ES2294004T3 - Mezcla nutritiva y procedimiento para la identificacion y recuento rapidos de organismos gram-negativos. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se relaciona con la microbiología, en concreto con una mezcla nutritiva y con un procedimiento para la identificación y el recuento temprano de microorganismos Gram negativos. En el medio de cultivo aparecen 5 colores diferentes, emisiones fluorescentes de 3 colores, halos de 3 colores y zonas de precipitación opaca alrededor de las colonias dependiendo del microorganismo de que se trate, todo lo cual permite la diferenciación con un alto grado de sensibilidad y especificidad. La mezcla comprende relaciones específicas de fracciones proteicas ricas en triptófano, libre o combinado, sales orgánicas y/o inorgánicas, sustancias que proporcionan color o fluorescencia, inhibidores de crecimiento de microorganismos Gram positivos, así como celulosa y hemicelulosa y otros componentes que proporcionan la estructura sólida al medio de cultivo.
Description
Mezcla nutritiva y procedimiento para la
identificación y recuento rápidos de organismos
Gram-negativos.
La presente invención se refiere a la
Microbiología y particularmente a una mezcla nutritiva y un método
para la identificación y el recuento diferenciado y rápido o
temprano de organismos Gram-negativos.
En el análisis de calidad microbiológica de
diferentes productos (agua, alimentos, etc.) se utilizan
ampliamente numerosas técnicas para la detección y recuento de
microorganismos indicadores, como por ejemplo E. coli y
organismos coliformes. Sin embargo, continúan las investigaciones
con el objetivo de lograr los procedimientos más simples y
efectivos.
Generalmente, se conocen muy pocas
características bioquímicas que pueden ser atribuidas solamente a
un género de bacterias Gram-negativas específico,
por ello se necesita el empleo de diferentes conjuntos de pruebas
apropiadas para lograr un diagnóstico certero.
Actualmente existe una amplia gama de técnicas
de cultivo para la detección y diferenciación de diversos grupos de
bacterias Gram-negativas, algunos de ellos son
cualitativos y otros cuantitativos.
El medio Agar Violeta Rojo Bilis incorpora sales
biliares y cristal violeta para la inhibición de bacterias
Gram-positivas (Soria Melquizo, F. Manual Difco.
Décima edición. 1984; Manual MERCK de Medios de Cultivo. 1990;
Manual de Medios de Cultivo OXOID. 1995). Este contiene, además, la
lactosa e indicador de pH-rojo neutro. Los
organismos coliformes crecen en el medio y fermentan la lactosa. El
rojo neutro proporciona el color rojo intenso a la colonia y a la
zona circundante del medio. Para una diferenciación segura de E.
coli y organismos coliformes se necesitan las pruebas
confirmatorias adicionales, como por ejemplo siembra en el Caldo
Verde Brillante con lactosa o estriado en el Agar Eosina Azul de
Metileno (Soria Melquizo, F. Manual Difco. Décima edición. 1984;
Manual MERCK de Medios de Cultivo. 1990; Manual de Medios de
Cultivo OXOID. 1995). Sin embargo, los resultados de las pruebas no
se conocen hasta después de 48 h de incubación de la muestra.
Por otra parte existe un grupo de medios de
cultivo para la detección de Salmonella que utilizan, como
mínimo, dos características bioquímicas de este género que se
manifiestan por presencia o ausencia de color en el medio de
cultivo o en la colonia. Entre ellos se puede mencionar Agar
Desoxicolato Citrato, Agar Entérico Hektoen, Agar S. S., Agar XLD,
Agar de Christensen y Agar Verde Brillante (Soria Melquizo, F.
Manual Difco. Décima edición. 1984; Manual MERCK de Medios de
Cultivo. 1990; Manual de Medios de Cultivo OXOID. 1995).
Estos medios contienen generalmente inhibidores
de las bacterias Gram-positivas y de algunas
Gram-negativas, por ejemplo, sales biliares, sodio
citrato y verde brillante. La detección de Salmonella se
basa en la habilidad de fermenta uno o más carbohidratos y de
producir el gas sulfhídrico en presencia de tiosulfato de sodio y
una sal de hierro. Estos medios de cultivo en la práctica no son
muy específicos ya que varias especies (Proteus vulgaris, P.
mirabilis, Citrobacter freundii) pueden desarrollar colonias
incoloras con el centro negro características de Salmonella.
Además, la producción de H_{2}S por las cepas de Salmonella
no ocurre siempre, pues varios factores, tales como el pH del medio
y la concentración de oxígeno alrededor de las colonias, pueden
influir en esta reacción bioquímica.
Alain Rambach, en 1993, patentó un medio para la
identificación de Salmonella (Patente U.S.A. Nº 5 194 374),
que incluye el empleo de un substrato cromogénico que desarrolla el
color azul como resultado de la hidrólisis realizada por la enzima
\beta-galactosidasa y la degradación del
propilenglicol. La prueba bioquímica principal que se utiliza en
este medio para la detección de Salmonella consiste en la
fermentación de propilenglicol, que se visualiza mediante un cambio
de color del indicador de pH rojo neutro.
El producto permite sólo identificar las
bacterias coliformes y Salmonella no typhi de
Proteus y otras bacterias Gram-negativas.
Además, en la práctica alrededor del 9% de las cepas de
Salmonella pueden poseer la enzima
\beta-galactosidasa y alrededor de 30% no
fermenta el propilenglicol (Kaluzewski y Tomczuk, Med. Dosw.
Mikrobiol., 1995, 47: 155-168).
Roth y colaboradores recibieron la aprobación de
la Patente U.S.A. Nº 5 393 662, mediante la cual dan a conocer un
medio y un método para la identificación y recuento de E.
coli y coliformes aplicando sustratos con diferentes grupos
cromoforos. Este medio no permite la identificación y contaje de
E. coli O157:H7, Salmonella y otras enterobacterias
no coliformes. Por otra parte, la Shigella sonnei provoca
falsos resultados positivos puesto que desarrolla colonias con las
mismas características cromáticas que E. coli.
En 1995 fue concedida una patente a Monget y
otros (Patente U.S.A. Nº 4 277 561), por un método para el análisis
bacteriológico, y un medio para la detección de Salmonella.
Este método se basa en la capacidad específica de Salmonella
en fermentar ácido glucurónico o una de sus sales y no producir la
enzima \beta-galactosidasa. El medio a su vez
incluye nutrientes, un compuesto fluorogénico o cromogénico para la
enzima \beta-galactosidasa, ácido glucurónico o
una de sus sales e indicador de pH. Este medio de cultivo contiene,
además, las sustancias inhibidoras de las especies diferentes de
Salmonella (verde brillante y desoxicolato de sodio), lo que
limita su habilidad de detectar otros organismos
Gram-negativos e imposibilita su utilización para el
recuento de microorganismos. El medio de cultivo incluye
glucuronato de sodio en forma de suplemento después de
esterilización. Según Denis y colaboradores, la especificidad de
este medio de cultivo es de 93,3%, mientras que la del otro medio
tradicional para la detección de Salmonella (Agar Enterico
Hektoen) es de 85,3% (Denis y otros, Revue francaise des
laboratoires, Diciembre 1994, Nº 271).
Rambach solicitó una patente para un medio de
cultivo y un método para la detección de las cepas
enterohemorrágicas de E. coli (Solicitud de Patente WO
97/39103). La invención se refería a un medio de cultivo selectivo
para la diferenciación E. coli, particularmente de los
serotipos O157 y/o O11. El medio contiene un substrato cromogénico
para la enzima \alpha-galactosidasa. Para aumentar
la capacidad diferencial del método se han añadido otros sustratos
cromogénicos, especialmente para
\beta-glucosidasa, que caracteriza a un gran
número de bacterias coliformes y para
\beta-glucuronidasa que es característica del
E. coli, excepto los serogrupos O157 y O11. Sin embargo,
este medio de cultivo no permite la diferenciación de otras
bacterias Gram-negativas y, por otra parte, se
indica que algunas cepas de E. coli y Citrobacter
pueden dar resultados falso-positivos (Wallace and
Jones, J. Appl. Bacteriol., 1996, 81: 663-668).
Roth y colaboradores, en marzo de 1998
recibieron la aprobación de la Patente U.S.A. Nº 5.726.031. En la
patente se describe un medio de ensayo y un método cuantitativo
para la identificación y diferenciación de materiales biológicos en
una muestra a ensayar. El método consiste en emplear un substrato
cromogénico, específico del primer material biológico y que produce
el primer color; otro substrato cromogénico que es específico del
segundo material biológico y produce el segundo color, y un tercer
material biológico es capaz de dividir uno de los substratos. El
primer y segundo materiales biológicos son capaces de degradar un
azúcar, y el tercer material biológico no corta este azúcar. Además,
en la composición del medio se incluye un indicador de pH, que
cambia el color del medio alrededor de las colonias, coloreadas por
los substratos cromogénicos, cuando el azúcar es degradado.
Los ingredientes fundamentales son el
6-cloro-3-indolil
galactósido,
5-bromo-4-cloro-3-indolil
glucurónido, sorbitol y fenol rojo. Otros componentes son las sales
biliares, lauril sulfato de sodio, desoxicolato de sodio, éter de
poliglicol y antibióticos derivados de la acriflavina.
El medio debería incluir en su formulación un
inductor de las reacciones enzimáticas: el
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido.
Se incluyen agares, pectinas, carrageninas,
alginatos, xantina, entre otros agentes gelificantes y peptonas.
Este prototipo puede ser considerado el más cercano a la presente
invención y presenta un grupo de inconvenientes:
- -
- El medio permite la identificación y enumeración de E. coli, E. coli O157:H7 y coliformes, pero es difícil realizar una identificación adecuada de Salmonella e incluso imposible para algunas cepas, ya que éstas pueden presentar color blanco, al igual que otras bacterias Gram-negativas, tales como Proteus. En el caso de coexistir varias especies, es difícil detectar la presencia de la zona amarilla alrededor de la colonia, que es característica de la Salmonella, ya que ésta se produce por la acidificación del medio.
- -
- No se pueden diferenciar Salmonella typhi de Salmonella no typhi.
- -
- Los coliformes no pueden ser diferenciados en el medio, y se precisa del empleo de otros medios diagnósticos adicionales para la ulterior identificación de patógenos de gran importancia, tales como Klebsiella.
- -
- El medio no permite la identificación y recuento de bacterias Gram-negativas no coliformes, tales como Pseudomonas.
- -
- El método empleado precisa de 24 a 48 horas para la identificación y recuento de los microorganismos reivindicados, lo que lo hace tan lento como los métodos de cultivo tradicionales.
- -
- La inclusión del sodio dodecilsulfato, acriflavina y/o antibióticos hace más compleja, de mayor costo y menor estabilidad la composición del medio. Esto ocurre principalmente por la presencia de antibióticos que deben ser añadidos como suplementos, pues son termosensibles y no pueden ser añadidos a la formulación deshidratada en polvo.
- -
- Los ingredientes favorecedores del crecimiento en este medio no son suficientes para permitir, por sí solos, el desarrollo rápido (antes de 24 horas) de las reacciones que permiten la identificación de los microorganismos. El medio incluso necesita un inductor para la \beta-galactosidasa, tal como IPTG.
- -
- El método prevé que las reacciones tengan lugar hasta 40ºC, más bien 44ºC, establecidos en los métodos tradicionales. Este hecho requiere establecer un nuevo parámetro en el equipo o técnicas que se utilizan de rutina.
- -
- Los análisis microbiológicos rutinarios no prevén la temperatura de incubación de 40ºC, por lo que requeriría de una extensa validación y aprobación como método oficial.
El objetivo de la presente invención consiste en
dar a conocer una mezcla nutritiva y un procedimiento para la
identificación y recuento rápido de organismos
Gram-negativos.
La novedad de la invención consiste en que por
primera vez se da a conocer una mezcla nutritiva para la
identificación y recuento rápido de organismos
Gram-negativos y un procedimiento que la utiliza,
basado en la aparición de al menos cinco colores diferentes, a la
luz visible y de tres emisiones de color fluorescentes en las
colonias; halos de 3 colores diferentes y una zona de precipitación
alrededor de dichas colonias, y/o la combinación de todos estos
elementos y cambios en el color del medio de cultivo.
Se aportan elementos novedosos proporcionando
cantidades suficientes de triptófano. Este aminoácido esencial
interviene en un número considerable de reacciones metabólicas, que
sirven de base a la identificación. Dichas cantidades son
suministradas, teniendo en cuenta la relación de estas con las
sales orgánicas e inorgánicas y las sustancias que proporcionan la
aparición de color y/o fluorescencia. El objetivo de esta mezcla es
que aparezcan de manera rápida reacciones claras.
Se evidenciaron elementos nuevos e inesperados,
cuando determinados organismos diana desarrollaron coloraciones no
descritas previamente o emiten fluorescencia de colores no
indicados anteriormente, o presentan zonas oscuras alrededor de la
colonia (halo) de colores no descritos, como el caso de, por
ejemplo, Enterobacter (fluorescencia amarillenta y centro de
colonia verde grisáceo), Citrobacter freundii (colonia
violeta oscuro con halo azul), Salmonella no typhi
(centro y fluorescencia amarilla después de 24 horas),
Salmonella typhi (zona de precipitado opaco alrededor de la
colonia).
Las relaciones entre los componentes de la
mezcla fueron establecidas de manera experimental, y constituyen
elementos que garantizan una nueva mezcla. Esta relación de
componentes no ha sido nunca descrita anteriormente.
A continuación se describen las ventajas que
ofrece la presente invención.
- -
- Toda la identificación y diferenciación de los organismos diana se realiza sólo con la mezcla preparada, y no se requieren pruebas adicionales o medio de cultivo.
- -
- Al no poseer inhibidores de bacterias Gram-negativas, la composición permite el crecimiento de éstas y la identificación de las especies más importantes desde el punto de vista clínico y/o sanitario, tales como E. coli, Salmonella, Pseudomonas, Klebsiella, y además, el recuento de E. coli y organismos coliformes.
- -
- La identificación de los diferentes organismos es muy segura gracias a la mezcla, pues se realiza combinando varias reacciones que tienen lugar simultáneamente. Estas reacciones están basadas en las especificidades del metabolismo de dichos organismos, y se producen gracias a proporciones adecuadas de componentes de la mezcla. Algunas de estas reacciones se han utilizado por primera vez y constituyen hallazgos, como en el caso de Enterobacter (E. aerogenes, E. agglomerans, E. cloacae), que aparecen con un color de la colonias de rosa a rojo y centro verde grisáceo; y Salmonella no typhi, que aparece como una colonia de color rojo o rojo con el centro amarillo. Ambos géneros emiten fluorescencia amarillenta (después de 24 horas de incubación). Estas características permiten identificar sin riesgo de equivocación los organismos.
- -
- La composición permite la identificación y recuento rápido de un amplio espectro de organismos Gram-negativos. Permite la identificación de E. coli y la diferenciación Salmonella typhi de no typhi, y organismos coliformes de mayor interés sanitario y otras bacterias Gram-negativas no coliformes tal como Pseudomonas. Todos estos organismos se pueden diferenciar en un solo procedimiento, en una sola placa y en un período máximo de 22 horas.
- -
- La identificación se realiza fundamentalmente por la combinación de la aparición de 5 colores diferentes de las colonias, de 3 fluorescencias de diferentes colores, la aparición de halos de 3 colores diferentes alrededor de las colonias y de una zona de precipitado opaco alrededor de las colonias. Los cambios de color del medio pueden jugar un papel secundario, o incluso no jugarlo para identificar determinados géneros, como en el caso de Shigella sonnei, E. coli O157:H7, Pseudomonas aeruginosa. Este hecho disminuye el riesgo de una falsa identificación de diferentes organismos en muestras contaminadas con diferentes gérmenes.
- -
- La composición es muy sencilla de preparar, no necesita de esterilización en autoclave, ni la adición de suplementos que aumentan el riesgo de contaminación de la muestra.
- -
- Al prescindir de la esterilización en autoclave, se conservan mejor los nutrientes y favorecedores del crecimiento y se mantiene más estable el pH de la composición.
- -
- Los nutrientes y favorecedores del crecimiento incorporados en la mezcla, sobre todo los ricos en triptófano, se encuentran en proporciones y cantidades absolutas tales en la composición, que garantizan la aparición de las reacciones cromáticas y bioquímicas rápidamente, en la mayoría de los casos antes de las 22 horas.
- -
- Los componentes sólidos, que conforman las capas de la composición, son de tal naturaleza que permiten que las emanaciones fluorescentes se concentren en la zona circundante de la colonia y no difundan al resto de la placa. La mezcla permite el recuento seguro de organismos fluorescentes, dado que la fluorescencia no se difunde a la superficie del medio.
- -
- La selección de los inhibidores del crecimiento de los organismos Gram-positivos, su contenido absoluto y la relación con los demás componentes, permiten el crecimiento adecuado de los organismos diana, a la vez que se logra la total inhibición (ausencia de crecimiento) de esos organismos Gram-positivos.
- -
- La amplia gama de sustancias, precursores o sustratos para las reacciones enzimáticas permiten que, al añadir una tercera capa con indicadores o reveladores de reacciones, a la composición en una porción de las placas, puedan ocurrir otras reacciones que permitan la ulterior identificación de otros organismos Gram-negativos.
- -
- La especificidad diagnóstica de la composición resultó del 100% para los organismos ensayados y la sensibilidad analítica alcanzó 10^{-6} CFU/mL a partir de una suspensión estandarizada al 50% de transmitancia.
- -
- El balance entre nutrientes e inhibidores permite la identificación rápida y el crecimiento exuberante de los organismos diana, incluso de aquellos que generalmente crecen después de 24 horas, tal como Salmonella.
- -
- Los resultados pueden ser fácilmente interpretados por personal no especializado, ya que la identificación o la diferenciación no se basa en las características morfológicas de los organismos.
La presente invención da a conocer una mezcla
nutritiva para la identificación y recuento rápido de organismos
Gram-negativos, la cual contiene los siguientes
componentes esenciales:
- -
- una mezcla de fracciones proteicas ricas en triptófano o triptófano libre, la cual se encuentra en cantidades entre 22 y 46% de la mezcla total (peso/peso);
- -
- una mezcla de sales orgánicas y/o inorgánicas seleccionadas que se encuentra en cantidades entre 15 y 20% de la mezcla total (peso/peso);
- -
- una mezcla de sustancias que proporcionan la aparición de color o fluorescencia, que se encuentra en cantidades entre 0,3 y 37% de la mezcla total (peso/peso);
- -
- sustancias inhibidoras de los organismos Gram positivos, que se encuentra en cantidades entre 2 y 4,5% de la mezcla total (peso/peso);
- -
- y una mezcla de sustancias para dar la estructura sólida al medio, en cantidades entre 20 y 50%.
La proporción de cada uno de los componentes de
la mezcla varía, dentro de los rangos predeterminados, con
dependencia del medio nutritivo que se desee preparar.
En la mezcla nutritiva de la invención, la
mezcla de fracciones ricas en proteínas contiene dicho aminoácido
triptófano en cantidades que oscilan entre 0,25 y 3,8% de dicha
mezcla.
Asimismo, la mezcla de la presente invención
contiene una mezcla de sales orgánicas y/o inorgánicas las cuales
son seleccionadas entre NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4},
(NH_{4})_{2}SO_{4}, Na_{2}CO_{3} y piruvato de
sodio y sus mezclas, seleccionándose realizaciones preferidas de la
invención NaCl y Na_{2}CO_{3}.
Dicha mezcla de sales orgánicas y/o inorgánicas
contiene las siguientes cantidades (peso/peso) con respecto a la
mezcla total:
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- NaCl entre 7 y 18%;
- -
- K_{2}HPO_{4} entre 6 y 11%;
- -
- KH_{2}PO_{4} entre 2 y 5%;
- -
- (NH_{4})_{2}SO_{4} entre 1 y 4%;
- -
- Na_{2}CO_{3} entre 0,1 y 0,4%; y
- -
- piruvato de sodio entre 0,7 y 3%.
La mezcla nutritiva de la invención también
comprende una mezcla de sustancias que proporcionan la aparición de
color o fluorescencia entre las que se encuentran
X-GAL, MUG, sorbitol y rojo neutro, seleccionándose
entre éstas preferiblemente X-GAL y MUG. Estas
sustancias se encuentran en la mezcla en las siguientes cantidades
(peso/peso) con respecto a la mezcla total:
- -
- X-GAL entre 0,16 y 0,36%;
- -
- MUG entre 0,16 y 0,18%;
- -
- sorbitol entre 15 y 36,5%; y
- -
- rojo neutro entre 0,09 y 0,11%.
Por otra parte, la mezcla también incluye
sustancias inhibidoras de los organismos
Gram-positivos, las cuales pueden ser el
desoxicolato de sodio o las sales biliares.
Finalmente la mezcla nutritiva de la invención
contiene una mezcla de sustancias que le dan la estructura sólida
al medio de cultivo cuando crecen los microorganismos a analizar,
la cual puede estar constituida por las siguientes combinaciones y
cantidades (peso/peso) con respecto a la mezcla total:
- -
- agarosa y agaropectina en cantidades entre 19 y 48% en combinación con nitrato de celulosa en cantidades entre 0,1 y 0,4%; ó
- -
- celulosa y hemicelulosa, de 1,4 a 3%, en combinación con nitrato de celulosa en cantidades de 0,1 a 0,4%; o
- -
- agarosa y agaropectina solamente, en cantidades entre 19 y 48%.
La mezcla nutritiva de la invención una vez
preparada presenta un pH entre 6,6 y 7,2.
Otro aspecto de la invención es que la misma
proporciona un procedimiento para la identificación y el recuento
rápido de dichos organismos Gram-negativos, en el
cual la mezcla nutritiva, una vez solidificada y en contacto con
los microorganismos o las muestras que los contienen, es incubada
por un período de 12 a 22 horas y a una temperatura de 30 a 45ºC, a
partir del cual es posible la identificación de los microorganismos
a simple vista, mientras que la detección de la fluorescencia es
llevada a cabo con luz ultravioleta de 360 a 366 nm.
El procedimiento de la invención permite la
identificación de los microorganismos por el aspecto de cinco
diferentes colores de las colonias, de emisiones fluorescentes de
tres colores, de halos de tres colores, de cambios de color en el
medio, y por la aparición de zonas de precipitación que rodean las
colonias, y también como combinaciones de estas
características.
La identificación de los organismos, empleando
el procedimiento de la invención es como sigue:
- Shigella sonnei - Se identifica por la aparición de colonias de color azul verdoso, fluorescencia azul y medio naranja;
- Shigella flexneri - Se identifica por la aparición de colonias de color rosa pálido, halo amarillento y medio naranja;
- Enterobacter (E. aerogenes, E. cloacae, E. agglomerans) - Se identifica por la aparición de colonias de color rosa a rojo con centro verde grisáceo, fluorescencia amarilla y medio de color rojo;
- Escherichia coli, excepto cepas verotoxigénicas - Se identifica por la aparición de colonias de color violeta claro, fluorescencia azul y medio de color rojo;
- Escherichia coli O157:H7 - Se identifica por la aparición de colonias de color azul verdoso y medio naranja;
- Citribacter freundii - Se identifica por la aparición de colonias de color violeta oscuro con halo azul y medio de color rojo;
- Klebsiella pneumoniae - Se identifica por la aparición de colonias de color violeta claro y medio de color rojo;
- Salmonella typhi - Se identifica por la aparición de colonias de color rojo y medio de color rojo con zona de precipitado opaco;
- Salmonella"no typhi" - Se identifica por la aparición de colonias de color rojo y medio de color rojo, con aparición, después de 24 horas de incubación, de color del centro y fluorescencia amarillos;
- Pseudomonas aeruginosa - Se identifica por la aparición de colonias de color rosa pálido, fluorescencia verdosa antes de 24 horas de incubación y medio naranja; colonias de color pardo verdoso y zona circundante verdosa, fluorescencia verdosa después de 24 horas de incubación;
- Proteus, Providencia, Alcaligenes y otros organismos Gram-negativos - Se identifican por la aparición de colonias incoloras o transparentes y medio naranja.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular de la presente
invención, cuando se utilizan X-gal y MUG como
únicos componentes de la mezcla que proporciona el color o
fluorescencia, la identificación de coliformes totales se realiza
por el color de las colonias azul verdoso, y específicamente para
E. coli, además por la fluorescencia azul.
Para la conformación de la mezcla nutritiva se
realizan las operaciones siguientes:
Las sustancias que aportan las fracciones
proteicas ricas en triptófano y/o triptófano libre en cantidad de
22 a 46%, se pesan en un frasco cónico, teniendo en cuenta que la
mezcla debe contener entre 0,25 y 3,8% de este aminoácido respecto
a su peso seco. Este frasco debe tener un volumen nominal dos veces
mayor al de la mezcla nutritiva a preparar.
Seguidamente se pesa el conjunto de sales
orgánicas e inorgánicas y se añade a la mezcla anterior, en
cantidad de 15 a 20% con respecto al peso seco de la mezcla
nutritiva.
Dichas sales orgánicas o inorgánicas son
seleccionadas en las siguientes cantidades relativas al peso de la
mezcla nutritiva deshidratada: NaCl de 7 a 18%, K_{2}HPO_{4} de
6 a 11%, KH_{2}PO_{4} de 2 a 5%,
(NH_{4})_{2}SO_{4} de 1 a 4%, Na_{2}CO_{3} de 0,1 a
0,4% y Piruvato de sodio de 0,7 a 3%.
Luego se pesan y se añaden los inhibidores de
los organismos Gram-positivos en cantidad de 2 a
4,5%, entre los que se emplean el desoxicolato de sodio y las sales
biliares.
Separadamente, en la balanza analítica, se pesa
la premezcla de las sustancias que proporcionan la aparición de
color o fluorescencia, en cantidad de 0,3 a 37%.
La premezcla de estas sustancias debería
contener sorbitol en cantidades de 15 a 36,5%, MUG de 0,16 a 0,18%,
X-GAL de 0,16 a 0,36% y rojo neutro de 0,09 a
0,11%, con respecto al peso seco de la mezcla nutritiva.
Todos los componentes antes mencionados se
mezclan con agua destilada o desionizada para lograr una solución
homogénea con la concentración de solutos de 3,5 a 6,5% y el pH de
6,6 a 7,2.
Finalmente la solución preparada se añade a la
mezcla de agarosa y agaropectina y/o se vierte sobre estructuras
formadas por las diferentes formas de las mezclas de celulosa y
hemicelulosa.
Si a la solución preparada se le adiciona la
primera mezcla de agarosa y agaropectina, la suspensión formada se
mezcla y se deja en remojo al menos 15 min. Luego se calienta hasta
ebullición, se enfría hasta aproximadamente 45ºC y se distribuye en
los recipientes finales del ensayo. La mezcla de los recipientes se
debe dejar en reposo a temperatura ambiente durante
20-30 minutos. Si ocurre acumulación de humedad,
antes de proceder a la inoculación se deben secar los recipientes
en condiciones asépticas.
En caso de utilizar la mezcla de celulosa y
hemicelulosa, primero se esteriliza esta (con vapor húmedo a 121ºC
durante 15 minutos o con óxido de etileno o mediante irradiación).
Posteriormente se coloca en los recipientes finales de ensayo y se
le añade la solución anteriormente preparada en una cantidad de 2 a
4 mL (por cada recipiente).
En ambos casos pueden ser colocadas otras capas
formadas por nitrato de celulosa y/u otros derivados de la
celulosa, tales como el acetato de celulosa, tanto durante como
después de la inoculación, para proporcionar una superficie sólida
para el desarrollo de colonias de organismos diana, o para revelar
una reacción específica.
Las muestras de ensayo pueden ser inoculadas por
diferentes métodos de estría o de dilución, e incubadas a una
temperatura de 33 a 45ºC, durante al menos 6 horas para la detección
de E. coli, preferiblemente entre 12 horas y 22 horas, y
entre 18 y 22 horas para la diferenciación de otros microorganismos
Gram-negativos.
La interpretación de los resultados se realiza
observando el color de la colonia aislada, el color del medio de
cultivo y la presencia de un precipitado opaco o colonias con zona
circundante coloreada (halo), la presencia y color de emisiones
fluorescentes y también es posible observar la morfología
colonial.
\newpage
Las colonias aisladas de diferentes bacterias
Gram-negativas se observan del siguiente modo (tabla
1):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las diferentes cepas de bacterias
Gram-negativas desarrollan las colonias de tamaño
hasta 5 mm, según el tiempo de incubación.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La composición de la mezcla nutritiva para la
diferenciación de diferentes cepas de bacterias
Gram-negativas resultó ser (tabla 2):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
48 g de esta mezcla se suspendieron en 1 L de
agua destilada o desionizada.
El ensayo se realizó comprobando el
comportamiento de diferentes cepas de enterobacterias respecto a
las pruebas bioquímicas predeterminadas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los resultados obtenidos (tabla 3) fueron los
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después de incubar 24 horas a 35\pm2ºC, se
colocó en las tapas de los recipientes utilizados, una capa delgada
de celulosa impregnada con el reactivo de Kovacs. En los
contenedores en los que se inocularon los microorganismos
productores de indol (E. coli, P. vulgaris y Aeromonas
hydrophila) el color de la capa de celulosa se tornó rosada en
un intervalo de 30 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó la mezcla nutritiva similar según el
compuesto descrito en el Ejemplo 1, pero el contenido de los
componentes del conjunto de fracciones proteicas ricas en
triptófano fue el siguiente (tabla 4):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La siembra de diferentes organismos de colección
ATCC se realizó mediante el método de siembra de la superficie para
obtener colonias aisladas.
La interpretación de los resultados se realizó a
las 6, 11, 19 y 24 horas de incubación y los mismos se muestran a
continuación (tablas 5, 6, 7 y 8, respectivamente):
Un hecho que llamó la atención fue que se
observó la formación del precipitado opaco alrededor de las
colonias de S. typhi, lo que brinda una característica
adicional para la diferenciación de esta especie de otras cepas de
Salmonella.
A continuación la misma formulación de mezcla
nutritiva (identificada en adelante como exp) se inoculó con las
diluciones 10^{-6} a partir de las suspensiones (estandarizadas a
50% de transmitancia) de organismos ensayados seleccionados.
Los microorganismos se ensayaron en paralelo en
el Caldo EC con MUG adicionándole el agar (13 g/L) y
X-GAL (0,1 g/L), siendo esta la mezcla de
referencia (C).
La observación de los resultados de crecimiento
se realizó a las 6, 12, 19, 24 y 40 horas de incubación (tablas 9,
10 y 11). Los resultados obtenidos se muestran a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente, a diferencia de otros
organismos coliformes, E. aerogenes y E. cloacae
presentan una coloración diferenciada en el centro y en los bordes
de las colonias.
El número de colonias no ha cambiado y el color
azul en los centros de las colonias se ve más intenso.
Desaparece el color rojo y predomina el color
azul en coliformes y las colonias rojas de Salmonella se
volvieron amarillas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el estudio de la influencia de
diferentes activadores del crecimiento de organismos coliformes, de
diferentes inhibidores y diferentes combinaciones de las fracciones
proteicas ricas en triptófano mediante las curvas de crecimiento de
dos cepas:
Escherichia coli ATCC 10536
Streptococcusfaecalis ATCC 29212
En paralelo se inoculó el Caldo EC con MUG
(Difco).
\vskip1.000000\baselineskip
Las composiciones experimentales (MN) tomadas
como factores experimentales diferentes se muestran en la tabla
12.
Los resultados obtenidos se muestran en las
figuras 1 y 2.
Como se observa en la figura 1, sólo en la
mezcla nutritiva MN3 la gama de crecimiento de E. coli es
menor que en las mezclas de referencia, mientras que la variante
MN2 promueve al máximo su crecimiento a las 3 horas de incubación.
A las 6 horas, prácticamente no hay diferencias en la promoción del
crecimiento entre las variantes, a excepción de la mezcla MN3.
En la figura 2 se observa que en todas las
composiciones propuestas en la presente invención Streptococcus
faecalis se encuentra mejor inhibido en comparación con el
medio de diagnóstico de referencia.
En este ensayo se utilizó la formulación
mostrada en la tabla 13:
En este estudio, para la inoculación se utilizó
el método de inundación de superficie ("spread plating").
Todos los recipientes se incubaron a 35ºC
durante 24 horas.
Se inocularon suspensiones diluidas 10^{-6} de
las cepas de los microorganismos coliformes, Escherichia
coli ATCC 25922 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048, y
la suspensión diluida 10^{-1} de Streptococcus faecalis
ATCC 29212.
El Caldo EC con MUG (Difco) con adición de agar
(13,0 g/L), se utilizó como medio de referencia y fue denominado
como "control" (C).
Los resultados obtenidos fueron los siguientes
(tabla 14):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
No existe diferencia significativa (p < 0,05)
entre la variante experimental y el Caldo EC con MUG (Difco) en
cuanto al contaje de Escherichia coli ATCC 25922 CFU, aunque
el tamaño de las colonias en la mezcla nutritiva experimental es
ligeramente mayor. La cantidad de colonias de Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 es mayor en la variante experimental, no
obstante no existe diferencia significativa entre ambas (p \cong
0,06).
De manera inesperada, E. aerogenes pudo
ser identificado por su coloración diferenciada en el centro y en
los bordes de la colonia y por su fluorescencia amarilla.
Por otra parte Streptococcus faecalis
ATCC 29212 fue inhibido completamente en todas las variantes
estudiadas (el microorganismo se incubó hasta 72 horas).
Seguidamente se inocularon 10 mL de la muestra
de agua potable de un depósito de almacenamiento en las mismas
variantes de mezcla nutritiva (tabla 15).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el recuento solamente de las colonias
con las características coliformes presuntivas. Las pruebas
bioquímicas realizadas (mostradas a continuación) confirmaron que
las colonias aisladas pertenecían al género
Enterobacter.
\newpage
| Prueba | Resultado |
| Utilización del citrato | + |
| Descarboxilación de la lisina | + |
| Descarboxilación de la ornitina | + |
| Descarboxilación de la arginina | - |
| Agar Hierro Kligler | A/A Gas + H_{2}S- |
| Ureasa | - |
| Movilidad | + |
| Producción de indol | - |
| Rojo de metilo | - |
| Voges-Proskauer | + |
Existe diferencia significativa (p < 0,05) en
el contaje de colonias, a favor de la variante experimental de la
mezcla nutritiva y frente al medio de referencia (Difco) con
adición de agar (13 g/L) y X-GAL (1,0 g/L).
Se preparó la misma mezcla nutritiva que en el
Ejemplo Nº 4, pero la cantidad total de las fracciones proteicas
ricas en triptófano se estableció en: 40,4; 37,7 y 34,8% en peso
seco (V1, V2 y V3, respectivamente).
Se prepararon tres variantes con la mezcla con
agarosa y agaropectina y las mismas sin la mezcla. En las primeras
tres variantes se inocularon las diluciones 10^{-6} de
Escherichia coli ATCC 25922 y Salmonella typhimurium
ATCC 14028, por el método de inundación de superficie.
Los resultados obtenidos se muestran en la tabla
16.
\vskip1.000000\baselineskip
El contaje de colonias de Escherichia
coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y
Salmonella typhimurium ATCC 14028 llevado a cabo en todas
las variantes fue similar (p>0,05).
Paralelamente las otras tres variantes sin la
mezcla de agarosa y agaropectina, se utilizaron para el análisis de
curva de crecimiento de los microorganismos
Gram-negativos (control positivo) y
Gram-positivos (control negativo). El medio de
referencia utilizado fue Caldo EC con MUG de la firma Difco.
Sorprendentemente se observó que con 6 horas de
incubación, el crecimiento (absorbancia) de las cepas Escherichia
coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y
Salmonella typhimurium ATCC 14028 en las tres variantes
experimentales fue significativamente mayor (p < 0,05) que en el
medio de referencia. Si bien la inhibición de la cepa de
Streptococcus faecalis ATCC 29212 (control negativo) fue
significativamente mayor en las mismas variantes correspondientes a
la presente invención (figuras 3-6).
Se preparó la mezcla nutritiva como la variante
V2 del ejemplo Nº 5, con concentraciones de cadena recta doble de
rojo neutro de MUG. La mezcla de agarosa y agaropectina se
sustituyó por la mezcla de celulosa y hemicelulosa para
proporcionar una estructura sólida para el desarrollo de las
colonias (exp) del organismo diana. Todos los ingredientes
mencionados conforma la primera capa de la mezcla nutritiva.
Se inoculó por el método de filtración de
membrana a 1 mL de suspensiones diluidas 10^{-6} de los
microorganismos representantes de varios géneros de
enterobacterias, de suspensiones 10^{-5} de la cepa Klebsiella
pneumoniae ATCC 13883 diluida y 10^{-1} de la cepa
Staphylococcus aureus ATCC 25923 diluida (control negativo).
Para filtrar se empleó un soporte de nitrato de celulosa el cual se
colocó como otra capa de la mezcla nutritiva.
En paralelo se inoculó el Agar Violeta Rojo
Bilis por el método de inundación de superficie (C).
Los resultados de la lectura a las 18 h de
incubación se muestran a continuación en la tabla 17:
Escherichia coli, Salmonella typhimurium
Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii.
El número de colonias de Shigella sonnei
y Enterobacter aerogenes en la mezcla nutritiva experimental
y el Agar Bílico de Rojo Violeta no eran significativamente
distintos (p < 0,05). Si bien los números de colonias de
Escherichia coli O157:H7 y Shigella flexneri eran
significativamente más elevados en la mezcla nutritiva. La
suspensión de baja dilución (10^{-1}) de Staphylococcus
aureus se mostró completamente inhibida (incubación hasta 48
h).
Se llevó a cabo un estudio comparativo de
recuperación de diferentes bacterias Gram-negativas
en el mismo compuesto de la mezcla nutritiva y en el caldo
m-Endo (Difco). Ambos medios fueron inoculados por
el método de filtrado de membrana obteniendo los siguientes
resultados (tabla 18):
La diferenciación de diferentes representantes
del grupo de coliformes es evidente en la mezcla nutritiva. Sin
embargo, en el Caldo m Endo las colonias de Enterobacter
aerogenes tienden a confundirse con algunas colonias de E.
coli con menor brillo metálico.
Inesperadamente se detectó la formación de un
halo azul (zona circundante a la colonia) alrededor de las colonias
de Citrobacter freundii en esta composición de la mezcla
nutritiva.
Los contajes de colonias de E. coli ATCC
25922, K. pneumoniae ATCC 13883, y S. typhimurim ATCC
14028 en la mezcla experimental fueron significativamente mayores
(p<0,05), mientras que el número de colonias de los
microorganismos restantes en ambas mezclas fue similar. Estos
resultados se pueden apreciar en la Fig. 7 que se muestra en los
anexos.
Se inocularon en paralelo la mezcla nutritiva
con la misma composición de la variante V2 del Ejemplo Nº 5 y el
Agar S.S.
El objetivo de este ensayo fue comparar la
especificidad de la mezcla nutritiva objeto de la presente
invención y el Agar S.S para la detección de Salmonella a
partir de una mezcla polimicrobiana.
El inóculo se preparó del siguiente modo:
A partir de una colonia de crecimiento reciente
en 10 mL de solución salina estéril se prepararon las suspensiones
primarias de Salmonella typhimurium ATCC 14028,
Citrobacter freundii ATCC 8090, Serratia marcescens
ATCC 8100, Enterobacter cloacae ATCC 23355, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27835.
A cada suspensión se le realizaron diluciones
decimales (hasta 10^{-4}). Luego a un tubo con 9 mL de solución
salina estéril se añadió 1 mL de la dilución 10^{-4} y se mezcló
con ayuda de un agitador Vortex.
El enriquecimiento se realizó en 10 mL de Caldo
Selenito inoculado con 1 mL de esta mezcla, y se incubó durante 24
horas a 43ºC.
Una muestra tomada con un bucle calibrado del
Caldo Selenito se inoculó en las placas de Petri con la mezcla
nutritiva según la invención y Agar S.S. Todas las placas se
incubaron a 43ºC.
Los resultados de crecimiento se analizaron tras
24 horas de incubación. En las placas con la mezcla nutritiva se
observaron tres tipos de colonias:
- 1.
- Colonias azules con el halo azul (Citrobacter freundii, presuntamente)
- 2.
- Colonias rojas con el centro amarillo (Salmonella, presuntamente)
- 3.
- Colonias incoloras con el centro rosado y fluorescencia verdosa (Pseudomonas aeruginosa, presuntamente).
\vskip1.000000\baselineskip
En el Agar S.S se observaron cuatro tipos de
colonias:
- 1.
- Colonias blancas grandes con el centro negro (Salmonella o Citrobacter)
- 2.
- Colonias incoloras con el centro negro (Salmonella o Citrobacter)
- 3.
- Colonias grandes rosadas (Coliformes)
- 4.
- Colonias pequeñas rosadas (Coliformes).
\vskip1.000000\baselineskip
Las pruebas bioquímicas arrojaron los resultados
siguientes (tabla 19):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la presunta identificación en
la mezcla nutritiva objeto de la invención se habían confirmado
utilizando la prueba serológica con antisuero polivalente para
Salmonella.
En el Agar S.S se confirmaron como
Salmonella solamente las colonias incoloras (son lisina
descarboxilasa +).
\newpage
La mezcla nutritiva se preparó según la
composición descrita en la tabla 20.
Se evaluó la funcionalidad de la mezcla
nutritiva en el diagnóstico de E. coli y coliformes en
muestras de orina (donde la infección por E. coli y
coliformes constituyen cerca del 90% de las sepsis urinarias).
Posteriormente se realizó la confirmación por pruebas bioquímicas
de los patógenos causantes de sepsis urinaria.
A continuación en la tabla 21 se resumen los
valores de las incidencias de los patógenos identificados.
Se determinó la sensibilidad diagnóstica y la
especificidad diagnóstica de la mezcla experimental.
Durante la evaluación no se encontraron falsos
negativos después de la identificación, por lo que la especificidad
diagnóstica resultó ser del 100%. Se observó fluorescencia en una
cepa de Klebsiella considerándose esta como un falso
positivo. Debido a esto, la sensibilidad diagnóstica resultó ser
del 98,04%.
figura 1: Resultados del crecimiento de E.
coli ATCC 10536. Se observa que sólo en la mezcla nutritiva
MN3, el crecimiento de E. coli fue menor que en las mezclas
de referencia, mientras que la variante MN2 a las 3 horas de
incubación promueve mejor su crecimiento. A las 6 horas,
prácticamente no hay diferencias en la promoción del crecimiento
entre las variantes, a excepción de la mezcla MN3.
figura 2: Crecimiento de Streptococcus
faecalis ATCC 29212. Se muestra que en todas las composiciones
propuestas el Streptococcus faecalis se encuentra inhibido
en comparación con el medio de diagnóstico de referencia.
figura 3: Crecimiento de Escherichia coli
ATCC 25922 en las composiciones V1, V2 y V3, y en el medio de
referencia.
figura 4: Crecimiento de Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 en las mezclas V1, V2 y V3 y en el medio
de referencia
figura 5: Crecimiento de Salmonella
typhimurium ATCC 14028 en las mezclas V1, V2 y V3 y en el medio
de referencia.
figura 6: Crecimiento de Streptococcus
faecalis ATCC 29212 en las mezclas V1, V2 y V3 y en el medio de
referencia
figura 7: Comportamiento de diferentes
microorganismos en la mezcla experimental (FCE) y en la composición
de referencia.
Claims (7)
1. Mezcla nutritiva para la identificación y
recuento rápido de organismos Gram-negativos que
contiene:
- -
- una mezcla de fracciones proteicas ricas en triptófano o triptófano libre, la cual se encuentra en cantidades entre el 22 y el 46% de la mezcla total (peso/peso), y en el que dicho triptófano aminoácido se encuentra en cantidades de 0,25 a 3,8% de dicha mezcla;
- -
- una mezcla de sales orgánicas y/o inorgánicas en cantidades entre el 15 y el 20% de la mezcla total (peso/peso) en la que dicha mezcla de sales orgánicas y/o inorgánicas son seleccionadas entre el grupo que consiste en NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4}, Na_{2}CO_{3} y piruvato sódico y sus mezclas, preferentemente seleccionadas entre NaCl y Na_{2}CO_{3}, interviniendo en dicha mezcla en las siguientes proporciones:
- NaCl de 7 a 18%;
- K_{2}HPO_{4} de 6 a 11%;
- KH_{2}PO_{4} de 2 a 5%;
- (NH_{4})_{2}SO_{4} de 1 a 4%;
- Na_{2}CO_{3} de 0,1 a 0,4%; y
- Piruvato sódico de 0,7 a 3%.
- -
- una mezcla de sustancias que proporcionan color o fluorescencia en cantidades comprendidas entre 0,3 y 37% de la mezcla total (peso/peso) de manera que dichas sustancias son seleccionadas entre el grupo que consiste en X-GAL, MUG, Sorbitol y Rojo Neutro, siendo seleccionadas preferentemente entre X-GAL y MUG, y encontrándose en dicha mezcla en las siguientes cantidades:
- X-GAL de 0,16 a 0,36%,
- MUG de 0,16 a 0,18%;
- Sorbitol de 15 a 36,5%; y
- Rojo Neutro de 0,09 a 0,11%;
- -
- sustancias inhibidoras de los organismos Gram-positivos en cantidades de 2 a 4,5% de la mezcla total (peso/peso); y
- -
- una mezcla de substancias que proporcionan estructura sólida al medio, en cantidades de 20 a 50%;
teniendo dicha mezcla nutritiva una
vez preparada un pH comprendido entre 6,6 y 7,
2.
2. Mezcla nutritiva, según la reivindicación 1,
en la que las sustancias inhibidoras de los organismos
Gram-positivos son desoxicolato sódico y sales
bílicas.
3. Mezcla nutritiva, según la reivindicación 1,
en la que la mezcla de substancias que proporcionan estructura
sólida al medio comprende las siguientes combinaciones y cantidades
con respecto a la mezcla total (peso/peso):
- -
- agarosa y agaropectina en cantidades de 19 a 48%, con nitrato de celulosa en cantidades de 0,1 a 0,4%; o bien
- -
- celulosa y hemicelulosa en cantidades de 1,4 a 3%, con nitrato de celulosa en cantidades de 0,1 a 0,4%; o bien
- -
- agarosa y agaropectina solamente, en cantidades desde 19 a 48%.
4. Procedimiento para la identificación y conteo
rápido de organismos Gram-negativos, en el que la
mezcla nutritiva de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
después de su solidificación y encontrándose en contacto con los
microorganismos o mezclas que contienen los mismos, es incubada
durante un período de tiempo de 12 a 22 horas, a una temperatura de
30 a 45ºC, a partir de la cual es posible la identificación de
dichos microorganismos por obser-
vación inmediata, mientras que la detección de fluorescencia es llevada a cabo con luz ultravioleta de 360 a 366 nm.
vación inmediata, mientras que la detección de fluorescencia es llevada a cabo con luz ultravioleta de 360 a 366 nm.
5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en
el que la identificación de los microorganismos es posible por la
aparición de cinco diferentes colores de colonias, de emisiones
fluorescentes de tres colores, de halos de tres colores, de cambios
de color del medio, y de la aparición de zonas de precipitación que
rodean las colonias, así como combinaciones de estas
características.
6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en
el que la identificación de los organismos a detectar es llevada a
cabo del modo siguiente:
- Shigella sonnei - Por el aspecto de las colonias azul verdoso con fluorescencia azul y medio naranja;
- Shigella flexneri - Por aparición de colonias de color rosa pálido, halo amarillento y el color del medio es naranja;
- Enterobacter (E. aerogenes, E. cloacae, E. agglomerans) - Por aparición de colonias de color rosa a rojo con centro verde grisáceo, fluorescencia amarilla y medio de color rojo;
- Escherichia coli, excepto cepas verotoxigénicas - Por aparición de colonias violeta pálido, fluorescencia azul y medio rojo;
- Escherichia coli O157:H7 - Por el aspecto de colonias de color azul verdoso y medio de color naranja;
- Citrobacter freundii - Por la aparición de colonias violeta oscuro con halo azul y medio rojo;
- Klebsiella pneumoniae - Por la aparición de colonias de color violeta claro y medio rojo;
- Salmonella typhi - Por la aparición de colonias de color rojo y medio rojo con una zona de precipitado opaco;
- Salmonella"no typhi" - Por la aparición de colonias de color rojo y medio rojo; después de 24 h de incubación el color del centro pasa a amarillo y muestra fluorescencia de color amarillo;
- Pseudomonas aeruginosa - Por la aparición de colonias rosa pálido, fluorescencia verdosa antes de 24 h de incubación y medio de color naranja; colonias de color marrón verdoso y zona verdosa circundante, fluorescencia de color verdoso después de las 24 h de incubación;
- Proteus, Providencia, Alcaligenes y otros organismos Gram-negativos - Por la aparición de colonias incoloras o transparentes y medio de color naranja.
7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en
el que cuando se utiliza X-gal y MUG como
componentes únicos de una mezcla que proporcionan el color o la
fluorescencia, la identificación total se realiza por el color azul
verdoso de las colonias, y específicamente para E. coli,
también por su fluorescencia azul.
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| RU2508400C1 (ru) * | 2012-07-17 | 2014-02-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | СУХАЯ ХРОМОГЕННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ И E.coli (ВАРИАНТЫ) |
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| US5464755A (en) * | 1994-04-29 | 1995-11-07 | Biolog, Inc. | Microbiological medium and method of assay |
| US6146840A (en) * | 1994-04-29 | 2000-11-14 | The Regents Of The University Of California | Simultaneous enumeration of E. coli and total coliforms |
| ES2079319B1 (es) * | 1994-05-16 | 1996-07-16 | Aguayo Jose Maria Garcia | Medio de cultivo bacteriologico y procedimiento para su preparacion. |
| US5510243A (en) * | 1994-06-21 | 1996-04-23 | Gelman Sciences, Inc. | Multiple chromogen enzyme targeting (MCET) for use in bacterial contamination monitoring |
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