤存在下、対応するキラール基質を用いる上述の蛍光アッセイ法によって別々にアッセイを行った。ｂ．阻害剤エバンスブルー（Evans Blue）は、ノンペプチド、アキラールなＨＩＶ−ＰＲの競合−非競合混合阻害剤である。キラール阻害剤は、酵素の対応するエナンシオマーに対してのみ有効であった。すなわちＬ−ＭＶＴ１０１はＬ−ＨＩＶＰＲ−触媒反応を阻害するが、Ｄ− ＨＩＶＰＲ−触媒反応を阻害しない。そしてＤ−ＭＶＴ１０１はＤ−ＨＩＶ− ＰＲ−触媒反応を阻害するがＬ−酵素−触媒反応には影響を及ぼさない。興昧深いことに、アキラールな阻害剤であるエバンスブルーは、混成の阻害動力学を示すが、酵素の両方のエナンシオマーの強力な阻害剤である（表１参照）。ＨＩＶ−１プロテアーゼはホモダイマーとして存在する。すなわち１つの酵素分子が２つの同一な９９残基のフォールドされたポリペプチド鎖からなる。Wlod awer等Science，２４５巻，６１６頁，１９８９年そしてMiller等Science，２４６巻，１１４９頁，１９８９年を参照。ＨＩＶＰＲは高活性であり、無触媒のペプチド結合加水分解に比べて約１０¹⁰倍の反応速度増加を示す。Kent等“Vira l Proteinases as TheraperticTargets：治療的標的としてのウイルス性プロテアーゼ”Wimmer等編．Cold Spring Harbor Press コールドスプリングハーバ出版社、．Cold Spring Harbor, N.Y コールドスプリングハーバ市、ニューヨーク州２２３−２３０頁１９８９年そしてRichards等，FEBS Lett ２４７巻，１１３頁，１９８９年を参照。それはペプチド同様タンパク質も開裂する高度に特異的な酵素である（Kent等、上述そしてKrousslich等Proc Natl．Acad．Sci ．USA ８６巻８０７頁，１９８９年参照）そしてその特異性は、基質ポリペプチド鎖中、６つの連続するアミノ酸残基と錯体を形成する３次元にフォールドされた酵素分子の相互作用によって決定される。Miller等Science，２４６巻，１１４９頁，１９８９年そしてKent等上述を参照。すべての酵素を同じく、ＨＩＶＰＲの特異性と触媒活性はポリペプチド鎖の特定のフォールディングによって形成される正確な３次元構造および基質と形成された特定の錯体中の正確な幾何学的相互作用に由来する。Fersht“Enzyme Str ucture and Mechamism：酵素の構造と機構”W．H．Freeman and Company．ダブリユ．エッチフリーマン社，サンフランシスコ市．７５〜８１頁，１９７７年を参照。したがって、観察された補完的キラール特異性は、酵素活性の原因となる３次元構造のすべての要素についてＤ−およびＬ−酵素のフォールド形がお互いの鏡像であることを示す。これらの相互作用の広がり具合は、２つの酵素分子がすべての点（２１）で鏡像であり、これは観測された等しく符号が反応のＣＤスペクトルと矛盾がないことを意昧する。特に注目すべきは、ポリペブチド骨格（側鎖を無視して）のフォールド形はそれ自身図３で示すように、２つのタンバク質エナンジオマで鏡像で存在するに違いないキラール物質である。図３に示されるＬ−およびＤ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵，¹⁶⁷，¹⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼリボン表示は、Miller等，Science，２４６巻，１１４９頁１９８９年に記載されるように基質から誘導されたペプチド阻害剤（阻害剤は示されていない）と錯体化されたときの化学的に合成された酵素のＸ−線結晶学的座標に基づく。このモデルはＬ−酵素データの鏡像変換を実施を実施ずることによって得られた。フォールドされた３次元「骨格」リボン構造は重なり合わない鏡像であり、そして数多くのキラール要素を含む。これらは図３に例示されるように第２次および超２次構造、３次および４次構造に見い出される。たとえば、フラップ（flap ）のお互いの関連性、螺旋セグメントの隣接するｂ−鎖への関連性、各々のフラップ中の逆平行のβ−鎖の特徴的な捩れ（Ｌ−プロテアーゼで右手方向）（Rich ardson等“Protein Folding：タンパク質折たたみ”Gierash等編，American Ass osiation of the Advancement of Science，アメリカ科学振興協会、ワシントンＤＣ５〜１７頁，１９９０年を参照）そして螺旋セグメントの手の方向に注目すること。化学合成されたポリペプチド鎖の中に導入された唯一のキラール要素は、アミノ酸Ｃα原子（そしてＴｈｒ，ＩｌｅのＣβ原子）での立体化学であるので、本明細書中提示されたデータはフォールドされた酵素分子のすべての立体化学的面（第２次から第４次構造）は単にポリペプチド骨格の立体化学によって決定されることを要求する。こうして化学的に合成された酵素エナンシオマーの補完的キラール特性は、最終のフォールド／３次元構造そしてその結果この２１，５００ダルトンホモジメリック酵素の分子の生物活性は完全にアミノ酸配列によって決定されるという基本的な例証である。本研究でのＬ−およびＤ−酵素は、生合成的条件におかれたことはなかった。そしてそのようにいかなる種類の生化学的因子と接触されたこともなかった。興味深いことに、ここで研究された簡単なホモジメリックな酵素分子は素早く（フォールディングおよび組立て）、アッセイ条件を用いる比較的低濃度でさえ正確に、同様により普通の変形剤から透析フォールディング条件でも形成される。本明細書中の結果は、提案された役割かどうかであれ、タンパク質の正しい、機能的にフォールドされ、組立てられた形態を形成するのに生合成因子が必要とされないという結論的な証拠である。本明細書中記載された鏡像酵素の観察された補完的なキラール特性は、タンバク質の生化学的相互作用のキラール性に支持を与え、そして一般的なものとする。このような挙動を与えるタンパク質分子のキラール特性そのものは生化学教科書でほんの上べだけでの注目しかされていない。実験的証拠に基づいて、本発明者らはタンバク質エナンシオマが触媒を含む生化学的相互作用において補完的なキラール特異性を示すということを明言できる。ＨＩＶＰＲの両方のエナンジオマーがアキラールな阻害剤エバンスブルーによって等しく影響を受けたという観察は、幾つかの重要な意昧を持つ。第１に、アキラール基質に作用し、そしてアキラール生成物を作り出す酵素の非天然型エナンシオマは、生体内で充分に機能しうるだろうということである。この点は重要な治療的応用の可能性をもたらす。その例はカルボニックアンヒドラーゼそしてスパーオキシドジスムターゼである。一般的に、Ｌ−アミノ酸からなるタンパク質のみを攻撃する天然に存在するプロテアーゼに対してＤ−酵素は耐性があるだろうから、Ｄ−酵素は生体内（Ｌ−タンパク質生物圏）で寿命が永いと期待される。Ｄ−タンパク質はＬ−タンパク質と比較して免疫原性が少ない。すべてＤ−アミノ酸からなる長いポリペプチドはＬ−アミノ酸からなるペプチド性免疫系で効率よく処理されたりしないからである。Ｄ−タンパク質分子は、他の実用性の可能性もある。たとえば、酵素エナンシオマは精密化学品（ファインケミカル）の純粋なエナンジオマの選択的な製造に用いるキラール触媒として用途がある。エナンシオメリックに純粋な化合合成は、ヒトの薬品を製造するのに適用できる。加えて、タンパク質エナンジオマは、 Mackay，Nature，３４２巻，１３３頁，１９８９年に記載されたようにＸ−線結晶学の相データの取得に貢献できる。Ｄ−，Ｌ−タンパク質対の共結晶によって形成された中心対称の結晶は、高度に単純化された相を有するだろう、そしてより信頼おけるＸ−線構造データを提供するだろう。現時点では、Ｄ−酵素およびＤ−タンパク質は、一般的に全化学合成によってのみ入手可能である。ポリペブチド鎖のリポゾーム合成の間、生体外の翻訳系でもＤ−アミノ酸は延びているポリペプチドに取り込まれないだろう。Ellman等Science，２５５巻，１９７頁，１９９２年。実施例４実施例１−３の検討本発明において、酵素ＨＩＶ−１プロテアーゼのＤ−およびＬ−形が全化学合成によって製造された。２つのタンバク質は同一の共有構造を有する。しかしながら、フォールドされたタンパク質／酵素エナンシオマはタンパク質基質に対して補完的なキラール特異性を示す。すなわち、各々の酵素エナンシオマは対応する基質エナンシオマのみを切断する。本発明で合成されたＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素のエナンシオメリック阻害剤への影響でも、補完的キラール特異性が明白であった。これらのデータは、化学的に合成されたＤ−およびＬ−酵素分子が３次元構造のすべての要素で互いの鏡像体であることを示す。エナンシオメリックタンバク質はそれらの生化学的相互作用のすべての面で補完的キラールな特異性を示し、酵素活性を保持し、そして本発明書中に記載する広範囲の有用な組成物を提供する。実施例５Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁷⁵（ＣＯ−Ｓ）⁵¹，⁵²］₂ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体の合成および連結図４は、Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）⁵¹，⁵²］₂ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体の全合成に用いられる計画を模式的に示すものである。保護されたＤ−およびＬ −アミノ酸はthe Peptide Institute（Osaka, Japan）タンパク研究所、大阪日本、Peptide International（Louisville，KY）：ペプチドインターナショナル（ルイスビル市ケンタッキー州）、Bachem Bio Science（Philadelphia，PA ）；バーケムバイオサイエンス（フィラデルフィア市ペンジルベニア州）そしてBachem Caifornia（Torrance，CA）；バーケムカリフォルニア（トーレンス，カリフォルニア州）から入手でき、そして０．０３％以下の反対のエナンシオマーを有する。ＨＰＬＣで精製され、機能化され、段階的な固相合成で組立てられ、保護されていないペブチドセグメントが６ＭＧｕＨＣｌの存在下反応され、連結された９９−残基Ｄ−およびＬ−［（ＮＨＣＨ₂ＣＯＳＣＨ₂ＣＯ）^51-52 ］ＨＩＶ−１ＰＲ生成物を生じる。schnolzer等Science，２５６巻，２２１− ２２５頁，１９９２年参照。図４の箱で囲んだ部分は、連結が起こった部位でのペブチド結合Ｇｌｙ⁵¹−Ｇｌｙ⁵²のチオエステル類似体の構造を表す。チオエステルは２つのＤ−ペプチド間の結合、すなわち連結の部位として働く。セレノールエステル結合もまた２つのＤ−ペプチドを連結するのに用いることができる。２つの大きなペプチドセグメント、すなわち［αＣＯＳＨ］ＨＩＶ−１ＰＲ（１−５１）および（Ｎ^a−ＢｒＣＨ₂ＣＯＨＩＶ−１ＰＲ（５３−９９）は、改良したＡＢＩ４３０Ａ合成機上で行われるＢｏｃ−化学を用いる高度に最適化された機械−支援ＳＰＰＳプロトコールで別々に合成され、図５に示すように組立てられた。 Kent等“Innovation & Perspectives in Solid-Phase Synthesis固相合成の新技術と展望”Epton．R．SPPC Ltd Birmingham，U，K．，エプトン編，アール，エスピピシ社バーミンガム英国を参照。プロトコールは、稀釈されていないＴＦＡ（合計２分）でＮａ−Ｂｏｃ基を除去し、続いてＤＭＦ流し洗浄（flow w assh）し、ＴＦＡ−ペプチド−樹脂塩を与え、ＨＢＴＵで活性化したＢｏｃ−アミノ酸を用いる単一回の１０分間カップリング段階そしてＤＭＦ中、ＤＩＥＡと液中（in situ ）中和化することからなる。脱保護基およびカップリング反応は、流し洗浄によって分けられる。精製の後、モノマーはそれぞれＤ−およびＬ −ＭＶＴ−１０１阻害剤存在下、透析によって個別にフォールドされ、ホモジメリックな酵素を与える。各々の生成物のミリグラム収量を図４に示す。［αＣＯＳＨ］ＨＩＶ−１ＰＲ（１−５１）ペプチドは、４−［ａ（Ｂｏｃ −Ｇｌｙ−Ｓ）べンジルＩ］フェノキジアセトアミドメチル−樹脂上で組立てられる。［Ｎ^a−ＢｒＣＨ₂ＣＯ］ＨＩＶ−ＩＰＲ［５３−９９］ペプチドは［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵］ＨＩＶ−１ＰＲ（５３−９９）−ＯＣＨ₂ Ｐａｍペプチド−樹脂のブロモアセチル化によって合成できる。Yamashiro等Int．J．Peptide Protein Res．３１巻，３２２−３３４頁１９８８年参照。すべてのペプチドは高濃度ＨＦ処理によって開裂され、そして脱保護基化される。調製用逆相ＨＰＬＣ精製（Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰｌＯ１５５０−５２５ｃｍ，０．１％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ，３０−５０ｍｌ／ｍｉｎ）の後、官能基化されたペプチドセグメントを６ＭＧｕＨｃｌ（０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ５．３）中、４８時間反応させ、連結したＤ−およびＬ−［（ＮＨＣＨ₂ＣＯＳＣＨ₂ ＣＯ）^51-52］ＨＩＶ−１ＰＲモノマを生成する。図６は、２つの）精製した、官能基化された保護されていないセグメントおよび最終（４８時間）連結反応生成物（太線）を流速１ｍｌ／ｍｉｎ，０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ａ）および０．９％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ，１：９（緩衝液Ｂ）で溶出されＶｙｄａｃ２１８ＴＰ５４１５カラムにかけられたものを示す合成クロマトグラフを表す。逆相ＨＰＬＣによる精製後、２０ミリモルリン酸緩衝液中、ｐＨ５．５、１０倍過剰のＤ−またはＬ−［ＭＶＴ−１０１］阻害剤（Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−ψ［ＣＨ₂ＮＨ］−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ．ＮＨ₂）（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）の存在下、生成物は透析により別々にフォールドされホモジメリックな酵素を与えた。Miller等，Science２４６巻，１１４９頁１９８９年を参照。Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）⁵¹ ^-52 ］₂ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体合成の段階ごとにの反応収率は、図７に挙げられている。Ｄ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］₂ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体の合成に関する総収量は４８ミリグラムまたは３．０％であった。Ｌ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］₂ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体の合成に関する総収量は４７ミリグラムまたは２．５％であった。実施例６連結生成物、Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］₂ ＨＩＶ−１ブロテアーゼ類似体の物理的特性ＨＰＬＣで精製された連結生成物のイオンスブレイ質量スペクトロメトリは図８に示される。イオンスブレイ質量スペクトロメトリは各々の場合、実測された分子量１０７６８．９±１．４ダルトン（Ｄ−エナンシオマー）および１０７６９．４±０．９ダルトン（Ｌ−エナンシオマー）［計算値１０７６３．９ダルトン（モノアイソトピック）および１０７７０．８ダルトン（平均）］を有する単一の分子種を明らかにする。少量の脱水副生成物もまた検出された。モノマーの配列もまた１段階レーザー脱着質量読出し．を利用する新しいタンパク質ラダー（ladder）配列手法で検査された。図８（ＡおよびＣ）は過剰のプロトンによって異なる単一分子種を表すラベルされたピークを示す。連結生成物の実測された分子量は、１０７６８．９±１．４ダルトン（Ｄ−エナンシオマー）そして１０７６９．４±０．９ダルトン（Ｌ，−エナンシオマー）［計算値：１０７６３．９ダルトン（モノアイソトピック）そして１０７７０．８ダルトン（平均）］である。図８（ＢおよびＤ）はＡおよびＣに示されたデータが単一の電荷状態に減られた再構成された質量ベクトルを示す。ＡおよびＣにおけるすべてのデータ点が計算に含まれ、そして数学的なフィルターリングは実施されない。１０−１１ＫＤの質量領域は明瞭に示されている。図９は、Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ_６７，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］ＨＩＶ−１ＰＲ連結生成物の逆相ＨＰＬＣの測定を示す。６ＭＧｕＨＣＩから連結された生成物は各々の場合単一のピークを示す。パネルＡおよびＣは６ＭＧｕＨＣＩ中、精製された連結されたモノマを示す。パネルＢおよびＤは、２５ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中、それぞれＤ−またはＬ−［ＭＶＴ−１０１］阻害剤の存在下、フォールドされたホモジメリックな酵素を示す。フォールディングの後、幾つかの少量の自已分解生成物がＤ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］₂ＨＩＶ−１プロテアーゼ調製物の再方に見られることに注意する。約２７分で、ＭＶＴ−１０１阻害剤ペプチドの少量のタンパク質加水分解生成物もまた見られた。大過剰の阻害剤の存在の元でもなお、酵素は、少量の割合の自已分解を受けるようである。試料は流速１ｍｌ／ｍｉｎ、０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ａ）および０．９％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ、１：９（緩衝液Ｂ）で溶出されたVydac ２１８ＴＰ５４１５カラムの上にかけられた。図１０は、フオールドされたＤ−およびＬ−プロテアーゼ調製物の遠紫外円二色性スペクトルを示す。スペクトルは、２５ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５（阻害剤の存在下、０．４ｍｇ／ｍｌプロテアーゼ）２５℃，１ｍｍの通過長を有するセルで記録された。各々の調製物は、鏡像タンパク質に予想されるように、大きさが等しいが、反対の符号である。 Coringliano−Murphy等，Int．J，Peptide Protein Res．２５巻，２２５頁，１９８５年そしてZawadzke等１９９２年J．Am Chem．Soc．１１４巻，４００２頁，１９９２を参照実施例７連結生成物、Ｄ−およびＬ− ［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52 ］ ₂ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体の酵素活性の特性Ｄ−およびＬ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ−Ｓ）^51-52］₂ＨＩＶ−１ＰＲエナンシオマーの酵素活性がヘキサペブチド基質Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−ＮＩｅ− Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ．アミド（ｐ２４／ｐ１５ＧＡＧウイルスブロセジング部位の類似体）のＤ−およびＬ−異性体に対するそれらの作用によって決定されるうることを図１１は示す。Ｄ−酵素はＤ−基質のみを開裂し、そしてＬ−基質に対して不活性で、そしてＬ−酵素はＬ−基質に対して完全な活性を示すが、Ｄ−基質に対して不活性である。この補完的なキラール特異性は、キラール阻害剤の効果でもまた明らかである。下表に示すように、Ｄ−およびＬ−［ＭＶＴ−１０１］はキラール蛍光性（fluorogenic）基質のＤ−およびＬ−ＨＩＶ−１ＰＲ類似体による開裂を夫々阻害する。しかし逆のエナンシオマーの作用については影響がない。興昧深いことに、アキラールな阻害剤であるエバンスブルー（Evance Blue）は、混成の阻害動力学を示すが、酵素の両方のエナンシオマーを阻害する。Ｄ−およびＬ−酵素は、阻害剤の５×１Ｃ₅₀濃度の存在下、対応するキラール基質を用いる蛍光アッセイによって別々にアッセイされた。ＭＥＳ緩衝液中、５０ｍＭＤ−またはＬ−蛍光性基質の溶液に１００ミリモルＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）の各々の酵素エナンシオマーを加えた１５μｌアリコート（１．７５（±１０％）ｍｇタンパク質に対応）を使って実行された。基質配列は、２−アミノベンゾイル−Ｔｈｒ−Ｉ１ｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ₂）− Ｇｌｎ−Ａｒｇアミド（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）。これは適当なエナンシオメリック形を提供するためにＤ−またはＬ−アミノ酸誘導体のいずれかで合成された。阻害剤エバンスブルーは、非ペプチド性ＨＩＶ−１ＰＲ酵素のアキラール競合−非競合混合阻害剤である。基質Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ．アミド（ＳＥＱＩＤＮＯ．）のＤ−およびＬ−異性体に関する［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵，（ＣＯ− Ｓ）^51-52］₂ＨＩＶ−１ＰＲエナンシオマーの酵素活性は以下のように測定できる。基質（１ｍｇ／ｍｌ）がｐＨ６．５（ＭＥＳ緩衝液，１００ｍＭ）３７ ℃で３０分間、酵素（０．１ｍｇ．／ｍｌ）と処理される。反応混合物のアリコートはそれから緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ）中緩衝液Ｂ（０．０９％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ，１：９）の線型勾配溶出０−４０％，２０分（流速１ｍｌ／分，Ａ^214nm）でクロマトグラフにかける。ペプチド生成物は、イオンスプレイＭＳで（Ｈ）−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇアミド（ｍ／：＝４１５．０−初期の溶出）およびＡｃ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−ＯＨ）（ｍ／Ｚ：３８８．０−終期の溶出）。基質調製物の中に存在する精製されていないペプチドによる少量の不純物は開裂されない。パネルＡはＤ−基質のみ、パネルＢはＬ−基質のみ、パネルＣはＤ−基質＋Ｄ−酵素、パネルＤはＤ−基質＋Ｌ−酵素、パネルＥはＬ−基質＋Ｌ−酵素、パネルＦはＬ−基質＋Ｄ−酵素を示す。実施例８実施例４−７の検討ＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素は、ホモジメリックとして存在する。それは、高度に特異的な酵素であり、そしてこの特異性および触媒活性は、フォールドされた二量体および基質分子の６つの残基の間で形成される正確な３− Ｄ（三次元）構造に依存する。したがって観察された補完的な特異性は、Ｄ−およびＬ−酵素分子のフォールドされた形が、それらの酵素活性の原因となる３− Ｄ構造のすべての要素においてお互いに鏡像であることを示す。この結果は、観察されたＣＤスペクトルと一致する。フォールドされた酵素分子の３−Ｄ構造は、図３に示されるように、第２次および超第２次（supersecondary）構造、３次構造および第４次構造において無数のキラール要素を含有する。合成Ｄ−およびＬ−ポリペプチド鎖の間の唯一の相違はアミノ酸のα−炭素原子（そしてＩｌｅおよびＴｈｒＣβ原子）の立体化学であるので、骨格の立体化学がこのタンパク質で高次構造のすべての面を決定すると結論づけられる。本明細書に開示されたＤ−およびＬ−ＨＩＶ−１プロテアーゼの酵素活性における補完的キラール特異性の観察は、タンパク質の生化学的相互作用のキラールな性質を一般化し強調するのに役立つ。化学連結方法を用いて合成された多量の高純度Ｄ−およびＬ−酵素エナンシオモルフによって、Ｘ−線結晶学でＤ−，Ｌ−タンパク質を使用するについて綿密な実験的評価が可能になるだろう。以上の記述は本発明を制限するのではなく、例示することを意図する。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、数多くの変形そして修正をなすことができる。配列リスティング（１）一般情報（ｉ）出願人（Ａ）ザスクリップスリサーチインスティチュート（Ｂ）番地ニノーストーリパインズロード１０６６６（Ｃ）都市：ラホヤ（Ｄ）州：カリフォルニア（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：９２０３７（Ｇ）電話：６１９−５５４−２９３７（Ｈ）ファックス：６１９−５５４−６３１２（ii）発明の名称：Ｄ−酵素組成物およびそれらを使用する方法（iii）配列の数：３（IV）コンビュータ読込みフォーム（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＣＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：PC−DOS／MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release （パテントイン，リリース）＃１．０バージョン＃１．２５（Ｖ）出願データ（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：１９９３年６月７日（VI）先出願データ（Ａ）出願番号：ＵＳ０７／８９４，８１７（Ｂ）出願日：１９９２年６月８日（２）ＳＥＱＩＤＮＯ．１に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）鎖長：６アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直線状（ii）分子タイプ：ペプチド（Ｖ）フラグメントタイプ：内部（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：１（Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｎ−アセチル／「Ｎ−アセチル基はペプチドのアミノ末端に位置する」ことに注意。（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：３（Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｎｌｅ／「修飾されたアミノ酸、Ｎｌｅはこの位置にある」ことに注意。（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：４（Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｎｌｅ／「修飾されたアミノ酸、Ｎｌｅはこの位置にある」ことに注意。（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：（３〜４）（Ｄ）他の情報：／ラベル＝ｐｓｉＣＨ₂ＮＨ／「これらのアミノ酸の間の開裂ペプチド結合は、還元された類似体ｐｓｉＣＨ₂ＮＨによって置換された」ことに注意。（ix）特徴（Ａ）名前／キー：修飾位置（Ｂ）位置：６（Ｃ）他の情報：／ラベル＝アミド／「アミドはペプチドのカルボキシ末端に位置する」ことに注意。（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ．１（２）ＳＥＱＩＤＮＯ．２に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）鎖長：６アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）分子タイプ：ペプチド（Ｖ）フラグメントタイプ：内部（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：１（Ｄ）他の情報：「２−アミノベンゾイル基はペプチドのアミノ末端に位置する」ことに注意。（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：３（Ｃ）他の情報：／ラベル＝Ｎｌｅ／「修飾されたアミノ酸、Ｎｌｅはこの位置にある」ことに注意。（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）：４（Ｃ）他の情報：／ラベル＝Ｐｈｅ−ｐＮＯ₂／「修飾されたアミノ酸、Ｐｈｅ−ｐＮＯ₂はこの位置にある」ことに注意。（ix）特徴（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：６（Ｃ）他の情報：／ラベル＝アミド／「アミドはペプチドのカルボキシ末端に位置する」ことに注意。（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ．２（２）ＳＥＱＩＤＮＯ．３に関する情報（ｉ）配列情報（Ａ）鎖長：６アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直線状（ii）分子タイプ：ペプチド（Ｖ）フラグメントタイプ：内部（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：１（Ｄ）他の情報：／ラベル＝ＡＣ／「アセチル、ＡＣ基はぺプチドのアミノ末端に位置する」ことに注意。（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：３（Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｎｌｅ／「修飾されたアミノ酸、Ｎｌｅはこの位置にある」ことに注意。（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：４（Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｎｌｅ／「修飾されたアミノ酸、Ｎｌｅはこの位置にある」ことに注意。（ix）特徴：（Ａ）名前／キー：修飾部位（Ｂ）位置：６（Ｄ）他の情報：／ラベル＝アミド／「アミドはペプチドのカルボキシ末端に位置する」ことに注意。（ix）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ．３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/88 9152−4ＢＣ１２Ｐ 41/00 Ｃ 9452−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/44 ＡＢＥＡＢＮ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者ミルトン，サスキアシャーロットフローレンスアメリカ合衆国カリフォルニア州 92037 ラホヤカレデラプラタ 7964―ビー (72)発明者ミルトン，レイモンドセシルデリスルアメリカ合衆国カリフォルニア州 92037 ラホヤカレデラプラタ 7964―ビー

Claims

【特許請求の範囲】１．酵素反応の触媒作用ができるポリペプチドを定義するアミノ酸残基配列を含んでなり、該アミノ酸残基配列は実質的にＤ−アミノ酸からなることを特徴とするＤ−酵素。２．前記酵素反応がアキラール基質特異性を有する請求項１記載のＤ−酵素。３．前記酵素がスーバオキシドジスムターゼまたはカルボニックアンハイドラーゼである請求項２記載のＤ−酵素。４．前記酵素反応がキラール基質特異性を有する請求項１記載のＤ−酵素。５．前記酵素がＨＩＶ−１プロテアーゼ、Ｄ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵，¹⁶⁷，¹⁹⁵］ＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＨＩＶ−１ＰＲ）、そしてＤ−［Ａｂａ⁶⁷，⁹⁵（ＣＯ− Ｓ）^51-52］₂ ＨＩＶ−１プロテアーゼ類似体からなる群より選ばれる請求項４記載のＤ−酵素。６．（ａ）水性混合物中、第１の立体異性体と該第１立体異性体を特異的にキラール反応生成物に変換するＤ−酵素とを反応させ、該反応は該反応生成物を生成するのに充分な時間および反応条件で起こり、該Ｄ−酵素は該反応の触媒作用ができる酵素を定義するアミノ酸残基配列を含んでなり、そして該アミノ酸配列は実質的にＤ−アミノ酸からなる工程そして（ｂ）前記混合物から前記キラール反応生成物を単離し、それによってキラール純粋な化学物質を生成する工程、以上の工程からなることを特徴とするキラール純粋な化学物質を製造する方法。７．前記水性混合物が少なくとも第１および第２の立体異性体を有するラセミ混合物からなる請求項６記載の方法。８．（ａ）水性混合物中、少なくとも第１および第２の立体異性体を有するラセミ混合物と該第１の立体異性体を特異的に反応生成物に変換するＤ−酵素とを反応させ、該反応は第１立体異性体の実質的にすべてを該反応生成物に変換するのに充分な時間および反応条件で起こり、該Ｄ−酵素は該反応の触媒作用ができる酵素を定義するアミノ酸残基配列を含んでなり、そして該アミノ酸配列は実質的にＤ−アミノ酸からなる工程そして（ｂ）前記混合物から前記第２の立体異性体を単離し、それによってキラール純粋な化学物質を生成する工程、以上の工程からなることを特徴とするキラール純粋な化学物質を製造する方法。９．次の工程からなることを特徴どするアキラール基質が関与する反応を触媒作用ずる方法：工程Ａ：前記アキラール基質に対する特異性を有するＤ−酵素を提供する、それから工程Ｂ：アキラール基質が関与する反応を触媒作用するために該アキラール基質と工程ＡのＤ−酵素を接触する。 10．前記工程Ａで、Ｄ−酵素がＤ−スーバオキシドジスムターゼであり、そしてアキラール基質がスーパオキジドラジカルであり、そして前記工程Ｂで、工程ＡのＤ−スーバオキシドジスムターゼがスーバオキシドラジカルを分子状酵素および過酸化水素に変換するためにスーバオキジドラジカルと接触される請求項９記載の方法。 11．酵素の共結晶化したＤ−およびＬ−エナンシオマーを含んでなることを特徴とする結晶。 12．次の工程からなることを特徴とするＬ−酵素を構造的に分析する方法：工程Ａ：Ｌ酵素の共結晶化したＤ−およびＬ−エナンシオマーを含んでなる結晶を提供する、それから工程Ｂ：Ｘ−線バターンを生成するのに工程Ａの結晶をＸ線に露出する、そしてそれから工程Ｃ：Ｌ−酵素に関する構造情報を得るのに工程Ｂで描かれたＸ−線パターンを分析する。 13．Ｌ−酵素に関する活性を有する薬品候補をスクリーニングする方法において、次の工程からなることを特徴とする前記方法：工程Ａ：前記Ｌ−酵素のエナンシオマーであるＤ−酵素を提供する；それから工程Ｂ：Ｄ−酵素に関する活性を有するライブラリーの１つまたはそれ以上の構成要素を同定するためにライブラリーをスクリーニングする；そしてそれから工程Ｃ：工程Ｂで同定されたライブラリーの１つまたはそれ以上の構成要素を用い、Ｌ−酵素に関する薬品候補を同定する。 14．前記Ｌ−酵素が受容体または結合部位を含む請求項１３記載の方法。 15．式Ｒ−Ｌ−Ｒ′（式中、ＲおよびＲ′はＤ−ペブチドであり、そして、ＬはＲをＲ′に連結するための連結ユニットを表す）で表されることを特徴とする連結されたＤ−タンパク質。 16．１００のＤ−アミノ酸残基以上を有する請求項１５記載の連結されたＤ− タンパク質。 17．Ｌがチオールエステルまたはセレノールエステル結合である請求項１５記載の連結されたＤ−タンパク質。