ES2291246T3 - Procedimiento para adquirir datos para el diagnostico presintomatico o prenatal de neurofribromatosis del tipo 1. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para adquirir datos para la preparación del diagnóstico presintomático o prenatal de neurofibromatosis del tipo 1 en un paciente de riesgo, con los pasos: a) se aísla ADN tumoral a partir de material tumoral de un pariente que padece la enfermedad del gen supresor tumoral del paciente de riesgo, b) se aísla ADN sanguíneo de la sangre del pariente, c) a partir del material tumoral se amplifican al menos dos marcadores microsatélite polimorfos de ADN, d) se amplifican los marcadores microsatélite polimorfos de ADN a partir de la sangre, e) se separan por longitud los al menos dos marcadores microsatélite polimorfos de ADN del material tumoral, f) se separan por longitud los al menos dos marcadores microsatélite polimorfos de ADN de la sangre, g) se representan las longitudes de los marcadores microsatélite polimorfos de ADN a partir del material tumoral, h) se representan las longitudes de los marcadores microsatélite polimorfos de ADN a partir de la sangre, i) se repiten los pasos b), d), f) h) con la sangre del paciente de riesgo, tratándose en el caso de los marcadores de marcadores que flanquean un gen de la neurofibromatosis o de marcadores intragénicos, tratándose en el caso del pariente de un progenitor del paciente de riesgo.
Description
Procedimiento para adquirir datos para el
diagnóstico presintomático o prenatal de neurofibromatosis del tipo
1.
La invención se refiere a un procedimiento para
adquirir datos para la preparación del diagnóstico presintomático o
prenatal de neurofibromatosis del tipo 1.
Del estado de la técnica se conocen
procedimientos de este tipo Principalmente sirven para determinar de
forma temprana, entre otras (en la medida de lo posible), de forma
prenatal, la probabilidad de la aparición repetida de una
enfermedad hereditaria en hijos de padres afectados por una
enfermedad hereditaria, o en sus nietos. En el estado de la
técnica, para este fin se efectuó un análisis de mutación del
segmento de ADN que codifica el gen correspondiente, que
caracteriza la enfermedad hereditaria, para la preparación del
diagnóstico correspondiente. Una de estas enfermedades del gen
supresor tumoral son las neurofibromatosis heredadas de forma
autosómica dominante. Las neurofibromatosis se presentan en dos
tipos, el "tipo periférico", llamado tipo 1, que corresponde
aproximadamente al 85% de los casos, y el "tipo central",
llamado tipo 2, que corresponde aproximadamente al 15% de los
casos. El tipo 1 se presenta con una frecuencia de aproximadamente
1:3000, mientras que el tipo 2 se presenta con una frecuencia de
aproximadamente 1:35000. En cuanto al cuadro de síntomas clínicos,
se remite a los textos médicos especializados correspondientes.
Sin embargo, una desventaja del análisis de
mutación conocido del estado de la técnica es que requiere mucho
tiempo. Así por ejemplo, el gen de la neurofibromatosis del tipo 1
en el cromosoma 17 (gen NF-1) presenta 60 exones.
Un examen completo de este gen con la ayuda del análisis de mutación
tarda más de cuatro meses. Aunque el gen de la neurofibromatosis
del tipo 2 en el cromosoma 22 (gen NF2) es menor porque sólo
presenta 17 exones, un examen completo del gen también tarda más de
un mes. Además, en el análisis de mutación conocido, es una
desventaja, que en las personas de riesgo sólo será posible un
diagnóstico seguro por genética molecular cuando se haya encontrado
una mutación en los afectados
Por ejemplo, de la publicación de C. L. Wu y
col. "Differential Diagnosis of Type 2 Neurofibromatosis:
Molecular Discrimination of NF2 and sporadic vestibular
schwannomas" Journal of Medical Genetics, tomo 35, Nº 12,
diciembre de 1998 (1998-12), páginas
973-977, XP008019307 ISSN: 0022-2593
también se conoce un procedimiento del tipo nombrado inicialmente.
En este procedimiento conocido, en pacientes de los que no se sabe
unívocamente si padecen neurofibromatosis, se examina material
tumoral de al menos dos tumores de estos pacientes y sangre de
estos pacientes, para constatar si estos pacientes han enfermado de
neurofibromatosis. Para esto, se busca una mutación correspondiente
en el ADN del paciente. Además, este estado de la técnica da a
conocer que cuando se constató una enfermedad en el paciente, en
los hijos del paciente puede excluirse el riesgo de una enfermedad
cuando estos hijos no muestran las mismas mutaciones. Como ya se
expuso anteriormente, tales análisis de mutación sin embargo son
desventajosos, porque sólo posibilitan una evaluación correcta del
riesgo si se encuentra una mutación en los hijos. Si no se
encuentra mutación, no es posible una evaluación segura del riesgo
para hijos del paciente.
De la publicación "CLINICAL APPLICATION OF
GENETIC POLYMORPHISM IN NEUROFIBROMATOSIS TYPE 1" de M. Clementi,
Stefania Boni, Isabella Mammi, M. Favarato y R. Tenconi, de la
revista Annales de Genétique, Francia, 1996, tomo 39, Nº 2, páginas
92-96, XP008019271, ISSN: 0003-3995
se conoce un procedimiento mediante el cual se han examinado
individuos reconocidos como enfermos de familias que poseen el gen
NF1. Se aisló ADN de la sangre y se examinó mediante PCR para
determinar una serie de polimorfismos.
Por ello, el objetivo de la presente invención
es mejorar un procedimiento del tipo nombrado al comienzo de esta
descripción.
Este objetivo se alcanza conforme a la
invención, en un procedimiento del tipo nombrado inicialmente,
mediante un procedimiento conforme a la reivindicación 1.
Las ventajas del procedimiento conforme a la
invención particularmente consisten en que puede llevarse a cabo
muy rápidamente. Así, el procedimiento conforme a la invención en
todo caso puede llevarse a cabo en un tiempo máximo de dos semanas;
sin embargo, en un procedimiento acelerado también puede llevarse a
cabo en aproximadamente dos días. Esta rapidez del procedimiento
conforme a la invención es particularmente importante en el
diagnóstico prenatal. Además, el procedimiento conforme a la
invención debido a su sencillez también es considerablemente más
económico que el análisis de mutación, conocido del estado de la
técnica.
Demostró ser especialmente conveniente en el
procedimiento conforme a la invención que en los casos en los que
en el análisis de mutación conocido no pueda encontrarse ninguna
mutación en el paciente examinado, el procedimiento conforme a la
invención en casos esporádicos brinda la única posibilidad de
excluir o confirmar neurofibromatosis del tipo 1 a nivel molecular.
Es particularmente importante la exclusión de la neurofibromatosis,
porque desde el punto de vista estadístico, en aproximadamente el
50% de las personas de riesgo puede excluirse la posibilidad de la
enfermedad. De esta manera, mediante la invención no sólo pueden
ahorrarse el análisis de mutación y exámenes costosos, sino que a
las personas de riesgo examinadas también se les alivia el temor de
haber heredado la enfermedad. También se evitan exámenes clínicos
costosos.
En una realización preferida, en el caso de los
marcadores se trata de segmentos de ADN relativamente cortos (hasta
300 pares de bases), flanqueadores de genes o intragénicos. Esto
ofrece la ventaja de que por ejemplo puede usarse material tumoral
que se encuentra en un bloque de parafina, que por ejemplo se obtuvo
de una operación de tumores dérmicos en el caso de
neurofibromatosis, ya que es posible amplificar segmentos cortos de
ADN a partir de la mayoría de los bloques de parafina existentes.
Debe considerarse como ventaja especial que particularmente en
neurofibromatosis puede obtenerse fácilmente el material tumoral
mediante intervenciones externas.
En otra realización preferida, se amplifican al
menos cuatro marcadores diferentes. De esta manera, para un
diagnóstico posterior se crea una mejor base de datos que excluye
posibles falsas evaluaciones inconvenientes.
En otra realización ventajosa de la invención,
se prepara el diagnóstico de la neurofibromatosis del tipo 1. A
este fin, se usa al menos un marcador microsatélite polimorfo del
intrón 27 del gen NF-1. Además, se prefiere usar
por lo menos otro marcador microsatélite polimorfo, del intrón 38
del gen NF-1. Se logran resultados óptimos, si en
total se usan tres o cuatro marcadores de los intrones nombrados.
Esto es conveniente, porque se demostró que en un número
mayoritario de los pacientes de riesgo examinados, al menos uno de
los marcadores nombrados es informativo. Un marcador es informativo
en una persona cuando el segmento correspondiente de ADN es
polimorfo y está presente en dos longitudes diferentes en ambas
copias del genotipo. De esta manera, mediante los marcadores
nombrados se asegura con alta probabilidad que en la representación
gráfica de los marcadores resultan dos picos debido a las
longitudes diferentes.
Entonces, como paso preparativo para el
diagnóstico, un médico puede comparar los dos picos de la
representación gráfica de los marcadores de la sangre del paciente
examinado con el resultado de la representación gráfica de la
longitud de los marcadores microsatélite de ADN del tumor, para
detectar una posible PDH (pérdida de heteroci-
gocia = PDH). La invención aquí incluye el reconocimiento de que los neurofibromas de las personas a quienes se ha extraído material tumoral en el 30% de los casos presentan una pérdida de la heterocigocia cuando se trata de la neurofibromatosis del tipo 1. En el caso de tumores asociados a la neurofibromatosis del tipo 2, la frecuencia de la PDH es aún mayor. De esta manera y debido al hecho de que los pacientes de NF-1 presentan muchos neurofibromas, la probabilidad de que la PDH esté presente en alguno de los neurofibromas del enfermo es muy alta y también lo es la probabilidad de que por ello también esté presente en el material tumoral puesto a disposición y pueda ser reconocida. La PDH entonces se reconoce en la representación gráfica de los marcadores, porque en el material tumoral puede reconocerse sólo un pico o un desequilibrio de los dos picos del marcador correspondiente. Ambas cosas significan que el tumor correspondiente ha perdido un alelo. Después de detectar una PDH, se examina el mismo marcador a partir de la sangre de la persona de riesgo.
gocia = PDH). La invención aquí incluye el reconocimiento de que los neurofibromas de las personas a quienes se ha extraído material tumoral en el 30% de los casos presentan una pérdida de la heterocigocia cuando se trata de la neurofibromatosis del tipo 1. En el caso de tumores asociados a la neurofibromatosis del tipo 2, la frecuencia de la PDH es aún mayor. De esta manera y debido al hecho de que los pacientes de NF-1 presentan muchos neurofibromas, la probabilidad de que la PDH esté presente en alguno de los neurofibromas del enfermo es muy alta y también lo es la probabilidad de que por ello también esté presente en el material tumoral puesto a disposición y pueda ser reconocida. La PDH entonces se reconoce en la representación gráfica de los marcadores, porque en el material tumoral puede reconocerse sólo un pico o un desequilibrio de los dos picos del marcador correspondiente. Ambas cosas significan que el tumor correspondiente ha perdido un alelo. Después de detectar una PDH, se examina el mismo marcador a partir de la sangre de la persona de riesgo.
En otra realización ventajosa de la invención,
los pasos c), e), g), i) se repiten al menos una vez. De esta
manera puede examinarse o confirmarse nuevamente una pérdida de un
alelo. De esta forma puede lograrse una confirmación de los
primeros resultados, si en una PDH la pérdida del alelo también se
confirma en al menos otra determinación.
En otra realización preferida, tal PDH se
examina en al menos otro tumor del paciente afectado, es decir, se
llevan a cabo los pasos antes nombrados con al menos otro tumor del
paciente afectado, si éste está a disposición. De esta forma puede
aumentarse aún más la fiabilidad de los datos obtenidos. Esto
particularmente es conveniente para el diagnóstico prenatal.
Otro ejemplo de realización de la invención
también lleva a cabo los pasos b), d), f), h) y j) con la sangre
del progenitor no afectado, en el caso de que paciente de riesgo sea
un niño de ambos progenitores. De esta forma, pueden detectarse
alelos no afectados. Esto, por un lado sirve también para aumentar
la fiabilidad de los datos obtenidos y por otro lado, en ciertos
casos es indispensable para evaluar los datos obtenidos para el
diagnóstico. Como ejemplo, es de mencionar que es posible que en la
representación gráfica de los alelos del paciente afectado se
demuestre que posee los alelos A y B. En la representación gráfica
de los alelos del paciente de riesgo, es decir, en este caso, del
hijo del paciente afectado, se demuestra que el hijo también posee
los alelos A y B. En la representación gráfica del material tumoral
del paciente afectado se demuestra que en el tumor se ha perdido el
alelo A. En tal caso, los datos obtenidos serían una base insegura
para un diagnóstico correcto, porque no está claro cuál de los
alelos A y B proviene del afectado. En este caso, en la presente
realización se analiza la sangre del progenitor no afectado. De esta
forma se averigua qué alelos provienen del progenitor no afectado.
Si en el presente caso el progenitor no afectado tiene los alelos A
y C, está claro que el alelo A sólo puede provenir del progenitor no
afectado. En este ejemplo entonces estaría igualmente claro que el
alelo B, que probablemente sea exclusivamente responsable de la
enfermedad del progenitor afectado, haya sido heredado por el hijo.
Por ello, el hijo en este caso presenta un riesgo aumentado de
enfermar.
En el caso de NF2, demostró ser ventajoso usar
al menos un marcador CRYB2, D22S275, NF2CA3, D22S268, D22S430.
La totalidad de los datos proporcionados
mediante el procedimiento conforme a la invención y su procesamiento
gráfico entonces posibilitan al médico que finalmente emite el
diagnóstico evaluar si en el paciente de riesgo examinado puede
excluirse la enfermedad. Porque si por ejemplo el médico que examina
constata que el alelo que todavía se encuentra en el tumor no fue
heredado del pariente, (como, por ejemplo, en el ejemplo
representado más adelante) puede excluirse la aparición de la
correspondiente enfermedad del gen supresor de tumores.
Sin embargo, además, el médico también puede
emitir un diagnóstico cuando el paciente de riesgo ha heredado el
alelo remanente en el tumor.
En tal caso, resultan dos posibilidades de
diagnóstico:
- 1.
- Si en tal caso, por ejemplo los abuelos del paciente de riesgo ya habían sido afectados por la correspondiente enfermedad del gen supresor de tumores, puede suponerse que el paciente de riesgo también ha heredado la enfermedad.
- 2.
- En cambio, si la enfermedad apareció por primera vez en los progenitores afectados (esporádicamente), por el otro lado existe la posibilidad de que se trate de la formación de un mosaico, con una probabilidad del 20 al 30%, de manera que habrá una probabilidad reducida de que el paciente de riesgo haya heredado la modificación genética de los progenitores afectados por la enfermedad del gen supresor tumoral.
El procedimiento conforme a la invención puede
usarse particularmente para la preparación del diagnóstico
presintomático y prenatal de neurofibromatosis. A continuación,
como ejemplo de realización de la presente invención, se explica la
aplicación del procedimiento en pacientes con riesgo de
neurofibromatosis:
Se dispone de material tumoral en forma de
bloques de parafina de un gran número de pacientes, debido a la
operación de tumores dérmicos deformantes de NF1. En cualquier
momento puede efectuarse sin complicaciones la extirpación de un
tumor por razones cosméticas. Además, existe una reserva de material
tumoral congelado. Todos los tumores existentes de un paciente se
incluyen en el análisis conforme a la invención.
De la sangre y del material tumoral del paciente
que se examina se aísla ADN mediante los kits QIAquick Blood y
QIAquick Tissue Kit de la empresa Qiagen. El procedimiento está
descrito por la empresa en las instrucciones para el kit.
Se amplifican cuatro marcadores microsatélite
polimorfos a partir del ADN de la sangre y del tumor, que se
encuentran en los intrones 27 y 38 del gen NF-1. De
cada paciente al menos dos de estos cuatro marcadores deberían ser
informativos; de lo contrario se usará un marcador adicional.
Con cebadores (oligonucleótidos) de
aproximadamente 20 a 24 pares de bases, que flanquean el extremo de
los segmentos de ADN que varían en su longitud, se amplifican los
marcadores mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Este
proceso de amplificación se lleva a cabo en 10 \mul de solución de
reacción que contiene ADN sanguíneo o tumoral, oligonucleótidos
como cebadores, dNTPs, tampones, polimerasa de Taq y agua. La PCR
se lleva a cabo en un termociclador. Para el siguiente análisis, se
marcan los cebadores con colorante fluorescente.
Se mezclan en conjunto de 0,1 a 1 \mul de cada
uno de los cuatro marcadores amplificados. Para esto se añade 0,5
de patrón de longitud ROX (empresa ABI) y 12 \mul de formamida
desmineralizada. Se carga esta muestra desnaturalizada por calor en
los capilares de un analizador Genetic Analyser AB1310. En este
proceso de separación se desprenden los segmentos de ADN,
clasificados por sus diferentes longitudes. Los resultados se
representan gráficamente mediante el programa GeneScan (empresa
ABI). De esta manera, los segmentos de ADN se representan en su
longitud y cantidad diferentes.
Cuando un marcador de una persona es
informativo, aparecen dos picos en la representación gráfica de los
marcadores de la sangre de la persona. Se comparan estos datos con
los resultados del análisis del material tumoral. Si un tumor
presenta sólo un pico respecto a este marcador, o un desequilibrio
de los dos picos de los marcadores, esto significa que el tumor ha
perdido un alelo.
7. Para preparar el diagnóstico, puede
compararse entonces este resultado con una representación gráfica
preparada de forma correspondiente, de los marcadores de la sangre
de un paciente de riesgo. Además, se preparan de manera
correspondiente los marcadores de la sangre del progenitor sano.
Para mayor explicación de las ventajas de la
invención, a manera de ejemplo, se ilustra un resultado del
procedimiento conforme a la invención mediante el dibujo adjunto.
El dibujo muestra:
la fig. 1 es una representación de marcadores
microsatélite de ADN, separados por longitud, que fueron
amplificados a partir del ADN de la sangre de un afectado;
la fig. 2 es una muestra de la representación
gráfica por longitud de los mismos marcadores que los de la figura
1, que fueron amplificados a partir de material tumoral del
afectado; y
la fig. 3 es una muestra de la representación
gráfica por longitud de los mismos marcadores, que fueron
amplificados a partir de ADN de la sangre de un descendiente del
afectado conforme a las figuras 1 y 2.
La figura 1 muestra una representación de
marcadores microsatélite de ADN separados por su longitud, que
fueron amplificados a partir del ADN de la sangre de un afectado.
La representación gráfica representa respectivamente la presencia
de los alelos que en la figura se denominan alelo 2 y alelo 3. La
figura 2 muestra la representación gráfica de la longitud de los
mismos marcadores que los de la figura 1, que fueron amplificados a
partir de material tumoral del afectado. Se reconoce, que el alelo
que en la figura 1 se denomina alelo 3 se ha perdido en el tumor
del afectado. La figura 3 muestra una representación gráfica por
longitud de los mismos marcadores, que fueron amplificados a partir
del ADN de la sangre de un descendiente del afectado conforme a las
figuras 1 y 2. En la figura 3 se reconoce que el descendiente del
afectado no ha heredado el alelo 2 que todavía está presente en el
tumor. El descendiente, de los alelos 2 y 3 sólo ha heredado el
alelo 3, que se ha perdido en el tumor. Como otro alelo, el
descendiente además ha heredado el alelo 1, del otro progenitor.
Para preparar el diagnóstico del descendiente, de esta manera puede
afirmarse que el descendiente no ha heredado el alelo que en forma
probable es el alelo exclusivamente responsable de la
enfermedad.
Claims (8)
1. Procedimiento para adquirir datos para la
preparación del diagnóstico presintomático o prenatal de
neurofibromatosis del tipo 1 en un paciente de riesgo, con los
pasos:
- a)
- se aísla ADN tumoral a partir de material tumoral de un pariente que padece la enfermedad del gen supresor tumoral del paciente de riesgo,
- b)
- se aísla ADN sanguíneo de la sangre del pariente,
- c)
- a partir del material tumoral se amplifican al menos dos marcadores microsatélite polimorfos de ADN,
- d)
- se amplifican los marcadores microsatélite polimorfos de ADN a partir de la sangre,
- e)
- se separan por longitud los al menos dos marcadores microsatélite polimorfos de ADN del material tumoral,
- f)
- se separan por longitud los al menos dos marcadores microsatélite polimorfos de ADN de la sangre,
- g)
- se representan las longitudes de los marcadores microsatélite polimorfos de ADN a partir del material tumoral,
- h)
- se representan las longitudes de los marcadores microsatélite polimorfos de ADN a partir de la sangre,
- i)
- se repiten los pasos b), d), f) h) con la sangre del paciente de riesgo, tratándose en el caso de los marcadores de marcadores que flanquean un gen de la neurofibromatosis o de marcadores intragénicos,
- tratándose en el caso del pariente de un progenitor del paciente de riesgo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que en el caso de los al menos dos marcadores polimorfos se
trata de marcadores cortos, preferentemente de una longitud de
aproximadamente 300 pares de bases.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que se usan al menos tres, más
preferentemente cuatro marcadores diferentes.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que al menos uno de los
marcadores se encuentra en el intrón 27 del gen de la
neurofibromatosis del tipo 1.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que al menos uno de los
marcadores se encuentra en el intrón 38 del gen de la
neurofibromatosis del tipo 1.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, que comprende los siguientes pasos
adicionales:
los pasos a), c), e), g) se repiten al menos una
vez.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, que
comprende los siguientes pasos adicionales:
los pasos a), c), e), g) se repiten con al menos
un tumor adicional del pariente.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, que comprende los siguientes pasos
adicionales:
los pasos b), d), f), h) se llevan a cabo
también con la sangre del progenitor no afectado, si en el caso del
paciente de riesgo se trata de un hijo de ambos progenitores.
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