ES2283024T3 - Un nuevo receptor galanina. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO RECEPTOR DE GALANINA QUE SE HA DENOMINADO RECEPTOR 2 DE GALANINA. LA INVENCION SE REFIERE TANTO A UNA PROTEINA DEL RECEPTOR COMO A LOS ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LA PROTEINA. ADEMAS LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS Y A COMPOSICIONES BASADOS BIEN EN PROTEINAS DE GAL - R2 O EN ACIDOS NUCLEICOS.

Description

Un nuevo receptor galanina.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo general de los receptores biológicos y los diversos usos que pueden hacerse de tales receptores. De modo más específico, la invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican un nuevo receptor galanina y la proteína receptora propiamente dicha.

Antecedentes y técnica anterior

La galanina es un péptido neuroendocrino pequeño (29-30 aminoácidos) que no pertenece a ninguna familia de péptidos conocida (Bedecs et al., Int. J Biochem. Cell. Biol. 27: 337-349 (1995)). La misma está ampliamente distribuida en el sistema nervioso central y otros tejidos, y se ha consignado que tiene un gran número de actividades biológicas y farmacológicas diversas. Se ha consignado que la galanina: (a) promueve la liberación de la hormona del crecimiento (Bauer et al., The Lancet 2: 192-195 (1986)); (b) inhibe la liberación de insulina inducida por glucosa (Ahren et al., FEBS Lett, 299: 233-237 (1988)); (c) regula la motilidad en el tracto gastrointestinal (Fox-Thelkeld et al., Gastroenterology 101: 1471-1476 (1991)); (d) estimula el comportamiento de alimentación (Crawley et al., J. Neurosci 10: 3695-3700 (1990)); y (e) deteriora la función cognitiva (Mastropaolo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9841-9845 (1988)).

De interés farmacológico particular son los efectos analgésicos de la galanina (Post et al., Acta Physiol. Scand. 132: 583-584 (1988)). En la médula espinal, la galanina inhibe los reflejos nociceptivos y potencia el efecto analgésico de la morfina (Wiesenfeld-Hallin et al., Neurosci. Lett. 105: 149-154 (1989)). La administración direccionada de galanina hiperpolariza las neuronas de las astas dorsales y se ha consignado que la administración crónica de un antagonista del receptor galanina después de axotomía aumenta notablemente la autonomía en las ratas (Verge et al., Neurosci. Lett. 149: 193-197 (1993)). Estas observaciones indican que la galanina, como la morfina, ejerce acciones anti-nociceptivas potentes in vivo. Así pues, los efectos farmacológicos conocidos de la galanina sugieren potenciales aplicaciones terapéuticas como anestésico o analgésico en animales y humanos.

La galanina ejerce sus efectos por fijación a receptores fijados a la membrana. El cDNA para uno de tales receptores ("GAL-R1") ha sido clonado a partir tanto de humanos como de ratas (Habert-Ortoliet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9780-9783 (1994); Burgevin et al., J. Mol. Neurosci. 6: 33-41 (1995)). Se han encontrado niveles altos de mRNA de GAL-R1 de rata en el hipocampo ventral, el tálamo, la amígdala y la médula oblonga del cerebro y en las astas dorsales de la médula espinal (Burgevin et al., supra). Datos farmacológicos obtenidos utilizando fragmentos de galanina, agonistas y antagonistas han sugerido que más de un tipo de receptor puede ser responsable de las acciones de la galanina (para una revisión, véase Valkna et al., Neurosci. Lett. 187: 75-78 (1995)). El aislamiento y la caracterización de nuevos receptores para galanina serían sumamente deseables para ayudar al descubrimiento y desarrollo de agentes terapéuticos para alterar la actividad de la galanina in vivo.

Sumario de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de un nuevo receptor galanina ("GAL-R2") que es distinto de los receptores consignados previamente en términos de estructura, distribución tisular y características de fijación. Receptores tanto de rata como humanos han sido aislados y secuenciados. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "GAL-R2" hace referencia al receptor de una cualquiera de estas especies a no ser que el texto, expresamente o por contexto, indique otra cosa.

En su primer aspecto, la invención está dirigida a proteínas, exenta esencialmente s de componentes contaminantes celulares, que comprenden la secuencia de aminoácidos de GAL-R2 humano (como se muestra en la figura 2). La invención comprende adicionalmente anticuerpos que se fijan específicamente a GAL-R2 (es decir, que tienen al menos una afinidad 100 veces mayor para GAL-R2 que cualquier otra proteína) y anticuerpos producidos por un proceso que implica la inyección de preparaciones farmacéuticamente aceptables de tales proteínas en un animal capaz de producción de anticuerpos. En una realización preferida, se produce un anticuerpo monoclonal para GAL-R2 por inyección de la preparación farmacéuticamente aceptable de GAL-R2 en un ratón y fusión subsiguiente de células del bazo del ratón con células de mieloma.

La invención está dirigida también a un polinucleótido, sustancialmente exento de componentes contaminantes celulares, que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de GAL-R2 humano (como se muestra en la figura 2). Este aspecto de la invención abarca polinucleótidos que codifican proteínas constituidas por las secuencias de aminoácidos que se muestran en las figuras, vectores de expresión que comprenden tales polinucleótidos, y células hospedadoras transformadas con dichos vectores. Se incluyen también las proteínas recombinantes humanas GAL-R2 producidas por las células hospedadoras producidas de esta manera. Preferiblemente, el polinucleótido que codifica GAL-R2 humano tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la figura 2. Se prefiere también que los vectores y células hospedadoras utilizados para la expresión de GAL-R2 utilicen estos polinucleótidos particulares.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para ensayar un compuesto de test respecto a su capacidad para fijarse a GAL-R2. El método se lleva a cabo por incubación de una fuente de GAL-R2 con un ligando conocido por fijarse al receptor y con el compuesto de test. La fuente de GAL-R2 debería estar sustancialmente exenta de otros tipos de receptores galanina, es decir, más del 90% de los receptores galanina presentes deberían corresponder a GAL-R2. Una vez completada la incubación, la capacidad del compuesto de test para fijarse a GAL-R2 se determina por el grado en el que se ha desplazado la fijación de ligando. Una fuente preferida de GAL-R2 para uso en el ensayo es una célula transformada con un vector para expresar el receptor y que comprende un polinucleótido que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (GAL-R2 humano). En lugar de utilizar células en el ensayo, puede prepararse una preparación de membrana a partir de las células y puede utilizarse ésta como la fuente de GAL-R2. Aunque no es esencial, el ensayo puede ir acompañado por la determinación de la activación de un camino de segundo mensajero tal como el camino de la adenil-ciclasa. Esto debería ayudar a determinar si un compuesto que se fija a GAL-R2 está actuando como agonista o antagonista para la galanina.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para ensayar un compuesto de test respecto a su capacidad para alterar la expresión de GAL-R2. Este método se lleva a cabo cultivando células que expresan GAL-R2, pero sustancialmente exentas de otros receptores galanina, en presencia del compuesto de test. Las células se recogen luego y se compara la expresión de GAL-R2 con la expresión en células de control que se han desarrollado en condiciones esencialmente idénticas pero en ausencia del compuesto de test. En realizaciones preferidas, las células que expresan GAL-R2 son células transformadas con un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (GAL-R2 humano). Un compuesto de test preferido es un oligonucleótido de al menos 15 nucleótidos de longitud y que comprende una secuencia complementaria a una secuencia representada en SEQ ID NO:3. El método preferido para determinar la expresión del receptor es por medio de un ensayo de fijación de receptores.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Se muestra la secuencia de nucleótidos compuesta y la secuencia de aminoácidos traducida correspondiente (en código de una sola letra) de GAL-R2 de rata. La secuencia de ácido nucleico ha recibido la designación SEQ ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO:2.

Figura 2: Se muestra la secuencia de nucleótidos compuesta y la secuencia de aminoácidos traducida correspondiente (en código de una sola letra) de GAL-R2 humano. La secuencia de ácido nucleico ha recibido la designación SEQ ID NO:3, y la secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO:4.

Figura 3: Se han alineado las secuencias de aminoácidos de GAL-R2 de rata (RGALR2.PRO), GAL-R1 de rata (rGALR1-PRO), GAL-R2 humano (HGALR2.PRO) y GAL-R1 humano (hGALR1.PRO) para mostrar las regiones de homología. Se han encuadrado los residuos en la secuencia de HGAL-R2 que están compartidos con otras secuencias. Con objeto de optimizar la alineación, se han creado lagunas en varios lugares en las secuencias de GAL-R2, indicándose estas lagunas por recuadros negros. La secuencia de rGALR1.PRO ha sido designada como SEQ ID NO:5, y la secuencia hGALR1.PRO como SEQ ID NO:6.

Figura 4: Se muestra la isoterma de saturación de la fijación de ^{125}I-galanina a las membranas de células HEK-293 que expresan GAL-R2. Se incubaron concentraciones crecientes de radiotrazador con las membranas, se dejó que la fijación alcanzara el equilibrio, y posteriormente la se filtró mezcla de reacción como se describe en el Ejemplo 3. Se midió la fijación inespecífica en presencia de 1 \muM de galanina sin marcar y se sustrajo de la fijación total para obtener la fijación específica.

Figura 5: La figura 4 muestra los resultados de ensayos de fijación en los cuales se dejaron competir galanina sin marcar y péptidos afines a galanina con galanina marcada por sitios de GAL-R2. Los datos se han convertido en porcentajes, sirviendo la fijación en ausencia de competidor como 100%. No se observó inhibición alguna cuando los ensayos de fijación se realizaron en presencia de péptidos no afines a galanina.

Figura 6: La galanina atenuaba la estimulación de adenil-ciclasa por la forskolina de una manera dependiente de la dosis en células HEK-293 que expresaban GAL-R2. El panel A muestra el nivel basal de cAMP en células no tratadas con forskolina ni galanina (C); el efecto de galanina 1 \muM (G); el efecto de forskolina 0,1 mM (F); y el efecto de galanina 1 \muM + forskolina 0,1 mM (F+G). En el panel B, las células se incubaron en presencia de forskolina 0,1 mM sola o en presencia de forskolina con diversas concentraciones de galanina. El cAMP intracelular se extrajo luego y se midió por inmunoensayo enzimático como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se expresan como porcentajes, donde 100% es el valor obtenido en presencia de forskolina sola.

Definiciones

La descripción que sigue utiliza varios términos que hacen referencia a la tecnología del DNA recombinante. Con objeto de proporcionar una comprensión clara y consistente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, con inclusión del alcance que debe adscribirse a dichos términos, se proporcionan las definiciones siguientes:

Vector de clonación: Un DNA de plásmido o fago u otra secuencia de DNA que es capaz de replicarse autónomamente en una célula hospedadora, y que se caracteriza por uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción. Un fragmento de DNA extraño puede someterse a corte y empalme en el vector en estos sitios a fin de causar la replicación y clonación del fragmento. El vector puede contener un marcador adecuado para uso en la identificación de células transformadas. Por ejemplo, los marcadores pueden proporcionar resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina.

Vector de expresión: Un vector similar a un vector de clonación pero que es capaz de inducir la expresión del DNA que se ha clonado en él, después de transformación en un hospedador. El DNA clonado está puesto usualmente bajo el control de (es decir, está enlazado operativamente a) ciertas secuencias reguladoras tales como promotores o intensificadores. Las secuencias promotoras pueden ser constitutivas, inducibles o reprimibles.

Sustancialmente puro: Tal como se utiliza en esta memoria, "sustancialmente puro" significa que el producto deseado está exento esencialmente de componentes contaminantes celulares. Los contaminantes pueden incluir, pero sin carácter limitante, proteínas, carbohidratos o lípidos. Un método para determinar la pureza de una proteína o ácido nucleico consiste en someter a electroforesis una preparación en una matriz tal como poliacrilamida o agarosa. La pureza se evidencia por la aparición de una sola banda después de la tinción.

Hospedador: Cualquier célula procariota o eucariota que es el destinatario de un vector de expresión o vector de clonación replicable es el "hospedador" para dicho vector. El término abarca células procariotas o eucariotas que se han modificado por ingeniería genética para incorporar un gen deseado en su cromosoma o en su genoma. Ejemplos de células que pueden servir como hospedadores son bien conocidos en la técnica, dado que son métodos para transformación celular (véase v.g. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición. Cold Spring Harbor (1989)).

Promotor: Una secuencia de DNA que se encuentra típicamente en la región 5' de un gen, localizada en situación proximal al codón de comienzo. La transcripción se inicia en el promotor. Si el promotor es del tipo inducible, entonces la velocidad de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor.

Secuencia de Nucleótidos Complementaria: Una secuencia de nucleótidos complementaria, como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la secuencia que se produciría por apareamiento normal de bases. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos 5'-AGAC-3' tendría la secuencia complementaria 5'-GTCT-3'.

Expresión: La expresión es el proceso por el cual se produce un polipéptido a partir de DNA. El proceso implica la transcripción del gen en mRNA, y la traducción de este mRNA en un polipéptido.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está dirigida a las proteínas receptoras de GAL-R2, secuencias genéticas que codifican los receptores, un método para ensayar compuestos respecto a fijación a GAL-R2 y un método para ensayar compuestos por su capacidad para alterar la expresión de GAL-R2. Los receptores y sus ácidos nucleicos se definen por sus estructuras (como se muestran en las figuras 1 y 2) así como por su distribución tisular y características de
fijación.

Con respecto a la estructura, se comprenderá que la presente invención abarca no sólo secuencias idénticas a las que se muestran en las figuras, sino también secuencias que son esencialmente iguales y secuencias que son de otro modo sustancialmente iguales y que dan como resultado un receptor que retiene las características de fijación básicas de GAL-R2. Por ejemplo, es bien sabido que pueden utilizarse técnicas tales como la mutagénesis orientada para introducir variaciones en la estructura de una proteína. Las variaciones en GAL-R2 introducidas por este método o un método similar están abarcadas por la invención con la condición de que el receptor resultante retenga la capacidad para fijarse específicamente a galanina o péptidos semejantes a galanina. Así, la invención se refiere a proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos constituidas por la secuencia de SEQ ID NO:4 (humana).

I. Secuencias de Ácido Nucleico Codificantes de GAL-R2

Secuencias de DNA codificantes de GAL-R2 están presentes en una diversidad de tejidos, cualquiera de los cuales puede servir como fuente para el aislamiento de ácido nucleico codificante del receptor. En las ratas, los tejidos de la médula espinal y del cerebro se encuentran entre las fuentes preferidas, siendo especialmente preferidos los ganglios dorsales de la médula espinal y el hipocampo, los cuerpos mamilares y el cerebelo del cerebro. Adicionalmente, células y líneas de células que expresan GAL-R2 pueden servir como fuente para ácido nucleico. Éstas pueden ser células cultivadas que no han sido sometidas a transformación o líneas de células modificadas específicamente por ingeniería genética para expresar GAL-R2 recombinante.

Están disponibles muchos métodos para aislar secuencias de DNA, los cuales pueden adaptarse para el aislamiento de ácido nucleico de GAL-R2 (véase por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press (1989)). Un método preferido para GAL-R2 de rata, ilustrado en el Ejemplo 1, consiste en escrutar una genoteca de cDNA que se ha preparado por transcripción inversa de mRNA aislado de tejidos o células que se sabe expresan GAL-R2. La genoteca puede prepararse a partir, por ejemplo, de ganglios de raíz dorsal o de tejido cerebral de la rata. Se ha encontrado que una genoteca de cDNA de médula espinal del tallo cerebral de rata en ZAP II produce resultados adecuados. Un método similar puede utilizarse para GAL-R2 humano o, alternativamente, puede escrutarse una genoteca de DNA humano como se describe en el Ejemplo 7.

Se espera que una gran diversidad de sondas específicas para GAL-R2 puedan utilizarse de modo igualmente satisfactorio para el escrutinio de genotecas de cDNA. Una vía para producir fácilmente una gran cantidad de muestra consiste en utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar la secuencia deseada a partir de una genoteca de cDNA. Por ejemplo, puede realizarse una PCR sobre una genoteca de cDNA de ganglios de la raíz dorsal de la rata utilizando los iniciadores:

100

La letra "I" en las secuencias anteriores es la abreviatura de inosina.

Los fragmentos amplificados pueden fraccionarse por tamaños en un gel de agarosa e insertarse los fragmentos seleccionados (v.g., fragmentos de 400-1000 pares de bases de longitud) en un vector apropiado (v.g., pGEM-T). El vector puede introducirse en células competentes (v.g., células DH5) por cualquiera de los métodos establecidos para transformación de células, v.g., por precipitación con fosfato de calcio. Las células transformadas que contienen el DNA de interés pueden identificarse realizando nuevamente una PCR con los iniciadores TM2 y TM7. Las inserciones de DNA presentes en estas células se cortan, se purifican y se lavan con ^{32}P. Los fragmentos de DNA marcados así producidos se utilizan como sondas para escrutar una genoteca de cDNA respecto a GAL-R2. La presencia de la secuencia correcta en las células seleccionadas puede confirmarse por secuenciación del DNA y, en caso necesario, los clones parciales pueden someterse juntos a corte y empalme para formar una secuencia de longitud total.

Aunque se sabe que el procedimiento anterior es adecuado para obtener ácido nucleido de GAL-R2, se espera que puedan desarrollarse técnicas alternativas con relativamente poco esfuerzo. Así pues, pueden escrutarse genotecas de cDNA utilizando sondas sintetizadas sobre la base de la secuencia de GAL-R2 representada en la figura 1 para ratas y la representada en la figura 2 para humanos. En general, las sondas deberían tener una longitud de al menos 14 nucleótidos y no deberían seleccionarse de regiones que se sepa están altamente conservadas entre las proteínas, v.g., los dominios transmembranales de los receptores enlazados a proteínas G. Alternativamente, utilizando las secuencias representadas en las figuras, debería ser posible seleccionar iniciadores PCR que amplifiquen la secuencia de longitud total de GAL-R2. Las mismas técnicas que han resultado satisfactorias en la rata y en humanos pueden utilizarse asimismo para obtener secuencias de GAL-R2 para otras especies.

II. Producción y Aislamiento de la Proteína GAL-R2 Recombinante

Con objeto de expresar GAL-R2 recombinante, la secuencia estructural para la proteína arriba descrita deben ponerse en un vector que contenga señales de transcripción y traducción reconocibles por un hospedador apropiado. Las secuencias GAL-R2 clonadas, preferiblemente en forma bicatenaria, se insertan en el vector de expresión en un enlace operativo, es decir, las mismas se posicionan de tal modo que se encuentren bajo el control de las secuencias reguladoras del vector y de tal manera que se produce mRNA que se traduce en la secuencia de aminoácidos de
GAL-R2.

La expresión de la proteína del receptor GAL-R2 en hospedadores diferentes puede dar como resultado modificaciones diferentes posteriores a la traducción que pueden, potencialmente, alterar las propiedades del receptor. Preferiblemente, el ácido nucleico codificante de GAL-R2 se expresa en células eucariotas, especialmente células de mamífero. Estas células proporcionan modificaciones posteriores a la traducción que, inter alia, ayudan al plegamiento correcto de la proteína receptora. Ejemplos de un vector apropiado, pCDNA3-GAL-R2, y hospedador, células HEK293, se dan en el Ejemplo 2.

Otras células de mamífero que pueden utilizarse incluyen, sin limitación, células NIH-3T3, células CHO, células HeLa, células LM(tk-), etc. Vectores adecuados para uso en cada uno de estos diversos tipos de células son bien conocidos en la técnica (véase, v.g., Sambrook et al., supra). Promotores eucariotas preferidos incluyen el del gen metalotioneína I de ratón; el promotor TK del virus del Herpes; el promotor precoz de SV40; y el promotor del gen de levadura GAL4. Algunos ejemplos de promotores de procariotas adecuados incluyen los capaces de reconocer las polimerasas T4, los promotores P_{R} y P_{L} del bacteriófago lambda, y los promotores trp, recA, de choque térmico y lacZ de E. coli.

Pueden introducirse vectores de expresión en células hospedadoras por métodos tales como precipitación con fosfato de calcio, microinyección o electroporación. Las células que expresan el receptor GAL-R2 pueden seleccionarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Un método simple para confirmar la presencia del ácido nucleico del receptor en células consiste en realizar la amplificación por PCR utilizando los procedimientos e iniciadores arriba indicados. La presencia del receptor funcional puede confirmarse por realización de ensayos de fijación utilizando galanina marcada.

Una vez que las células productoras del receptor GAL-R2 recombinante han sido identificadas, pueden utilizarse las mismas en ensayos de fijación o en ensayos diseñados para identificar agentes capaces de alterar la expresión de GAL-R2. Alternativamente, pueden aislarse las membranas de las células y utilizarse en ensayos de fijación del receptor.

III. Anticuerpos para GAL-R2

La presente invención está dirigida también a anticuerpos que se fijan específicamente a GAL-R2 y a un proceso para producir tales anticuerpos. Los anticuerpos que "se fijan específicamente a GAL-R2" se definen como aquéllos que tienen una afinidad al menos 100 veces mayor para GAL-R2 que para GAL-R1 y cualquier proteína no desnaturalizada que no se fije a galanina. El proceso para producir tales anticuerpos puede implicar inyección de la proteína GAL-R2 propiamente dicha en un animal apropiado o, preferiblemente, inyección de péptidos cortos producidos que corresponden a regiones diferentes de GAL-R2. Los péptidos debían tener una longitud de al menos 5 aminoácidos y deberían seleccionarse de regiones que se cree son exclusivas de la proteína GAL-R2. Así, deberían evitarse por lo general regiones transmembranales altamente conservadas en la selección de los péptidos para la generación de anticuerpos. Métodos para producir y detectar anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica como se pone de manifiesto por trabajos estándar de referencia tales como: Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (1982); Kennett, et al., Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses (1980); y Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, (1984)).

"Anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto incluir moléculas intactas así como fragmentos que retienen su capacidad para fijarse a un antígeno (v.g., los fragmentos Fab y F(ab)_{2}. Estos fragmentos se producen típicamente por escisión proteolítica de anticuerpos intactos utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab)_{2}). El término "anticuerpo" se refiere también tanto a anticuerpos monoclonales como a anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se derivan de los sueros de animales inmunizados con el antígeno. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando tecnología de hibridoma (Kohler, et al., Nature 256: 495 (1975); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)). En general, esta tecnología implica inmunizar un animal, usualmente un ratón, con GAL-R2 intacto o un fragmento derivado de GAL-R2. Los esplenocitos de los animales inmunizados se extraen y se fusionan con células de mieloma adecuadas, v.g., células SP_{2}O. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT y se clonan luego por dilución limitante (Wands, et al., Gastroenterology 80: 225-232 (1981)). Las células obtenidas por dicha selección se ensayan luego para identificar los clones que secretan anticuerpos capaces de fijarse a GAL-R2.

Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, de la presente invención pueden utilizarse para detectar la presencia de la proteína GAL-R2 utilizando cualquiera de una diversidad de inmunoensayos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse en radioinmunoensayos o ensayos inmunométricos, conocidos también como ensayos de "dos sitios" o "sándwich" (véase Chard, T., "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques", en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y. (1978)). En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo sin marcar se fija a un soporte sólido que es insoluble en el fluido que se ensaya, v.g., sangre, linfa, extractos celulares, etc. Después de la fijación inicial del antígeno al anticuerpo inmovilizado, se añade una cantidad de segundo anticuerpo marcado detectablemente (que puede ser o no el mismo que el primero) para permitir la detección y/o cuantificación del antígeno fijado (véase v.g. Radioimmune Assay Method, Kirkham et al., e.d., pp. 199-206, E & S. Livingstone, Edimburgo (1970)). Muchas variaciones de estos tipos de ensayos se conocen en la técnica y pueden emplearse para la detección de GAL-R2.

Los anticuerpos para GAL-R2 pueden utilizarse también en la purificación del receptor intacto o fragmentos del receptor (véase en líneas generales, Dean et al., Affinity Chromatography, A Practical Approach, IRL Press (1986)). Típicamente, el anticuerpo se inmoviliza en una matriz cromatográfica tal como Sepharose 4B. La matriz se empaqueta luego en una columna y la preparación que contiene GAL-R2 se pasa a su través en condiciones que promueven la fijación, v.g., en condiciones de baja concentración de sal. La columna se lava luego, y el GAL-R2 fijado se eluye utilizando un tampón que promueve disociación del anticuerpo, v.g., un tampón que tiene un pH o concentración de sal alterados. El GAL-R2 eluido puede transferirse a un tampón de elección, v.g., por diálisis, y guardarse o utilizarse directamente.

IV. Ensayo para Fijación de GAL-R2

Uno de los usos principales para los ácidos nucleicos y proteínas recombinantes GAL-R2 es en ensayos diseñados para identificar agentes, distintos de galanina, capaces de fijarse a los receptores GAL-R2. Tales agentes pueden ser agonistas, que mimetizan los efectos de galanina, o antagonistas, que inhiben los efectos de galanina. De particular interés es la identificación de agentes que se fijan a los receptores GAL-R2 y modulan la actividad de adenil-ciclasa en las células. Estos agentes tienen aplicación terapéutica potencial como analgésicos o anestésicos.

Un ejemplo de un ensayo que puede utilizarse para detectar compuestos que se fijan a GAL-R2 se presenta en el Ejemplo 4. La característica esencial de este ensayo es que una fuente de GAL-R2 se incuba junto con un ligando conocido que se fija al receptor y con el compuesto que se ensaya en cuanto a actividad de fijación. La fuente preferida para GAL-R2 son células, preferiblemente células de mamífero, transformadas para expresar recombinantemente el receptor. Las células seleccionadas no deberían expresar una cantidad sustancial de ningún otro receptor que fije galanina, v.g., GAL-R1. Esto puede determinarse fácilmente por realización de ensayos de fijación de galanina en células derivadas del mismo tejido o línea de células que las que expresan recombinantemente GAL-R2 pero que no han sufrido transformación.

El ensayo puede realizarse con células intactas o, preferiblemente, con membranas preparadas a partir de las células (véase v.g. Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10230-10234 (1993)). Las membranas se incuban con un ligando específico para los receptores galanina y con una preparación del compuesto que se ensaya. Una vez completada la fijación, se separa el receptor de la solución que contiene ligando y compuesto de test, v.g. por filtración, y se determina la cantidad de fijación que se ha producido. Preferiblemente, el ligando utilizado es galanina marcada detectablemente con un radioisótopo tal como ^{125}I. No obstante, si se desea, pueden utilizarse en su lugar marcadores fluorescentes o quimioluminiscentes. Entre los compuestos marcadores fluorescentes utilizados más comúnmente se encuentran isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. Compuestos quimioluminiscentes útiles incluyen luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio, y éster oxalato. Cualquiera de estos agentes que pueden utilizarse para marcar detectablemente galanina producirá un ligando adecuado para uso en el ensayo.

La fijación inespecífica puede determinarse por realización de la reacción de fijación en presencia de un gran exceso de ligando sin marcar. Por ejemplo, puede incubarse ^{125}I-galanina con receptor y compuesto de test en presencia de un exceso de 1000 veces de galanina sin marcar. La fijación inespecífica debe restarse de la fijación total, es decir la fijación en ausencia de galanina sin marcar, para llegar a la fijación específica para cada muestra ensayada. Otros pasos tales como lavado, agitación, sacudidas, filtración y análogos pueden incluirse en los ensayos en caso necesario. Típicamente, se incluyen pasos de lavado después de separar el ligando fijado a la membrana del ligando que permanece en solución y antes de la cuantificación de la cantidad de ligando fijado, v.g., por recuento del isótopo radioactivo. La fijación específica obtenida en presencia del compuesto de test se compara con la obtenida en presencia del ligando marcado solo para determinar el grado en que el compuesto de test ha desplazado la galanina.

En la realización de los ensayos de fijación, debe tenerse cuidado a fin de evitar artefactos que pueden aparentar que un compuesto de test está interaccionando con el receptor GAL-R2 cuando, de hecho, la fijación está siendo inhibida por algún otro mecanismo. Por ejemplo, el compuesto que se ensaya debería encontrarse en un tampón que no inhiba por sí mismo sustancialmente la fijación de galanina a GAL-R2 y, preferiblemente, debería ensayarse a varias concentraciones diferentes. Las preparaciones del compuesto de test deberían examinarse también respecto a actividad proteolítica, y es deseable que se incluyan antiproteasas en los ensayos. Finalmente, es muy deseable que los compuestos identificados como desplazantes de la fijación del ligando al receptor GAL-R2 se re-examinen en un intervalo de concentraciones suficiente para realizar un análisis Scatchard de los resultados. Este tipo de análisis es bien conocido en la técnica y puede utilizarse para determinar la afinidad de un compuesto de test para el receptor (véase, v.g., Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, 11.2.1-11.2.19 (1993); Laboratory Techniques and Biochemistry and Molecular Biology, Work, et al., ed. N.Y. (1978), etc.). Pueden utilizarse programas de ordenador para ayudar al análisis de los resultados (véase v.g., Munson, P., Methods Enzymol. 92: 543-577 (1983); McPherson, G.A., Kinetic, EBDA Ligand, Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysis Programs, Elsevier-Biosoft, Reino Unido (1985)). Un ejemplo de los tipos de curvas que pueden obtenerse utilizando este método se muestra en la figura 5, y ejemplos de constantes inhibidoras para péptidos afines a galanina determinados utilizando ensayos de fijación se muestran en la Tabla 1.

La activación de un camino de segundo mensajero puede examinarse realizando ensayos de adenil-ciclasa para compuestos que han sido identificados por fijarse al receptor GAL-R2. Estos ensayos pueden llevarse a cabo como se expone en el Ejemplo 5 o utilizando cualquier otro método para determinar la concentración de cAMP. Típicamente, los ensayos de adenil-ciclasa se realizarán por separado de los ensayos de fijación, pero también puede ser posible realizar los ensayos de fijación y de adenil-ciclasa sobre una misma preparación de células.

V. Ensayo para Capacidad de Modulación de la Expresión de GAL-R2

Una vía para aumentar o disminuir los efectos biológicos de la galanina consiste en alterar el grado en que se expresa GAL-R2 en las células. Por esta razón, los ensayos para la identificación de compuestos que inhiban o aumenten la expresión presentan un interés considerable. Estos ensayos se llevan a cabo cultivando células que expresan GAL-R2 en presencia de un compuesto de test y comparando luego la expresión del receptor en estas células con células cultivadas en condiciones esencialmente idénticas pero en ausencia del compuesto de test. Como en los ensayos de fijación expuestos anteriormente, es deseable que las células utilizadas estén sustancialmente exentas de receptores para galanina distintos de GAL-R2. El análisis Scatchard de los ensayos de fijación realizados con galanina marcada puede utilizarse para determinar el número de receptores. Los ensayos de fijación pueden llevarse a cabo como se ha expuesto anteriormente en la sección IV y utilizarán preferiblemente células que han sido modificadas por ingeniería genética para expresar recombinantemente GAL-R2 como se describe en las secciones I y II.

Un grupo preferido de compuestos de test para inclusión en el ensayo de expresión de GAL-R2 está constituido por oligonucleótidos complementarios para diversos segmentos de la secuencia de ácido nucleico de GAL-R2. Estos oligonucleótidos deberían tener al menos una longitud de 15 bases y deberían derivarse de regiones no conservadas de la secuencia de ácido nucleico del receptor.

Oligonucleótidos que se ha encontrado reducen la expresión del receptor pueden derivatizarse o conjugarse a fin de aumentar su eficacia. Por ejemplo, pueden emplearse nucleósido-fosforotioatos en sustitución de sus homólogos naturales (véase Cohen, J., Oligodeoxy-nucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press (1989)). Los oligonucleótidos pueden suministrarse a un paciente in vivo con el propósito de inhibir la expresión de GAL-R2. Cuando se hace esto, es preferible que el oligonucleótido se administre en una forma que aumente su absorción por las células. Por ejemplo, el oligonucleótido puede suministrarse por medio de un liposoma o conjugado a un péptido que es ingerido por las células (véanse v.g., las Patentes U.S. Núms. 4.897.355 y 4.394.448; véanse también los documentos no patentados en los Estados Unidos WO 8903849 y EP 0263740). Otros métodos para mejorar la eficiencia del suministro de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica y son también compatibles con la presente
invención.

Una vez descrita la invención, la misma se comprenderá más fácilmente por referencia a los ejemplos siguientes que se proporcionan con carácter de ilustración y que no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación del Receptor-2 de Galanina de Rata (GAL-R2)

Se utilizó una estrategia de escrutinio de homología basada en PCR para aislar nuevas secuencias de cDNA codificantes de los receptores acoplados a proteínas G. Secuencias que codificaban probablemente receptores acoplados a proteínas G se amplificaron a partir de mRNA de ganglios de raíz dorsal de rata por PCR de transcripción inversa utilizando los iniciadores siguientes:

1

Los moldes para la amplificación por PCR se sintetizaron utilizando un "Kit de Síntesis de cDNA de la Primera Cadena" (Pharmacia Biotech.) y 400 ng de poli A + RNA de ganglios de raíz dorsal. El cDNA de la primera cadena así preparado se diluyó dos veces con agua destilada, se calentó a 95ºC durante 3 minutos y se enfrió rápidamente en hielo. Se amplificaron luego 5 \mul del cDNA así producido con 50 pmoles de cada uno de los iniciadores TM2 y TM7 y 2,5 unidades de DNA-polimerasa Taq en KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tris (HCl) 10 mM, y dNTPs 200 \muM, de pH 9,0. Los tubos de reacción se calentaron a 95ºC durante 1 minuto y se sometieron luego a 40 ciclos de desnaturalización (a 95ºC/1 min), reasociación (45ºC/1 min) y extensión (72ºC/1 min). La extensión final se realizó durante 10 minutos. Los fragmentos amplificados se analizaron y se fraccionaron por tamaños en una columna de agarosa al 1,5%. Los fragmentos entre 400 pb y 1000 pb de longitud se escindieron del gel, se purificaron utilizando un kit Sephaglas BandPrep de Pharmacia, y se insertaron en un vector pGEM-T de Promega. Los plásmidos recombinantes así producidos se utilizaron para transformar células competentes DH5.

Las células transformadas se extendieron sobre placas de agar 2YT que contenían ampicilina y los clones pGEM-T recombinantes se seleccionaron por PCR directa de colonias utilizando iniciadores diseñados para los promotores T7 y SP6. Las condiciones de la PCR fueron exactamente las mismas que anteriormente excepto que se utilizaron 50 pmoles de cada uno de los iniciadores T7 y SP6 en lugar de los iniciadores TM2 y TM7. La temperatura de reasociación era 50ºC y se realizaron 30 ciclos. Se preparó DNA plasmídico a partir de los clones que contenían plásmidos recombinantes utilizando un "Sistema de Purificación de DNA Wizard Miniprep" (Promega Corporation) partiendo de 4 ml de cultivo bacteriano. La secuencia de DNA de estos clones se determinó utilizando el método de terminación de cadenas de didesoxinucleótidos de Sanger sobre moldes plasmídicos bicatenarios desnaturalizados utilizando un kit de frecuencia T7, de Pharmacia.

El fragmento de inserción de DNA del clon 3B-21 se escindió del vector utilizando Sac II y Nde I, se aisló en un gel de agarosa y se marcó con ^{32}P por síntesis aleatoria cebada utilizando un kit de marcación de DNA Ready-To-Go de Pharmacia. Este fragmento marcado se utilizó para escrutar una genoteca de cDNA de médula espinal de tallo cerebral de rata en ZAP II (Stratagene). Los filtros se prehibridaron durante 2 horas a 42ºC en formamida al 50%, 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt, 1% de glicina y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y cizallado. La hibridación con la sonda marcada se realizó a 42ºC durante 18 horas en una solución que contenía 50% de formamida, 5 x SSC, 1 x solución de Denhardt, 0,3% de SDS y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y cizallado. Los filtros se lavaron dos veces en 2 x SSC, 0,1% SDS a la temperatura ambiente. Los mismos se lavaron luego dos veces durante 15 min en 2 x SSC, 0,1% SDS a 42ºC, dos veces durante 15 min a 42ºC en 0,2 x SSC,
0,1% SDS, dos veces con 0,05 x SSC, 0,1% SDS a 55ºC y finalmente en la misma solución de lavado a 65ºC.

Los fagos que se hibridaron positivamente se purificaron, y sus inserciones se rescataron por escisión mediada con fago adyuvante para producir DNAs plasmídicos. Un clon, 21RSC4, contenía la secuencia codificante completa para el receptor excepto 51 pb de la región 5'. Esta región se obtuvo por PCR y se unió luego en el sitio Bsu36I en el nucleótido número 16 de 21RSC4. De este modo, se generaron 67 pb en el extremo 5' de la región codificante del clon pBS/GAL-R2 a partir de un fragmento generado por PCR.

Ejemplo 2 Características Estructurales del Receptor 2 de Galanina de Rata

Se encontró que el plásmido pBS/GAL-R2 recombinante contenía un marco de lectura abierto de 372 aminoácidos, flanqueado por regiones sin traducir 3' y 5' de, respectivamente, 289 y 308 pb. La secuencia del marco de lectura abierto se muestra en la figura 1 junto con la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. La proteína tiene un peso molecular de 40.700 daltons. El análisis de hidropatía de la proteína es consistente con una topografía de siete dominios transmembranales, indicativa de la familia de receptores acoplados a proteínas G (Sprengel et al., "Hormone Receptors", en Handbook of Receptors and Channels: G Protein-Coupled Receptors, Peroutka, S.J., ed., pp. 153-207, CRC Press (1994)). Adicionalmente, el análisis de la secuencia reveló que el marco de lectura abierto de pBS/GAL-R2 contiene varias características/residuos estructurales conservados que se encuentran entre los miembros de la familia de receptores neuropeptídicos, que incluyen: una asparagina en TM1 (Asn43); una leucina (Leu67) y un ácido aspártico (Asp71) en TM2; y un residuo arginina (Arg123) y tirosina (Tyr124) en TM3. Otras características de este gen receptor GAL-R2 son: sitios potenciales para glicosilación en N en el término amino (Asn2, Asn11); la presencia de varias serinas y treoninas en el término carboxilo; y la presencia de un segundo y tercer bucles intracelulares, que pueden servir como sitios potenciales para fosforilación por proteína-quinasas.

Una comparación del marco de lectura abierto de GAL-R2 de rata con las secuencias de los receptores GAL-R2 y GAL-R1 humanos se muestra en la figura 3. En conjunto, GAL-R2 de rata tiene una identidad de aproximadamente 53% al nivel de nucleótidos y 35,5% al nivel de aminoácidos con GAL-R1 de rata (Burgevin et al., J. Mol. Neurosci. 6: 33-41 (1995)) y 34,8% con GAL-R1 humano (Habert-Ortoli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 9780-9783 (1994)). Sin embargo, la homología de secuencia es mayor en los dominios transmembranales supuestos. Respectivamente, las homologías entre GAL-R1 y GAL-R2 de rata conocidos en TM1 a TM7 son 37,5%, 67%, 41,6%, 25%, 50%, 33% y 50%.

Globalmente, es evidente que GAL-R2 tiene una secuencia exclusiva que lo separa de los otros receptores acoplados a proteínas G u otros miembros de la subfamilia de receptores neuropeptídicos. Los residuos de aminoácidos esenciales para la fijación de galanina al receptor GAL-R1 han sido identificados como His264, His267, Phe282 y, en menor proporción, Glu271. Solamente uno de estos residuos, correspondiente a His264, se conserva en GAL-R2.

Ejemplo 3 Expresión Recombinante del Receptor-2 de Galanina de Rata

Para generar un vector de expresión de mamífero, un fragmento de restricción Hind III - Bst-XI de 1,4 kb de pBS/GAL-R2 se aisló y se subclonó entre los sitios Hind III y BstX-I de pcDNA3 de InVitrogen, San Diego, CA. Este vector de expresión, designado pCDNA3/ GAL-R2 contiene, además de la secuencia codificante del receptor entera, 50 pb de secuencia 5' no traducida y 288 pb de secuencia 3' no traducida. El DNA plasmídico para análisis ulterior se preparó utilizando el sistema Qiaprep de Qiagen.

A. Transfección Transitoria

Se obtuvieron células HEK293s del laboratorio de Cold Spring Harbor. Las mismas se mantuvieron en medio de cultivo a 37ºC, 5% CO_{2} y se diluyeron 10 veces cada tres días. Las células se inocularon en matraces de 80 cm^{2} (2 x 10^{6} células por matraz) en Medio Esencial Modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco BRL), se complementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 0,25 \mug/ml de fungizona. Un día después de la inoculación, las células se transfectaron transitoriamente utilizando un método de CaCl_{2} modificado (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) y 30 \mug de DNA plasmídico por matraz. Las células se cosecharon 48 horas después de la transfección para experimentos de fijación de ligando o de transducción de señales.

B. Transfección Estable

Se transfectaron células HEK293s en matraces de 80 cm^{2} con 30 \mug de pCDNA3/GAL-R2. Después de 21 días de selección en medio de cultivo que contenía 600 \mug/ml de G418, las colonias resistentes se agruparon y se expandieron para los estudios de fijación de radioligandos y transducción de señales.

Ejemplo 4 Características de Fijación de GAL-R2 de Rata Expresado Recombinantemente A. Métodos

Se realizó un ensayo de fijación de galanina sobre las membranas brutas preparadas a partir de células transfectadas con pcDNA3/GAL-R2. Las células se cultivaron en cápsulas Petri de 150 mm hasta aproximadamente 80% de la confluencia. Antes de la cosecha, las células contenidas en las placas Petri se lavaron una sola vez con PBS fría (Gibco BRL). Las células se rascaron luego en PBS enfriada con hielo utilizando un rascador de células de Teflón. Las células así cosechadas se centrifugaron suavemente a 1500 x g a 4ºC, se resuspendieron en tapón de membrana, "MB" (HEPES 20 mM de pH 7,5 que contenía 10 \mug/ml de benzamidina, 5 \mug/ml de leupeptina, 5 \mug/ml de inhibidor de tripsina de soja, y 0,1 mM de fluoruro de fenil-metil-sulfonilo) y se disgregaron con un Polytron a un ajuste de \sim20.000 rpm durante 30 s. La suspensión de células disgregada se centrifugó a \sim100.000 x g durante 60 minutos a 4ºC utilizando un rotor de ángulo fijo en una Ultracentrífuga Beckman L8-70M. El sedimento así obtenido se resuspendió en el tampón de membrana a una concentración de 1,0-1,5 mg/ml, se dividió en partes alícuotas y se congeló a -80ºC hasta su utilización.

La reacción de fijación se realizó en un volumen total de 100 \mul de tampón de fijación (MB + 0,4% de seroalbúmina bovina) que contenía 5-10 \mug de proteína de membrana y 0,1 nM de ^{125}I-galanina (2200 cI/mmol, DuPont/NEN con o sin competidores sin marcar. Se estimó la fijación inespecífica en presencia de 1 \muM de galanina sin marcar. Las reacciones de fijación transcurrieron durante 20 min a la temperatura ambiente y se detuvieron por filtración a través de Unifilters-96, filtros GF-B (Canberra Packard), utilizando el sistema de filtración Filtermate 196, de 96 pocillos, de Canberra Packard. Los filtros se lavaron 5 veces con 0,5 ml de HEPES 20 mM enfriado en hielo, de pH 7,5. Los filtros se secaron a 55ºC durante 1 hora y se añadieron luego 100 \mul de \muScint-20 (Canberra Packard) por pocillo. Los filtros se sometieron a recuento con el contador de microplacas Topcount, de Canberra Packard.

B. Resultados

Cuando se transfectó a células HEK293, pCDNA3/GAL-R2 dio como resultado la expresión de sitios específicos de fijación de ^{125}I-galanina. Se generaron sitios de fijación inespecíficos de ^{125}I-galanina por la transfección del vector propiamente dicho o un constructo de expresión de pCDNA3 de control que codificaba un receptor de delta-opioides. Se generó una agrupación de células HEK293 estables que expresaban el receptor GAL-R2 por selección de células transfectadas con pCDNA3/GAL-R2 utilizando G418 y se llevaron a cabo experimentos de fijación sobre las membranas de estas células. Un ejemplo de los resultados de un experimento de fijación se muestra en la figura 4.

Se detectó una sola clase de sitios de fijación de galanina ^{125}I saturables con un valor Kd estimado para ^{125}I-galanina de 1,68 ± 0,43 nM y un Bmax de 1-2 pmol/mg de proteína bruta. Se utilizaron diversos péptidos afines a galanina en experimentos de competición utilizando como trazador ^{125}I-galanina. Las curvas de competición para estos péptidos se presentan en la figura 5, y los valores Ki de los péptidos ensayados se resumen en la Tabla 1.

TABLA 1 Constantes inhibidoras de péptidos afines a galanina para fijación de ^{125}I-galanina en GAL-R2

2

La fijación de galanina marcada fue desplazada por galanina y péptidos afines a galanina, pero no por ligandos no afines a galanina (v.g. sustancia P, polipéptido intestinal vasoactivo, angiotensina II y dinorfina). La diferencia principal entre GAL-R1 y GAL-R2 de rata, sin embargo, reside en el reconocimiento del péptido quimérico C7, que es equipolente a la galanina en el receptor GAL-R1, pero es mucho menos activo en GAL-R2.

Ejemplo 5 Activación de cAMP

Agrupaciones estables de células transfectadas se inocularon en placas de 24 pocillos y se dejaron crecer durante una noche. Antes de los experimentos, las células se lavaron con PBS a 37ºC y se cubrieron luego con PBS que contenía 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) 1 mM. Las células contenidas en pocillos duplicados se estimularon durante 10 minutos a 37ºC con forskolina (0,1 mM) sola, o en presencia de diversas concentraciones de galanina o péptidos afines a galanina. Se extrajo cAMP en etanol, se liofilizó y se resuspendió en tampón de ensayo 0,5 mM. El ensayo de cAMP se realizó utilizando el Sistema de Inmunoensayo Enzimático de cAMP Biotrack (Amersham) o el Sistema de Ensayo de AMP Cíclico [^{3}H] (Amersham).

Se encontró que la activación de GAL-R2 de rata en las células HEK293 transfectadas establemente conduce a una inhibición significativa de la acumulación de cAMP estimulada por forskolina, y que esta inhibición ocurre de una manera dependiente de la concentración (Figura 6). Las células no transfectadas no exhibían este efecto.

Ejemplo 6 Hibridación in Situ A. Métodos

Se sacrificaron ratas Sprague-Dawley macho adultas (\sim300 g; Charles River, St-Constant, Quebec), por decapitación. Se extirparon inmediatamente el cerebro, la hipófisis y la médula espinal, se congelaron bruscamente en isopentano a -40ºC durante 20 s y se guardaron a -80ºC. El tejido congelado se seccionó a 14 \mum en un criostato Microm HM 500M (Alemania) y se montó después de descongelación en portaobjetos ProbeOn Plus (Fisher Scientific, Montreal, Quebec). Las secciones se guardaron a -80ºC antes de la hibridación in situ.

El plásmido pCDNA3-GAL-R2 se linealizó utilizando las enzimas de restricción XbaI o Hind III que cortan en el polienlazador a ambos lados del cDNA insertado. Se transcribieron in vitro ribosondas GAL-R2 de sentido y antisentido utilizando RNA-polimerasas T7 o SP6 (Pharmacia Biotech.), en presencia de [^{35}S]UTP (\sim800 Ci/mmol); Amersham, Oakville, Ontario). Después de la transcripción, el DNA molde se digirió con DNAsa I (Pharmacia). Las ribosondas se purificaron ulteriormente por extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se precipitaron en etanol al 70% que contenía acetato de amonio y tRNA. La calidad de las ribosondas marcadas se comprobó por electroforesis en gel de poliacrilamida-urea.

Las secciones se post-fijaron en paraformaldehído al 4% (BDH, Poole, Inglaterra) en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) durante 10 min a la temperatura ambiente (TA) y se lavaron en tres cambios de tampón de citrato de sodio estándar 2X (SSC: NaCl 0,15M, citrato de sodio 0,015M, pH 7,0). Las secciones se equilibraron luego en trietanol-amina 0,1M, se trataron con anhídrido acético al 0,25% en trietanolamina, se lavaron en 2X SSC y se deshidrataron en una serie de etanol (50-100%). La hibridación se realizó en un tampón que contenía formamida al 75%, NaCl 600 mM, Tris 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, 1X solución de Denhardt, 50 mg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado, 50 mg/ml de tRNA de levadura, sulfato de dextrano al 10%, ditriotreitol 20 mM y sondas de cRNA marcadas con [^{35}S]UTP (10 x 10^{6} cpm/ml) a 55ºC durante 18 h en cámaras humidificadas. Después de la hibridación, los portaobjetos se lavaron en 2 X SSC a TA, se trataron con 20 mg/ml de RNasa IA en tampón de RNasa (Tris 10 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) durante 45 min a TA y se lavaron a una severidad final de 0,1 X SSC a 65ºC. Las secciones se deshidrataron luego y se expusieron a película Kodak Biomax MR durante 10 días y/o se sumergieron en emulsión Kodak NTB2 diluida en relación 1:1 con agua destilada y se expusieron durante 3-4 semanas a 4ºC antes de revelado y contratinción con acetato de violeta de cresilo. Las estructuras neuroanatómicas se identificaron de acuerdo con el atlas de cerebro
de rata de Paxinos y Watson (Paxinos et al., The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, N.Y. (1986)).

B. Resultados

Se observaron los niveles máximos de expresión de mRNA de GAL-R2 de rata en los ganglios de raíz dorsal con células de diámetro grande, intermedio y pequeño marcadas específicamente. Se observó sólo una marcación difusa a lo largo de las astas dorsales y ventrales de la médula espinal. En el cerebro de la rata, las densidades máximas de marcación de mRNA de GAL-R2 se detectaban en el hipocampo dorsal, los cuerpos mamilares y el cerebelo (en particular, la capa de células de Purkinje). Se detectó una marcación más moderada en el núcleo pontino así como en un núcleo motor craneal específico. Se detectó una hibridación moderada a débil a lo largo de las cortezas cerebrales. Otras áreas cefálicas tales como el tálamo, el hipotálamo restante, y los ganglios basales estaban desprovistas por lo general de marcación. Esta distribución difiere considerablemente de la consignada para mRNA de GAL-R1 que se expresa particularmente bien en el hipocampo ventral, la amígdala, el núcleo supraóptico, varios núcleos hipotalámicos y talámicos, el núcleo parabraquial lateral y el locus ceruleus del cerebro de la rata.

El alto nivel de expresión de GAL-R2 observado en las neuronas sensoriales de los ganglios de raíz dorsal y los niveles más moderados observados en el asta dorsal de la médula espinal es consistente con el papel de la galanina en la transmisión del dolor. La presencia de niveles elevados de GAL-R2 en el hipocampo dorsal y los cuerpos mamilares es consistente con un papel en la función cognitiva.

Ejemplo 7 Clonación y Características Estructurales del Receptor-2 de Galanina Humana

Una genoteca de DNA genómico humano preparada a partir de placenta humana (Clonetech) en el vector EMBL-3 se escrutó con un fragmento aleatorio marcado (marcado con el kit de marcación T7-Quick-Prime, nº. de catálogo #27-9252-01, Pharmacia Biotech.) que contenía la región codificante completa de cDNA de GAL-R2 de rata. Las condiciones de pre-hibridación e hibridación fueron como sigue:

Pre-hibridación: 50% formamida, 5X solución de Denhardt, 5X SSC, 1% glicina, 100 g/ml de DNA de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado a 42ºC durante 5 horas.

Hibridación: 50% formamida, 1X solución de Denhardt, 5X SSC, 0,3% SDS, 100 g/ml de DNA de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado, una noche a 42ºC.

Lavado: Se realizó un paso de lavado a partir de la severidad baja de 2X SSC, 0,1% SDS a 42ºC a la severidad máxima de 0,2X SSC, 0,1% SDS a 60ºC (65ºC para transferencias Southern).

Se identificaron 8 clones positivos, que se procesaron para escrutinio secundario en condiciones de hibridación y lavado idénticas a las primeras. El escrutinio secundario dio como resultado la identificación de 4 clones; los otros 4 clones se consideraron positivos falsos. Los 4 clones positivos se procesaron respecto a escrutinio terciario y cuaternario a fin de obtener clones puros.

Se purificó el DNA a partir de los 4 clones puros indicados anteriormente y se procesó para análisis de restricción e hibridación por transferencia Southern con objeto de identificar fragmentos más pequeños que produjeran una señal positiva. Se identificaron 3 bandas con hibridación positiva (de tamaños estimados \sim5kb, \sim3,2 kb y \sim0,7 kb) por la escisión con las endonucleasas de restricción Sac I y Rsa I (Pharmacia Biotech.) por hibridación mediante transferencia Southern. Estas bandas se escindieron del gel y se subclonaron en el plásmido pBlueScript KS (-) digerido con Sac I o Eco RV. Los constructos plasmídicos se sometieron a secuenciación por el método de secuenciación didesoxi de Sanger (kit de Secuenciación T7, Pharmacia Biotech. Cat. #27-1682-01) y el Kit de Secuenciación ABI Prizm Cycle (Cat. #402079, Perkin-Elmer) y se construyó la secuencia compuesta.

La secuencia de nucleótidos para el gen de GAL-R2 humano se representa en la figura 2. Está presente un marco de lectura abierto de 1155 nucleótidos que codifica supuestamente una proteína de 385 aminoácidos con un peso molecular calculado de 41.478 kD. Existe un intrón supuesto de más de 1000 nucleótidos de longitud después de la base número 420. La secuencia intrónica se ha eliminado de la secuencia finalizada reproducida en la figura 2. Los límites exón/intrón se determinaron basándose en las secuencias de consenso alrededor de los sitios de corte y empalme 5' y 3' en pre-mRNAs de vertebrados (Lodish et al., Molecular Cell Biology, 3ª Ed., Scientific American Books, pp. 500; figura 4). A nivel de proteínas, el 84,4% de los aminoácidos son idénticos entre el GAL-R2 de rata y humano; la identidad entre GAL-R2 humano y el GAL-R1 de rata o humano es aproximadamente 34%.

Una vez descrita con detalle esta invención, se comprenderá por una persona con experiencia en la técnica que la invención puede realizarse dentro de una gama extensa y equivalente de condiciones, parámetros y análogos.

Depósito del material biológico

El plásmido HUMAN GAL-R2 ha sido depositado de acuerdo con el tratado de Budapest en "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" (DSMZ), Braunschweig, Alemania. El número de depósito es DSM 11632, y la fecha de depósito es 26 de junio de 1997.

(1) INFORMACION GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Astra Pharma Inc., Canadá

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Un Nuevo Receptor galanina

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Astra AB

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: S-151 85 Södertalje

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Södertalje

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO:

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(E)

PAÍS: Suecia

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(F)

CÓDIGO POSTAL: ninguno

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO:46-8 553 26000

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 46-8 553 28820

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1714 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

3

4

5

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 372 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

6

7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1219 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 385 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 345 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 349 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

200

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "iniciador PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

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(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCGTCGAC TTCATCGTCW MYCTIKCIYT IGCNGAC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "iniciador PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RHWRCARTAI ATIATIGGRT T

\hfill

21

Claims (17)

1. Una proteína, exenta esencialmente de componentes contaminantes celulares, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

2. Un polinucleótido, exento esencialmente de componentes contaminantes celulares, que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

3. El polinucleótido de la reivindicación 2, en donde dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

4. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

5. Una célula hospedadora transformada con el vector de la reivindicación 4.

6. Una proteína recombinante que comprende SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:4 que tiene adiciones, deleciones o sustituciones que retienen las propiedades cualitativas de fijación de SEQ ID NO:4.

7. Un anticuerpo específico para una proteína que comprende SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:4 que tiene adiciones, deleciones o sustituciones que retienen las propiedades cualitativas de fijación de SEQ ID NO:4, siendo producido dicho anticuerpo por un proceso que comprende el paso de inyectar una preparación farmacéuticamente aceptable que comprende la proteína de la reivindicación 1 en un animal capaz de producir dicho anticuerpo.

8. Un anticuerpo que se fija específicamente a una proteína de la reivindicación 1.

9. Un método para identificar un agente capaz de fijarse a la proteína de la reivindicación 1 que comprende:

(a) incubar una fuente que contiene la proteína de la reivindicación 1, pero sustancialmente exenta de otros receptores galanina, con:

i)

un ligando conocido que se fija a la proteína de la reivindicación 1; y

ii)

un agente de test; y

(b) determinar el grado en que dicha fijación de ligando es desplazada por dicho agente de test.

10. El método de la reivindicación 9, en donde dicha fuente es una célula transformada con un vector de la reivindicación 4.

11. El método de la reivindicación 9, en donde dicha fuente es una preparación de membrana derivada de una célula transformada con un vector de la reivindicación 4.

12. Un método para ensayar la capacidad de un agente para activar la proteína de la reivindicación 1, que comprende:

a) incubar una fuente que contiene la proteína de la reivindicación 1, pero sustancialmente exenta de otros receptores galanina, con un agente de test; y

b) determinar la activación de un camino de segundo mensajero.

13. Un método para identificar un compuesto capaz de modular la expresión de la proteína de la reivindicación 1, que comprende:

(a) cultivar células que expresan la proteína de la reivindicación 1, pero sustancialmente exentas de otros receptores galanina, en presencia de un compuesto de test; y

(b) comparar la expresión de la proteína de la reivindicación 1 en las células expuestas a dicho compuesto de test con células de control no expuestas a dicho compuesto de test.

14. El método de la reivindicación 13, en donde dichas células que expresan la proteína de la reivindicación 1 son células transformadas con un vector de acuerdo con la reivindicación 4.

15. El método de la reivindicación 13, en donde dicho compuesto de test es un oligonucleótido que tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos y que comprende una secuencia complementaria a una secuencia representada en SEQ ID NO:3.

\newpage

16. El método de la reivindicación 13, en donde la expresión de dicha proteína se determina por detección de la fijación de un ligando de la proteína de la reivindicación 1.

17. El método de la reivindicación 16, en donde el ligando es galanina.