ES2292460T3 - Receptor acoplado a proteina g. - Google Patents

Abstract

Una proteína, excepto la existente en la naturaleza, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Description

Receptor acoplado a proteína G.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican un nuevo receptor acoplado a proteína G y al receptor propiamente dicho.

Antecedentes de la invención

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) constituyen una familia de proteínas que comparten una organización estructural común caracterizada por un extremo extracelular N-terminal, 7 hélices alfa hidrófobas que constituyen supuestamente dominios transmembranales y un dominio intracelular C-terminal. Los GPCRs se fijan a una gran diversidad de ligandos que desencadenan señales intracelulares por la activación de proteínas G transductoras (Caron et al., Rec. Prog. Horm. Res. 48:277-290 (1993); Freedman et al., Rec. Prog. Horm. Res. 51:319-353 (1996)).

Aproximadamente el 50-60% de todos los fármacos clínicamente relevantes actúan por modulación de las funciones de diversos GPCRs (Cudermann et al., J. Mol. Med. 73:51-63 (1995)). Presentan interés particular los receptores localizados en el sistema nervioso central. Se sabe que los receptores acoplados a proteínas G en esta región están involucrados en la transmisión, modulación y sensación del dolor. Por tanto, los receptores acoplados a proteínas G derivados del cerebro y la médula espinal pueden utilizarse en ensayos para la identificación de nuevos agentes anestésicos y analgésicos.

Sumario de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de un nuevo receptor acoplado a proteína G que es estructuralmente distinto de los receptores consignados previamente. En esta memoria se hace referencia al mismo como el "receptor B1C3".

En su primer aspecto, la invención está dirigida a una proteína, excepto la existente en la naturaleza, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. El término "constituido funcionalmente por" hace referencia a las proteínas en las cuales la secuencia de SEQ ID NO: 1 ha sufrido adiciones, deleciones, o sustituciones que no alteran sustancialmente las características funcionales del receptor. El término tiene por objeto abarcar proteínas que tienen exactamente la misma secuencia de aminoácidos que la de SEQ ID NO: 1, así como proteínas con diferencias de secuencia que no son sustanciales como se evidencia porque retienen las propiedades básicas, la fijación cualitativa de ligandos y las propiedades fisiológicas del receptor B1C3. El término "excepto la existente en la naturaleza" hace referencia a un compuesto que o bien es expresado por medios recombinantes o que se encuentra en un estado purificado (con preferencia sustancialmente purificado).

En una realización preferida, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de SEQ ID NO: 1. La invención incluye anticuerpos que se fijan preferentemente a dicha proteína (es decir, anticuerpos que tienen al menos una afinidad 100 veces mayor para B1C3 que cualquier otra proteína); y anticuerpos producidos por un proceso que implica la inyección de una preparación farmacéuticamente aceptable de B1C3 en un animal capaz de producción de anticuerpos. Preferiblemente, un anticuerpo monoclonal para B1C3 se produce por administración de B1C3 a un ratón seguida por fusión de las células del bazo del ratón con células de mieloma.

La invención está dirigida también a un polinucleótido, excepto el existente en la naturaleza, que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Este aspecto de la invención abarca polinucleótidos que codifican proteínas constituidas por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, vectores de expresión que comprenden tales polinucleótidos, y células hospedadoras aisladas transformadas con tales vectores. Se incluye también el receptor B1C3 recombinante producido por células hospedadoras aisladas obtenidas de esta manera. Preferiblemente, el polinucleótido que codifica el receptor B1C3 tiene una secuencia constituida por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y los vectores y células hospedadoras aisladas utilizados para la expresión del receptor utilizan también este polinucleótido particular.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para ensayar un compuesto de test respecto a su capacidad para fijarse al receptor B1C3. El método se realiza por incubación de una fuente de B1C3 con un ligando que se sabe se fija al receptor, y con el compuesto de test. La fuente del receptor debería expresar preferiblemente una gran cantidad de B1C3 con relación a otros receptores acoplados a proteínas G. Una vez completada la incubación, la amplitud del compuesto de test para fijarse a B1C3 se determina por la extensión con la que se ha desplazado la fijación del ligando. Preferiblemente, el receptor presente debería tener la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1. Aunque no es esencial, el ensayo de fijación puede ir acompañado por un ensayo para determinar si se ha activado un camino de segundo mensajero, v.g., el camino de la adenil-ciclasa. Esto debería contribuir a determinar si un compuesto particular que se fija a B1C3 actúa como agonista o como antagonista.

Un segundo método para determinar si un compuesto de test es un agonista de B1C3, un método que no requiere ligando alguno, consiste en utilizar un ensayo de señalización de células, v.g., un ensayo que mide la actividad intracelular de adenil-ciclasa o la concentración intracelular de calcio. El compuesto de test debería incubarse generalmente con células que expresen cantidades elevadas de B1C3 con relación a otros receptores acoplados a proteínas G, típicamente una célula transfectada con un vector de expresión que codifica el B1C3 de SEQ ID NO: 1. Los compuestos de test que son agonistas se identifican porque los mismos causan un cambio estadísticamente significativo en los resultados obtenidos por el ensayo de señalización de células cuando se comparan con células de control no expuestas al compuesto de test. Las células de control pueden ser células que no han sido transfectadas o células que han sido transfectadas falsamente con un vector que no produce receptor activo. Sería de esperar que las células que expresan B1C3 expuestas a compuestos de test que son agonistas exhibieran típicamente un aumento significativo en la actividad de adenil-ciclasa o en la concentración intracelular de calcio con relación a las células de control.

Es un hecho bien conocido que, después de estimulación con un agonista, los GPCRs se internalizan. Así pues, otro método que puede utilizarse para identificar un ligando endógeno de B1C3, o para seleccionar los compuestos que actúan como agonistas del receptor, consiste en determinar si una célula que expresa el receptor internaliza el mismo en respuesta al contacto con uno o más compuestos de test. Un método para realizar esto consiste en marcar el receptor B1C3 con una sonda fluorescente (v.g., por expresión del mismo como una proteína de fusión enlazada a la proteína fluorescente verde) y utilizar microscopía para determinar si se produce internalización (véase el Ejemplo 3). Para hacer esto, puede comenzarse con un extracto bruto de compuestos y, si se produce internalización, purificar los factores responsables utilizando métodos estándar de bioquímica.

La invención abarca también un método para determinar si un compuesto de test es un antagonista o agonista inverso de B1C3, que está basado en la conocida activación constitutiva de los receptores acoplados a proteínas G que ocurre cuando dichos receptores se expresan en grandes cantidades. Este método requiere que el DNA que codifica el receptor se incorpore en un vector de expresión de tal manera que el mismo se enlace operativamente a un promotor y que el vector se utilice luego para transfectar un hospedador apropiado. Para producir receptor suficiente para dar como resultado una activación constitutiva del receptor (es decir, activación en ausencia de ligando natural), se prefieren sistemas de expresión capaces de producción abundante de proteínas, v.g., el DNA de B1C3 puede enlazarse operativamente a un promotor de CMV y expresarse en células COS o HEK293. Después de la transfección, las células con receptores activados se seleccionan basándose en que las mismas exhiben una actividad incrementada en un ensayo de señalización de células con relación a células comparables que no han sido transfectadas o que han sido transfectadas con un vector que es incapaz de expresar B1C3 funcional. Típicamente, las células se seleccionarán sea porque las mismas exhiben un cambio estadísticamente significativo en la actividad intracelular de adenil-ciclasa, en la concentración intracelular de calcio, o en la actividad de genes informadores tales como SEAP (fosfatasa alcalina secretada). Las células seleccionadas se ponen en contacto con el compuesto de test y se repite el ensayo de señalización de células para determinar si esto da como resultado una disminución de la actividad con relación a células seleccionadas que no se han puesto en contacto con el compuesto de test. Por ejemplo, una disminución estadísticamente significativa en la actividad de adenil-ciclasa, la concentración de calcio o la actividad de SEAP con relación a células de control indicaría que el compuesto de test es un antagonista de B1C3. Preferiblemente, el B1C3 utilizado en los ensayos tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.

Los ensayos para compuestos que interaccionan con B1C3 pueden realizarse por incubación de una fuente que contiene el receptor (v.g., una célula transformada establemente) con un ligando específico para B1C3 tanto en presencia como en ausencia de compuesto de test y medida de la modulación de la concentración intracelular de calcio. Un aumento o una disminución importante en la señalización de calcio estimulada por el ligando en respuesta al compuesto de test es indicativo de la existencia de una interacción en el receptor B1C3. El receptor preferido es el que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para ensayar un compuesto de test respecto a su capacidad para alterar la expresión de B1C3. Este método se realiza cultivando células que expresan B1C3 en presencia del compuesto de test. Las células se recogen luego y se compara la expresión de B1C3 con la expresión en células de control cultivadas en condiciones esencialmente idénticas pero en ausencia del compuesto de test. El receptor preferido es uno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Un compuesto de test preferido es un oligonucleótido de al menos 15 nucleótidos de longitud que comprende una secuencia complementaria a la secuencia del mRNA de B1C3 utilizado en el ensayo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. La Figura 1 contiene la secuencia de nucleótidos completa de un clon construido por los métodos descritos en la sección de ejemplos. El clon se depositó en la International Depository Authority Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH en la dirección Mascheroder Weg IB, D-3300 Braunschweig, Alemania. El depósito se efectuó el 14 de mayo de 1999 y le fue asignado el número de acceso DSM 12808.

Figura 2. La Figura 2 muestra la secuencia de amino-ácidos deducida de B1C3 de rata. El polinucleótido de la Figura 1 codifica una proteína de 400 aminoácidos de longitud.

Figura 3. La Figura 3 muestra una comparación de secuencias entre B1C3 y las secuencias de los receptores EDG-1 de ratón y rata. B1C3 tiene una homología de aproximadamente 34% con el receptor EDG-1 de ratón y aproximadamente una homología de 33% con el receptor EDG-1 de rata.

Definiciones

La descripción que sigue utiliza varios términos que hace referencia a la tecnología del DNA recombinante. Con objeto de proporcionar una comprensión clara y consistente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, con inclusión del alcance que debe asignarse a dichos términos, se proporcionan las definiciones siguientes.

Vector de clonación: Un plásmido o DNA de fago u otra secuencia de DNA que es capaz de replicarse autónomamente en una célula hospedadora y que se caracteriza por uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento por endonucleasas de restricción. Un fragmento de DNA extraño puede cortarse y empalmarse al vector en estos sitios a fin de producir la replicación y clonación del fragmento. El vector puede contener un marcador adecuado para uso en la identificación de células transformadas. Por ejemplo, un marcador puede proporcionar resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina.

Vector de expresión: Un vector similar a un vector de clonación pero que es capaz de inducir la expresión del DNA que ha sido clonado en él, después de transformación en un hospedador. El DNA clonado se pone usualmente bajo el control de (es decir se enlaza operativamente a) ciertas secuencias reguladoras tales como promotores o intensificadores. Los promotores pueden ser constitutivos, inducibles o reprimibles.

Sustancialmente puro: Tal como se utiliza en esta memoria, "sustancialmente puro" significa que el producto deseado está esencialmente exento de componentes celulares contaminantes. Una proteína o ácido nucleico "sustancialmente pura(o)" comprenderá típicamente al menos 85% de una muestra, prefiriéndose porcentajes mayores. Los contaminantes pueden incluir proteínas, carbohidratos o lípidos. Un método para determinar la pureza de una proteína o ácido nucleico consiste en someter a electroforesis una preparación en una matriz tal como poliacrilamida o agarosa. La pureza se evidencia por la aparición de una sola banda después de la tinción. Otros métodos para evaluar la pureza incluyen cromatografía y centrifugación analítica.

Proteína recombinante: Una proteína recombinante o receptor recombinante es una proteína no endógena producida por la introducción de un vector de expresión en células hospedadoras.

Hospedador: Una célula procariota o eucariota que es el destinatario de un vector de expresión o vector de clonación replicable es el "hospedador" de dicho vector. El término abarca células procariotas o eucariotas que han sido modificadas por ingeniería genética para incorporar un gen deseado en su cromosoma o en su genoma. Ejemplos de células que pueden servir como hospedadores son bien conocidos en la técnica, como lo son los métodos para la transformación celular (véase, v.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour (1989)).

Promotor: Una secuencia de DNA encontrada típicamente en la región 5' de un gen, localizada proximal al codón de partida. La transcripción se inicia en el promotor. Si el promotor es del tipo inducible, entonces la tasa de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor.

Secuencia de nucleótidos complementaria: Una secuencia de nucleótidos complementaria, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la secuencia que se produciría por apareamiento de bases normal. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos 5'-AGAC-3' tendría la secuencia complementaria 5'-GTCT-3'.

Expresión: La expresión es el proceso por el cual se produce un polipéptido a partir de DNA. El proceso implica la transcripción del gen en mRNA y la traducción de este mRNA en un polipéptido.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está dirigida a una proteína receptora B1C3, secuencias genéticas que codifican la proteína, métodos para ensayar compuestos a fin de determinar si los mismos interaccionan con B1C3 y un método para ensayar compuestos respecto a su capacidad para alterar la expresión del receptor.

El ácido nucleico codificante del receptor y el receptor propiamente dicho se definen por las estructuras que se muestran en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) y la Figura 2 (SEQ ID NO: 1), respectivamente. Sin embargo, la invención abarca no sólo secuencias idénticas a las que se muestran en las figuras y el listado de secuencias, sino también secuencias que son esencialmente iguales y secuencias que son por lo demás sustancialmente iguales y que dan como resultado un receptor que retiene las características básicas de fijación de B1C3. Por ejemplo, es bien sabido que pueden utilizarse técnicas tales como mutagénesis orientada para introducir variaciones en la estructura de una proteína. Las variaciones en el receptor B1C3 introducidas por este u otro método similar están abarcadas por la invención con tal que el receptor resultante retenga las características cualitativas básicas de fijación y fisiológicas del B1C3 inalterado. Así pues, la invención se refiere a proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos constituidas funcionalmente por SEQ ID NO: 1.

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I. Secuencias de Ácido Nucleico Codificantes de B1C3

Las secuencias de DNA codificantes de B1C3 de rata se expresan en todo el sistema nervioso central de la rata adulta. El tejido de estas áreas puede utilizarse como fuente para el aislamiento de ácidos nucleicos que codifican el receptor. Adicionalmente, pueden utilizarse células y líneas de células que expresan B1C3. Éstas pueden ser o bien células cultivadas que no han sido sometidas a transformación o líneas de células modificadas específicamente por ingeniería genética a fin de expresar B1C3 recombinante. Son muy preferidas las células depositadas como DSMZ No. 12808. El DNA que codifica B1C3 puede obtenerse como resultado de digestiones estándar de restricción. Alternativamente, puede aislarse poli A^{+} mRNA a partir de tejido o células, someterse a transcripción inversa y clonarse. La genoteca de cDNA así formada puede explorarse luego utilizando sondas derivadas de SEQ ID NO: 2. Las sondas deberían tener típicamente al menos 14 bases de longitud y preferiblemente no deberían obtenerse de regiones del DNA correspondientes a dominios transmembranales de B1C3 altamente conservados.

Puede obtenerse también B1C3 de células recombinantes que contengan la secuencia B1C3 de longitud total o de genotecas de cDNA por realización de amplificaciones PCR con utilización de iniciadores localizados en cualquier extremo del gen de B1C3. Estos iniciadores pueden seleccionarse a partir de las secuencias que se muestran en SEQ ID NO: 2.

II. Anticuerpos para B1C3

La presente invención está dirigida también a anticuerpos que se fijan específicamente a B1C3 y a un proceso para producir tales anticuerpos. Anticuerpos que "se fijan específicamente" se definen como aquéllos que tienen al menos una afinidad 100 veces mayor para B1C3 que para otras proteínas. El proceso para producir dichos anticuerpos puede implicar o bien inyectar la proteína B1C3 propiamente dicha en un animal apropiado o, alternativamente, inyectar péptidos cortos producidos para corresponder a regiones diferentes del receptor. Los péptidos deberían tener una longitud de al menos 5 aminoácidos y deberían seleccionarse de regiones consideradas como exclusivas de B1C3. Así, deberían evitarse por regla general regiones transmembranales altamente conservadas en la selección de péptidos para la generación de anticuerpos. Métodos para fabricar y detectar anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica tal como se evidencia por trabajos estándar de referencia tales como: Harlow et al., Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (1982); Kennett et al., Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses (1980); y Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, (1984)).

"Anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto incluir moléculas intactas así como fragmentos que retienen su capacidad de fijación a un antígeno (v.g., los fragmentos Fab y F(ab')_{2}). Estos fragmentos se producen típicamente por escisión proteolítica de anticuerpos intactos utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}). El término "anticuerpo" se refiere también tanto a anticuerpos monoclonales como a anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se derivan de los sueros de animales inmunizados con el antígeno. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando la tecnología del hibridoma (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)). En general, esta tecnología implica inmunizar un animal, usualmente un ratón, con B1C3 intacto o con un fragmento derivado de B1C3. Los esplenocitos de los animales inmunizados se extraen y se fusionan con células de mieloma adecuadas, v.g., células SP_{2}O. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT y se clonan luego por dilución limitante (Wands et al., Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las células obtenidas por dicha selección se ensayan luego para identificar clones que secreten anticuerpos capaces de fijarse a B1C3.

Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, de la presente invención pueden utilizarse para detectar la presencia de B1C3 utilizando cualquiera de una diversidad de inmunoensayos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse en radioinmunoensayos o en ensayos inmunométricos, conocidos también como ensayos "de dos sitios" o "sándwich" (véase Chard, T., "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques", en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y. (1978)). En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo sin marcar se fija a un soporte sólido que es insoluble en el líquido de test, v.g., sangre, linfa, extractos celulares, etc. Después de la fijación inicial del antígeno al anticuerpo inmovilizado, se añade una cantidad de un segundo anticuerpo marcado detectablemente (que puede ser o no el mismo que el primero) para permitir la detección y/o cuantificación del antígeno fijado (véase, v.g., Radioimmune Assay Method, Kirkham et al., compiladores, pp. 199-206, E & S. Livingstone, Edimburgo (1970)). Muchas variaciones de estos tipos de ensayos se conocen en la técnica y pueden emplearse para la detección de B1C3.

Los anticuerpos para B1C3 pueden utilizarse también en la purificación del receptor intacto o fragmentos del receptor (véase en general: Dean et al., Affinity Chromatography. A Practical Approach, IRL Press (1986)). Típicamente, el anticuerpo se inmoviliza sobre una matriz cromatográfica tal como Sepharose 4B. La matriz se empaqueta luego en una columna y la preparación que contiene B1C3 se hace pasar a su través en condiciones que promueven la fijación, v.g. en condiciones de baja concentración de sal. La columna se lava luego y el B1C3 fijado se eluye utilizando un tampón que promueve la disociación del anticuerpo, v.g., un tampón que tiene un pH o concentración de sal alterados. El B1C3 eluido puede transferirse a un tampón de elección, v.g., por diálisis, y guardarse luego o utilizarse directamente.

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III. Ensayo de Radioligandos para Fijación del Receptor

Uno de los usos principales de los ácidos nucleicos y proteínas recombinantes de B1C3 es en ensayos diseñados para identificar agentes capaces de fijarse al receptor. Tales agentes pueden ser agonistas, que mimetizan los efectos normales de la fijación del receptor, o antagonistas, que inhiben los efectos normales de la fijación del receptor. Es particularmente interesante la identificación de agentes que se fijan al receptor B1C3 y modulan la señalización intracelular, tal como la actividad de adenil-ciclasa o calcio intracelular. Estos agentes tienen aplicación terapéutica potencial como analgésicos o anestésicos.

En los ensayos de fijación de radioligandos, una fuente de B1C3 se incuba junto con un ligando conocido por fijarse al receptor y con el compuesto que se testa para actividad de fijación. La fuente preferida de B1C3 son células, preferiblemente células de mamífero, transformadas para expresar el receptor recombinantemente. Las células seleccionadas no deben expresar una cantidad sustancial de ningún otro receptor acoplado a proteína G que pudiera fijarse al ligando y distorsionar los resultados. Esto puede determinarse fácilmente por realización de ensayos de fijación sobre células derivadas del mismo tejido o línea de células que las que expresan B1C3 recombinantemente pero que no han sufrido transformación alguna.

El ensayo puede realizarse con células intactas o con membranas preparadas a partir de las células (véase, v.g., Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10230-10234 (1993)). Las membranas, o las células, se incuban con un ligando específico para el receptor B1C3 y con una preparación del compuesto que se testa. Después que se ha completado la fijación, el receptor se separa de la solución que contiene el ligando y el compuesto de test, v.g., por filtración, y se determina la cantidad de fijación que ha ocurrido. Preferiblemente, el ligando utilizado está marcado detectablemente con un radioisótopo tal como ^{125}I. No obstante, en caso deseado, pueden utilizarse en su lugar marcadores fluorescentes o quimioluminiscentes. Entre los compuestos marcadores fluorescentes utilizados más corrientemente se encuentran isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, aldehído o-ftálico y fluorescamina. Compuestos quimioluminiscentes útiles incluyen luminol, isoluminol, éster teromático de acridinio, imidazol, sal de acridinio, y éster oxalato. Cualquiera de estos agentes puede utilizarse para producir un ligando adecuado para uso en el ensayo.

La fijación inespecífica puede determinarse realizando la reacción de fijación en presencia de un gran exceso de ligando sin marcar. Por ejemplo, el ligando marcado puede incubarse con el receptor y el compuesto de test en presencia de un exceso de mil veces de ligando sin marcar. La fijación inespecífica debe sustraerse de la fijación total, es decir la fijación en ausencia del ligando sin marcar, para llegar a la fijación específica para cada muestra testada. Otros pasos tales como lavado, agitación, sacudidas, filtración y análogos pueden incluirse en los ensayos en caso necesario. Típicamente, se incluyen pasos de lavado después de la separación del ligando fijado a la membrana del ligando que permanece en solución y antes de la cuantificación de la cantidad de ligando fijada, v.g., por recuento de un isótopo radiactivo. La fijación específica obtenida en presencia de compuesto de test se compara con la obtenida en presencia exclusivamente de ligando marcado para determinar la extensión en la que el compuesto de test ha desplazado la fijación del receptor.

En la realización de ensayos de fijación, debe tenerse cuidado para evitar artefactos que pueden hacer que parezca que un compuesto de test está interaccionando con el receptor B1C3 cuando, en realidad, la fijación está siendo inhibida por cualquier otro mecanismo. Por ejemplo, el compuesto a testar debería encontrarse en un tampón que no inhiba en sí mismo sustancialmente la fijación del ligando a B1C3 y, preferiblemente, debería testarse a varias concentraciones diferentes. Las preparaciones del compuesto de test deberían examinarse también en cuanto a actividad proteolítica, y es deseable que se incluyan antiproteasas en los ensayos. Finalmente, es muy deseable que los compuestos identificados como desplazadores de la fijación del ligando al receptor B1C3 se examinen de nuevo en una gama de concentraciones suficiente para realizar un análisis Scatchard de los resultados. Este tipo de análisis es bien conocido en la técnica y puede utilizarse para determinar la afinidad de un compuesto de test para un receptor (véase, v.g., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 11.2.1-11.2.19 (1993); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Work et al., ed., N.Y. (1978) etc.). Pueden utilizarse programas de ordenador para facilitar el análisis de los resultados (véase, v.g., Munson, P., Methods Enzymol. 92:543-577 (1983); McPherson, G.A., Kinetic,
EBDA Ligand, Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysis Programs,Elsevier-Biosoft, Reino Unido (1985)).

La activación del receptor por la fijación del ligando puede monitorizarse utilizando cierto número de ensayos diferentes. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de adenil-ciclasa por cultivo de células en los pocillos de una placa de microtitulación e incubación posterior de los pocillos en presencia o ausencia del compuesto de test. Puede extraerse luego el cAMP en etanol, liofilizarse y suspenderse de nuevo en tampón de ensayo. El ensayo del cAMP así recuperado puede realizarse utilizando cualquier método para determinación de la concentración de cAMP, v.g., el Sistema J Biotrack cAMP Enzyme-Immunoassay (Amersham) o el Sistema Cyclic AMP[^{3}H] Assay (Amersham). Típicamente, los ensayos de adenil-ciclasa se realizaran por separado de los ensayos de fijación, aunque puede ser también posible realizar los ensayos de fijación y de adenil-ciclasa sobre una misma preparación de células. Otros "ensayos de señalización de células" que pueden utilizarse para monitorizar la actividad del receptor se describen a continuación.

IV. Identificación de Agonistas y Antagonistas de B1C3 Utilizando Ensayos de Señalización de Células

Los receptores B1C3 pueden utilizarse también para seleccionar fármacos candidato utilizando ensayos de señalización de células. Para identificar agonistas de B1C3, el DNA que codifica un receptor se incorpora en un vector de expresión y se transfecta luego a un hospedador apropiado. Las células transformadas se ponen luego en contacto con una serie de compuestos de test y se monitoriza el efecto de cada uno. Entre los ensayos que pueden utilizarse se encuentran ensayos que miden la producción de cAMP (véase la discusión anterior), ensayos que miden la activación de la actividad de un gen informador, ensayos que miden la modulación de la fijación de ligando, v.g., GTP-gamma-S, o ensayos que miden cambios en la concentración intracelular de calcio.

Los ensayos de señalización de células pueden utilizarse también para identificar antagonistas de B1C3. Receptores acoplados a proteínas G pueden ponerse en su estado activo incluso en ausencia de su ligando cognato por expresión de los mismos a concentración muy alta en un sistema heterólogo. Por ejemplo, el receptor puede sobreexpresarse utilizando la infección por baculovirus de células de insecto Sf9, o bien puede enlazarse operativamente el gen de B1C3 a un promotor CMV y expresarse en células COS o HEK293. En este estado constitutivo activado, los antagonistas del receptor pueden identificarse en ausencia de ligando por medida de la aptitud de un compuesto de test para inhibir la actividad constitutiva de señalización de células. Ensayos apropiados para esto son, una vez más, ensayos de cAMP, ensayos de activación de genes informadores o ensayos que miden la fijación de GTP-gamma-S.

Un ensayo preferido de señalización de células está basado en células transfectadas establemente con B1C3 que exhiben un cambio en los niveles intracelulares de calcio en respuesta a la incubación en presencia de ligando. Así, puede utilizarse un procedimiento para identificar agonistas o antagonistas de B1C3 que es similar a los ensayos con radiorreceptores expuestos anteriormente, excepto que se mide la concentración de calcio en lugar de la radiactividad fijada. La concentración de calcio en presencia del compuestos de test y el ligando se compara con la existente en presencia de ligando solo para determinar si el compuesto de test está interaccionando con el receptor B1C3. Un aumento estadísticamente significativo en el calcio intracelular en respuesta al compuesto de test indica que el compuesto de test está actuando como agonista, mientras que una disminución estadísticamente significativa en el calcio intracelular indica que aquél está actuando como antagonista.

Pueden realizarse también ensayos que miden la activación de un gen informador. Por ejemplo, las células que expresan B1C3 recombinante pueden transfectarse con un gen informador (v.g., un gen de cloranfenicol-acetiltransferasa o luciferasa) enlazado operativamente a un elemento de respuesta a adenil-ciclasa o diacilglicerol. Las células se incuban luego con los compuestos de test, y la expresión del gen informador se compara con la expresión en células de control que no expresan B1C3 recombinante pero que son esencialmente idénticas en otros aspectos. Un cambio estadísticamente significativo en la expresión del gen informador en las células que expresan B1C3 es indicativo de un compuesto de test que interacciona con el receptor B1C3.

V. Ensayo de Capacidad de Modulación de la Expresión de B1C3

Una vía para aumentar o disminuir los efectos biológicos de B1C3 consiste en alterar la extensión en la que el receptor se expresa en las células. Por esta razón, los ensayos para la identificación de compuestos que inhiben o intensifican la expresión presentan un interés considerable. Estos ensayos se efectúan cultivando células que expresan B1C3 en presencia de un compuesto de test y comparando luego la expresión del receptor en estas células con la expresión en células cultivadas en condiciones esencialmente idénticas pero en ausencia del compuesto de test. Como en los ensayos de fijación expuestos anteriormente, es deseable que las células utilizadas estén sustancialmente exentas de receptores competidores acoplados a proteínas G. Una vía para medir la expresión del receptor consiste en fusionar la secuencia de B1C3 a una secuencia que codifique un péptido o proteína que pueda cuantificarse fácilmente. Por ejemplo, la secuencia de B1C3 puede ligarse a una secuencia que codifique hemaglutinina y utilizarse para transfectar células de manera estable. Después de la incubación con el compuesto de test, el complejo hemaglutinina/receptor puede someterse a inmunoprecipitación y realizarse transferencias Western utilizando un anticuerpo anti-hemaglutinina. Alternativamente, puede realizarse un análisis Scatchard de los ensayos de fijación con ligando marcado a fin de determinar el número de receptores. Los ensayos de fijación pueden realizarse como se ha expuesto anteriormente y uti-
lizarán preferiblemente células que se han modificado por ingeniería genética para expresar B1C3 recombinantemente.

Un grupo preferido de compuestos de test para inclusión en el ensayo de expresión de B1C3 está constituido por oligonucleótidos complementarios a diversos segmentos de la secuencia de ácido nucleico de B1C3 que se muestra en SEQ ID NO: 2. Estos oligonucleótidos deberían tener una longitud de al menos 15 bases y deberían derivarse de regiones no conservadas de la secuencia de ácido nucleico del receptor.

Los oligonucleótidos que se haya encontrado que reducen la expresión del receptor pueden derivatizarse o conjugarse a fin de aumentar su eficacia. Por ejemplo, se pueden emplear nucleosido-fosforotioatos en sustitución de sus contrapartidas naturales (véase Cohen, J., Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press (1989)). Los oligonucleótidos pueden suministrarse también a un paciente in vivo para el propósito de inhibir la expresión de B1C3. Cuando se hace esto, se prefiere que el oligonucleótido se administre en una forma que aumente su adsorción por las células. Por ejemplo, el oligonucleótido puede suministrarse por medio de un liposoma o conjugado a un péptido que es ingerido por las células (véanse, v.g., las Patentes U.S. núms. 4.897.355 y 4.394.448; véanse también los documentos no patentados en los Estados Unidos WO 8903849 y EP 0263740). Otros métodos para aumentar la eficiencia del suministro de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica y son también compatibles con la presente invención.

Una vez descrita la invención, la misma se comprenderá más fácilmente por referencia a los ejemplos que siguen, que se proporcionan a modo de ilustración y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación de B1C3 de rata

Generación de la Sonda para la Exploración de una Genoteca de cDNA: Un método de obtención de una nueva secuencia codificante de un receptor consiste en realizar una exploración a severidad moderada o baja de genotecas de cDNA con una sonda relevante. Para encontrar nuevos genes afines a receptores de lípidos (fosfato de esfingosina, ácido lisofosfatídico, cannabinoides, etc) se utilizó la secuencia de un EST (Etiqueta de Secuencia Expresada), aa451451, a fin de generar una sonda de cDNA para la exploración de genotecas de cDNA. Se utilizaron los oligonucleótidos siguientes para la PCR:

100

Se utilizaron dos de estos oligonucleótidos en una mezcla para reacción en cadena de polimerasa (volumen total 100 \mul), que contenía 1.5il [sic] de una genoteca de cDNA de cerebro de rata (sin el cerebelo) en pcDNA1 (Invitrogen), tampón 1X PCR ((NH_{4})_{2}SO_{4} 14 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 9,2), Roche Diagnostics), dNTPs 200 \muM (Amersham-Pharmacia), 2,6 U de Expand High FidelityJ (Roche Diagnostics) y 100 pmoles de cada uno de los iniciadores SP6 y 451-1R. La amplificación se llevó a cabo en un Gene Amp PCR Sys 9700J (Perkin Elmer: Applied Biosystems). El molde se desnaturalizó a 94ºC durante 3 minutos, seguido por 35 ciclos constituidos por pasos de desnaturalización, reasociación y extensión, cada uno durante 1 minuto a 94ºC, 53ºC y 72ºC, respectivamente, y se extendió luego durante 5 minutos más a 72ºC.

El producto resultante se diluyó en relación 1:100 y se amplificó con iniciadores SP6-1R y 451-3R. La mezcla de la reacción en cadena de polimerasa (50 il) contenía 1 il de solución diluida de la primera reacción PCR, 1X tampón PCR (el mismo que anteriormente, Roche Diagnostics), 200 iM de dNTPs (Amersham-Pharmacia), 2,6 U Expand High FidelityJ (Roche Diagnostics) y 50 pmoles de cada uno de los iniciadores SP6-1R y 451-3R. La amplificación se llevó a cabo en un Gene Amp PCR Sys 9700J (Perkin Elmer: Applied Biosystems). El molde se desnaturalizó a 94ºC durante 3 minutos, seguido por 25 ciclos constituidos por pasos de desnaturalización, reasociación y extensión a 94ºC (1 minuto),
53ºC (1 minuto) y 72ºC (1 minuto y 20 segundos) respectivamente, y se extendió luego durante 5 minutos más a 72ºC.

Un producto PCR de 450 pb se escindió y se purificó con el kit de extracción en gel QIAquickJ (Qiagen), se hizo romo en los extremos con Klenow (Amersham-Pharmacia) y se subclonó en KS- digerido con ER V, y desfosforilado. Los plásmidos se prepararon con el protocolo de lisis alcalina utilizando un kit Qiaprep 8J (Qiagen) y se exploraron por secuenciación utilizando el kit de reacción rápida de secuenciación por ciclos ABI Prism dRhodamineJ (PE Applied Biosystems). La secuencia del fragmento de 450 pb de rata era idéntica a la de EST aa451451. Se digirió luego un fragmento NotI/HindIII de 400 pb, se escindió y se purificó con el kit de extracción de gel QIAquickJ (Qiagen) para utilizarlo como herramienta para aislar un clon de rata afín a EDG.

Exploración de Genotecas de cDNA: Una genoteca de cDNA de tallo cerebral/médula espinal de rata de Stratagene (cat #936521) se exploró utilizando el fragmento NotI/HindIII como sonda. Se extendieron en placas 8 x 10^{5} calvas, se transfirieron a filtros Hybond N+J (Amersham-Pharmacia), se desnaturalizaron durante 5 minutos (NaCl 1,5 M y NaOH 0,5 M) y se neutralizaron durante 5 minutos (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 8). Los filtros se enjuagaron en 2X SSC y se secaron al aire durante una hora a la temperatura ambiente. Las membranas se hibridaron durante una noche a 42ºC en formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10% (procedente de una solución al 50%), SDS al 1%, 5 x SSC, 1 x Denhardt's, Tris 10 mM de pH 8 y 100 g/ml de esperma de salmón tratado por ultrasonidos. El fragmento NotI/HindIII se marcó aleatoriamente utilizando T7 Quick PrimeJ (Amersham-Pharmacia) y se añadió a la solución de hibridación a 3 x 10^{6} cpm/ml. Los filtros se lavaron con 2X SSC/0,1% SDS a la temperatura ambiente seguido por un lavado de alta severidad con 0,2 x SSC/0,1% SDS a 65ºC.

Utilizando este procedimiento de exploración, se identificaron 6 clones independientes y se aislaron por extensión en placa y exploración repetidas con el fragmento NotI/HindIII marcado. Se sometieron dos clones independientes a secuenciación (clones BIA7 y C3A3). El análisis de la secuencia de DNA reveló que el clon B1A7 contenía la secuencia 5' de un nuevo GPCR supuesto, pero faltaba el extremo 3'. Aunque C3A3 contenía la secuencia codificante entera, faltaba un nucleótido, lo que conducía a un codón de parada prematuro. Con objeto de obtener la secuencia codificante completa, los dos clones se digirieron con XbaI y se ligaron uno a otro. El clon resultante "B1C3" contiene la región codificante completa de un GCPR nuevo supuesto.

Resultados: La secuencia de nucleótidos completa del clon de cDNA de B1C3 se muestra en la Figura 1. El marco de lectura abierto comprende 1203 nucleótidos, que codifican una proteína de 401 aminoácidos (Figura 2) con un peso molecular predicho de aproximadamente 42,3 kDa. La secuencia de proteína contiene las características identificadoras de los GCPRs: la presencia de 7 hélices hidrófobas que parecen representar dominios transmembranales; un término amino; y un término carboxi. Adicionalmente, varios sitios de modificación propuestos como implicados en la regulación de la función del receptor están presentes también en la secuencia de aminoácidos predicha. Así, la secuencia del receptor tiene: un sitio potencial de fosforilación de cAMP en la posición 236; sitios de glicoxilación enlazados a N; sitios de miristilación; y sitios de fosforilación de Proteína Quinasa-C. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos primaria predicha del receptor B1C3 no están presentes en su totalidad en la base de datos Genebank. Las secuencias se asemejan muy estrechamente a las del receptor EDG-1 de ratón y de rata (receptor del gen de diferenciación epitelial). Una alineación de secuencias de B1C3 con receptores conocidos revela que el mismo es idéntico
aproximadamente en un 34% al receptor EDG-1 de ratón e idéntico en un 33% al receptor EDG-1 de rata (Figura 3).

Ejemplo 2 Experimentos de Hibridación in Situ

Preparación del Tejido: Se sacrificaron ratas macho Sprague-Dawley adultas (aproximadamente 250 g, Charles River, St.-Constant, Quebec) por decapitación. Se extirparon rápidamente el cerebro, la médula espinal con DRGs todavía unidos y varios tejidos periféricos (corazón, riñón, bazo, hígado, pulmón y músculo esquelético), se congelaron instantáneamente en isopentano a -40ºC durante 20 s y se guardaron a -80ºC. El tejido congelado se seccionó a 16 m en un criostato Microm HM 500MJ (Alemania) y se montó descongelado en portaobjetos ProbeOn PlusJ (Fisher Scientific, Montreal, Quebec). Las secciones se guardaron a -80ºC antes de la hibridación in situ.

Síntesis de Ribosonda: El plásmido pBluescript KS^{-}-B1A7, que contenía un fragmento de 1 kb del extremo 5' del gen B1A7, se linealizó por corte en el sitio del polienlazador a ambos lados del cDNA insertado utilizando las enzimas de restricción NotI o SacI (Pharmacia Biotech, U.S.A.) y los tampones apropiados. Las ribosondas B1A7 antisentido y sentido se transcribieron in vitro utilizando RNA polimerasa T7 o T3 (Promega), respectivamente, en presencia de -[^{35}S]-UTP (aproximadamente 800 Ci/mmol; Amersham, Oakville, Ontario).

Hibridación in situ : Se post-fijaron secciones en paraformaldehído al 4% (BDH, Poole, Inglaterra) en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) durante 10 min a la temperatura ambiente (TA) y se enjuagaron en 3 cambios de tampón de citrato de sodio estándar 2X (SSC; NaCl 0,15 M; citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0). Las secciones se equilibraron luego en trietanolamina 0,1 M, se trataron con anhídrido acético al 0,25% en trietanolamina, se enjuagaron en 2X SSC y se deshidrataron en una serie de etanol (50-100%). La hibridación se realizó en un tampón que contenía formamida al 75% (Sigma, St. Louis, Mo.), NaCl 600 mM, Tris 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, 1X solución de Denhardt (Sigma), 50 g/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado (Sigma), sulfato de dextrano al 10% (Sigma), ditiotreitol 20 mM y sondas de cRNA marcadas con -[^{35}S]-UTP (10 x 10^{6} cpm/ml) a 55ºC durante 18 h en cámaras humidificadas. Después de la hibridación, los portaobjetos se enjuagaron en 2X SSC a la temperatura ambiente, se trataron con 20 g/ml de RNasa IA (Pharmacia) en tapón de RNasa (Tris 100 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) durante 45 min a 37ºC y se lavaron hasta una severidad final de 0,1X SSC a 70ºC. Las secciones se deshidrataron luego con etanol y se expusieron a película Kodak Biomax MRJ durante 14-21 días, después de lo cual se sumergieron en emulsión Kodak NTB2 diluida en relación 1:1 con agua destilada y se expusieron durante 7-8 semanas a 4ºC antes del revelado y la contratinción con acetato de cresil-violeta (Sigma).

Resultados: Los autorradiogramas de la película de hibridación in situ revelan que el mRNA de B1A7 se expresa ubicuamente en el sistema nervioso central (CNS) de la rata adulta. En la médula espinal de la rata, el mRNA de B1A7 se expresa abundantemente de manera uniforme en toda la sustancia blanca y la sustancia gris. En cambio, en el cerebro de la rata el mRNA de B1A7 se expresa variablemente. El mRNA del receptor se expresa fundamentalmente en tractos de fibras por todo el cerebro, a saber, el cuerpo calloso, la comisura anterior (anterior y posterior), el fórnix, las fimbrias (del hipocampo), la cápsula interna y el pedúnculo cerebelar. Otras estructuras, con inclusión del córtex piriforme del lóbulo olfatorio, el hipocampo y el núcleo habenular están marcadas moderadamente; mientras que diversas otras regiones del cerebro, tales como el córtex y la sustancia gris periacueductal, por ejemplo, expresan mensajes moderada-
mente. El examen al microscopio de las secciones procesadas en emulsión sugiere que estas células no son neuronales.

Además de esta distribución central, se detecta una señal de hibridación moderada para el mensaje de B1A7 en el bazo de la rata adulta, pero no en corazón, riñón, hígado, pulmón o músculo esquelético. Los resultados preliminares, utilizando la ribosonda de B1A7 de rata, indican que el mRNA del receptor B1A7 está distribuido análogamente en el CNS del ratón, mientras que no se detecta marcación alguna en las médulas espinales o DRGs humanas adultas.

Ejemplo 3 Desarrollo de un Ensayo para el Ligando Endógeno

Un método que puede utilizarse para identificar el ligando endógeno o para explorar compuestos naturales o sintéticos consiste en enlazar estructuralmente el receptor, preferiblemente por su término carboxi a una sonda fluorescente, por ejemplo la proteína fluorescente verde (GFP). Es un hecho bien conocido que después de estimulación con un agonista, los GPCRs se internalizan (Ashworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:512-516 (1995)). Cuando se acoplan a una sonda fluorescente (v.g., GFP) puede monitorizarse fácilmente la internalización del receptor por técnicas convencionales (v.g., microscopía fluorescente o confocal, etc.). Por consiguiente, puede prepararse el extracto tisular de cerebro, médula espinal, etc., incubar un extracto fraccionado con las células que expresan el constructo híbrido GPCR-GFP y monitorizar la internalización. Únicamente las fracciones que contienen ligando endógeno para este GPCR particular harán que el híbrido se internalice. Una fracción activa de este tipo puede fraccionarse luego adicionalmente hasta que se consigue la recuperación de un ligando puro. Análogamente, pueden ensayarse los compuestos activadores del receptor en una mezcla compleja de una genoteca de compuestos sintética.

1

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Astra Pharma Inc.

\hskip1cm Ahmad, Sultan

\hskip1cm Hoffert, Cyrla

\hskip1cm O'Donnell, Dajan

\hskip1cm Pelletier, Manon

\hskip1cm Wlaker, Philippe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Receptor Acoplado a Proteína G B1C3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> transeúnte 6

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\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 400

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Rata

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

3

4

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<210> 2

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<211> 1203

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rata

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Iniciador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttaggtga cactatagaa ta

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Iniciador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgcggaag gagtagatg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Iniciador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctctagatg catgctcgag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

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<212> DNA

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<213> Iniciador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggagcagg ccaaacagg

\hfill

19

Claims (15)

1. Una proteína, excepto la existente en la naturaleza, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

2. La proteína de la reivindicación 1, en donde dicha proteína está constituida por la secuencia de amino-ácidos de SEQ ID NO: 1.

3. Un anticuerpo que tiene al menos una afinidad 100 veces mayor para la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que cualquier otra proteína.

4. Un polinucleótido, excepto como existe en la naturaleza, que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

5. El polinucleótido de la reivindicación 4, en donde dicho polinucleótido codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

6. El polinucleótido de la reivindicación 4, en donde dicho polinucleótido está constituido por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.

7. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6.

8. Una célula hospedadora aislada transformada con el vector de la reivindicación 7.

9. Un método para determinar si un compuesto de test es un agonista de la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende:

a)

incubar una célula que expresa la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 con dicho compuesto de test; y

b)

determinar si dicho compuesto de test causa un aumento estadísticamente significativo en la actividad intracelular de adenil-ciclasa o la concentración intracelular de calcio.

10. Un método para determinar si un compuesto de test es un ligando o agonista de la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende determinar si una célula que expresa una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos constituida funcionalmente por SEQ ID NO: 1 internaliza dicha proteína en respuesta al contacto con dicho compuesto de test.

11. El método de la reivindicación 10, en donde:

a)

dicha proteína se expresa recombinantemente en dicha célula como una proteína de fusión enlazada a una proteína fluorescente;

b)

la célula del paso (a) se pone en contacto con dicho compuesto de test; y

c)

la internalización de dicha proteína se determina por microscopía.

12. Un método para determinar si un compuesto de test es un antagonista de la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende:

a)

incorporar una molécula de DNA que codifica la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en un vector de expresión de tal modo que aquélla se enlaza operativamente a un promotor;

b)

transfectar dicho vector de expresión a un hospedador;

c)

seleccionar las células transfectadas en el paso b) que tienen la proteína activada constitutivamente como se evidencia por:

i)

un aumento estadísticamente significativo en la actividad intracelular de adenil-ciclasa; o

ii)

un aumento estadísticamente significativo en la concentración intracelular de calcio;

d)

poner en contacto las células seleccionadas en el paso c) con dicho compuesto de test; y

e)

determinar si dicho compuesto de test causa una disminución estadísticamente significativa en dicha actividad de adenil-ciclasa o dicha concentración de calcio con relación a células de control que no se han puesto en contacto con dicho compuesto de test.

13. Un método para ensayar un compuesto de test respecto a su capacidad para alterar la expresión de la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende:

a)

cultivar células que expresan la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2;

b)

recoger dichas células; y

c)

comparar la expresión de la proteína en las células expuestas a dicho compuesto de test con células de control cultivadas en condiciones esencialmente idénticas pero no expuestas a dicho compuesto de test.

14. El método de la reivindicación 13, en el cual dichas células que expresan dicha proteína son células transformadas con un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

15. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el cual dicho compuesto de test es un oligonucleótido de al menos 15 nucleótidos de longitud y que comprende una secuencia complementaria a la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha proteína.