ES2291534T3

ES2291534T3 - Metodo para la produccion de proteinas recombinantes en celulas eucariotas.

Info

Publication number: ES2291534T3
Application number: ES02800041T
Authority: ES
Inventors: Ida Moelgaard Knudsen
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 2001-10-02
Filing date: 2002-09-20
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2022-09-20
Also published as: DE60221553T2; US20030096366A1; CN1309825C; PL368119A1; ATE368730T1; HUP0402158A2; CN1564863A; JP4351049B2; BR0212780A; KR20040039472A; WO2003029442A1; US20060194289A1; EP1434857B1; CA2460206A1; EP1434857A1; JP2005518190A; CA2460206C; US20080064068A1; US7947471B2; DE60221553D1

Abstract

Método para la producción de polipéptidos en células eucariotas, que incluye las etapas de (i) cultivo de las células que expresan dicho polipéptido en microportadores bajo unas condiciones y a una temperatura de valor consignado apropiados para la expresión de dicho polipéptido; (ii) enfriamiento del cultivo a una temperatura predeterminada por debajo de dicho valor consignado; (iii) sedimentación de los microportadores; y (iv) cosecha de todo o parte del medio de cultivo.

Description

Método para la producción de proteínas recombinantes en células eucariotas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para cultivar células eucariotas y para producir proteínas recombinantes en cultivos a gran escala o a escala industrial de tales células.

Antecedentes de la invención

El cultivo de microportadores es muy usado dentro del área del cultivo de células. En el cultivo de microportadores las células son sea inmovilizadas por fijación sobre la superficie de los microportadores sólidos o sea por fijación a o por atrapamiento físico dentro de la estructura interna de los microportadores macroporosos. Cuando se usa un cultivo de microportadores se necesita una metodología para retener los portadores con células en el vaso de cultivo mientras que se cosecha el sobrenadante del cultivo. Un tipo de proceso basado en microportadores es el proceso de perfusión continua, en el que el sobrenadante del cultivo es continuamente cosechado y un medio nuevo es continuamente añadido. En este tipo de proceso los microportadores son normalmente retenidos mediante un decantador gravitacional o un filtro interno en el vaso de cultivo. Otro tipo de proceso basado en microportadores es el proceso semicontinuo en el que la cosecha tipo discontinuo del sobrenadante de cultivo y la adición de un medio nuevo es realizada con intervalos regulares. En este tipo de proceso los microportadores son más fácilmente retenidos parando el agitador del vaso de cultivo y de ese modo dejando los portadores con sedimento de células en el fondo del vaso. Cuando los portadores con contenido celular han sedimentado, parte del sobrenadante de cultivo es cosechado y sustituido con un medio nuevo, en el que después el agitador se pondrá en funcionamiento otra vez. No obstante, la falta de agitación durante la sedimentación pone a las células en peligro de ser sometidas a una falta de oxígeno o de nutrientes. La presente invención proporciona un método mejorado que mejora la capacidad de las células para resistir las condiciones mientras que son sedimentadas en el fondo del vaso y de este modo obtener un efecto positivo en el rendimiento global del cultivo.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método mejorado para cultivar células, en particular para producir los polipéptidos deseados, caracterizada por el hecho de que incluye una fase de enfriamiento antes de la sedimentación de los portadores y la cosecha del sobrenadante del cultivo conteniendo el producto.

En un aspecto, la invención proporciona un método para la producción de polipéptidos en células eucariotas, que incluye las etapas de (i) cultivo de las células que expresan dicho polipéptido en microportadores bajo unas condiciones y a un valor consignado de temperatura apropiado para la expresión de dicho polipéptido; (ii) enfriamiento del cultivo a una temperatura predeterminada por debajo de dicho valor consignado; (iii) sedimentación de los microportadores; y (iv) cosecha de todo o parte del medio de cultivo.

En algunas formas de realización el método además comprende una fase de adición del medio fresco al vaso de cultivo después de dicha cosecha.

En algunas formas de realización el método además comprende una fase de recuperación de dicho polipéptido del medio de cultivo cosechado.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para el cultivo de células eucariotas, que incluyen las etapas de (i) cultivo de las células en microportadores bajo unas condiciones y a un valor consignado de temperatura apropiado para mantener el cultivo; (ii) enfriamiento del cultivo a una temperatura predeterminada por debajo de dicho valor consignado; (iii) sedimentación de los microportadores; y (iv) cosecha de todo o parte del medio de cultivo.

En algunas formas de realización el método es un método a gran escala o a escala industrial.

En otro aspecto la invención proporciona un método para cosechar los polipéptidos producidos por células eucarióticas que crecen en un cultivo de microportadores, dicho método comprendiendo (i) enfriamiento del cultivo a una temperatura predeterminada por debajo del valor consignado del cultivo, seguido de (ii) sedimentación de los microportadores.

En algunas formas de realización, antes de permitir que los portadores se sedimenten, el cultivo es enfriado desde la temperatura de crecimiento hasta una temperatura entre aproximadamente 5ºC y 30ºC por debajo del valor consignado de temperatura del cultivo, o entre aproximadamente 5ºC y 20ºC por debajo del valor consignado, o entre 5ºC y 15ºC por debajo del valor consignado, o aproximadamente 5ºC; 10ºC; 15ºC o 20ºC por debajo del valor consignado de temperatura del cultivo.

En algunas formas de realización el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 18ºC y aproximadamente 32ºC antes de permitir que los portadores se sedimenten o entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 30ºC, o entre aproximadamente 22ºC y aproximadamente 28ºC, o entre aproximadamente 24ºC y aproximadamente 28ºC, o entre aproximadamente 25ºC y aproximadamente 27ºC.

En algunas formas de realización, las células usadas son células de insectos. En algunas formas de realización, las células usadas son células mamíferas. En algunas formas de realización de las mismas, las células usadas son células BHK; en otras formas de realización, las células son células CHO; en otras formas de realización, las células son células HEK; en otras formas de realización, las células son células COS; en otras formas de realización, las células son celulasa HeLa. Son preferidas las células BHK y CHO, en particular las células CHO.

En algunas formas de realización los microportadores son portadores sólidos; en algunas formas de realización los microportadores son portadores macroporosos; en algunas formas de realización los microportadores son portadores macroporosos que tienen una carga de superficie positiva.

En algunas formas de realización, las células producen un polipéptido deseado, preferiblemente un factor de coagulación y más preferiblemente el factor VII humano o un polipéptido relacionado con el factor VII humano, incluyendo, sin limitación, el Factor VII tipo salvaje, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L3051-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/
M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298QFVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, S336G-FVII; S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, S344A-Factor VII, Factor VIIa carente del dominio Gla; y P11 Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/NI45T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315NN317T-FVII, K143N/N145T/R315NN317T-FVII; y FVII teniendo sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos desde 233Thr hasta 240Asn, FVII teniendo sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos desde 304Arg hasta 329Cys.

En algunas formas de realización, la proteína expresada es el factor VII humano. En otras formas de realización, la proteína expresada es el factor VII teniendo sustancialmente la misma actividad biológica o mejorada en comparación con FVII de tipo salvaje. En otras formas de realización, la proteína expresada es un polipéptido relacionado con el factor VII teniendo actividad biológica modificada o reducida en comparación con FVII de tipo salvaje. En otras formas de realización, la proteína expresada es FVIII, FIX, FX, FII, proteína C, un activador del plasminógeno (t-PA, u-PA), PDGF, VEGF, hormona del crecimiento, insulina, interleuquina, interferón, o un anticuerpo, o un fragmento de dichas proteínas.

En algunas formas de realización las células eucariotas cultivadas son células recombinantes, transformadas o modificadas con un vector preparado por recombinación genética in vitro. En algunas formas de realización las células son células humanas que expresan un gen del factor Vil endógeno.

En algunas formas de realización el polipéptido deseado es producido a un nivel de al menos aproximadamente 15 mg/l de cultivo.

En algunas formas de realización, las células usadas en la puesta en práctica la presente invención son células dependientes de fijación fijadas a la superficie de los portadores sólidos o dentro de la estructura interna de los portadores macroporosos por adhesión celular. En otras formas de realización, las células usadas en la puesta en práctica la presente invención son células de suspensión capturadas dentro de la estructura interna de los portadores macroporosos por atrapamiento físico.

En una forma de realización particularmente preferida, las células huéspedes son células BHK 21 o CHO que han sido creadas genéticamente para expresar el factor VII humano o los polipéptidos relacionados con el factor Vil humano y que han sido adaptadas para crecer en la ausencia de suero y otros componentes derivados de animales.

En una serie de formas de realización el medio es un medio carente de componentes derivados de animales. En otras formas de realización el medio carece de componentes derivados de animales y de proteínas ("sin proteínas").

En una forma de realización las células son células CHO, el polipéptido es el factor VII humano, los portadores son portadores macroporosos, el medio es un medio sin proteínas sin componentes derivados de animales, las células son células CHO, el valor consignado de la temperatura del cultivo es aproximadamente 36ºC, y la temperatura a la que se enfría el cultivo antes de la sedimentación de los portadores es aproximadamente 26ºC.

Lista de figuras

Los títulos FVII en los cultivos FFF 1235, FFF 1239, y FFF 1242 están mostrados gráficamente en la Figura 1 (visión de conjunto de cultivos con células CHO en portadores Cytopore en vasos de cultivo de 500 l).

Las cuentas celulares y los títulos FVII para cultivos FFF 1235, FFF 1239, y FFF 1242 están mostrados en la figura 2 hasta la figura 4: FFF 1235, cuentas celulares y títulos FVII (figura 2); FFF 1239, cuentas celulares y títulos FVII (figura 3) y FFF 1242, cuentas celulares y títulos FVII (figura 4).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos para el cultivo basado en microportadores de células eucariotas, particularmente para producir cantidades a gran escala o a escala industrial de polipéptidos deseados que son expresadas por estas células. El tipo de proceso de cultivo en cuestión es un tipo de proceso basado en microportadores con cosecha de tipo discontinuo del sobrenadante de cultivo después de la sedimentación de los portadores.

Se ha descubierto que la aplicación de una fase de enfriamiento antes de la sedimentación de los portadores conteniendo células tiene un efecto positivo en el rendimiento global del cultivo.

Sin la intención de ceñirse a la teoría científica, se cree que la fase de enfriamiento aumenta la capacidad de las células para resistir las condiciones mientras que éstas son sedimentadas en el fondo del vaso de cultivo. Esto, sucesivamente, tiene un efecto positivo en el rendimiento global del cultivo. Durante el periodo de sedimentación, que dura hasta aproximadamente una hora en un vaso de cultivo de 500 l, ningún control de oxígeno puede ser realizado, y la concentración del oxígeno disuelto se reduce rápidamente.

Utilizando el tipo de proceso de microportadores aquí descrito, el bucle de regulación de la temperatura del vaso de cultivo es generalmente desactivado antes de la sedimentación de los portadores; no obstante, no se realiza ningún enfriamiento activo del vaso de cultivo. El único objetivo de desactivar el bucle de regulación de la temperatura es para prevenir un sobrecalentamiento local de las células mientras que éstas son sedimentadas en el fondo del vaso de cultivo. La desactivación no supone un enfriamiento real del vaso de cultivo, y normalmente la reducción de la temperatura es inferior a 1ºC. Se ha descubierto que utilizando una fase de enfriamiento según la presente invención, un enfriamiento de, p. ej.; 10ºC por debajo del valor consignado de la temperatura del cultivo, tal como p. ej., a 26ºC, los requisitos de oxígeno de las células (según ha sido medido por el consumo de oxígeno) se reducen aproximadamente un 50%. El enfriamiento a 20ºC redujo los requisitos de oxígeno de las células aproximadamente un 75%. El cultivo es enfriado a una temperatura predeterminada por debajo del valor consignado de la temperatura del cultivo (p. ej. entre aproximadamente 5ºC y 30ºC, o entre aproximadamente 5ºC y 20ºC, o entre aproximadamente 5ºC y 15ºC, o hasta aproximadamente 5ºC; 10ºC; 15ºC o 20ºC por debajo del valor consignado).

La fase de enfriamiento según la invención se aplica inmediatamente antes de la sedimentación de los portadores. Como se utiliza en este caso, "inmediatamente antes" significa que tan pronto como el contenido del vaso de cultivo ha sido enfriado hasta la temperatura predeterminada, el enfriamiento es detenido y la agitación del vaso es detenida para permitir que los portadores con células se sedimenten en el fondo del vaso.

La duración de la fase de enfriamiento normalmente requiere de 10 a 240 minutos, tal como, p. ej, de 20 a 180 minutos, o de 30 a 120 minutos, dependiendo del tamaño del vaso de cultivo, de la reducción de la temperatura deseada y del método de enfriamiento empleado; no obstante, una fase de enfriamiento de cualquier duración está comprendida por la presente invención. La fase de enfriamiento es por lo tanto inicia normalmente aproximadamente 10 a aproximadamente 240 minutos antes de permitir que los microportadores que contienen células se sedimenten. Por ejemplo, la reducción de la temperatura de un vaso de cultivo de 500 l de una temperatura de cultivo de 36ºC a 26ºC por el suministro de agua de refrigeración a la envoltura del vaso de cultivo normalmente necesita aproximadamente 30 minutos; la reducción de la temperatura de un vaso de cultivo de 5000 l de una temperatura de cultivo de 36ºC a 26ºC por el suministro de agua de refrigeración a la envoltura del vaso de cultivo normalmente también necesita aproximadamente 30 minutos.

La fase es normalmente realizada como sigue: el bucle de regulación de la temperatura del vaso de cultivo es desactivada y el vaso de cultivo es enfriado, por ejemplo manteniendo la válvula para enfriar el agua para la envoltura del vaso de cultivo constantemente abierta. La temperatura es continuamente vigilada y cuando el contenido del vaso de cultivo alcanza una temperatura predeterminada por debajo del valor consignado de temperatura, tal como, p. ej.; 10ºC por debajo del valor consignado del cultivo, se detiene el enfriamiento. A continuación, se detiene el agitador del vaso de cultivo con lo cual los portadores con células son dejados sedimentar. Después de la sedimentación, la parte del sobrenadante del cultivo o medio es cosechada y el medio fresco es añadido al vaso de cultivo para reemplazar el medio cosechado. Cuando el sobrenadante de cultivo ha sido cosechado y el nuevo medio ha sido añadido, el agitador es puesto en funcionamiento y la temperatura es otra vez regulada hasta el valor consignado para el cultivo mediante la activación del bucle de regulación de la temperatura. Los medios frescos que son añadidos son normalmente precalentados a una temperatura cerca del valor consignado del cultivo, p. ej., hasta aproximadamente 30ºC, o más, dependiendo del valor consignado real.

En la puesta en práctica de la presente invención, cualquier método eficaz para el enfriamiento del cultivo puede ser empleado. El vaso de cultivo puede, por ejemplo, ser enfriado suministrando agua de enfriamiento a la envoltura del vaso de cultivo durante un periodo temporal suficiente hasta que la temperatura deseada sea alcanzada, o bien el vaso de cultivo puede ser equipado con un serpentín de enfriamiento que puede luego ser usado solo o en combinación con el enfriamiento de la envoltura mencionado arriba.

Procedimientos de cultivo de células: el cultivo de células de la invención se realiza en un sistema de vaso de cultivo agitado y se emplea un tipo de proceso basado en microportadores. En el proceso basado en microportadores, las células han emigrado a la estructura interna de los portadores (portadores macroporosos) o se han unido ellas mismas a la superficie de los portadores (portadores sólidos), o ambos. En un proceso basado en microportadores, las células eucariotas, los microportadores y el medio de cultivo son suministrados a un vaso de cultivo inicialmente. En los días sucesivos, un medio de cultivo adicional puede ser suministrado si el volumen de cultivo no hubiera alcanzado el volumen de trabajo final del vaso desde el inicio. Durante el periodo siguiente, se realiza la cosecha periódica del sobrenadante del cultivo conteniendo el producto y la sustitución por el nuevo medio, hasta que el cultivo se termine finalmente. Cuando se cosecha el sobrenadante conteniendo el producto, la agitación, p. ej., la remoción, del cultivo es detenida y los portadores conteniendo las células son dejados sedimentar tras lo cual parte del medio de cultivo conteniendo el producto es retirada.

Fases de propagación: antes de alcanzar la fase de producción en la que se realiza una cosecha regular del sobrenadante del cultivo que contiene el producto para un tratamiento de recuperación adicional, las células se propagan de acuerdo con cualquier esquema o rutina que puede ser adecuado para la célula particular en cuestión. La fase de propagación puede hacerse una única fase o un procedimiento de fase múltiple. En un procedimiento de propagación de una única fase, las células son retiradas del almacenamiento e inoculadas directamente en el vaso de cultivo que contiene los microportadores donde va a tener lugar la producción. En un procedimiento de propagación de fase múltiple, las células son eliminadas del almacenamiento y propagadas a través de varios vasos de cultivo de tamaño gradualmente en aumento hasta alcanzar el vaso de cultivo final que contiene los microportadores donde va a tener lugar la producción. Durante las fases de propagación, las células crecen bajo condiciones optimizadas para el crecimiento. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH, oxígeno disuelto y similares, son aquellas conocidas por ser óptimas para la célula particular y serán evidentes para el experto en la materia o trabajador dentro de este campo (ver, p. ej., Animal Cell Culure: A Practical Approach 2ª Ed., Rickwood, D. and Hames, B.D., eds., Oxford University Press, Nueva York (1992)).

En una forma de realización de la presente invención el proceso de cultivo de células es accionado en un vaso de cultivo: las células son inoculadas directamente en el vaso de cultivo que contienen microportadores donde va a tener lugar la producción; las células son propagadas hasta que se alcanza una densidad celular adecuada y comienza la fase de producción.

En otra forma de realización de la presente invención el proceso de cultivo de células es accionado en al menos dos vasos de cultivo diferentes: uno o más vaso(s) de cultivo de semillas (primera(s) fase(s) de propagación segui-
da(s) por la producción en el vaso de cultivo (última fase de propagación seguida por la fase de producción). En la primera fase de propagación, las células que expresan el polipéptido deseado son inoculadas en un medio de cultivo conteniendo el vaso de cultivo de semillas y se propagan hasta que las células alcanzan una densidad de siembra cruzada mínima. Posteriormente, el cultivo de las semillas propagadas es transferido al vaso de cultivo de producción conteniendo (a) el medio de cultivo y (b) los microportadores. En este vaso de cultivo las células son cultivadas bajo condiciones en las que las células migran sobre la superficie de los portadores sólidos o las superficies exteriores e interiores de los portadores macroporosos, y continúan creciendo en esta última fase de propagación hasta que los portadores son completamente colonizados por las células. Durante esta fase de propagación, el intercambio del medio se realiza permitiendo que los microportadores se instalen en el fondo del vaso de cultivo, tras lo cual un porcentaje predeterminado del volumen del tanque es retirado y un porcentaje de volumen del tanque correspondiente del medio fresco es añadido al vaso. Los microportadores son luego resuspendidos en el medio y este proceso de eliminación y sustitución del medio son repetidos a un intervalo predeterminado, por ejemplo cada 24 horas. La cantidad de medio sustituido depende de la densidad celular y puede normalmente ser del 10 al 95%, preferiblemente del 25% al 80%, del volumen del tanque como se muestra en la Tabla 1 más abajo.

Se entiende que en un proceso en el que la fase de propagación es un procedimiento de fase múltiple, la propagación puede ocurrir en vasos de cultivo con un tamaño que aumenta progresivamente hasta que un número suficiente de células sea obtenido para introducirse en el vaso de cultivo final. Por ejemplo, uno o más vasos de cultivo de semillas de 5 l; 50 l; 100 l o 500 l puede(n) ser usado(s) consecutivamente. Un vaso de cultivo de semillas normalmente tiene una capacidad de entre 5 l y 1000 l. Normalmente, las células son inoculadas en un vaso de cultivo de semillas a una densidad inicial de aproximadamente 0,2 a 0,4 X 10^{6} células/ml y se propagan hasta que el cultivo alcanza una densidad celular de aproximadamente 1,0 X 10^{6} células/ml. Normalmente, una densidad de siembra cruzada mínima corresponde a entre 0,8 y aproximadamente 1,5 X 10^{6} células/ml.

Algunos valores asignados que son adecuados para la producción de un polipéptido deseado, p. ej., el factor VII, no son necesariamente adecuados para el crecimiento inicial de las células, bien en el cultivo de semillas o en los microportadores. Por ejemplo, la temperatura, DOT, y/o pH pueden ser diferentes para las dos fases. Los intercambios de medio durante la propagación se hace para mantener las células vivas y en crecimiento, no para cosechar el sobrenadante del cultivo para operaciones de recuperación.

Las condiciones de cultivo posibles para la última fase de propagación en el vaso de cultivo final (conteniendo microportadores) están detalladas en la Tabla 1, a continuación.

TABLA 1

1

Fase de producción: cuando la densidad celular alcanza el valor adecuado para el inicio de la fase de producción, es decir para que el sobrenadante del cultivo conteniendo el producto esté en proceso de recuperación; el 60-95% del sobrenadante del cultivo es cosechado cada 24 horas, preferiblemente el 80%. Este valor de densidad celular corresponde normalmente a 1-12 X 10^{6} células por ml. Los valores asignados pueden ser cambiados en este punto y asignados a valores adecuados para la producción del polipéptido deseado.

El intercambio de medio se realiza permitiendo que los microportadores se instalen en el fondo del tanque, tras lo cual el porcentaje seleccionado del volumen del tanque es retirado y un porcentaje de volumen del tanque correspondiente del medio fresco es añadido al vaso. Entre el 25 y el 90% del volumen del tanque son normalmente sustituidos; preferiblemente; el 80% del volumen del tanque es sustituido por un medio fresco. Los microportadores son luego resuspendidos en el medio y este proceso de retirada del medio y sustitución son normalmente repetidos cada 10 a 48 horas; preferiblemente, cada 24 horas.

Un detalle de este aspecto del proceso está mostrado en la Tabla 2.

TABLA 2

3

Opcionalmente, una caída del valor consignado de la temperatura del cultivo puede ser empleado al introducirse en la fase de producción, y durante la misma.

Cuando se introduce en la fase de producción, la temperatura, el pH operativo y la frecuencia de intercambio del medio son normalmente cambiados a valores que son óptimos para la producción. Ejemplos de gamas y valores de temperatura en la fase de crecimiento y de producción, respectivamente, pueden ser observados en las tablas 1 y 2. Se prefiere una temperatura de aproximadamente 36ºC para una línea celular CHO durante la fase de producción.

Microportadores: Según se utiliza en este caso, los microportadores son partículas que son lo bastante pequeñas para permitir su uso en cultivos de suspensión (con un nivel de agitación que no cause daños de cizalla significantes para las células). Son sólidos, porosos, o tienen un núcleo sólido con un revestimiento poroso en la superficie. Los microportadores pueden estar basados, por ejemplo, sin limitación, en celulosa o en dextrano, y sus superficies (superficie exterior e interior en el caso de los portadores porosos) pueden estar cargadas positivamente.

En una serie de formas de realización, los microportadores tienen un diámetro de partícula global entre aproximadamente 150 y 350 um; y tienen una densidad de carga positiva de entre aproximadamente 0,8 y 2,0 meq/g. En una serie de formas de realización, el microportador es un soporte sólido. Los microportadores sólidos útiles incluyen, sin limitación, Cytodex 1^{TM} y Cytodex 2^{TM} (Amersham pharmacia Biotech, Piscataway NJ). Los portadores sólidos son particularmente adecuados para células de adhesión (células dependientes del anclaje).

En otra serie de formas de realización, el microportador es un portador macroporoso. Según se utiliza en este caso, los portadores macroporosos son partículas, p. ej. basadas en celulosa, que tienen las propiedades siguientes: (a) son lo bastante pequeñas como para permitir su uso en cultivos de suspensión (con un nivel de agitación que no cause daños de cizalla significantes para las células); y (b) tienen poros y espacios interiores de tamaño suficiente para permitir que las células migren a los espacios interiores de la partícula. Sus superficies (exterior y interior) pueden ser cargadas positivamente en una forma de realización. En una serie de formas de realización, los portadores: (a) tienen un diámetro de partícula global entre aproximadamente 150 y 350 um; (b) tienen poros con un promedio de diámetro de abertura de poro de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 um; y (c) tienen una densidad de carga positiva de entre aproximadamente 0,8 y 2,0 meq/g. En algunas formas de realización, la carga positiva está provista de grupos DEAE (N, N,-dietilaminoetilo). Los portadores macroporosos útiles incluyen, sin limitación, Cytopore 1^{TM} y Cytopore 2^{TM} (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ). Particularmente son preferidos los portadores Cytopore 1^{TM}, que tienen un diámetro de partícula medio de 230 um, un tamaño de poro de promedio de 30 um, y una densidad de carga positiva de 1,1 meq/g.

Condiciones de cultivo a gran escala: Según se utiliza en este caso, un vaso de cultivo a gran escala tiene una capacidad de al menos aproximadamente 100 l, preferiblemente al menos aproximadamente 500 l, más preferiblemente al menos aproximadamente 1000 l y más preferiblemente al menos aproximadamente 5000 l. Cuando el proceso de cultivo de células es accionado en al menos dos vasos de cultivo diferentes, tal como uno o más vaso(s) de cultivo de semillas (primera(s) fase(s) de propagación seguida del vaso de cultivo de producción (última fase de propagación seguida de la fase de producción), entonces el proceso normalmente implica la transferencia de aproximadamente 50 l del cultivo de semillas propagadas (que contiene aproximadamente 1,0 x 10^{6} células/ml) en un vaso de cultivo de 500 l que contiene 150 l de medio de cultivo. El cultivo a gran escala es mantenido bajo condiciones apropiadas de, p. ej., temperatura, pH, tensión de oxígeno disuelto (DOT), y nivel de agitación, y el volumen es gradualmente aumentado añadiendo el medio al vaso de cultivo. En el caso de un proceso con microportadores el vaso de cultivo también comprende una cantidad de microportadores correspondiente a una concentración de microportadores final en la gama de 1 a 10 g/l. Después de la transferencia, las células normalmente migran sobre la superficie de los portadores o en el interior de los portadores dentro de las primeras 24 horas. El término "proceso a gran escala" puede ser usado de forma intercambiable con el término "proceso a escala industrial". Además, el término "vaso de cultivo" puede ser usado de forma intercambiable con "tanque", "reactor", "fermentador" y "biorreactor".

Células: al poner en práctica la presente invención, las células que son cultivadas son preferiblemente células eucariotas, más preferiblemente una línea celular eucariota establecida, que incluye, sin limitación, las líneas celulares CHO (p. ej., ATCC CCL 61), COS-1 (p. ej., ATCC CRL 1650), riñón de cría de hámster (BHK), y HEK293 (p. ej., ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Una línea celular BHK preferida es la línea celular tk- ts13 BHK (Waetcher y Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), de ahora en adelante referido como BHK 570 células. La línea celular BHK 570 está disponible por la American Type Culture Collection; 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852; bajo el número de acceso de ATCC CRL 10314. Una línea celular tk^{-} ts13 BHK está también disponible por la ATCC bajo el número de acceso CRL 1632.

Una línea celular CHO preferida es la línea celular CHO K1 disponible por la ATCC bajo el número de acceso CCI61.

Otras líneas celulares adecuadas incluyen, sin limitación, células Hep I de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Hep II de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), de pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9,1); DUKX (línea celular CHO)(Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) (las células DUKX también se denominan células DXB11), y DG44 (línea celular CHO) (Cell, 33:405, 1983, y Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555, 1986). También son útiles las células 3T3, células de Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras células. En algunas formas de realización, las células pueden ser células mutantes o recombinantes, tales como p. ej., las células que expresan de forma cualitativa o cuantitativa un espectro diferente de enzimas que catalizan la modificación postraduccional de las proteínas (p. ej., enzimas de glicosilación tales como las glicosil transferasas y/o glicosidasas, o enzimas de procesamiento tales como los propéptidos) que el tipo celular del cual fueron derivadas. Las líneas celulares de insecto adecuadas también incluyen, sin limitación, las líneas celulares de lepidópteros, tales como células de Spodoptera frugiperda o células Trichoplusia ni (ver, p. ej., US 5.077.214).

En algunas formas de realización, las células usadas para poner en práctica la invención son capaces de crecer en cultivos de suspensión. Según se utiliza en la presente, las células competentes de suspensión son aquellas que pueden crecer en suspensión, sin hacer grandes agregados firmes, es decir, células que son monodispersas o que crecen en agregados sueltos con sólo algunas células por agregado. Las células competentes en suspensión incluyen, sin limitación, las células que crecen en suspensión sin adaptación o manipulación (tales como p. ej., células hematopoyéticas o linfoides) y las células que han sido hechas competentes en suspensión por adaptación gradual de las células dependientes de la fijación (tales como p. ej., las células epiteliales o de fibroblastos) para el crecimiento en suspensión.

Las células usadas para poner en práctica la invención pueden ser células de adhesión (también conocidas como dependientes del anclaje o células dependientes de la fijación). Como se utiliza en este caso, las células de adhesión son aquellas que necesitan adherirse o anclarse a una superficie adecuada para su propagación y crecimiento. En una forma de realización de la invención, las células usadas son células de adhesión. En estas formas de realización, las fases de propagación y la fase de producción incluyen el uso de microportadores. Las células de adhesión usadas deberían ser capaces de migrar sobre los portadores (y en la estructura interior de los portadores si se usa un portador macroporoso) durante la(s) fase(s) de propagación y para migrar a portadores nuevos cuando son transferidas al biorreactor de producción. Si las células de adhesión no son lo suficientemente capaces de migrar a nuevos portadores por sí mismas, éstas pueden ser liberadas de los portadores poniendo en contacto a los microportadores conteniendo células con las enzimas proteolíticas o EDTA. El medio usado (particularmente cuando está libre de componentes derivados de animales) debería además contener componentes adecuados para soportar células de adhesión; medios adecuados para el cultivo de células de adhesión están disponibles por proveedores comerciales, como p. ej., Sigma.

Las células pueden también ser células adaptadas en suspensión o competentes en suspensión. Si se usan estas células, la propagación de células puede hacerse en suspensión, de este modo los microportadores son sólo usados en la fase de propagación final en el propio vaso de cultivo de producción y en la fase de producción. En el caso de las células adaptadas en suspensión, los microportadores usados son portadores normalmente macroporosos donde las células son fijadas mediante atrapamiento físico dentro de la estructura interna de los portadores.

Medio: los términos "medio de cultivo de células" y "medio de cultivo" se refieren a una solución nutriente usada para hacer crecer células eucariotas que normalmente proporciona al menos un componente de una o más de las siguientes categorías: (1) sales de p. ej. sodio, potasio, magnesio, y calcio que contribuyen a la osmolalidad del medio; (2) una fuente de energía, normalmente en forma de un carbohidrato como la glucosa; (3) todos los aminoácidos esenciales, y normalmente el grupo básico de veinte aminoácidos; (4) vitaminas y/u otros compuestos orgánicos requeridos a bajas concentraciones; y (5) elementos traza, donde elementos traza se definen como compuestos inorgánicos que son normalmente requeridos a concentraciones muy bajas, normalmente en la gama micromolar. La solución nutriente puede opcionalmente ser suplementada con uno o más de los componentes de cualquiera de las siguientes categorías: (a) suero animal; (b) hormonas y otros factores de crecimiento tales como, por ejemplo, insulina, transferrina, y factor de crecimiento epidérmico; y (c) hidrolizados de proteínas y tejidos.

La presente invención comprende el cultivo de células eucariotas en el medio que comprende componentes derivados de animales, p. ej. suero o componentes del suero, así como en el medio carente de componentes derivados de animales. El medio de cultivo de células comprendiendo componentes derivados de animales (tales como, p. ej., suero fetal bovino (FBS) puede comprender más del 5% de suero o entre el 0-5% suero, tal como, por ejemplo, entre el 0-1% de suero o el 0-0,1% de suero. Los medios carentes de componentes derivados de animales son preferidos. Como se utiliza en este caso, los componentes "derivados de animales" son componentes cualquiera que son producidos en un animal intacto (tales como p. ej., proteínas aisladas y purificadas de suero), o que son producidos usando componentes producidos en un animal intacto (tales como p. ej., un aminoácido hecho usando una enzima aislada y purificada de un animal para hidrolizar un material de una fuente vegetal). En contraste, una proteína que tiene la secuencia de una proteína animal (es decir, que tiene un origen genómico en un animal) pero que es producida in vitro en un cultivo de células (tal como p. ej., en una levadura recombinante o célula bacteriana o en una línea celular eucariota continua establecida, recombinante o no), en medios carentes de componentes que son producidos en, y aislados y purificados de un animal intacto no es un componente "derivado de un animal" (tal como, p. ej., la insulina producida en una levadura o una célula bacteriana, o la insulina producida en una línea celular de mamífero establecida, tal como, p. ej., células CHO, BHK o HEK, o interferón producido en células de Namalwa). Por ejemplo, una proteína que tiene la secuencia de una proteína animal (es decir, tiene un origen genómico en un animal) pero que es producida en una célula recombinante en medios carentes de componentes animales (tales como, p. ej., insulina producida en una levadura o célula bacteriana) no es un "componente derivado de un animal". Por consiguiente, un medio de cultivo de células carente de componentes derivados de animales es uno que puede contener proteínas animales que son producidas por recombinación; un medio de este tipo, no obstante, no contiene, p. ej., suero animal o proteínas u otros productos purificados del suero animal. Un medio de este tipo puede, por ejemplo, contener uno o más componentes derivados de plantas. Se puede usar cualquier medio de cultivo de células, en particular uno carente de componentes derivados de animales, que soporte el crecimiento celular y la conservación bajo las condiciones de la invención. Normalmente, el medio contiene agua, un regulador de la osmolalidad, un tampón, una fuente de energía, aminoácidos, una fuente de hierro inorgánica o recombinante, uno o varios factores de crecimiento sintéticos o recombinantes, vitaminas, y cofactores. En una forma de realización, el medio carece de componentes derivados de animales y carece de proteínas ("sin proteínas"). Los medios carentes de componentes derivados de animales y/o proteínas están disponibles por proveedores comerciales, tales como por ejemplo, Sigma, JRH Biosciences, Gibco y Gemini.

Además de los componentes convencionales, un medio adecuado para producir el factor VII o polipéptidos relacionados con el factor VII contiene Vitamina K la cual se requiere para la \gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico en factor VII, a una concentración entre aproximadamente 0,1-50 mg/litro, preferiblemente entre aproximadamente 0,5-25 mg/litro, más preferiblemente entre aproximadamente 1-10 mg/litro y más preferiblemente aproximadamente 5 mg/litro.

Los medios adecuados para el uso en la presente invención están disponibles por proveedores comerciales tales como por ejemplo, Gibco, y JRH Biosciences.

En una forma de realización, el medio está compuesto como se muestra en Tabla 3, opcionalmente suplementado con uno o más de los componentes mostrados en la Tabla 4. La tabla siguiente (Tabla 3) es una composición de un medio adecuado para el uso en la presente invención. Opcionalmente, uno o más de los componentes enumerados en la Tabla 4 es/son añadidos al medio de cultivo. Las gamas preferidas están enumeradas en la Tabla 4. En una forma de realización, el medio usado es el Medio 318-X; en otra forma de realización, es el medio CHO-K.

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TABLA 3

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Componentes opcionales TABLA 4

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En otra forma de realización, el medio usado tiene la composición siguiente (medio 318-U):

TABLA 5

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El medio es preferiblemente un medio carente de componentes derivados de animales, o un medio carente de componentes derivados de animales y carente de proteínas ("sin proteínas").

En una forma de realización el medio es un medio CHO sin proteínas comercialmente disponible carente de componentes derivados de animales (JRH Biosciences) y la línea celular es una célula CHO. En una forma de realización, el medio es el medio 318-X y la línea celular es una línea celular BHK; en otra forma de realización, el medio es el medio 318-U y la línea celular es una línea celular BHK. En otra forma de realización, el medio es el medio CHO-K y la línea celular es una línea celular CHO.

En algunas formas de realización, las células usadas en la puesta en práctica de la presente invención están adaptadas para el crecimiento en suspensión en un medio carente de componentes derivados de animales tal como p. ej., un medio carente de suero. Tales procedimientos de adaptación están descritos, p. ej., en Scharfenberg, et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21st Century, E.C. Beuvery et al., (Eds.), Kluwer Academic Publishers, págs. 619-623, 1995 (células BHK y CHO); Cruz, Biotechnol. Tech. 11:117-120, 1997 (células de insecto); Keen, Cytotechnol. 17:203-211, 1995 (células de mieloma); Berg et al., Biotechniques 14:972-978, 1993 (células de riñón humano 293). En una forma de realización particularmente preferida, las células huéspedes son células BHK 21 o CHO que han sido creadas genéticamente para expresar el factor VII humano y que han sido adaptadas para crecer en ausencia de suero o de componentes derivados de animales.

Vasos de cultivo: los vasos de cultivo pueden ser p. ej. biorreactores convencionales tipo tanque agitados (CSTR) donde la agitación se obtiene mediante tipos de propulsores convencionales o reactores airlift en los que la agitación se obtiene mediante la introducción de aire desde el fondo del vaso. Entre los parámetros controlados dentro de los límites especificados están el pH, la tensión de oxígeno disuelto (DOT) y la temperatura. El pH puede ser controlado p. ej. variando la concentración de dióxido de carbono (CO_{2}) en el gas del espacio de cabeza y mediante la adición de la base al líquido de cultivo cuando se requiera. La tensión de oxígeno disuelto puede ser mantenida p. ej. por burbujeo con aire u oxígeno puro o mezclas de los mismos. El medio de control de la temperatura es el agua, calentado o enfriado según la necesidad. El agua puede ser pasado a través de una envoltura que comprende el vaso o a través de una bobina de canalización sumergida en el cultivo.

Fases de tratamiento: una vez que el medio ha sido retirado del vaso de cultivo, puede ser sometido a una o más fases de tratamiento para obtener la proteína deseada, incluyendo, sin limitación, centrifugado o filtración para eliminar las células que no fueron inmovilizadas en los portadores; cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía de exclusión de tamaño; procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio (IEF), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación del sulfato amónico), o extracción y similares. Ver, generalmente, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; y Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989).

Purificación del Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII pueden implicar, p. ej., cromatografía de afinidad en una columna de anticuerpos anti-factor VII (ver, p. ej., Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; y Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988) y activación por seccionamiento proteolítico, usando el factor XIIa u otras proteasas con especifidad de tipo tripsina, tales como p. ej., el Factor IXa, kalikreína, factor Xa, y trombina. Ver, p. ej., Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, Patente US No. 4.456.591; y Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). De forma alternativa, el Factor VII puede ser activado pasándolo a través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, tal como mono Q® (Pharmacia) o similares.

Polipéptidos para la producción a gran escala: en algunas formas de realización, las células usadas en la puesta en práctica de la invención son las células humanas que expresan un gen del Factor VII endógeno. En estas células, el gen endógeno puede estar intacto o puede haber sido modificado in situ, o una secuencia externa al gen del Factor VII puede haber sido modificada in situ para alterar la expresión del gen del Factor VII endógeno.

En otras formas de realización, las células de cualquier fuente eucariota son creadas genéticamente para expresar el Factor VII humano a partir de un gen recombinante. Como se utiliza en este caso, "Factor VII" o "polipéptido del Factor VII" engloba el Factor VII tipo salvaje (es decir, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la patente US 4.784.950), así como las variantes del Factor VII que presentan sustancialmente la misma actividad biológica o mejorada con respecto al Factor VII tipo salvaje. El término "Factor VII" se destina a comprender polipéptidos del Factor VII en su forma no dividida (zimógeno), al igual que aquellos que han sido proteolíticamente procesados para producir sus formas bioactivas respectivas, que pueden ser denominadas Factor VIIa. Normalmente, el Factor VII es dividido entre los residuos 152 y 153 para producir el factor VIIa.

Como se utiliza en este caso, "polipéptidos relacionados con el Factor VII" comprende los polipéptidos, que incluyen variantes, donde la actividad biológica del factor VIIa ha sido sustancialmente modificada o reducida con respecto a la actividad del factor VIIa tipo salvaje. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, el Factor VII o Factor VIIa en los que se han introducido alteraciones de la secuencia de aminoácidos específicas que modifican o interrumpen la bioactividad del polipéptido.

La actividad biológica del Factor VIIa en la coagulación sanguínea deriva de su capacidad para (i) enlazarse con el factor tisular (FT) y (ii) catalizar el seccionamiento proteolítico del Factor IX o Factor X para producir el Factor IX o X activado (factor IXa o Xa, respectivamente). Para los fines de la invención, la actividad biológica del Factor VIIa puede ser cuantificada midiendo la capacidad de una preparación para promover la coagulación de la sangre usando plasma deficitario de Factor VII y tromboplastina, como se describe, p. ej., en la patente US 5.997.864. En este ensayo, la actividad biológica se expresa como la reducción del tiempo de coagulación con respecto a una muestra de control y se convierte en "unidades del Factor VII" por comparación con un suero humano estándar agrupado que contiene 1 unidad/ml de actividad del Factor VII. De forma alternativa, la actividad biológica del Factor VIIa puede ser cuantificada (i) midiendo la capacidad del factor VIIa para producir el Factor Xa en un sistema comprendiendo FT incluido en una membrana lipídica y el Factor X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) midiendo la hidrólisis del Factor X en un sistema acuoso; (iii) midiendo su unión física al FT usando un instrumento basado en la resonancia de plasmón superficial (Persson, FEBS Lefts. 413:359-363, 1997) y (iv) midiendo la hidrólisis de un sustrato sintético.

Las variantes del Factor VII que tienen sustancialmente la misma actividad biológica o mejorada con respecto al Factor VIIa tipo salvaje comprenden aquellas que presentan al menos aproximadamente el 25%, preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 75% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de la actividad específica del factor VIIa que ha sido producida en el mismo tipo de célula, cuando se evalúa en uno o varios ensayo(s) de coagulación, ensayo de proteólisis, o ensayo de enlace al FT según el modo descrito anteriormente. Las variantes del Factor VII que tienen actividad biológica sustancialmente reducida con respecto al Factor VIIa tipo salvaje son aquellas que presentan menos de aproximadamente el 25%, preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% y más preferiblemente menos de aproximadamente el 1% de la actividad específica del Factor VIIa tipo salvaje que ha sido producido en el mismo tipo de célula al evaluarse en uno o varios ensayo(s) de coagulación, ensayo de proteólisis, o ensayo de enlace al FT según el modo descrito anteriormente. Las variantes del Factor Vil que tienen una actividad biológica sustancialmente modificada con respecto al Factor VII tipo salvaje incluyen, sin limitación, las variantes del Factor VII que presentan actividad proteolítica del Factor X independiente del FT y aquellas que se enlazan al FT pero no seccionan el Factor X.

Las variantes del Factor VII, si exhiben sustancialmente la misma bioactividad o una mejor que el Factor VII tipo salvaje, o, de forma alternativa, exhiben bioactividad sustancialmente modificada o reducida con respecto al factor VII tipo salvaje, incluyen, sin limitación, polipéptidos con una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del Factor VII tipo salvaje por inserción, deleción, o sustitución de uno o más aminoácidos.

Ejemplos no limitativos de variantes del Factor VII que tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el Factor Vil tipo salvaje incluyen S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); variantes de FVIIa que presentan estabilidad proteolítica aumentada como se describe en la patente US 5.580.560; el Factor VIIa que ha sido seccionado proteoliticamente entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48: 501-505, 1995); formas oxidadas del factor VIIa (Korfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); variantes de FVII como se describe en PCT/DK02/00189; y variantes de FVII que presentan estabilidad proteolítica aumentada como se describe en WO 02/38162 (Scripps Research Institute); variantes de FVII teniendo un dominio Gla modificado y que presentan una unión de membrana mejorada como se describe en WO 99/20767 (Universidad de Minnesota); y variantes de FVII como se describe en WO 01/58935 (Maxygen ApS).

Ejemplos no limitativos de variantes de FVII con actividad biológica aumentada en comparación con FVIIa de tipo salvaje incluyen variantes de FVII como se describe en WO01/83725, WO 02/22776; WO 02/38162 (Scripps Research institute); y variantes de FVIIa con actividad mejorada como se describe en JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.).

Ejemplos no limitativos de variantes del Factor VII con actividad biológica sustancialmente reducida o modificada con respecto al Factor VII tipo salvaje incluyen R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 29: 3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Hoist et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), y Factor VIIa sin el dominio Gla, (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993).

Ejemplos de Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII incluyen, sin limitación, Factor VII tipo salvaje, Factor VII, L305V-FVII, L305V/M306D/D3095-FVII, L3051-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII,
V158D/E296V/M29SQ/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, S336G-FV)); S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, S344A-Factor VII, Factor VIIa sin el dominio Gla; y P11Q/
K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FV)), V253N-FVII, R290N/A292T-FVH, G291N-FVII, R315NN317T-FVII, K143N/N145T/R315NN317T-FVII; y FVII con sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos desde 233Thr hasta 24OAsn, FVII con sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos desde 304Arg hasta 329Cys.

La presente invención también comprende el cultivo, preferiblemente el cultivo a gran escala, de las células eucariotas que expresan una o más proteínas de interés, sea a partir de genes endógenos o después de la introducción en estas células de los genes recombinantes que codifican la proteína. Tales proteínas incluyen; sin limitación, Factor VIII; Factor IX; Factor X; proteína C; factor tisular; renina; hormona del crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento humano; hormona del crecimiento bovino; factor de liberación de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante de la tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona estimuladora del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factor natriurético atrial; agente tensioactivo del pulmón; un activador del plasminógeno tal como activador del plasminógeno de tipo uroquinasa o tipo urina humana o tipo tejido (t-PA); bombesina; trombina; factor del crecimiento hemopoyético; factor-alfa y -beta de la necrosis tumoral; encefalinasa; proteína inflamatoria del macrófago humano (MIP-1-alfa); una albúmina de suero tal como la albúmina de suero humano; sustancia inhibidora de Muller; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como la beta-lactamasa; ADNsa; inhibina; activina; factor del crecimiento vascular endotelial (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento del nervio tal como el factor de crecimiento derivado de las plaquetas NGF-B (PDGF); factor de crecimiento del fibroblasto tal como \alpha-FGF y \beta-FGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, Factor-I y II de crecimiento tipo insulina (IGF-I y II IGF); proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8, y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón-alfa, -beta, y -gamma; factores estimuladores de colonias (CSFs), p. ej., M-CSF, GM CSF, y G-CSF; interleuquinas (ILs), p. ej., IL-1 para IL-10; superóxido-dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración del deterioro; antígeno vírico tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura del SIDA; proteínas de transporte; receptores de localización; adresina; proteínas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos anteriores.

Los ejemplos siguientes están previstos como ilustraciones no limitativas de la presente invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de célula CHO

Un vector plásmido pLN174 para la expresión de FVII humano ha sido descrito (Persson y Nielsen. 1996. FEBS Left. 385: 241-243). En resumen, éste lleva la secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica el FVII humano que incluye el propéptido bajo el control de un promotor de metalotioneina de ratón para la transcripción del ADNc insertado, y el ADNc de dihidrofolato-reductasa de ratón según el control de un promotor temprano SV40 para el uso como un marcador seleccionable.

Para la construcción de un vector plásmido que codifica una secuencia de reconocimiento de gamma-carboxilación, se utilizó un vector de clonación PBluescript II KS+ (Stratagene) conteniendo FVII que codifica el ADNc incluyendo su propéptido (pLN171). (Persson et al. 1997. J. Biol. Chem. 272: 19919-19924). Una secuencia de nucleótidos que codificaba un codón de detención fue insertado en el FVII que codificaba el ADNc después del propéptido de FVII por mutagénesis mediada por PCR inversa en este vector de clonación. El plásmido del molde fue desnaturalizado por tratamiento con NaOH seguido de PCR con las polimerasas Pwo (Boehringer-Mannheim) y Taq (Perkin-Elmer) con los cebadores siguientes:

5'-AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3'

5'-CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC-3'

La mezcla resultante fue digerida con Dpnl para digerir el ADN del molde residual y Escherichia coli fueron transformadas con el producto de la PCR. Se seleccionaron los clones por la presencia de la mutación por secuenciación. El ADNc de un clon correcto fue transferido como un fragmento BamHI-EcoRI al plásmido de expresión pcDNA3 (In-vitrogen). El plásmido resultante fue denominado pLN329. Las células CHO K1 (ATCC CC161) fueron transfectadas con iguales cantidades de pLN174 y pLN329 con el método Fugene6 (Boehriner-Mannheim). Los transfectantes fueron seleccionados por la adición de metotrexato a 1 \muM y G-418 a 0,45 mg/ml. La agrupación de transfectantes fue clonada limitando la dilución y se midió la expresión de FVII de los clones.

Un clon de alta producción fue subclonado adicionalmente y un clon E11 con una expresión de FVII específica de 2,4 pg/célula/día en medio Eagle modificado por Dulbecco con el 10% de suero fetal de ternera fue seleccionado. El clon fue adaptado al cultivo de suspensión sin suero en un medio de CHO comercialmente disponible (JRH Bioscience) sin componentes derivados de animales.

Ejemplo 2

Producción del Factor VII Resumen de las condiciones experimentales

El medio comercialmente disponible sin proteínas para células CHO libres de componentes derivados de animales (JRH Biosciences) fue suplementado con insulina (5 mg/l) y vitamina K1 (5 mg/l) en los tres cultivos del ejemplo.

El tamaño del vaso de cultivo fue de 500 l. El tipo de proceso fue el cultivo de microportadores Cytopore 1 estándar con intercambio discontinuo diario del 80% del medio (400 l) después de la sedimentación de los portadores.

En los cultivos FFF 1239 y FFF 1242 una fase de enfriamiento fue aplicada cada día inmediatamente antes de la sedimentación de los portadores en el intercambio del medio (enfriamiento a 26ºC en FFF 1239; enfriamiento a 26ºC hasta el día 19 seguido de enfriamiento a 20ºC hasta el día 53 en FFF 1242).

En los tres cultivos, los valores estándares consignados fueron usados para los parámetros del cultivo de temperatura, pH, y oxígeno disuelto. El valor consignado de temperatura fue 36,0ºC. Los valores consignados del pH fueron 7.10 para la regulación hacia abajo (por adición de gas CO_{2} al espacio de aire) y 6.80 para la regulación hacia arriba (por adición de una solución de carbonato sódico al líquido de cultivo). El valor consignado para el oxígeno disuelto fue el 50% de saturación con aire.

Resumen de los resultados y conclusiones

En el primero de los tres cultivos, FFF 1235, el clon de CHO de alta producción (como se describe en el Ejemplo 1) fue cultivado en un proceso en microportadores estándar y ninguna fase de enfriamiento fue aplicada. Como se puede observar a partir de la Figura 1 el gráfico sobre los títulos de FVII versus tiempo fue "campaniforme", es decir, se observó un descenso en los títulos de FVII, en este cultivo desde el día 18-20 en adelante. Fue obvio que el descenso fue provocado por un descenso en la densidad de la célula total en el vaso de cultivo, es decir por una pérdida de células del vaso de cultivo.

Durante las fases de enfriamiento realizadas antes de la sedimentación de los portadores en FFF 1239 y FFF 1242 la válvula para el enfriamiento del agua para la envoltura fue mantenida constantemente abierta. La temperatura del agua de refrigeración, que fue el único parámetro decisivo para la duración de la fase de enfriamiento, fue 10-15ºC. El enfriamiento a partir de 36,0ºC hasta 26,0ºC y 20,0ºC, respectivamente, requirió alrededor de 30 minutos y 55 minutos, respectivamente. El medio nuevo añadido al vaso de cultivo después de la cosecha del medio antiguo fue precalentado a 30ºC. Después de la adición del medio nuevo, el bucle de regulación de la temperatura del vaso de cultivo fue activado con el valor consignado de 36,0ºC, y el calentamiento posterior hasta el valor consignado requirió alrededor de 120 minutos, sin tener en cuenta la temperatura meta antes de la sedimentación de los portadores (26,0ºC o 20,0ºC).

El perfil global de los dos cultivos, FFF 1239 y FFF 1242, cuando se aplicaron fases de enfriamiento diarias, fueron similares al cultivo FFF 1235. Las fases de enfriamiento diarias aplicadas inmediatamente antes de la sedimentación de los portadores en FFF 1239 y FFF 1242 tuvo un efecto positivo en las densidades celulares y en los títulos de FVII. Aunque los gráficos fueron además "campaniformes" las fases de enfriamiento hicieron aumentar los valores máximos de las densidades celulares y los títulos FVII (título máximo de FVII en FFF 1239 36 mg/l versus 22 mg/l en FFF 1235) al igual que extendieron el periodo con densidades celulares elevadas y títulos de FVII elevados (periodo con títulos de FVII sobre de 15 mg/l se extendieron de 8-9 días en FFF 1235 a 13-14 días en FFF 1239). Se puede observar que el enfriamiento a 26ºC resultó en las densidades celulares y títulos de FVII máximos.

Resultados Presentaciones gráficas

Los títulos de FVII en FFF 1235, FFF 1239, y FFF 1242 están mostrados gráficamente en la Figura 1.

Las cuentas celulares y los títulos de FVII para los cultivos FFF 1235, FFF 1239, y FFF 1242 están mostrados en la Figura 2 hasta la Figura 4.

La conclusión global extraída de los cultivos FFF 1239 y FFF 1242 es que una fase de enfriamiento antes de la sedimentación diaria de los portadores tiene un efecto positivo en el rendimiento global del cultivo, y que se prefiere la temperatura de 26ºC antes que 20ºC.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante es sólo para la conveniencia lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido bastante cuidado al redactar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO renuncia a toda responsabilidad en este aspecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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<110> Novo Nordisk A/S

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<120> MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN CÉLULAS EUCARIOTAS

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<130> 6480.504-WO

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<160> 2

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

agcgttttag cgccggcgcc ggtgcaggac

\hfill

30

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<210> 2

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgccggcgct aaaacgcttt cctggaggag ctgcggcc

\hfill

38

Claims

1. Método para la producción de polipéptidos en células eucariotas, que incluye las etapas de

(i): cultivo de las células que expresan dicho polipéptido en microportadores bajo unas condiciones y a una temperatura de valor consignado apropiados para la expresión de dicho polipéptido;

(ii): enfriamiento del cultivo a una temperatura predeterminada por debajo de dicho valor consignado;

(iii): sedimentación de los microportadores; y

(iv): cosecha de todo o parte del medio de cultivo.

2. Método según la reivindicación 1, comprendiendo además una fase de adición del medio fresco al vaso de cultivo después de dicha cosecha.

3. Método según la reivindicación 1 o reivindicación 2, comprendiendo además una fase de recuperación de dicho polipéptido del medio de cultivo cosechado.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la temperatura predeterminada es entre aproximadamente 5ºC y 30ºC inferior al valor consignado.

5. Método según la reivindicación 4, donde la temperatura predeterminada es entre aproximadamente 5ºC y 20ºC inferior al valor consignado.

6. Método según la reivindicación 5, donde la temperatura predeterminada es entre aproximadamente 5ºC y 15ºC inferior al valor consignado.

7. Método según la reivindicación 6, donde la temperatura predeterminada es aproximadamente 10ºC inferior al valor consignado.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 18ºC y aproximadamente 32ºC antes de la sedimentación.

9. Método según la reivindicación 7, donde el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 30ºC.

10. Método según la reivindicación 9, donde el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 22ºC y aproximadamente 28ºC.

11. Método según la reivindicación 10, donde el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 24ºC y aproximadamente 28ºC.

12. Método según la reivindicación 11, donde el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 25ºC y aproximadamente 27ºC.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde las células eucariotas son células de insecto.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde las células eucariotas son células mamíferas.

15. Método según la reivindicación 14, donde las células mamíferas están seleccionadas del grupo que consiste en las células HEK, BHK y CHO.

16. Método según la reivindicación 15, donde las células mamíferas son células CHO.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el polipéptido es el factor VII o un polipéptido relacionado con el factor VII.

18. Método según la reivindicación 17, donde el polipéptido es el factor VII tipo salvaje humano.

19. Método según la reivindicación 17, donde el polipéptido es un polipéptido relacionado con el factor VII seleccionado del grupo que consiste en: L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L3051-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII,
L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/
M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-PVII, V158D/
M298K-FVII, S336G-FVII; S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, 5344A-Factor VII, Factor
VIIa sin el dominio Gla; y P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/NI45T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-
FVII, G291 N-FVII, R315NN317T-FVII, K143N/N145T/R315NN317T-FVII; y FVII teniendo sustituciones, adi-
ciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos desde 233Thr hasta 240Asn, FVII teniendo sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos desde 304Arg hasta 329Cys.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde el polipéptido es producido a un nivel de al menos aproximadamente 15 mg/l de cultivo.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polipéptido es el Factor VII humano, las células son células CHO, los portadores son portadores macroporosos, el valor consignado del cultivo es 36ºC, y el cultivo es enfriado hasta aproximadamente 26ºC, antes de permitir que los portadores se sedimenten.

22. Método para el cultivo de células eucariotas, que incluye las etapas de

(i): cultivo de las células en microportadores bajo condiciones y a una temperatura de valor consignado apropiada para mantener el cultivo;

(iii): sedimentación de los microportadores; y

(iv): cosecha de todo o parte del medio de cultivo.

23. Método según la reivindicación 22, comprendiendo además una fase de adición del medio fresco al vaso de cultivo después de dicha cosecha.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23, donde la temperatura predeterminada es entre aproximadamente 5ºC y 30ºC inferior al valor consignado.

25. Método según la reivindicación 24, donde la temperatura predeterminada es entre aproximadamente 5ºC y 20ºC inferior al valor consignado.

26. Método según la reivindicación 25, donde la temperatura predeterminada es entre aproximadamente 5ºC y 15ºC inferior al valor consignado.

27. Método según la reivindicación 26, donde la temperatura predeterminada es aproximadamente 10ºC inferior al valor consignado.

28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23, donde el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 18ºC y aproximadamente 32ºC.

29. Método según la reivindicación 28, donde el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 30ºC.

30. Método según la reivindicación 29, donde el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 22ºC y aproximadamente 28ºC.

31. Método según la reivindicación 30, donde el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 24ºC y aproximadamente 28ºC.

32. Método según la reivindicación 31, donde el cultivo es enfriado a una temperatura entre aproximadamente 25ºC y aproximadamente 27ºC.

33. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 32, donde las células eucariotas son células de insecto.

34. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 32, donde las células eucariotas son células mamíferas.

35. Método según la reivindicación 34, donde las células mamíferas están seleccionadas del grupo que consiste en las células HEK, BHK y CHO.

36. Método según la reivindicación 35, donde las células mamíferas son células CHO.

37. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 36, donde dichas células producen un factor VII deseado o polipéptido relacionado con el factor VII.

38. Método según la reivindicación 37, donde el polipéptido deseado es el factor VII tipo salvaje humano.

39. Método según la reivindicación 38, donde el polipéptido deseado es un polipéptido relacionado con el factor VII seleccionado del grupo que consiste en: L305V-FVII, L305V/M306D/D3095-FVII, L3051-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, VI58T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M29SQ-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/
M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/
M298K-FVII, S336G-FVII; S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, S344A-Factor VII, Factor VIIa sin el dominio Gla; y P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291 N-FVII, R315NN317T-FVII, K143N/N145T/R315NN317T-FVII; y FVII teniendo sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos desde 233Thr hasta 240Asn, FVII teniendo sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos desde 304Arg hasta 329Cys.

40. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 39, donde el polipéptido deseado es producido a un nivel de al menos aproximadamente 15 mg/l de cultivo.

41. Método de cosecha de los polipéptidos producidos por células eucarióticas que crecen en un cultivo de microportadores, dicho método comprendiendo (i) enfriamiento del cultivo a una temperatura predeterminada por debajo del valor consignado del cultivo, seguido de (ii) sedimentación de los microportadores.