ES2577009T3 - Agente terapéutico para daño del nervio sensorial corneal que contiene un inhibidor de semaforina como principio activo - Google Patents

Abstract

Un agente que comprende, como ingrediente activo, un compuesto representado por la fórmula (1) siguiente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:**Fórmula** en donde R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo carboxilo; R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo; R3 representa un átomo de hidrógeno o un grupo carboxilo; y R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo; para uso en un método que es: (i) un método para el tratamiento o la prevención de la neuropatía sensorial causada por enfermedad corneal o cirugía corneal; o (ii) un método para promover la regeneración del nervio sensorial corneal. en donde el compuesto representado por la fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra por vía parenteral tópicamente en los ojos.

Description

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Además, el compuesto de xantona usado en la presente invención es químicamente estable en extremo en una solución acuosa tal como un tampón fosfato. Cuando el presente compuesto de xantona se usa para tratamiento o prevención de la neuropatía sensorial causada por enfermedad corneal o cirugía corneal, o como promotor de la regeneración, la forma más preferible de uso es mediante administración de gotas oftálmicas. Por consiguiente, se ha precisado que el compuesto de xantona usado en la presente invención es extremadamente preferible porque es estable en las lágrimas o en la córnea después de su administración en forma de gotas oftálmicas.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1] La Fig. 1 es una vista que muestra los resultados obtenidos midiendo la longitud de una fibra nerviosa regenerada en una córnea trasplantada por queratoplastia en el Ejemplo 1, a saber, un injerto de córnea [ensayo t de Student, comparación con un grupo testigo, *: p < 0,01]. El eje longitudinal indica el total de las longitudes de las fibras regeneradas. El eje horizontal indica un grupo de administración de vinaxantona (SPF-3059-5) y un grupo testigo (al que sólo se administró disolvente sin contener fármacos). A partir de la Fig. 1, se encuentra que la regeneración de las fibras nerviosas en el injerto de córnea se ha promovido por administración de vinaxantona.

[Fig. 2] Fig. 2 es una vista que muestra los resultados obtenidos midiendo la sensibilidad corneal en la porción central de un injerto de córnea usando un estesiómetro corneal Cochet-Bonnet cada semana después de la finalización de la cirugía, donde esta medición se llevó a cabo para evaluar la función del nervio regenerado en el Ejemplo 1 [ensayo U de Mann-Whitney, comparación con un grupo testigo, *: p < 0,01]. El eje longitudinal indica el nivel de sensibilidad corneal. El eje horizontal indica los resultados obtenidos 1 semana, 2 semanas, y 3 semanas después de la finalización del trasplante. En la Fig. 2, el círculo con relleno (●) indica un grupo de administración de vinaxantona, y el círculo sin relleno (○) indica un grupo testigo al que sólo se administró disolvente sin contener fármacos. A partir de la Fig. 2, se encuentra que la sensibilidad corneal mejoró por administración de vinaxantona. Como resultado de la mejora de la sensibilidad corneal, se encuentra que el nervio regenerado en el Ejemplo 1 fue principalmente el nervio sensorial corneal.

[Fig. 3] La Fig. 3 es una vista que muestra los resultados obtenidos midiendo el número de vasos sanguíneos que se han formado recientemente en el injerto de córnea trasplantado en el Ejemplo 1 [ensayo t de Student, no se encontró diferencia significativa en comparación con un grupo testigo]. El eje longitudinal indica un total de longitudes de los vasos sanguíneos recién formados. El eje horizontal indica un grupo de administración de vinaxantona (SPF-3059-5) y un grupo testigo (al que sólo se administró disolvente sin contener fármacos). A partir de la Fig. 3, se encuentra que la nueva formación de vasos sanguíneos en el injerto de córnea no fue promovido por administración de vinaxantona.

[Fig. 4] La Fig. 4 es una vista que muestra los resultados obtenidos midiendo la retención de vinaxantona en la córnea después de la administración en forma de gota oftálmica, donde la concentración de la solución de vinaxantona se ajustó a 0,5 mg/mL en el Ejemplo 2. La línea discontinua indica el valor de CI50 (75 ng/mL = 130 nM) obtenido en el experimento in vitro. El eje longitudinal indica la concentración de la vinaxantona retenida (ng/g). El número en el eje horizontal indica el nivel de retención de vinaxantona una vez que ha pasado cierto periodo de tiempo (p.ej. el número 0,5 indica el nivel de retención 0,5 horas después de la administración, el número 2 indica el nivel de retención 2 horas después de la administración, y el número 6 indica el nivel de retención 6 horas después de la administración). A partir de la Fig. 4, se encuentra que la vinaxantona que se había administrado a una concentración de 0,5 mg/mL en forma de gota oftálmica era retenida durante 0,5 horas después de la administración a una concentración en la córnea que se consideró que era necesaria para la expresión de los efectos del fármaco.

[Fig. 5] Al igual que la Fig. 4, la Fig. 5 es una vista que muestra los resultados obtenidos midiendo la retención de vinaxantona en la córnea después de la administración en forma de gota oftálmica, donde la concentración de la solución de vinaxantona se ajustó a 1,5 mg/mL en el Ejemplo 2.

[Fig. 6] Al igual que la Fig. 4, la Fig. 6 es una vista que muestra los resultados obtenidos midiendo la retención de vinaxantona en la córnea después de la administración en forma de gota oftálmica, donde la concentración de la solución de vinaxantona se ajustó a 5,0 mg/mL en el Ejemplo 2.

[Fig. 7] La Fig. 7 es una vista que muestra los resultados obtenidos midiendo la estabilidad de un compuesto de xantona en PBS (tampón fosfato) en el Ejemplo 10. El eje horizontal indica el nombre de cada compuesto usado en la medición. El eje longitudinal indica el porcentaje residual de cada compuesto. A partir de la Fig. 7, se encuentra que todos los compuestos de xantona excluidos de la fórmula (1) se descomponían casi por completo, mientras que los compuestos de xantona incluidos en la fórmula (1) permanecían en un porcentaje residual de 90% o más.

[Fig. 8] La Fig. 8 es una vista que muestra los resultados obtenidos midiendo un cambio a lo largo del tiempo en la estabilidad de la vinaxantona (SPF-3059-5) y SPF-3059-1 en PBS (tampón fosfato) en el Ejemplo 11. El eje horizontal indica el número de días que cada compuesto se conservaba después de la disolución. El eje longitudinal indica el porcentaje residual de cada compuesto. En la Fig. 8, el triángulo con relleno (▲) indica un cambio a lo largo del tiempo en la estabilidad de vinaxantona, y el círculo con relleno (●) indica un cambio a lo largo del tiempo en la estabilidad de SPF-3059-1. A partir de la Fig. 8, se encuentra que SPF-3059-1 se descomponía casi por completo

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Ejemplos de "neuropatía sensorial" en la expresión "la neuropatía sensorial causada por enfermedad corneal o cirugía corneal" incluyen reducción en el sentido del tacto y la sensación del dolor. La falta de reflejo de parpadeo es causada por falta de percepción, y ello puede dar como resultado ojos secos, globos oculares lesionados, etc. Por consiguiente, la "neuropatía sensorial" también incluye ojos secos. Hay que señalar que la expresión "nervio sensorial" se refiere a la distribución de los nervios sensoriales en la córnea, y por lo tanto, tiene el mismo significado que el nervio trigémino itinerante en la córnea (el nervio oftálmico itinerante en la córnea), a saber, el nervio sensorial corneal.

La expresión "promotor de la regeneración del nervio sensorial corneal" se usa para referirse a un fármaco que tiene la acción de promover la regeneración del nervio sensorial corneal. La expresión "acción de promover la regeneración del nervio sensorial corneal" se usa para referirse a la acción de promover la regeneración del nervio sensorial corneal que ha resultado desconectado o dañado por cirugía corneal o similares.

En el compuesto representado por la fórmula (1), R1 y R3 representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo, o un grupo alcoxicarbonilo. Ejemplos de un grupo alcoxicarbonilo preferido incluyen grupos alcoxicarbonilo que contienen 2 a 4 átomos de carbono, tal como un grupo metoxicarbonilo, un grupo etoxicarbonilo, o un grupo propoxicarbonilo. Entre ellos, es más preferible un grupo metoxicarbonilo. Como R1, es preferible un átomo de hidrógeno o un grupo carboxilo, y de estos, es más preferible un grupo carboxilo. Como R3, es preferible un átomo de hidrógeno o un grupo carboxilo, y de estos, es más preferible un grupo carboxilo.

R2 y R4 representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, o un grupo aciloxi. Ejemplos de un grupo aciloxi preferido incluyen grupos aciloxi que contienen 2 a 4 átomos de carbono, tales como un grupo acetoxi, un grupo propioniloxi, un grupo butiriloxi, o un grupo isobutiriloxi. Entre ellos, es más preferible un grupo acetoxi. Como R2, es preferible un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo, y de estos, es más preferible un grupo hidroxilo. Como R4, es preferible un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo, y de estos, es más preferible un grupo hidroxilo.

Ejemplos específicos del compuesto representado por la fórmula (1) incluyen: SPF-3059-2 en el que R1 es un grupo carboxilo, R2 es un grupo hidroxilo, R3 es un átomo de hidrógeno, y R4 es un grupo hidroxilo; SPF-3059-4 en el que R1 es un grupo carboxilo, R2 es un grupo hidroxilo, R3 es un grupo carboxilo, y R4 es un átomo de hidrógeno; SPF3059-5 en el que R1 es un grupo carboxilo, R2 es un grupo hidroxilo, R3 es un grupo carboxilo, y R4 es un grupo hidroxilo; SPF-3059-12 en el que R1 es un grupo carboxilo, R2 es un átomo de hidrógeno, R3 es un grupo carboxilo, y R4 es un grupo hidroxilo; SPF-3059-24 en el que R1 es un átomo de hidrógeno, R2 es un grupo hidroxilo, R3 es un grupo carboxilo, y R4 es un grupo hidroxilo; SPF-3059-25 en el que R1 es un átomo de hidrógeno, R2 es un grupo hidroxilo, R3 es un grupo carboxilo, y R4 es un átomo de hidrógeno; y SPF-3059-26 en el que R1 es un átomo de hidrógeno, R2 es un grupo hidroxilo, R3 es un átomo de hidrógeno, y R4 es un grupo hidroxilo. Entre estos compuestos, SPF-3059-5 es el más preferible. SPF-3059-5 también se conoce como vinaxantona.

Como sal farmacéuticamente aceptable del compuesto representado por la fórmula (1), son preferibles una sal sódica, un a sal potásica, y una sal de calcio porque estas sales tienen una solubilidad mejorada en agua y el pH de la solución no necesita ser ajustado. Entre estas sales, la más preferible es una sal sódica.

El compuesto representado por la fórmula (1) se puede obtener por cultivo o síntesis química total de Penicillium sp. cepa SPF-3059, o por conversión química de acuerdo con un método sintético conocido usando un producto obtenido por el cultivo o la síntesis total ya mencionados como material de partida.

Es decir, en el caso de aplicar un método de cultivo, el compuesto representado por la fórmula (1) se puede obtener de forma eficaz cultivando un moho perteneciente a Penicillium sp. aislado de la tierra en la prefectura de Osaka, es decir, una cepa SPF-3059 [en donde esta cepa se depositó bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes, con la Depositaria de Microorganismos para Patentes del NITE, el Instituto Nacional de Ciencia Industrial y Tecnología Avanzadas, una Institución Administrativa Independiente bajo el Ministerio de Economía, Comercio e Industria de Japón (AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón, código postal: 305-8566), con nº de acceso. FERM BP-7663 a 13 de julio de 2001]. Expresamente, el compuesto representado por la fórmula (1) se puede obtener de acuerdo con el método descrito en la Publicación Internacional WO02/09756 (la bibliografía de patentes mencionada anteriormente 1) o en la Publicación Internacional WO03/062243 (la bibliografía de patentes mencionada anteriormente 2).

En el caso de aplicar síntesis total, el compuesto representado por la fórmula (1) se puede obtener de acuerdo con el método descrito en JP 2008-13530 A.

Entre los compuestos representados por la fórmula (1), un compuesto en el que al menos uno de R1 y R3 representa un grupo alcoxicarbonilo o al menos uno de R2 y R4 representa un grupo aciloxi se puede sintetizar efectuando una esterificación conocida sobre el compuesto representado por la fórmula (1) en la que el grupo alcoxicarbonilo concernido es un grupo carboxi, usado como material de partida, y/o efectuando una acilación conocida sobre el compuesto representado por la fórmula (1) en al que el grupo aciloxi concernido es un grupo hidroxilo, usado como material de partida, con lo que se efectúa la conversión química del compuesto. Dicha esterificación o acilación

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un total de las longitudes de las mismas, y luego se hizo una comparación entre el grupo de administración de vinaxantona y el grupo control.

A partir de los resultados mostrados en la Fig. 3, se constató que la vascularización de la córnea en el injerto no fue promovida en el grupo de administración de vinaxantona, en comparación con el grupo control.

Estos resultados demostraron que vinaxantona promueve la regeneración del nervio sensorial corneal desconectado, y también promueve la recuperación de la función nerviosa, es decir, la sensibilidad corneal. Además, se hizo evidente que vinaxantona no promueve la vascularización de la córnea, que es un fenómeno perjudicial.

Ejemplo 2

Evaluación de la retención de la preparación de vinaxantona en tejidos de la córnea

A conejos (Kbs: JW, sanos, machos, peso corporal: 2,00 a 2,49 kg) se administraron a cada uno 50 µL de una solución en PBS (tampón fosfato 0,12 M (pH 7,4)) de vinaxantona (0,5, 1,5 y 5,0 mg/mL) por administración de gotas oftálmicas sobre la córnea del ojo derecho, y sus ojos se cerraron a continuación durante 30 segundos. Después de esto, 0,5, 2, y 6 horas después de completar la administración, los conejos se sometieron a eutanasia y, a continuación, los globos oculares extirpados se lavaron con una solución salina normal. Después de esto, se recogió la córnea de cada globo ocular. Se homogeneizó la córnea y luego se extrajo vinaxantona de ella. Se examinó un cambio con el tiempo en el contenido y la concentración de vinaxantona en los tejidos corneales usando HPLC.

Por los resultados mostrados en las Figs. 4, 5, y 6, se confirmó que vinaxantona se transfirió a los tejidos corneales de una manera dependiente de la concentración/dosis aplicada. En el grupo de administración de la solución de 5,0 mg/mL de vinaxantona, se confirmó que vinaxantona se retenía en la córnea en una cantidad mayor que el valor IC50 (75 ng/ml = 130 nM, que se muestra la línea de puntos en cada figura) obtenido por un experimento in vitro (un experimento con respecto a la actividad inhibidora sobre la actividad de colapso de Sema3A en el Ejemplo 4), incluso 6 horas después de finalizar la administración. Se hizo evidente que la concentración de vinaxantona en la córnea, que se considera que es necesaria para la expresión de efectos de los medicamentos, se puede lograr incluso por administración de gotas en los ojos.

Como resultado, se sugirió que administración de gotas para los ojos es un método realista de la administración de vinaxantona.

Ejemplo 3

Producción del compuesto de xantona representado por la fórmula (1)

Los compuestos de xantona representados por la fórmula (1) de la presente invención son todos ellos compuestos conocidos, y se describen en la publicación internacional WO02/09756 (la bibliografía de patentes mencionada anteriormente 1), publicación internacional WO03/062243 (la bibliografía de patentes mencionada anteriormente 2), publicación internacional WO03/062440 (la bibliografía de patentes mencionada anteriormente 3), JP 2006-335683 A, y JP 2008-13530 A. Los presentes compuestos de xantona pueden ser producidos por cultivo, síntesis total química, o conversión química de la cepa SPF-3059. Además de los métodos de producción, las propiedades fisicoquímicas de los compuestos también se describen en la literatura de patentes antes mencionada. El método de producción y similares son concretamente como sigue.

Se vertieron 10 ml de un medio que contenía 2% de glucosa, 5% de sacarosa, 2% de polvo de semillas de algodón, 0,1% de nitrato de sodio, 0,1% de L-histidina, 0,05% de fosfato dipotásico, 0,07% de cloruro de potasio y 0,0014% de sulfato de magnesio heptahidratado, que se había ajustado para tener pH 7,0, en un matraz Erlenmeyer de 50 ml de capacidad, y después se esterilizó en un autoclave. En el medio resultante, se inoculó un asa de platino de la cepa SPF-3059 (FERM BP-7663) de Penicillium sp en cultivo inclinado, y la mezcla obtenida se sometió entonces a un cultivo de agitación rotatoria a 27 ° C a 180 rpm durante 4 días para obtener una pre-pre-cultivo. En cada uno de cinco matraces Erlenmeyer de 500 ml de capacidad, se vertieron 125 ml de un medio con la misma composición que se ha descrito anteriormente, y después se esterilizaron en un autoclave. A cada uno de los medios resultantes, se añadieron 4 ml de medio de pre-pre-cultivo y se les sometió entonces a un cultivo con agitación rotatoria a 27°C a 180 rpm durante 4 días para obtener un pre-cultivo. En un fermentador de jarra de 50 L de capacidad se vertieron 30 L de un medio que contenía 1,43% de glucosa, 3,57% de sacarosa, 1,43% de polvo de semilla de algodón, 0,07% de sulfato de sodio, 0,07% de L-histidina, 0,036% de fosfato dipotásico, 0,05% de cloruro de potasio, 0,001% de sulfato de magnesio heptahidratado y 0,01% de Adekanol LG-295 (un agente antiespumante, fabricado por ADEKA Corporation), que se había ajustado para estar a pH 7,0, y se después se sometió a esterilización con vapor de alta presión (121°C, 20 minutos). Después de esto, se añadieron 500 ml del medio de pre-cultivo descrito anteriormente al medio resultante, y la mezcla obtenida se sometió a cultivo con agitación y ventilación a 27°C a 400 rpm a un volumen de ventilación de 15 L/min durante 9 días.

Después de la terminación del cultivo, el medio de cultivo se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos para separar un sobrenadante de una masa de células. La fracción sobrenadante se extrajo dos veces con 20 L de acetato de etilo-ácido fórmico (99:1). La fracción de la masa de células se extrajo con 30 L de acetona, y a

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continuación se filtró y se concentró. La solución acuosa resultante se extrajo con 10 L de acetato de etilo-ácido fórmico (99:1). Los dos extractos anteriores se mezclaron entre sí, y la mezcla obtenida se sometió luego a concentración al vacío para obtener 224 g de un extracto bruto. Se disolvieron 100 g del extracto crudo en 500 ml de etanol. Después, la solución obtenida se sometió a cromatografía en columna utilizando Sephadex (marca registrada) LH-20 (GE Healthcare), y se eluyó a continuación con metanol. Las fracciones activas se reunieron, y el disolvente se separó por destilación a continuación a presión reducida para obtener 48,8 g de un producto oleoso. El producto oleoso obtenido se disolvió en 400 ml de metanol. A continuación, el producto resultante se sometió a cromatografía en columna usando gel TSK TOYOPEARL HW-40F (Tosoh Corporation), y después se eluyó con metanol. Las fracciones activas se reunieron, y el disolvente se separó por destilación a presión reducida para obtener 21,8 g de un producto purificado en forma tosca. Este producto se disolvió en porciones de 200 mg cada vez en 2 ml de dimetil sulfóxido (DMSO), y la solución obtenida se sometió entonces a HPLC de separación de fase inversa. Las condiciones para la HPLC de separación de fase inversa fueron los siguientes. Columna: Wakopak-Wakosil (marca registrada) -II5C18HGprep (5 cm de diámetro x 10 cm conectadas con 5 cm de diámetro x 25 cm, fabricada por Wako Pure Chemical Industries Ltd.), eluyente A: 1% de solución acuosa de ácido fórmico, eluyente B: metanol, gradiente: un gradiente lineal en el que el porcentaje de la solución B era 45% → 75% durante 2 horas, caudal: 25 ml/min, y detección: absorbancia a 260 nm. El eluyente se separó cada minuto.

Las fracciones así separadas se analizaron por HPLC analítica. Las condiciones para el análisis HPLC fueron las siguientes. Columna: Wakopak-Wakosil (marca registrada) -II5C18RS (4,6 mm de diámetro x 150 mm, fabricado por Wako Pure Chemical Industries Ltd.), eluyente A: 1% de solución acuosa de ácido fórmico, eluyente B: metanol, gradiente: un gradiente lineal en el que el porcentaje de la solución B era 20% → 67% durante 71,1 horas, caudal: 1,3 ml/min, y detección: absorbancia a 260 nm. Usando el tiempo de retención en esta HPLC analítica como un indicador, se reunieron las fracciones de elución de HPLC de separación, y el disolvente se separó por destilación a presión reducida. El residuo se sometió a HPLC de separación de nuevo, y la purificación se llevó a cabo entonces de la misma manera descrita anteriormente. El producto resultante se sometió adicionalmente a cromatografía en columna utilizando TSKgel TOYOPEARL HW-40F (Tosoh Corporation), y la purificación se llevó a cabo de la misma manera que la descrita anteriormente. El disolvente se separó por destilación a presión reducida, y el residuo se secó luego para obtener un producto purificado del compuesto deseado.

Los compuestos obtenidos concretamente y sus propiedades físico-químicas son las siguientes.

SPF-3059-2

 Apariencia: polvo de color crema

 Espectro de masas por bombardeo de electrones de alta resolución y alta velocidad (HRFAB-MS) m/z (M+H)+: Valor de medición real: 533,0710, Valor teórico: 533,0721

 Fórmula molecular: C27H16O12

 Espectro de absorción ultravioleta-visible λmax (en metanol) nm (ε): 209 (40.600), 236 (42.600), 283 (28.500), 323 (25.400)

 Espectro de absorción infrarroja vmax (KBr)cm-1: 3266, 1678, 1654, 1623, 1562, 1471, 1296

 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm: 2,53 (6H, s), 6,93 (1H, s), 6,95 (1H, s), 7,47 (1H, s), 8,15 (1H, s), 8,54 (1H, s), 9,38 (1H, s ancho), 9,89 (1H, s ancho), 10,78 (1H, s ancho), 11,37 (1H, s ancho), 12,68 (1H, s ancho)

 13C-NMR(DMSO-d6) δ ppm: 29,1, 32,1, 102,3, 103,1, 108,7, 112,5, 113,5, 119,6, 119,8, 120,9, 126,2, 132,4, 133,6, 136,1, 141,7, 144,5, 150,71,150,74, 152,49, 152,54, 152,7, 154,4, 167,4, 172,9, 173,4, 199,2, 201,2

Sobre la base de los datos anteriores, la fórmula estructural del compuesto SPF-3059-2 se determinó que era la siguiente fórmula (2).

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SPF-3059-4  Apariencia: polvo de color crema  Peso molecular: 560  Fórmula molecular: C28H16O13  Espectro de masas por bombardeo de electrones a alta velocidad (FAB-MS) m/z (positivo): 561 (M+H)+  Espectro de masas por bombardeo de electrones a alta velocidad (FAB-MS) m/z (negativo): 559 (M-H) Espectro de masas por bombardeo de electrones de alta resolución y alta velocidad (HRFAB-MS) m/z

(M+H)+: Valor de medición real: 561,0667, Valor teórico: 561,0670 (C28H17O13)

 Espectro de absorción ultravioleta-visible λmax (en metanol) nm (ε): 221 (35.600), 250 (38.100), 276 hombro (25.800), 323 (24.300)  Espectro de absorción infrarroja vmax (KBr)cm-1: 3412, 1665, 1619, 1563, 1465, 1427, 1263  1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm: 2,53 (3H, s), 2,56 (3H, s), 6,84 (1H, d, 2,1), 6,95 (1H, s), 6,96 (1H, d, 2,1), 8,17

(1H, s), 8,52 (1H, s), 10,10-11,40 (3H, s ancho), 12,71 (1H, s ancho), 13,26 (1H, s ancho)

 13C-NMR(DMSO-d6) δ ppm: 29,2, 32,1, 102,3, 103,2, 110,1, 112,4, 112,8, 119,6, 120,3, 120,8, 126,3, 133,1, 133,4, 136,7, 137,5, 141,7, 150,8, 152,3, 152,7, 152,8, 157,2, 163,9, 167,4, 69,3, 172,2, 172,9, 199,3, 201,0  Solubilidad: Insoluble en agua y hexano, soluble en metanol y DMSO

Sobre la base de los datos anteriores, la fórmula estructural del compuesto SPF-3059-4 se determinó que era la siguiente fórmula (3).

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SPF-3059-5 (vinaxantona)  Apariencia: polvo de color crema  Espectro de masas por bombardeo de electrones de alta resolución y alta velocidad (HRFAB-MS) m/z

(M+H)+: Valor de medición real: 577,0615, Valor teórico: 577,0619  Fórmula molecular: C28H16O14  Espectro de absorción ultravioleta-visible λmax (en metanol) nm (ε): 229 (35.800), 284 (22.600), 322

(21.000)

 Espectro de absorción infrarroja vmax (KBr)cm-1: 3260, 1684, 1626, 1567, 1467, 1288

 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm: 2,53 (3H, s), 2,55 (3H, s), 6,93 (1H, s), 6,96 (1H, s), 8,17 (1H, s), 8,53 (1H, s), 9,5-13,0 (6H)

 13C-NMR(DMSO-d6) δ ppm: 29,1, 32,1, 102,26, 102,32, 109,9, 112,4, 119,6, 119,8, 120,3, 120,9, 126,3, 132,5, 133,4, 136,2, 141,2, 141,7, 150,4, 150,8, 152,1, 152,68, 152,73, 154,5, 167,4, 167,5, 172,5, 172,9, 199,1, 201,1

Sobre la base de los datos anteriores, la fórmula estructural del compuesto SPF-3059-5 (vinaxantona) se determinó que era la siguiente fórmula (4).

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SPF-3059-12

5  Apariencia: polvo de color crema  Peso molecular: 560  Fórmula molecular: C28H16O13  Espectro de masas por bombardeo de electrones a alta velocidad (FAB-MS) m/z (positivo): 561 (M+H)+  Espectro de masas por bombardeo de electrones a alta velocidad (FAB-MS) m/z (negativo): 559 (M-H)

10  Espectro de masas por bombardeo de electrones de alta resolución y alta velocidad (HRFAB-MS) m/z

(M+H)+: Valor de medición real: 561,0680, Valor teórico: 561,0670 (C28H17O13)  Espectro de absorción ultravioleta-visible λmax (en metanol) nm (ε): 232 (37.400), 250 hombro (34.800), 285 (28.000), 308 hombro (23.200), 360 hombro (9.000)

 Espectro de absorción infrarroja vmax (KBr)cm-1: 3080, 1698, 1608, 1468, 1291

15  1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm: 2,54 (3H, s), 2,55 (3H, s), 6,82 (1H, d, 2,1), 6,87 (1H, s), 6,95 (1H, d, 2,1), 8,22 (1H, s), 8,55 (1H, s), 9,50-13,50 (5H, s ancho)  13C-NMR(DMSO-d6) δ ppm: 29,1, 32,2, 102,1, 103,0, 109,4, 112,1, 113,5, 119,8, 120,0, 121,7, 126,6, 132,0,

133,3, 135,9, 136,7, 141,7, 150,6, 152,1, 153,0, 155,4, 157,6, 162,4, 167,4, 167,6, 172,2, 172,9, 199,1, 201,1  Solubilidad: Insoluble en agua y hexano, soluble en metanol y DMSO 20 Sobre la base de los datos anteriores, la fórmula estructural del compuesto SPF-3059-12 se determinó que era la siguiente fórmula (5).

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SPF-3059-24  Apariencia: polvo de color crema

25  Peso molecular: 532  Fórmula molecular: C27H16O12  Espectro de masas por bombardeo de electrones a alta velocidad (FAB-MS) m/z (positivo): 533 (M+H)+  Espectro de masas por bombardeo de electrones a alta velocidad (FAB-MS) m/z (negativo): 531 (M-H)

 Espectro de masas por bombardeo de electrones de alta resolución y alta velocidad (HRFAB-MS) m/z

(M+H)+: Valor de medición real: 531,0621, Valor teórico: 531,0564 (C27H17O12)  Espectro de absorción ultravioleta-visible λmax (en metanol) nm (ε): 212 (36.900), 229 hombro (34.500), 283 (26.300), 323 (21.700)

5  Espectro de absorción infrarroja vmax (KBr)cm-1: 3447, 1697, 1629, 1578, 1470, 1290

 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm: 2,52 (3H, s), 2,54 (3H, s), 6,92 (1H, s), 6,93 (1H, s), 7,28 (1H, s), 8,13 (1H, s), 8,54 (1H, s), 9,50-13,00 (5H, s ancho)  13C-NMR (DMSO-d6) δ ppm: 29,1, 32,3, 102,3, 102,9, 107,9, 110,0, 115,8, 119,8, 120,4, 120,7, 126,5,

133,0, 133,3, 136,0, 141,2, 145,0, 150,4, 151,1, 152,2, 152,9, 153,0, 154,3, 167, 172,6, 173,6, 199,1, 201,1 10  Solubilidad: Insoluble en agua y hexano, soluble en metanol y DMSO Sobre la base de los datos anteriores, la fórmula estructural del compuesto SPF-3059-24 se determinó que era la siguiente fórmula (6).

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SPF-3059-25

15  Apariencia: polvo de color crema  Fórmula molecular: C27H16O11  Espectro de masas por bombardeo de electrones a alta velocidad (FAB-MS) m/z (positivo): 517 (M+H)+  Espectro de masas por bombardeo de electrones a alta velocidad (FAB-MS) m/z (negativo): 515 (M-H) Espectro de masas por bombardeo de electrones de alta resolución y alta velocidad (HRFAB-MS) m/z

20 (M+H)+: Valor de medición real: 517,0778, Valor teórico: 517,0771 (C27H17O11)

 Espectro de absorción ultravioleta-visible λmax (en metanol) nm (ε): 215 (35.000), 253 (35.100), 276 hombro (25.200), 323 (23.400)  Espectro de absorción infrarroja vmax (KBr)cm-1: 3417, 1691, 1625, 1471, 1293  1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm: 2,54 (6H, s), 6,82 (1H, s ancho), 6,92 (2H, s ancho), 7,27 (1H, s), 8,14 (1H, s),

25 8,53 (1H, s), 9,5-14,0 (4H, s ancho)

 13C-NMR(DMSO-d6) δ ppm: 29,2, 32,3, 102,9, 103,0, 107,8, 109,9, 113,0, 115,7, 120,4, 120,6, 126,4, 133,3, 133,4, 136,4 (2c), 145,0, 151,2, 152,3, 152,98, 153,01, 157,3, 164,2, 169,4, 172,6, 173,6, 199,2, 201,0  Solubilidad: Insoluble en agua y hexano, soluble en metanol y DMSO

Sobre la base de los datos anteriores, la fórmula estructural del compuesto SPF-3059-25 se determinó que era la siguiente fórmula (7).

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SPF-3059-26

5  Apariencia: polvo de color crema  Peso molecular: 488  Fórmula molecular: C26H16O10  Espectro de masas por bombardeo de electrones a alta velocidad (FAB-MS) m/z (positivo): 489 (M+H)+  Espectro de masas por bombardeo de electrones a alta velocidad (FAB-MS) m/z (negativo): 487 (M-H)

10  Espectro de masas por bombardeo de electrones de alta resolución y alta velocidad (HRFAB-MS) m/z

(M+H)+: Valor de medición real: 489,0823, Valor teórico: 489,0822 (C26H17O10)  Espectro de absorción ultravioleta-visible λmax (en metanol) nm (ε): 212 (31.500), 235 (30.900), 284 (23.900), 324 (19.500)

 Espectro de absorción infrarroja vmax (KBr)cm-1: 3454, 1694, 1625, 1517, 1471, 1293

15  1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm: 2,53 (3H, s), 2,54 (3H, s), 6,91 (1H, s), 6,92 (1H, s), 7,27 (1H, s), 7,47 (1H, s), 8,11 (1H, s), 8,57 (1H, s ancho)  13C-NMR(DMSO-d6) δ ppm: 29,1, 32,2, 102,9, 103,0, 107,9, 108,5, 113,3, 115,7, 119,8, 120,7, 126,3, 132,7,

133,5, 135,8, 144,6, 145,0, 150,8, 151,1, 152,5, 152,9 (2c), 154,7, 173,3, 173,6, 199,1, 201,2  Solubilidad: Insoluble en agua y hexano, soluble en metanol y DMSO 20 Sobre la base de los datos anteriores, la fórmula estructural del compuesto SPF-3059-26 se determinó que era la siguiente fórmula (8).

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Ejemplo 4

Actividad inhibidora del compuesto de xantona sobre la actividad de colapso de Sema3A

25 Una placa de 96 pocillos recubiertos de polilisina (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) se revistió adicionalmente con laminina (20 µg/ ml de laminina, temperatura ambiente, 1 hora). Después, a cada pocillo se añadieron 100 µl de un medio (medio F12 que contenía 10% de suero vacuno fetal, 20 ng/ml de NGF, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina). Después de esto, un ganglio de la raíz dorsal extirpado de un embrión de pollo de 7 días de edad, se inoculó en el pocillo resultante, y la mezcla obtenida se cultivó a continuación en condiciones que

30 consistían en 16 a 20 horas, 5% de CO2 y 37°C. Después de esto, los compuestos descritos en el Ejemplo 3 anterior se añadieron a diferentes concentraciones cada uno al cultivo resultante, y la mezcla obtenida se cultivó después

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durante 1 hora. Después de esto, se añadieron 2 unidades/ml de semaforina de ratón 3A (Sema3A) al cultivo, y la mezcla obtenida se cultivó adicionalmente durante 1 hora. Una hora después de iniciar el cultivo, se añadió glutaraldehído al cultivo, de manera que rápidamente pudo alcanzar una concentración final de 1%. A continuación, la mezcla obtenida se dejó a una temperatura ambiente durante 15 minutos para fijar un corte de tejido. Después de esto, del porcentaje del cono de crecimiento retraído se midió con un microscopio. Un pocillo, al que no se había añadido Sema3A, se utilizó como control. El porcentaje de retracción del cono de crecimiento en un grupo de control negativo (al que no se añadió ni el compuesto ni Sema3A) se definió como (A)%; el porcentaje de retracción del cono de crecimiento en un grupo de control positivo (a la que no se había añadido el compuesto, pero fue añadido Sema3A) se definió como (B)%; y el porcentaje de retracción del cono de crecimiento en un grupo de ensayo (al

que fueron añadidos tanto el compuesto como Sema3A) se definió como (C)%. La concentración de cada compuesto que mantenía la fórmula C = (A + B) / 2 se definió como un valor de CI50. Los resultados se muestran a continuación. A partir de los resultados obtenidos, se encuentra que los compuestos del Ejemplo 3 inhiben cada uno fuertemente la semaforina 3A.

[Tabla 1]

Compuesto

CI50 (µg/ml)

SPF-3059-2

<0,1

SPF-3059-4

2,0

SPF-3059-5

0.075

SPF-3059-12

2,0

SPF-3059-24

0,1

SPF-3059-25

4,0

SPF-3059-26

0,2

Ejemplo 5

Acción del compuesto de xantona para suprimir la actividad inhibidora del alargamiento de neuritas de la semaforina 3A

Una masa de células COS7 que expresaba Sema 3A y ganglio de la raíz dorsal de embrión de pollo de 7 u 8 días de edad se sometieron a co-cultivo en gel de colágeno (Neuroprotocols 4, 116, 1994), y se examinó si cada uno de los compuestos del Ejemplo 3 presentaba una acción para inhibir continuamente Sema3 A. La masa de células COS7 que expresaba Sema3Afue producida por el método siguiente. A saber, usando reactivo de transfección FuGENE6 (Roche), se introdujo 1 µg de un plásmido de expresión de Sema3Aen células COS7 (100.000 células/placa de cultivo de 35 mm) que se había cultivado durante toda la noche. Las células se retiraron de la placa de cultivo usando tripsina 2,5 horas después del inicio de la transfección, y después se reunieron por centrifugación. Las células recogidas se suspendieron de nuevo en200 µl de un medio. Después de esto, se añadieron 20 µl de la suspensión de células a la tapa (lado interno) de la placa de cultivo, y después la tapa se invirtió, y seguidamente se realizó un cultivo de 20 horas (cultivo de gota en suspensión) (Cell, 78, 425, 1994). Después de completarse el cultivo, la masa celular COS7 coagulada se recuperó en un medio y después se recortó a un tamaño de 0,5 mm de diámetro. Esta masa celular COS7 que expresa Sema 3A y el ganglio de la raíz dorsal descrito anteriormente se colocaron en gel de colágeno al 0,2% con una distancia de 0,5 a 1 mm entre ellos, y este gel de colágeno fue entonces cultivado a 37°C en 5% de CO2 durante 2 días en un medio que contenía cada uno de los compuestos anteriormente mencionados en diferentes concentraciones. Posteriormente, se añadió glutaraldehído al cultivo, de tal manera que rápidamente pudo alcanzar una concentración final de 1%. A continuación, la mezcla obtenida se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora para fijar una sección de tejido. Después de esto, el alargamiento de las neuritas se midió con un microscopio.

En el gel de colágeno descrito anteriormente, se secretó Sema3A a partir de la masa de células COS7 en las que se había introducido el plásmido que expresa Sema3A, y se formó un gradiente de concentración (en el que cuanto más cerca de la masa de células COS7, mayor será la concentración). Cuando se utilizó un medio que no contenía los compuestos de ensayo, la neurita no podía ser alargada en una dirección en la que la masa de células COS7 estaba presente y por tanto la concentración de Sema3A era alta, y se alargaba sólo en una dirección opuesta.

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Los resultados obtenidos mediante la evaluación de la estabilidad de los compuestos de xantona en PBS se muestran en la Fig. 7. Según los resultados mostrados en la Fig. 7, se encuentra que los 4 tipos de compuestos de xantona incluidos en la fórmula (1) presentaron un porcentaje de permanencia de 90% o más. Por otro lado los 4 tipos de compuestos de xantona que no están incluidos en la fórmula (1) se descompusieron en casi cantidades totales de los mismos.

Ejemplo 11

Estabilidad de vinaxantona en PBS (tampón fosfato)

Se disolvieron cada uno de Vinaxantona (SPF-3059-5) y SPF-3059-1 en PBS (Dulbecco's PBS(-)) a una concentración de 100 µg/ml. Las soluciones obtenidas se conservaron a 37°C, y la cantidad de agente que permanecía en la solución se cuantificó por HPLC en puntos de tiempo individuales desde el inicio de la conservación hasta 4 semanas después del inicio de la conservación, para examinar un cambio a lo largo del tiempo en los porcentajes de permanencia. Se aplicaron las mismas condiciones de HPLC que las del Ejemplo 10.

Se evaluó la estabilidad de vinaxantona (SPF-3059-5) y SPF-3059-1 en PBS. Los resultados se indican en la Fig. 8. A partir de los resultados indicados en la Fig. 8, se encuentra que vinaxantona (SPF-3059-5) que es un compuesto de xantona incluido en la fórmula (1) permanecía en PBS a 37°C a un porcentaje de permanencia de 96% o más hasta 4 semanas después del inicio de la conservación, y por tanto que este compuesto era estable durante 4 semanas o más. Por otro lado, SPF-3059-1 se descompuso en una cantidad casi total del mismo durante aproximadamente 1 semana.

Ejemplo 12

Análisis en cuanto al cambio en el contenido del compuesto de la presente invención en las lágrimas y en la córnea

Para el tratamiento de daño en los nervios de la córnea, lo más preferible es la administración de gotas oculares del agente. Por lo tanto, es importante analizar un cambio en el contenido del agente en las lágrimas y / o en la córnea después de la administración de gotas oculares del agente. El análisis de un cambio en el contenido del agente puede llevarse a cabo, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente método de ensayo.

[Método de ensayo]

Los compuestos representados por la fórmula (1) de la presente invención (por ejemplo, SPF-3059-5; abreviada en lo sucesivo como el compuesto de la presente invención) y los compuestos diana (compuestos que no están incluidos en la fórmula (1), tales como la SPF-3059-1 antes mencionada) se analizaron en términos de un cambio en el contenido del mismo. Es decir, cada compuesto se disolvió en PBS a una concentración de 0,1 mg / ml a 1 mg / mL. 10 µL de cada uno de una solución del compuesto de la presente invención, una solución del compuesto diana o PBS solo se administró a un ojo de cada rata medio de la administración de gotas oculares. Treinta minutos, dos horas, y 10 horas después de la administración, se recogieron 1 µL a 10 µL de lágrimas con una pipeta, y las ratas se sometieron a eutanasia. Se extirpó el globo ocular de cada rata y después se recogió la córnea.

El contenido de cada compuesto en lágrimas y/o en la córnea se midió por LC-MS. Se añadió HCl 0,1 M a la muestra, y a continuación, la mezcla obtenida se agitó en el caso de lágrimas, o se homogeneizó en el caso de córnea. Después de esto, se añadió acetato de etilo al resultado, y después la mezcla obtenida se agitó completamente para centrifugación. Después se recogió una capa superior. Se añadió más acetato de etilo a la capa inferior, y las operaciones descritas anteriormente se llevaron a cabo repetidas veces sobre la mezcla obtenida. Se reunieron las capas superiores de tres veces de operaciones, y una muestra obtenida secando la capa reunida con gas nitrógeno se usó después en la medición por LC-MS.

Aplicabilidad industrial

El compuesto de xantona que tiene actividad inhibidora de semaforina 3A de la presente invención es eficaz como agente terapéutico o preventivo para la neuropatía sensorial causada por enfermedad corneal o cirugía corneal. Expresamente, el presente compuesto de xantona se puede usar eficazmente como agente terapéutico o preventivo para la neuropatía sensorial causada por daño del nervio sensorial corneal debido a una enfermedad corneal tal como queratitis, leucoma, infección corneal, degeneración corneal, distrofia corneal, distrofia estromal corneal queratopatía bullosa, queratocono, descompensación corneal, úlcera corneal, queratopatía neuroparalítica, queratopatía diabética, quemaduras químicas de la córnea, o quemaduras térmicas de la córnea; o para la neuropatía sensorial causada por daño del nervio sensorial corneal debido a cirugía corneal tal como queratoplastia, cirugía correctora de la miopía, y cirugía corneal que tiene como objetivo la córnea y es requerida para el tratamiento de enfermedad ocular o lesión corneal. Además, el compuesto de xantona que tiene actividad inhibidora de semaforina 3A de la presente invención también se puede usar eficazmente como promotor para la regeneración del nervio sensorial corneal.

Además, el compuesto de xantona usado en la presente invención es químicamente estable en extremo en una solución acuosa tal como un tampón fosfato. Así, cuando el presente compuesto de xantona se administra en forma

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Claims (1)

1. imagen1

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