ES2294793T3 - Induccion de tolerancia inmunologica a un anticuerpo terapeutico usando variantes de dicho anticuerpo terapeutico. - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a un anticuerpo que es una versión modificada de un anticuerpo terapéutico con afinidad por un antígeno de superficie celular, teniendo el citado anticuerpo una afinidad reducida por el antígeno en comparación con el anticuerpo terapéutico como resultado de una modificación o modificaciones en la molécula de anticuerpo, siendo capaz el anticuerpo de inducir tolerancia inmunológica frente al anticuerpo terapéutico. La invención comprende también un procedimiento de inducción de tolerancia inmunológica frente a un anticuerpo terapéutico que comprende administrar a un paciente un anticuerpo que es una versión modificada del anticuerpo terapéutico y que tiene una afinidad reducida por el antígeno, en comparación con el anticuerpo terapéutico.

Description

Inducción de tolerancia inmunológica a un anticuerpo terapéutico usando variantes de dicho anticuerpo terapéutico.

Esta invención se refiere al uso de anticuerpos modificados para inducir tolerancia inmunológica en seres humanos o animales.

Los anticuerpos, o inmunoglobulinas, comprenden dos cadenas pesadas conjuntamente unidas mediante enlaces de disulfuro y dos cadenas ligeras, en que cada cadena ligera está unida a una respectiva cadena pesada mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido de un cierto número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en su otro extremo, en que el dominio variable de cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada y el dominio constantes de cadena ligera alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los dominios constantes en las cadenas ligeras y pesadas no están directamente involucrados en la unión del anticuerpo al antígeno.

Los dominios variables de cada par de cadenas ligera y pesada forman el sitio de unión al antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada tienen la misma estructura general; cada dominio comprende cuatro regiones de entramado, cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectadas mediante tres regiones determinantes complementarias (CDRs). Las CDRs están mantenidas en una estrecha proximidad por medio de las regiones de entramado. Las CDRs de dominios variables de cadenas ligera y pesada adyacentes contribuyen conjuntamente a la formación del sitio de unión al antígeno.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos dirigidos a antígenos específicamente escogido han sido usados en el tratamiento de diversos estados. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales (mAb) Campath-1 han sido usados satisfactoriamente para inducir remisiones en asientos de linfoma y leucemia y para el tratamiento de artritis reumatoide y vasculitis. El antígeno diana CD52 (también denominado CDw52; véase, por ejemplo, Xia et al, 1991) es una glicoproteína anclada a GPI de linfocitos y monocitos (y partes del sistema reproductor masculino). Tiene una secuencia de péptidos excepcionalmente cortos de 12 aminoácidos y un único oligosacárido complejo unido a N en Asn3 (Hale et al. 1990; Xia et al. 1991). El CD52 es una buena diana para la destrucción mediada por anticuerpos y, por lo tanto, es una molécula de superficie celular eficaz para diversos regímenes terapéuticos en lo que es un objetivo la reducción de linfocitos (por ejemplo, la supresión de células de médula ósea donante para evitar la enfermedad de injerto frente a hospedante, tratamiento de leucemia y linfoma e inmuno-supresión).

Diversos mAb de Campath-1 CD52 anti-humanos de rata fueron generados mediante fusión de la línea de mieloma de rata Y3 con células de bazo de una rata inmunizada con linfocitos T humanos (Hale et al, 1983). Aunque la eficacia clínica de mAb de Campath-1 de rata ha sido demostrada de forma regular, muchos pacientes mostraron una respuesta anti-anticuerpos (antiglobulina) frente a la proteína xenogénica que evitaba un nuevo tratamiento con el anticuerpo terapéutico. La terapia de anticuerpos es a menudo limitada por la respuesta antiglobulina. El componente anti-idiotípico (anti-Id; dirigido contra las regiones Ab V y en particular el sitio de combinación de Ab) inhibe la unión del Ab a su diana, mientras que el componente tanto anti-Id como el anti-isotípico dirigido contra las regiones constantes) actúan para acelerar la desaparición de anticuerpos. Una preocupación principal es el efecto neutralizante de la respuesta antiglobulina. En general, como con las respuestas antiglobulina, las respuestas anti-Id interfieren con la potencia clínica de un Ab terapéutico formando agregados de Ab que desaparecen rápidamente de la circulación, reduciendo la posibilidad de una interacción con antígeno diana. Desgraciadamente, la mayoría de los sueros antiglobulinas contienen anticuerpos anti-Ib. Esto ha sido demostrado para un cierto número de mAb terapéuticos y es especialmente apreciado después de tratamientos repetidos.

Para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo de Campath-1 IgG2b de rata, YTH34-5, los fragmentos de genes que codifican el VL y VH fueron humanizados mediante "injertado en CDR" de las regiones hiperavariables de roedores en regiones de entramado humanas (Jones et al. 1986; Reichmann et al. 1988). Esto se llevo a cabo escindiendo las secuencias de CDR que codifican el anticuerpo de Campath-1 de rata en la cadena principal del entramado humano que codifica secuencias proporcionada por las proteínas de mieloma cristalográficamente resueltas NEW (para el VH) y REI (para el VL). La proteína resultante tenía un título bajo unión a antígenos y la modelación de la región V humanizada mostró que el residuo 27 en la secuencia del entramado de VH era crítica para conservar la estructura de bucle de CDR1. Este residuo fue alterado desde el residuo encontrado en NEW (Ser) nuevamente hasta el residuo de rata Phe que dio lugar a la restauración de la unión a antígenos. Durante la modelación fue sugerido también un cambio adicional (residuo NEW Ser para el residuo Thr de rata). Sin embargo, en ensayos funcionales está sustitución no tuvo ningún efecto sobre la unión a antígenos, pero el mutante doble (Ser27 para Phe27 y Ser30 para Thr30) expresó la mayoría de las proteínas y, por lo tanto, fue usado para producir Ab Campath-1 humanizado terapéutico, denominado Campath-1 (Reichmann et al, 1988, documento EP 0.308.404). Como muchos entramados de VH humano tienen una treonina en la posición 30, este cambio no fue considerado un riesgo adicional para la inmunogenicidad del anticuerpo. Seguidamente los VL y los VH humanizados fueron genéticamente fusionados con regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. En resumen, el anticuerpo de Campath-1 humanizado consiste en residuos humanos en todas las posiciones excepto las que codifican las 3 CDRs de la cadena ligera, las 3 CDRs de la cadena pesada y los residuos Phe27 y Thr30 en el VH de la cadena pesada.

En ensayos clínicos, la versión humanizada (Campath-1H) se encontró que era mucho menos inmunogénica que el anticuerpo de Campath-1 IgG2b de rata. La humanización reduce la inmunogenicidad de mAb de roedores, aunque tanto el idiotipo como el alotipo de mAb humanizados pueden ser todavía dianas para respuesta humorales. La sensibilización para el idiotipo ha sido documentada de hecho en algunos receptores de alotipos coincidentes de Campath-1H (Isaacs et al, 1992; Lockwood et al, 1993). Estas respuestas fueron puestas de manifiesto por la presencia de anti-Id en sueros de pacientes. Un paciente género anti-Id de título elevado que tubo una reacción cruzada en el panel completo de mAb CD52.

Una estrategia para reducir adicionalmente la inmunogenicidad de Campath-1 puede ser injertar nuevamente los 6 bucles de CDR en regiones de entramado de líneas germinales humanas bien caracterizadas. La mayoría de las regiones V humanizadas hasta ahora usadas reagruparon genes V como secuencia de entramado aceptora. Este fue el caso para Campath-1H cuando fueron usadas secuencias de entramado de proteínas de mieloma para proporcionar secuencias aceptoras de VH y VL. Los genes de V reagrupados contienen a menudo mutaciones somáticas, adquiridas durante el procedimiento de maduración de la afinidad. Esto será único para el individuo del que derivan los genes reagrupados y, por lo tanto, puede ser considerado como ajeno en otro individuo. Sin embargo hay una posibilidad de que un nuevo injerto pueda introducir nuevos epitopos idiotípicos, formados por las regiones de unión que abarcan residuos de CDR y residuos de entramados nuevos. Además de ello la humanización sola puede que no resuelva el problema de respuestas anti-Id, por que la población humana es de razas distintas y es improbable que todos los pacientes sean tolerantes a un mAb humanizado dado. Incluso en regiones constantes de anticuerpos, hay un cierto número de alelos diferentes que portan marcadores alotípicos para los que pueden ser demostradas respuestas antiglobulinas que se producen de forma natural. El problema es más complejo para segmentos de la región de V, que muestran un mayor grado de variación tanto en alotipo como en haplotipo en comparación con las regiones constantes.

Otra aproximación es inducir tolerancia a los péptidos potencialmente ajenos contenidos en la región V de Campath-1H. Se conoce que la respuesta antiglobulina es en sí misma una respuesta de células B que es dependiente de CD4 + células T. Isaacs y Waldmann (1994) demostraron que ratones desprovistos de células CD4+ T eran incapaces de responder a mAb de unión celular ajenas (mAb CD8 anti-ratón de rata. El agotamiento de células CD4+T se llevó a cabo mediante timectomía adulta combinada con la administración de un mAb CD4 de agotamiento.

En estos ratones, se midió la respuesta a mAb o SRBC posteriormente administrados. Los ratones deficientes en células CD4+T no consiguieron hacer una respuesta antiglobulina o una respuesta anti-SRBC demostrando que la respuesta anti-Ig, como la respuesta SRBC, es clásicamente dependiente de células CD4+T. Con el fin de generar ayuda de células T y conseguir la respuesta apropiada de células T, el Ab administrado debe ser tratado como un antígeno de proteína y presentado presumiblemente en el contexto de una molécula de clase II de MHC, por una célula adecuada presentadora de antígeno. Por lo tanto pueden ser adoptadas dos estrategias principales para disminuir la inmunogenicidad de una región V humanizada. (1) Se puede "silenciar" la molécula de anticuerpo en sí misma adoptando estrategias para eliminar cualesquiera epitopos helper T potenciales o (2) se pueden presentar todos los epitopos helper H potenciales de una manera que induzca tolerancia en lugar de reactividad para esos epitopos.

"Silenciado" de la molécula de anticuerpo

a) En teoría, debe ser posible silenciar el anticuerpo en sí mismo en forma que el sistema inmune no reconozca determinantes ajenos. Esto sería posible si se pudieran explorar las secuencias de aminoácidos de VL y VH en cuanto a restos que puedan unirse a moléculas de clase II de MHC. Si se pudieran identificar así residuo(s) clave(s) en un péptido de clase II potencial que no estuviera(s) involucrado(s) en la especifidad o afinidad de anticuerpos, entonces podría(n) ser alterados mediante mutagénesis dirigida al sitio para residuo(s) que no permitan una asociación con moléculas de clase II. Los péptidos helper T no son al azar, y cualquier proteína tiene solamente un número limitado de péptidos capaces de unirse a moléculas de clase II de MHC y también a receptores de antígenos de células T. Sin embargo, esto no es posible en la actualidad por que los péptidos de unión de clase II todavía no están caracterizados hasta un grado suficiente como para ser identificados explorando secuencia de proteínas. Esto es debido en parte a la naturaleza heterogénea de los péptidos de clase II. Los péptidos tratados de forma natural aislados a partir de moléculas de clase II de MHC son generalmente de tamaño mayor, de longitud variable y tienen ambos extremos irregulares en las terminaciones de C y N en comparación con péptidos tratados aislados a partir de moléculas de clase I de MHC. Mientras que los péptidos derivados de la clase I son mayoritariamente de longitud uniforme de 8-9 residuos de aminoácidos, los péptidos asociados a la clase II de MCH varían en el intervalo de 12-24 aminoácidos (Rudensky et al, 1991; Hunt et al, 1992; Rudensky y Janeway, 1993). Los péptidos derivados de la clase I tienen restos de secuencias con residuos de anclaje específico en ciertas posiciones que permiten que sus cadenas laterales se ajusten en los embolsamientos de unión de los entrantes de unión al péptido, y el entrante de unión al péptido está cerrado en ambos extremos. Por el contrario, los péptidos de clase II están unidos en una conformación extendida que sobresale de ambos extremos de un anclaje de unión a antígeno de "extremos abiertos"; un embolsamiento no polar sobresaliente en el que una cadena lateral de péptido de anclaje es ajustada cerca de un extremo anclaje de unión (Brown et al, 1993).

b) Otras estrategias que pueden ser adoptadas para "silenciar" el anticuerpo si se pudieran predecir los restos de unión a péptido de clase II. Por ejemplo, se podría incluir una inserción de sitio escisión de proteasa en cualquier epitopo de clase II potencial para aumentar la posibilidad de degradación del péptido antes de que pudiera ser presentado en el contexto de la clase II. Alternativamente, la inserción de restos en una región V como repeticiones de Gly-Ala puede inhibir la degradación de la región V en péptidos que se podrían asociar con moléculas de clase II. En un sistema, se mostró que las repeticiones Gly-Ala de EBNA1 generaba una señal inhibidora de actuación en cis que interfería con el tratamiento del antígeno durante la presentación restringida a la clase I de MHC, de forma que era inhibido el reconocimiento de CTL (Levitskaya et al, 1995). Aunque cualquiera de estas aproximaciones puede resultar algo alentadora en el futuro, nuevamente se basan en la predicción de péptidos de clase II de MHC a partir de secuencias de proteínas de regiones VL y VH humanizadas y, por lo tanto están limitadas por el conocimiento insuficiente relativo a los restos de consenso para péptidos de clase II.

Inducción de tolerancia para epitopos helper T

En lugar de un conocimiento suficiente relativo a los restos de péptidos de clase II, se ha dirigido la atención hacia la inducción de tolerancia a anticuerpos terapéuticos. En 1986, Benjamin et al y Cobbold et al describieron una propiedad inesperada de mAb de unión celular: mientras era posible inducir una tolerancia a la región Fc (tolerancia anti-isotipo), el isotipo permanecía antigénico bajo condiciones equivalentes. Además de ello, era relativamente fácil inducir una tolerancia a mAb que no son de unión celular, pero los mAb de unión celular se encontró que eran muy inmunogénicos.

Isacss y Waldmann (1994) en un estudio preliminar usaron unos derivados de "moléculas mixtas" que no eran de unión celular de un Ab de una unión celular para inducir una tolerancia a la forma de tipo salvaje. El anticuerpo de unión celular era un mAb anti-CD8 en un modelo de ratón. Los derivados que no eran de unión celular fueron preparados emparejando las cadenas L y H relevantes con una cadena H o L irrelevante, respectivamente. La cadena H relevante emparejada con una cadena L irrelevante fue obtenida limitando la clonación por dilución del hibridoma original que estaba expresando una cadena ligera de mieloma (a partir del asociado de fusión Y3), así como las cadenas H y L anti-CD8 específicas. Se obtuvo una variante del hibridoma que expresaba la cadena L de mieloma y la cadena H anti-CD8 específica pero no la cadena L anti-CD8. Se obtuvo también de está manera un clon que expresaba solamente la cadena L relevante. Ese clon fue seguidamente fusionado a un hibridoma que expresaba una especifidad irrelevante (CD3 anti-humano) y se selecciono una variante que expresaba la cadena L anti-CD8 relevante con la cadena H anti-CD3 irrelevante. Como las proteínas son tratadas en forma de péptidos antes de la preparación de células T, los péptidos helper a partir de cadenas H y L específicas para antígenos "serían observados" por células T independientemente de su cadena asociada. Sin embargo, en este caso, no hubo ninguna ventaja en la inducción de tolerancia usando derivados de moléculas mixtas que no eran de unión celular mAb terapéuticos in vivo, en comparación con un testigo de isotipos coincidentes, sugiriendo que en la cepa de los ratones usados, la mayoría (o la totalidad) de los epitopos helper estaban ubicados en la región constante.

En la práctica, el uso de estas "moléculas mixtas" de cadenas de inmunoglobulinas específicas para antígenos e irrelevantes para una terapia humana no sería factible porque las cadenas H y L irrelevantes portarían ellas mismas algunos epitopos helper, complicando así la capacidad para conseguir una tolerancia para las cadenas H y L relevantes. Tampoco se podría esperar conseguir una tolerancia para esas células B que "observan" los determinantes idiotípicos formados por la combinación de las cadenas H y L relevantes del anticuerpo.

El Campath-1 es un mAb de unión celular, y un tolerogen eficaz para ser usado con el mismo, de manera que una forma que no es de unión celular del mAb terapéutico sería por tanto ventajosa. Esto mismo es válido para otros anticuerpos terapéuticos que tienen propiedades de unión celular, y sus variantes que no son de unión celular.

La invención

Por lo tanto la invención proporciona el uso de (i) un anticuerpo como se especifica en la reivindicación 1 que es una versión modificada de un anticuerpo terapéutico, en el que el anticuerpo terapéutico tiene afinidad por un antígeno de superficie celular en que dicho anticuerpo tiene una afinidad reducida por el antígeno en comparación con el anticuerpo terapéutica como consecuencia de una modificación o de modificaciones de la molécula del anticuerpo, en que el anticuerpo comprende al menos un epitopo también presente en el anticuerpo terapéutico, que induce una respuesta inmune en el paciente pretendido, para la elaboración de un medicamento para inducir una tolerancia inmunológica al anticuerpo terapéutico.

Preferentemente, la afinidad del anticuerpo modificado por el antígeno es reducida a 50% o menos de la afinidad del anticuerpo terapéutico por el antígeno. Más preferentemente, la afinidad es reducida a 10% o menos o a 1% o menos de la afinidad del anticuerpo terapéutico. La afinidad es necesario que sea suficientemente reducida para permitir que el anticuerpo según la invención actué como un tolerogen con respecto al anticuerpo terapéutico. La expresión "variante que no es de unión celular" es usada en la presente memoria descriptiva para hacer referencia a anticuerpos según la invención, aunque los anticuerpos según la invención pueden tener todavía alguna afinidad de unión por el antígeno de superficie celular.

La capacidad del anticuerpo modificado para inducir una tolerancia inmunológica a un anticuerpo de unión celular terapéutico se basa en la presencia en el anticuerpo que no es de unión celular de al menos de un epitopo también presente en el anticuerpo terapéutico, que induce una respuesta inmune en el paciente pretendido.

El anticuerpo que no es de unión celular es preferentemente capaz de inducir una tolerancia a repuestas anti-idiotípicas, al menos para las regiones hipervariables de dominios V del anticuerpo terapéutico y preferentemente también a las regiones de entramado. Por tanto, es deseable que anticuerpo que induce una tolerancia tenga una secuencia de aminoácidos similar al anticuerpo terapéutico en esas regiones. Preferentemente, hay una identidad de secuencias de aminoácidos >90% o >95% o >99% entre los dominios variables del anticuerpo que no es de unión celular y el anticuerpo terapéutico. Lo más preferentemente, las diferencias están restringidas a cualquier sustitución(es)
de aminoácidos necesaria(s) para reducir suficientemente la afinidad de unión a antígenos en el anticuerpo que no es de unión celular.

También, preferentemente el anticuerpo que no es de unión celular es capaz de inducir una tolerancia a las regiones constantes del anticuerpo terapéutico. Por tanto, los dominios constantes del anticuerpo que no es de unión celular son similares a los del anticuerpo terapéutico teniendo una identidad de secuencia de aminoácidos >90% o >95% o >99%. Lo más preferentemente, los dominios constantes del anticuerpo que no es de unión celular y el anticuerpo terapéutico son iguales y, por tanto, son alotípicamente coincidentes.

La descripción emplea adicionalmente fragmentos de un anticuerpo descrito en la presente memoria descriptiva, teniendo los fragmentos una capacidad inductora de tolerancia. Estos fragmentos incluyen fragmentos monovalentes y divalentes como los fragmentos Fab, Fab' y F(ab\cdot)_{2}. También están incluidos anticuerpos de cadenas únicas. Las características preferidas de estos fragmentos son como se describe en la presente memoria descriptiva en relación con anticuerpos que no son de unión celular según la invención. Los fragmentos que no son de unión celular pueden ser para ser usados con los correspondientes fragmentos de anticuerpos terapéuticos, o con moléculas de anticuerpos terapéuticos.

La afinidad de unión reducida de los anticuerpos que no son de unión celular puede ser conseguida mediante una diversidad de formas. En la realización preferida descrita en la presente memoria descriptiva, una alteración en las CDRs que comprende una o dos sustituciones más de aminoácidos reduce la afinidad de unión. Alternativamente, las sustituciones de aminoácidos en otras partes de la molécula del anticuerpo pueden ser usadas para reducir la afinidad de unión. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos en las regiones de entramado se conoce que afectan significativamente a ala afinidad de unión (Reichmann et al, 1998). Otra alternativa que esta fuera del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones anejas es una forma monovalente del anticuerpo terapéutico. Los anticuerpos monovalentes tienen una afinidad de unión reducida en comparación con sus equivalentes bivalentes. Las formas monovalentes pueden ser, por ejemplo, fragmentos Fab o anticuerpos de cadena única o cualesquiera otros fragmentos de anticuerpos tratados por ingeniería genética que retengan un único sitio de unión. Las variantes monovalentes pueden ser producidas también mutando el residuo de cisteína que participa en la formación de disulfuros (H-H) entre cadenas (por ejemplo, cys \rightarrow ser o cys \rightarrow ala). La reducción de la afinidad de unión de un anticuerpo monovalente en comparación con su equivalente bivalente puede ser suficiente para hacer posible la inducción de tolerancia. Preferentemente, el anticuerpo monovalente es incapaz de unir receptores Fc, o incapaz de unir el componente complementario C1q, o ambos. Cualquiera o ambas de estas propiedades puede ser inducidas mediante mutaciones adecuadas (véase, por ejemplo, Morgan et al. documento WO 94/29351, publicado el 22 de diciembre de 1944 y Winter et al. documento EP 0.037.434 B1).

Por tanto, los anticuerpos que no son de unión celular pueden ser uno de una diversidad de tipos de anticuerpos que incluye anticuerpos tratados por ingeniería genética. Además, los anticuerpos serán generalmente de una mezcla de orígenes. Por ejemplo, pueden ser quiméricos, por ejemplo, regiones constantes humanas con dominios variables de rata; o humanizados o injertados por CDR o reconformados de algún otro modo (véase, por ejemplo Cabilly et al., patente de EE.UU nº 4.816.567; Cabilly et al., patente Europea nº 0.125.023 B1; Boss et al., patente EE.UU nº 4.816.397; Boss et al., patente Europea nº 0.120.694 B1; Neuberger, M.S. et al., documento WO86/1533; Neuberger, M.S. et al., patente Europea nº 0.194.276 B1; Winter, patente de EE.UU nº 5.225.539, Winter patente Europea nº 0.239.400 B1; Queen el al., EE.UU. nº 5.585.089; Queem et al., patente Europea nº 0.451.216 B1, Adair et al., documento WO 91/09967, publicado el 11 de julio de 1991, Adair et al., patente Europea nº 0.460.167 B1; y Padlan, E:A: et al., patente Europea No. 0.519.596 A1. Véase también Newman, R. et al., Biotechnology, 10:1455-1460 (1992), publicación relativa a un anticuerpo primatizado y Huston et al. patente EE.UU. nº 5.091.513; Huston et al. patente EE.UU. nº 5.132.405; Ladner et al., patente de EE.UU. nº 4.946.778 y Bird, R. E. et al., Science, 242: 423-426 (1998) relativas a anticuerpos de cadenas únicas). El Campath-1H es considerado humanizado aunque contiene dos sustituciones de aminoácidos en las regiones de entramado.

De forma ideal, el anticuerpo modificado es tan próximo como sea posible al anticuerpo terapéutico en el que está basado. La administración de un "mutante mínimo" antes de la inyección del mAb terapéutico de unión celular puede ser usada para hacer tolerantes todos los epitopos de células T y la mayoría de B en el mAb terapéutico. Experimentos clásicos indican que la tolerancia es mantenida más eficazmente por las células T que por las células B. Pero como la mayoría de las respuestas de células B que incluyen la respuesta anti-Id requieren la ayuda de células T incluso si una célula B es sensible a un antígeno dado, la producción de anticuerpos será determinada por el estado de sensibilidad de las T (Chiller et al. 1971). Por tanto, será preferible usar una variante que no es unión celular que contenga las mínimas diferencias necesarias para reducir su afinidad por el antígeno de superficie celular de forma suficiente para hacer posible que sea usado como un tolerogen. Usando técnicas como cristalografía de rayos X, modelación por ordenador y mutagénesis dirigida al sitio, y también métodos genéticos como exhibición de fagos, será posible diseñar variantes adecuadas que no son de unión celular para cualquier anticuerpo terapéutico de unión celular.

El anticuerpo modificado está preferentemente en forma biológicamente pura, y está deseablemente exento en al menos 95% (en peso) de otros materiales biológicos.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión "antígeno de superficie celular" significa un antígeno que se encuentra en las superficies de células, pero no necesariamente de forma exclusiva en las superficies de células.

La expresión "anticuerpo terapéutico" es usada en la presente memoria descriptiva para hacer referencia a un anticuerpo que puede ser administrado a seres humanos o animales para que tenga un efecto deseado, en particular, en el tratamiento de una enfermedad. Estos anticuerpos terapéuticos serán generalmente anticuerpos monoclonales y generalmente habrán sido tratados por ingeniería genética.

En las figuras anejas:

La Figura 1 muestra los constructos de mutantes mínimos de cadena pesada de Campath-1H preparados como se describe en los ejemplos.

La Figura 2 muestra la estrategia de mutagénesis por PCR para preparar los constructos mutantes de la Figura 1.

La Figura 3 muestra pGEM9zf que contiene una cadena pesada de Campath-1H de tipo salvaje y una sustitución de fragmentos mutantes en la cadena pesada.

La Figura 4 muestra una representación esquemática de una realización de un anticuerpo terapéutico monovalente que no es de unión celular.

Uso de un diseño racional para crear un "mutante mínimo"

En una realización para producir una variante que no es de unión celular de un mAb terapéutico, son identificados residuos de aminoácidos que están involucrados en la unión al antígeno diana. En relación al número de residuos que comprende los dominios de VL y VH los que están directamente involucrados en interacciones con el antígeno son de número pequeño (Novotny et al, 1983). Aunque el sitio de combinación de Ab está constituido por 6 bucles hipervariables, 1 ó 2 de estos bucles pueden dominar en esa interacción. Si un residuo o residuos claves pueden ser identificados, puede(n) ser cambiado(s) mediante mutagénesis dirigida al sitio a un residuo que reducirá (reducirá o eliminará) la unión al antígeno. Como estos residuos se encontraran lo más probablemente en las estructuras de bucles hipervariables y no en la secuencia de entramado que soporta esos bucles, los cambios pequeños puede que no rompan significativamente la estructura global del Ab.

Construcción de modelos de sitios de unión a Ab para definir residuos claves para la mutagénesis

Como las regiones constantes y regiones variables de Ab son muy similares en secuencias y estructuras, los principios generales relativos a la estructura de Ab han sido definidos usando relativamente pocas estructuras cristalinas resueltas. Hasta la fecha, han sido incluidas aproximadamente 50 estructuras de fragmentos de Ab en el banco de datos Brokhaven Protein Data Bank, y de estos, un 20% han sido refinados hasta una resolución de 2,0 angstroms o mejor. A medida que aumenta la base de conocimiento estructural, se hace más fiable la modelación comparativa de Ab modelación por homología, ya que hay una mayor elección de plantillas estructurales. Pueden ser combinadas regiones variables (VL o VH) de estructuras de Ab diferentes como una plantilla estructural después de superponer sus residuos más conservados. Seguidamente son modeladas las conformaciones de las cadenas laterales de residuos ocultados. Los bucles de CDR son moderados mediante la identificación de plantillas de bucles estructuralmente similares (a menudo bucles con la misma longitud y una secuencia similar tienen conformaciones similares de la cadena principal). Estas secuencias de CDR caen a menudo en forma de restos de bucles canónicos (excluyendo H3, entre un 50 y un 95% de VL (kappa) y VH tienen secuencias de bucles congruentes con los restos canónicos clasificados). Las cadenas principales de los bucles canónicos pueden ser seguidamente escindidas en el modelo del entramado y las conformaciones de las cadenas laterales de CDR pueden ser modeladas basándose en las conformaciones de los residuos encontrados en las correspondientes posiciones en otros bucles de la misma estructura canónica. Finalmente, el modelo es a menudo refinado usando programas de ordenador que minimizan las restricciones estereoquímicas conflictivas.

La construcción de modelos comparativos está resultando ampliamente usada a medida que aumenta el tamaño de las bases de datos estructurales, proporcionando una mayor gama de plantillas estructurales. También, la mayor gama de programas ordenador disponible asegura que los modelos están resultando crecientemente exactos. Por ejemplo, la estructura cristalina resuelta de Campath-1H era muy próxima a la estructura prevista por modelación molecular. Se podría predecir a partir de los datos de modelación que las mutaciones 1 y 2 descritas en los ejemplos es probable que tuvieran un efecto perjudicial sobre la unión a CD52. La estructura cristalina confirmó estas predicciones y predijo también que la mutación 3 podría romper la unión a CD52.

Obviamente para crear una versión que no es de unión celular de un Ab terapéutico, es deseable comenzar con una estructura cristalina resuelta, preferentemente co-cristalizada con un antígeno que forma que el (o los) residuo(s)
de contacto clave pueda(n) ser identificado(s) y sustituir a los residuo(s) que destruye(n) la unión al antígeno. Sin embargo, en muchos caso, un buen modelo molecular podría proporcionar la información necesaria. En los casos en que el modelo molecular es de escasa calidad (por ejemplo, si las plantillas estructurales apropiadas no existen en el banco de datos), los experimentos de intercambio de CDR (como se describe en los ejemplos) proporcionarán información sobre qué CDRs deben ser dirigidos a diana para la mutación. La metagénesis de exploración de alanina (mutando cada residuo secuencialmente a Ala) a través de esas regiones podría identificar el (o los) residuo(s) clave(s)
involucrado(s) en la unión al antígeno (Cunningham y Wells, 1989). Si cambia un único residuo a Ala reducido pero no destruye la unión, esa posición podría ser dirigida a diana para mutaciones más drásticas (por ejemplo, una sustitución que fuera creada en una diferencia de carga) para reducir adicionalmente la unión, si se desea.

Métodos alternativos para obtener versiones que no son de unión celular de anticuerpos terapéuticos incluyen técnicas genéticas como exhibición de fagos usando PCR propensa a error (Gram et al, 1992) y ciclación de genes de la región V (por ejemplo, como constructos sFv) a través de una cepa mutadora bacteriana (por ejemplo, mutD5) (Low et al., 1996). Estos métodos genéticos pueden proporcionar sistemas de selección potentes.

La invención se describirá seguidamente en los ejemplos que siguen. Aunque en este documento es proporcionado el ejemplo específico de Campath-1H, la invención no está limita a anticuerpos basados en Campath-1H. Esta anticipado que otros anticuerpos terapéuticos de unión celular, especialmente los que serían proporcionados en dosis repetidas, resultarían más ampliamente aceptados usando esta estrategia.

Ejemplos A. Creación de un "mutante mínimo"

Se ha concebido un método para determinar cuáles de los bucles de CDR del mAb de Campath-1H humanizado son los más importantes para la unión a CD52. Fueron genéticamente construidos VL o VH mutantes en los que cada una de las 6 regiones hipervariables (como se define por Kabat et al (1987) usando alineaciones de secuencias de aminoácidos de regiones V en las bases de datos de proteínas) estaban individualmente intercambiada con la correspondiente CDR de la región V que había proporcionado la secuencia aceptora VL o VH humana durante la humanización (REI y NEW, respectivamente). Las regiones V tratadas por ingeniería fueron expresadas como fragmentos de Fab en E. coli usando el vector pHEN (Hoogenboom et al, 1991). En este sistema, la secuencia líder peIB fue usada para dirigir la expresión de proteínas al periplasmo, donde se produce la asociación de la cadena L y la cadena H truncada (Hoogenboom et al, 1991). Cuando estos fragmentos Fab fueron ensayados en cuanto la unión a CD52 inmovilizado, se encontró que intercambiando el (VH) CD12 de NEW en el Fab de Campath-1 se destruyó completamente la unión a CD52. La sustitución de (VH) CDR3 redujo la unión a CD52 8 veces mientras que la sustitución de (VH) CDR1 y (VL) CD3 redujo la unión 3 veces. No se detectó ningún cambio cuando fueron sustituidos (VL) CDR1 o (VL) CDR2. A partir de estos resultados, es evidente que el (VH) CDR2 contenía un(os) residuo(s) clave(s) necesario(s) para la unión al antígeno. El DNA que codifica la cadena H de Campath-1 humanizado de "tipo salvaje" (Reichmann et al, 1988) fue usado como plantilla de PCR para la mutagénesis dirigida al sitio. Esta secuencia de cadena pesada codifica proteína humana en todas las posiciones excepto las tres regiones VH CDR y las posiciones 27 y 30 de la primera región de entramado. Se abordó el bucle CH2 en VH CDR2 para hacer mutaciones que impidieran la unión del Ab a CD52. H2 es la estructura del bucle real (Chothia and Lesk, 1987) que es encontrado en los 19 aminoácidos de VH CDR2 denominados "hipervariables" por la definición de Kabat et al (Kabat et al, 1987) (véase la Figura 1). Es conocido que unos pocos residuos en el bucle y/o las regiones de entramado determinan relativamente pocas conformaciones de bucles de CDR y los restos de bucles canónicos han sido identificados para la mayoría de CDR que incluyen VH CDR2 (Chothia and Lesk, 1987). Como las estructuras de los bucles son las que se desprenden del entramado de la caja \beta de la región V para entrar en contacto con el antígeno, las mutaciones en el bucle tendrían la mayor posibilidad de destruir la unión al antígeno, al mismo tiempo que conservan la estructura del Ab. En general, fueron restringidos los cambios al bucle H2 excepto para la cadena H mut6 que contenía una mutación adicional en el residuo que precedía inmediatamente a H2, como se expone más en detalle con posterioridad.

Sumario de constructos de mutantes mínimos de cadena pesada de Campath-1H (Figura 1)

La mutación 1 es una única diferencia de carga en el residuo 52b de Lys Asp. Se predijo a partir de la modelación molecular de Ab de Campath-1H, y apoyado por la estructura cristalina, que la cadena lateral de este residuo está sobresaliendo del embolsamiento de unión Ag, hacia la aproximación del antígeno. Como la carga positiva de Lys se cree que interacciona con los grupos fosfatos de carga negativa del anclaje GPI de CD52, es posible que esta mutación única destruya la unión al antígeno.

La mutación 2 es una única diferencia de carga en el residuo 52a de Asp a Lys. Se predijo a partir de la modelación molecular de Ab de Campath-1H que este cambio podría interferir con la unión al antígeno.

La mutación 3 es una única diferencia de carga en el residuo 53 de Lys a Asp. A partir de la estructura cristalina de Ab de Campath-1H, está claro que la mayoría de esta cadena lateral del residuo es accesible a disolventes y, por lo tanto, puede estar involucrada en la interacción con los grupos fosfatos de carga negativa del anclaje GPI de CD52, como para la mutación 1.

La mutación 4 es una mutación doble que abarca las sustituciones individuales del mutante 1 y 3 (Lys52b y Lys53 a Asp).

La mutación 5 es una mutación triple que abarca las sustituciones individuales del mutante 1, 2 y 3 (tres diferencias de carga: Asp52a a Lys; Lys52b y Lys53 a Asp).

La mutación 6 es una mutación triple que abarca las sustituciones individuales del mutante 1 y 2 (dos diferencias de carga Asp52a a Lys; Lys52b a Asp) y una mutación adicional de Arg52 a Ala. El residuo 52 se ha mostrado que difiere entre 3 Ab de Campath-1 de afinidad elevada, baja y moderada y, por lo tanto, puede estar directamente involucrado en la maduración de la afinidad. Esto ha su vez pude sugerir una función en la unión al antígeno.

Para cada una de estas mutaciones de cadenas pesadas, el (o los) cambio(s) fue/fueron codificados en cebadores de oligonucleótidos 1B y 2A (Figura 2). La PCR se llevó a cabo sobre DNA de cadena pesada de Campath-1 de "tipo salvaje" usando un cebador en 5' que se hibridaba a la secuencia líder y que contenía un sitio HindIII en dirección ascendente cebador (1A) y un cebador 1B para generar un fragmento de 200 bp. Análogamente, fue generado un cebador 2B (que se hibridaba a CH1 y que contenía un sitio BstXI seguido de un sitio EcoRi) y un cebador 2A, un fragmento de 440 bp. Estos fragmentos fueron purificados sobre gel y seguidamente combinados en una única reacción PCR. El cebador 1A y el cebador 2B fueron añadidos después del primer ciclo (permitiendo así que los 2 trozos de DNA superpuestos se hibridaran antes de la amplificación). A continuación de la PCR, los fragmentos fueron purificados sobre gel y digeridos con HindIII y EcoRI y fueron transferidos en vectores de secuenciado intermedios (PUC19 o pGEM3zf) para la verificación de la secuencia. Un único sitio Pstl ubicado en el Vh de Campath-1 y un único sitio BstXI en la región de CH1 permitieron que las regiones V mutantes (y la secuencia de CH1 parcial) fueran aisladas en forma de fragmentos de Pstl-BstXI de forma que la(s) mutación(es) fuera(n) codificada(s) en seis cassettes de DNA diferentes flanqueados por sitios Pstl y BstXi. Para crear las cadenas pesada de Campath-1H, el constructo de cadena pesada original (en el vector intermedio pGEM9zf) fue cortado con Pstl y BstXI y el fragmento fue suprimido. El DNA restante (que codificaba la secuencia líder de cadena pesada de Campath-1H de la región V en dirección ascendente del sitio Pstl, más la región de CH1 en dirección descendente del sitio BstXCI seguido por la artuculación, CH2, CH3 en pGEM9zf) fue purificado sobre gel (Figura 3). Seguidamente fueron establecidas las ligaduras en las que cada uno de los cassettes de DNA que contenía la(s) mutación(es) anteriormente descrita(s) estaban unidas al DNA de cadena pesada de Campath-1H cortado en pGEM9zf/Pst-BstXi purificado sobre gel. Estas seis cadenas pesadas de Campath-1H mutagenizadas fueron seguidamente aisladas por digestión con HindIII y purificación sobre gel, seguido de ligadura en vector pBAN-2 de expersión de mamíferos cortados en HindIII. Este vector es derivado del vector pNH316 que contiene un marcador seleccionable de neomicina bajo el control del promotor de metalotioneina de ratón y el promotor de \beta-actima humano fuerte/señales de poliadenilación para la expresión del producto génico deseado (Page y Sydenham, 1991). A medida que estos fragmentos fueron introducidos en único sitio de restricción HindIII, la orientación de cada fragmento fue verificada mediante secuenciado de DNA.

Constructo de cadena ligera de Campath-1H para una co-transfección

El DNA que codifica la cadena ligera de Campath-1H de "tipo salvaje" humanizada (secuencia humana en todos los residuos excepto los tres CDR en la región V) fue aislado a partir de un vector intermedio como un fragmento HindIII a EcoRI. Este fragmento fue purificado sobre gel y seguidamente ligado en vector de expresión pRDN-1 de mamífero cortado en HindIII-EcoRI. Este vector es derivado del vector pLD9 que contiene un marcador seleccionable de dihidrofolato reductasa "tarado" (el elemento mejorador del promotor SV40 ha sido suprimido para permitir niveles aumentados de expresión génica en presencia de metrotrexato) y el promotor de \beta-actina humano/señales de poliadenilación para la expresión del producto génico deseado (Page y Sydenham, 1991).

Co-transfección de DNA de cadena ligera de Campath-1H y DNA de cadena pesada mutante

El sistema de expresión usado para producir niveles elevados de Ab de Campath-1H humanizado en el pasado es el sistema de expresión de mamíferos ampliamente usado que caracteriza la amplificación de genes mediante el uso de células de ovario de hamster chino (CHO) deficiente en dihidrofolato reductasa (dhfr) y el uso de promotores de \beta-actina fuertes para la selección y amplificación de los productos génicos deseados (Page y Sydenham, 1991).

Se llevaron a cabo las siguientes transfecciones (TF):

TF1: Simulación (pRDN-1 "vacío" más pBAN-2 "vacío")

TF2: Solamente cadena ligera (cadena ligera/pEDN-1 más pBAN-2 "vacío")

TF3: Cadena ligera/pRDN-1 más mutante 1 de cadena H/pBAN-2

TF4: Cadena ligera/pRDN-1 más mutante 2 de cadena H/pBAN-2

TF5: Cadena ligera/pRDN-1 más mutante 3 de cadena H/pBAN-2

TF6: Cadena ligera/pRDN-1 más mutante 4 de cadena H/pBAN-2

TF7: Cadena ligera/pRDN-1 más mutante 5 de cadena H/pBAN-2

TF8: Cadena ligera/pRDN-1 más mutante 6 de cadena H/pBAN-2

TF9: Cadena ligera/pRDN-1 más "tipo salvaje" de cadena H/pBAN-2

Se mezcló DNA (20 \mug de cadena ligera/pRDN-1 más 20 \mug de cadena pesada/pBAN-2) en un matraz Eppendorf esterilizado, se precipitó con etanol y se aclaró dos veces con etanol al 70%. Los sedimentos de DNA se volvieron a poner en suspensión Tris-EDTAS esterilizado.

Para cada transfección, el DNA fue diluido con 60 \mul de HEPES 20 mM (pH 7,4) en un tubo de poliestireno de 5 ml. En otro tubo se diluyeron 120 \mul de reactivo de transfección liposomal DOTAP (Boehringer Mannheim) con 80 \mul de HEPES 20 mM (pH 7,4). Seguidamente se añadió el DNA/HEPES al DOTAP diluido, se mezcló suavemente y se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se aspiró el medio de cultivo (IMDM + 5% de FCS + HT) en un matraz T75 que contenía células CHO deficientes dhfr que crecían a una confluencia de aproximadamente 50%. El DNA/DOTAP fue seguidamente añadido al matraz junto con 10 ml en medio de cultivo de nueva aportación. El matraz fue cultivado durante 24 h a 37ºC en 5% de CO_{2}. El DNA/DOTAP fue seguidamente aspirado del matraz y a las células se les proporcionaron 15 ml de medio de cultivo de nueva aportación. Después de 24 h adicionales, se inició la selección separando el medio de cultivo y añadiendo medio de selección (IMDM + 5% de FCS dializado +1 mg/ml de G418). Las células fueron cultivadas a 37ºC en 5% de CO_{2} y se añadió medio de selección de nueva aportación en la medida necesaria. Las materias sobrenadantes sobre el cultivo fueron seguidamente ensayadas mediante un ensayo ELISA en cuanto a la presencia de anticuerpo, como se describe con posterioridad.

Detección de Ab secretado en materias sobrenadantes de transfección mediante ensayo ELISA

Placas de microtitulación fueron revestidas con 50 \mul/pocillo de Ig Fc anti-humano (Sigma, número de catalogo I-2136) en PBS a 2,5 \mug/ml durante una noche a 4ºC. El Ab de revestimiento fue retirado y las placas fueron bloqueadas mediante la adicción de 100 \mul/pocillo de tampón bloqueante (PBS + 1%BSA + 5% FCS + 1% de suero de conejo normal inactivado con calor (NRS)) durante una noche a 4ºC. Se añadieron las materias sobrenadantes de la transfección (50 \mul/pocillo) durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con PBS/0,5% de Tween-20 (PBS-Tween). Se añadió Ig anti-humana de oveja biotinilada (Amersham, número de catalogo RPN 1003) diluido 1/5000 en tampón bloqueante o cadena ligera kappa anti-humana de cabra biotinilada (Sigma, número de catalogo B-1393) diluida 1/1000 en tampón bloqueante (50 \mul/pocillo) durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos fueron lavados con PBS/Tween y se añadieron 50 \mul/pocillo de ExtrAvidin-peroxidasa (Sigma, número de catalogo E-2886) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron una vez más y se añadieron 100 \mul/pocillo de sustrato de dihidrocloruro de o-fenilenodiamina (Sigma, número de catálogo P-7288). El cambio de color se midió a 492 nM usando un lector de placas de microtitulación Multiskan Plus.

Detección de unión a antígeno de Campath-1 mediante ensayo ELISA

Placas de microtitulación fueron revestidas con 50 \mul/pocillo de Ig Fc anti-ratón (Sigma, número de catalogo M-4280) en PBS a 2,5 \mug/ml durante una noche a 4ºC. El Ab de revestimiento fue retirado y las placas fueron bloqueadas mediante la adicción de 100 \mul/pocillo de tampón bloqueante (PBS + 1% de BSA + 5% de FCS + 1% de NRS inactivado con calor) durante una noche a 4ºC. Seguidamente se añadió proteína de fusión Ag de Campath-1 recombinante purificada (secuencia que codifica la cadena principal del péptido CD52 fusionada a una secuencia que codifica los dominios CH2 y CH3 de ratón, y purificada en una columna de proteína A) a 4 \mug/ml para cada pocillo (50 \mul/pocillo) en PDS durante una noche a 4ºC. Los pocillos fueron seguidamente lavados con PBS/Tween y las materias sobrenadantes de la transfección fueron añadidas (50 \mul/pocillo) durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos fueron lavados con PBS/Tween y se añadió y Ig anti-humana de oveja biotinilada (Amersham, número de catalogo RPN 1003) diluida en 1/5000 de tampón bloqueante (50 \mul/pocillo) durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con PBS/Tween y se añadieron 50 \mul/pocillo de ExtrAvidin-peroxidasa (Sigma, número de catalogo E-2886) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron una vez más y se añadieron 100 \mul/pocillo de sustrato de dihidrocloruro de o-fenilenodiamina (Sigma, número de catalogo P-7288). El cambio de color fue medido a 492 nM.

Valoración de mutantes que no son de unión mediante ensayo ELISA

El Ab de Campath-1H purificado de "tipo salvaje" se une fuertemente a la proteína de fusión Ag de Campath-1 recombinante en ensayos ELISA. Para proporcionar una comparación para valorar los anticuerpos que no son de unión celular, puede ser titulada la concentración Ab de tipo salvaje justo a que sea detectable la unión. Esto puede ser denominado "unidad de unión de uno Ab". Un mutante que no es de unión adecuado del tipo salvaje no mostrara una unión detectable a un valor de muchas veces esta concentración, por ejemplo, 100 veces o 1000 veces, o preferentemente 10000 veces esta concentración de Ab de Campath-1H de tipo salvaje.

Valoración de mutantes que no son de unión in vivo

Se describe un método alternativo que puede ser aplicado para valorar la potencialidad de no unión. Como se conoce que el Campath-1H de tipo salvaje provoca una fuerte respuesta anti-inmunoglobulina en ratones tras génicos que expresan CD52 humano (véase la siguiente sección para detalles sobre estos ratones), pueden ser usadas preparaciones desagregadas purificadas de los mutantes in vivo para valorar si son inmunogénicas. Si una respuesta anti-globulina no puede ser detectada a dosis entre 1 \mug y 1 mg de mutante desagregado por ratón, esto es un buen indicio del que el mutante es incapaz de unirse a CD52.

B. Modelos in vivo de inducción de la tolerancia

Para ensayar la capacidad de los mutantes mínimos de Campath-1H para hacer que sea tolerante el Ab de Campath-1H de tipo salvaje in vivo, son usados ratones transgénicos. Por ejemplo, pueden ser usados ratones transgénicos que expresen CD52 humano detrás de un promotor CD2 de murina para emular la expresión de CD52 sobre células
T.

Para crear este ratón, un fragmento génomico de 2,8 kb que contiene los dos exones del gen CD52 humano, así como en dirección ascendente de 4,5 kb y la secuencia que flanquea en 3' del gen CD2 humano puede ser introducido en el genoma de ratones trasgénicos. Se cree que están presentes regiones de control elevado en 3' respecto al gen CD2 humano que determina los niveles elevados y la expresión específica para los tejidos del gen (Greaves et al, 1989). Mediante este método, fueron establecidos cuatro fundidores CD52/CBA que transmitían el transgén de hecho, cuando fueron analizadas manchas de sangre periférica de su progenie mediante clasificación celular activada por fluorescencia y manchas de dos colores, se mostró que las células que expresaban CD3 de ratón (células T) expresaban también CD52 humano. Estos ratones fueron criados para una homozigosidad y más de 95% de sus células T expresaban niveles elevados de CD52 humano en la superficie celular.

Estos ratones producen una vigorosa respuesta anti-globulina (título de 1/1000 o más) respecto a Campath-1H de tipo salvaje a dosis de 1 a 10 mg/ratón. Esta respuesta anti-globulina incluyen un componente anti-Id, ya que los bucles de CDR son secuencias de ratas. La eficacia de los mutantes mínimos para hacer tolerantes la provocación posterior de Ab de Campath-1H de tipo salvaje puede ser valorada de las formas siguientes:

1. Administración intravenosa de una única dosis (0,5 a 1 mg/ratón el día 0) de cada mutante que no es de unión celular o Ab testigo irrelevante (desagregado mediante un ultracentrifugación) seguido de provocación con 1 a 10 mg de Ab de Campath-1H de tipo salvaje a las 4 a 6 semanas. La sangre de la cola de 10 días posteriores a la provocación es ensayada mediante ensayos ELISA en cuanto a la especifidad anti-Id de Campath-1H.

2. Administración intravenosa de dosis múltiples (0,5 a 1 m g/ratón) de mutante que no es de unión a celular desagregado o Ab testigo durante 2 meses antes de la provocación con 1 a 10 mg de Ab de Campath-1H de tipo salvaje. Las sangres de la cola 10 días después del desafío fueron ensayadas mediante un ensayo ELISA en cuanto a la especifidad anti-Id de Campath-1H. En ambos casos, el Ab testigo irrelevante va a ser un Ab que no es de unión celular de isotipos coincidentes en ratones, como Campath-9, que es un Ab anti-CD4 humanizado (Gorman et al, 1991).

C. Modo de estrategia que podría ser adoptada para una terapia humana

Una cantidad (por ejemplo, 500 mg de la forma no celular del anticuerpo terapéutico seria administrada un paciente a la espera de un tratamiento con el anticuerpo terapéutico. Preferentemente, el anticuerpo que no es de unión celular administrado está recientemente desagregado (por ejemplo, mediante paso a través de un filtro fino). Un periodo de tiempo después (por ejemplo 7 días) tiempo durante el cual las células T y células B se habrían hecho tolerantes, se habría proporcionado la forma de tipo salvaje del anticuerpo terapéutico.

1) Consideraciones adicionales

1. Debe ser más fácil de hacer tolerante a un mutante mínimo que a HGG o a moléculas de Ab de cadenas mixtas.

En los modelos de tolerancia de Bejamin et al (1986) la tolerancia a HGG policlonal fue inducida en ratones a continuación del agotamiento de CD4 + células T, pero también usando material degradado. Se encontró que la tolerancia a estas proteínas solubles podía ser concedida de forma relativamente fácil. También en el trabajo de Isaacs y Waldmann (1994) se proporcionaron Ab de CV4 mediante la inducción de tolerancia a moléculas de Ab de cadena mixta que no son de unión celular (cadenas H y R irrelevantes y específicas para el antígeno) o se usaron formas que no son de unión celular como tolerogenes por sí mismos a continuación de su desagregación.

En la aproximación modificada para inducir tolerancia usando un mutante mínimo, el carácter ajeno de la proteína será menor que el de HGG policlonal o las moléculas de Ab de cadenas mixtas en ratones. En los casos en los que mAb terapéutico sea humanizado, solamente los bucles de CVDR y en algunos casos algunas posiciones de los entramados están comprendidos por secuencias de roedores. Por lo tanto, puede ser posible inducir una tolerancia con un mutante mínimo desagregado en ausencia de mAb de CD4. Sin embargo, incluso aunque se requiera la administración de CD4, esta disponible un CD4 terapéutico humanizado (CAMPTH-9; Gorman et al, 1991). Los estudios en animales transgénicos deben abordar estos detalles.

2. Creación de una forma monovalente del mutante mínimo (Figura 4). Esta opción se sitúa fuera del alcance de la presente invención, y está incluida solo por motivos de ilustración.

Por tanto, hasta ahora se ha considerado la inducción de tolerancia usando un mutante mínimo que es esencialmente como el terapéutico de tipo salvaje excepto en cuanto a cambio(s) de residuos mínimos que romperán la unión al antígeno. Se propone también una forma monovalente que es también significativamente más pequeña que el mutante mínimo.

En una realización la forma monovalente es una Fv de cadena única [formada por el VL, un conector de péptidos cortos (como los examinados por Huston et al, 1991) y el VH mutado) generalmente fusionado con la secuencia que codifica la articulación CH2-CH3 de IgG1 humana. Este constructo es expresado en asociación con una cadena pesada truncada (articulación CH2-CH3 solamente; Routlrdge et al, 1991) de forma que es expresada una proteína que está compuesta es esencialmente por un único sitio de combinación de Ab y un dominio funcional de Ig Fc. La inmunogenicidad de los diferentes conectores de péptidos se espera que no sea despreciable dado su pequeño tamaño (generalmente 14 a 18 residuos de longitud) y la abundancia de residuos pequeños (por ejemplo, Gly y Ser) que constituyen los conectores. Una elección generalizada es el conector de 15 residuos (Gly_{4}Ser)_{3} en el que los residuos de serina confieren una hidrofilicidad extra sobre la cadena principal del péptido (para inhibir su intercalación entre los dominios variables durante el plegado) y que por lo demás esta exento de cadenas laterales que podrían complicar el plegado de los dominios (Huston et al, 1988).

El SFv asido expresado en células de mamíferos a partir de un cierto número de anticuerpos diferente se ha mostrado que se pliega en la conformación correcta para la unión a antígenos mediante una actividad funcional (Gilliland et al, 1996). La parte Fc es una característica preferida que debería asegurar una semivida del suero comparable a la del mutante mínimo y al Ab terapéutico de tipo salvaje, mientras que la monovalencia asegurara que la unión CD52 está considerablemente reducida debido a la disminución de la avidez. Se ha mostrado ya a partir de experimentos de intercambio de CDR (sección A1) que el Ab de Campath-1 se une escasamente a CD52 de una forma monovalente. Además de reducir la avidez de la molécula, el tamaño más pequeño puede ser una ventaja: en experimentos clásicos de tolerancia, se encontró que cuanto más pequeña fuera la molécula, mejor era para inducir la tolerancia (Parish y Ada, 1969; Anderson, 1969; Miranda et al, 1973). Combinado la monovalencia con un mutante que no es de unión celular puede ser obtenido un tolerogen altamente eficaz.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias

Anderson B. 1969. Induction of immunity and immunologic paralysis in mice against polyvinyl pyrrolidone. J Immunol 102, 1309-1313.

Benjamin R J, Cobbold S P, Clark M R and Waldmann H. 1986. Tolerance to rat monoclonal antibodies: implications for serotherapy. J Exp Med 163, 1539-1552.

Bird R E, Hardman K D, Joacobson J W. 1988. Single-chain antigenbinding proteins. Science 242, 423-426.

Brown J H, Jardetzky T S, Gorga J C, Stern, Urban R G, Strominger J L, Wiley D C. 1993. Three-dimensional structure of the human class II histocompatability antigen HLA-DR1. Nature 364, 33-39.

Chiller J M, Habicht G S, Weigle W O. 1971. Kinetic differences in unresponsiveness of thymus and bone marrow cells. Science 171, 813-815.

Chothia C and Lesk A M 1987. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol. Biol. 196, 901-917.

Chothia C, Lesk A M, Tramontano A, Levitt M, Smith-Gill S J, Air G, Sheriff S, Padlan E A, Davies D, Tulip W R, Colman P M, Spinelli S, Alzari P M, Poljak R J. 1989. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883.

Chothia C, Lesk A M, Gherardi E, Tomlinson I M, Walter G, Marks J D, Llewelyn, M B, Winter G. 1992. Structural repertoire of the human VH segments. J Mol Biol 227, 799-817.

Cobbold S P, Clark M R, Benjamin R J, Waldmann H. Monoclonal antibodies and their use. EP 0.536.807 and EP 0.240.344. Wellcome Foundation Ltd.

Cunningham, B. C. and Wells, J. A. 1989. High resolution epitope mapping of hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis. Science, 244, 1081-1085.

Gilliland L K, Norris N A, Marquardt H, Tsu T T, Hayden M S, Neubauer M G, Yelton D E, Mittler R S, Ledbetter J A. 1996. Rapid and reliable cloning of antibody variable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments. Tissue Antigens, 47, 1-20.

Gorman S D, Clark M R, Routledge, E G, Cobbold S P, Waldmann H. 1991. Reshaping a therapeutic CD4 antibody. Proc Natl Acad Sci USA 88, 41814185.

Gram H, Marconi L A, Barbas C F 3rd, Collet T A, Lemer R A, Kang A S. 1992. In vitro selection and affinity maturation of antibodies from a naive combinatorial immunoglobulin library. Proc Natl Acad Sci USA 89, 3576-
3580.

\newpage

Greaves D R, Wilson F D, Lang G, Kioussis D. 1989. Human CD2 3'-flanking sequences confer high-level, T-cell specific, position independent gene expression in transgenic mice. Cell 56, 979-986.

Hale G, Xia M-Q, Tighe H P, Dyer M J S, Waldmann H. 1990. The CAMPATH-1 antigen (CDw52). Tissue Antigens 35, 118-127.

Hale G, Hoang T, Prospero T, Watt S M, Waldmann H. 1983. Removal of T cells from bone marrow for transplantation: comparison of rat monoclonal anti-lymphocyte antibodies of different isotypes. Mol Biol Med 1, 305-319.

Huston J S, Mudgett-Hunter M, Tai M-S, McCartney J, Warren F, Haber E, Oppermann H. 1991. Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proteins. Methods Enzymol 203, 46-88.

Hoogenboom H R, Griffiths A D, Johnson K S, Chiswell D J, Hudson P, Winter G. 1991. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucl Acids Res 19, 4133-4137.

Hunt D F, Michel H, Dickinson T A, Shabanowitz J, Cox A L, Sakaguchi K, Apella E, Grey H M, Sette A. 1992. Peptides presented to the immune system by the murine class Il major histocompatability molecule I-Ad. Science 256, 1817-1820.

Huston J S, Levinson D, Mudgett-Hunter M et al. 1988. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 85, 5879-5883.

Isaacs J D, Watts R A, Hazleman B L et al. 1992. Humanized monoclonal antibody therapy for rheumatoid arthritis. Lancet 340, 748-752.

Isaacs J D, Waldmann H. 1994. Helplessness as a strategy for avoiding antiglobulin responses to therapeutic monoclonal antibodies. Therapeutic Immunol 1, 303-312.

Jones P T, Dear P H, Foote J, Neuberger M S, Winter G. 1986. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321, 522-525.

Kabat E A, Wu T T, Reid-Miller M, Perry H M, Gottesman K S. 1987. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed. Washington DC, Public Health Service, NIH.

Levitskaya J, Coram M, Levitsky V, Imreh S, Steigerwald-Mullen P M, Klein G, Kurilla M G, Masucci M G. 1995. Inhibition of antigen processing by the internal repeat region of the Epstein-Barr virus nuclear antigen. Nature 375, 685-688.

Lockwood C M, Thiru S, Isaacs J D, Hale G, Waldmann H. 1993. Longterm remission of intractable systemic vasculitis with monoclonal antibody therapy. Lancet 341, 1620-1622.

Low N M, Hollinger P H, Winter G. 1996. Mimicking somatic hypermutation: affinity maturation of antibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain. J Mol Biol 260, 359-368.

Miranda J J Zola H, Howard J G. 1973. Studies on immunological paralysis. X. Cellular characteristics of the induction and loss of tolerance to leva (polyfructose). Immunology 23, 843-855.

Novotny J, Bruccoleri R E, Newell J, Murphy D, Haber E, Karplus M. 1983. Molecular anatomy of the antibody binding site. J Biol Chem 258, 14433-14437.

Page M J, Sydenham M A. 1991. High level expression of the humanized monoclonal antibody Campath-1 H in Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. 9, 64-68.

Parish C R, Ada G L. 1969. The tolerance inducing properties in rats of bacterial flagellin cleaved at the methionine residues. Immunology 17, 153-164.

Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G. 1988. Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332, 323-327.

Routledge E G, Gorman S D, Clark M R. 1993. Reshaping antibodies for therapy. In Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man. ed. M Clark, Academic Titles, Nottingham, UK. pp 13-44.

Routledge E G, Lloyd I, Gorman S D, Clark M, Waldmann H. 1991. A humanized monovalent CD3 antibody which can activate homologous complement. Eur J Immunol 21, 2717-2725.

Rudensky A Y, Preston-Hurlburt P, Hong S, Barlow A, Janeway C A Jr. 1991. Sequence analysis of peptides bound to MHC class Il molecules. Nature 353, 622-627.

Rudensky A, Janeway C A Jr. 1993. Studies on Naturally processed peptides associated with MHC class II molecules. In Sette A (ed.) Naturally Processed Peptides. Basel, Karger, pp 134-151.

Xia M-Q Tone M, Packman L, Hale G, Waldmann H. 1991. Characterization of the CAMPATH-1 (CDw52) antigen: biochemical analysis and cDNA cloning reveal an unusually small peptide backbone. Eur J Immunol 21, 1677-1684.

Claims (11)

1. Uso de un anticuerpo que es una versión modificada de un anticuerpo terapéutico, en el que el anticuerpo terapéutico tiene afinidad por un antígeno de superficie celular en que dicho anticuerpo tiene una afinidad reducida por el antígeno en comparación con el anticuerpo terapéutico como consecuencia de una modificación o de modificaciones en la molécula del anticuerpo, en que (a) hay >90% de identidad de secuencias entre los dominios constantes del anticuerpo y los dominios constantes del anticuerpo terapéutico, (b) la modificación comprende una alteración de al menos una de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs), y (c) el anticuerpo comprende al menos un epitopo presente también en el anticuerpo terapéutico que induce una respuesta inmune en el paciente previsto, para la elaboración de un medicamento para inducir una tolerancia inmunológica al anticuerpo terapéutico.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que hay >90% de identidad de secuencias de aminoácidos entre las regiones de entramado de los dominios variables del anticuerpo y las regiones de entramado del anticuerpo terapéutico.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que las regiones de entramado de los dominios variables del anticuerpo tienen la misma secuencia de aminoácidos que las regiones de entramado del anticuerpo terapéutico.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que la alteración es conseguida mediante una manipulación genética de un ácido nucleico que codifica las CDR.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la afinidad por el antígeno es reducida hasta 50% o menos de la afinidad del anticuerpo terapéutico.

6. Uso según las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo terapéutico tiene afinidad por CD52.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que el anticuerpo terapéutico es un anticuerpo de Campath-1 humanizado.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que la modificación comprende una alteración en (VH) CDR2.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que la modificación comprende una sustitución única o doble de aminoácidos en (VH) CDR2.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que los dominios constantes del anticuerpo tienen la misma secuencia de aminoácidos que los dominios constantes del anticuerpo terapéutico.