ES2301247T3 - Nuevo receptor acoplado a proteina g. - Google Patents
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Abstract
Una proteína recombinante o purificada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.
Description
Nuevo receptor acoplado a proteína G.
La presente invención pertenece al campo general
de los receptores biológicos y los diversos usos que se pueden
hacer de tales receptores. Más específicamente, la invención se
refiere a ácidos nucleicos que codifican un nuevo receptor afín a
neurotensina (NLR), y al receptor propiamente dicho.
Los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs)
constituyen una familia de proteínas que comparten una organización
estructural común caracterizada por un extremo
N-terminal extracelular, siete hélices alfa
hidrófobas que constituyen supuestamente dominios transmembranales,
y un dominio C-terminal intracelular. Los GPCRs se
unen a una amplia variedad de ligandos que disparan señales
intracelulares a través de la activación de proteínas G
transductoras (Caron, et al., Rec. Prog. Horm. Res.
48:277-290 (1993); Freedman et al., Rec.
Prog. Horm. Res. 51:319-353 (1996)).
Se han clonado hasta ahora más de 300 GPCRs, y
se supone generalmente que existen mucho más de 1000 receptores de
esta clase. En términos mecanísticos, aproximadamente el
50-60% de todos los fármacos clínicamente
importantes actúan modulando las funciones de diversos GPCR
(Cudermann, et al., J. Mol. Med. 73:51-63
(1995)). Son particularmente interesantes los receptores
localizados en el sistema nervioso central. Se sabe que los
receptores acoplados a proteína G localizados en esta región están
implicados en la transmisión, modulación y sensación del dolor. Por
ello, nuevos receptores acoplados a proteína G encontrados en el
cerebro y la médula espinal pueden utilizarse en ensayos para la
identificación de nuevos agentes para producir anestesia y
analgesia.
Se ha descrito la evidencia de subtipos de
receptores de receptores de neurotensina adicionales (Tyler et
al., Brain Research 792:246-252 (1998)).
La presente invención está basada en el
descubrimiento de un nuevo receptor acoplado a proteína G que se
expresa en el sistema nervioso central y tiene una estructura
distinta de todos los receptores consignados anteriormente. Dado
que el mismo parece compartir una homología sustancial con el
receptor de neurotensina humana, se hace referencia al mismo en esta
memoria como el "receptor afín a neurotensina".
En su primer aspecto, la invención está dirigida
a una proteína, excepto la existente en la naturaleza, que
comprende una secuencia de aminoácidos constituida funcionalmente
por SEQ ID NO: 1. El término "constituida funcionalmente por"
hace referencia a las proteínas en las cuales la secuencia de SEQ ID
NO: 1 ha sufrido adiciones, deleciones o sustituciones que no
alteran sustancialmente las características funcionales del
receptor. El término tiene por objeto abarcar proteínas que tienen
exactamente la misma secuencia de aminoácidos que la de SEQ ID NO:
1, así como proteínas con diferencias de secuencia que no son
sustanciales como se evidencia por el hecho de que las mismas
retienen las propiedades básicas, de fijación cualitativa de
ligandos y fisiológicas del receptor afín a neurotensina. El
término "excepto la existente en la naturaleza" hace referencia
a un compuesto que o bien se expresa por medios recombinantes o que
se encuentra en un estado purificado (con preferencia purificado
sustancialmente).
La invención abarca también una proteína
recombinante o purificada, que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
La invención está dirigida también a un
polinucleótidos recombinante o purificado, que codifica una proteína
que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Este
aspecto de la invención abarca polinucleótidos que codifican
proteínas constituidas por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
1, vectores de expresión que comprenden tales polinucleótidos, y
células hospedadoras transformadas con tales vectores. Se incluye
también el receptor recombinante afín a neurotensina producido por
células hospedadoras obtenidas de esta manera.
Preferiblemente, el polinucleótido que codifica
el receptor afín a neurotensina tiene la secuencia de nucleótidos
que se muestra en SEQ ID NO: 2, y los vectores y células
hospedadoras utilizados para la expresión del receptor utilizan
también este polinucleótido particular.
En otro aspecto, la presente invención está
dirigida a un método para ensayar un compuesto de prueba en cuanto
a su capacidad para unirse a un receptor afín a neurotensina humana.
El método se lleva a cabo incubando una fuente de NLR con un
ligando que se sabe se une al receptor y con el compuesto de prueba.
La fuente del receptor debería expresar, preferiblemente, una gran
cantidad de NLR con relación a otros receptores acoplados a proteína
G. Una vez completada la incubación, la idoneidad del compuesto de
prueba para unirse a NLR se determina por la magnitud en la que se
ha desplazado la unión de ligando. El receptor comprende la
secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1. Aunque no es esencial, el
ensayo puede acompañarse de un ensayo para determinar si se ha
activado una ruta de segundo mensajero, v.g. la ruta de
adenil-ciclasa. Esto debería ayudar a determinar si
un compuesto particular que se une a NLR actúa como agonista o como
antagonista.
Un método alternativo para determinar si un
compuesto de prueba es un agonista de NLR, método que no requiere
ligando alguno, consiste en utilizar un ensayo de señalización
celular, por ejemplo, un ensayo que mide la actividad intracelular
de adenil-ciclasa o la concentración intracelular
de calcio. El compuesto de prueba debería incubarse generalmente
con células que expresan grandes cantidades de NLR con relación a
otros vectores acoplados a proteína G, típicamente una célula
transfectada con un vector de expresión que codifica el NLR de SEQ
ID NO: 1. Los compuestos de prueba que son agonistas se identifican
por el hecho de que los mismos causan un cambio estadísticamente
significativo en los resultados obtenidos del ensayo de señalización
de células cuando se comparan con células de control no expuestas
al compuesto de prueba. Las células de control pueden ser o bien
células que no han sido transfectadas o células que se han
transfectado falsamente con un vector que no produce receptor
activo. Las células que expresan NLR expuestas a compuestos de
prueba que son agonistas podría esperarse típicamente que
exhibieran un aumento significativo en la actividad de
adenil-ciclasa o en la concentración intracelular
de calcio con relación a células de control.
La invención engloba también un método para
determinar si un compuesto de prueba es un antagonista de NLR, que
está basado en la activación conocida de los receptores acoplados a
la proteína G que se produce cuando tales receptores se expresan en
grandes cantidades. Este método requiere que el DNA que codifica el
receptor se incorpore en un vector de expresión de forma que esté
enlazado operativamente a un promotor, y que el vector se utilice
luego para transfectar una célula hospedadora apropiada. A fin de
producir suficiente receptor para dar como resultado la activación
constitutiva del receptor (es decir, la activación en ausencia de
ligando natural), se prefieren sistemas de expresión capaces de
producir abundante proteína, por ejemplo, el DNA de NLR puede estar
enlazado operativamente a un promotor de CMV, y se puede expresar en
células COS o HEK293. Después de la transfección, las células con
receptores activados se seleccionan basándose en el incremento de
actividad mostrado en un ensayo de señalización celular con relación
a células comparables que, o bien no se han transfectado o se han
transfectado con un vector que es incapaz de expresar NLR funcional.
Típicamente, las células se seleccionarán porque exhiben un
incremento estadísticamente significativo en la actividad
intracelular de adenil-ciclasa o en la
concentración intracelular de calcio. Las células seleccionadas se
ponen en contacto con el compuesto de prueba, y se repite el ensayo
de señalización celular para determinar si éste da como resultado
una disminución de actividad con relación a células seleccionadas
que no han estado en contacto con el compuesto de prueba. Por
ejemplo, una disminución estadísticamente significativa en la
actividad de adenil-ciclasa o en la concentración
de calcio, con relación a las células de control, indicaría que el
compuesto de prueba es un antagonista de NLR. El NLR utilizado en
los ensayos tiene la secuencia de
SEQ ID NO:1.
SEQ ID NO:1.
Los ensayos para determinar compuestos que
interaccionan con NLR se pueden realizar incubando una fuente que
contiene el receptor (por ejemplo, una célula transformada
establemente) con un ligando específico para NLR tanto en presencia
como en ausencia del compuesto de prueba, y midiendo la modulación
de la concentración intracelular de calcio. Un incremento o una
disminución significativo(a) en la señalización de calcio
estimulada por el ligando en respuesta al compuesto de prueba es
indicativo de una interacción que se produce en el receptor afín a
neurotensina. El receptor comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO:1.
En otro aspecto, la presente invención está
dirigida a un método para ensayar un compuesto de prueba en cuanto
a su capacidad para alterar la expresión de NLR. Este método se
lleva a cabo dejando crecer células que expresan NLR en presencia
del compuesto de prueba. Las células se recogen luego y se compara
la expresión de NLR con la expresión en células de control que se
han dejado crecer en condiciones esencialmente idénticas pero en
ausencia del compuesto de prueba. El receptor es uno que comprende
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Un compuesto de prueba
preferido es un oligonucleótido con una longitud de al menos 15
nucleótidos, que comprende una secuencia complementaria a la
secuencia del mRNA de NLR utilizado en el ensayo.
Figura 1. La Figura 1 contiene la secuencia de
nucleótidos completa de un clon construido por los métodos
descritos en la sección de Ejemplos. El clon se depositó en la
International Depository Authority Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) en la dirección
Mascheroder Weg 1B, D-38124, Braunschweig,
Alemania. El depósito (pcDNA plasmídico
3-10-29-FL) se hizo
el 9 de abril de 1998 y le fue asignado el número de acceso DSM
12101. La secuencia de aminoácidos de NLR humano comienza en el
nucleótido 65 y termina con el codón de terminación que comienza en
el nucleótido 1310.
Figura 2. La Figura 2 muestra la secuencia de
aminoácidos deducida de NLR humano. El polinucleótido de la Figura
1 codifica una proteína de 415 aminoácidos de longitud.
La descripción que sigue utiliza varios términos
que se refieren a tecnología de DNA recombinante. A fin de
proporcionar una comprensión clara y consistente de la memoria
descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se ha
de dar a tales términos, se proporcionan las definiciones
siguientes.
Vector de clonación: Un DNA plasmídico o
de fago, u otra secuencia de DNA, que es capaz de replicarse
autónomamente en una célula hospedadora, y que se caracteriza por
uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento por
endonucleasas de restricción. En estos sitios, puede empalmarse en
el vector un fragmento de DNA extraño a fin de provocar la
replicación y clonación del fragmento. El vector puede contener un
marcador adecuado para utilización en la identificación de células
transformadas. Por ejemplo, los marcadores pueden proporcionar
resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina.
Vector de expresión: Un vector similar a
un vector de clonación, pero que es capaz de inducir la expresión
del DNA que se ha clonado en él, después de transformación en un
hospedador. El DNA clonado se pone habitualmente bajo el control de
(es decir, se enlaza operativamente a) ciertas secuencias
reguladoras, tales como promotores o intensificadores. Las
secuencias promotoras pueden ser constitutivas, inducibles o
reprimibles.
Sustancialmente puro: Como se utiliza en
esta memoria, "sustancialmente puro" significa que el producto
deseado está esencialmente exento de componentes celulares
contaminantes. Una proteína o ácido nucleico "sustancialmente
puro(a)" comprenderá típicamente al menos 85% de una
muestra, prefiriéndose porcentajes más elevados. Los contaminantes
pueden incluir proteínas, hidratos de carbono o lípidos. Un método
para determinar la pureza de una proteína o ácido nucleico consiste
en someter a electroforesis una preparación en una matriz, tal como
poliacrilamida o agarosa. La pureza se evidencia por la aparición de
una sola banda después de la tinción. Otros métodos para evaluar la
pureza incluyen cromatografía y centrifugación analítica.
Proteína recombinante: Una proteína
recombinante o receptor recombinante es una proteína no endógena
producida por la introducción de un vector de expresión en células
hospedadoras.
Hospedante: Cualquier célula procariota o
eucariota que es el receptor de un vector de expresión o vector de
clonación replicable es el "hospedador" para dicho vector. El
término engloba células procariotas o eucariotas que se han
modificado por ingeniería genética para incorporar un gen deseado en
su cromosoma o en su genoma. Los ejemplos de células que pueden
servir como hospedadores son bien conocidos en la técnica, al igual
que lo son las técnicas de transformación celular (véase, por
ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor (1989)).
Promotor: Una secuencia de DNA encontrada
típicamente en la región 5' de un gen, localizada próxima al codón
de partida. La transcripción se inicia en el promotor. Si el
promotor es del tipo inducible, entonces la velocidad de
transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor.
Secuencia Nucleotídica Complementaria:
Una secuencia nucleotídica complementaria, como se utiliza en esta
memoria, se refiere a la secuencia que se originaría por el
apareamiento normal de bases. Por ejemplo, la secuencia
nucleotídica 5'-AGAC-3' tendría como
secuencia complementaria
5'-GTGT-3'.
Expresión: La expresión es el proceso por
el cual se produce un polipéptido a partir de DNA. El proceso
implica la transcripción del gen en mRNA, y la traducción de este
mRNA en un polipéptido.
La presente invención se dirige a una proteína
del receptor afín a neurotensina, a secuencias genéticas que
codifican la proteína, a un método para ensayar compuestos respecto
a su unión a los receptores afines a neurotensina, y a un método
para ensayar compuestos respecto a su capacidad para alterar la
expresión de los receptores.
El receptor y su ácido nucleico se definen por
las estructuras que se muestran en las figuras 1 y 2 y en SEQ ID
Núms. 1 y 2. Sin embargo, la presente invención abarca no sólo
secuencias idénticas a las que se muestran en las figuras y en el
listado de secuencias, sino también secuencias que son esencialmente
iguales y secuencias que son de otro modo sustancialmente iguales y
que dan como resultado un receptor que retiene las características
de unión básicas de NLR. Por ejemplo, es bien sabido que pueden
utilizarse técnicas tales como mutagénesis orientada para
introducir variaciones en la estructura de una proteína. Variaciones
en el receptor afín a neurotensina introducidas por este método o
un método similar están abarcadas por la invención, con la condición
de que el receptor resultante retenga las características
cualitativas básicas y fisiológicas de unión del NLR inalterado.
Así pues, la invención se refiere a proteínas que comprenden
secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1.
Las secuencias de DNA que codifican el receptor
afín a neurotensina humana se expresan en el sistema nervioso
central, la placenta y los músculos esqueléticos, y cualquiera de
éstos puede servir como una fuente para el aislamiento de ácidos
nucleicos que codifican el receptor. Además, pueden utilizarse
células y líneas de células que expresan NLR humano. Éstas pueden
ser células cultivadas que no han sufrido transformación, o líneas
de células modificadas específicamente por ingeniería genética para
expresar NLR recombinante. En todos los casos, el mRNA poli A+ se
aísla del tejido o de las células, se transcribe de forma inversa, y
se clona. La genoteca de cDNA así formada puede cribarse luego
utilizando sondas derivadas de SEQ ID NO: 2. Las sondas deberían
tener típicamente una longitud de al menos 14 bases y,
preferiblemente, no deberían obtenerse a partir de las regiones del
DNA correspondientes a los dominios transmembranales de NLR
altamente conservados.
Alternativamente, el receptor análogo a
neurotensina humana puede obtenerse a partir de células
recombinantes que contienen la secuencia de NLR de longitud total o
de genotecas de cDNA por realización de amplificaciones por PCR con
iniciadores localizados en ambos extremos del gen NLR. Estos
iniciadores pueden seleccionarse a partir de las secuencias que se
muestran en SEQ ID NO: 2. La sección de ejemplos describe un
procedimiento por el cual se utilizaron las amplificaciones PCR
para obtener el receptor afín a neurotensina a partir de cDNA de
médula espinal fetal.
Se describen anticuerpos que se unen
específicamente al receptor afín a neurotensina humana, y un proceso
para producir tales anticuerpos. Los anticuerpos que se "unen
específicamente" se definen como aquéllos que tienen al menos
una afinidad cien veces mayor para NLR que para cualquier otra
proteína. El proceso para producir tales anticuerpos puede implicar
inyectar la proteína NLR propiamente dicha en un animal apropiado o,
alternativamente, inyectar péptidos cortos obtenidos que
correspondan a diferentes regiones del receptor. Los péptidos
deberían tener al menos una longitud de cinco aminoácidos, y
deberían seleccionarse de regiones que se cree que son exclusivas
para NLR.
Así, deberían evitarse en general en la
selección de péptidos para la generación de anticuerpos las regiones
transmembranales muy conservadas. Métodos para producir y detectar
anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica, como
se evidencia por artículos de referencia estándar tales como:
(Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, N. Y. (1988); Klein, Immunology: The Science of
Self-Nonself Discrimination (1982); Kennett, et
al., Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in
Biological Analyses (1980); y Campbell, "Monoclonal Antibody
Technology", in Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology, (1984)).
"Anticuerpo", como se utiliza en esta
memoria, debe considerarse que incluye tanto moléculas intactas como
fragmentos que retienen su capacidad para unirse al antígeno (por
ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')_{2}). Estos fragmentos se
producen por lo general escindiendo proteolíticamente anticuerpos
intactos con utilización de enzimas tales como papaína (para
producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos
F(ab')_{2}). El término "anticuerpo" se refiere
también tanto a anticuerpos monoclonales como a anticuerpos
policlonales. Los anticuerpos policlonales se derivan de los sueros
de animales inmunizados con el antígeno. Los anticuerpos
monoclonales se pueden preparar utilizando la tecnología del
hibridoma (Kohler, et al., Nature 256:495 (1975);
Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and
T-Cell Hybridomas. Elsevier. N.Y. p.
563-681 (1981)). En general, esta tecnología
implica inmunizar un animal, habitualmente un ratón, con NLR intacto
o con un fragmento derivado de NLR. Los esplenocitos de los
animales inmunizados se extraen y se fusionan con células de mieloma
adecuadas, por ejemplo células SP_{2}O. Después de la fusión, las
células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en
medio HAT, y se clonan después por dilución limitante (Wands, et
al., Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las
células obtenidas a través de esta selección se ensayan luego para
identificar clones que secretan anticuerpos capaces de unirse a
NLR.
Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de
la presente invención, pueden utilizarse para detectar la presencia
de NLR utilizando cualquiera de una diversidad de inmunoensayos. Por
ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse en radioinmunoensayos o
en ensayos inmunométricos, conocidos también como ensayos de "dos
sitios" o "sándwich" (véase Chard, T., "An Introduction
to Radioimmune Assay and Related Techniques", in Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland
Publishing Co., N.Y. (1978)). En un ensayo inmunométrico típico, se
une una cantidad de anticuerpo sin marcar a un soporte sólido que es
insoluble en el fluido que se estudia, por ejemplo sangre, linfa,
extractos celulares, etc. Después de la unión inicial del antígeno
al anticuerpo inmovilizado, se añade una cantidad de un segundo
anticuerpo detectablemente marcado (que puede ser o no el mismo que
el primero), para permitir la detección y/o cuantificación del
antígeno unido (véase, por ejemplo, Radioimmune Assay Method,
Kirkham et al., ed. p. 199-206. E & S.
Livingstone. Edinburgh (1970)). Se conocen en la técnica muchas
variaciones de estos tipos de ensayos, y se pueden emplear para la
detección del NLR.
Los anticuerpos para NLR humano pueden
utilizarse también en la purificación del receptor intacto o de
fragmentos del receptor (véase generalmente Dean et al.,
Affinity Chromatography. A Practical Approach, IRL Press (1986)).
Típicamente, el anticuerpo se inmoviliza en una matriz
cromatográfica tal como Sepharose 4B. La matriz se empaqueta luego
en una columna, y la preparación que contiene el NLR se hace pasar a
su través en condiciones que promueven la unión, por ejemplo en
condiciones de salinidad baja. La columna se lava luego, y el NLR
unido se eluye, utilizando un tampón que promueve la disociación
del anticuerpo, por ejemplo un tampón que tiene un pH o
concentración salina alterado(a). El NLR eluido se puede
transferir a un tampón de elección, por ejemplo mediante diálisis,
y se puede almacenar o se puede utilizar directamente.
Uno de los usos principales para los ácidos
nucleicos de NLR y las proteínas recombinantes tiene lugar en
ensayos diseñados para identificar agentes capaces de unirse al
receptor NLR. Tales agentes pueden ser agonistas que imitan los
efectos normales de la unión al receptor, o antagonistas que inhiben
los efectos normales de la unión al receptor. De particular interés
es la identificación de agentes que se unen al receptor afín a
neurotensina y modulan la señalización intracelular, tal como la
actividad de adenil-ciclasa o el calcio
intracelular. Estos agentes tienen una aplicación terapéutica
potencial como analgésicos o anestésicos.
En los ensayos de unión de radioligandos, se
incuba una fuente de NLR junto con un ligando que se sabe se une al
receptor y con el compuesto a probar en cuanto a actividad de unión.
La fuente preferida de NLR son células, preferiblemente células de
mamífero, transformadas para expresar recombinantemente el receptor.
Las células seleccionadas no deben expresar una cantidad sustancial
de ningún otro receptor acoplado a proteína G que pudiera unirse al
ligando y distorsionar los resultados. Esto se puede determinar
fácilmente realizando ensayos de unión sobre células derivadas del
mismo tejido o línea celular que aquéllas que expresan
recombinantemente NLR pero que no han sufrido transformación
alguna.
El ensayo se puede realizar con células intactas
o con membranas preparadas a partir de las células (véase, por
ejemplo, Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
90:10230-10234 (1993)). Las membranas, o las
células, se incuban con un ligando específico para el receptor NLR,
y con una preparación del compuesto a ensayar. Después que se ha
completado la unión, el receptor se separa de la solución que
contiene el ligando y el compuesto de prueba, por ejemplo mediante
filtración, y se determina la cantidad de unión que se ha producido.
Preferiblemente, el ligando utiliza do se marca de forma detectable
con un radioisótopo tal como ^{125}I. No obstante, si se desea,
pueden utilizarse en su lugar marcadores fluorescentes o
quimioluminiscentes. Entre los compuestos marcadores fluorescentes
utiliza dos más habitualmente se encuentran el isotiocianato de
fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la
aloficocianina, o-ftaldehído y la fluorescamina.
Compuestos quimioluminiscentes útiles incluyen luminol, isoluminol,
éster teromático de acridinio, imidazol, sal de acridinio, y éster
oxalato. Cualquiera de estos agentes se puede utilizar para producir
un ligando adecuado para utilización en el ensayo.
La unión inespecífica se puede determinar
llevando a cabo la reacción de unión en presencia de un gran exceso
de ligando sin marcar. Por ejemplo, el ligando marcado se puede
incubar con receptor y con compuesto de prueba en presencia de un
exceso de mil veces de ligando sin marcar.
La unión inespecífica se debería restar de la
unión total, es decir, la unión en ausencia de ligando sin marcar,
para llegar a la unión específica para cada muestra ensayada. En
caso necesario, pueden incluirse en los ensayos otras etapas tales
como lavado, agitación mecánica, agitación manual, filtración y
similares. Típicamente, las etapas de lavado se incluyen después de
la separación del ligando unido a la membrana del ligando que queda
en disolución, y antes de la cuantificación de la cantidad de
ligando unido, por ejemplo por conteo del isótopo radioactivo. La
unión específica obtenida en presencia del compuesto de prueba se
compara con la obtenida en presencia del ligando marcado solo, para
determinar el grado en el que el compuesto de prueba ha desplazado
la unión al receptor.
En la realización de los ensayos de unión, debe
tenerse cuidado de evitar artefactos que pueden hacer que parezca
que un compuesto de prueba está interaccionando con el receptor afín
a neurotensina cuando, de hecho, la unión está siendo inhibida por
cualquier otro mecanismo. Por ejemplo, el compuesto que se ensaya
debe estar en un tampón que no inhiba sustancialmente por sí mismo
la unión del ligando a NLR, y preferiblemente debería ensayarse a
varias concentraciones diferentes. También se deberían examinar las
preparaciones del compuesto de prueba respecto a actividad
proteolítica, y es deseable que se incluyan antiproteasas en los
ensayos. Finalmente, es muy deseable que los compuestos
identificados por desplazar la unión del ligando al receptor NLR se
reexaminen en un intervalo de concentraciones suficiente para
llevar a cabo un análisis de Scatchard de los resultados. Este tipo
de análisis es bien conocido en la técnica y se puede utilizar para
determinar la afinidad de un compuesto de prueba por un receptor
(véase, por ejemplo, Ausubel, et al., Current Protocols in
Molecular Biology, 11.2.1-11.2.19 (1993);
Laboratory Techniques and Biochemistry and Molecular Biology. Work
et al., ed., N.Y. (1978) etc.). Se pueden utilizar programas
de ordenador como ayuda en el análisis de los resultados (véase,
por ejemplo, Munson, P., Methods Enzymol. 92:543-577
(1983); McPherson, G.A., Kinetic, EBDA Ligand.
Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysis
Programs. Elsevier-Biosoft. U.K. (1985)).
La activación del receptor por la unión del
ligando se puede monitorizar utilizando un número de ensayos
diferentes. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de
adenil-ciclasa dejando crecer células en los
pocillos de una placa de microtitulación, e incubando después los
pocillos en presencia o en ausencia de compuesto de prueba. El cAMP
puede extraerse luego en etanol, liofilizarse y resuspenderse en
tampón de ensayo. El ensayo de cAMP así recuperado se puede llevar
a cabo utilizando cualquier método para determinar la concentración
de cAMP, por ejemplo el Sistema de Inmunoensayo Enzimático de cAMP
Biotrack (Amersham), o el Sistema de Ensayo de AMP [^{3}H]
Cíclico (Amersham). Típicamente, los ensayos de
adenil-ciclasa se realizarán por separado de los
ensayos de unión, pero también puede ser posible realizar la unión y
los ensayos de adenil-ciclasa en una única
preparación de celdas. Más adelante se describen otros "ensayos de
señalización celular" que pueden utilizarse para monitorizar la
actividad del receptor.
Los receptores afines a neurotensina pueden
utilizarse también para seleccionar fármacos candidato utilizando
ensayos de señalización celular. Para identificar los agonistas de
NLR, se incorpora en un vector de expresión el DNA que codifica un
receptor, y se transfecta después en un hospedador apropiado. Las
células transformadas se ponen en contacto luego con una serie de
compuestos de prueba, y se monitoriza el efecto de cada uno. Entre
los ensayos que pueden utilizarse se encuentran ensayos que miden la
producción de cAMP (véase la exposición anterior), ensayos que
miden la activación de la actividad del gen informador, ensayos que
miden la modulación de la unión de ligandos, v.g.
GTP-gamma-S, o ensayos que miden
cambios en la concentración intracelular de calcio.
Los ensayos de señalización celular pueden
utilizarse también para identificar antagonistas de NLR. Los
receptores acoplados a la proteína G se pueden poner en su estado
activo incluso en ausencia de su ligando cognato expresándolos a
una concentración muy elevada en un sistema heterólogo. Por ejemplo,
el receptor se puede sobreexpresar utilizando la infección con
baculovirus de células de insecto Sf9, o el gen de NLR puede
enlazarse operativamente a un promotor de CMV y expresarse en
células COS o HEK293. En este estado constitutivo activado, los
antagonistas del receptor se pueden identificar en ausencia de
ligando midiendo la capacidad de un compuesto de prueba para
inhibir la actividad de señalización celular constitutiva. Ensayos
apropiados para esto son, nuevamente, ensayos de cAMP, ensayos de
activación de genes informadores, o ensayos que miden la unión de
GTP-gamma-S.
Un ensayo preferido de señalización celular se
basa en la observación de que las células transfectadas establemente
con NLRs muestran un cambio en los niveles intracelular de calcio
en respuesta a la incubación en presencia de ligando. De este modo,
se puede utilizar un proceso para identificar los agonistas o
antagonistas de NLR que es similar a los ensayos de
radiorreceptores expuestos anteriormente, excepto que se mide la
concentración de calcio en lugar de la radioactividad unida. La
concentración de calcio en presencia de compuesto de prueba y
ligando se compara con la existente en presencia de ligando solo,
para determinar si el compuesto de prueba está interaccionando en
el receptor afín a neurotensina. Un incremento estadísticamente
significativo en el calcio intracelular en respuesta al compuesto
de prueba indica que el compuesto de prueba está actuando como
agonista, mientras que una disminución estadísticamente
significativa en el calcio intracelular indica que aquél está
actuando como antagonista.
Pueden realizarse también ensayos que miden la
activación de un gen informador. Por ejemplo, células que expresan
el receptor NLR recombinante pueden transfectarse con un gen
informador (v.g. un gen de
cloranfenicol-acetiltransferasa o luciferasa)
enlazado operativamente a un elemento de respuesta a
adenil-ciclasa o diacilglicerol. Las células se
incuban luego con compuestos de prueba y la expresión del gen
informador se compara con la expresión en células de control que no
expresan NLR recombinante pero que son esencialmente idénticas en
otros aspectos. Un cambio estadísticamente significativo en la
expresión del gen informador en las células que expresan NLR es
indicativo de un compuesto de prueba que interacciona con el
receptor NLR.
Una forma de incrementar o disminuir los efectos
biológicos de NLR consiste en alterar el grado en el que el
receptor se expresa en las células. Por lo tanto, los ensayos para
la identificación de compuestos que inhiben o potencian la
expresión son de considerable interés. Estos ensayos se llevan a
cabo dejando crecer células que expresan NLR en presencia de un
compuesto de prueba y comparando después la expresión del receptor
en estas células con la expresión en células que se dejan crecer en
condiciones esencialmente idénticas pero en ausencia del compuesto
de prueba. Al igual que en los ensayos de unión expuestos
anteriormente, es deseable que las células utiliza das estén
sustancialmente libres de receptores competidores acoplados a la
proteína G. Una forma de cuantificar la expresión del receptor es
fusionar la secuencia de NLR con una secuencia que codifica un
péptido o proteína que se puede cuantificar fácilmente. Por ejemplo,
la secuencia de NLR puede ligarse a una secuencia que codifica
hemaglutinina, y utilizarse para transfectar células establemente.
Después de la incubación con el compuesto de prueba, el complejo
hemaglutinina/vector puede inmunoprecipitarse y someterse a una
transferencia Western con anticuerpo antihemaglutinina. Como
alternativa, se puede realizar un análisis de Scatchard de los
ensayos de unión con ligando marcado para determinar el número de
receptores. Los ensayos de unión se pueden llevar a cabo como se ha
expuesto anteriormente, y utilizarán preferiblemente células que se
han manipulado mediante ingeniería genética para expresar NLR de
forma recombinante.
Un grupo preferido de compuestos de prueba para
la inclusión en el ensayo de expresión de NLR está constituido por
oligonucleótidos complementarios a diversos segmentos de la
secuencia SEQ ID NO:2 de ácido nucleico de NLR. Estos
oligonucleótidos deben tener una longitud de al menos 15 bases, y
deberían derivarse de regiones no conservadas de la secuencia de
ácido nucleico del receptor.
Los oligonucleótidos que se sabe reducen la
expresión del receptor pueden derivatizarse o conjugarse a fin de
aumentar su eficacia. Por ejemplo, pueden emplearse
nucleósido-fosforotioatos en sustitución de sus
homólogos naturales (véase Cohen J., Oligodeoxynucleotides,
Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press (1989)). Los
oligonucleótidos se pueden suministrar a un paciente in vivo
con el fin de inhibir la expresión de DRR. Cuando se hace esto, se
prefiere que el oligonucleótido se administre en una forma que
potencie su absorción por las células. Por ejemplo, el
oligonucleótido puede suministrarse por medio de un liposoma, o
puede conjugarse a un péptido que es ingerido por las células
(véanse, por ejemplo, las patentes U.S. Núms. 4.897.355 y 4.394.448;
véanse también los documentos que no son patente U.S. WO 8903849 y
EP 0263740). Otros métodos para potenciar la eficacia del
suministro de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica y
son compatibles también con la presente invención.
Habiéndose descrito ahora la invención, la misma
se comprenderá más fácilmente por la referencia a los siguientes
ejemplos que se proporcionan a título ilustrativo y que no pretenden
limitar el alcance de la invención.
Se diseñaron un par de oligonucleótidos
degenerados basados en las secuencias peptídicas conservadas entre
los diversos miembros de la familia de receptores de opioides y
somatostatina. Las secuencias de los iniciadores son como sigue:
| 5'-AARMTSAARACIGCYACIAA-3' | (SEQ ID NO:3) | iniciador directo 1I-U; y |
| 5'-AYRGCGAYRTAICKRTCIAC-3' | (SEQ ID NO:4) | iniciador inverso 2I-L. |
La mezcla de la reacción en cadena de polimerasa
(volumen total 100 \mul) contenía -250 ng del DNA genómico humano
(NOVAGEN), 1 X tampón PCR (KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 8,9), Pharmacia), dNTPs 200
\muM (Pharmacia), 200 pmol de cada uno de los iniciadores
anteriores, y 5 U de polimerasa Taq (Pharmacia). Las
amplificaciones se realizaron en un RoboCycler Gradient 40
(Stratagene). El molde se desnaturalizó a 95ºC durante un minuto,
seguido por 35 ciclos constituidos por los pasos de
desnaturalización, reasociación y extensión, cada uno durante un
minuto a 95ºC, 42ºC y 72ºC, respectivamente. Los productos
resultantes se resolvieron en un gel de agarosa al 1%. Una banda
principal esperada de alrededor de 220 pb se escindió y se purificó
con el Kit Sephaglas BandPrep (Pharmacia) y se clonó en
pGEM-T (Promega). Los plásmidos se prepararon con
el protocolo de lisis alcalina y se cribaron con el método de
secuenciación de terminación didesoxi de Sanger et al. Se
encontró que la mayoría de los productos PCR clonados eran el
receptor de opioides delta humano, que se separó por hibridación de
colonias bacterianas. Entre los otros receptores de opioides humanos
conocidos (kappa y mu) y hORL1 (Orphanin FQ o receptor de
nociceptina), se encontraba un nuevo receptor supuesto acoplado a
proteína G, que se designó 10-29.
Se utilizó PCR para determinar en primer lugar
la genoteca de cDNA de tejido humano a cribar con un par de
iniciadores diseñados sobre la base del fragmento PCR original
(véase arriba): Las secuencias de los oligonucleótidos eran:
| 5'-TGGTCCTGCTCCTTGGAATG | (SEQ ID NO:5) | 29-1, iniciador directo; y |
| 5' GCGAAGCACACGGTCTCAAA | (SEQ ID NO:6) | 29-2, iniciador inverso. |
La mezcla PCR (volumen total 30 \mul) contenía
1 \mul de cDNA Humano QUICK-Screen Library Panel
(CLONTECH, Cat #k 1003-1), 1 X tampón PCR
(Pharmacia), dNTPs 200 \muM (Pharmacia), 25 pmol de cada iniciador
y 1 U de polimerasa Taq (Pharmacia). La desnaturalización inicial
de los moldes durante 1 min a 95ºC fue seguida por 45 ciclos de
desnaturalización, reasociación y extensión, cada uno durante 1
minuto a 95ºC, 55ºC y 72ºC, respectivamente. Se encontró que las
genotecas de cerebro, placenta, músculo esquelético y, a mucho menor
nivel, riñón contenían clones positivos (datos no presentados). Se
eligió una genoteca de cDNA de cerebro humano \lambdagt11
(CLONTECH, Cat #HL3002b) para seleccionar el gen con el fragmento
PCR original de 220 pb como sonda, marcado por el método de cebado
aleatorio (Glóbulos de Marcación de DNA
Ready-To-Go (-dCTP), Pharmacia). La
prehibridación y la hibridación se llevaron a cabo a 62ºC en 2 X
SSC, 5 X solución de Denhardt, 0,5% de SDS y 100 \mug/ml de DNA
de esperma de arenque. La concentración de la sonda era
aproximadamente 0,5 x 106 cpm/ml. Se identificó un clon positivo.
El inserto de este clon se escindió, se subclonó en pBlueScript, y
se designó pBS 10-29.
El clon pBS 10-29 contiene el
término N completo para el receptor supuesto: sin embargo, la región
codificante está interrumpida por codones de parada en el extremo
de la región transmembranal 5 (TM5) y la homología con HNTR1 se ha
perdido también más allá de esta región. Aparentemente, en este cDNA
los intrones no se han empalmado completamente. Se obtuvo un clon
de DNA genómico humano P1 utilizando los iniciadores
29-1 (iniciador directo, véase arriba), y
29-B:
| 5'- GGGGAAGTAGTGGAACTTGATGC-3', | (SEQ ID NO:7) | iniciador inverso |
Este clon P1 se digirió con endonucleasa de
restricción Stu-I y el material digerido se sometió
a electroforesis, seguida por transferencia Southern y cribado con
la sonda 10-29 descrita anteriormente. Se identificó
un fragmento StuI de 8,5 kb del clon P1 que proporcionaba una señal
fuerte después de hibridación. Este fragmento se subclonó en
pBlueScript, se designó pBS10-29-8k
y se secuenció completamente. Se encontró que incluía 12 pb aguas
arriba del codón inicial y la región codificante hasta la región
TM-5, pero no contenía información de secuencia para
el término C del receptor.
Otro fragmento Kpn1 de 11 kb, que se solapaba
con el fragmento de 8 kb a aproximadamente 1,3 kb del extremo 3'
del último, se subclonó también en pBlueScript (pBS
10-29-11k). Después de amplificación
en bacterias, el fragmento Kpn1 se aisló en gran cantidad y se
digirió completamente con Sau3AI. Los fragmentos resultantes se
clonaron aleatoriamente en pBlueScript y se secuenciaron. Se
encontró que dos clones, 8 y 74 eran idénticos y contenían un tramo
que codificaba la región TM7. Se diseñaron iniciadores alrededor de
esta región que permitían la determinación de secuencias situadas
más aguas arriba, el terminal C completo y la región 3' no
traducida. Los resultados sugirieron que existe otro intrón aguas
arriba de TM7 dado que no se encontró un TM6 reconocible en la
posición esperada con relación a la región TM7.
Utilizando el iniciador 3'-270r
(5'-TCCTCTGTGAAGTTTTGAGGC-3' (SEQ ID
NO: 8)) correspondiente a una secuencia en la región 3' no
traducida, fue posible clonar el término C completo del gen
10-29 por PCR anidada, utilizando dos iniciadores
10-29 específicos, anidados, directos,
29-1, véase arriba, y 29-f3':
5'-ATCGTCTGGGGCTTCT
CCG-3' (SEQ ID NO: 9). Un \mul de cDNA preparado a partir de médula espinal fetal humana con DRGs fijados Se seleccionó como molde para la primera tanda de PCR; las amplificaciones PCR anidadas se realizaron utilizando los productos PCR previos (1 \mul) como moldes. Las condiciones de la PCR eran las mismas que se han descrito arriba, excepto en lo que se refiere a la temperatura de reasociación (50ºC) y el número de ciclos (35). Se amplificó un fragmento de 857 pb, se clonó en pGEM-7 (fácil) (Promega) y se secuenció. Este clon se designó 29-CT (para el término C) y se encontró que compartía 222 pb con pBS 10-29 hasta la posición en la que comienza el primer intrón. El resto de la secuencia codifica la parte restante del gen 10-29. La combinación de ambas secuencias forma la región codificante entera del receptor, que totaliza 1245 pb y tiene una proteína receptora deducida de 415 aminoácidos.
CCG-3' (SEQ ID NO: 9). Un \mul de cDNA preparado a partir de médula espinal fetal humana con DRGs fijados Se seleccionó como molde para la primera tanda de PCR; las amplificaciones PCR anidadas se realizaron utilizando los productos PCR previos (1 \mul) como moldes. Las condiciones de la PCR eran las mismas que se han descrito arriba, excepto en lo que se refiere a la temperatura de reasociación (50ºC) y el número de ciclos (35). Se amplificó un fragmento de 857 pb, se clonó en pGEM-7 (fácil) (Promega) y se secuenció. Este clon se designó 29-CT (para el término C) y se encontró que compartía 222 pb con pBS 10-29 hasta la posición en la que comienza el primer intrón. El resto de la secuencia codifica la parte restante del gen 10-29. La combinación de ambas secuencias forma la región codificante entera del receptor, que totaliza 1245 pb y tiene una proteína receptora deducida de 415 aminoácidos.
La secuencia de nucleótidos completa del clon
cDNA compuesto se ilustra en la Figura 1. El marco de lectura
abierto constituido por 1245 nucleótidos codifica una proteína de
415 aminoácidos (Figura 2) con una masa molecular predicha de -43,6
kDaltons. La secuencia de la proteína contiene todos los rasgos
característicos de GPCRs siete hélices hidrófobas que representan
probablemente dominios transmembranales, un dominio de término
amino y un dominio de término carboxi. Existe un sitio de
glicosilación potencial en el dominio extracelular
N-terminal (posición 9) y una secuencia conservada
NPXXY en la posición 323-327.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia
predicha de aminoácidos del receptor 10-29 se
asemejan muy estrechamente a las secuencias de los receptores de
neurotensina NTR-1 y NTR-2. Una
alineación de secuencias del receptor 10-29 con los
receptores de neurotensina conocidos revela que la misma es
aproximadamente 32% idéntica a los NTR-1 y
NTR-2 humano y de rata. Entre los dominios
transmembranales, el grado máximo de homología se observa en la
región TM-2 (61%) y el mínimo en la región
TM-4 (20%). La semejanza en los aminoácidos entre
NTR-1, NTR-2 y el receptor
10-29 es particularmente alta (> 55%), lo que
sugiere que la neurotensina puede servir como el ligando endógeno
para el receptor 10-29. Así pues, el receptor
10-29 puede ser un nuevo subtipo del receptor de
neurotensina.
Preparación del tejido: Se obtuvieron
ganglios congelados de médula espinal y de la raíz dorsal humana
adulta y fetal, del Brain and Tissue Bank for Developmental
Disorders, Universidad de Maryland en Baltimore, de acuerdo con las
directrices éticas más estrictas. Se sacrificaron por decapitación
ratas macho adultas Sprague-Dawley (\sim 250 g:
Charles River, St-Constant, Quebec). Se extirparon
inmediatamente el cerebro y la médula espinal con DRGs todavía
fijados, se congelaron bruscamente en isopentano a -40ºC durante 20
s, y se guardaron a -80ºC. El tejido congelado se seccionó a 16
\mum en un criostato Microm HM 500 M (Alemania), y se montó
descongelado sobre portaobjetos ProbeOn Plus (Fisher Scientific,
Montreal, Quebec). Las secciones se guardaron a -80ºC antes de la
hibridación in situ.
Síntesis de Ribosondas: Se linealizó el
plásmido pCDNA3-10-29 que contenía
un fragmento de 506 pb utilizando las enzimas de restricción XbaI o
HindIII que cortan en el polienlazador en ambos sitios del cDNA
insertado. Las ribosondas de 10-29 de sentido y
antisentido se transcribieron in vitro utilizando RNA
polimerasas T7 o SP6 (Pharmacia Biotech), respectivamente, en
presencia de [^{35}S]UTP (\sim 800 Ci/mmol; Amersham,
Oakville, Ontario). A continuación de la transcripción, el molde de
DNA se digirió con DNAsa I (Pharmacia). Las ribosondas se
purificaron a continuación en microcolumnas G-50
ProbeQuant (Pharmacia Biotech, EE.UU.), de acuerdo con las
especificaciones del fabricante. La calidad de las ribosondas
marcadas se verificó mediante electroforesis en gel de
poliacri-
lamida-urea.
lamida-urea.
Hibridación In Situ : Las secciones
se fijaron posteriormente en paraformaldehído al 4% (BDH, Poole,
Inglaterra), en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) durante 10 minutos
a la temperatura ambiente (TA), y se lavaron en tres cambios de 2 X
tampón de citrato de sodio estándar (SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M
citrato de sodio, pH 7,0). Las secciones se equilibraron luego en
trietanolamina 0,1 M, se trataron con anhídrido acético al 0,25% en
trietanol-amina, se lavaron en 2 X SSC, y se
deshidrataron en una serie etanólica (50-100%). La
hibridación se realizó en un tampón que contenía 75% de formamida
(Sigma. St-Louis. Mo), 600 mM NaCl, 10 mM Tris (pH
7,5), 1 mM EDTA, 1 X solución de Denhardt (Sigma), 50 mg/ml de DNA
de esperma de salmón desnaturalizado (Sigma), 50 mg/ml de tRNA de
levadura (Sigma), 10% de sulfato de dextrano (Sigma), 20 mM de
ditiotreitol y sondas de cRNA marcadas con [^{35}S]UTP (10
X 106 cpm/ml), a 55ºC durante 18 h en cámaras humidificadas. Tras la
hibridación, los portaobjetos se lavaron en 2 X SSC a TA, se
trataron con 20 mg/ml de RNAsa IA (Pharmacia) en tampón de RNAsa
(10 mM Tris, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) durante 45 minutos a
TA, y se lavaron a una severidad final de 0,1 X SSC a 65ºC. Las
secciones se deshidrataron luego y se expusieron a una película
Kodak Biomax MR durante 17-21 días, y/o se bañaron
en una emulsión Kodak NTB2 diluida 1:1 con agua destilada, y se
expusieron durante 6 semanas a 4ºC antes del revelado y la
contratinción con acetato de cresil-violeta
(Sigma).
Resultados: El patrón de expresión del
clon 10-29 en la médula espinal del adulto humano es
absolutamente singular como se observa tanto al nivel de los
autorradiogramas de película como por autorradiografía en emulsión
de alta resolución. A todos los niveles segmentales examinados
(cervical, torácico y lumbar), solo un pequeño número de neuronas
expresaban específicamente mRNA de 10-29, y estas
células se restringían a 3 regiones funcionalmente distintas de la
materia gris medular, a saber la sustancia gelatinosa, el núcleo de
Clarke y el asta ventral. Dentro de la sustancia gelatinosa, una
proporción modesta (< 10%) de pequeñas neuronas altamente
marcadas estaban dispersas por todo el campo. La señal de
hibridación en el núcleo de Clarke era espectacular, expresando
unas cuantas células individuales niveles muy altos de mRNA de
10-29. El análisis al microscopio reveló que la
señal estaba asociada exclusivamente con la mayoría, pero no con
todas las neuronas grandes del núcleo de Clarke. Estas neuronas
envían sus axones al funículo lateral para formar el tracto
espinocerebelar posterior y están involucradas en el procesamiento
de la información propioceptiva de las extremidades inferiores.
Dentro del asta ventral, una minoría de neuronas motoras grandes
(aproximadamente 10 células/sección) estaban marcadas, pero en una
proporción mucho
menor.
menor.
Se observaba también la expresión del mRNA del
receptor del clon 10-29 en las neuronas de la
sustancia gelatinosa de la médula espinal humana fetal y en los
ganglios de la raíz dorsal (DRG). La expresión del clon
10-29 en los DRG adultos está pendiente de
confirmación. Los controles de hibridación estándar con sondas de
sentido marcadas con ^{35}S eran negativos.
Los estudios preliminares utilizando la sonda
humana 10-29 en secciones de cerebro de rata han
proporcionado resultados positivos. Se detectó una señal de
hibridación débil, pero específica, en las células piramidales CA
del hipocampo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Formulario pasa a página
siguiente)
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Astra Pharma Inc. Canada
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVO RECEPTOR
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Astra AB, Patent Department
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: S-151 85 Sodertälje
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Södertälje
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: ninguno
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 46-8 553 26000
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: 46-8 553 28820
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 415 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: no pertinente
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no pertinente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1360 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAARMTSAARA CIGCYACIAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAYRGCGAYRT AICKRTCIAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGTCCTGCT CCTTGGAATG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGAAGCACA CGGTCTCAAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGAAGTAG TGGAACTTGA TGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTCTGTGA AGTTTTGAGG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGTCTGGG GCTTCTCCG
\hfill19
Claims (16)
1. Una proteína recombinante o purificada que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.
2. La proteína de la reivindicación 1, en la
cual dicha secuencia de aminoácidos está constituida por la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.
3. Un polinucleótido recombinante o purificado
que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID NO:1.
4. El polinucleótido de la reivindicación 3, en
donde dicho polinucleótido codifica una proteína constituida por la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.
5. Un vector de expresión que comprende el
polinucleótido de la reivindicación 3 o la reivindicación 4.
6. Una célula hospedadora transformada con el
vector de la reivindicación 5.
7. La proteína de la reivindicación 1 producida
por la célula hospedadora de la reivindicación 6.
8. El polinucleótido de la reivindicación 4, en
donde dicho polinucleótido tiene una secuencia constituida por los
nucleótidos 65-1309 de SEQ ID NO:2.
9. Un vector de expresión que comprende el
polinucleótido de la reivindicación 8.
10. Una célula hospedadora transformada con el
vector de la reivindicación 9.
11. Un método de ensayo de un compuesto de
prueba respecto a su idoneidad para unirse a la proteína de la
reivindicación 1, que comprende:
- a)
- incubar una fuente que contiene la proteína de la reivindicación 1 con:
- i)
- un ligando conocido que se une a dicha proteína;
- ii)
- dicho compuesto de prueba; y
- b)
- determinar la extensión en la que la unión de dicho ligando es desplazada por dicho compuesto de prueba.
12. Un método para determinar si un compuesto de
prueba es un agonista de la proteína de la reivindicación 1, que
comprende:
- a)
- incubar una célula que expresa la proteína de la reivindicación 1 con dicho compuesto de prueba; y
- b)
- determinar si dicho compuesto de prueba causa un aumento estadísticamente significativo en su actividad intracelular de adenil-ciclasa o en la concentración intracelular de calcio.
13. Un método para determinar si un compuesto de
prueba es un agonista de la proteína de la reivindicación 1, que
comprende:
- a)
- incorporar una molécula de DNA que codifica la proteína de la reivindicación 1 en un vector de expresión de tal modo que la misma se enlaza operativamente a un promotor;
- b)
- transfectar dicho vector de expresión en un hospedador;
- c)
- seleccionar células transfectadas en el paso b) que tienen receptores afines a neurotensina activados constitutivamente como se evidencia por:
- i)
- un aumento estadísticamente significativo en la actividad intracelular de adenil-ciclasa; o bien por
- ii)
- un aumento estadísticamente significativo en la concentración intracelular de calcio;
- d)
- poner en contacto las células seleccionadas en el paso c) con dicho compuesto de prueba; y
- e)
- determinar si dicho compuesto de prueba causa una disminución estadísticamente significativa en dicha actividad de adenil-ciclasa o dicha concentración de calcio en comparación con células de control que no se han puesto en contacto con dicho compuesto de prueba.
\newpage
14. Un método para ensayar un compuesto de
prueba en cuanto a su idoneidad para alterar la actividad de la
proteína de la reivindicación 1, que comprende:
- a)
- incubar una fuente que contiene la proteína de la reivindicación 1 con:
- i)
- un ligando que se une con especificidad a dicha proteína;
- ii)
- dicho compuesto de prueba; y
- b)
- determinar si dicho compuesto de prueba aumenta o disminuye la concentración intracelular de calcio en respuesta a dicho ligando.
15. Un método de ensayo de un compuesto de
prueba respecto a su idoneidad para alterar la expresión de la
proteína de la reivindicación 1, que comprende:
- a)
- cultivar células que expresan la proteína de la reivindicación 1;
- b)
- recoger dichas células; y
- c)
- comparar la expresión de dicha proteína en las células expuestas a dicho compuesto de prueba con células de control que se han cultivado en condiciones esencialmente idénticas pero sin exposición a dicho compuesto de prueba.
16. El método de la reivindicación 15, en el
cual dicho compuesto de prueba es un oligonucleótido de al menos 15
nucleótidos de longitud y que comprende una secuencia complementaria
a la secuencia de un polinucleótido que codifica la proteína de la
reivindicación 1.
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