ES2292652T3 - Ligando de exotoxinas. - Google Patents

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ES2292652T3 ES02004217T ES02004217T ES2292652T3 ES 2292652 T3 ES2292652 T3 ES 2292652T3 ES 02004217 T ES02004217 T ES 02004217T ES 02004217 T ES02004217 T ES 02004217T ES 2292652 T3 ES2292652 T3 ES 2292652T3
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Abstract

Un método para la producción de un adsorbente, caracterizado por la preparación de un ligando para toxinas bacterianas que comprende un oligosacárido y/o un oligopéptido y/o un oligonucleótido y que es capaz de interaccionar selectivamente con la estructura de lámina beta-bisagra-hélice alfa de los superantígenos, que comprende la secuencia aminoacídica YNKKKVTAQELD (SEC ID Nº: 4), y la unión covalente del ligando a una matriz.

Description

Ligando de exotoxinas.
La presente invención se refiere a un método para la producción de un adsorbente con un ligando para toxinas bacterianas, particularmente enterotoxinas o exotoxinas de bacterias grampositivas, que es capaz de interaccionar selectivamente con una estructura que comprende una secuencia aminoacídica que está conservada en las toxinas bacterianas.
Los superantígenos bacterianos pertenecen a las toxinas más potentes. A la familia de los superantígenos pertenecen, por ejemplo, las enterotoxinas o exotoxinas de bacterias grampositivas como SEA a SEE (donde SEB aparece más frecuentemente) de Staphylococcus, la toxina 1 del síndrome de choque tóxico (TSST-1) y SPEA y SPEC de Streptococcus. Las mismos estimulan, por la unión al receptor de células T (TCR) y/o al complejo principal de histocompatibilidad II (MCH II) de las células T auxiliares 1 (Th 1), la producción y secreción de linfocinas (por ejemplo, citoquinas o interleucinas), como por ejemplo IL-2, IFN-\gamma y/o TNF-\beta. Como superantígenos, estas moléculas actúan desacopladas del mecanismo normal de activación de la respuesta inmune por la presentación de antígenos procesados.
Para el tratamiento o la prevención de un choque tóxico desencadenado por tales antígenos, se han propuesto en el estado de la técnica, entre otras cosas, materiales para retirar de la sangre de un paciente estas sustancias de efecto pirógeno. De este modo, en el documento US-A-4.381.293 se han descritos adsorbentes para pirógenos que comprenden un soporte insoluble en agua y un compuesto heterocíclico que contiene nitrógeno. En el documento US-A-5.928.633 se describe un material que contiene un compuesto de urea o tiourea que presenta una afinidad respecto a la enterotoxina de Staphylococcus y la exotoxina de Streptococcus. Además, en el documento DE-A-197 05 366 se describe un dispositivo para la purificación de soluciones que contienen proteínas, como sangre, plasma sanguíneo o medios de cultivo, que comprende un material de soporte biocompatible de plástico que está recubierto de forma covalente mediante enlaces peptídicos con albúmina y, por tanto, debe unir una serie de toxinas, a modo de ejemplo, toxinas exógenas.
Sin embargo, los ligandos contenidos en los adsorbentes conocidos a partir del estado de la técnica se unen de forma relativamente inespecífica a los más diversos sitios de las estructuras de proteína que se tienen que unir y/o solamente presentan una afinidad respecto a representantes individuales de los superantígenos.
Por lo tanto, la presente invención tiene el objetivo de proporcionar un sistema nuevo para la unión de toxinas bacterianas que se basa en la interacción selectiva con las estructuras conservadas en las toxinas y, por lo tanto, se puede usar en composiciones farmacéuticas y adsorbentes, para tratar o evitar, por ejemplo, un choque séptico producido o esperado por tales toxinas bacterianas.
Este objetivo se resuelve por las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones de la presente invención. Particularmente, este objetivo se resuelve por el método definido en la reivindicación 1 para la producción de un adsorbente.
El ligando para toxinas bacterianas es capaz de interaccionar selectivamente con la estructura de lámina \beta-bisagra-hélice \alpha de los superantígenos.
La expresión "capaz de interaccionar selectivamente" significa que el ligando de acuerdo con la invención presenta una elevada afinidad respecto a la estructura conservada en las toxinas, y por lo tanto, interacciona preferiblemente con la misma. Preferiblemente, la constante de asociación del ligando para la toxina o la estructura, por ejemplo, in vitro en condiciones fisiológicas o aproximadamente fisiológicas, como a 37ºC, pH 7,4 y NaCl aproximadamente de 140 a 150 mM, comprende al menos 10^{6} M^{-1}, más preferiblemente al menos 10^{8} M^{-1}. La interacción del ligando puede comprender cualquier tipo de unión química o física, como por ejemplo, interacciones electrostáticas, interacciones Van der Waals, enlaces de puentes de hidrógeno y/o interacciones hidrófobas.
Por lo tanto, la preparación del ligando se basa en el conocimiento de que las toxinas bacterianas pertenecientes a los superantígenos presentan, respecto a sus secuencias totales, solamente una baja homología entre sí, sin embargo, en el interior de estas secuencias se presentan motivos de secuencias conservados o las estructuras espaciales conservadas están configuradas por estas secuencias aminoacídicas relacionadas y/o restos aminoacídicos separados entre sí en la secuencia lineal.
Particularmente, la estructura de lámina \beta-bisagra-hélice \alpha de los superantígenos, también denominada P12, está muy conservada (compárese Fig. 1) y comprende generalmente un dodecapéptido. La secuencia correspondiente de la SEB comprende los aminoácidos 150 a 161 y es TNKKKVTAQELD (SEC ID Nº: 1). El motivo estructural correspondiente en SEA (TNKKNVTVQRLD, aminoácidos 145 a 156, SEC ID Nº: 2) solamente está modificado en dos posiciones en comparación con la SEB. La zona de secuencia correspondiente de la TSST-1 (FDKKQLAISTLD, aminoácidos 135 a 146, SEC ID Nº: 3), de hecho, comprende en comparación con la SEB solamente cuatro restos idénticos, sin embargo, forma, como muestra la formación marcada en rojo en la Fig. 1, una estructura espacial muy parecida. Las numeraciones de aminoácidos anteriores se refieren a las secuencias publicadas por Papageorgiou et al. (Protein Sci. 5 (8), 1737-1741, 1996), Sundstrom et al. (J. Biol. Chem. 271, 32212-32216, 1996) o Papageorgiou et al. (J. Mol. Biol. 277, 61-79, 1998).
En Arad et al. (2000), Nature Medicine 6, 414-421 se hace referencia a una posible importancia de esta estructura conservada para la investigación y el modo de acción de las correspondientes toxinas bacterianas. Según ese documento, el dodecapéptido YNKKKVTAQELD (SEC ID Nº: 4), en el que, en comparación el motivo de secuencia inicial de la SEB, se ha sustituido la primera treonina por tirosina, ya que el primer aminoácido correspondiente en TSST-1 es una fenilalanina, inhibe como antagonista la activación de la respuesta inmune, es decir, la producción de linfocinas. Por el suministro intravenoso del péptido se ha conseguido evitar un choque séptico en un ensayo animal con ratones. También se demostró la inhibición de la producción de linfocinas respecto a la inducción inmune modulada por SEA, SEB, TSST-1 y SPEA. Sin embargo, Arad et al. no describen la posibilidad de proporcionar un ligando dirigido contra una estructura conservada en las toxinas bacterianas, por ejemplo, el dominio de lámina \beta-bisagra-
hélice \alpha.
Preferiblemente, por lo tanto, el ligando une exotoxinas o enterotoxinas de bacterias grampositivas, como SEA, SEB, SEC, SED, SEE, TSST-1, SPEA y SPEC.
De acuerdo con realizaciones preferidas, el ligando puede ser un ligando orgánico sintético, un sacárido, por ejemplo, un oligosacárido, un péptido, por ejemplo, un oligopéptido o un ácido nucleico, como un oligonucleótido de hélice única. Un ejemplo de un ligando peptídico es un anticuerpo que está dirigido contra la estructura conservada de los superantígenos. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, recombinante o puede ser una quimera, por ejemplo, de una parte variable de ratón y partes no variables de ser humano.
Desde el punto de vista de posibles problemas inmunológicos, particularmente cuando el ligando está contenido en un adsorbente, se prefiere que el ligando comprenda un oligopéptido, oligosacárido u oligonucleótido, donde se trata más preferiblemente de aquellos oligómeros con no más de 100 componentes.
A continuación se describen métodos para la producción del ligando.
Para la producción del ligando se pueden usar diferentes métodos, en los que durante la selección del método en concreto se tienen que tener en cuenta los siguientes puntos:
-
estabilidad térmica de los ligandos y estabilidad frente al entorno biológico (por ejemplo, sangre o plasma sanguíneo),
-
gran variabilidad de los ligandos para cubrir un gran grupo de moléculas diana durante la identificación del ligando,
-
economía del método y
-
afinidad suficiente de los ligandos respecto a la estructura diana, para usarse en la absorción de sangre o plasma sanguíneo.
De este modo, por ejemplo, se pueden identificar ligandos sintéticos usando la denominada síntesis de SPOT. La síntesis de SPOT (o síntesis de punto) ofrece la posibilidad de producir, por síntesis paralela automática, bibliotecas de péptidos sobre fases sólidas de forma rápida y flexible. El principio se basa en la distribución de gotas mínimas con soluciones de reactivos sobre zonas que se han definido anteriormente de forma exacta (ingles "spots", puntos) de una superficie adecuada (por ejemplo, membranas de celulosa, vidrio, etc.). La fijación en una superficie común ofrece la ventaja de que las bibliotecas que se están generando se presentan en un formato fácil de manejar. Las etapas intermedias de la síntesis, como el lavado, o la retirada de grupos protectores, se pueden realizar de forma común para todos los miembros de la biblioteca. Por lo demás, la biblioteca también se puede explorar de esta manera de forma común, lo que conlleva en total un ahorro evidente de tiempo y de material.
La técnica de SPOT se puede usar, por el empleo de un sistema a modo de caja, que se desarrolló por Jerini et al, supra, para la construcción de los más diversos sistemas de ligandos. La estructura líder que se tiene que unir, por ejemplo, una estructura que comprende la secuencia aminoacídica TNKKKVYAQELD (SEC ID Nº: 1), se puede optimizar o estabilizar dependiendo de los requerimientos. Además de la realización de mutaciones con los aminoácidos naturales, en cada sitio de la secuencia se puede introducir cualquier componente. Se dispone de un amplio repertorio de componentes orgánicos sintéticos, que se conocen por el especialista. Por ejemplo, se pueden usar componentes de 1,3,5-triclorotriazina, cuya introducción, por la posibilidad de sustitución múltiple controlada, proporciona múltiples posibilidades de modificación. Por la sustitución por etapas de todos los aminoácidos, de este modo también se puede construir un ligando orgánico completamente sintético. Esta circunstancia se ilustra por el siguiente esquema de reacción:
1
Tales ligandos sintéticos son estables en el entorno biológico como la sangre y el plasma sanguíneo.
Evidentemente, el péptido deseado se puede modificar químicamente o derivatizar per se por métodos conocidos en el estado de la técnica.
Un método adicional para proporcionar ligandos basados en péptidos se sirve de la denominada técnica de presentación de fagos. Por la manipulación del ADN de un fago se presenta una secuencia peptídica adicional sobre la superficie de este fago y, por lo tanto, es accesible para ensayos de unión con la molécula diana. Si se detecta en la biblioteca de fagos usada una secuencia que une la molécula diana, se puede precisar su estructura primaria de forma conocida por amplificación del correspondiente ADN de fago y su secuenciación. Una ventaja de la técnica de presentación de fagos consiste, por ejemplo, en que un ligando identificado en primer lugar se puede optimizar en esta técnica de forma sencilla respecto a su afinidad por la molécula diana. Para esto, la secuencia nucleotídica que codifica el ligando peptídico se modifica por sustitución, adición, deleción y/o inserción de uno o varios nucleótidos de tal modo (mutagénesis) que se proporciona de forma rápida y sencilla, partiendo del ligando peptídico identificado en primer lugar, un ligando mejorado respecto a la actividad frente a la estructura diana, que comprende una secuencia aminoacídica modificada de forma correspondiente a la manipulación del ADN codificante.
Un problema de la técnica de presentación de fagos original consiste en que, de forma similar a las bibliotecas peptídicas combinatorias, las bibliotecas, a partir de cierto número de aminoácidos, solamente se pueden construir de forma compleja (por ejemplo, una biblioteca de dodecámeros peptídicos basados en todos los 20 aminoácidos de origen natural requiere más de 10^{15} clones). Sin embargo, el uso de péptidos más cortos no alcanza, por norma, las afinidades de unión de péptidos más largos. Por lo tanto, de acuerdo con la invención se usa preferiblemente la "estrategia Cosmix" descrita a continuación (Cosmiplexing-Technik, Empresa Cosmix Molecular Biologicals GmBH): en un primer ciclo de selección se realiza una preselección de secuencias peptídicas que interaccionan con la estructura diana. En las secuencias obtenidas se realiza a continuación, por la técnica Cosmiplexing, una optimización de la afinidad respecto a la molécula diana. La optimización de unión se realiza de forma particularmente eficaz, ya que por la técnica de combinación específica usada se consigue una diversidad extremadamente elevada en la biblioteca de secuencias preseleccionada, que conduce a una combinación óptima de incrementos de estructura de unión. Esto conduce a afinidades, particularmente en secuencias peptídicas cortas, que por lo demás solamente se consiguen con oligómeros de moléculas superiores de bibliotecas base esencialmente mayores.
De acuerdo con otra realización, la diversidad de bibliotecas de presentación de fagos se puede limitar delimitando la secuencia inicial que puede mutar. Como base para la construcción de una biblioteca de presentación de fagos se proporcionan, por ejemplo, inhibidores de proteasa de la empresa Dyax (Cambridge, MA, EEUU). Parte de estas proteínas se presenta en la biblioteca sobre el fago, y en los dominios de unión se realizan mutaciones de aminoácidos individuales o de varios aminoácidos. El problema que se presenta usando péptidos de origen natural de la posible inestabilidad en fluidos biológicos como la sangre o el plasma sanguíneo se puede evitar usando ligandos basados en inhibidores de proteasa, que por lo general presentan una elevada bioestabilidad.
Para la exploración, la molécula diana se inmoviliza sobre microesferas o perlas y se pone en contacto de forma conocida con la biblioteca de fagos. Las microesferas con los fagos unidos a las mismas por los ligandos peptídicos se aíslan y los fagos se escinden enzimáticamente de los péptidos presentados por los mismos. Los fagos separados de este modo que contienen las moléculas de ADN que codifican los ligandos peptídicos que unen la molécula diana se amplifican en E. coli y, por tanto, quedan disponibles para etapas adicionales, a modo de ejemplo, la mutagénesis que se ha mencionado anteriormente para optimizar la afinidad del ligando respecto a la estructura diana, etc.
Por lo demás, debido a las interacciones proteína-ácido nucleico específicas que se presentan a menudo en la naturaleza (por ejemplo, proteína/ARN en ribosomas y proteína/ADN en nucleasas) también se pueden usar ácidos nucleicos para la producción del ligando de acuerdo con la invención. Al usar ácidos nucleicos, por una sustitución de bases es posible proporcionar un gran número de variantes de secuencias, y por lo tanto, de estructuras, de forma sencilla. Las secuencias de longitud predefinida se acoplan a una matriz y, como se ha descrito anteriormente respecto a la presentación de fagos, se ponen en contacto con la molécula diana. Los ácidos nucleicos de unión presentan una estructura que es capaz de interaccionar con la molécula diana. Desde el punto de vista de la optimización de la secuencia para proporcionar un ligando con mayor afinidad, los ácidos nucleicos presentan la ventaja de que se pueden amplificar de forma sencilla (por ejemplo, in vitro por PCR o in vivo mediante E. Coli), por lo que, como punto de partida para la optimización de la unión, puede ser suficiente la unión de una única molécula de ácido nucleico. En condiciones adecuadas se puede realizar un pase, como se ha descrito anteriormente, adicional de una primera mezcla de ácido nucleico (amplificada) enriquecida.
Como en los ligandos peptídicos que se han descrito anteriormente, también en los ácidos nucleicos se puede presentar el problema de la inestabilidad en un entorno biológico. Particularmente, el ARN es a menudo más inestable que el ADN. Como ligandos de ácidos nucleicos se pueden considerar especies de hélice única y de doble hélice (donde en una molécula de hélice única, evidentemente, se pueden presentar pares de bases intramoleculares). Para la estabilización respecto a las nucleasas que se presentan en líquidos biológicos como sangre o plasma sanguíneo son adecuados, por ejemplo, los métodos que se describen a continuación.
Un método preferido para preparar un ligando basado en ácidos nucleicos se basa en el principio de la denominada tecnología Spiegelmer (compárese documento WO-A-98/00885). A partir de la molécula diana (por ejemplo, el dodecapéptido con la SEC ID Nº: 4) se sintetiza una "imagen especular", es decir, su enantiómero, que se compone de componentes de L-aminoácidos. La molécula diana reflejada de tal modo se explora a continuación con una biblioteca, por ejemplo, de oligómeros de ARN en su forma D natural. Se determina la secuencia de miembros de unión de la biblioteca y después se sintetiza en forma de sus isómeros L que no son de origen natural. Estos isómeros L se unen, debido a la esteroquímica, a las moléculas diana no reflejadas. De este modo se proporcionan ligandos de ácidos nucleicos que son particularmente adecuados para usarse en líquidos biológicos, debido a que son esencialmente biológicamente inertes por la forma L que no se presenta en la naturaleza.
Los ligandos basados en ácidos nucleicos se pueden estabilizar adicionalmente, por ejemplo, por la introducción de nucleótidos modificados por fosfato. De este modo, por la introducción de nucleótidos correspondientemente modificados, por ejemplo, mediante PCR se consigue una estabilización en el entorno biológico. Por ejemplo, son posibles sustituciones de oxigeno en el grupo fosfato por azufre (compárese secuenciación de ADN-S^{35}, \alpha-tiofosfatos) o por un grupo metilo. Tales moléculas de ADNcs modificados están protegidas, por ejemplo, de la degradación por ADNasas.
Una posibilidad adicional de estabilización, particularmente de ligandos de ADN, consiste en la metilación por metilasas. De este modo se pueden producir, por ejemplo, ligandos de ADN en bacterias como E. Coli en presencia de diferentes metilasas, que se presentan preferiblemente codificadas por plásmidos. Particularmente en ligandos de ADNcs se protegen secciones de doble hélice producidas por pares de bases intramoleculares, por la metilación contra endonucleasas. Una protección eficaz contra exonucleasas, por lo demás, se puede conseguir por la unión de secuencias "cap" repetitivas.
Las posibilidades de utilización de los ligandos que se han definido anteriormente, comprenden, por ejemplo, su uso para la purificación de toxinas bacterianas o su retirada de líquidos, como por ejemplo, sangre o plasma sanguíneo, y para la inhibición de las toxinas bacterianas diana debido a la unión selectiva a una estructura conservada presente en las mismas.
La presente invención se refiere a un método para la producción de un adsorbente que comprende una matriz, preferiblemente una matriz orgánica, y al menos un ligando que se ha definido anteriormente que se une de forma covalente a la matriz.
El adsorbente es preferiblemente biocompatible. Un adsorbente "biocompatible" es preferiblemente compatible con sangre y plasma. De acuerdo con una realización preferida adicional es compatible con sangre completa.
En principio se pueden concebir varios materiales de soporte como matriz, como por ejemplo, vidrio, hidratos de carbono, Sepharose®, sílice, o matrices orgánicas, como copolímeros de acrilatos o metacrilatos y poliamidas. Preferiblemente, la matriz se compone de material orgánico, y particularmente preferiblemente, es de copolímeros derivados de ésteres y/o amidas de ácido (met)acrílico. Los mismos comprenden preferiblemente grupos epoxi. Por el término "(met)acrilo" se entienden los correspondientes compuestos acrilo y metacrilo.
Como matriz para el adsorbente se prefiere un copolímero estadístico producido por polimerización de las unidades monoméricas
(A)
(met)acrilamida en una cantidad del 10 al 30% en peso
(B)
N,N'-metilen-bis(met)acrilamdida en una cantidad del 30 al 80% en peso y
(C)
alilglicidiléter y/o glicidil(met)acrilato en una cantidad del 10 al 20% en peso, referido respectivamente al peso total de las unidades monoméricas.
El copolímero se produce preferiblemente por polimerización en suspensión.
Tal copolímero está disponible en el mercado con la denominación Eupergit C250L o Eupergit FE 162 de la empresa Röhm GmBH.
Al usar el copolímero que se ha mencionado anteriormente u otra matriz orgánica que contiene los grupos oxirano (grupos epoxi), por ejemplo, un copolímero también preferido en el marco de la presente invención, que se ha obtenido por la polimerización en suspensión de etilenglicoldimetacrilato y glicidilmetacrilato y/o alilglicidiléter, estos grupos oxirano se aminan antes de la introducción de los ligandos que se tienen que unir de forma covalente preferiblemente con amoniaco o con una amina primaria. Se prefiere el amoniaco por motivos de la técnica del método y por motivos económicos.
Usando el adsorbente para la retirada de toxinas bacterianas, como enterotoxinas o exotoxinas de bacterias grampositivas de sangre o plasma sanguíneo, la matriz se puede presentar, por ejemplo, en forma de partículas esféricas no agregadas, las denominadas microesferas o perlas, fibras o una membrana, proporcionándose una matriz porosa que presenta una superficie mayor. La formación o el ajuste de la porosidad se puede conseguir, por ejemplo, por la adición de formadores de poros, como ciclohexanol o 1-dodecanol, a la mezcla de reacción de la polimerización en suspensión para la matriz. Por lo demás, es ventajoso que la matriz tenga un límite exclusión de al menos 10^{7} Dalton, de forma que las toxinas bacterianas puedan penetrar con el plasma en los poros para alcanzar el ligando unido a la matriz.
Una configuración ventajosa adicional de la invención consiste en introducir el adsorbente por una selección adecuada de la matriz de soporte en sangre completa. Para esto, la matriz se compone de partículas no agregadas esféricas en un intervalo de tamaño de partícula de 50 a 250 \mum y tiene un límite de exclusión de al menos 10^{7} Dalton. De este modo se pueden poner en contacto las células sanguíneas con el material del adsorbedor sin que se ocluya la columna o se retenga o agregue un número inaceptable de células. Esto se posibilita por el tamaño y la configuración esférica de las perlas junto con el límite de exclusión del adsorbente de acuerdo con la invención, ya que las células se deslizan a lo largo de la superficie externa lisa de las perlas, por lo que solamente se produce una baja adhesión de trombocitos y el plasma con las toxinas bacterianas sigue teniendo la posibilidad de penetrar en los
poros.
De este modo se omiten etapas extracorpóreas como la separación de células sanguíneas, el tratamiento del plasma aislado, y la agregación posterior de los componentes sanguíneos, por lo que la biocompatibilidad del método aumenta, por ejemplo, continúa disminuyendo considerablemente el riesgo de una activación del complemento. La omisión de etapas extracorpóreas provoca adicionalmente un acortamiento del tiempo de tratamiento y una simplificación del método, por lo que se posibilita una retirada lo más rápida posible de las toxinas de la circulación sanguínea del paciente.
El adsorbente, por lo demás, se puede usar para la purificación de toxinas bacterianas, preferiblemente enterotoxinas o exotoxinas de bacterias grampositivas.
Un método para la purificación de toxinas bacterianas de un fluido comprende las etapas
a)
preparación del adsorbente como se ha definido anteriormente y
b)
puesta en contacto del fluido con el adsorbente.
Preferiblemente, el método de purificación se realiza de forma continua, proporcionándose el adsorbente, por ejemplo, en una columna de cromatografía, y el fluido con la toxina que se tiene que purificar se pasa por la columna de cromatografía que contiene el adsorbente de forma conocida. Sin embargo, también es posible usar el adsorbente de acuerdo con la invención en un método discontinuo.
Como se ha explicado anteriormente, un adsorbente que contiene el ligando para toxinas bacterianas se puede usar para disminuir la concentración de toxinas bacterianas, particularmente de las enterotoxinas y exotoxinas de bacterias grampositivas, en sangre o plasma sanguíneo. Para ello se usa el adsorbente en la producción de un absorbedor correspondiente.
Un adsorbente para disminuir la concentración de toxinas bacterianas en sangre o plasma sanguíneo comprende una cubierta que se configura preferiblemente con forma de tubo o de columna, y que contiene el adsorbente como material de relleno. Desde el punto de vista de las cantidades de sangre o de plasma sanguíneo que se tienen que pasar habitualmente y desde el punto de vista de la eficacia del adsorbedor, el mismo comprende preferiblemente un volumen de 30 a 1250 ml, más preferiblemente de 50 a 200 ml, particularmente cuando se trata de un adsorbedor que se puede regenerar. El adsorbedor se pude usar individualmente, en un funcionamiento doble o múltiple. Con dos o más adsorbedores existe la posibilidad de alimentar un adsorbedor con la sangre o el plasma sanguíneo, mientras que el otro adsorbedor se regenera. Esto conduce a un aumento adicional de la eficacia usando el adsorbedor, particularmente ya que puede ser decisivo durante el tratamiento y/o la prevención de una sepsis grampositiva con el adsorbedor, retirar las toxinas correspondientes lo más rápidamente posible de la sangre o del plasma sanguíneo del paciente. El adsorbedor se configura preferiblemente de tal modo que comprende una cubierta con una zona de entrada en el lado frontal, por el que se suministra la sangre o el plasma sanguíneo al adsorbedor, donde en este caso, la salida se sitúa en el fondo de la cubierta del adsorbedor.
Para evitar que se conduzcan sustancias no deseadas, por ejemplo, sustancias que se originan en el material del adsorbente, con la sangre o el plasma sanguíneo tratada/o de vuelta a la circulación sanguínea del paciente, preferiblemente, en la salida de la cubierta del adsorbedor se dispone un filtro. Se trata preferiblemente de un filtro de partículas.
Usando el adsorbedor también se proporciona un método para el tratamiento y/o la prevención de la sepsis grampositiva, en el que la sangre o el plasma sanguíneo de un paciente que se ha infectado con las respectivas bacterias, como Staphylococcus o Streptococcus, y en el que posiblemente se tenga que esperar un choque séptico debido a las toxinas originadas en las bacterias, se conduce en un circuito por el adsorbedor de acuerdo con la invención.
Como se ha explicado anteriormente, el ligando, por su unión selectiva a las toxinas bacterianas correspondientes, también se puede usar para la inhibición o disminución del efecto tóxico de estas moléculas.
Una posibilidad de utilización adicional del ligando consiste en su uso para la comprobación de las toxinas bacterianas correspondientes, lo que puede servir, por ejemplo, para detectar una sepsis que posiblemente se presentará debido a la infección con bacterias, como bacterias grampositivas, para poder aplicar a tiempo contramedidas terapéuticas adecuadas.
Las Figuras muestran:
La Fig. 1 es una representación gráfica que muestra la estructura peptídica de las estructuras espaciales de los superantígenos SEB (Fig. 1A), TSST-1 (Fig. 1B) y SEA (Fig. 1C). Las secuencias aminoacídicas (SEC ID Nº: 1 a 3) de los dominios conservados de lámina \beta-bisagra-hélice \alpha y sus posiciones se indican en la secuencia global.

Claims (12)

1. Un método para la producción de un adsorbente, caracterizado por la preparación de un ligando para toxinas bacterianas que comprende un oligosacárido y/o un oligopéptido y/o un oligonucleótido y que es capaz de interaccionar selectivamente con la estructura de lámina \beta-bisagra-hélice \alpha de los superantígenos, que comprende la secuencia aminoacídica YNKKKVTAQELD (SEC ID Nº: 4), y la unión covalente del ligando a una matriz.
2 El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la toxina es una enterotoxina o exotoxina de bacterias grampositivas.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la toxina se selecciona del grupo compuesto por SEA, SEB, SEC, SED, SEE, TSST-1, SPEA y SPEC.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la matriz es una matriz orgánica.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la matriz orgánica es un copolímero derivado de ésteres y/o amidas de ácido (met)acrílico.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el copolímero derivado de ésteres y/o amidas de ácido (met)acrílico comprende grupos epoxi.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en el que el copolímero es un copolímero estadístico producido por la polimerización de las unidades monoméricas
(A)
(met)acrilamida en una cantidad del 10 al 30% en peso,
(B)
N,N'-metilen-bis(met)acrilamida en una cantidad del 30 al 80% en peso y
(C)
alilglicidiléter y/o glicidil(met)acrilato en una cantidad del 10 al 20% en peso, referido respectivamente al peso total de las unidades monoméricas.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el que los grupos epoxi se han aminado antes de la introducción de las cadenas laterales con amoniaco o una amina primaria.
9. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 a 8, en el que la matriz orgánica se compone de partículas esféricas no agregadas.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que las partículas esféricas no agregadas presentan un tamaño de partícula de 50 \mum a 250 \mum.
11. El método de acuerdo con una del las reivindicaciones 4 a 10, en el que la matriz orgánica presenta un límite de exclusión de al menos 10^{7} Dalton.
12. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el adsorbente es biocompatible.
13. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el adsorbente es compatible con sangre completa.
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