ES2294014T3

ES2294014T3 - Promotores de la regeneracion de nervios que contienen un inhibidor de semaforina como ingrediente activo.

Info

Publication number: ES2294014T3
Application number: ES01954366T
Authority: ES
Inventors: Toru Kimura; Kaoru Kikuchi; Kazuo Kumagai; Norio Hosotani; Akiyoshi Kishino
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2001-07-27
Publication date: 2008-04-01
Anticipated expiration: 2021-07-27
Also published as: DE60130769D1; JP4975231B2; WO2002009756A1; DE60130769T2; JPWO2002009756A1; ATE374623T1; US20030166711A1; US7244761B2; EP1306093A4; AU2001276694A1; EP1306093B1; US7317038B2; EP1306093A1; US20070015820A1

Abstract

Utilización de un compuesto representado por la fórmula [8] o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita, en la que R4 representa un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alcoxicarbonilo y R5 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo aciloxi y R6 y R7 están representados por (1) o (2) a continuación: (1) R6 representa un grupo metilo y R7 representa un grupo mostrado por las fórmulas [2], [9] o [10], en la que R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alquiloxicarbonilo y R2 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo aciloxi y R3 representa un átomo de hidrógeno, un grupo metoximetilo o la fórmula [3], en las que R1 y R2 tienen los mismos significados que en la fórmula [2], en la que R1 y R2 tienen los mismos significados que en la fórmula [2], (2) R6 representa un grupo mostrado por la fórmula [5] u [11] y R7 representa un grupo acetilo; en las que R1 y R2 tienen los mismos significados que en la fórmula [2].

Description

Promotores de la regeneración de nervios que contienen un inhibidor de semaforina como ingrediente activo.

Campo técnico

La presente invención se refiere a promotores de la regeneración de nervios centrales o periféricos que contienen un inhibidor de semaforina como ingrediente activo, a preventivos y remedios para enfermedades neurodegenerativas o similares que contienen promotores de regeneración de nervios, a inhibidores de semaforina no peptídicos y no nucleotídicos, a los compuestos con actividad inhibidora de semaforina y a un procedimiento microbiológico para producir dichos compuestos o similares.

Antecedentes de la técnica

Las células nerviosas son tejidos específicos, que no presentan potencial mitótico en un adulto. Por consiguiente, una vez se lesionan, el daño perdurará durante un periodo de tiempo prolongado. Se dice que no existe potencial de regeneración especialmente en el sistema nervioso central (SNC) tal como en el cerebro y la médula espinal. La falta de potencial de regeneración en los nervios centrales puede considerarse una de las razones por las que no se han creado terapias para lesiones traumáticas tales como la lesión de la médula espinal ni para enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Por otra parte, los nervios periféricos poseen potencial de regeneración. Sus axones pueden regenerarse y sus funciones pueden recuperarse incluso después de agravarse. En este caso, sin embargo, la recuperación requiere un espacio de tiempo prolongado comprendido entre varios meses e incluso más de un año, y por lo tanto los pacientes han de padecer dolores considerables. Además, el periodo de recuperación es tan largo que algunas células nerviosas pueden morir durante este periodo, lo que con frecuencia conduce al fallo de la recuperación de las funciones. Y sin embargo, incluso los nervios periféricos que presentan regeneración potencial son completamente incapaces de crecer más en el SNC tal como en el cerebro y en la médula espinal. Esto conduce a la base para la hipótesis de que existen algunas sustancias en el sistema nervioso central que inhiben el crecimiento de los nervios. Si se suprimen las sustancias inhibidoras para la regeneración de los nervios en el sistema nervioso central utilizando anticuerpos o similares, se observará la regeneración de los nervios en el sistema nervioso central así como la recuperación de sus funciones, si bien parcialmente. Como una de dichas sustancias inhibidoras para la regeneración de los nervios centrales, se ha descubierto recientemente Nogo (Nature 403, 434, 2000, Nature 403, 439, 2000). Sin embargo, solamente una pequeña parte de los axones se regeneran al inhibir Nogo y de este modo se supone que existen algunas otras sustancias inhibidoras de la regeneración. Las siguientes son sustancias ejemplificadas como experimentales que inhiben la regeneración de los nervios: MAG (glucoproteína asociada a la mielina); tenascina; gangliósidos; efrina; netrina; slit; semaforinas y similares. La única razón para que estas sustancias estén ejemplificadas como sustancias experimentales es que inhiben el crecimiento de las neuritas in vitro. Hasta ahora no se ha aclarado si realmente actúan para inhibir la regeneración in vivo de los nervios.

Haciendo referencia a la semaforina, su gen se aisló en primer lugar como un factor implicado en la formación del sistema nervioso en langostas en desarrollo. Desde entonces, se ha publicado que las semaforinas constituyen una gran familia de genes que se distribuyen en nemátodos, peces, mamíferos o incluso en determinados tipos de virus, y actualmente los genes de semaforina se clasifican en ocho subfamilias o clases de genes basándose en sus estructuras (Cell 97, 551, 1999). La semaforina es una proteína endógena identificada como un factor que colapsa el cono del crecimiento nervioso y suprime el crecimiento del axón, y hasta ahora, se han descrito aproximadamente 20 especies moleculares (Cell 97, 551, 1999). Sin embargo, la mayoría de las funciones de muchas familias de semaforina no se han descubierto con detalle. El grupo génico más estudiado es el de una subfamilia denominada tipo clase III, de la que todos los productos de la traducción son proteínas secretoras. Aunque es sabido que las proteínas codificadas por estos genes poseen crecimiento intensivo de las neuritas que suprime la actividad y el cono de crecimiento colapsa la actividad in vitro, se publicó que provocan crecimiento de neuritas en determinadas condiciones. Entre éstas, la semaforina 3A (Sema3A) es la más estudiada y es conocida por provocar el desplome del cono de crecimiento de las células nerviosas cultivadas a una concentración tan baja como 10 pM en un corto periodo de tiempo (Cell 75, 217, 1993, Cell 75, 1389, 1993). Con el fin de analizar las funciones in vivo de las semaforinas, se han estudiado (Neuron 19, 995, 1997) ratones modificados genéticamente por neuropilina-1, que es uno de los componentes del receptor Sema3A. Dichos ratones modificados genéticamente presentan letalidad embriónica así como anomalía motriz en algunos sistemas nerviosos tales como el nervio trigémino y anomalía de angiogénesis. Aunque se aprecia similar anomalía motriz en sistemas nerviosos en ratones modificados genéticamente por Sema3A, algunos ratones aislados es sabido que crecen hasta adultos sin graves problemas. Por consiguiente, las funciones in vivo de Sema3A permanecen en gran medida desconocidas.

Además, con respecto a las semaforinas son también conocidas las siguientes: nucleótidos complementarios y antagonistas tales como anticuerpos o similares para semaforina W, semaforina Y y semaforina Z se preparan para promotores de regeneración de nervios centrales (documentos WO 98/5628, WO 98/11216 y WO 98/20928); y es conocido un procedimiento de provocación del crecimiento de neuritas poniendo en contacto una célula nerviosa con un anticuerpo que se une específicamente a colapsina humana (patente US nº 5.416.197). Sin embargo, se desconocen todavía las acciones in vivo de estos anticuerpos o similares. Además, cualquiera de los compuestos de bajo peso molecular aparte de péptidos o nucleótidos tales como un anticuerpo o un nucleótido complementario o similares, que inhiben específicamente a semaforina han sido completamente desconocidos.

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar inhibidores de semaforina, promotores de regeneración de nervios periféricos o centrales que contienen dichos inhibidores de semaforina como ingrediente activo, preventivos y remedios para las enfermedades neuropáticas y las enfermedades neurodegenerativas que contienen los promotores de regeneración de nervios.

Exposición de la invención

Se cree que las semaforinas presentan varias acciones, y algunos investigadores propusieron que las semaforinas estaban implicadas no solamente en el desarrollo de nervios sino también en la regeneración de nervios, aunque existían pocas pruebas. Además, un animal que carece del gen no sirve siempre como herramienta para evaluar la función del gen porque la pérdida de la función génica provoca con frecuencia una acción compensadora por otros genes, como se observa en el animal modificado genéticamente con MAG. Aunque se ha descubierto hace años como resultado de numerosos estudios que MAG es una de las sustancias inhibidoras para la regeneración de nervios, los ratones modificados genéticamente por MAG no presentaban estimulación de la regeneración de nervios. Los presentes inventores, por consiguiente, comenzaron el estudio sobre semaforina para examinar si la inhibición de semaforina ocasiona la regeneración de nervios in vivo sin utilizar animales modificados genéticamente con semaforina.

En primer lugar, se identificó una sustancia que inhibe completamente la actividad de semaforina in vivo, y de este modo se administró el inhibidor de semaforina a un modelo animal de regeneración de nervios para aclarar la actividad que provoca la regeneración de nervios de dicho inhibidor de semaforina. Como resultado de este estudio los presentes inventores han descubierto que una sustancia, que no solamente inhibe la actividad del desplome del cono de crecimiento de semaforina completamente sino que también inhibe persistentemente la actividad de semaforina en un gel de colágeno y provoca el crecimiento de neuritas en presencia de semaforina, y presenta la actividad que estimula la regeneración de nervios in vivo. Los presentes inventores han descubierto además que la regeneración de nervios fue activada no solamente en el sistema nervioso periférico sino en el SNC utilizando el inhibidor de semaforina. El estudio no sólo aclaró la acción in vivo de la semaforina sino que también hizo posible proporcionar un promotor de regeneración de nervios que contiene un inhibidor de semaforina, que ha permanecido completamente desconocido, como ingrediente activo, y un producto farmacéutico que contiene el promotor de regeneración de nervios. El estudio ha aclarado también que un compuesto con una estructura específica en la molécula descubierta en el cultivo de Penicillium sp. SPF-3059, que fue identificado por los presentes inventores, presenta actividad inhibidora de semaforina. La presente invención se llevó a cabo basándose en estos descubrimientos.

La presente invención se refiere a la utilización de un compuesto representado por la fórmula [8] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita,

1

en la que R^{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alcoxicarbonilo y R^{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo aciloxi y R^{6} y R^{7} están representadas por (1) o (2) a continuación:

(1) R^{6} representa un grupo metilo y R^{7} representa un grupo mostrado por las fórmulas [2], [9] o [10],

2

en la que R^{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alquiloxicarbonilo y R^{2} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo aciloxi y R^{3} representa un átomo de hidrógeno, un grupo metoximetilo o la fórmula [3],

3

4

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en las que R^{1} y R^{2} tienen los mismos significados que en la fórmula [2],

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5

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en la que R^{1} y R^{2} tienen los mismos significados que en la fórmula [2],

(2) R^{6} representa un grupo mostrado por la fórmula [5] u [11] y R^{7} representa un grupo acetilo;

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7

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en las que R^{1} y R^{2} tienen los mismos significados que la fórmula [2].

Se conocen compuestos similares a los descritos anteriormente. Por ejemplo, el documento EP-A-0537622 se refiere al compuesto xantofulvina, que se dice que presenta propiedades antimicóticas.

El documento WO-A-92/16517 y Wrigley et al., Pure & Applied Chemistry, 66(10/11), 2383-2386 (1994) se refieren ambos a derivados de xantona que son agentes de unión de CD4 e inhibidores de las enzimas proteína cinasa C (PKC) y colagenasa. Se dice que los compuestos son útiles en el tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria, la enfermedad injerto contra el hospedador, rechazo de órganos, artritis reumatoide, lupus eritematoso generalizado, diabetes mellitus, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, enfermedades alérgicas, enfermedades inflamatorias y VIH.

Aoki et al., Tetrahedron Letters, 32(36), 4737-4740 (1991) se refiere al inhibidor de fosfolipasa C, Vinaxantona que es producido por Penicillium vinaceum.

Sin embargo, ninguno de los documentos anteriores sugieren que los compuestos que describen podrían ser útiles como inhibidores de semaforina o podrían utilizarse para estimular la regeneración nerviosa.

Por otra parte, Yoshio Goshima et al., Jpn. J. Pharmacol., 82, 273-279 (2000) da a conocer que las semaforinas tales como sema 3A son reconocidas como moléculas repulsivas potentes que inhiben o repelen el crecimiento de neuritas y esta inhibición de la actividad repulsiva puede aumentar la regeneración de las neuronas del SNC, pero no menciona ningún compuesto que podría utilizarse con esta finalidad.

La invención se refiere también a la utilización de un compuesto representado por la fórmula [12] o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita (reivindicación 2).

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8

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en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} tiene los mismos significados que en las fórmulas [2] y [8].

Para los objetivos de esta utilización, se prefiere que en la fórmula [12]:

por lo menos uno entre R^{2} y R^{5} represente un grupo hidroxilo (reivindicación 3);

R^{2} representa un grupo hidroxilo (reivindicación 4);

tanto R^{2} como R^{5} representan grupos hidroxilo (reivindicación 5);

R^{4} representa un grupo carboxilo (reivindicación 6);

R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{2} un grupo hidroxilo (reivindicación 7).

Además, la invención se refiere a un compuesto representado por la fórmula [12]

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9

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en la que por lo menos uno de entre R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} está representado por un átomo de hidrógeno, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable (reivindicación 8).

Además, se prefiere que en la fórmula [12]:

por lo menos uno entre R^{2} y R^{5} represente un grupo hidroxilo (reivindicación 9);

R^{2} representa un grupo hidroxilo (reivindicación 10);

tanto R^{2} como R^{5} representan grupos hidroxilo (reivindicación 11);

R^{4} representa un grupo carboxilo (reivindicación 12);

R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{2} un grupo hidroxilo (reivindicación 13).

La invención se refiere además a la utilización de un compuesto representado por la fórmula [13] o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

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10

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en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y [8], para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita (reivindicación 14).

Para los objetivos de esta utilización, en el compuesto de fórmula [13], se prefiere que:

por lo menos uno entre R^{2} y R^{5} represente un grupo hidroxilo (reivindicación 15);

R^{2} representa un grupo hidroxilo (reivindicación 16);

tanto R^{2} como R^{5} representan grupos hidroxilo (reivindicación 17);

R^{4} representa un grupo carboxilo (reivindicación 18);

R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo, R^{1} representa un grupo carboxilo y R^{4} un grupo átomo de hidrógeno (reivindicación 19);

R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{5} representa un grupo hidroxilo (reivindicación 20).

La invención se refiere además a un compuesto representado por la fórmula [13]

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en la que por lo menos uno de entre R^{1}, R^{2} y R^{5} representa un átomo de hidrógeno o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable (reivindicación 21).

En el compuesto de fórmula [13] se prefiere que:

por lo menos uno entre R^{2} y R^{5} represente un grupo hidroxilo (reivindicación 22);

R^{2} representa un grupo hidroxilo (reivindicación 23);

tanto R^{2} como R^{5} representan grupos hidroxilo (reivindicación 24);

R^{4} representa un grupo carboxilo (reivindicación 25);

R^{2} representa un grupo hidroxilo y R^{4} representa un grupo carboxilo (reivindicación 26);

R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{5} un grupo hidroxilo (reivindicación 27).

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La invención proporciona asimismo un compuesto representado por la fórmula [14] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

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en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} tiene los mismos significados que en las fórmulas [2] y [8] (reivindicación 28).

En el compuesto de fórmula [14] se prefiere que:

por lo menos uno entre R^{2} y R^{5} represente un grupo hidroxilo (reivindicación 29);

R^{2} representa un grupo hidroxilo (reivindicación 30);

R^{2} y R^{5} representan grupos hidroxilo (reivindicación 31);

R^{2} representa un grupo carboxilo (reivindicación 32);

R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo (reivindicación 33);

R^{1} representa un grupo carboxilo y R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo y R^{3} representa un grupo metoximetilo (reivindicación 34);

R^{1} representa un grupo carboxilo o un grupo metoximetilo,

R^{4} representa un grupo carboxilo, R^{3} representa un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un grupo hidroxilo (reivindicación 35);

R^{1} representa un grupo carboxilo o un grupo metoximetilo,

R^{4} representa un grupo carboxilo, R^{2} y R^{3} representan un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un grupo hidroxilo (reivindicación 36);

R^{3} está representado por la fórmula [3] (reivindicación 37);

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La invención se refiere además a un compuesto de fórmula [14] tal como el descrito anteriormente o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita (reivindicación 38).

En un aspecto adicional, la invención proporciona un compuesto representado por la fórmula [15] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

14

en la que R^{4} y R^{5} tiene los mismos significados que en la fórmula [8] (reivindicación 39).

En el compuesto de fórmula [15]:

R^{5} representa un grupo hidroxilo (reivindicación 40);

R^{4} representa un grupo carboxilo (reivindicación 41).

La invención se refiere además a la utilización de un compuesto de fórmula [15] tal como el definido anteriormente o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita (reivindicación 42).

La invención se refiere en otro aspecto a un compuesto representado por la fórmula [16] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

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en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} tiene los mismos significados que en la fórmulas [2] y [8] (reivindicación 43).

En el compuesto de fórmula [16] se prefiere que:

por lo menos uno de entre R^{4} y R^{5} represente un átomo de hidrógeno (reivindicación 44);

R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo (reivindicación 45);

R^{4} representa un grupo carboxilo (reivindicación 46).

En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de un compuesto de fórmula [16] o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita (reivindicación 47).

La invención se refiere también a la utilización mencionada anteriormente en la que el medicamento está destinado a tratar o prevenir enfermedades neuropáticas y/o enfermedades neurodegenerativas (reivindicación 48).

Las enfermedades neuropáticas y/o las enfermedades neurodegenerativas pueden estar acompañadas de una lesión de los nervios raquídeos y/o una lesión de los nervios periféricos (reivindicación 49).

Las enfermedades neuropáticas y/o las enfermedades neurodegenerativas pueden ser, por ejemplo, anomalía olfativa, neuropatía traumática, neuropatía de infarto cerebral, parálisis de los nervios faciales, neuropatía diabética, glaucoma, retinitis pigmentaria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedades neurodegenerativas, esclerosis lateral hipoplástica muscular, enfermedad de Lou Gehrig, corea de Huntington, infarto cerebral o enfermedades neurodegenerativas traumáticas (reivindicación 50).

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para producir el compuesto de fórmula [12], [13], [14], [15] o [16], en el que el procedimiento comprende cultivar un hongo productor de un compuesto de fórmula [12], [13], [14], [15] o [16] que pertenece al género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo (reivindicaciones 51 a 57).

El hongo que pertenece al género Penicillium es preferentemente Penicillium sp. SPF-3059 (reivindicación 58).

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 presenta la acción inhibidora dependiente de la concentración de los inhibidores de semaforina de la presente invención, SPF-3059-1, M162 y A721, sobre la actividad de desplome del cono de crecimiento de Sema3A.

La Fig. 2 presenta la acción inhibidora dependiente de la concentración de los inhibidores de semaforina de la presente invención, SPF-3059-1, SPF-3059-2 y SPF-3059-5, sobre la actividad de desplome del cono de crecimiento de Sema3A.

La Fig. 3 presenta la acción inhibidora dependiente de la concentración de los inhibidores de semaforina SPF-3059-1 de la presente invención sobre la actividad de desplome del cono de crecimiento de Sema6C.

La Fig. 4 son fotografías que presentan la acción inhibidora de los inhibidores de semaforina de la presente invención, SPF-3059-1, M162 y A721, sobre la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de Sema3A en el procedimiento de cultivo conjunto de colágeno-gel.

La Fig. 5 presenta la acción promotora de la regeneración de nervios in vivo del inhibidor SPF-3059-1 de semaforina de la presente invención en la incisión del nervio olfativo.

La Fig. 6 presenta la acción promotora de la regeneración de nervios in vivo de los inhibidores M162 y A721 de semaforina de la presente invención en la incisión del nervio olfativo.

La Fig. 7 presenta la acción promotora de la regeneración de nervios del inhibidor SPF-3059-1 de semaforina de la presente invención en la herida del nervio ciático.

La Fig. 8 presenta el resultado de examinar la influencia del inhibidor SPF-3059-1 de semaforina de la presente invención sobre la proliferación de células COS7.

La Fig. 9 presenta el resultado de examinar la influencia del inhibidor SPF-3059-1 de semaforina de la presente invención sobre la unión al receptor de semaforina 3A (Neurofilina-1).

La Fig. 10 presenta el resultado de examinar que la molécula diana del inhibidor SPF-3059-1 de semaforina de la presente invención es semaforina 3A.

La Fig. 11 son fotografías que presentan los resultados de examinar la acción de activación de la regeneración de nervios in vivo del inhibidor SPF-3059-1 de semaforina de la presente invención en la incisión del nervio raquídeo (trayectoria corteza cerebral-médula espinal).

La Fig. 12 son fotografías que presentan los resultados de examinar la acción de activación de la regeneración de nervios in vivo de PBS como referencia en la incisión del nervio raquídeo (trayectoria corteza cerebral-médula espinal).

Mejor modo de poner en práctica la invención

No existe ninguna limitación específica para un promotor de regeneración de nervios de la presente invención de manera que el promotor contenga un inhibidor para un factor repelente del crecimiento de nervios tal como semaforina o similares como ingrediente activo. En la presente memoria, semaforina es una denominación genérica para las proteínas que tienen dominios de semaforina con estructuras similares constituidas por aproximadamente 500 restos de aminoácido (Neuron 14, 941-948, 1995), y hasta la fecha se han descrito aproximadamente 20 variantes o más. En la presente invención, sin embargo, las semaforinas no se limitarán a las conocidas públicamente. Pueden ejemplificarse como tales semaforinas las siguientes: semaforinas de mamíferos tales de la especie humana, etc.; preferentemente semaforinas de la clase 3, 4, 5 ó 6 definidas en la bibliografía (Cell 97, 551, 1999); más preferentemente las semaforinas de la clase 3 ó 6; y todavía más preferentemente la semaforina 3A (Cell 75, 217, 1993, Cell 75, 1389, 1993) en las semaforinas de clase 3 y la semaforina 6C (documento WO 98/11216, Moll. Cell. Neurosci. 13, 9-23 (1999)) en las semaforinas de clase 6. En cuanto a la información de la secuencia con respecto a los genes que codifican estas semaforinas está descrita en la base de datos del GenBank, en las bibliografías mencionadas anteriormente o similares, el ADNc que codifica la semaforina puede clonarse según dicha información de la secuencia y utilizando, por ejemplo, un banco de ADNc procedente del cerebro o similar con una parte apropiada de ADN como sonda para la hibridación o como cebador para PCR. Los expertos en la materia pueden realizar fácilmente esta clonación según los protocolos básicos tales como Molecular Cloning 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), etc. Además, las proteínas pueden producirse según varios libros de texto y bibliografías tales como la Molecular Cloning mencionada anteriormente o similares expresando un gen que codifica la semaforina así obtenida. Además, la semaforina de la presente invención no estará limitada solamente a una proteína natural o recombinante sino que también incluye: una proteína en la que se expresa el dominio extracelular de una semaforina unida a la membrana y se disuelve; una proteína de fusión con otra proteína tal como un anticuerpo, fosfatasa alcalina o similar; una proteína a la que se añade una etiqueta tal como la etiqueta His, Flag o similar; o un mutante en el que se eliminan, sustituyen o añaden parte de los aminoácidos.

Por ejemplo, la semaforina 6C (Sema6C) es una proteína unida a la membrana y el dominio extracelular de Sema6C se utiliza normalmente tal como para medir la actividad de una sustancia del asunto utilizando acciones de activación o supresión de actividades de Sema6C. Se conocen dos isoformas en el dominio extracelular de Sema6C (documento WO 98/11216 y Moll. Cell. Neurosci. 13, 9-23 (1999)), cada una de las cuales presenta la actividad de desplome del cono de crecimiento. Una proteína de fusión en la que el dominio extracelular de dicho Sema6C y una proteína marcadora y/o una etiqueta peptídica se unen puede utilizarse con ventaja para dichos casos de medición de la actividad de una sustancia en cuestión con tal que la actividad de Sema6C no se deteriore. Ejemplos de proteínas marcadoras son las proteínas marcadoras convencionalmente bien conocidas tales como la fosfatasa alcalina (Cell 63, 185-194 (1990)), la zona Fc de un anticuerpo (número de registro M87789 de Genbank), HRP y similares, y las etiquetas peptídicas están ejemplificadas por la etiqueta Mic, la etiqueta His, la etiqueta Flag convencionalmente bien conocidas y similares.

En la presente invención, un inhibidor de semaforina significa una sustancia que inhibe una actividad de cualquiera de las semaforinas mencionadas anteriormente tales como, por ejemplo, la actividad de migración de una célula, la actividad de provocación de la muerte celular, cambios morfológicos de una célula tal como el redondeo de la célula o el desplome del cono de crecimiento, la actividad de supresión o activación del crecimiento de neuritas, la actividad de supresión o activación del crecimiento de dendritas de las células nerviosas, la actividad de dirección del axón del nervio o similares. Cualquier sustancia que inhiba las siguientes actividades de semaforina pueden adoptarse como dicho inhibidor de semaforina sin limitación específica. Preferentemente, se ejemplifica un compuesto que presenta acción promotora sobre la regeneración de los nervios centrales y/o periféricos, más preferentemente un compuesto que presenta acción supresora sobre la actividad de desplome del cono de crecimiento y/o la actividad inhibidora del crecimiento de nervios en un gel de colágeno, y todavía más preferentemente un compuesto que presenta actividad supresora tanto en la actividad de desplome del cono de crecimiento de semaforina como en la actividad inhibidora del crecimiento de nervios en un gel de colágeno.

La acción promotora descrita anteriormente sobre la regeneración de nervios centrales y/o periféricos se refiere a una acción que favorece la regeneración de nervios en el sistema (tejido) nervioso central que comprende tejidos tales como el del cerebro, médula espinal y similar, y/o en el sistema (tejido) nervioso periférico que están en los órganos o en la superficie del cuerpo o en el cuerpo que consisten en partes marginales y/o periféricas y no dicho sistema (tejido) nervioso central. En la presente memoria, la acción promotora de la regeneración de los nervios centrales incluye la acción promotora no solamente de la regeneración de nervios en las que un axón surge de un cuerpo de célula nerviosa en la zona central, tal como un nervio de la retina o un nervio de la corteza cerebral, y se proyecta sobre otra célula nerviosa que está también en el central, sino también sobre la regeneración de nervios en la que un axón de nervio se regenera en el sistema (tejido) nervioso central, circunstancia aun cuando un nervio, tal como una fibra aferente del nervio olfativo o un nervio sensitivo del ganglio del pedículo dorsal, surge de un cuerpo de célula nerviosa en el sistema periférico. Además, la acción promotora de la regeneración de nervios periféricos incluye la acción promotora no solamente de la regeneración de nervios de un nervio que surge de un cuerpo de célula nerviosa periférica y se prolonga en un tejido periférico, sino también en la regeneración de nervios en la que la circunstancia para la regeneración es el sistema (tejido) nervioso periférico, aun cuando un nervio emerja de un cuerpo de célula nerviosa central (cerebro, médula espinal o similares). Éste último puede estar ejemplificado por la acción promotora de la regeneración de nervios para dicho nervio motriz de la médula espinal, un nervio preganglionar en el sistema nervioso autonómico como los nervios simpático y parasimpático, y similares. La acción promotora en la regeneración de un nervio tal como un nervio ciático, que tiene ambos nervios mencionados anteriormente, se incluye también en la ejemplificación. Un compuesto con acción promotora sobre la regeneración de nervios centrales y periféricos se prefiere particularmente para un inhibidor de semaforina de la presente invención. El sistema (tejido) nervioso central descrito anteriormente se refiere a un tejido que comprende el cerebro, bulbo raquídeo, médula espinal, ojos y similares, y más particularmente se refiere a una zona en la que el transporte de las sustancias poliméricas está restringido por estructuras tales como la barrera sangre-cerebro y la barrera sangre-retina. El sistema (tejido) nervioso periférico se refiere a la zona de las demás partes del cuerpo. Las fibras nerviosas son en general capaces de regenerarse en los tejidos nerviosos periféricos, pero son incapaces de regenerarse en los tejidos nerviosos centrales.

La actividad del desplome del cono de crecimiento de la semaforina descrita anteriormente significa una actividad para hacer desaparecer los conos de crecimiento. Esta actividad se observa después de realizar las etapas siguientes: cultivo de células nerviosas (generalmente explantes tisulares de ganglios) durante un periodo de tiempo dado in vitro hasta que pueden observarse las neuritas extendidas así como los conos de crecimiento al borde de dichas neuritas; y a continuación añadir a éstas una concentración dada (p. ej. aproximadamente 3 unidades/ml; 1 unidad/ml se define como una concentración de semaforina en la que el 50% de los conos de crecimiento están colapsados) de semaforina y cultivar durante otro periodo de tiempo dado (p. ej. una hora). Con el fin de obtener las neuritas extendidas y los conos de crecimiento al borde de dichas neuritas listas para la observación, las células nerviosas se cultivan generalmente durante 10 a 20 horas in vitro, cuya duración puede alterarse según una variante de nervios y las condiciones de cultivo. Cuando el desplome del cono de crecimiento producido por la semaforina es suprimido, por ejemplo, mediante la adición de un compuesto a este sistema experimental a una concentración apropiada aproximadamente una hora antes de la adición de semaforina, entonces dicho compuesto se considera como inhibidor de semaforina especialmente como un compuesto con una acción supresora sobre la actividad de desplome del cono de crecimiento de la semaforina. Aunque no existe ninguna limitación específica para un compuesto con dicha acción supresora sobre la actividad de desplome del cono de crecimiento, pueden ejemplificarse compuestos que presentan dicha acción supresora a una concentración de 100 \mug/ml o inferior, preferentemente 30 \mug/ml o inferior, más preferentemente 10 \mug/ml o inferior y todavía más preferentemente 3 \mug/ml o inferior. Además, un compuesto que no afecta sustancialmente a la proliferación de las células tales como las células nerviosas, las células que expresan a semaforina o similares se prefiere como inhibidor de semaforina para confirmar el efecto de los inhibidores de semaforina de la presente invención y en vista de la seguridad cuando se utiliza como producto farmacéutico.

La actividad inhibidora del crecimiento de nervios de la semaforina en un gel de colágeno como se describió anteriormente significa, por ejemplo, la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas observada en un gel de colágeno que contiene, por ejemplo, tanto las células productoras de semaforina como las células nerviosas (normalmente ganglios). Y la acción supresora de dicha actividad inhibidora del crecimiento de neuritas es una actividad para inhibir de manera persistente la actividad de semaforina en un gel de colágeno y, por ejemplo, es una actividad mediante la cual las neuritas pueden crecer del lado de las células que producen semaforina tanto como 1/2 o más del crecimiento observado en el lado opuesto en presencia de la sustancia en cuestión bajo la condición experimental en la que las neuritas pueden solamente crecer hasta 1/3 o menos para las células productoras de semaforina en comparación con el crecimiento observado en el lado opuesto de las células que producen semaforina cuando se observa después de cultivar células que producen semaforina y células nerviosas adyacentes en un gel de colágeno, normalmente durante la noche o incluso más tiempo. Además, no existe limitación específica para un compuesto con acción supresora sobre la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de semaforina en dicho gel de colágeno. Sin embargo, se ejemplifican las que presentan la siguiente acción supresora a una concentración de 100 \mug/ml o inferior, preferentemente 30 \mug/ml o inferior, más preferentemente 10 \mug/ml o inferior y todavía más preferentemente 3 \mug/ml o inferior.

La semaforina utilizada para medir los dos tipos de actividades de semaforina mencionadas anteriormente no está limitada a una semaforina natural y pueden utilizarse también las semaforinas siguientes descritas anteriormente: semaforina en la que solamente se expresa y se disuelve el dominio extracelular de una semaforina de unión a la membrana; una proteína de fusión con otra proteína tal como un anticuerpo, fosfatasa alcalina o similar; semaforina a la que se añade una etiqueta tal como la etiqueta His o una Flag; o semaforina en la que están alterados algunos aminoácidos. Además, los ganglios del pedículo dorsal procedentes de embriones de pollitos de 7 a 8 días se utilizan convenientemente como células nerviosas para el cultivo. Sin embargo, los ganglios del pedículo dorsal de otros animales aparte de pollitos, o cualquier otra célula nerviosa tal como los ganglios del simpático, los ganglios de la retina, los ganglios cervicales superiores o similares aparte de los ganglios del pedículo dorsal pueden utilizarse también de manera que las células nerviosas sean capaces de extender sus neuritas en el cultivo in vitro. No existe ninguna limitación específica a la condición del cultivo con tal que pueda observarse crecimiento de neuritas y puedan medirse las actividades de la semaforina.

El mecanismo de acción de los inhibidores de semaforina de la presente invención puede considerarse de la manera siguiente. La inhibición del crecimiento de neuritas o del desplome del cono de crecimiento causado por la semaforina es desencadenada por la unión de la semaforina a su receptor en la superficie de la célula nerviosa (cono de crecimiento). La señal se transmite del receptor al que se une la semaforina hasta la serie de realizaciones de señalización intracelular y la despolimerización de las fibras de actina se consigue finalmente, lo que da lugar a la supresión del crecimiento de neuritas y al desplome del cono de crecimiento. La inhibición de la actividad de semaforina se consigue inhibiendo o bloqueando cualquiera de las etapas en el transcurso de estas reacciones. Como receptor mencionado anteriormente para la semaforina, puede adoptarse un receptor para cualquiera de las semaforinas siguientes, y puede también adoptarse un mutante o un componente de una parte de dicho receptor con la condición de que la semaforina pueda unirse a éste. Son ejemplos la Neuropilina-1, la plexina y similares. Los inhibidores de semaforina de la presente invención no estarán limitados por sus mecanismos de actuación y un inhibidor que inhibe cualquiera de las etapas en el mecanismo de actuación descrito anteriormente se incluye en la categoría de la presente invención. Es decir, se incluye un compuesto también en la categoría de la presente invención, cuando el compuesto inhibe la actividad de semaforina inhibiendo las reacciones que conciernen a la serie de reacciones de señalización intracelular que tienen lugar desde la fijación del receptor de semaforina mencionado anteriormente hasta la despolimerización de las fibras de actina. Además, un procedimiento de medición de la actividad inhibidora de la fijación al receptor de semaforina puede ser cualquier procedimiento si es seleccionado de manera apropiada por los expertos en la materia, que está ejemplificado por un procedimiento de medición de la actividad inhibidora de fijación al receptor de la semaforina, en la que la semaforina fusionada con otra proteína tal como un anticuerpo, fosfatasa alcalina o similar o la semaforina a la que se añade etiqueta His, Flag o similares, tal como se describió anteriormente, se une a un receptor de dicha semaforina o a una célula que expresa un componente del receptor en presencia de una sustancia en cuestión.

Por ejemplo, la actividad inhibidora de SPF-3059-1 para la unión de Sema3A a la Neuropilina-1 se examinó realmente utilizando la Sema3A fusionada a fosfatasa alcalina (= Sema3A-AP) y las células COS7 que expresan a Neuropilina-1. SPF-3059-1 es un compuesto descubierto por los presentes inventores, que inhibe tanto el desplome como la inhibición del crecimiento de neuritas provocado por la semaforina 3A (Sema3A). El presente estudio puso de manifiesto que SPF-3059-1 inhibe la unión de Sema3A-AP a Neuropilina-1 en función de la concentración. Además, con el fin de aclarar el mecanismo de dicha inhibición, es decir, para aclarar si SPF-3059-1 interactúa con Sema3A o con su receptor, se realizó la comparación midiendo la actividad de desplome entre (1) la actividad de desplome que se observó cuando una muestra, a la que se mezclaron SPF-3059-1 y Sema3A con antelación a la concentración que alcanza suficiente actividad inhibidora (0,25 \mug/ml de SPF-3059-1) se añadió a la solución de cultivo de los ganglios del pedículo dorsal y (2) la actividad de desplome que se observó al añadir Sema3A a la solución de cultivo mencionada anteriormente tras la adición de SPF-3059-1. La concentración final de SPF-3059-1 (0,05 \mug/ml) en la solución de cultivo fue la misma para (1) y (2). La inhibición de la actividad de desplome no se observó en (2) a esta concentración de SPF-3059-1. Sin embargo en (1), se observó inhibición de la actividad de desplome. Este resultado indica que Sema3A ha perdido su actividad de desplome porque SPF-3059-1 interactuó con ella. A partir de las consideraciones anteriores, se cree que SPF-3059-1 actúa mediante un mecanismo en el que la unión de Sema3A al receptor está inhibida por la acción directa de SPF-3059-1 sobre Sema3A. Cuando se considera este descubrimiento, se prefiere un compuesto que inhibe la unión de semaforina a su receptor interactuando directamente con la semaforina y que inhibe la función y la actividad de la semaforina para un inhibidor de semaforina de la presente invención. Un inhibidor de semaforina, particularmente un compuesto que inhibe la función de semaforina interactuando con éste, puede ser identificado por los procedimientos de medición mencionados anteriormente de la actividad de desplome o la actividad inhibidora de unión al receptor o similares.

Un compuesto preferido para el inhibidor de semaforina de la presente invención es un compuesto en el que el inhibidor de semaforina no afectará de manera sustancial la proliferación celular, es decir, un compuesto que no presenta la acción supresora sobre la proliferación celular a una concentración que está comprendida entre 50 y 3.000 veces o superior a la concentración a la que puede observarse actividad inhibidora de semaforina. Además, aunque no existe ninguna limitación específica del peso molecular de los inhibidores de semaforina de la presente invención, es deseable un compuesto con un bajo peso molecular a la vista de la capacidad de difusión, permeabilidad de la membrana, distribución del tejido, permeabilidad de la barrera sangre-cerebro específicamente o similares, y los ejemplos adecuados incluyen un compuesto de bajo peso molecular con un peso molecular de 10.000 o inferior, preferentemente un peso molecular de 5.000 o inferior, más preferentemente un peso molecular de 1.000 o inferior y particularmente un compuesto con un peso molecular de 600 o inferior. Todavía además, como inhibidores de semaforina de la presente invención, pueden proporcionarse a título de ejemplo dichos compuestos no peptídicos y no nucleotídicos. Dichos compuestos no peptídicos y no nucleotídicos están ejemplificados por un compuesto M162 sintetizado alifático, un compuesto A721 derivado de actinomicetos, y todavía más preferentemente, los compuestos obtenidos a partir del cultivo de Penicillium sp. SPF-3059 que se describe más adelante.

Un ejemplo de los compuestos mencionados anteriormente obtenidos a partir del cultivo de Penicillium sp. SPF-3059 es un compuesto con actividad inhibidora de semaforina representado por la fórmula general [8] mencionada anteriormente y más preferentemente un compuesto representado por una de las fórmulas generales [12] a [16] mencionadas anteriormente. En las fórmulas generales [2], [9], [10], [11], [12], [13], [14] y [16] en estos compuestos, R^{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alcoxicarbonilo, preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo carboxilo, y un grupo metoxicarbonilo, un grupo etoxicarbonilo, un grupo propoxicarbonilo y similares están ejemplificados como el grupo alcoxicarbonilo mencionado anteriormente, entre los que resulta preferido un metoxicarbonilo. Específicamente, R^{1} en las fórmulas generales [9], [10], [11], [12], [13] y [16] representan preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo carboxilo y R^{1} en las fórmulas generales [2] y [14] representan preferentemente un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo metoxicarbonilo en el que resulta más preferido un átomo de hidrógeno o un grupo carboxilo. Asimismo, R^{2} en las fórmulas generales [2], [9], [10], [11], [12], [13], [14] y [16] representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo aciloxi, preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo. Como grupo aciloxi mencionado anteriormente, un grupo acetoxi, un grupo propioniloxi, un grupo pivaloiloxi y similares está ejemplificado como grupo aciloxi mencionado anteriormente. R^{3} en las fórmulas generales [2] y [14] representa un átomo de hidrógeno, un grupo metoximetilo o un grupo mostrado por la fórmula [3]. R^{4} en las fórmulas generales [8], [12], [13], [14], [15] y [16] representa un átomo de hidrógeno, un grupo carbonilo o un grupo alcoxicarbonilo, preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo carboxilo. Los ejemplos del grupo alcoxicarbonilo mencionados anteriormente son un grupo metoxicarbonilo, un grupo etoxicarbonilo, un grupo propoxicarbonilo y similares, entre los que se prefiere un grupo metoxicarbonilo. Asimismo, R^{5} en las fórmulas generales [8], [12], [13], [14], [15] y [16] representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo aciloxi, preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo. Y un grupo acetoxi, un grupo propioniloxi, un grupo pivaloiloxi y similares están ejemplificados como grupo aciloxi mencionado anteriormente. Como R^{6} y R^{7} en la fórmula general [8], (1) cuando R^{6} representa un grupo metilo, R^{7} representa un grupo mostrado por las fórmulas [2], [9] o [10] y (2) cuando R^{6} representa un grupo mostrado por la fórmula [5] o [11], R^{7} representa un grupo acetilo.

Un compuesto que presenta un grupo representado por la fórmula general [8] mencionada anteriormente y particularmente un compuesto representado por las fórmulas generales [12] a [16] mencionadas anteriormente puede obtenerse a partir del cultivo de Penicillium sp. SPF-3059 con la actividad inhibidora de semaforina como índice. Además, dicho compuesto puede obtenerse también a partir del compuesto con actividad inhibidora de semaforina obtenido de este modo o similar por procedimientos de conversión y síntesis con actividad inhibidora de semaforina como índice. Los compuestos que constituyen inhibidores de semaforina de la presente invención están ejemplificados por los mostrados por las fórmulas [17] a [37] que se describen a continuación en los ejemplos en la presente descripción, y están ejemplificados más específicamente por: los compuestos representados por la fórmula general [12] que está presentada por las fórmulas [17], [20], [23], [24] y [32]; los compuestos representados por la fórmula general [13] presentados por las fórmulas [18], [19], [21], [25], [26], [27] y [28]; los compuestos representados por la fórmula general [14] mostrados por las fórmulas [22], [30], [31], [34], [36] y [37]; los compuestos representados por la fórmula general [15] mostrados por las fórmulas [29] y [35]; y los compuestos representados por la fórmula general [16] mostrados por la fórmula [33]. Estos compuestos ejemplificados específicamente anteriormente son nuevos compuestos excepto los siguientes: el compuesto SPF-3059-1 mostrado por la fórmula [17] (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 1993-239050); el compuesto SPF-3059-2 presentado por la fórmula [18] (Pure & Appl. Chem. 66, 2383-2386, 1994); y el compuesto SPF-3059-5 mostrado por la fórmula [19] (Pure & Appl. Chem. 66, 2383-2386, 1994, y la traducción japonesa publicada de la publicación internacional PCT nº 1994-506202).

Además, en los compuestos que constituyen los inhibidores de semaforina de la presente invención, las sales o derivados de los compuestos, preferentemente las sales farmacéuticamente aceptables desde un punto de vista farmacéutico o veterinario o los derivados que también están incluidos en la categoría de la presente invención. Ejemplos de sales son: las sales inorgánicas básicas tales como la sal de sodio, la sal de potasio, la sal de calcio, la sal de magnesio, la sal de aluminio, la sal de amonio o similares; sales orgánicas básicas tales como la sal de trietilamonio, sal de trietanolamonio, sal de piridinio, sal de diisopropilamonio o similares; las sales de aminoácidos básicos tales como la sal de arginina, la sal de lisina o similares. Están ejemplificados los derivados en los que el grupo carboxilo o el grupo hidroxilo de un compuesto se convierte en un grupo éster en los que los ejemplos incluyen un derivado en el que el grupo hidroxilo está acilado por un grupo acilo con 2 a 5 carbonos tal como un grupo acetilo, un grupo propionilo o similares, y un derivado en el que el grupo carboxilo se convierte en ésteres con 2 a 5 carbonos tal como éster metílico, éster etílico o similares.

Ejemplos de un compuesto de la presente invención, preferentemente un compuesto que presenta actividad inhibidora de semaforina y particularmente un compuesto obtenido a partir del cultivo de Penicillium sp. SPF-3059 y que presenta actividad inhibidora de semaforina incluyen un compuesto en el que por lo menos uno de entre R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} en la fórmula general [12] mencionada anteriormente (en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} son como se describió anteriormente) está representado por un átomo de hidrógeno, preferentemente un compuesto en el que por lo menos uno de R^{2} y R^{5} representa un grupo hidroxilo, por ejemplo, un compuesto en el que R^{2} representa un grupo hidroxilo, por ejemplo, un compuesto en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo y un átomo de hidrógeno, respectivamente, etc.), un compuesto en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo, el compuesto mencionado anteriormente en el que R^{4} representa un grupo carboxilo y el compuesto mencionado anteriormente en el que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{2} representa un grupo hidroxilo y similares. Está ejemplificado específicamente por el compuesto SPF-3059-3 presentado por la fórmula [20], el compuesto SPF-3059-7 presentado por [23], el compuesto SPF-3059-9 presentado por [24] y el compuesto SPF-3059-30 presentado por [32]. Los compuestos de la presente invención incluyen también sales o derivados farmacéuticamente aceptables del compuesto representado por la fórmula general [12] mencionada anteriormente.

Ejemplos de un compuesto de la presente invención, preferentemente un compuesto que presenta actividad inhibidora de semaforina y particularmente un compuesto obtenido a partir del cultivo de Penicillium sp. SPF-3059 y que presenta actividad inhibidora de semaforina incluyen un compuesto en el que por lo menos uno de entre R^{1}, R^{2} y R^{5} en la fórmula general [13] mencionada anteriormente (en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} son como se describió anteriormente) está representado por un átomo de hidrógeno, preferentemente un compuesto en el que por lo menos uno de R^{2} y R^{5} representa un grupo hidroxilo, por ejemplo, un compuesto en el que R^{2} representa un grupo hidroxilo (un compuesto en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo y un átomo de hidrógeno, respectivamente, etc.), un compuesto en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo, el compuesto mencionado anteriormente en el que R^{4} representa un grupo carboxilo y el compuesto mencionado anteriormente en el que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{5} representa un grupo hidroxilo y similares. Está ejemplificado más específicamente por el compuesto SPF-3059-4 presentado por la fórmula [21], el compuesto SPF-3059-12 presentado por la fórmula [25], el compuesto SPF-3059-24 presentado por [26], el compuesto SPF-3059-25 presentado por [27] y el compuesto SPF-3059-26 presentado por [28]. Los compuestos de la presente invención incluyen también sales o derivados farmacéuticamente aceptables del compuesto representado por la fórmula general [13] mencionada anteriormente.

Ejemplos de un compuesto de la presente invención, preferentemente un compuesto que presenta actividad inhibidora de semaforina y particularmente un compuesto obtenido a partir del cultivo de Penicillium sp. SPF-3059 y que presenta actividad inhibidora de semaforina incluyen un compuesto representado por la fórmula general [14] (en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son como se describieron inicialmente), preferentemente un compuesto en el que por lo menos uno de R^{2} y R^{5} está representado por un grupo hidroxilo, por ejemplo, un compuesto en el que R^{2} representa un grupo hidroxilo (un compuesto en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo y un átomo de hidrógeno, respectivamente, etc.), un compuesto en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo, el compuesto mencionado anteriormente en el que R^{4} representa un grupo carboxilo, un compuesto en el que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo, un compuesto en el que R1 representa un grupo carboxilo, R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo y R^{3} representa el grupo metoximetilo, un compuesto en el que R^{1} representa ya sea un grupo carboxilo o un grupo metoxicarbonilo, R^{4} representa un grupo carboxilo, R^{3} representa un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un grupo hidroxilo, especialmente un compuesto en el que R^{1} representa ya sea un grupo carboxilo o un grupo metoxicarbonilo, R^{4} representa un grupo carboxilo, y R^{2} y R^{3} representan un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un grupo hidroxilo, un compuesto en el que R^{3} representa un grupo mostrado por la fórmula [3] mencionada anteriormente y así sucesivamente. Está ejemplificado más específicamente por el compuesto SPF-3059-6 presentado por la fórmula [22], el compuesto SPF-3059-28 presentado por [30], el compuesto SPF-3059-29 presentado por [31], el compuesto SPF-3059-35 presentado por [34], el compuesto SPF-3059-37 presentado por [36] y el compuesto SPF-3059-39 presentado por [37]. Los compuestos de la presente invención incluyen también sales o derivados farmacéuticamente aceptables del compuesto representado por la fórmula general [14] mencionada anteriormente.

Los ejemplos de un compuesto de la presente invención, preferentemente un compuesto que presenta actividad inhibidora de semaforina y particularmente un compuesto obtenido a partir del cultivo de Penicillium sp. SPF-3059 y que presenta actividad inhibidora de semaforina comprenden un compuesto representado por la fórmula general [15] mencionada anteriormente (en la que R^{4} y R^{5} son como se describió anteriormente) preferentemente un compuesto en el que R^{5} representa un grupo hidroxilo, el compuesto mencionado anteriormente en el que R^{4} representa un grupo carboxilo y similares. Está ejemplificado más específicamente por el compuesto SPF-3059-27 presentado por la fórmula [29] y el compuesto SPF-3059-36 presentado por [35]. Los compuestos de la presente invención comprenden asimismo sales o derivados del compuesto representado por la fórmula general [15] mencionada
anteriormente.

Ejemplos de un compuesto de la presente invención, preferentemente un compuesto que presenta actividad inhibidora de semaforina y particularmente un compuesto obtenido a partir del cultivo de Penicillium sp. SPF-3059 y que presenta actividad inhibidora de semaforina incluyen un compuesto representado por la fórmula general [16] mencionada anteriormente (en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} son como se describió anteriormente), preferentemente un compuesto en el que por lo menos uno de R^{2} y R^{5} representa un grupo hidroxilo, especialmente un compuesto en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo, el compuesto mencionado anteriormente en el que R^{4} representa un grupo carboxilo y similares. Está ejemplificado más específicamente por el compuesto SPF-3059-34 presentado por la fórmula [33]. Los compuestos de la presente invención incluyen también sales o derivados del compuesto representado por la fórmula general [16] mencionada anteriormente.

Un compuesto que presenta un grupo representado por las fórmulas generales [2] o [5] mencionadas en la molécula y que presenta actividad inhibidora de semaforina, preferentemente un compuesto representado por la fórmula general [8] mencionada anteriormente, más preferentemente un compuesto representado por las fórmulas generales [12] a [16] mencionadas anteriormente, más específicamente los compuestos que constituyen los inhibidores de semaforina de la presente invención mostrados por las fórmulas [17] a [37] mencionadas anteriormente, etc., todos estos compuestos pueden obtenerse eficazmente cultivando la cepa micótica SPF-3059 que pertenece al género Penicillium.La cepa fue aislada por los presentes inventores de una muestra de suelo recogida en la prefectura de Osaka, Japón. La cepa SPF-3059 posee las siguientes características taxonómicas.

(a) Características del cultivo y morfológicas

En agar-agar con extracto de malta, crecieron lentamente colonias que alcanzan un diámetro de 2,8 a 2,9 cm en 21 días a 25 grados C. Las colonias eran de color blanco amarillo y de aspecto floculento. El color del lado opuesto era amarillo oscuro. No se observó ni producción de pigmento soluble ni formación de esporas. En agar Czapek, las colonias crecieron lentamente alcanzando un diámetro de 3,1 a 3,2 cementación en 21 días a 25ºC. Las colonias eran blancas a grises y de aspecto floculento. El color del lado opuesto era amarillo crema. No se observó ni producción de pigmento soluble ni formación de esporas. En agar-agar con dextrosa de patata, crecieron lentamente colonias que alcanzaron un diámetro de 3,2 a 3,3 cm en 21 días a 25 grados C. Las colonias eran de color amarillo crema y de aspecto floculento. El color del lado opuesto era amarillo oscuro a marrón. No se observó ni producción de pigmento soluble ni formación de esporas. En agar-agar de Czapec, crecieron lentamente colonias que alcanzan un diámetro de 3,1 a 3,2 cm en 21 días a 25ºC. Las colonias eran blancas a grises y de aspecto floculento. El color del lado opuesto era amarillo crema. No se observó ni producción de pigmento soluble ni formación de esporas. En agar-agar con harina de avena (medio Actino nº 3 "DAIGO", Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), crecieron lentamente colonias que alcanzan un diámetro de 2,0 a 2,1 cm en 21 días a 25 grados C. Las colonias eran blancas a amarillas o verde grisáceas y de aspecto floculento. El color del lado opuesto era amarillo a gris. No se produjo pigmento soluble pero se observó la formación de esporas. Los conidióforos eran de pared lisa con una longitud entre 5 y 20 \mum, y generaron 3 a 6 proyecciones en forma de frasco en un solo verticilo al final de los tallos. En la parte superior de las proyecciones en forma de frasco, que tenían una longitud de 3 a 4 \mum, se formaron conidios en forma de cadena, con 2 a 10 conidios por cadena. Los conidios son esféricos con un diámetro entre 2,2 y 2,4 \mum con la superficie estriada (en general, 10 líneas longitudinales en la superficie). No se observó teleomorfo.

(b) Características fisiológicas (1) Intervalo de pH para el crecimiento

Se examinó el crecimiento en cultivo en agitación utilizando caldo de cultivo Sabouraud. La observación se realizó después del cultivo durante 3 días a 27 grados C. El resultado fue el siguiente:

pH	Crecimiento

3,1	-
4,5	+
5,5	++
7,1	+++
8,0	++
9,0	\pm
10,0	-

(2) Intervalo de temperatura para el crecimiento

Se examinó el crecimiento utilizando agar-agar con harina de avena. La observación se realizó después de la incubación durante 5 días a 38 grados C. El resultado fue que la cepa creció con la temperatura.

Basándose en las características taxonómicas anteriores, se identificó la cepa como una cepa del género Penicillium y se utilizó Penicillium sp. SPF-3059. Dicha cepa se depositó el 13 de julio de 2001 en el organismo depositario de patentes internacionales, el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Japón (1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japón) con el número de registro FERM BP-7663 como número de depósito internacional bajo el Tratado de Budapest bajo el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para el objeto del procedimiento de la patente.

Según la presente invención, el cultivo para la producción de dichos inhibidores de semaforina por la cepa SPF-3059 puede realizarse en un medio nutritivo. El medio nutritivo puede ser líquido o sólido. Se prefiere el cultivo en agitación o el cultivo sumergido con aireación. La composición del medio puede estar comprendida en un amplio intervalo. Ninguna limitación específica se asigna a la composición del medio para su utilización. Esencialmente, lo que se requiere es una fuente de carbono, y una fuente de nitrógeno. Pueden añadirse también elementos inorgánicos en trazas. Ejemplos de fuentes de carbono adecuadas son la glucosa, sacarosa, glicerina, almidón, dextrina, molasas o similares. Ejemplos de fuentes de nitrógeno adecuadas son peptona, caseína o su hidrolizado, extracto de carne, extracto de levadura, harina de soja, harina de semilla de algodón, jarabe de maíz a remojo, aminoácidos tales como histidina, sales amónicas, sales de nitrato o similares. Ejemplos de fuentes de elementos inorgánicos adecuados son las sales de fosfato tales como el fosfato sódico y el fosfato potásico, sulfato de magnesio, cloruro sódico, cloruro potásico, carbonato cálcico o similares. Pueden añadirse también elementos inorgánicos al medio para ajustar la presión osmótica, ajustar el pH, complementar los elementos en trazas o similares. Además, pueden añadirse varios aditivos tales como vitaminas, ácidos nucleicos o similares al medio para estimular el crecimiento de la cepa productora. También es posible añadir un agente antiespumante tal como aceite de silicona, derivado de polipropilenglicol, aceite de soja o similares durante el periodo de cultivo. Un intervalo de temperatura preferido para el cultivo está comprendido preferentemente entre 20 y 35 grados C, más preferentemente entre 25 y 30 grados C y el pH preferido del medio es, por ejemplo, el que está comprendido en aproximadamente la neutralidad y el periodo de cultivo es, por ejemplo, un periodo de 5 a 10 días.

Para la recuperación de los inhibidores de semaforina de la presente invención, mostrados por las fórmulas [17] a [37] mencionadas anteriormente, a partir del caldo de cultivo de fermentación después del cultivo, pueden adoptarse cualquier procedimiento convencional adoptado para el aislamiento y la purificación de los metabolitos secundarios producidos por los microorganismos. Estos procedimientos incluyen la extracción con disolvente, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de adsorción, la cromatografía de reparto, la cromatografía de filtración en gel, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la cromatografía en capa fina y similares. Estos procedimientos de aislamiento y purificación pueden adoptarse ya sea solos o en combinación. Para obtener los compuestos objeto del sobrenadante del cultivo, pueden adoptarse estos procedimientos de aislamiento y purificación. Además, cuando los compuestos objeto están dentro del micelio del hongo cultivado, el micelio puede recogerse mediante dicha filtración o centrifugación y puede extraerse directamente utilizando un disolvente orgánico soluble en agua tal como acetona, metanol o similares. A continuación puede obtenerse un compuesto de interés a partir del extracto por procedimientos similares descritos anteriormente. Dicho compuesto de interés puede convertirse también en una sal añadiendo una cantidad apropiada de base en disolventes tales como agua, metanol, etanol, acetona, acetato de etilo, cloroformo, éter o similares. Además, un grupo hidroxilo puede acilarse, un grupo carboxilo puede esterificarse en dicho compuesto de interés por los procedimientos convencionales. Por ejemplo, un grupo hidroxilo puede acilarse mediante la adición de un agente de acilación tal como el anhídrido acético, cloruro de acetilo o similares en un disolvente orgánico apropiado y en presencia de bases. Alternativamente, un grupo carboxilo puede esterificarse utilizando haluro de alquilo tal como yoduro de metilo, bromuro de etilo o similares en un disolvente orgánico apropiado y en presencia de bases. Para dichos disolventes orgánicos pueden ponerse como ejemplos acetona, acetato de etilo, cloroformo, éter, DMF, piridina o similares. Para bases pueden ponerse como ejemplos, trietilamina, piridina, carbonato potásico o similares.

Además, M162 o A721, que están descritos en los Ejemplos, se proporcionan asimismo a título de ejemplo como otros inhibidores de semaforina de la presente invención. M162 es un compuesto alifático con una absorción ultravioleta débil, en tanto que A721 es un producto natural aislado procedente del caldo de cultivo cultivado de una cepa de actinomiceto que presenta un peso molecular de 437 y un espectro de absorción \lambda max UV-visible máximo (en metanol) a 397 nm. Considerando éstos, M162 y A721 son compuestos de bajo peso molecular cuyas estructuras químicas son totalmente diferentes de las de los compuestos mostrados por las fórmulas [17] a [37] mencionadas anteriormente y similares.

No existe ninguna limitación específica como preventivos o remedios de la presente invención para enfermedades neuropáticas y/o enfermedades neurodegenerativas incluyendo la lesión de los nervios raquídeos y/o la lesión de los nervios periféricos con tal de que contengan los promotores de regeneración de nervios descritos anteriormente que poseen un inhibidor para un factor repelente del crecimiento de nervios, particularmente los inhibidores de semaforina mencionados anteriormente como ingrediente activo. A dichos preventivos y remedios, pueden añadirse varias composiciones para dosificación tales como portadores, aglutinantes, estabilizantes, excipientes, diluyentes, tampones de pH, agentes disgregadores, disolventes, coadyuvantes de disolución, agentes isotónicos ordinarios farmacéuticamente aceptables o similares. Además, estos preventivos y remedios pueden administrarse ya sea por vía oral o parenteral. En otras palabras, pueden administrarse en un medio de administración habitual, por ejemplo, pueden administrarse por vía oral en formas de agente tales como polvo, gránulos, cápsulas, jarabe, líquido en suspensión o similares, o pueden administrarse por vía parenteral inyectando en formas de agente tal como en solución, emulsión, suspensión o similares. Alternativamente, puede administrarse por vía nasal en forma de agentes de nebulización.

Aunque la dosis y la frecuencia o la administración difieren dependiendo del método de administración y de la edad, peso, condiciones médicas o similares de un paciente, se prefiere administrar por vía local en el punto de la enfermedad. Ya que se tarda de varios días a varios meses para regenerar los nervios, los preventivos o los remedios se administran preferentemente una o más de dos veces durante este periodo para suprimir las actividades de semaforina. Cuando se administran dos veces o más, resulta preferido administrar los preventivos o los remedios de forma repetida durante días consecutivos o a intervalos apropiados. La dosis puede definirse como varios centenares de \mug a 2 g por administración en forma de inhibidor de semaforina, preferentemente varias docenas de mg o menos. Con el fin de reducir la frecuencia de administración, pueden utilizarse agentes de liberación lenta, una bomba osmótica o similares. En algunos de estos procedimientos de administración, se prefiere adoptar una vía y procedimiento de administración en los que la concentración alcanzaría la suficiente concentración para inhibir la actividad de semaforina en el punto de actuación.

Las enfermedades neuropáticas y/o las enfermedades neurodegenerativas mencionadas anteriormente incluyendo la lesión de los nervios raquídeos y/o la lesión de los nervios periféricos significa la lesión o enfermedades degenerativas de los nervios periféricos o centrales enumerados por: anomalía olfativa debida al envejecimiento o similares, lesión de los nervios distintos de los olfativos producida por traumatismo tal como la lesión de la médula espinal o similares; lesión de nervios debida a infarto cerebral o similares; parálisis de los nervios faciales, neuropatía diabética, glaucoma, retinitis pigmentaria, enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y ALS; esclerosis lateral hipoplástica muscular, enfermedad de Lou Gehrig, corea de Huntington, infarto cerebral o enfermedades neurodegenerativas traumáticas; y demás. Las enfermedades acompañadas de angiogénesis en las que VEGF165 está implicada son también objetivos, ya que VEGF165 también utiliza neuropilina como receptor suyo.

Además, la aplicación de los promotores de la regeneración de nervios de la presente invención no se limitará a los productos farmacéuticos tales como preventivos o remedios para enfermedades neuropáticas y/o enfermedades neurodegenerativas, sino que se aplican también competentemente a fármacos veterinarios, o además a reactivos experimentales industrialmente importantes como los inhibidores de señalización de semaforina. Debido a que contienen inhibidores de semaforina como ingrediente activo, los promotores de regeneración de nervios de la presente invención estimulan la regeneración del nervio olfativo que es un nervio periférico, y estimulan la regeneración de nervios en la zona central, que es el bulbo olfativo, corteza cerebral, hipocampo, cuerpo estriado, tálamo, diencéfalo, mesoencéfalo, cerebelo, protuberancia, bulbo raquídeo, médula espinal, retina y similares.

La presente invención se explica a continuación con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos. El alcance técnico de la invención, sin embargo, no se limitará a estos ejemplos.

Ejemplo 1

Producción de los compuestos, SPF-3059-1, SPF-3059-2 y SPF-3059-5

Un medio de 75 ml que contiene 2% de glucosa, 5% de sacarosa, 2% de semillas de algodón en polvo, 0,1% de nitrato sódico, 0,1% de L-histidina, 0,05% de fosfato dipotásico, 0,07% de cloruro potásico y 0,0014% de sulfato magnésico heptahidratado, con su pH ajustado a 7,0, se pipeteó a un matraz Sakaguchi de 500 ml de volumen y se esterilizó en un autoclave. Una aguja de inoculación de Penicillium sp. SPF-3059 (FERM BP-7663) en cultivo inclinado se inoculó en este medio y se cultivó con agitación a 130 rpm durante 5 días a 27 grados C como precultivo. Se pipetearon 300 ml de un medio con la misma composición que el medio mencionado anteriormente en cada uno de los 10 matraces Sakaguchi de 2 litros de volumen y se esterilizó en un autoclave. Posteriormente, la solución de precultivo mencionada anteriormente se añadió a estos matraces en 6 ml a cada uno, que se cultivaron a continuación en agitación a 110 rpm durante 7 días a 27 grados C.

Tras el cultivo, el caldo de fermentación se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4 grados C para separar el sobrenadante y el micelio. Las fracciones de sobrenadante se extrajeron con 3 litros de acetato de etilo-ácido fórmico (99:1). La fracción del micelio se extrajo con 3 litros de acetona, se filtró a continuación y se concentró. Una vez concentrada en solución acuosa, se extrajo con 1 litro de acetato de etilo-ácido fórmico (99:1). Ambos extractos se mezclaron a continuación y se concentraron a presión reducida para obtener 10,4 g de extracto en bruto. Este extracto se disolvió a continuación en 100 ml de metanol y se aplicó a una cromatografía en columna con Sephadex (marca registrada) LH-20 (Amersham Biosciences K.K.) y se eluyó con metanol. Se recogieron las fracciones activas y se evaporó el disolvente a presión reducida para obtener 2,6 g del material en bruto. Este material en bruto se disolvió a continuación en 100 ml de metanol para una cromatografía en columna utilizando TSKgel TOYOPEARL HW-40F (Tosoh Corporation) y se eluyó con metanol. Se recogieron las fracciones activas y se evaporó el disolvente a presión reducida para obtener 1,6 g de sustancia en bruto. Esta sustancia en bruto se disolvió a continuación en alícuotas de 50 mg en 1 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) para una HPLC en fase inversa. Las condiciones de la HPLC en fase inversa fueron, columna: Wakopak® Wakosil-II5C18RS (conexión 20\times50 mm y 20\times250 mm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), disolución A: solución acuosa al 1% de ácido fórmico, solución B: metanol, gradiente: gradiente lineal durante 90 min. desde 35% hasta 65% para la proporción de la solución B, caudal: 5 ml/min., detección: absorbancia a 260 nm. Las fracciones eluidas a 59, 74 y 81 minutos se recogieron y se evaporó el disolvente a presión reducida, y de este modo se obtuvieron los compuestos, SPF-3059-5 (34,2 mg), SPF-3059-1 (64,1 mg) y SPF-3059-2 (12,0 mg) respectivamente. Las propiedades fisicoquímicas de estos compuestos obtenidos de este modo son las siguientes.

Compuesto SPF-3059-1

Aspecto: polvo amarillo

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido de alta resolución (HRFAB-MS) m/z (M+H)^{+}:

: Valor medido: 579,0772

: Valor calculado: 579,0776

Fórmula molecular: C_{28}H_{18}O_{14}

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 241(31.600), 315(23.400), 365(16.500)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.400, 1.701, 1.615, 1.570, 1.457, 1.273

^{1}H-RMN (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,28, 2,67, 2,69, 4,6-4,7, 5,02, 6,40, 6,91, 7,91, 8,52, 9,33, 11,1-11,6, 12,8

^{13}C-RMN (125 MHz, DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 16,5, 17,0, 32,4, 56,2, 65,7, 68,0, 102,3, 104,2, 108,8, 110,1, 118,2, 118,5, 120,6, 122,2, 125,8, 127,7, 132,4, 134,9, 137,6, 139,1, 140,7, 140,8, 150,1, 150,2, 152,2, 153,8, 154,5, 156,3, 167,5, 167,6, 172,7, 172,8, 186,3, 199,1, 202,7, 202,9

Considerada en conjunto, la estructura de SPF-3059-1 se determinó como la fórmula [17] siguiente (tautómera):

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

Compuesto SPF-3059-2

Aspecto: polvo de color crema

: Valor medido: 533,0710

: Valor calculado: 533,0721

Fórmula molecular: C_{27}H_{16}O_{12}

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 209(40.600), 236(42.600), 283(28.500), 323(25.400)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.266, 1.678, 1.654, 1.623, 1.562, 1.471, 1.296

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,53 (6H,s), 6,93 (1H, s), 6,95 (1H, s), 7,47 (1H, s), 8,15 (1H, s), 8,54 (1H, s), 9,38 (1H, brs), 9,89 (1H, brs), 10,78 (1H, brs), 11,37 (1H, brs), 12,68 (1H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 29,1, 32,1, 102,3, 103,1, 108,7, 112,15, 113,5, 119,6, 119,8, 120,9, 126,2, 132,4, 133,6, 136,1, 141,7, 144,5, 150,71, 150,74, 152,49, 152,54, 152,7, 154,4, 167,4, 172,9, 173,4, 199,2, 201,2

Considerada en conjunto, la estructura de SPF-3059-2 se determinó como la fórmula [18] siguiente:

17

Compuesto SPF-3059-3

Aspecto: polvo de color crema

: Valor medido: 577,0615

: Valor calculado: 577,0619

Fórmula molecular: C_{28}H_{16}O_{14}

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 229(35.800), 284(22.600), 322(21.000)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.260, 1.684, 1.626, 1.567, 1.467, 1.288

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,53 (3H,s), 2,55 (3H, s), 6,93 (1H, s), 6,96 (1H, s), 8,17 (1H, s), 8,53 (1H, s), 9,5-13,0 (6H)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 29,1, 32,1, 102,26, 102,32, 109,9, 112,4, 119,6, 119,8, 120,3, 120,9, 126,3, 132,5, 133,4, 136,2, 141,2, 141,7, 150,4, 150,8, 152,1, 152,68, 152,73, 154,5, 167,4, 167,5, 172,5, 172,9, 199,1, 201,1

A partir de estos resultados, se determinó la estructura de SPF-3059-5 como la fórmula [19] siguiente:

18

Ejemplo 2

Acción supresora de los compuestos SPF-3059-1, SPF-3059-2, SPF-3059-5, M162 y A721 de la presente invención para la actividad de desplome de Sema3A

Una placa de 96 pocillos (Sumitomo Bakelite Co., ltd.) recubierta previamente con polilisina se recubrió además con laminina (20 \mu/ml de laminina, durante 1 hora a temperatura ambiente). A cada pocillo se le añadieron 100 \mul de medio (medio F12 que contiene 10% de suero bovino fetal, 20 ng/ml de NGF, 100 unidades/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina) cuyos medios se inocularon a continuación con ganglios nerviosos del pedículo dorsal extirpados de embriones de pollo E7 (embriones de 7 días) y se cultivaron durante 16 a 20 horas en CO_{2} al 5% y a 37 grados C. Posteriormente, se añadieron los compuestos del asunto a los medios a varias concentraciones y se añadieron 2 unidades/ml de semaforina 3A (Sema3A) de ratón después de cultivar durante 1 hora. Los cultivos se incubaron más durante 1 hora más. Se añadió rápidamente glutaraldehído a éstos después de dicha 1 hora hasta una concentración final del 1%. Los cultivos de dejaron a continuación durante 15 minutos a temperatura ambiente de modo que se fijaron las secciones de tejido y se observaron al microscopio los ritmos de desplome de los conos de crecimiento. Un pocillo sin adición de Sema3A efectuó el control. Los resultados se representan en las Figs. 1 y 2.

Las Figs. 1 y 2 demuestran que el ritmo de desplome de los conos de crecimiento disminuyen a medida que aumenta la concentración del compuesto. Por el contrario, los compuestos solos no afectaron los ritmos en absoluto. Los resultados pusieron de manifiesto que estos compuestos (SPF-3059-1, SPF-3059-2, SPF-3059-5, M162 y A721) inhiben las actividades de desplome del cono de crecimiento de Sema3A en función de la concentración. Los ejes longitudinal y lateral en las figuras representan el ritmo de desplome de los conos de crecimiento y la concentración de los compuestos, respectivamente. \bullet \sqbullet \blacktriangle presentan los resultados cuando se añadió Sema3A después de la adición de los compuestos y o \Box \Delta demuestran éstos cuando no se añadió Sema3A. Además, se determinaron los IC_{50} (\mug/ml) de los inhibidores por el procedimiento que comprende: calcular el ritmo del desplome del cono de crecimiento (A) % de las referencias negativas (no se añadieron compuestos ni Sema3a); posteriormente se calcula el ritmo de desplome del cono de crecimiento (B) % de las referencias positivas (no se añadieron compuestos pero se añadió Sema3a); y se seleccionó la concentración de cada compuesto a partir del gráfico en el que el ritmo de desplome del cono de crecimiento cumple (A+B)/2 (%), que era igual a la concentración de IC_{50}. Los resultados son los siguientes.

Compuesto	IC_{50} (\mug/ml)

SPF-3059-1	<0,1
SPF-3059-2	<0,1
SPF-3059-5	<0,1
M162	2,0
A721	5,0

Estos resultados demuestran que SPF-3059-1, SPF-3059-2 y SPF-3059-5 inhiben potencialmente la semaforina.

Ejemplo 3

Acción supresora de SPF-3059-1 para la actividad de desplome de Sema6C

El experimento se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 2 con la excepción de que se utilizó la semaforina 6C-AP de rata (Sema6C-AP: proteína de fusión de dominio extracelular de Sema6C y fosfatasa alcalina procedente de placenta humana) en lugar de semaforina 3A (Sema3A) de ratón y se utilizaron los ganglios del pedículo dorsal extraídos de embriones de pollitos de 8 días en lugar de los extraídos de embriones de pollitos de 7 días. Se midió el ritmo de desplome del cono de crecimiento cuando se añadió Sema6C-AP una hora después de la adición del compuesto SPF-3059-1 a varias concentraciones. Los resultados se presentan en la Fig. 3. Los ejes longitudinal y lateral en la figura representan el ritmo de desplome de los conos de crecimiento y la concentración de SPF-3059-1, respectivamente. \bullet presenta los resultados cuando se añadió Sema6C-AP después de la adición de SPF-3059-1 y presenta el resultado cuando no se añadió Sema6C-AP. La Fig. 3 demuestra que el ritmo de desplome de los conos de crecimiento disminuye a medida que aumenta la concentración de SPF-3059-1. Por el contrario, SPF-3059-1 solo no afectó el ritmo en absoluto. Estos resultados ponen de manifiesto que SPF-3059-1 inhibe las actividades de desplome del cono de crecimiento de Sema6C-AP en función de la concentración.

Ejemplo 4

Supresión de la acción inhibidora de crecimiento de neuritas de Sema3A por los inhibidores

Si los presentes compuestos (SPF-3059-1, M162, A721) presentan acción inhibidora persistente para Sema3A se analizaba por el método de cultivo conjunto colágeno gel (Neuroprotocols 4, 116, 1994) utilizando grupos de células COS7 que expresan a Sema3A y ganglios del pedículo dorsal de embriones de pollitos de 7 y 8 días. Se generaron grupos de células COS7 que expresan a Sema3A de la forma siguiente. Se introdujo 1 \mug de Sema3A-plásmido de expresión en células COS7 (100.000 células/35 mm de placa de cultivo), que se cultivaron durante la noche, con el reactivo de transfección FuGENE6 (Roche). 2,5 horas después del comienzo de la transfección, se recogieron las células COS7 por tripsinización y centrifugación, y se volvieron a poner en suspensión en un medio de 200 \mul. Se colocaron 20 \mul de la suspensión celular sobre la tapa de la placa de cultivo (interior) y se volvió a colocar la tapa, y a continuación se cultivó la suspensión durante 20 horas (cultivo en gota suspendida) (Cell 78, 425, 1994). Cuando se terminó el cultivo, se recogieron las células COS7 agregadas (grupo) y se recortaron hasta un diámetro de 0,5 mm. El grupo de células COS7 que expresa a Sema3A y los ganglios del pedículo dorsal mencionados anteriormente se colocaron en paralelo a una distancia entre 0,5 y 1 mm en un gel de colágeno al 0,2% que se cultivó a continuación en un medio que contenía los compuestos mencionados anteriormente a varias concentraciones durante 2 días a 37 grados C en CO_{2} al 5%. Se le añadió rápidamente glutaraldehído hasta una concentración final del 1%. Se dejaron a continuación los cultivos durante 1 hora a temperatura ambiente de modo que se fijaron los tejidos, y se observó al microscopio el crecimiento de neuritas. En la Fig. 4 se encuentran los resultados.

Se formaron gradientes de concentración en los geles de colágeno mencionados anteriormente debido a que se segregó Sema3A del grupo de células COS7 que se introdujo con los plásmidos que expresan a Sema3A (el más próximo al grupo de células COS7 presentó una concentración mayor). Cuando se utilizó un medio que no contiene un compuesto del asunto, las neuritas no pudieron crecer hacia el grupo de células COS7 con la concentración elevada de Sema3A y crecieron solamente en la dirección opuesta. Sin embargo, cuando se añadió al medio el compuesto SPF-3059-1 o M162, se observó crecimiento de neuritas en dirección hacia el grupo de células COS7 que expresa Sema3A. Dicho crecimiento de neuritas hacia el grupo de células COS7 que expresa a Sema3A fue más destacable a medida que la concentración del compuesto era mayor, lo que sugiere la dependencia de la concentración. Este resultado demostró la capacidad de SPF-3059-1 y de M162 de inhibir persistentemente las actividades de Sema3A. Sin embargo, solamente cuando se añadió A721, no se observó el crecimiento de neuritas hacia el grupo de células COS7 que expresan a Sema3A, que se observó con la adición de SPF-3059-1 y M162. Esto demostró que A721 no presentaba la acción inhibidora persistente sobre Sema3A.

Ejemplo 5

Supresión de la acción inhibidora del crecimiento de neuritas de Sema3A

De manera similar a la del Ejemplo 4, se analizó la supresión de la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas en los compuestos, SPF-3059-1, SPF-3059-2 y SPF-3059-5. Cuando las neuritas crecieron en forma circular concéntrica completa precisamente como para los grupos de referencia en los que se utilizaron células COS7 que no expresan a Sema3A, se puntuó +++ (efecto inhibidor potente para Sema3A). Cuando el crecimiento se observó casi en forma circular concéntrica acompañado de una pequeña supresión del crecimiento en dirección de las células que expresan a Sema3A, se puntuó ++. Cuando el crecimiento en dirección de las células COS que expresan a Sema3A apenas se suprime para presentar una forma de media luna, se puntuó +. Cuando no se observó en absoluto crecimiento en dirección de las células COS que expresan a Sema3A, efecto no inhibidor para Sema3A), se puntuó -. Los resultados determinados se presentan a continuación.

Compuesto	Concentración de los presentes compuestos
	(\mug/ml)
	0,5	1,0	2,0
SPF-3059-1	+	++	+++
SPF-3059-2	+	++	+++
SPF-3059-5	+	++	++
PBS (referencia)	-	-	-

Estos resultados pusieron de manifiesto que los compuestos, SPF-3059-1, SPF-3059-2 y SPF-3059-5 inhibieron persistentemente la acción de Sema3A segregada de las células COS7 que expresan Sema3A durante el cultivo de 48 horas.

Ejemplo 6

Acción promotora de la regeneración de nervios in vivo del inhibidor SPF-3059-1 de semaforina en la axotomía del nervio olfativo

Se adquirieron ratas Wister macho (de 6,5 semanas) en CHARLES RIVER JAPAN, INC. y se criaron con alimentación libre y toma de agua en un criadero dedicado. Se preparó una muestra de solución diluyendo SPF-3059-1 hasta 1 mg/ml con PBS y se rellenó en una bomba de presión osmótica (alzet 2004, ALZA Co., US). Se utilizó una bomba llena con PBS como referencia. La solución de la muestra y una similar se prepararon el día antes de la operación y la bomba de presión osmótica se puso en un baño en PBS y se colocó durante la noche a temperatura ambiente. Justo antes de la operación, se conectó una cánula en L a un extremo de un tubo de silicio relleno con la solución de la muestra y de la similar, y el otro extremo del tubo se conectó a la bomba. Se anestesió una rata con pentobarbital (50 mg/kg, inyectado por vía intrapeniana) y su cabeza se fijó al aparato estereotáxico. Se practicó una incisión en el cuero cabelludo a lo largo de la línea media y el cráneo por encima del bulbo olfativo se abrió para exponer el bulbo olfativo (parte anterior). Con el fin de axotomizar el nervio olfativo, se insertó una cuchilla (se cortó una cuchilla en 1,5 mm de profundidad) entre el bulbo olfativo y la lámina cribosa. El nervio olfativo que se proyecta sobre el bulbo olfativo superior se axotomiza mediante esta manipulación. La cánula en L se fijó a la apertura craneal por encima del bulbo olfativo con adhesivo instantáneo quirúrgico y cemento dental de modo que el borde de la cánula está dispuesto en la proximidad de la incisión. La salida de la muestra se colocó a 6 \mul (6 \mug)/día. La bomba se insertó por vía subcutánea en el cuello dorsal y la incisión se suturó. A continuación el animal volvió en sí.

Dos y tres semanas después de la operación, la rata anestesiada con pentobarbital se extendió sobre su lomo y se inyectó con 100 \mul de WGA-HRP/PBS al 1% (TOYOBO) en la cavidad nasal utilizando una microjeringuilla. 24 horas después de la inyección de HRP, la rata se continuó anestesiando con pentobarbital (50 mg/kg, inyectado por vía intrapeniana) y se le practicó una incisión torácica. Posteriormente, se perfundió PBS en el ventrículo izquierdo y a continuación se perfundió PBS que contenía 200 \mul de paraformaldehído al 4%. Se extrajo el bulbo olfativo y se colocó en PBS que contenía sacarosa al 30%, se colocó en un baño durante la noche a 4 grados C y a continuación se congeló con nieve carbónica. El bulbo olfativo se impregnó en un compuesto de OTC en nieve carbónica y a continuación se prepararon secciones de 30 \mum con un criostato. Se tomaron alícuotas de las secciones en solución salina tamponada con Tris (TBS) (una de cada tres piezas). Se lavaron las secciones en PBS en la que se añadió a continuación TBS 0,1 M que contenía DAB al 0,48%, NiCl al 0,096% y H_{2}O al 0,036% y la reacción tuvo lugar durante 15 min. Una vez que se hubo lavado en TBS, se montaron las secciones en un portaobjetos de vidrio y se sellaron después de secarse. Las secciones se observaron al microscopio y se observó la reacción de HRP del glomérulo en la parte externa del bulbo olfativo.

Se evaluó cuantitativamente la regeneración de los nervios olfativos observando en qué sección horizontal del bulbo olfativo del vértice emergía el glomérulo positivo a HRP. En la Figura 5 y en la Tabla 1 se presentan los resultados. Todas las ratas excepto la que murió por asfixia la 2ª semana a la inyección de HRP se utilizaron para la evaluación. Cuando se inyectó SPF-3059-1, se observaron secciones positivas a HRP en las piezas más superficiales que las referencias inyectadas con PBS tanto en la 2ª semana como en la 3ª. Se interpretaron las diferencias significativas en el grupo inyectado con SPF-3059-1 frente al grupo inyectado con PBS, se observaron los positivos a HRP en las secciones más superficiales que el grupo inyectado con PBS la 3ª semana. Estos resultados demuestran que SPF-3059-1 ha puesto de manifiesto la acción promotora de la regeneración de nervios en modelos de rata adulta para la axotomía del nervio olfativo.

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TABLA 1

19

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Ejemplo 7

Acción promotora de la regeneración de nervios in vivo de los inhibidores de semaforina, M162 y A721 en la axotomía del nervio olfativo

Se realizó el mismo experimento que en el Ejemplo 6 con M162 y A721. En la Fig. 6 se presentan los resultados. Estos resultados demuestran que M162 presenta la acción promotora de la regeneración de nervios in vivo pero A721 no.

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Ejemplo 8

Acción promotora de la regeneración de nervios in vivo del inhibidor SPF-3059-1 de semaforina en el aplastamiento del nervio ciático

Se adquirieron ratas Wister macho de 7 semanas (CHARLES RIVER JAPAN, INC.) y se criaron en ciclos de luz y oscuridad durante 12 horas. Las ratas tenían libre acceso a pienso sólido (CLEA Japan, Inc., CE2) y agua, y se utilizaron en el experimento tras aproximadamente una semana de cría preliminar. Bajo anestesia de pentobarbital, se expuso el nervio ciático de los muslos de la rata, se pinzó durante 30 s. con fórceps de 5 mm de profundidad, y se comprimió de este modo. El punto de compresión se marcó con hilo de nilón 10-0. Se disolvió SPF-3059-1 en PBS a razón de 8,3 \mug/ml y se administró localmente al punto de la lesión durante 14 días consecutivos a un caudal de 1 \mug/día utilizando una bomba de presión osmótica (2ML2, 5 \mul/h, alzet). Se administró PBS a las referencias. El 14º día de administración, se extrajeron los nervios ciáticos y se recortaron en las áreas distales del punto de compresión (posiciones de calificación) por 2 mm, 6 mm y 10 mm. Los nervios ciáticos incisos se fijaron en glutaraldehído al 2,5%/tampón fosfato 0,1 M durante un día y una noche. Cuando estaban fijados, se deshidrataron los nervios en alcohol y se impregnaron en resina epoxi. Se realizaron secciones transversales de los nervios ciáticos y se secaron con azul de toluidina, y se tomaron fotografías en un microscopio óptico para determinar los recuentos de las fibras con mielina. Una vez medidas las áreas de los nervios ciáticos, se calculó la densidad de la fibra con mielina dividiendo cada área por el recuento de fibras con mielina. Los resultados se presentan en la Fig. 7. La densidad de la fibra con mielina aumentó más en el grupo inyectado con SPF-3059-1 en comparación con el grupo inyectado con PBS en las áreas distales de 2 mm y 6 mm del punto de compresión. Este resultado demuestra que SPF-3059-1 presenta efecto promotor para la regeneración de los nervios ciáticos que fueron
comprimidos.

Ejemplo 9

Efecto del inhibidor SPF-3059-1 de semaforina sobre la proliferación celular

Se sembraron células COS7 en una placa de 96 pocillos (100 \mul de medio/pocillo) a razón de 10.000 células por pocillo. Al mismo tiempo, se añadió SPF-3059-1 de varias concentraciones y se cultivaron las células durante dos días en presencia de CO_{2} al 5% a 37 grados C. A continuación se añadieron a cada pocillo 10 \mul de solución MTT a razón de 5 mg/ml y se cultivó durante otra hora. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante del cultivo y el formazán (derivado de MTT producido en células viable) acumulado en las células se disolvió mediante la adición de 50 \mul de DMSO y a continuación se midió la absorbancia a 570 nm para determinar la proliferación de las células COS7. En la Fig. 8 se presentan los resultados. Como se muestra en la Fig. 8, el nivel de proliferación celular en el cultivo realizado en presencia de SPF-3059-1 fue similar al nivel observado en ausencia de SPF-3059-1. Este resultado demuestra que SPF-3059-1 no presenta actividad inesperada para la proliferación celular. Los ejes longitudinal y lateral en la figura presentan la proliferación celular y la concentración de SPF-3059-1, respectivamente. Además, la desviación estándar (n=4) se añadió a cada columna.

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Ejemplo 10

Efectos de los inhibidores de semaforina SPF-3059-1, SPF-3059-2 y SPF-3059-5 sobre la proliferación celular

El mismo efecto sobre la proliferación celular que en el Ejemplo 9 se examinó para los compuestos, SPF-3059-1, SPF-3059-2 y SPF-3059-5. Los pocillos con estos compuestos sirvieron como muestras, los pocillos con PBS sirvieron como referencia y los pocillos en los que se realizó el experimento sin añadir las células sirvieron como blanco. Se determinó IC_{50} (\mug/ml), índice inhibidor para la proliferación celular, que se calcula mediante la ecuación presentada a continuación.

Índice inhibidor para la proliferación celular (%) = (1 - (absorbancia de un pocillo de muestra - absorbancia del pocillo del blanco)/(absorbancia del pocillo de referencia - absorbancia del pocillo del blanco)) \times 100

Los resultados de la determinación del índice inhibidor para la proliferación celular de los compuestos mencionados anteriormente son los siguientes, demostrando que no se observó ninguna citotoxicidad entre 1.000 y 3.000 veces o incluso a concentraciones superiores en las que pueden observarse actividades inhibidoras de semaforina.

Compuesto	IC_{50} (\mug/ml)

SPF-3059-1	> 300
SPF-3059-2	> 100
SPF-3059-5	> 300

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Ejemplo 11

Actividad inhibidora de la unión Sema3A-receptor

Si SPF-3059-1 inhibe la unión de Sema3A y Neuropilina-1, que es un componente constituyente del complejo receptor Sema3A, se examinaba en el experimento de unión al receptor. La Neuropilina-1 y la plexina A1 son conocidas actualmente como componentes constituyentes de los receptores de Sema3A. Sin embargo, principalmente Neuropilina-1 es conocida porque contribuye a la unión de Sema3A. Sema3A condensada con fosfatasa alcalina (procedente del hombre: resistencia al calor) (Sema3A-AP) se utilizó como ligando en el experimento de unión al receptor y la cantidad unida al receptor se detectó con la actividad de fosfatasa alcalina como índice. Se utilizó Sema3A procedente de ratón. Se generó un gen recombinante en el que se condensó la fosfatasa alcalina desde el aminoácido 758º hasta el lado del terminal C en dicha Sema3A. Este gen recombinante se introdujo a continuación en la célula COS7 donde se expresó y segregó y se preparó Sema3A-AP.

Se llevó a cabo el experimento de unión al receptor como se describe a continuación. Se introdujo el plásmido que expresa Neuropilina-1 (pUCSR\alpha-Neuropilina-1) en células COS7 y se cultivó durante 24 horas. Estas células expresan Neuropilina-1 sobre la superficie celular. Se lavaron las células una vez en solución de tampón HBH (solución salina equilibrada de Hank que contiene HEPES 20 mM, pH 7,2 y 0,5 mg/ml de albúmina de suero bovino) y se añadieron a continuación solución de tampón HBH que contenía Sema3A-AP y SPF-3059-1 de varias concentraciones (0 a 10 \mug/ml) al mismo tiempo. Una vez que se ha dejado durante una hora a temperatura ambiente en agitación, se unió Sema3A-AP a Neuropilina-1 que expresa las células, tras lo cual se eliminó el sobrenadante. Posteriormente, se lavaron seis veces las células en solución de tampón HBH para eliminar el exceso de Sema3A-AP. A continuación se disolvió Sema3A-AP unido a las células con Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, solución al 1% de Triton X-100 (extracto celular). Se eliminaron los materiales insolubles en el extracto celular por centrifugación y a continuación fosfatasa alcalina endógena de la célula se inactivó después de una hora de tratamiento a 65 grados C. Se determinó la actividad de fosfatasa alcalina procedente de Sema3A-AP en el extracto celular (= cantidad de unión de Sema3A-AP). Se mezcló una alícuota del extracto celular con tampón SEAP (dietanolamina 1 M, MgCl_{2} 0,5 mM, L-homoarginina 10 mM) y un sustrato fluorescente (fosfato de p-nitrofenil 10 mM), y se mantuvo caliente a 37 grados C. Se midió a continuación la solución su absorbancia a 405 nm (p-nitrofenol: generada a partir de fosfato p-nitrofenilo con fosfatasa alcalina). Los resultados se presentan en la Fig. 9. Los resultados demuestran que la unión de Sema3A-AP disminuye en función de la concentración con la concentración creciente de SPF-3059-1. Esto demuestra claramente que SPF-3059-1 inhibe la actividad de Sema3A porque el compuesto inhibe la unión de Sema3A a su
receptor.

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Ejemplo 12

Inhibición de la actividad de desplome por contacto de Sema3A y el inhibidor

Se mezcló Sema3A con SPF-3059-1, cuya concentración es lo bastante alta para mostrar la actividad inhibidora (0,25 \mug/ml) (= muestra de premezcla). A continuación se añadió la muestra de premezcla a la solución de cultivo de los ganglios del pedículo dorsal para examinar si se inhibía la actividad de desplome del cono de crecimiento de Sema3A. La cantidad de muestra de premezcla fue un cuarto de la solución de cultivo. Esto significa que la concentración de SPF-3059-1 se diluirá desde 0,25 \mug/ml hasta 0,05 \mug/ml (1/5 veces) cuando la muestra de premezcla se añada a la solución de cultivo de los ganglios del pedículo dorsal. Esta es la concentración a la que la actividad inhibidora no se observará cuando SPF-3059-1 y Sema3A se añaden independientemente. En la Fig. 10 se presentan los resultados. La Fig. 10 demuestra que la actividad de Sema3A se inhibió cuando la muestra de premezcla se añadió a la solución de cultivo y a los ganglios del pedículo dorsal a pesar del hecho de que la concentración final de SPF-3059-1 era 0,05 \mug/ml (concentración de actividad no inhibidora). Esto significa que la actividad de Sema3A se perderá en el momento en que Sema3A y SPF-3059-1 se ponen en contacto. A partir de este resultado, la molécula diana de SPF-3059-1 se cree que es Sema3A.

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Ejemplo 13

Acción promotora de la regeneración de nervios in vivo del inhibidor SPF-3059-1 de semaforina en la transacción del nervio raquídeo conducto corteza cerebral-médula espinal

Se adquirieron ratas Wister macho (de 10 semanas) en Charles River Japan, Inc. y se criaron con alimentación y toma de agua libres en un criadero dedicado. Se utilizaron en el experimento tras aproximadamente una semana de cría previa. Se preparó SPF-3059-1 a 0,1 mg/ml con PBS. Se utilizó PBS como referencia. El agente se llenó en una bomba de presión osmótica (Alzet, modelo 2004, dosis para cuatro semanas, caudal 0,25 \mul/h). Una cánula rellena con la disolución de la muestra se conectó a la bomba y se preincubó en solución salina durante la noche a temperatura ambiente.

Se inyectó pentobarbital (50 mg/kg) a una rata por vía intrapeniana. Se realizaron incisiones en la piel y en los músculos en la zona de la médula espinal torácica dorsal de la rata anestesiada y se expusieron las vértebras T8 a T12. Se practicó una laminectomía en la vértebra torácica T11 al microscopio. Se punzaron un par de tijeras oftalmológicas unidas al manipulador y se insertaron a través de la línea media a una profundidad de 1,5 mm de la superficie de la duramadre, y se practicó una incisión en la trayectoria de la corteza cerebral a la médula espinal y se separó. La abertura de las vértebras se llenó con un gel esponjoso. Se practicó una canulación desde la vértebra T9 que se perforó con un taladro quirúrgico para exponer la duramadre. La parte de la duramadre, a la que la cánula tenía que insertarse, se perforó con una aguja de inyección y el tubo de silicio conectado a la bomba se insertó en ésta. Esto aseguró que el borde de la cánula alcanzaba el área lesionada de la médula espinal T11. A continuación se llenó con gel esponjoso la abertura de la vértebra en la que se infiltró una gota de adhesivo instantáneo quirúrgico. Se fijó la cánula al músculo adyacente con sutura para impedir el deslizamiento. Después de suturar el músculo operado, se practicaron puntos de sutura a la piel incisa junto con grapas de sutura. La muestra fue administrada durante cuatro semanas consecutivas al caudal de muestra de 0,6 \mug/día.

Dos semanas después de la operación, se anestesió a la rata con pentobarbital (50 mg/kg, inyectado por vía intrapeniana) cuya cabeza se fijó al aparato estereotáxico. Se hizo una incisión en el cuero cabelludo a lo largo de la línea media y se perforó el cráneo con un taladro para exponer el cerebro. Se inyectaron 0,1 \mul de DBA al 10% (amina biotinilada con dextrano) en cada uno de los puntos en el área motriz de la corteza cerebral con una microjeringuilla, después de lo cual se suturó la incisión y se recuperó el animal. La DBA se transportará desde el núcleo del nervio hasta la médula espinal a través de los nervios. Después de dos semanas de cría, la rata se anestesió otra vez con pentobarbital y se realizó una incisión en la parte torácica y a continuación se perfundió PBS desde el ventrículo izquierdo. Posteriormente, se perfundió PBS que contiene 200 ml de paraformaldehído al 4%. La médula espinal (incluyendo la parte lesionada) se extrajo y se fijó durante la noche en la solución, que se colocó a continuación en PBS que contiene sacarosa al 30% y se colocó en un baño a 4 grados C. La médula espinal se impregnó en el compuesto OTC y se congeló en nieve carbónica. Se prepararon secciones de 30 \mum en un criostato y se pusieron alícuotas en solución de tampón Tris (TBS). Se lavaron las secciones en TBS y se colocaron en baños en solución de reacción ABC durante dos horas. Una vez lavadas las secciones, se observaron con sustrato DBA y se efectuaron las preparaciones. Las fibras nerviosas regeneradas en el área lesionada se observaron al microscopio. La Fig. 11 presenta el resultado de la inyección de SPF-3050-1 de la presente invención y la Fig. 12 presenta el resultado de la inyección de PBS como referencia. La Fig. 11A, B y C y la Fig. 12A, B y C presentan secciones en serie en la proximal de la zona traumatizada, respectivamente. La Fig. 11D y la Fig. 12D son grandes macrofotografías de la Fig. 11B y la Fig. 12B, respectivamente. Cuando se administró SPF-3059-1, se observó la retención de DBA (cabeza de flecha negra) en la parte del rostro hasta el punto de la lesión presentado en la Fig. 11D. Se observaron muchas fibras positivas a DBA que se extienden desde el área de retención hasta la caudal a lo largo del área lesionada (cabeza de flecha blanca) y fibras nerviosas regeneradas que se extienden eludiendo el punto de incisión se observaron frecuentemente. Por el contrario, cuando se administró PBS, se observó retención de DBA (cabeza de flecha negra) en la parte del rostro hasta el punto de la lesión como se muestra en la Fig. 12D. Se observaron unas pocas fibras positivas a DBA hasta el lado de la cola a lo largo del área lesionada (cabeza de flecha blanca) y solamente se observaron unas pocas fibras nerviosas. Estos resultados pusieron de manifiesto que SPF-3059-1 presenta la acción de activación de regeneración de nervios en ratas adultas del modelo de lesión de médula espinal.

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Ejemplo 14

Producción de los nuevos compuestos de la presente invención

Un medio de 10 ml que contiene 2% de glucosa, 5% de sacarosa, 2% de semillas de algodón en polvo, 0,1% de nitrato sódico, 0,1% de L-histidina, 0,05% de fosfato dipotásico, 0,07% de cloruro potásico y 0,0014% de sulfato magnésico heptahidratado, con su pH ajustado a 7,0, se pipeteó a un matraz Erlenmeyer de 50 ml de volumen y se esterilizó en un autoclave. Una aguja de inoculación de Penicillium sp. SPF-3059 (FERM BP-7663) en cultivo inclinado se inoculó en este medio y se cultivó con agitación a 180 rpm a 27ºC durante 4 días como precultivo. Se pipetearon 125 ml de un medio con la misma composición que el medio mencionado anteriormente en cada uno de los cinco matraces Erlenmeyer de 500 ml de volumen y se esterilizó en un autoclave. Posteriormente, la solución de precultivo mencionada anteriormente se añadió a los cinco matraces en 4 ml a cada uno y se cultivaron con agitación a 180 rpm durante 4 días a 27 grados C. 30 litros de medio que contienen 1,43% de glucosa, 3,57% de sacarosa, 1,43% de semillas de algodón en polvo, 0,07% de nitrato sódico, 0,07% de L-histidina, 0,036% de fosfato dipotásico, 0,05% de cloruro potásico, 0,001% de sulfato magnésico heptahidratado y 0,01% de Adekanol LG-295S (agente de antimoldeo de Asahi Denka Co., Ltd.), con su pH ajustado a 7,0, en un fermentador de vaso de 50 litros de volumen se esterilizó al vapor de alta presión (121 grados C, 20 min.). A continuación se añadieron 500 ml del caldo del cultivo mencionado anteriormente al fermentador y se cultivaron a 27 grados C, durante 9 días con una agitación de 400 rpm y una aireación de 15 litros/min.

Cuando acabó el cultivo, el caldo cultivado se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos para separar el sobrenadante y el micelio. La fracción sobrenadante se extrajo dos veces con 20 litros de acetato de etilo-ácido fórmico (99:1). La fracción del micelio del hongo se extrajo con 30 litros de acetona, y a continuación se filtró y se concentró. Una vez concentrada en solución acuosa, se extrajo con 10 litros de acetato de etilo-ácido fórmico (99:1). Ambos extractos se mezclaron y se concentraron a presión reducida para obtener 224 g de extracto en bruto. 100 g de este extracto en bruto se disolvieron en 500 ml de metanol y se aplicó a una cromatografía en columna con Sephadex (marca registrada) LH-20 (Amersham Biosciences K.K.) y se eluyó con metanol. Se recogieron las fracciones activas y se evaporó el disolvente a presión reducida para obtener 48,8 g de la sustancia aceitosa. Esta sustancia se disolvió a continuación en 400 ml de metanol y se aplicó a una cromatografía en columna utilizando TSKgel TOYOPEARL HW-40F (Tosoh Corporation) y se eluyó con metanol. Se recogieron las fracciones activas y se evaporó el disolvente a presión reducida para obtener 21,8 g de sustancia en bruto. Esta sustancia en bruto se disolvió a continuación en alícuotas de 200 mg en 2 ml de DMSO y se aplicó a una HPLC en fase inversa. Las condiciones de la HPLC de preparación en fase inversa fueron, columna: Wakopak® Wakosil-II5C18HGprep (conexión 5 d.i. x 10 cm y 5 d.i. x 25 cm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), disolución A: solución acuosa al 1% de ácido fórmico, solución B: metanol, gradiente: gradiente lineal durante dos horas desde 45% hasta 75% para la proporción de la solución B, caudal: 25 ml/min. y detección: absorbancia a 260 nm. El eluido se fraccionó durante un
minuto.

Las fracciones eluidas como las descritas anteriormente se analizaron por HPLC analítica. Las condiciones de la HPLC analítica fueron, columna: Wakopak® Wakosil-II5C18RS (4,6\times150 mm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), disolución A: solución acuosa al 1% de ácido fórmico, solución B: metanol, gradiente: gradiente lineal durante 71,1 min. desde 20% hasta 67% para la proporción de la solución B, caudal: 1,3 ml/min., y detección: absorbancia a 260 nm. Las fracciones que contenían el compuesto objetivo se recogieron con el tiempo de retención en esta HPLC analítica como índice y se evaporó el disolvente a presión reducida. El material resultante se aplicó de nuevo a la HPLC de preparación y se purificó de manera similar a la del caso anterior, y se continuó aplicando a una cromatografía en columna utilizando TSKgel TOYOPEARL HW-40F (Tosoh Corporation) y se purificaron de manera similar a como se hizo anteriormente. Las fracciones que contienen el compuesto objetivo se recogieron y se evaporó el disolvente a presión reducida. De este modo, se obtuvieron los compuestos purificados descritos a
continuación.

\newpage

Compuesto	Cantidad obtenida (mg)	Tiempo de retención en la
		HPLC analítica (min.)

SPF-3059-12	6,2	34,4
SPF-3059-24	28,0	34,5
SPF-3059-4	10,2	36,0
SPF-3059-25	4,0	39,3
SPF-3059-34	2,9	40,8
SPF-3059-6	34,9	45,6
SPF-3059-27	17,4	46,1
SPF-3059-26	6,2	46,5
SPF-3059-28	11,8	46,6
SPF-3059-7	13,0	47,0
SPF-3059-39	2,8	49,95
SPF-3059-37	4,0	50,0
SPF-3059-3	118,2	50,1
SPF-3059-35	11,0	51,5
SPF-3059-9	100,9	52,7
SPF-3059-29	45,6	54,0
SPF-3059-36	3,7	57,8
SPF-3059-30	23,5	63,0

Las propiedades fisicoquímicas de los compuestos obtenidos de este modo son las siguientes.

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Compuesto SPF-3059-3

Aspecto: polvo amarillo

Peso molecular: 534

Fórmula molecular: C_{27}H_{18}O_{12}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 535 (M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 533 (M-H)^{-}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido de alta resolución (HRFAB-MS) m/z (M-H)^{+}:

: Valor medido: 535,0905

: Valor calculado: 535,0877 (C_{27}H_{19}O_{12})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 242(30.800), 317(22.700), 367(14.000)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.356, 1.700, 1.652, 1.610, 1.515, 1.475, 1.283

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,28, 2,29, 2,68, 2,69, 4,62, 4,62, 4,64, 4,72, 5,03, 6,38, 6,40, 6,90, 6,91, 7,44, 7,98, 8,54, 8,90-11,10, 12,70

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 16,5, 17,0, 32,3, 32,4, 56,2, 65,8, 68,0, 103,0, 104,2, 108,7, 108,8, 109,4, 113,5, 118,2, 118,6, 122,2, 125,7, 127,5, 129,8, 132,0, 132,6, 137,9, 134,8, 137,6, 138,8, 144,3, 150,5, 150,6, 152,0, 152,6, 154,2, 154,5, 155,5, 156,3, 167,6, 167,7, 173,4, 183,5, 186,2, 199,2, 202,8, 203,0

\newpage

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-3 como la fórmula [20] siguiente (tautómera):

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Compuesto SPF-3059-4

Aspecto: polvo de color crema

Peso molecular: 560

Fórmula molecular: C_{28}H_{16}O_{13}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 561(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 559(M-H)^{-}

: Valor medido: 561,0667

: Valor calculado: 561,0670 (C_{28}H_{17}O_{13})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 221(35.600), 250(38.100), 276sh(25.800), 323(24.300)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.412, 1.665, 1.619, 1.563, 1.465, 1.427, 1.263

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,53 (3H,s), 2,56 (3H,s), 6,84 (1H, d, 2,1), 6,95 (1H, s), 6,96 (1H, d, 2,1), 8,17 (1H, s), 8,52 (1H, s), 10,10-11,40 (3H, brs), 12,71 (1H, brs), 13,26 (1H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 29,2, 32,1, 102,3, 103,2, 110,1, 112,4, 112,8, 119,6, 120,3, 120,8, 126,3, 133,1, 133,4, 136,7, 137,5, 141,7, 150,8, 152,3, 152,7, 152,8, 157,2, 163,9, 167,4, 169,3, 172,2, 172,9, 199,3, 201,0

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

\newpage

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-4 como la fórmula [21] siguiente:

21

SPF-3059-6

Aspecto: polvo de color crema

Peso molecular: 592

Fórmula molecular: C_{29}H_{20}O_{14}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 593(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 591(M-H)^{-}

: Valor medido: 593,0949

: Valor calculado: 593,0932 (C_{29}H_{21}O_{14})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 210sh(45.900), 223(47.700), 317(25.800), 358sh(14.700)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.418, 1.701, 1.617, 1.565, 1.465, 1301

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,22 (3H,s), 2,72 (3H,s), 3,11 (3H, s), 3,98 (2H, brs), 6,78 (1H, s), 6,88 (1H, s), 8,21 (1H, s), 9,00-13,00 (6H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 16,8, 32,4, 57,8, 64,4, 102,1, 102,3, 109,3, 111,9, 118,4, 118,6, 119,1, 119,6, 127,6, 128,2, 131,6, 139,0, 141,6, 142,1, 150,7(2C), 151,9, 152,9, 155,5, 162,0, 167,8, 167,9, 172,4, 174,6, 202,6

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-6 como la fórmula [22] siguiente:

22

SPF-3059-7

Aspecto: polvo amarillo

Peso molecular: 562

Fórmula molecular: C_{28}H_{18}O_{13}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 563(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 561(M-H)^{-}

: Valor medido: 563,0843

: Valor calculado: 593,0826 (C_{28}H_{19}O_{13})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 242(31.600), 312(24.500), 385(10.200)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.424, 1.701, 1.603, 1.504, 1.448, 1420, 1270

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,28, 2,29, 2,68, 2,69, 4,62, 4,67, 4,71, 5,04, 6,38, 6,41, 6,81, 6,92, 6,93, 7,95, 8,52, 9,33, 11,22, 11,35, 12,93

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 16,6, 17,0, 32,3, 32,4, 56,2, 65,7, 67,9, 102,3, 102,8, 103,1, 104,3, 108,7, 109,3, 110,1, 112,5, 112,6, 118,5, 118,7, 121,6, 122,1, 125,9, 127,6, 130,1, 131,9, 132,4, 135,3, 137,4, 137,6, 138,9, 139,7, 151,9, 152,3, 154,5, 155,5, 156,2, 157,1, 163,6, 167,6, 169,3, 172,7, 172,8, 183,7, 186,2, 199,1, 202,5, 202,7

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-7 como la fórmula [23] siguiente (tautómera):

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

SPF-3059-9

Aspecto: polvo amarillo

Peso molecular: 534

Fórmula molecular: C_{27}H_{18}O_{12}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 535(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 533(M-H)^{-}

: Valor medido: 535,0876

: Valor calculado: 535,0877 (C_{27}H_{19}O_{12})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 207(47.600), 243(41.800), 314(34.400), 369(23.000)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.444, 1.702, 1.614, 1.474, 1.289

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,29, 2,31, 2,67, 2,70, 4,60, 4,65, 4,69, 5,97, 6,32, 6,35, 6,89, 6,90, 7,03, 7,17, 7,94, 8,50, 12,50, 9,20-10,80

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 16,6, 17,1, 32,3, 32,4, 56,2, 65,9, 68,2, 102,3, 103,0, 103,2, 103,9, 109,9, 110,0, 110,4, 110,5, 111,9, 112,2, 118,2, 118,6, 120,5, 125,7, 127,7, 130,0, 131,9, 132,4, 134,8, 138,2, 139,1, 140,9, 141,1, 141,5, 150,2, 150,3, 151,7, 152,2, 154,1, 154,6, 154,9, 1588,8, 156,6 167,5, 172,6, 172,7, 183,5, 187,2, 199,3, 202,7, 202,9

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-9 como la fórmula [24] siguiente (tautómera):

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

SPF-3059-12

Aspecto: polvo de color crema

Peso molecular: 560

Fórmula molecular: C_{28}H_{16}O_{13}

: Valor medido: 561,0680

: Valor calculado: 561,0670 (C_{28}H_{17}O_{13})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 232(37.400), 250sh(34.800), 285(28.000), 308sh(23.200), 360sh(9.000)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.080, 1.698, 1.608, 1. 468, 1.291

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,54 (3H,s), 2,55 (3H,s), 6,82 (1H, d, 2,1), 6,87 (1H, s), 6,95 (1H, d, 2,1), 8,22 (1H, s), 8,55 (1H, s), 9,50-13,50 (5H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 29,1, 32,2, 102,1, 103,0, 109,4, 112,1, 113,5, 119,8, 120,0, 121,7, 126,6, 132,0, 133,3, 135,9, 136,7, 141,7, 150,6, 152,1, 153,0, 155,4, 157,6, 162,4, 167,4, 167,6, 172,2, 172,9, 199,1, 201,1

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-12 como la fórmula [25] siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

SPF-3059-24

Aspecto: polvo de color crema

Peso molecular: 532

Fórmula molecular: C_{27}H_{16}O_{12}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 533(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 531(M-H)^{-}

: Valor medido: 531,0621

: Valor calculado: 531,0564 (C_{27}H_{17}O_{12})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 212(36.900), 229sh(34.500), 283(26.300), 323(21.700)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.447, 1.697, 1.629, 1.578, 1.470, 1.290

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,52 (3H,s), 2,54 (3H,s), 6,92 (1H, s), 6,93 (1H, s), 7,28 (1H, s), 8,13 (1H, s), 8,54 (1H, s), 9,50-13,00 (5H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 29,1, 32,3, 102,3, 102,9, 107,9, 110,0, 115,8, 119,8, 120,4, 120,7, 126,5, 133,0, 133,3, 136,0, 141,2, 145,0, 150,4, 151,1, 152,2, 152,9, 153,0, 154,3, 167,5, 172,6, 173,6, 199,1, 201,1

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-24 como la fórmula [26] siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPF-3059-25

Aspecto: polvo de color crema

Fórmula molecular: C_{27}H_{16}O_{11}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 517(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 515(M-H)^{-}

: Valor medido: 517,0778

: Valor calculado: 517,0771 (C_{27}H_{17}O_{11})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 215(35.000), 253(35.100), 276sh(25.200), 323(23.400)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.417, 1.691, 1.625, 1.471, 1.293

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,54 (6H,s), 6,82 (1H, brs), 6,92 (2H, brs), 7,27 (1H, s), 8,14 (1H, s), 8,53 (1H, s), 9,0-14,00 (4H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 29,2, 32,3, 102,9, 103,0, 107,8, 109,9, 113,0, 115,7, 120,4, 120,6, 126,4, 133,3, 133,4, 136,4(2C), 145,0, 151,2, 152,3, 152,98, 153,01, 157,3, 164,2, 169,4, 172,6, 173,6, 199,2, 201,0

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-25 como la fórmula [27] siguiente:

27

SPF-3059-26

Aspecto: polvo de color crema

Peso molecular: 488

Fórmula molecular: C_{26}H_{16}O_{10}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 489(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 487(M-H)^{-}

: Valor medido: 489,0823

: Valor calculado: 489,0822 (C_{26}H_{17}O_{10})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 212(31.500), 235(30.900), 284(23.900), 324(19.500)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.454, 1.694, 1.625, 1517, 1.471, 1.293

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,53 (3H,s), 2,54 (3H,s), 6,91 (1H, s), 6,92 (1H, s), 7,27 (1H, s), 7,47 (1H, s), 8,11 (1H, s), 8,57 (1H, s)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 29,1, 32,2, 102,9, 103,0, 107,9, 108,5, 113,3, 115,7, 119,8, 120,7, 126,3, 132,7, 133,5, 135,8, 144,6, 145,0, 150,8, 151,1, 152,5, 152,9(2C), 154,7, 173,3, 173,6, 199,1, 201,2

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-26 como la fórmula [28] siguiente:

28

SPF-3059-27

Aspecto: polvo amarillo

Peso molecular: 642

Fórmula molecular: C_{33}H_{22}O_{14}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 643(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 641(M-H)^{-}

: Valor medido: 643,1088

: Valor calculado: 643,1089 (C_{33}H_{23}O_{14})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 213(46.100), 246(46.600), 287(31.700), 354(19.900)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.400, 1.694, 1.640, 1604, 1.468, 1.290

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,41 (3H,s), 2,45 (3H,s), 2,67 (3H,s), 6,34 (1H, s), 6,63 (1H,s), 6,90 (1H, s), 7,48 (1H, d, 2,1), 7,97 (1H, d, 2,1), 8,49 (1H, s), 11,9 (1H, brs), 12,5 (1H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 27,4, 30,2, 32,7, 102,3, 102,8, 109,8, 111,8, 117,4, 119,6, 119,7, 120,3, 126,7, 127,5, 128,4, 133,0, 133,4, 135,1, 135,8, 138,6, 139,9, 141,3, 150,5, 151,7, 154,6, 155,8, 157,5, 158,3, 167,5, 172,5, 196,3, 200,0, 201,6, 205,3

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-27 como la fórmula [29] siguiente:

29

SPF-3059-28

Aspecto: polvo de color crema

Peso molecular: 532

Fórmula molecular: C_{27}H_{16}O_{12}

: Valor medido: 533,0735

: Valor calculado: 533,0721 (C_{27}H_{17}O_{12})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 217(35.300), 236(34.100), 309(26.100)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.502, 3.096, 1.690, 1.598, 1.503, 1.434, 1.303

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,39 (3H,s), 2,71 (3H,s), 6,52 (1H, s), 6,85 (1H,d, 2,1), 6,92 (1H, d, 2,1), 6,98 (1H, d, 2,1), 8,25 (1H, s), 9,5-13,5 (5H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 17,3, 32,4, 102,3, 103,3, 110,0, 112,1, 112,3, 113,4, 118,8, 120,6, 127,6, 128,9, 132,1, 136,1, 138,8, 140,9, 150,2, 152,0, 154,1, 157,8, 162,2, 162,6, 167,5, 169,2, 172,5, 175,3, 202,7

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-28 como la fórmula [30] siguiente:

30

SPF-3059-29

Aspecto: polvo de color crema

Peso molecular: 548

Fórmula molecular: C_{28}H_{20}O_{12}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 549(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 547(M-H)^{-}

: Valor medido: 549,1027

: Valor calculado: 549,1034 (C_{28}H_{21}O_{12})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 226(48.900), 316(26.200), 352sh(17.400)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.388, 1.687, 1.662, 1.626, 1.469, 1.296

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,23 (3H,s), 2,72 (3H,s), 3,11 (3H, s), 3,98 (2H, brs), 6,89 (1H,s), 6,93 (1H, s), 7,44 (1H, s), 8,27 (1H, s), 9,00-13,00 (5H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 16,8, 32,4, 57,8, 64,4, 102,3, 103,1, 108,6, 112,0, 113,5, 118,46, 118,48, 119,1, 127,7, 128,1, 131,8, 138,9, 141,8, 144,3, 150,6, 150,7, 151,9, 152,6, 154,2, 162,1, 167,8, 173,5, 174,6, 202,7

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-29 como la fórmula [31] siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

SPF-3059-30

Aspecto: polvo de color crema

Peso molecular: 490

Fórmula molecular: C_{26}H_{18}O_{10}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 491(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 489(M-H)^{-}

: Valor medido: 491,0966

: Valor calculado: 491,0979 (C_{26}H_{19}O_{10})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 206(36.000), 240(32.700), 315(26.500), 372(17.900)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.396, 1.704, 1.618, 1.518, 1.479, 1.294

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,28, 2,30, 2,67, 2,69, 4,62, 4,66, 4,70, 4,96, 6,32, 6,36, 6,90, 6,91, 7,03, 7,17, 7,43, 7,98, 8,54, 9,20-10,80

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 16,5, 17,0, 32,3, 32,4, 56,2, 65,9, 68,3, 103,0, 103,2, 103,8, 108,6, 110,4, 111,8, 113,4, 118,6, 125,6, 127,5, 129,5, 132,1, 132,6, 134,4, 137,9, 138,8, 141,2, 141,5, 144,3, 150,6, 152,0, 152,5, 154,3, 154,6, 154,9, 155,8, 156,6, 172,6, 173,4, 183,5, 187,2, 199,3, 202,7, 202,9

\global\parskip0.940000\baselineskip

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-30 como la fórmula [32] siguiente:

32

SPF-3059-34

Aspecto: polvo amarillo

Peso molecular: 550

Fórmula molecular: C_{27}H_{18}O_{13}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 551(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 549(M-H)^{-}

: Valor medido: 551,0846

: Valor calculado: 551,0826 (C_{27}H_{19}O_{13})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 211(35.600), 240(31.100), 283(24.100), 349(14.500)

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,18 (3H,s), 2,66 (3H,s), 4,39 (1H, d, 11,9), 4,64 (1H, d, 11,9), 6,37 (1H,s), 6,84 (1H, s), 7,09 (1H, s), 8,47 (1H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 16,8, 32,4, 72,5, 80,0, 102,1, 103,0, 109,5, 110,6, 111,1, 117,7, 120,0, 126,5, 131,8, 133,6, 138,6, 141,4, 141,5, 150,5, 151,7, 154,9, 155,0, 156,2, 167,7, 172,6, 188,5, 202,8, 204,0

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-34 como la fórmula [33] siguiente:

33

\newpage

\global\parskip1.000000\baselineskip

SPF-3059-35

Aspecto: polvo de color crema

Peso molecular: 546

Fórmula molecular: C_{28}H_{18}O_{12}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 547(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 545(M-H)^{-}

: Valor medido: 547,0911

: Valor calculado: 547,0877 (C_{28}H_{19}O_{12})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 216(38.600), 237(37.300), 307(30.100), 356sh(8.800)

Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr) cm^{-1}:

: 3.460, 3.076, 1.734, 1.699, 1.629, 1.466, 1.302

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,39 (3H,s), 2,71 (3H,s), 3,82 (3H, s), 6,49 (1H,s), 6,86 (1H, d, 2,1), 6,92 (1H, s), 7,01 (1H, d, 2,1), 8,25 (1H, s), 9,5-13,5(4H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 17,3, 32,4, 52,5, 102,3, 103,6, 110,0, 112,1, 112,8, 113,5, 118,8, 120,6, 127,7, 129,0, 132,1, 134,3, 138,8, 140,9, 150,3, 152,1, 154,1, 157,7, 162,2, 162,8, 167,5, 168,6, 172,6, 175,1, 202,7

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-35 como la fórmula [34] siguiente:

34

SPF-3059-36

Aspecto: polvo de color crema

Peso molecular: 598

Fórmula molecular: C_{32}H_{22}O_{12}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 599(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 597(M-H)^{-}

: Valor medido: 599,1198

: Valor calculado: 599,1190 (C_{32}H_{23}O_{12})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 213(46.300), 246(48.700), 287(33.200), 360(20.000)

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,41 (3H,s), 2,45 (3H,s), 2,66 (3H, s), 6,34 (1H,s), 6,63 (1H, s), 6,90 (1H, s), 7,46 (1H, d, 2,0), 7,46 (1H, s), 7,95 (1H, d, 2,0), 8,52 (1H, s)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 27,3, 30,2, 32,7, 102,8, 103,1, 108,6, 111,7, 113,4, 117,3, 119,6(2C), 126,7, 127,5, 128,5, 133,2, 133,4, 135,1, 135,6, 138,6, 139,7, 144,6, 150,8, 152,1, 154,6, 155,9, 157,5, 158,4, 173,3, 196,3, 200,0, 201,6, 205,2

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-36 como la fórmula [35] siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

SPF-3059-37

Aspecto: polvo amarillo

Peso molecular: 806

Fórmula molecular: C_{41}H_{26}O_{18}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (positivo): 807(M+H)^{+}

Espectro de masas con bombardeo atómico rápido (FAB-MS) m/z (negativo): 805(M-H)^{-}

: Valor medido: 807,1197

: Valor calculado: 807,1198 (C_{41}H_{27}O_{18})

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 219(68.900), 323(30.700), 349(30.600)

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,08 (3H,s), 2,20 (3H,s), 2,53 (3H, s), 3,42 (1H,d, 15,6), 3,56 (1H,d, 15,6), 4,64 (1H,d, 13,4), 4,71 (1H,d, 13,4), 6,27 (1H, s), 6,83 (1H, s), 6,84 (1H, s), 6,88 (1H, s), 8,15 (1H, s), 9,0-13,0 (8H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 16,6, 17,7, 20,0, 32,0, 62,3, 102,1, 102,25, 103,8, 106,0, 108,4, 108,7, 109,9, 111,55, 118,56, 119,2, 119,6, 120,4, 121,7, 127,9, 129,13, 131,1, 139,5, 140,6, 141,00, 141,7, 150,1, 150,23, 150,46, 150,51, 151,6, 152,3, 154,09, 154,17, 158,7, 161,1, 167,7, 168,0, 172,5, 173,2, 175,1, 202,2

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-37 como la fórmula [36] siguiente:

36

SPF-3059-39

Aspecto: polvo amarillo

Peso molecular: 548

Fórmula molecular: C_{27}H_{16}O_{13}

Espectro \lambda_{máx} de absorción UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):

: 223(40.000), 319(23.900), 348(20.100)

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 2,37 (3H,s), 2,71 (3H, s), 6,47 (3H, s), 6,91 (1H, s), 6,98 (1H, s), 8,22 (1H, s), 9,0-13,0 (6H, brs)

^{13}C-RMN (DMSO-d_{6}) \delta ppm:

: 17,3, 32,4, 102,3, 102,7, 109,9, 111,49, 112,4, 118,64, 118,8, 120,5, 127,5, 129,12, 132,1, 138,8, 140,96, 142,5, 150,29, 151,1, 152,0, 152,6, 154,24, 162,1, 167,5, 167,9, 172,6, 175,5, 202,7

Solubilidad:

: Insoluble: agua, hexano

: Soluble: metanol, DMSO

Considerada en conjunto, se determinó la estructura de SPF-3059-39 como la fórmula [37] siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15

Acción inhibidora de los nuevos compuestos de la presente invención para la actividad de desplome de Sema 3A

De manera similar a la del Ejemplo 2, se midieron las acciones inhibidoras de los nuevos compuestos de la presente invención para la actividad de desplome de Sema 3A. Los IC_{50} fueron los siguientes y todos ellos inhibieron fuertemente a Sema 3A.

Compuesto	IC_{50} (\mug/ml)

SPF-3059-3	0,2
SPF-3059-4	2,0
SPF-3059-6	0,1
SPF-3059-7	1,0
SPF-3059-9	0,1
SPF-3059-12	2,0
SPF-3059-24	0,1
SPF-3059-25	4,0
SPF-3059-26	0,2
SPF-3059-27	0,5
SPF-3059-28	2,0
SPF-3059-29	0,1
SPF-3059-30	0,2
SPF-3059-34	0,1
SPF-3059-35	2,0
SPF-3059-36	4,0
SPF-3059-37	< 0,1
SPF-3059-39	0,1

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16

Inhibición de la acción inhibidora del crecimiento de neuritas de Sema3A por el inhibidor

De manera similar a la del Ejemplo 5, se midieron las acciones inhibidoras de los nuevos compuestos de la presente invención para la acción inhibidora del crecimiento de neuritas de Sema3A. Los resultados de la medición se presentan a continuación.

Compuesto	Concentración del compuesto (\mug/ml)

	2	6	20
SPF-3059-2	+++	NT	NT
SPF-3059-3	+++	NT	NT
SPF-3059-5	++	NT	NT
SPF-3059-4	-	+	++

(Continuación)

Compuesto	Concentración del compuesto (\mug/ml)

	2	6	20
SPF-3059-6	++	++	+++
SPF-3059-7	+	+	++
SPF-3059-12	+	+	++
PBS (referencia)	-	-	-

(NT = no analizado)

Este resultado demuestra que la acción inhibidora del crecimiento de neuritas presentada por Sema3A puede ser inhibida persistentemente por los nuevos compuestos de la presente invención.

Ejemplo 17

Determinación de la citotoxicidad de los nuevos compuestos de la presente invención

Se determinaron los efectos de los compuestos para la proliferación celular utilizando células COS7, de manera similar a la del Ejemplo 10. Los resultados de la determinación de la inhibición de la proliferación celular de los nuevos compuestos de la presente invención fueron los siguientes. Se puso de manifiesto que la falta de citotoxicidad se observó a una concentración tan alta como 50 a 1.000 veces la concentración en la que pueden observarse actividades de semaforina.

Presente compuesto	IC_{50} (\mug/ml)

SPF-3059-3	> 100
SPF-3059-4	> 100
SPF-3059-6	> 100
SPF-3059-7	> 100
SPF-3059-9	> 100
SPF-3059-12	> 100
SPF-3059-24	> 100
SPF-3059-29	> 100
SPF-3059-30	> 100

Ejemplo 18

Producción de sales de los compuestos de la presente invención

Un compuesto de la presente invención se disuelve en metanol para preparar una solución 1 mM. La disolución en metanol de hidróxido sódico 1 mM se añade a 1 ml de la disolución anterior por 2 ml cuando un compuesto de la presente invención tiene dos grupos carboxilo y en 1 ml cuando tiene un grupo carboxilo, y se mezcla a fondo. El disolvente de la disolución se evapora a presión reducida y los residuos se secan, y de este modo se obtiene 1 \mumol de la sal sódica de un compuesto de la presente invención.

Aplicabilidad industrial

Los inhibidores de semaforina como ingredientes activos para los promotores de regeneración de nervios de la presente invención presentan la acción promotora de regeneración de nervios periféricos o centrales incluso a baja concentración y presentan acción supresora de la actividad de desplome del cono de crecimiento de semaforina y/o sobre la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas de semaforina en un gel de colágeno. Especialmente, un compuesto inhibidor de semaforina de bajo peso molecular con un peso molecular de 1.000 o inferior se utiliza con ventaja como preventivo o como remedio para varias enfermedades neuropáticas y neurodegenerativas debido a su difusividad molecular significativa, permeabilidad de la membrana, distribución en órganos, permeabilidad de la barrera sangre-cerebro en particular, o similares.

Claims

1. Utilización de un compuesto representado por la fórmula [8] o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita,

38

en la que R^{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alcoxicarbonilo y R^{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo aciloxi y R^{6} y R^{7} están representados por (1) o (2) a continuación:

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

41

en las que R^{1} y R^{2} tienen los mismos significados que en la fórmula [2],

42

en la que R^{1} y R^{2} tienen los mismos significados que en la fórmula [2],

43

44

en las que R^{1} y R^{2} tienen los mismos significados que en la fórmula [2].

2. Utilización del compuesto representado por la fórmula [12] o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita.

45

3. Utilización del compuesto según la reivindicación 2, en la que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representa un grupo hidroxilo en la fórmula [12].

4. Utilización del compuesto según la reivindicación 3, en la que R^{2} representa un grupo hidroxilo en la fórmula [12].

5. Utilización del compuesto según la reivindicación 3, en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo en la fórmula [12].

6. Utilización del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que R^{4} representan un grupo carboxilo en la fórmula [12].

7. Utilización del compuesto según la reivindicación 2, en la que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{2} representa un grupo hidroxilo en la fórmula [12].

8. Compuesto representado por la fórmula [12]

46

en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y [8] pero por lo menos uno de entre R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} está representado por un átomo de hidrógeno, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

9. Compuesto según la reivindicación 8, en el que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

10. Compuesto según la reivindicación 9, en el que R^{2} representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

11. Compuesto según la reivindicación 9, en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que R^{4} representa un grupo carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

13. Compuesto según la reivindicación 8, en el que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{2} representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

14. Utilización de un compuesto representado por la fórmula [13] o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

47

en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y [8], para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita.

15. Utilización del compuesto según la reivindicación 14, en la que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representa un grupo hidroxilo en la fórmula [13].

16. Utilización del compuesto según la reivindicación 15, en la que R^{2} representa un grupo hidroxilo en la fórmula [13].

17. Utilización del compuesto según la reivindicación 15, en la que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representa un grupo hidroxilo en la fórmula [13].

18. Utilización del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en la que R^{4} representa un grupo carboxilo en la fórmula [13].

19. Utilización del compuesto según la reivindicación 14, en la que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo, R^{1} representa un grupo carboxilo y R^{4} representa un átomo de hidrógeno en la fórmula [13].

20. Utilización del compuesto según la reivindicación 14, en la que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{5} representa un grupo hidroxilo en la fórmula [13].

21. Compuesto representado por la fórmula [13]:

48

en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y [8], pero en la que por lo menos uno de entre R^{1}, R^{2} y R^{5} representa un átomo de hidrógeno; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

22. Compuesto según la reivindicación 21, en el que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

23. Compuesto según la reivindicación 22, en el que R^{2} representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

\newpage

24. Compuesto según la reivindicación 22, en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

25. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el que R^{4} representa un grupo carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

26. Compuesto según la reivindicación 21, en el que R^{2} representa un grupo hidroxilo y R^{4} representa un grupo carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

27. Compuesto según la reivindicación 21, en el que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{5} representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

28. Compuesto representado por la fórmula [14] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

49

en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y [8].

29. Compuesto según la reivindicación 28, en el que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

30. Compuesto según la reivindicación 29, en el que R^{2} representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

31. Compuesto según la reivindicación 29, en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

32. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en el que R^{4} representa un grupo carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

33. Compuesto según la reivindicación 28, en el que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

34. Compuesto según la reivindicación 28, en el que R^{1} representa un grupo carboxilo, R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo y R^{3} representa un grupo metoximetilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

35. Compuesto según la reivindicación 28, en el que R^{1} representa un grupo carboxilo o un grupo metoxicarbonilo, R^{4} representa un grupo carboxilo, R^{3} representa un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

36. Compuesto según la reivindicación 35, en el que R^{1} representa un grupo carboxilo o un grupo metoxicarbonilo, R^{4} representa un grupo carboxilo, R^{2} y R^{3} representan un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

37. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, en el que R^{3} está representado por un grupo de fórmula [3] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

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50

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38. Utilización del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 37 o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita.

39. Compuesto representado por la fórmula [15] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

51

en la que R^{4} y R^{5} tienen los mismos significados que en la fórmula [8].

40. Compuesto según la reivindicación 39, en el que R^{5} representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

41. Compuesto según la reivindicación 39 ó 40, en el que R^{4} representa un grupo carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

42. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41 o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita.

43. Compuesto representado por la fórmula [16] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

52

en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} tienen los mismos significados que en la fórmulas [2] y [8].

44. Compuesto según la reivindicación 43, en el que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representa un átomo de hidrógeno o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

45. Compuesto según la reivindicación 43, en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

46. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, en el que R^{4} representa un grupo carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

47. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46 o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios.

48. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 14 a 20, 38, 42 ó 47, en la que el medicamento está destinado a tratar o prevenir enfermedades neuropáticas y/o enfermedades neurodegenerativas.

49. Utilización según la reivindicación 48, en la que las enfermedades neuropáticas y/o enfermedades neurodegenerativas están acompañadas de una lesión de los nervios raquídeos y/o una lesión de los nervios periféricos.

50. Utilización según la reivindicación 48, en la que las enfermedades neuropáticas y/o enfermedades neurodegenerativas son la anomalía olfativa, la neuropatía traumática, la neuropatía de infarto cerebral, la parálisis de los nervios faciales, la neuropatía diabética, el glaucoma, la retinitis pigmentaria, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, las enfermedades neurodegenerativas, la esclerosis lateral hipoplástica muscular, la enfermedad de Lou Gehrig, la corea de Huntington, el infarto cerebral o las enfermedades neurodegenerativas traumáticas.

51. Procedimiento para producir el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que el procedimiento comprende cultivar un hongo productor del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 que pertenece al género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo.

52. Procedimiento para producir el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en el que el procedimiento comprende cultivar un hongo productor del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27 que pertenece al género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo.

53. Procedimiento para producir el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 37, en el que el procedimiento comprende cultivar un hongo productor del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 37 que pertenece al género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo.

54. Procedimiento para producir el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41, en el que el procedimiento comprende cultivar un hongo productor del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41 que pertenece al género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo.

55. Procedimiento para producir el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46, en el que el procedimiento comprende cultivar un hongo productor del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46 que pertenece al género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo.

56. Procedimiento para producir un compuesto de fórmula [12]

53

en el que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y [8], o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

en el que el procedimiento comprende cultivar el hongo productor de compuesto Penicillium sp. SPF-3059 y recoger dicho compuesto del cultivo.

57. Procedimiento para producir un compuesto de fórmula [13]

54

en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y [8], o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

58. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55, en el que el hongo productor que pertenece al género Penicillium es el sp. Penicillium SPF-3059.