ES2296287T3 - Quinasa similar a los receptores de activina (alk), que pertenece a la familia de los receptores de tgf y/o a la familia de los receptores de bmp. - Google Patents
Quinasa similar a los receptores de activina (alk), que pertenece a la familia de los receptores de tgf y/o a la familia de los receptores de bmp. Download PDFInfo
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Abstract
NUEVAS PROTEINAS RECEPTORAS DE SERINA/TREONINA Y PROTEINAS RECEPTORAS DE BMP SON REVELADAS, ASI COMO MOLECULAS DE ADN QUE CODIFICAN DICHAS PROTEINAS Y METODOS PARA UTILIZAR LAS PROTEINAS RECEPTORAS. ADEMAS SE PRESENTAN PROTEINAS Y MOLECULAS RECEPTORAS BMP TRUNCADAS QUE ACTUAN COMO LIGANDOS DE DICHAS PROTEINAS RECEPTORAS BMP.
Description
Quinasa similar a los receptores de activina
(ALK), que pertenece a la familia de los receptores de TGF y/o a la
familia de los receptores de BMP.
La presente invención se refiere a nuevas
proteínas de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa, incluida una nueva familia
de proteínas que son receptoras de proteínas morfogénicas óseas
(BMP). Más particularmente, la presente invención se refiere a
proteínas de receptores que son capaces de unirse a BMP, incluidas
BMP-2 y BMP-4. La presente
invención se refiere, además, a métodos para aislar nuevas proteínas
de receptores de BMP utilizando fragmentos de ADN recientemente
identificados como sondas para el aislamiento de dichas
proteínas.
Las proteínas morfogénicas óseas (BMP) son una
familia de proteínas que se han identificado por su capacidad de
inducir la formación de hueso y cartílago en extractos de tejidos.
Las BMP constituyen una subfamilia dentro de la superfamilia de
TGF-\beta. Las BMP tienen múltiples usos
terapéuticos, incluida una amplia gama de escenarios en los que ha
habido pérdidas óseas debidas a procesos fisiológicos o
traumáticos.
Se ha comprobado que la superfamilia de
proteínas TGF-\beta se unen a receptores con
actividad serina/treonina-quinasa: Massague,
Cell 69: 1067-1070 (1992); Attisano et
al., Cell 68:97-108 (1992); Lin et al.,
Cell, 68:775-785 (1992); Wang et al.,
Cell 67:797-805 (1991). De modo similar, los
receptores de activina han sido aislados y caracterizados como una
serina-quinasa que se ha predicho que atraviesa la
membrana: Mathews et al., Cell 65:973-982
(1991); Nakamura et al., J. Biol. Chem.
267:18924-18928 (1992). Ebner et al.,
Science, 260:1344-1348 (1993) describen la
existencia de receptores de TGF-\beta de tipo I y
de tipo II, y los efectos del receptor de tipo I en la unión del
TGF-\beta al receptor de tipo II.
Se ha descrito que las proteínas de receptores
de tipo I no se unen a las moléculas que son sus ligandos de forma
independiente, sino que, actuando en concierto con las proteínas de
receptores de tipo II, parece que contribuyen a aumentar la unión
del ligando. Ver Matsuzaki et al., J. Biol. Chem.,
268:12719-12723 (1993); Ebner et al.,
Science, 260:1344-1348 (1993).
Paralkar et al., PNAS USA
88:3397-3401 (1991) describen la presencia de sitios
de unión de alta afinidad para BMP-4 en células
MC3T3E1 y NIH3T3. No se encontró competición de
TGF-\beta con las proteínas que se unen a
BMP-4, ni se observó competición de
BMP-4 por los receptores de
TGF-\beta en el estudio de Attisano et al.,
Cell 68:97-108 (1992).
En una forma de realización, la presente
invención comprende una molécula de ADN aislada y purificada que
codifica una proteína de receptor de BMP, tal como se define en la
reivindicación 1.
Entre otras utilizaciones, estas moléculas de
ADN son útiles en la actualidad como sondas para el aislamiento y la
purificación de otros nuevos receptores de BMP.
La presente invención también comprende nuevas
secuencias de ADN que codifican proteínas de receptores; dichas
nuevas secuencias de ADN se identifican mediante un método que
utiliza una secuencia de ADN que codifica la totalidad, o un
fragmento, de las proteínas de receptores de la presente invención.
En formas de realización preferidas, las nuevas secuencias de ADN
se identifican utilizando una secuencia de ADN procedente del
dominio de serina/treonina-quinasa de un receptor,
que está muy conservada en la familia de receptores de BMP. Como
alternativa, la secuencia de ADN que codifica el dominio de unión al
ligando puede utilizarse para identificar otras nuevas secuencias
que codifican receptores de BMP.
La presente invención comprende, además,
moléculas de ADN que codifican proteínas truncadas, solubles, de
receptores, y las mismas proteínas solubles. Las proteínas truncadas
de receptores comprenden preferentemente el dominio de unión al
ligando, pero no los dominios de
serina/treonina-quinasa ni transmembranario, de la
proteína de receptor. Las proteínas truncadas de receptores son
solubles, y serán secretadas en el sobrenadante por células de
mamífero. Así, cuando se expresa en células de mamífero utilizando
una molécula de ADN que codifica una proteína truncada de receptor,
la proteína truncada de receptor será secretada, en vez de
expresarse en la superficie de la célula hospedadora. La proteína
truncada de receptor expresada de dicha manera sigue uniéndose de
forma específica a BMP, y puede utilizarse para bloquear la
mediación de receptores en procesos celulares en los que participan
normalmente como mecanismos de transmisión de señales mediante
competición por el mismo ligando. La proteína truncada de receptor
podría competir por el ligando funcional con proteínas de
receptores que se expresan normalmente en la superficie de células
que responden, e inhibir la formación de un complejo funcional
receptor-ligando, bloqueando de este modo el
mecanismo normal de transmisión de señales del complejo y los
procesos celulares afectados normalmente por las interacciones
funcionales receptor-ligando.
\global\parskip0.900000\baselineskip
En un aspecto, la invención proporciona un
método para producir células que expresan más de una proteína de
receptor, que comprende cultivar una célula hospedadora seleccionada
que contiene una secuencia de polinucleótidos que codifica una
primera proteína seleccionada, que es una proteína de receptor,
proteína truncada de receptor, o fragmento activo de las mismas, y
una secuencia de polinucleótidos que codifica una segunda proteína
seleccionada, que es una proteína de receptor, proteína truncada de
receptor, o fragmento activo de las mismas. Las células
resultantes, que expresarán a la vez múltiple receptores
biológicamente activos, pueden aislarse y utilizarse en una
composición terapéutica.
Otro aspecto de la presente invención comprende
ligandos para los receptores de BMP y la proteína truncada de
receptor de BMP, estando caracterizados dichos ligandos por la
capacidad de unirse a los receptores. Dichos ligandos pueden
estimular el crecimiento del hueso y/o el cartílago, o pueden
afectar a otros procesos del desarrollo. Dichos ligandos pueden ser
anticuerpos monoclonales, pequeños péptidos que son análogos de BMP,
o pequeñas moléculas orgánicas que son análogos de BMP, como se
caracteriza adicionalmente en la presente memoria. En una forma de
realización preferida, dichos ligandos comprenden anticuerpos contra
la proteína truncada, soluble, de receptor y las proteínas de
receptores de la invención. Estos anticuerpos pueden emplearse para
diversas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Dichos
anticuerpos pueden utilizarse para identificar tipos celulares que
expresan de forma natural receptores de la invención y, por
consiguiente, pueden tener la capacidad de provocar una respuesta
biológica cuando se exponen al ligando apropiado. Estos anticuerpos
puede ser útiles también para la identificación de otras proteínas
de receptores capaces de unirse a otras BMP individuales y/o
heterodímeros de BMP. Además, dichos anticuerpos son útiles para
bloquear la formación de complejos funcionales de
receptor-ligando, e inhibir de este modo las
respuestas celulares que serían mediadas normalmente por dichos
complejos. Como alternativa, dichos anticuerpos pueden imitar el
efecto de la BMP por su interacción con el receptor, de modo que se
estimulen las respuestas celulares que serían normalmente mediadas
por un complejo funcional receptor-ligando.
En otra forma de realización, la invención
comprende composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto
identificado primero para dicha utilización como ligando para el
receptor truncado de BMP, y métodos terapéuticos para el
tratamiento de trastornos del hueso y/o del cartílago, que
comprenden administrar un ligando para el receptor truncado de
BMP.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la
siguiente descripción detallada y de las formas de realización
preferidas de la misma.
La SEC ID nº: 1 comprende la secuencia de ADN y
de aminoácidos de la proteína de receptor de BMP
CFK1-23a, aislada a partir de la línea celular de
rata CFK1. Este ADN contenido en el plásmido
CFK1-23a, ha sido depositado y ha recibido el nº de
la ATCC 69378, y se describe con más detalle más adelante.
La SEC ID nº: 2 comprende la secuencia
aminoácida codificada por la secuencia de ADN de
CFK1-23a.
La SEC ID nº: 3 comprende la secuencia de ADN y
de aminoácidos de la proteína de receptor de BMP
CFK1-43a, aislada a partir de la línea celular de
rata CFK1. Este ADN contenido en el plásmido
CFK1-43a ha sido depositado y ha recibido el nº de
la ATCC 69381, y se describe con más detalle más adelante.
La SEC ID nº: 4 comprende la secuencia
aminoácida codificada por la secuencia de ADN de
CFK1-43a.
La SEC ID nº: 5 comprende la secuencia de ADN y
de aminoácidos de la proteína de receptor con actividad
serina/treonina-quinasa CFK1-10a,
aislada a partir de la línea celular de rata CFK1. Este ADN
contenido en el plásmido CFK1-10a ha sido depositado
y ha recibido el nº de la ATCC 69380, y se describe con más detalle
más adelante.
La SEC ID nº: 6 comprende la secuencia
aminoácida codificada por la secuencia de ADN de
CFK1-10a.
La SEC ID nº: 7 comprende la secuencia de ADN y
de aminoácidos de la proteína de receptor con actividad
serina/quinasa W101, aislada a partir de la línea celular murina
W-20-17. Este ADN contenido en el
plásmido pMT101 ha sido depositado y ha recibido el nº de la ATCC
69379, y se describe con más detalle más adelante.
La SEC ID nº: 8 comprende la secuencia
aminoácida codificada por la secuencia de ADN de W101.
La SEC ID nº: 9 comprende la secuencia de ADN y
de aminoácidos de la proteína de receptor con actividad
serina/treonina-quinasa W120, aislada a partir de la
línea celular murina W-20-17. Este
ADN contenido en el plásmido pMT120E ha sido depositado y ha
recibido el nº de la ATCC 69377, y se describe con más detalle más
adelante.
La SEC ID nº: 10 comprende la secuencia
aminoácida codificada por la secuencia de ADN de W120.
La SEC ID nº: 11 comprende la secuencia de ADN y
de aminoácidos de la proteína de receptor con actividad
serina/quinasa KDA-B5. Este ADN se utilizó como
sonda para identificar nuevos receptores con actividad
serina/quinasa de la presente invención.
La SEC ID nº: 12 comprende la secuencia
aminoácida codificada por la secuencia de ADN de
KDA-B5.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La SEC ID nº: 13: comprende la secuencia de ADN
del cebador oligonucleotídico A.
La SEC ID nº: 14: comprende la secuencia de ADN
del cebador oligonucleotídico B.
La SEC ID nº: 15: comprende la secuencia de ADN
del cebador oligonucleotídico C.
La SEC ID nº: 16 comprende la secuencia de ADN
del cebador oligonucleotídico D.
La SEC ID nº: 17 comprende la secuencia de ADN
del cebador oligonucleotídico E.
La SEC ID nº: 18: comprende la secuencia
aminoácida de una porción de KDA-B5 utilizada para
diseñar el cebador oligonucleotídico A.
La SEC ID nº: 19 comprende la secuencia
aminoácida de una porción de KDA-B5 utilizada para
diseñar los cebadores oligonucleotídicos B a E.
Las proteínas morfogénicas óseas se caracterizan
por su capacidad de promover, estimular, o inducir de otro modo la
formación de cartílago y/o hueso. La capacidad de estas proteínas de
presentar actividad de formación de cartílago y/o hueso en el
ensayo de formación de hueso en ratas se describe más adelante.
Estas proteínas pueden utilizarse en composiciones que pueden
emplearse para inducir la formación de hueso y/o cartílago. Estas
composiciones con BMP también pueden utilizarse para la curación de
heridas y la reparación de tejidos. Otras utilizaciones de dichas
composiciones incluyen el tratamiento de defectos del hueso y/o del
cartílago, enfermedad periodontal y otros procesos de reparación de
dientes, el tratamiento de la osteoporosis y el aumento de la
supervivencia neuronal.
Los receptores de BMP y los receptores truncados
de la presente invención son útiles, entre otras aplicaciones, para
la identificación de las BMP, la identificación de otros receptores
de BMP, y la identificación de ligandos o moléculas, incluidos
anticuerpos, que son capaces de imitar las características de unión
de las BMP. Estos ligandos pueden actuar como agonistas o
antagonistas, en función de ligando individual. La actividad de los
ligandos puede caracterizarse en un ensayo de actividad de BMP, tal
como el ensayo de inducción de la fosfatasa alcalina en células
W-20-17 y el ensayo de formación de
hueso ectópico en ratas, descritos más adelante en los Ejemplos XII
y XIII. Los receptores de BMP son también útiles para inhibir los
efectos de las BMP, cuando dicha inhibición es deseable.
Las proteínas de receptores de BMP de la
presente invención pueden caracterizarse por una secuencia
aminoácida que comprende los aminoácidos nº 1-532 de
la SEC ID nº: 2; o los aminoácidos nº 1-502 de la
SEC ID nº: 4.
Las proteínas humanas purificadas de receptores
de BMP de la presente invención pueden producirse cultivando una
célula hospedadora transformada con una secuencia de ADN que
comprende la secuencia de ADN codificante de la SEC ID nº: 1 desde
el nucleótido nº 61 hasta el nucleótido 1656 (o hasta el codón de
terminación 1659); o de la SEC ID nº: 3 desde el nucleótido nº 247
hasta el nucleótido 1752 (o hasta el codón de terminación 1755); y
recuperando y purificando, a partir de la membrana celular
transformada, una proteína que contiene la secuencia aminoácida
derivada, o una secuencia sustancialmente homóloga como la que va
del aminoácido nº 24 hasta el aminoácido nº 532 de la SEC ID nº: 2;
o desde el aminoácido nº 8 hasta el aminoácido nº 502 de la SEC ID
nº: 4. Dado que se espera que las proteínas de receptores de BMP
expresadas de esta manera permanezcan asociadas con la membrana
celular de la célula transformada, las proteínas recombinantes de
receptores de la invención pueden disociarse de la membrana celular
transformada y purificarse después aislándolas de otros materiales
proteicos con los que se coproducen, así como de otros contaminantes
presentes.
Las proteínas truncadas de receptores de BMP de
la presente invención pueden caracterizarse por una secuencia
aminoácida que comprende los aminoácidos nº 1-149 de
la SEC ID nº: 2, o los aminoácidos nº 1-124 de la
SEC ID nº: 4.
Las proteínas truncadas humanas purificadas de
receptores de BMP de la presente invención pueden producirse
cultivando una célula hospedadora transformada con una secuencia de
ADN que comprende la secuencia de ADN codificante de la SEC ID nº:
1 desde el nucleótido nº 61 hasta el nucleótido 507; o de la SEC ID
nº: 3 desde el nucleótido nº 247 hasta el nucleótido 618; y
recuperando y purificando a partir del medio de cultivo una
proteína que contiene la secuencia aminoácida derivada, o una
secuencia sustancialmente homóloga, como la que va del aminoácido
nº 24 hasta el aminoácido nº 149 de la SEC ID nº: 2; o del
aminoácido nº 8 hasta el aminoácido nº 124 de la SEC ID nº: 4. En
las secuencias de aminoácidos anteriores, la secuencia líder
secretora (por ejemplo, aminoácidos 1 hasta 23 de la SEC ID nº: 2)
no estará presente, ya que estas secuencias típicamente se eliminan
por escisión en las proteínas secretadas. La secuencia líder
predicha para la SEC ID nº: 4 por los programas estándar de
ordenador corresponde a los aminoácidos 1 a 7; sin embargo, se
contempla que la secuencia líder real sea más larga, ya que siete
aminoácidos constituyen una secuencia líder inusualmente corta.
Así, la proteína purificada a partir de células hospedadoras
cultivadas transformadas con una molécula de ADN que comprende la
secuencia de ADN de la SEC ID nº: 3 desde el nucleótido nº 247 hasta
el nucleótido 618 puede ser más corta que la secuencia que va desde
el aminoácido nº 8 hasta el aminoácido nº 124 de la SEC ID nº:
4.
Las proteínas truncadas de receptores de BMP
recuperadas a partir del medio de cultivo se purifican aislándolas
de otros materiales proteicos con los que se coproducen y de otros
contaminantes presentes.
Otras proteínas de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa de la presente invención
pueden caracterizarse por una secuencia aminoácida que comprende
los aminoácidos nº 1-509 de la SEC ID nº: 6.
Las proteínas purificadas de receptores con
actividad serina/treonina-quinasa de la presente
invención pueden producirse cultivando una célula hospedadora
transformada con una secuencia de ADN que comprende la secuencia de
ADN codificante de la SEC ID nº: 5 desde el nucleótido nº 474 hasta
el nucleótido 2000 (o hasta el codón de terminación 2003); y
recuperando y purificando a partir de la membrana celular
transformada una proteína que contiene la secuencia aminoácida
derivada, o una secuencia sustancialmente homóloga como la que va
desde el aminoácido nº 18 hasta el aminoácido nº 509 de la SEC ID
nº: 6. Dado que se espera que las proteínas de receptores con
actividad serina/treonina-quinasa expresadas de este
modo permanezcan asociadas a la membrana celular de la célula
transformada, las proteínas recombinantes de receptores de la
invención pueden disociarse de la membrana celular transformada y
purificarse después aislándolas de otros materiales proteicos con
los que se coproducen y de otros contaminantes presentes.
Las proteínas truncadas de receptores con
actividad serina/treonina-quinasa de la presente
invención pueden caracterizarse por una secuencia aminoácida que
comprende los aminoácidos nº 1-121 de la SEC ID nº:
6.
Las proteínas truncadas humanas purificadas de
receptores con actividad serina/treonina-quinasa de
la presente invención pueden producirse cultivando una célula
hospedadora transformada con una secuencia de ADN que comprende la
secuencia de ADN codificante de la SEC ID nº: 5 desde el nucleótido
nº 474 hasta el nucleótido 836 y recuperando y purificando a partir
del medio de cultivo una proteína que contiene la secuencia
aminoácida derivada, o una secuencia sustancialmente homóloga, como
la que va desde el aminoácido nº 18 hasta el aminoácido Nº 121 de
la SEC ID nº: 6. Las proteínas truncadas de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa recuperadas a partir del
medio de cultivo se purifican aislándolas de otros materiales
proteicos con los que se coproducen y de otros contaminantes
presentes.
La proteínas de receptores con actividad
serina/quinasa de la presente invención pueden caracterizarse por
una secuencia aminoácida que comprende los aminoácidos nº
1-505 de la SEC ID nº: 8; o los aminoácidos nº
1-503 de la SEC ID nº: 10.
Las proteínas purificadas de receptores con
actividad serina/quinasa de la presente invención pueden producirse
cultivando una célula hospedadora transformada con una secuencia de
ADN que comprende la secuencia de ADN codificante de la SEC ID nº:
7 desde el nucleótido nº 80 hasta el nucleótido 1594 (o hasta el
codón de terminación 1597); o de la SEC ID nº: 9 desde el
nucleótido nº 83 hasta el nucleótido 1591 (o hasta el codón de
terminación 1594); y recuperando y purificando a partir de la
membrana celular transformada una proteína que contiene la
secuencia aminoácida derivada, o una secuencia sustancialmente
homóloga como la que va desde el aminoácido nº 24 hasta el
aminoácido nº 505 de la SEC ID nº: 8; o desde el aminoácido nº 30
hasta el aminoácido nº 503 de la SEC ID nº: 10. Dado que se espera
que las proteínas de receptores con actividad serina/quinasa
expresadas de este modo permanezcan asociadas con la membrana
celular de la célula transformada, las proteínas recombinantes de
receptores de la invención pueden disociarse de la membrana celular
transformada y purificarse después aislándolas de otros materiales
proteicos con los que se coproducen y de otros contaminantes
presentes.
Las proteínas truncadas de receptores con
actividad serina/treonina-quinasa de la presente
invención pueden caracterizarse por una secuencia aminoácida que
comprende los aminoácidos nº 1-122 de la SEC ID nº:
8; o los aminoácidos nº 1-121 de la SEC ID nº:
10.
Las proteínas truncadas humanas purificadas de
receptores con actividad serina/treonina-quinasa de
la presente invención pueden producirse cultivando una célula
hospedadora transformada con una secuencia de ADN que comprende la
secuencia de ADN codificante de la SEC ID nº: 7 desde el nucleótido
nº 80 hasta el nucleótido 445; o de la SEC ID nº: 9 desde el
nucleótido nº 83 hasta el nucleótido 445; y recuperando y
purificando a partir del medio de cultivo una proteína que contiene
la secuencia aminoácida derivada, o una secuencia sustancialmente
homóloga, como la que va desde el aminoácido nº 24 hasta el
aminoácido nº 122 de la SEC ID nº: 8; o desde el aminoácido nº 30
hasta el aminoácido nº 121 de la SEC ID nº: 10. Las proteínas
truncadas de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa recuperadas a partir del
medio de cultivo se purifican aislándolas de otros materiales
proteicos con los que se coproducen y de otros contaminantes
presentes.
La presente invención también abarca moléculas
de ADN que comprenden las nuevas secuencias de ADN, exentas de
asociación con secuencias de ADN que codifican otros materiales
proteicos, y que codifican la expresión de las proteínas de
receptores descritas anteriormente. Estas secuencias de ADN incluyen
las presentadas en las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7 y 9, en la dirección
5' a 3', y aquellas secuencias que se hibridan en condiciones
restrictivas de hibridación [ver, T. Maniatis et al., Molecular
Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory
(1982), páginas 387 a 389] a las secuencias de ADN de las SEC ID nº:
1, 3, 5, 7 y 9; y codifican una proteína que tiene la capacidad de
unirse a BMP, o que es útil para aislar nuevos receptores de
BMP.
\newpage
De forma similar, las secuencias de ADN que
codifican los anteriores polipéptidos de receptores representados
por las secuencias aminoácidas de las SEC ID nº: 2, 4, 6, 8 y 10,
pero que difieren en la secuencia de codones debido a
degeneraciones del código genético o a variaciones alélicas (cambios
de bases que aparecen en la naturaleza en las poblaciones de
especies y que pueden dar lugar, o no, al cambio de un aminoácido)
también codifican las nuevas proteínas de receptores descritas en
la presente memoria. Las variaciones en las secuencias de ADN de
las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7 y 9 causadas por mutaciones puntuales o
por modificaciones provocadas (incluidas la inserción, deleción y
sustitución) para aumentar la actividad, la semivida o la producción
de los polipéptidos así codificados también están abarcadas por la
invención.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona un nuevo método para la producción de proteínas de
receptores. El método de la presente invención implica el cultivo
de una línea celular adecuada, que ha sido transformada con una
molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la
expresión de una proteína de receptor, bajo control de secuencias
reguladoras conocidas. Las células hospedadoras transformadas se
cultivan, y las proteínas de receptores se recuperan y se purifican
a partir de la membrana celular transformada. Las proteínas
purificadas están sustancialmente exentas de otras proteínas con las
que han sido coproducidas, así como de otros contaminantes.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona un nuevo método para la producción de proteínas
truncadas de receptores. El método de la presente invención implica
el cultivo de una línea celular adecuada, que ha sido transformada
con una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que
codifica la expresión de una proteína truncada de receptor, bajo el
control de secuencias reguladoras conocidas. Las células
hospedadoras transformadas se cultivan, y las proteínas truncadas
de receptores se recuperan y se purifican a partir del medio de
cultivo. Las proteínas purificadas están sustancialmente exentas de
otras proteínas con las que han sido coproducidas, así como de otros
contaminantes.
Las células o líneas celulares adecuadas para la
producción de las proteínas de receptores o de las proteínas
truncadas de receptores pueden ser células de mamífero, tales como
células de ovario de hámster chino (CHO) o células BHK. La
selección de células hospedadoras de mamífero adecuadas, y de
métodos de transformación, cultivo, purificación, cribado, y
producción y purificación del producto son conocidas en la técnica.
Ver, por ejemplo, Gething y Sambrook, Nature,
293:620-625 (1981), o, como alternativa, Kaufman
et al., Mol. Cell. Biol.,
5(7):1750-1759 (1985) o Howley et al.,
patente US nº 4.419.446. Otra línea celular de mamífero adecuada,
que se describe en los ejemplos adjuntos, es la línea celular de
mono COS-1. También puede ser adecuada la línea
celular de mamífero CV-1.
Las células bacterianas también pueden ser
hospedadores adecuados. Por ejemplo, las diferentes cepas de E.
coli (por ejemplo, HB101, MC1061) son bien conocidas como
células hospedadoras en el campo de la biotecnología. También
pueden emplearse en el presente método varias cepas de B.
subtilis, Pseudomonas, otros bacilos, y similares.
Muchas cepas de levaduras conocidas por los
expertos en la materia pueden emplearse asimismo como células
hospedadoras para la expresión de los polipéptidos de la presente
invención. Además, si se desea, pueden utilizarse células de
insecto como células hospedadoras en el método de la presente
invención. Ver, por ejemplo Miller et al., Genetic
Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) y las
referencias citadas en dicho documento.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona vectores para su utilización en la expresión de dichos
nuevos polipéptidos de receptores. Preferentemente, los vectores
contienen las nuevas secuencias completas de ADN descritas
anteriormente, que codifican las nuevas proteínas de receptores de
la invención. Además, los vectores contienen secuencias adecuadas
para el control de la expresión, que permiten la expresión de las
secuencias de la proteína de receptor.
Como alternativa, los vectores que incorporan
secuencias modificadas de ADN como se ha descrito anteriormente son
también formas de realización de la presente invención, y son útiles
para la producción de las proteínas de receptores. Los vectores
pueden emplearse en el método de transformación de líneas celulares
y contienen secuencias reguladoras seleccionadas asociadas
funcionalmente a las secuencias codificantes de ADN de la invención
que son capaces de dirigir la replicación y la expresión de las
mismas en células hospedadoras seleccionadas. Las secuencias
reguladoras útiles para dichos vectores son conocidas por los
expertos en la materia y pueden seleccionarse en función de las
células hospedadoras escogidas. Dicha selección es una práctica
habitual y no forma parte de la presente invención.
Se ha comprobado que las proteínas de receptores
de BMP de la presente invención, tales como CFK1-23a
y CFK1-43a, se unen a miembros de la familia de
BMP, preferentemente BMP-2 y BMP-4,
pero no al TGF-\beta. Por tanto, las proteínas de
receptores de BMP de la presente invención se distinguen de los
receptores del TGF-\beta, que se unen al
TGF-\beta.
La presente invención puede incluir la
cotransfección de células con moléculas de ADN que comprenden
secuencias de ADN que codifican múltiples proteínas de receptores
con el objeto de lograr la unión a una molécula de ligando tal como
una BMP. Así, por ejemplo, una molécula de ADN que comprende una
secuencia de ADN que codifica la proteína de receptor
CFK1-10a puede utilizarse para cotransfectar células
junto con una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN
que codifica la proteína de receptor CFK1-23a o
CFK1-43a.
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Las moléculas de ADN que comprenden secuencias
de ADN que codifican las proteínas de receptores de la presente
invención son útiles para la producción de células que expresan
proteínas de receptores. Cuando estas células se transforman con
las moléculas de ADN de la presente invención, expresarán proteínas
de receptores en su superficie. A su vez, estas células se unirán
más fácilmente al ligando y pueden demostrar una mayor capacidad de
respuesta al ligando. Por ejemplo, las células que expresan las
proteínas de receptores de BMP de la presente invención presentan
una mayor unión a BMP-2 y BMP-4, y
mostrarán una mayor capacidad de respuesta a BMP tales como
BMP-2 y BMP-4. La mayor capacidad de
respuesta a BMP es deseable para acelerar los efectos de las BMP,
que incluyen la estimulación osteoinductora del crecimiento de
huesos y de la regeneración del cartílago.
Las proteínas de receptores de BMP de la
presente invención son útiles para el aislamiento de BMP. Además,
las proteínas de receptores de BMP de la invención son útiles para
la identificación de nuevas moléculas relacionadas con las BMP, que
pueden ser capaces de provocar la formación de hueso o cartílago, o
pueden afectar a otros procesos del desarrollo. Además, las
proteínas de receptores de BMP son útiles para la identificación y/o
cuantificación de BMP-2 y/o BMP4 en una muestra,
así como para la inhibición de los efectos de BMP-2
o BMP-4 en las células. Los receptores de BMP de la
presente invención pueden ser útiles también para la identificación
de compuestos químicos sintéticos y naturales capaces de imitar los
efectos de la unión de BMP-2 y/o
BMP-4. Las proteínas de receptores de BMP de la
invención pueden ser útiles también para la identificación de
compuestos químicos sintéticos y naturales capaces de antagonizar
y/o inhibir los efectos de la unión de BMP-2 y/o
BMP4. Las proteínas de receptores de BMP también pueden ser útiles
para la identificación de compuestos que desempeñan una función en
la regulación de la expresión de proteínas de receptores de BMP.
Dichos compuestos podrían utilizarse para estimular la capacidad de
respuesta a BMP, por ejemplo: crecimiento óseo, en tejidos
particulares o células de interés.
Las nuevas proteínas de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa de la presente invención
también incluyen W101 y W120, que han sido aisladas a partir de la
línea celular murina W-20-17, una
línea celular que se sabe que responde a BMP. El ADN que codifica
una de dichas nuevas proteínas de receptores se ha utilizado como
sonda para aislar otros clones que son miembros potenciales de la
clase de proteínas de receptores de BMP, incluidos los clones
CFK1-23a y CFK1-43a, de los que se
ha confirmado que codifican proteínas que son miembros de la
familia de receptores de BMP. De este modo, las moléculas de ADN que
comprenden la secuencia de ADN que codifica las proteínas de
receptores con actividad serina/quinasa de la presente invención son
útiles para el aislamiento del ADN que codifica proteínas de
receptores de BMP, y la presente invención incluye dicho método de
utilización de las moléculas de ADN que comprenden la secuencia de
ADN que codifica proteínas de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa, así como las nuevas
proteínas de receptores de BMP aisladas de dicha forma.
En una forma de realización de la presente
invención, las nuevas secuencias de ADN que codifican proteínas de
receptores de BMP se identifican por un método que utiliza la
secuencia de ADN que codifica la totalidad, o un fragmento, de las
proteínas de receptores con actividad serina/quinasa de la presente
invención. En formas de realización preferidas, las nuevas
secuencias de ADN se identifican utilizando la secuencia de ADN que
codifica el dominio de serina/treonina-quinasa de un
receptor. Como alternativa, la secuencia de ADN que codifica el
dominio de unión al ligando podría utilizarse para identificar otras
nuevas secuencias codificantes de receptores de BMP.
Por tanto, la presente invención comprende,
además, métodos para la identificación de nuevas proteínas de
receptores de BMP y moléculas de ADN que codifican dichas proteínas,
y las proteínas y moléculas de ADN identificadas de esta forma. El
método comprende preparar un fragmento de ADN que codifica un
dominio seleccionado de una proteína de receptor de BMP,
preferentemente el dominio de la quinasa de una proteína de receptor
de BMP, o, como alternativa, un fragmento de ADN que codifica el
dominio de unión al ligando, y utilizar dicho fragmento como sonda
para cribar una genoteca genómica o de ADNc. La genoteca de ADNc se
prepara preferentemente a partir de una línea celular que se sabe
que expresa receptores de BMP. Dichas líneas incluyen la línea
celular murina W-20-17 y la línea
celular de rata CFK1. Las secuencias de ADN así identificadas
comparten homología con la proteína conocida de receptor de BMP,
por lo que se espera que codifiquen una proteína que capaz de unirse
a una o más BMP. Utilizando métodos conocidos en la técnica se
puede clonar la secuencia completa de ADN identificada de este
modo, que se puede utilizar para expresar la nueva proteína
identificada de receptor de BMP. La identificación de la nueva
proteína como una proteína de receptor de BMP se confirma utilizando
el ensayo de unión descrito en el Ejemplo VI.
Otra forma de realización de la presente
invención comprende moléculas de ADN que comprenden secuencias de
ADN que codifican proteínas truncadas de receptores, y las propias
proteínas truncadas. Las proteínas truncadas de receptores
preferentemente comprenden el dominio de unión al ligando, pero no
los dominios de serina/treonina-quinasa y
transmembranario, de la proteína de receptor. Las proteínas
truncadas de receptores son solubles, y serán secretadas en el
sobrenadante por células de mamífero. De este modo, cuando se
expresa en células de mamífero utilizando una molécula de ADN que
codifica una proteína truncada de receptor, la proteína truncada de
receptor será secretada en vez de expresarse en la superficie de la
célula hospedadora. La proteína truncada de receptor así expresada
sigue uniéndose de forma específica a su ligando. Así, las proteínas
truncadas de receptores de BMP pueden utilizarse para bloquear la
mediación de receptores de BMP de la invención en procesos celulares
en los que participan normalmente como mecanismos de transmisión de
señales. La proteína truncada de receptor podría competir por la
unión al ligando funcional con proteínas de receptores expresadas
normalmente en la superficie de células que responden, e inhibir la
formación de un complejo funcional de
receptor-ligando, bloqueando de este modo el
mecanismo normal de transmisión de señales del complejo y los
procesos celulares afectados normalmente por las interacciones de
los complejos funcionales receptor-ligando.
Las composiciones que contienen las proteínas
truncadas de receptores de BMP de la presente invención pueden
utilizarse para la inhibición de los efectos de las BMP, tales como
BMP-2 y/o BMP-4, en las células. La
presente invención incluye métodos terapéuticos que comprenden la
administración de dicha composición por vía tópica, sistémica, o
local, como implante o dispositivo. Cuando se administra, la
composición terapéutica para su utilización en la presente
invención está, naturalmente, en una forma exenta de pirógenos,
aceptable desde el punto de vista fisiológico. Además, puede ser
deseable encapsular o inyectar la composición en forma viscosa para
su suministro en el lugar deseado. Opcionalmente, también pueden
incluirse o administrarse de forma simultánea o secuencial agentes
terapéuticos útiles tales como factores de crecimiento (por ejemplo,
BMP, TGF-\beta, FGF, IGF), citocinas (por
ejemplo, interleucinas y CSF) y antibióticos, junto con la
composición de receptores en los métodos de la invención.
Otra forma de realización de la presente
invención comprende células que han sido transformadas con las
moléculas de ADN que comprenden secuencias de ADN que codifican las
proteínas de receptores de BMP de la presente invención. Dichas
células expresarán receptores de BMP en la superficie, lo que
aumentará la capacidad de respuesta de las células a BMP. De este
modo, las células transformadas con las moléculas de ADN que
codifican las proteínas de receptores de BMP pueden administrarse
de forma terapéutica, para estimular la respuesta a BMP, por
ejemplo: regeneración de hueso y/o cartílago en el lugar
deseado.
Existe una amplia gama de métodos que pueden
utilizarse para suministrar las células que expresan proteínas de
receptores de BMP a un sitio para su utilización en la estimulación
de una respuesta a BMP tal como la regeneración de hueso y/o
cartílago. En una forma de realización de la invención, las células
que expresan la proteína de receptor de BMP pueden suministrarse
por aplicación directa, por ejemplo, inyección directa de una
muestra de dichas células en el lugar que presenta un defecto del
hueso o del cartílago. En una forma de realización particular,
dichas células pueden purificarse. En una forma de realización
preferida, las células que expresan la proteína de receptor de BMP
pueden suministrarse en un medio o matriz que impide parcialmente
su movilidad, de modo que las células queden localizadas en un sitio
en el que haya una lesión del hueso o del cartílago. Dicho medio o
matriz puede ser un semisólido, tal como pasta o gel, incluido un
polímero de tipo gel. Como alternativa, el medio o matriz puede
estar en forma de sólido, preferentemente, un sólido poroso que
permite la migración de células a la matriz sólida, y las mantiene
en dicho lugar permitiendo la proliferación de las células.
En un método de la presente invención, las
células que expresan receptores de BMP se aplican al sitio deseado
como se ha descrito anteriormente, y se aplica BMP. La BMP puede
aplicarse de forma simultánea o inmediatamente después de la
aplicación de las células que expresan receptores de BMP. Las BMP
son conocidas y se han descrito como sigue: BMP-2
(a veces denominada BMP-2A) y BMP-4
(a veces denominada BMP-2B), patente US nº
5.013.649; BMP-3, patente US nº 5.116.738;
BMP-5, patente US nº 5.106.748;
BMP-6, patente US nº 5.187.076;
BMP-7, patente US nº 5.141.905;
BMP-8, publicación PCT nº WO93/00432;
BMP-9, nº de serie 07/720.590, presentada el 25 de
junio de 1991; BMP-10, nº de serie _____, presentada
el 12 de mayo de 1993. Se han descrito heterodímeros en la
solicitud de patente US nº de serie 07/787.496, presentada el 7 de
abril de 1992. La BMP puede aplicarse de formas conocidas en la
técnica, tales como las descritas en las patentes anteriores, así
como en la patente US nº 5.171.579.
Para producir la proteína de receptor, el ADN
que codifica la proteína deseada se transfiere a un vector de
expresión adecuado y se introduce en células de mamífero u otros
hospedadores eucarióticos o procarióticos preferidos mediante
técnicas convencionales de ingeniería genética. El sistema de
expresión preferido en la actualidad para la proteína recombinante
de receptor biológicamente activa son las células de mamífero
transformadas de forma estable.
El experto en la materia puede construir
vectores de expresión en mamíferos empleando la secuencia de la SEC
ID nº: 1, 3, 5, 7 ó 9, u otras secuencias de ADN que contienen las
secuencias codificantes de la SEC ID nº: 1, 3, 5, 7 ó 9, u otras
secuencias modificadas y vectores conocidos, tales como pCD [Okayama
et al., Mol. Cell Biol., 2:161-170
(1982)] y pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J.,
4:645-653 (1985)]. Las secuencias de ADNc de la
proteína de receptor pueden modificarse mediante eliminación de los
nucleótidos no codificantes adyacentes a los extremos 5' y 3' de la
región codificante. Los nucleótidos no codificantes eliminados puede
sustituirse, o no, por otras secuencias que sabe que son
beneficiosas para la expresión. La utilización de dichos vectores
para transformar células hospedadoras adecuadas puede dar lugar a la
expresión de proteínas de receptores.
El experto en la materia puede manipular las
secuencias de la SEC ID nº: 1, 3, 5, 7 ó 9 eliminando o sustituyendo
las secuencias reguladoras de mamífero que flanquean la secuencia
codificante con secuencias bacterianas, para crear vectores
bacterianos para la expresión intracelular o extracelular en células
bacterianas. Por ejemplo, las secuencias codificantes puede
manipularse de forma adicional (por ejemplo, pueden ligarse a otros
conectores conocidos, o modificarse eliminando las secuencias no
codificantes de las mismas, o alterando los nucleótidos de las
mismas mediante otras técnicas conocidas). La secuencia codificante
modificada de la proteína de receptor puede insertarse después en
un vector bacteriano conocido utilizando procedimientos tales como
los descritos en T. Taniguchi et al., Proc. Natl Acad. Sci.
USA 77:5230-5233 (1980). Este ejemplo de vector
bacteriano puede después utilizarse para transformar células
hospedadoras bacterianas y expresar de este modo la proteína de
receptor. Para consultar una estrategia para producir la expresión
extracelular de proteínas de receptores en células bacterianas,
ver, por ejemplo, la solicitud de patente europea EPA 177.343.
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Pueden realizarse manipulaciones similares para
la construcción de un vector de insectos [Ver, por ejemplo los
procedimientos descritos en la solicitud publicada de patente
europea 155.476] para la expresión en células de insecto. También
puede construirse un vector de levaduras empleando secuencias
reguladoras de levaduras para la expresión intracelular o
extracelular de las proteínas de receptores de la presente invención
por células de levaduras. [Ver, por ejemplo, los procedimientos
descritos en la la publicación de solicitud de PCT WO86/00639, y la
solicitud de patente europea EPA 123.289].
Un método para producir niveles elevados de una
proteína de receptor de la invención en células de mamífero implica
la construcción de células que contienen múltiples copias de uno o
más de los genes heterólogos de receptores. El gen heterólogo se
conecta a un marcador amplificable, por ejemplo el gen de la
dihidrofolato-reductasa (DHFR) de modo que las
células que contienen más copias del gen pueden seleccionarse para
su propagación en concentraciones crecientes de metotrexato (MTX)
siguiendo los procedimientos de Kaufman y Sharp, J. Mol.
Biol., 159:601-629 (1982). Esta estrategia puede
emplearse con diversos tipos celulares distintos.
Por ejemplo, un plásmido que contiene una
secuencia de ADN para una proteína de receptor de BMP de la
invención asociada funcionalmente a otras secuencias plasmídicas
que permiten la expresión de la misma, y el plásmido de expresión
de DHFR pAdA26SV(A)3 [Kaufman y Sharp, Mol. Cell.
Biol., 2:1304 (1982)] pueden introducirse conjuntamente en
células CHO que carecen de DHFR, DUKX-BII, mediante
coprecipitación con fosfato de calcio y transfección,
electroporación, fusión de protoplastos o lipofección. Los
transformantes que expresan DHFR se seleccionan para su cultivo en
medio alfa con suero dializado de ternero fetal, y después se
seleccionan para su amplificación mediante cultivo en
concentraciones crecientes de MTX (por ejemplo, en etapas
secuenciales de 0,02, 0,2, 1,0 y 5 \muM de MTX) como se describe
en Kaufman et al., Mol Cell Biol., 5:1750 (1983).
Los transformantes se clonan, y se mide la unión
a BMP-2 o BMP-4 mediante el ensayo
de unión descrito anteriormente en el Ejemplo VI. La unión a
BMP-2 y BMP-4 debe aumentar al
aumentar los niveles de resistencia al MTX. Pueden seguirse
procedimientos similares para producir otras proteínas relacionadas
de receptores de BMP.
Según una forma de realización de la presente
invención, la célula hospedadora puede cotransfectarse con uno o
más vectores que contienen secuencias codificantes de una o más
proteínas de receptores, proteínas truncadas de receptores, o
fragmentos activos de las mismas. Cada secuencia de polinucleótidos
de receptores puede estar presente en el mismo vector o en vectores
individuales cotransfectados en la célula. Como alternativa, los
polinucleótidos que codifican receptores, receptores truncados, o
fragmentos de los mismos, pueden incorporarse en un cromosoma de la
célula hospedadora. Además, una sola unidad de transcripción puede
codificar una sola copia de dos genes que codifican diferentes
proteínas de receptores.
Según otra forma de realización de la presente
invención, la célula hospedadora seleccionada que contiene las dos
secuencias que codifican polipéptidos es una línea celular hibrida
obtenida por fusión de dos células hospedadoras estables
seleccionadas, en la que cada célula hospedadora se transfecta con,
y es capaz de expresar de forma estable, una secuencia de
polinucleótidos que codifica una primera o segunda proteína
seleccionada, que es una proteína de receptor, proteína truncada de
receptor o fragmento activo de las mismas.
Por consiguiente, en otro aspecto de la presente
invención, se proporcionan composiciones de células que expresan
más de una forma recombinante de proteína de receptor, proteína
truncada de receptor, o fragmentos activos de las mismas, que
retienen las características de unión del receptor o del receptor
truncado. También se proporcionan composiciones de proteínas
truncadas de receptores secretadas por las células hospedadoras. Las
células, proteínas y composiciones de proteínas de receptores,
proteínas truncadas de receptores, o fragmentos activos de las
mismas, pueden caracterizarse por su capacidad de unirse de forma
selectiva a las BMP con mayor afinidad de unión que otras proteínas
de la superfamilia de TGF-\beta en un ensayo de
unión.
Las células y composiciones pueden comprender
una o más proteínas de receptores de BMP, proteínas truncadas de
receptores de BMP, o fragmentos activos de las mismas; o una o más
proteínas de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa, proteínas truncadas de
receptores con actividad serina/treonina-quinasa, o
fragmentos activos de las mismas, tales como W-101,
W-120 o CFK1-10a, en combinación con
una o más proteínas de receptores de BMP, proteínas truncadas de
receptores de BMP, o fragmentos activos de las mismas, tales como
CFK1-23a o CFK1-43a. Dichas células
o composiciones pueden producirse mediante coexpresión de cada
proteína en una célula hospedadora seleccionada y aislamiento de
las células en una composición o, en el caso en el que se producen
proteínas truncadas de receptores, mediante aislamiento de las
proteínas truncadas de receptores a partir del medio de cultivo.
En otro aspecto adicional de la presente
invención se proporciona una línea celular que comprende una primera
secuencia de polinucleótidos que codifica una primera proteína de
receptor, proteína truncada de receptor, o fragmento activo de las
mismas, y una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica una
segunda proteína de receptor, proteína truncada de receptor, o
fragmento activo de las mismas, estando las secuencias bajo control
de uno o más sistemas reguladores de expresión adecuados capaces de
coexpresar las proteínas de receptores. La línea celular puede
transfectarse con una o más de una molécula de polinucleótido. Como
alternativa, la línea celular puede ser una línea celular híbrida
creada por fusión de células, como se ha descrito anteriormente.
Otro aspecto de la invención es una molécula de
polinucleótido o vector plasmídico que comprende una secuencia de
polinucleótidos que codifica una primera proteína seleccionada, que
es una proteína de receptor, proteína truncada de receptor, o
fragmento activo de las mismas, y una secuencia de polinucleótidos
que codifica una segunda proteína seleccionada, que es una proteína
de receptor, proteína truncada de receptor, o fragmento activo de
las mismas. Las secuencias están bajo control de por lo menos una
secuencia reguladora adecuada capaz de dirigir la coexpresión de
cada proteína o fragmento activo. La molécula puede contener una
sola unidad de transcripción que contiene una copia de ambos genes,
o más de una unidad de transfección, que contiene cada una, una
copia de un solo gen.
Una forma de realización del método de la
presente invención para la producción de composiciones de células o
proteínas recombinantes de receptores implica el cultivo de una
línea celular adecuada, que ha sido cotransfectada con una
secuencia de ADN que codifica la expresión de una primera proteína
de receptor, proteína truncada de receptor, o fragmento activo de
las mismas, y una secuencia de ADN que codifica la expresión de una
segunda proteína de receptor, proteína truncada de receptor, o
fragmento activo de las mismas, bajo control de secuencias
reguladoras conocidas. Las células hospedadoras transformadas se
cultivan, y las células se aíslan y se purifican para formar
composiciones de células transformadas. En la forma de realización
en la que se producen proteínas truncadas de receptores, la
proteína truncada de receptor se recupera y se purifica a partir del
medio de cultivo, y puede utilizarse para formar composiciones de
proteínas truncadas de receptor.
En otra forma de realización de dicho método,
que es el método preferido en la actualidad para la expresión de
las proteínas recombinantes de receptores de la presente invención,
una sola célula hospedadora, por ejemplo, una célula CHO DUKX, se
cotransfecta con una primera molécula de ADN que contiene una
secuencia de ADN que codifica una proteína de receptor, tal como la
proteína de receptor CFK1-10a, y una segunda
molécula de ADN que contiene una secuencia de ADN que codifica una
segunda proteína seleccionada de receptor, como la proteína de
receptor de BMP CFK1-23a o CFK1-43a.
Uno o ambos plásmidos contienen un marcador seleccionable que puede
utilizarse para generar líneas celulares estables que expresan las
proteínas de receptores. Estos plásmidos individuales que contienen
distintos genes de receptores en unidades distintas de transcripción
se mezclan y se transfectan en células CHO utilizando protocolos
convencionales. Puede determinarse una relación de plásmidos que
proporcione la expresión máxima de la actividad en el ensayo de
unión.
Por ejemplo, relaciones iguales de un plásmido
que contiene el gen de la primera proteína de receptor y un gen
marcador de dihidrofolato-reductasa (DHFR) y otro
plásmido que contiene el gen de una segunda proteína de receptor y
un gen marcador de DHFR pueden introducirse conjuntamente en células
CHO, DUKX-BII, que carecen de DHFR, por
coprecipitación con fosfato de calcio y transfección,
electroporación, microinyección, fusión de protoplastos o
lipofección. Los transformantes individuales que expresan DHFR se
seleccionan mediante cultivo en medio alfa con suero dializado de
ternero fetal mediante técnicas convencionales. Las células DHFR+
que contienen más copias del gen pueden seleccionarse para su
propagación en concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) (por
ejemplo, etapas secuenciales en 0,02, 0,1, 0,5 y 2,0 \muM de MTX)
siguiendo los procedimientos de Kaufman y Sharp, J. Mol.
Biol., 159:601-629 (1982); y Kaufman et al.,
Mol. Cell Biol., 5:1750 (1983). La expresión de por lo menos
una proteína de receptor ligada a la DHFR debería aumentar al
aumentar los niveles de resistencia al MTX. Las células que
expresan de forma estable uno o ambos genes de proteína de
receptor/DHFR sobrevivirán. Sin embargo, con mucha frecuencia, las
líneas celulares incorporan de forma estable y expresan ambos
plásmidos que estaban presentes durante la transfección inicial.
Después se recoge el medio condicionado y la proteína de receptor
se aísla por métodos convencionales y se analiza para medir su
actividad. Esta estrategia puede emplearse con células que carecen
de DHFR.
Como forma de realización alternativa de este
método, una molécula de ADN que contiene un gen de receptor
seleccionado puede transfectarse en una línea celular estable que ya
expresa otro gen de receptor seleccionado. Por ejemplo, una línea
celular CHO estable que expresa el gen del receptor
CFK1-10a con el marcador DHFR puede transfectarse
con un plásmido que contiene el gen del receptor
CFK1-23a y un gen de un segundo marcador
seleccionable, por ejemplo, la resistencia a la neomicina (Neo).
Tras la transfección, las células se cultivan y se seleccionan
células adecuadas por tratamiento con MTX y el antibiótico G418. Las
células que sobreviven se criban para detectar la expresión de
ambas proteínas de receptores. Este sistema de expresión tiene la
ventaja de permitir la selección en una sola etapa.
También pueden utilizarse estrategias
alternativas de selección dual utilizando diferentes líneas
celulares o diferentes marcadores. Por ejemplo, la utilización de
un marcador de adenosina-desaminasa (ADA) para
amplificar el gen del segundo receptor en una línea celular CHO
estable que expresa un receptor diferente con el marcador de DHFR
puede ser preferible, dado que el nivel de expresión puede
aumentarse utilizando la amplificación de genes mediada por
desoxicoformicina (DCF). Como alternativa, cualquier línea celular
que exprese un receptor generada primero utilizando este marcador
puede recibir después un vector de expresión de un segundo receptor
que contiene un marcador distinto, y puede seleccionarse la
resistencia dual y la coexpresión de los receptores.
Otra forma de realización adicional de un método
para la expresión de receptores de la presente invención incluye
transfectar la célula hospedadora con una sola molécula de ADN que
codifica múltiples genes para la expresión en una sola unidad de
transcripción o en unidades de transcripción distintas. La expresión
multicistrónica implica múltiples polipéptidos codificados en un
solo transcrito, que pueden traducirse de forma eficaz a partir de
vectores que utilizan una secuencia líder, por ejemplo, a partir del
virus EMC, a partir del poliovirus, o a partir de otras fuentes
convencionales de secuencias líder. Dos genes de receptores (Rx y
Ry, respectivamente) y un marcador seleccionable pueden expresarse
en una sola unidad de transcripción. Por ejemplo, los vectores que
contienen la configuración
Rx-EMC-Ry-DHFR o
Rx-EMC-Ry-EMC-DHFR
pueden utilizarse para transfectar células CHO, y seleccionarse y
amplificarse utilizando el marcador DHFR. Puede construirse un
plásmido que contiene secuencias de ADN que codifican dos
receptores diferentes, uno o más genes marcadores, y una secuencia
líder o reguladora adecuada en una sola unidad de transcripción.
De modo similar, pueden transfectarse células
hospedadoras con un solo plásmido que contiene unidades de
transcripción distintas para cada receptor. Un marcador
seleccionable, por ejemplo, DHFR, puede estar presente en otra
unidad de transcripción, o, como alternativa, como el segundo
cistrón en uno o en ambos genes de receptores. Estos plásmidos
pueden utilizarse para transfectar una célula hospedadora
seleccionada para la expresión de los receptores.
Otra forma de realización de este método de
expresión implica la fusión de células. Dos líneas celulares
estables que expresan receptores seleccionados, tales como una
línea celular transformada con un vector para
CFK1-23a (por ejemplo, pMV23a) y una línea celular
transformada de forma estable con un vector para
CFK1-43a (por ejemplo, pMV43a), generada utilizando
el sistema de amplificación de genes con DHFR/MTX y que expresa
elevados niveles de receptores, pueden transfectarse con uno o
varios genes marcadores dominantes (por ejemplo, neo^{r},
higromicina^{r}, GPT). Después de un tiempo suficiente de
cocultivo (aproximadamente un día) una línea celular resultante que
expresa un receptor y un marcador dominante puede fusionarse con una
línea celular que expresa un receptor diferente, y preferentemente
un marcador diferente, utilizando un reactivo fusigénico, tal como
polietilenglicol, virus Sendai, u otro agente conocido.
Los híbridos celulares resultantes que expresan
ambos marcadores dominantes y DHFR pueden seleccionarse utilizando
condiciones de cultivo adecuadas, y haciendo un cribado de la
coexpresión de los receptores, los receptores truncados, o los
fragmentos de los mismos. La célula híbrida seleccionada contiene
secuencias que codifican ambos receptores seleccionados; y ambos
receptores serán retenidos en la membrana de la célula. Las
composiciones de células que expresan múltiples receptores pueden
utilizarse en los métodos de la presente invención para
interaccionar con BMP. En el caso en el que se utilizan genes que
codifican receptores truncados, el receptor truncado se forma en la
célula y después se secreta. La proteína truncada de receptor se
obtiene en el medio condicionado, y se aísla y se purifica a partir
del mismo empleando métodos convencionales. La composición
resultante de proteína de receptor puede caracterizarse por métodos
descritos en la presente memoria, y puede utilizarse en los métodos
de la presente invención, por ejemplo, para competir por la unión al
ligando con receptores presentes en células, e inhibir de este modo
la actividad de BMP.
Las líneas celulares generadas empleando las
estrategias descritas anteriormente pueden utilizarse para producir
la coexpresión de polipéptidos de receptores. Las proteínas de
receptores se retienen en la membrana de las células. Las
composiciones de las células pueden utilizarse para aumentar la
respuesta a BMP, por ejemplo, para estimular la formación de
cartílago y/o hueso. Las composiciones de las células pueden
aplicarse junto con BMP.
En el caso en el que se producen polipéptidos
truncados de receptores, las proteínas de receptores se aíslan a
partir del medio de cultivo en forma sustancialmente exenta de otras
proteínas con las que se coproducen, así como de otros
contaminantes presentes en las células hospedadoras, empleando
técnicas convencionales de purificación. El método de producción
preferido en la actualidad es la cotransfección con diferentes
vectores de células CHO y la amplificación de genes mediada por
metotrexato. Pueden utilizarse líneas celulares estables para
generar medio condicionado que contiene el receptor truncado, que
puede purificarse y analizarse in vitro e in vivo
para detectar su actividad. Por ejemplo, las líneas celulares
resultantes que producen receptores truncados obtenidas mediante
cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria pueden
cribarse para detectar su actividad empleando los ensayos de unión
descritos en el Ejemplo VI, expresión de ARN, y expresión de
proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).
Los métodos descritos anteriormente para la
coexpresión de los receptores de la presente invención utilizan
células hospedadoras o líneas celulares adecuadas. Las células
adecuadas incluyen preferentemente células de mamífero, tales como
células de ovario de hámster chino (CHO). La selección de células
hospedadoras adecuadas de mamífero y los métodos de transformación,
cultivo, amplificación, cribado, y producción y purificación del
producto se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Gething y
Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981), o,
como alternativa, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol.,
5(7):1750-1759 (1985), o Howley et
al., patente US nº 4.419.446. Otras líneas celulares adecuadas
de mamíferos son la línea celular CV-1, las líneas
celulares EHK, y la línea celular 293.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona moléculas de ADN o vectores plasmídicos para su
utilización en la expresión de dichas proteínas recombinantes de
receptores. Estos vectores plasmídicos pueden construirse empleando
métodos conocidos y componentes disponibles conocidos por los
expertos en la materia. En general, para generar un vector útil en
los métodos de la presente invención, el ADN que codifica la
proteína deseada: proteína de receptor, proteína truncada de
receptor, o fragmento activo de las mismas, se transfiere a uno o
más vectores de expresión apropiados, adecuados para la célula
hospedadora seleccionada.
En la actualidad se contempla el empleo de
cualquier vector de expresión adecuado para la expresión eficaz en
células de mamífero para producir las proteínas recombinantes de
receptores de la presente invención en células hospedadoras de
mamífero. Preferentemente, los vectores contienen las secuencias de
ADN del receptor descritas anteriormente y en las listas de
secuencias, que codifican las proteínas seleccionadas: proteínas de
receptores, o proteínas truncadas de receptores. Como alternativa,
los vectores que incorporan secuencias modificadas son asimismo
formas de realización de la presente invención, y son útiles para la
producción de los vectores.
Además de los vectores específicos descritos
anteriormente, el experto en la materia puede construir vectores de
expresión en mamíferos empleando la secuencia de la SEC ID nº: 1, 3,
5, 7 ó 9, u otras secuencias de ADN que codifican proteínas de
receptores, proteínas truncadas de receptores, o fragmentos activos
de las mismas, y vectores conocidos, tales como pCD [Okayama et
al., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)] y pJL3,
pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653
(1985)]. Las secuencias de ADN de los receptores pueden modificarse
eliminando los nucleótidos no codificantes en los extremos 5' y 3'
de la región codificante. Los nucleótidos no codificantes
eliminados pueden sustituirse, o no, por otras secuencias que se
sabe que son beneficiosas para la expresión. La utilización de
estos vectores para transformar células hospedadoras adecuadas, como
se ha descrito anteriormente, puede producir las proteínas de
receptores.
El experto en la materia podría manipular las
secuencias de la SEC ID nº: 1, 3, 5, 7 ó 9 eliminando o sustituyendo
las secuencias reguladoras de mamífero que flanquean la secuencia
codificante, con, por ejemplo, secuencias reguladoras de levadura o
de insecto, para crear vectores para la expresión intracelular o
extracelular en levaduras o en células de insecto. [Ver, por
ejemplo, los procedimientos descritos en la publicación de solicitud
de patente europea 155.476] para la expresión en células de
insecto; y los procedimientos descritos en la publicación de
solicitud PCT WO86/00639 y en la solicitud de patente europea EPA
123.289 para la expresión en células de levadura].
De modo similar, secuencias bacterianas y
codones de preferencia pueden sustituir a las secuencias en los
vectores de mamíferos descritos y presentados como ejemplo para
crear sistemas de expresión adecuados para su utilización en la
producción de las proteínas de receptores en el método descrito
anteriormente. Por ejemplo, las secuencias codificantes podrían
manipularse adicionalmente (por ejemplo, ligándolas a otros
conectores conocidos, o modificándolas por eliminación de las
secuencias no codificantes de las mismas, o por alteración de los
nucleótidos contenidos en las mismas utilizando otras técnicas
conocidas). Las secuencias codificantes modificadas de los
receptores podrían insertarse después en un vector bacteriano
conocido utilizando procedimientos tales como los descritos en T.
Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:5230-5233 (1980). El vector bacteriano del
ejemplo podría después utilizarse para transformar células
hospedadoras bacterianas, y expresar de este modo las proteínas de
receptores.
Otros vectores útiles en los métodos de la
presente invención pueden contener múltiples genes en una sola
unidad de transcripción. Por ejemplo, un plásmido propuesto contiene
el gen del receptor CFK1-10a seguido de la
secuencia líder del EMC, seguido por el gen del receptor de BMP
CFK1-23a, seguido por el gen marcador de DHFR. Otro
ejemplo contiene el gen del receptor de BMP
CFK1-23a, la secuencia líder del EMC, el gen del
receptor con actividad serina/treonina-quinasa W101,
otra secuencia líder del EMC y el gen marcador de DHFR. Como
alternativa, el vector puede contener más de una unidad de
transcripción. Como ejemplo, el plásmido puede contener una unidad
de transcripción para el gen del receptor de BMP
CFK1-23a y una unidad de transcripción distinta
para el gen del receptor CFK1-43a, es decir,
CFK1-23a-EMC-DHFR y
CFK1-43a-EMC-DHFR.
Como alternativa, cada unidad de transcripción del plásmido puede
contener un gen marcador diferente. Por ejemplo, el plásmido puede
contener
CFK1-10a-EMC-Neo y
CFK1-43a-EMC-DHFR.
Naturalmente, los ejemplos anteriores no son limitantes. Otras
combinaciones (por ejemplo, coexpresión) de los receptores de la
presente invención se encuentran también dentro del alcance de la
invención.
Además, los vectores pueden contener también
secuencias adecuadas para el control de la expresión, que son
capaces de dirigir la replicación y la expresión del receptor en las
células hospedadoras seleccionadas. Las secuencias reguladoras
útiles para dichos vectores son conocidas por el experto en la
materia y puede seleccionarse en función de las células
hospedadoras escogidas. Dicha selección es práctica habitual y no
forma parte de la presente invención. De modo similar, los vectores
pueden contener uno o más marcadores de selección, tales como el
gen de resistencia a antibióticos Neo, o marcadores seleccionables
tales como DHFR y ADA. El gen marcador preferido en la actualidad
es DHFR. Dichos genes marcadores pueden ser seleccionados también
por el experto en la materia.
Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de
la presente invención para la recuperación y caracterización de las
proteínas de receptores de la presente invención y su empleo para
recuperar las correspondientes proteínas humanas de receptores de
la presente invención, y para la expresión de las proteínas mediante
técnicas recombinantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se utiliza en la presente memoria, se
dice que una molécula es "similar a BMP" si presenta por lo
menos un actividad similar a BMP. A los efectos de la invención, la
actividad similar a BMP incluye la capacidad de unirse a un
receptor truncado de BMP y de estimular la proliferación de líneas
celulares dependientes de BMP tales como la línea celular
W-20-17 descrita en el Ejemplo VIII.
Tal como se utiliza la presente memoria, el término "anticuerpo
monoclonal similar a BMP" incluye anticuerpos monoclonales no
humanos similares a BMP, regiones determinantes de la
complementariedad (CDR) de los anticuerpos monoclonales no humanos
similares a BMP, centros de reconocimiento de BMP de los
anticuerpos monoclonales no humanos similares a BMP, todas las
formas injertadas de los centros de reconocimiento de BMP de los
anticuerpos monoclonales no humanos similares a BMP, y pequeños
péptidos que son análogos de BMP.
Según la presente invención, el término
"análogo de BMP" abarca anticuerpos monoclonales, pequeños
péptidos, y pequeñas moléculas que poseen actividad similar a BMP.
Para los efectos de la invención, actividad similar a BMP se define
como la capacidad de unirse al receptor truncado de BMP y de
estimular la proliferación de líneas celulares dependientes de BMP
tal como la línea celular W-20-17
descrita en el Ejemplo VIII.
Los anticuerpos monoclonales similares a BMP de
la invención pueden ser objeto de alteraciones moleculares para
aumentar su utilidad como fármacos humanos. Por ejemplo, las CDR de
los anticuerpos monoclonales similares a BMP comprenden sitios de
reconocimiento específicos para receptores de BMP, que están
abarcados por la presente invención. Dichas CDR pueden insertarse
en regiones de la estructura de la inmunoglobulina humana para
reducir al mínimo la antigenicidad causada por la presencia de
regiones de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, empleando las
técnicas descritas en el documento WO 91/09967. Los sitios de
reconocimiento del receptor de BMP de la presente invención pueden
también insertarse en otras estructuras de proteínas para aumentar
al máximo la eficacia terapéutica de los análogos de BMP generados
a partir de los mismos. Las CDR de los anticuerpos monoclonales
similares a BMP también pueden ser objeto de alteraciones
moleculares para formar anticuerpos de cadena única.
Las CDR de los anticuerpos monoclonales
similares a BMP también pueden utilizarse para generar pequeños
péptidos que son análogos de BMP. Toda la CDR puede estar presente
en los pequeños péptidos que son análogos de BMP de la invención, o
una porción de la CDR similar a BMP puede comprender dichos pequeños
péptidos que son análogos de BMP. Dos o más CDR pueden unirse en la
orientación "cabeza a cabeza", "cabeza a cola", o "cola
a cola" para formar dímeros o multímeros de pequeños péptidos
que son análogos de BMP. Dado que cada anticuerpo monoclonal
similar a BMP puede contener múltiples CDR, una sola CDR puede estar
presente en el pequeño péptido que es un análogo de BMP, o pueden
estar presentes diferentes CDR similares a BMP procedentes de uno o
más anticuerpos monoclonales similares a BMP. Aminoácidos no
presentes en la naturaleza, sintéticos, y
D-aminoácidos pueden sustituir a los aminoácidos
específicos de las CDR similares a BMP.
La invención abarca asimismo péptidos que se
unen específicamente al receptor truncado, y que tienen actividad
similar a BMP. Dichos péptidos pueden estar basados, pero no
exclusivamente, en la secuencia de las CDR de los anticuerpos
similares a BMP. Los péptidos pueden estar "conectados" o
"unidos" a otros péptidos en estructuras multiméricas de dos
péptidos o más, para generar la actividad similar a BMP. Los
aminoácidos de los péptidos puede ser, pero no exclusivamente,
aminoácidos "no naturales" de, por ejemplo,
estereoespecificidad D, o análogos de aminoácidos con otros grupos
químicos, o unidos a la cadena principal peptídica. Los péptidos
también pueden tener estructura cíclica. Tal y como se utiliza en
la presente memoria, un péptido es una molécula que comprende por lo
menos dos aminoácidos, y hasta treinta aminoácidos.
La invención también abarca pequeñas moléculas
orgánicas, que pueden incluir moléculas similares a aminoácidos,
que presentan unión específica al receptor de BMP humano truncado, y
que poseen actividad similar a BMP. Según la presente invención,
las "pequeñas moléculas orgánicas" se definen como moléculas no
proteicas que contienen carbonos, de peso molecular menor de 3000,
que se han identificado primero debido a su empleo como análogos de
BMP utilizando el receptor truncado de la invención. Las pequeñas
moléculas orgánicas de la invención son susceptibles de ser
incorporadas en fármacos orales para el tratamiento de trastornos
del hueso y/o del cartílago.
Las composiciones farmacéuticas que contienen
los anticuerpos monoclonales similares a BMP, pequeños péptidos que
son análogos de BMP, o pequeñas moléculas orgánicas de la presente
invención son útiles para el tratamiento de varios trastornos del
hueso y/o del cartílago de diversas etiologías. Dichas composiciones
farmacéuticas pueden contener también sustancias aceptables desde
el punto de vista farmacéutico, tales como excipientes, diluyentes,
sustancias de relleno, sales, tampones, estabilizantes, y/o otros
materiales bien conocidos en la técnica. El término "aceptable
desde el punto de vista farmacéutico" significa un material no
tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica
del principio o principios activos. Las características del
excipiente o de otro material dependerán de la vía de
administración.
La administración de los anticuerpos
monoclonales similares a BMP, pequeños péptidos que son análogos de
BMP, o de las pequeñas moléculas orgánicas de la invención, puede
llevarse a cabo empleando diversas vías convencionales, incluidas
la utilización de matrices y/o excipientes tales como los descritos
en la patente US nº 5.171.579. Para los anticuerpos monoclonales
similares a BMP, es preferida la administración intravenosa al
paciente. También puede emplearse la inyección cutánea o subcutánea
para la administración de la realización de anticuerpo monoclonal
de la invención. La administración oral es preferida para la
administración de las realizaciones de análogos de BMP en forma de
pequeños péptidos y pequeñas moléculas orgánicas de la
invención.
La cantidad de anticuerpo monoclonal similar a
BMP, análogo en forma de pequeño péptido o pequeña molécula
orgánica de la composición farmacéutica de la presente invención,
dependerá de la naturaleza y gravedad del trastorno que se va a
tratar, y de la naturaleza de los tratamientos previos administrados
al paciente. En última instancia, el médico encargado decidirá la
cantidad de análogo de BMP con el que se tratará a cada paciente
individual. Se contempla que las diversas composiciones
farmacéuticas de la presente invención contengan aproximadamente
0,1 \mug hasta aproximadamente 100 \mug de molécula análoga de
BMP por kg de peso corporal.
Dos secuencias peptídicas procedían de la
secuencia aminoácida del receptor de activina en la región descrita
como el dominio de la quinasa de la molécula (Mathews et al.,
Cell, 65:973-982 (1991)). Estas secuencias
particulares fueron seleccionadas sobre la base de una comparación
entre la secuencia aminoácida del producto del gen
Daf-1 y el receptor de activina, y se ha predicho
que estarán conservadas en otras moléculas de receptores con
actividad serina/treonina-quinasa. Las dos
secuencias peptídicas seleccionadas fueron:
1.
Asn-Glu-Tyr-Val-Ala-Val-Lys
2.
His-Arg-Asp-Ile-Lys-Ser
Se diseñó el siguiente cebador oligonucleotídico
basado en la secuencia aminoácida nº 1, y se sintetizó en un
sintetizador automático de ADN.
Cebador oligonucleotídico A:
GCGGATCCGARTAYGTNGCNGTNAAR
Los primeros 8 nucleótidos de este cebador
(subrayados) comprenden una secuencia de reconocimiento de la
endonucleasa de restricción BamHI para facilitar las manipulaciones
posteriores de los productos de ADN amplificado, y no proceden de la
secuencia aminoácida nº 1.
Los siguientes cebadores oligonucleotídicos se
diseñaron sobre la base de la secuencia aminoácida nº 2 y se
sintetizaron en un sintetizador automático de ADN.
Cebador oligonucleotídico B:
GACTCTAGARCTYTTDATRTCYCTRTG
Cebador oligonucleotídico C:
GACTCTAGARCTYTTDATRTCNCGRTG
Cebador oligonucleotídico D:
GACTCTAGANGAYTTDATRTCYCTRTG
Cebador oligonucleotídico E:
GACTCTAGANGAYTTDATRTCNCGRTG
Los primeros 9 nucleótidos de los cebadores B a
E (subrayados) comprenden una secuencia de reconocimiento de la
endonucleasa de restricción XbaI para facilitar las manipulaciones
posteriores de los productos de ADN amplificado, y no proceden de la
secuencia aminoácida nº 2.
Los símbolos estándar de nucleótidos en los
cebadores identificados anteriormente son los siguientes: A =
adenosina, C = citosina, G = guanina, T = timina, R = adenosina o
guanina, Y = citosina o timina, y D = guanina, adenosina o
timina.
Estos oligonucleótidos han sido seleccionados
por su capacidad prevista para amplificar de forma específica las
secuencias codificantes del dominio de
serina/treonina-quinasa similares a las presentes en
la secuencia del receptor de activina. Dado que las moléculas de
activina y de BMP son miembros de la gran superfamilia
TGF-\beta de factores de crecimiento y
diferenciación, cabe predecir que sus correspondientes receptores
estarán asimismo relacionados en estructura y secuencia aminoácida
primaria. La secuencia del receptor de TGF-\beta
de tipo II (Lin et al., Cell, 68:775-785
(1992)) indica que, como es el caso del receptor de activina, es
también una serina/treonina-quinasa. Sobre la base
de las relaciones descritas anteriormente, cabe predecir que estos
oligonucleótidos degenerados amplificarán de forma específica
secuencias que codifican fragmentos de otras moléculas que son
receptores con actividad serina/treonina-quinasa,
incluidos los receptores de activina, los receptores de
TGF-\beta y los receptores de BMP.
La línea celular de ratón
W-20-17 que responde a
BMP-2 se seleccionó como fuente del ARNm del que
cabe predecir que contiene moléculas capaces de codificar
receptores de BMP. Se extrajo el ARN total de células
W-20-17 utilizando procedimientos
estándar conocidos por los expertos en la materia, y después se
seleccionó el ARNm por cromatografía con
oligo-(dT)-celulosa. Se utilizaron 10 ng del ARNm de
W-20-17 como molde para sintetizar
la primera cadena del ADNc en una mezcla de reacción (volumen total
de 20 \mul) que contenía 1 mM de cada uno de los
desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 5
mM, 1 U/\mul de inhibidor de ARNasa, 2,5 U/\mul de transcriptasa
inversa, 2,5 \muM de hexámeros al azar, y 20 ng del ARNm de
W-20-17 descrito anteriormente. Esta
mezcla de reacción se incubó durante 10 minutos a temperatura
ambiente, seguido por 15 minutos a 42ºC, y después 5 minutos a 99ºC.
La reacción completada para la síntesis de la primera cadena del
ADNc se mantuvo después a 4ºC.
Las combinaciones de oligonucleótidos que
comprendían el cebador oligonucleotídico A emparejado con cualquiera
de los cebadores oligonucleotídicos B, C, D o E fueron utilizadas
como cebadores para permitir la amplificación de las secuencias
específicas de nucleótidos del molde de la primera cadena del ADNc
de W-20-17 descrita anteriormente.
La reacción de amplificación se llevó a cabo ajustando la reacción
de la primera cadena del ADNc descrita anteriormente (20 \mul)
hasta un volumen de 100 \mul con el objeto de llevar los
componentes del tampón de reacción hasta las siguientes
concentraciones finales: MgCl_{2} 2 mM, Tris-HCl
10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, 2,5 U/100 \mul de ADN polimerasa Taq,
1 pM/\mul del cebador oligonucleotídico A y 1 pM/\mul de
cualquiera de los cebadores oligonucleotídicos B, C, D o E. Después
se incubó la mezcla de reacción completa a 95ºC durante dos
minutos, y después se sometió a ciclos térmicos de la siguiente
manera: 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 40ºC y 1 minuto a 72ºC durante
cuarenta ciclos; seguido por una incubación de 7 minutos a 72ºC,
después de lo cual se mantuvo la reacción completada a 4ºC.
El ADN que había sido específicamente
amplificado por esta reacción se precipitó con etanol, se digirió
con las endonucleasas de restricción BamHI y XbaI y se sometió a
electroforesis en gel de agarosa. Las regiones del gel en las que
aparecían bandas de ADN se cortaron, y el ADN contenido se eluyó con
un kit de extracción en gel QIAEX (nº de catálogo de Qiagen: 20020)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN
extraídos del gel se subclonaron en el vector plasmídico
pGEM-3 entre los sitios BamHI y XbaI de la región
de clonación múltiple. El análisis de la secuencia de ADN de uno de
los subclones resultantes llamado KDA-B5 indicaba
que el inserto de la secuencia de ADN específicamente amplificada
codifica una secuencia aminoácida homóloga a la correspondiente
región de los dominios de la quinasa del receptor de activina y del
producto del gen Daf-1 en la región en la que se
diseñaron los cebadores oligonucleotídicos A, B, C, D y E (como se
ha descrito al comienzo del presente apartado). La secuencia
aminoácida codificada por esta región de la secuencia de
KDA-B5 específicamente amplificada presenta una
identidad del 41% y 47% con las correspondientes regiones de los
dominios de la quinasa del receptor de activina y de
Daf-1, respectivamente.
La secuencia de ADN y la secuencia aminoácida
derivada del fragmento de ADN de KDA-B5
específicamente amplificado se exponen en la SEC ID nº: 11 y la SEC
ID nº: 12, respectivamente.
Los nucleótidos 1-24 de la
secuencia expuesta en la SEC ID nº: 11 comprenden una porción del
cebador oligonucleotídico A, y los nucleótidos
319-341 comprenden una porción del complemento
inverso del cebador oligonucleotídico B utilizado para llevar a
cabo la reacción de amplificación específica. Debido a la función de
los oligonucleótidos A y B en la iniciación de la reacción de
amplificación, puede que no correspondan exactamente a la secuencia
real codificada por la proteína KDA-B5 de ratón, por
lo que no han sido traducidos en la secuencia aminoácida derivada
anterior.
La secuencia de 341 pb del inserto de
KDA-B5 expuesta en la SEC ID nº: 11 se utilizó como
sonda para cribar una genoteca de ADNc de
W-20-17 en condiciones poco
restrictivas (4X SSC, SDS al 0,1% a 60ºC) para tratar de aislar
otras secuencias de ratón relacionadas con KDA-B5 de
la siguiente manera.
Se sembraron 1.000.000 recombinantes de una
genoteca de ADNc de W-20-17 (Thies
et al., Endocrinology, 130:1318-1324 (1992))
construida en el vector \lambdaZAPII a una densidad de 20.000
placas de bacteriófagos recombinantes en cada una de 100 placas de
cultivo. Se hicieron réplicas duplicadas de las placas en
nitrocelulosa. Un fragmento de ADN que correspondía a la secuencia
de 341 pb del inserto de KDA-B5 presentado en la SEC
ID nº: 11 se marcó con ^{32}P por el procedimiento de cebado al
azar de Feinberg et al., Anal. Biochem.
132:6-13 (1983), y se hibridó a un grupo de filtros
en tampón estándar de hibridación (SHB: 5X SSC, SDS al 0,1%,
solución de Denhardt 5X, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón)
a 60ºC durante 2 días. El otro grupo de filtros se hibridó a una
sonda de ADN que correspondía a los nucleótidos nº 710 hasta 1044 de
la secuencia publicada del receptor de activina (Mathews et
al., Cell, 65:973-982 (1991)) en las mismas
condiciones descritas para el primer grupo. Esta región del dominio
de la quinasa del receptor de activina corresponde a la secuencia
de ADN del inserto de KDA-B5. Los filtros se lavaron
en condiciones poco restrictivas (4X SSC, SDS al 0,1% a 60ºC). Se
seleccionaron 13 placas de bacteriófagos recombinantes que
resultaron positivas en la hibridación y se sembraron de nuevo en
placas de cultivo para cribados secundarios. Se hicieron de nuevo
réplicas duplicadas de las placas recombinantes en nitrocelulosa. De
nuevo, un grupo de filtros se hibridó con la sonda de
KDA-B5 y el otro grupo con la sonda del receptor de
activina, como se ha descrito anteriormente para el cribado
primario (en SHB a 60ºC durante 2 días). Ambos grupos de filtros se
lavaron empleando las condiciones poco restrictivas descritas
anteriormente (4X SSC, SDS al 0,1% a 60ºC). Dos recombinantes que
presentaban una potente hibridación con la sonda de
KDA-B5 pero no con la correspondiente sonda del
receptor de activina fueron seleccionados para su análisis
posterior. Estos dos clones de ADNc, denominados
W-101 y W-120, fueron purificados
por placas y sus insertos fueron transferidos al plásmido Bluescript
SK (+/-) siguiendo el protocolo de escisión in vivo descrito
por el fabricante (Stratagene). El análisis de la secuencia de ADN
de estos recombinantes indicaba que codificaban proteínas homólogas
al receptor de activina y al producto del gen
Daf-1. La secuencia de ADN y la secuencia aminoácida
derivada de una porción de pMT101 (ATCC 69379) se exponen en la SEC
ID nº: 7 y la SEC ID nº: 8, respectivamente.
La secuencia de nucleótidos del clon
W-101 indica que codifica un polipéptido parcial de
467 aminoácidos que comprende la porción carboxiterminal de la
molécula del receptor murino W-101. Se preparó una
genoteca de ADNc cebada al azar a partir del ARNm de
W-20-17 utilizando un hexámero al
azar pd(N)_{6} (Pharmacia/LKB, nº de catálogo
27-2166-01) para cebar la síntesis
de la primera cadena del ADNc a partir del molde de ARNm de
W-20-17. La genoteca se cribó con un
oligonucleótido de 30 bases que correspondían a los nucleótidos nº
245 hasta 274 de la SEC ID nº: 7. La secuencia de ADN utilizada para
diseñar esta sonda de oligonucleótido procedía de la secuencia
codificante del clon W-101. La hibridación se llevó
a cabo en SHB a 65ºC y se emplearon condiciones de lavado
restrictivas con 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC para eliminar la sonda
unida de forma no específica. El inserto de ADN de uno de dichos
clones, WR9, se caracterizó por análisis de la secuencia de ADN y
se comprobó que contenía secuencias codificantes adicionales en 5'
del receptor W-101 murino que no estaban presentes
en el clon original ADNc descrito anteriormente. Sin embargo, el
inserto de 0,7 kb del clon W9 carece de las secuencias que
codifican la región C-terminal de la proteína del
receptor W-101 murino. Con el objeto de construir
una secuencia de ADNc que codifique la proteína completa del
receptor W-101, las secuencias de ADN del
oligo-(dT) original y del clon W9 cebado al azar han sido unidas en
un sitio común de endonucleasa de restricción BstEII. La secuencia
expuesta en la SEC ID nº: 7 contiene un marco abierto de lectura de
1515 pares de bases que codifica la secuencia completa de 505
aminoácidos de la proteína del receptor W-101
murino. Los nucleótidos 1-660 de la secuencia
expuesta en la SEC ID nº: 7 proceden del clon W9 de ADNc, mientras
que el resto de la secuencia (los nucleótidos
661-1648) procede del clon de ADNc
W-101 cebado con el oligo-(dT). La secuencia de
reconocimiento de la endonucleasa de restricción BstEII, GGTNACC
(situada en la posición 660-666), facilitó la
construcción de esta secuencia quimérica de ADNc. Esta construcción
se llevó a cabo digiriendo el clon W-101 y el clon
W9 con la endonucleasa de restricción BstEII, lo que da lugar a la
linealización de cada plásmido en el sitio común de BstEII de sus
respectivos insertos. Los dos plásmidos linealizados fueron
aislados en gel, y después ligados entre sí en dicho sitio y
digeridos con la endonucleasa de restricción SalI para separar la
secuencia expuesta en la SEC ID nº: 7 de las secuencias del vector
plasmídico (pBluescript). Los fragmentos de ADN resultantes de esta
reacción secuencial de ligado y digestión con SalI fueron sometidos
a electroforesis en un gel de agarosa. Una región que contenía un
fragmento de ADN de aproximadamente 2,3 kb, que comprendía 660 pb
del extremo 5' del ADNc de W9 y aproximadamente 1,64 kb del extremo
3' del ADNc original de W-101, se cortó del gel y
el ADN allí contenido se eluyó con el kit de extracción en gel QIAEX
(Qiagen, nº de catálogo 20020) siguiendo las instrucciones del
fabricante. El fragmento de ADN resultante que comprende la
secuencia expuesta en la SEC ID nº: 7 (que codifica la proteína
completa del receptor W101 murino) se subclonó en el vector de
expresión en células de mamíferos pMT3 en el sitio Sal I de la
región de clonación múltiple. Este plásmido se denomina pMT101.
La secuencia de nucleótidos de una porción del
inserto del clon de ADNc W120 se expone en la SEC ID nº: 9. La
presunta secuencia codificante de la metionina iniciadora está
precedida por 68 pb de secuencia no traducida en 5' y define un
marco abierto de lectura de 1509 pb que codifica la secuencia
completa de 503 aminoácidos de la molécula del receptor
W-120 murino. El codón de terminación está seguido
por al menos 203 pb de secuencia no traducida en 3'. El inserto del
clon W120 que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID nº: 9 se
cortó del plásmido pBluescript empleando la endonucleasa de
restricción EcoRI, y se transfirió al vector de expresión en
células de mamíferos pMT3 en el sitio EcoRI de la región de
clonación múltiple. Este plásmido se denomina pMT120E y ha sido
depositado en la American Type Culture Collection (ATCC nº
69377).
Otra línea celular que responde a
BMP-2, CFK1 [Bernier y Goltzman, J. Cell.
Physiol., 152:317 (1992)], se seleccionó como fuente de ARNm
que estaba previsto que contuviese moléculas capaces de codificar
receptores de BMP y otras secuencias codificantes de
serina/treonina-quinasa relacionadas con el receptor
del TGF-\beta, el receptor de activina,
daf-1, W101 y W-120.
Se sembraron 1 x 10^{6} recombinantes de una
genoteca de ADNc de CFK1 construida en el vector \lambdaZAPII a
una densidad de 20.000 placas de bacteriófagos recombinantes en cada
una de 50 placas de cultivo. Se hicieron réplicas duplicadas de las
placas en nitrocelulosa. Un fragmento de ADN de 645 pares de bases
del inserto de ADNc de W-101 correspondiente a los
nucleótidos nº 828-nº 1472 de la SEC ID nº: 7 se
marcó con ^{32}P mediante el procedimiento de cebado al azar de
Feinberg et al., Anal. Biochem., 132:6-13
(1983) y se hibridó con ambos grupos de filtros en SHB a 60ºC
durante dos días. Los filtros se lavaron empleando condiciones poco
restrictivas (4X SSC, SDS al 0,1% a 60ºC). Se observaron muchos
recombinantes duplicados que presentaban hibridación de intensidad
variable (aproximadamente 200). 27 placas de bacteriófago, que eran
representativas de la amplia gama de intensidades de hibridación,
fueron purificadas por placas y sus insertos fueron transferidos al
plásmido pBluescript SK (+/-) siguiendo el protocolo de escisión
in vivo descrito por el fabricante (Stratagene). El análisis
de la secuencia de ADN de varios recombinantes indicaba que
codifican proteínas homólogas al receptor de activina,
Daf-1 y otras proteínas de receptores de la
familia de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa.
La secuencia de nucleótidos del clon
CFK1-10a comprende un marco abierto de lectura de
1527 pb, y codifica una proteína de receptor
CFK1-10a de 509 aminoácidos. Se considera que los
509 aminoácidos codificados de la proteína de receptor
CFK1-10a constituyen el producto de traducción
primario, ya que la secuencia codificante está precedida por 458 pb
de secuencia no traducida en 5' con codones de terminación en los
tres marcos de lectura. La secuencia de ADN y la secuencia
aminoácida derivada de la mayor parte del inserto de
CFK1-10a (ATCC nº 69380) se expone en la SEC ID nº:
5.
Sobre la base de los datos conocidos referentes
a otras proteínas de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa, la proteína
CFK1-10a codificada de 509 aminoácidos presenta los
rasgos característicos de los receptores con actividad
serina/treonina-quinasa, en particular aquellos
capaces de reconocer ligandos de la superfamilia
TGF-\beta/BMP de factores de crecimiento y
diferenciación. Esta molécula codifica una molécula de receptor de
longitud completa con una secuencia líder hidrófoba característica
que dirige el dominio de unión al ligando de la proteína al espacio
extracelular, una región transmembranaria que ancla la molécula
completa del receptor a la membrana celular, lo que permite el
posicionamiento del dominio de
serina/treonina-quinasa en el espacio intracelular.
El dominio de unión al ligando de la molécula del receptor
CFK1-10a de la invención presenta un perfil de
conservación de cisteínas observado en otros receptores capaces de
reconocer ligandos de la superfamilia
TGF-\beta/BMP de factores de crecimiento y
diferenciación. La región de la proteína del receptor
CFK1-10 correspondiente al dominio intracelular de
serina-treonina-quinasa presenta un
grado significativo de identidad de secuencia aminoácida con el
correspondiente dominio de otros receptores de esta familia, a
saber: receptor de TGF-\beta de tipo II (Nº de
acceso a Genbank: M85079), 35%; receptor de activina de tipo II (Nº
de acceso a Genbank: M65287), 40%; receptor de activina de tipo IIB
(Nº de acceso a Genbank: M84120), 38%; y
Daf-1 (Nº de acceso a Genbank: A35103), 39%.
El inserto de 3,2 kb del clon de ADNc de CFK1-10a se
corta con la endonucleasa de restricción NotI y se transfiere al
vector de expresión en células de mamíferos pMV2 en el sitio NotI de
la región de clonación múltiple. Este plásmido se denomina
CFK1-10a/Not-4.
El receptor CFK1-10a de la
presente invención es homólogo a un ARNm humano de receptor con
actividad serina/treonina-quinasa depositado en
Genbank, con el número de acceso L02911, para el que no se ha
identificado ningún ligando. Esta proteína de receptor es también
homóloga a la secuencia descrita del receptor murino de
TGF-\beta de tipo I, Ebner et al., Science,
260:1344-1348 (1993) (Nº de acceso a Genbank:
L15436).
La secuencia de nucleótidos del clon
CFK1-23a (ATCC nº 69378) comprende un marco abierto
de lectura de 1596 pb, que codifica una proteína de receptor
CFK1-23a de 532 aminoácidos. Se considera que los
532 aminoácidos codificados de la proteína de receptor
CFK1-23a constituyen el producto de traducción
primario. La secuencia codificante está precedida por 60 pb de
secuencia no traducida en 5'. La secuencia de ADN y la secuencia
aminoácida derivada de la mayor parte del inserto de
CFK1-23a se expone en la SEC ID nº: 1.
Sobre la base de los datos conocidos referentes
a otras proteínas de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa, la proteína
CFK1-23a codificada de 532 aminoácidos presenta los
rasgos característicos de los receptores con actividad
serina/treonina-quinasa, en particular aquellos
capaces de reconocer ligandos de la superfamilia
TGF-\beta/BMP de factores de crecimiento y
diferenciación. La región de la proteína del receptor
CFK1-23a correspondiente al dominio intracelular de
serina-treonina-quinasa presenta un
grado significativo de identidad de secuencia aminoácida con el
correspondiente dominio de otros receptores de esta familia, a
saber: receptor de TGF-\beta de tipo II (Nº de
acceso a Genbank: M85079), 35%; receptor de activina de tipo II (Nº
de acceso a Genbank: M65287), 41%; receptor de activina de tipo IIB
(Nº de acceso a Genbank: M84120), 39%; y
Daf-1 (Nº de acceso a Genbank: A35103), 39%.
El inserto de 2,8 kb del clon de ADNc de CFK1-23a se
corta con la endonucleasa de restricción EcoRI y se transfiere al
vector de expresión en células de mamíferos pMV2 en el sitio EcoRI
de la región de clonación múltiple. Este plásmido se denomina
pMV23a.
La secuencia de nucleótidos del clon
CFK1-43a comprende un marco abierto de lectura de
1506 pb, que codifica una proteína de receptor
CFK1-43a de 502 aminoácidos. Se considera que los
502 aminoácidos codificados de la proteína de receptor
CFK1-43a constituyen el producto de traducción
primario, ya que la secuencia codificante está precedida por 239 pb
de secuencia no traducida en 5' con codones de terminación en los
tres marcos de lectura. La secuencia de ADN y la secuencia
aminoácida derivada del inserto de CFK1-43a (ATCC nº
69381) se expone en la SEC ID nº: 3.
Sobre la base de los datos conocidos referentes
a otras proteínas de receptores con actividad
serina/treonina-quinasa, la proteína
CFK1-43a codificada de 502 aminoácidos presenta los
rasgos característicos de los receptores con actividad
serina/treonina-quinasa, en particular aquellos
capaces de reconocer ligandos de la superfamilia
TGF-\beta/BMP de factores de crecimiento y
diferenciación. La región de la proteína del receptor
CFK1-43a correspondiente al dominio intracelular de
serina-treonina-quinasa presenta un
grado significativo de identidad de secuencia aminoácida con el
correspondiente dominio de otros receptores de esta familia, a
saber: receptor de TGF-\beta de tipo II (Nº de
acceso a Genbank: M85079), 35%; receptor de activina de tipo II (Nº
de acceso a Genbank: M65287), 41%; receptor de activina de tipo IIB
(Nº de acceso a Genbank: M84120), 40%; y
Daf-1 (Nº de acceso a Genbank: A35103), 38%.
El inserto de 2,1 kb del clon de ADNc de CFK1-43a
clon de ADNc se corta con la endonucleasa de restricción EcoRI y se
transfiere al vector de expresión en células de mamíferos pMV2 en
el sitio EcoRI de la región de clonación múltiple. Este plásmido se
denomina pMV43a.
El receptor CFK1-43a de la
invención es homólogo al ARNm del receptor con actividad
serina/treonina-quinasa de pollo, depositado con nº
de acceso a Genbank: D 13432, para el que no se ha identificado
ningún ligando.
Se supone que los genes del receptor de BMP de
ratón y/o rata son significativamente homólogos. Por consiguiente,
las secuencias de ratón que codifican W-101 o
W-120, o porciones de las mismas, pueden utilizarse
para cribar una genoteca genómica humana o una genoteca de ADNc
humano, o emplearse como sondas para identificar una línea celular
o tejido humanos que sintetizan las proteínas análogas humanas de
receptores de BMP. De modo similar, las secuencias de rata que
codifican CFK1-10a, CFK1-23a o
CFK1-43a, o porciones de las mismas, pueden
utilizarse para cribar genotecas humanas, o como sondas para
identificar una línea celular o tejido humanos que sintetizan las
proteínas análogas humanas de receptores de BMP. Una genoteca
genómica humana puede cribarse con dichas ondas, y los presuntos
clones recombinantes que exhiben hibridación positiva pueden
aislarse, y puede obtenerse su secuencia de ADN. Los indicios de
que dichos recombinantes codifican porciones de las correspondientes
proteínas humanas de receptores de BMP se basan en las homologías
de ADN, proteínas y estructura de genes en ratones o ratas/seres
humanos.
Una vez obtenido un bacteriófago o plásmido
recombinante que contiene ADN que codifica una porción de una
molécula de receptor humano de BMP, la secuencia codificante humana
puede utilizarse para identificar una línea celular o tejido
humanos que sintetizan el ARNm del correspondiente receptor humano
de BMP. Como alternativa, la secuencia codificante del receptor de
BMP de ratón o de rata puede utilizarse como sonda para identificar
dicha línea celular o tejido humanos. Brevemente: se extrae ARN a
partir de una fuente de células o tejidos seleccionados y se somete
a electroforesis en gel de agarosa con formaldehído, y se transfiere
a nitrocelulosa, o se hace reaccionar con formaldehído y se
transfiere directamente a nitrocelulosa. Después se hibrida la
nitrocelulosa con una sonda procedente de una secuencia que codifica
el receptor de BMP de ratón, rata o seres humanos. Como
alternativa, la secuencia que codifica el receptor de BMP de ratón o
de rata se utiliza para diseñar cebadores oligonucleotídicos que
amplificarán específicamente una porción de la secuencia codificante
del receptor de BMP localizada en la región entre los cebadores
utilizados para llevar a cabo la reacción de amplificación
específica. Se contempla que las secuencias que codifican el
receptor de BMP de ratón, rata o seres humanos serán
suficientemente homólogas para permitir la amplificación específica
de las correspondientes secuencias que codifican el receptor humano
de BMP a partir de moldes de ARNm, ADNc o de ADN genómico. Una vez
identificada una fuente positiva mediante uno de los métodos
descritos anteriormente, se selecciona el ARNm por cromatografía en
oligo-(dT)-celulosa y el ADNc se sintetiza y se
clona en un vector adecuado (por ejemplo, \lambdagt10,
\lambdaZAPII u otros vectores conocidos por los expertos en la
materia) mediante técnicas reconocidas. También es posible llevar a
cabo la reacción de amplificación dirigida por el cebador
oligonucleotídico, descrita anteriormente, directamente en una
genoteca humana predeterminada de ADNc o genómica que ha sido
clonada en un vector del bacteriófago \lambda o en un vector
plasmídico. En tales casos, una genoteca que proporciona un
producto de ADN específicamente amplificado que codifica una porción
de la proteína del receptor de BMP humano podría cribarse
directamente, utilizando como sonda el fragmento amplificado de ADN
que codifica el receptor de BMP.
Para producir proteínas de receptores de BMP de
ratón, rata, seres humanos, u otros mamíferos, el ADN que codifica
las mismas se transfiere a un vector de expresión adecuado (como se
ha descrito anteriormente para el caso de W-101,
W-120, CFK1-10a,
CFK1-23a y CFK1-43a) y se introduce
en las células de mamífero u otros hospedadores preferidos
eucarióticos o procarióticos empleando técnicas convencionales de
ingeniería genética. Las secuencias de ADN que codifican la
proteína de receptor de BMP pueden insertarse en un vector adecuado
para la célula hospedadora particular, como se ha descrito
anteriormente. Se contempla que el sistema de expresión preferido
para las proteínas recombinantes humanas de receptores de BMP sean
células de mamífero transformadas de forma estable.
Como ejemplo específico de expresión de una
proteína de receptor con actividad
serina/treonina-quinasa de la invención, el inserto
de CFK1-23a (que contienen la secuencia completa del
ADNc del receptor de BMP correspondiente a
CFK1-23a) se libera de la estructura del vector por
digestión con EcoRI y se subclona en el sitio EcoRI del vector de
expresión de mamífero pMV2, un derivado de pMT2, que ha sido
depositado en la ATCC con el número de acceso ATCC 67122, aunque
también pueden ser adecuados otros derivados del mismo, tales como
pMT3. El ADN plasmídico de este subclón se utiliza para transfectar
células COS mediante el procedimiento con
DEAE-dextrano [Sompayrac y Danna PNAS
78:7575-7578 (1981); Luthman y Magnusson, Nucl.
Acids Res. 11: 1295-1308 (1983)] y las células
se cultivan. El medio condicionado durante 24 h, exento de suero, se
recoge de las células a partir de 40-70 h después de
la transfección.
Con el objeto de obtener elevados niveles de
expresión de la proteína de receptor con actividad
serina/treonina-quinasa, cada una de la secuencias
de ADN de la SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7
o SEC ID nº: 9 se inserta en un vector de expresión eucariótica,
por ejemplo, pMV2 o pMT3, se introduce de forma estable en células
CHO y se amplifica hasta obtener un elevado número de copias
mediante selección con metotrexato de DHFR [Kaufman et al., EMBO
J. 6:189 (1987)]. Las células transformadas se cultivan y las
proteínas de receptores expresadas permanecen asociadas a la
membrana celular de la célula transformada. Las proteínas
recombinantes de receptores de la presente invención pueden
disociarse de la membrana de la célula transformada y después
recuperarse y purificarse de otros contaminantes presentes.
\newpage
Una proteína de receptor con actividad
serina/treonina-quinasa de la invención se expresa
en células CHO liberando el inserto del CFK1-43a
clonado descrito anteriormente con EcoRI. El inserto se subclona en
el sitio de clonación de EcoRI del vector de expresión en
mamíferos, pMV2, descrito anteriormente, aunque también pueden ser
adecuados derivados del mismo, por ejemplo, pMT3.
Los métodos para producir proteínas heterólogas
a partir de células CHO se conocen en la técnica y han sido
descritos anteriormente, en las páginas 16 a 19.
Un receptor de BMP de la invención puede
definirse como una proteína que posee la capacidad de unirse a una
BMP particular con mayor afinidad de unión que a
TGF-\beta, activina, inhibina u otros miembros de
la familia TGF-\beta de factores de crecimiento y
diferenciación. Los receptores de BMP de la presente invención se
unen específicamente a una BMP particular de modo que
aproximadamente un exceso de 100 veces de un ligando competitivo
tal como TGF-\beta o activina no desplazará de
forma significativa la BMP. La unión específica de las BMP a un
receptor particular de BMP de la invención puede demostrarse
transfectando un plásmido de expresión que contiene secuencias de
ADN que codifican la proteína particular de receptor de BMP de
interés en células COS y permitiendo la expresión transitoria de la
proteína de receptor de BMP en la superficie celular. Las BMP
individuales, BMP heterodiméricas u otras proteínas de la
superfamilia TGF-\beta se unen a células COS que
expresan el receptor de BMP, y las células se analizan para
determinar su capacidad de unirse específicamente a una molécula de
BMP o a un grupo particular de proteínas BMP con mayor afinidad que
a TGF-\beta u otros miembros de la superfamilia
TGF-\beta. Dichos ensayos de unión pueden
realizarse de la siguiente manera:
Células COS que han sido transfectadas con un
vector de expresión que contiene la secuencia que codifica el
receptor de BMP particular de interés (por ejemplo, pMT101, pMT120,
CFK1-10a/Not4, pMV23a o pMV43a) se siembran en
placas, tratadas con gelatina, de 6 pocillos, y se preincuban a 37ºC
durante 60 minutos en tampón de unión (NaCl 128 mM, KCl 5 mM,
MgSO_{4} 5 mM, CaCl_{2} 1,2 mM, HEPES 50 mM y 5 mg/ml de BSA, pH
7,5). Las células COS preincubadas se lavan y se incuban en tampón
de unión al que se ha añadido KCN 10 mM y NaF 2 mM durante 10
minutos antes de la adición de BMP-4 y/o
[I^{125}]BMP-4. Se permite que la unión de
BMP-4 alcance el equilibrio a 37ºC durante 60
minutos. Tras la unión, las células se lavan dos veces con tampón de
unión enfriado con hielo, y se solubilizan con Triton
X-100 al 1%, glicerol al 10%, HEPES 25 mM y 1 mg/ml
de BSA, pH 7,5, como se describe
por Massague [Meth. Enzymol.146:174-195 (1987)]. Después se determina la radiactividad en un contador gamma.
por Massague [Meth. Enzymol.146:174-195 (1987)]. Después se determina la radiactividad en un contador gamma.
Las proteínas truncadas de receptores de la
invención comprenden preferentemente el dominio de unión al ligando
pero no los dominios transmembranario y de
serina/treonina-quinasa de las proteínas de
receptores. Dichas proteínas truncadas de receptores pueden
expresarse en células de mamífero de forma que las proteínas
truncadas de receptores se secreten en el sobrenadante, en vez de
expresarse en la superficie de la célula hospedadora. Las
secuencias de ADN que codifican el dominio de unión al ligando de
cada proteína de receptor de la invención pueden aislarse a partir
de las secuencias de ADN que codifican los dominios transmembranario
y de serina/treonina-quinasa de cada
correspondiente proteína de receptor de la invención, e insertarse
en vectores que permitan la producción de las proteínas truncadas
de receptores en células de mamífero. Como alternativa, las
secuencias de ADN que codifican las proteínas truncadas de
receptores pueden aislarse e insertarse en vectores adecuados para
la expresión en células bacterianas, de insecto, virus y levaduras.
Dichos vectores son conocidos por los expertos en la materia y se
describen en otro lugar de la presente solicitud.
En una forma de realización preferida, las
secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos nº 61 a nº 507 de
la SEC ID nº: 1 que codifican los aminoácidos nº 1 a 149 de la
proteína CFK1-23a de receptor de la invención (SEC
ID nº: 2) pueden amplificarse específicamente, y la secuencia de ADN
resultante puede insertarse en un vector estándar de expresión en
células de mamíferos (por ejemplo, pMV2 o pMT3). Dicha amplificación
específica puede realizarse de la siguiente manera:
En un sintetizador automático de ADN se
sintetizan cebadores oligonucleotídicos que comprenden la secuencia
de nucleótidos nº 1 a nº 20 de la SEC ID nº: 1 y un cebador distinto
que comprende la cadena complementaria de la secuencia de
nucleótidos nº 488 a 507 de la SEC ID nº: 1. Además, dichos
oligonucleótidos pueden diseñarse de forma que incluyan secuencias
de reconocimiento para endonucleasas de restricción conocidas por
los expertos en la materia (por ejemplo, BamHI, EcoRI, XbaI etc.)
que serán útiles en la manipulación de los productos de ADN
amplificados y en la facilitación de su inserción en vectores
plasmídicos. Además, el cebador que comprende los nucleótidos nº
488 a 507 puede incluir también una secuencia trinucleotídica que
corresponde a un codón de terminación de la traducción (es decir,
TAA, TAG o TGA) en lugar de los nucleótidos nº 583 a 585 de la SEC
ID nº: 1. El oligonucleótido que comprende los nucleótidos nº 488 a
507 se diseñaría sobre la base de la cadena antisentido
(complementaria) de esta región de la SEC ID nº: 1, y en combinación
con un oligonucleótido que comprende los nucleótidos nº 1 a 20 de
la cadena con sentido (codificante) de la SEC ID nº: 1 podría
utilizarse para amplificar específicamente un fragmento de ADN que
comprende los nucleótidos nº 1 a nº 507 de la SEC ID nº: 1. Este
fragmento de ADN codificará una proteína truncada de receptor de la
invención. El fragmento de ADN que codifica la proteína truncada de
receptor de la invención puede producirse ampliando específicamente
la secuencia que comprende los nucleótidos nº 1 a nº 507 de la SEC
ID nº: 1 utilizando como molde un clon que codifica la secuencia
completa del receptor de la invención, tal como pMV23a. Esta
reacción de amplificación específica de ADN puede llevarse a cabo
de la siguiente manera: aproximadamente 1 ng de ADN molde, tal como
pMV23a, se combina con 100 pM de un oligonucleótido que comprende
los nucleótidos nº 1 a 20, y 100 pM de un oligonucleótido que
comprende la cadena complementaria de los nucleótidos nº 488 a 507
en una mezcla de reacción de 100 \mul que consta de
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5
mM, 200 \muM de cada desoxinucleótido trifosfato, 2,5 unidades de
ADN-polimerasa Taq. Después se incuba toda la
reacción a 95ºC durante dos minutos, y a continuación se somete a
ciclos térmicos de la siguiente manera: 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a
40ºC y 1 minuto a 72ºC durante veinticinco a cuarenta ciclos;
seguido por una incubación de 7 minutos a 72ºC, después de lo cual
se mantiene la reacción completada a 4ºC.
El fragmento de ADN que se amplifica
específicamente por esta reacción se precipita con etanol, se
digiere con las endonucleasas de restricción adecuadas en los casos
en los que se hayan añadido secuencias de reconocimiento de
endonucleasas de restricción a los oligonucleótidos utilizados para
cebar la síntesis del fragmento de ADN amplificado (descrito
anteriormente), y se someten a electroforesis en agarosa. Se corta
una región del gel en la que aparece una banda de ADN del tamaño
esperado y se subclona en un vector plasmídico. Como alternativa,
este fragmento de ADN específicamente amplificado que codifica una
proteína truncada de receptor de la invención podría subclonarse
directamente en un vector estándar de expresión en células de
mamíferos tal como pMT3 u otros vectores similares conocidos por los
expertos en la materia.
Podrían llevarse a cabo manipulaciones similares
a las descritas anteriormente, con el objeto de aislar y expresar
otras proteínas truncadas de receptores de la invención.
Por ejemplo, las secuencias de ADN que
comprenden los nucleótidos nº 247 a 618 de la SEC ID nº: 3, que
codifican los aminoácidos nº 1 a 124 del receptor de BMP
CFK1-43a de la invención (SEC ID nº: 4) pueden
amplificarse específicamente para producir un fragmento de ADN que
comprende los nucleótidos nº 247 a 618 de la SEC ID nº: 3, que
codificaran otra proteína truncada de receptor de BMP. Estas
secuencias codificarán el dominio de unión al ligando del receptor
de BMP CFK1-43a, pero no codificarán los dominios
transmembranario y de serina/treonina-quinasa de la
correspondiente proteína de receptor. Cuando se inserta en un vector
de expresión adecuado y se utiliza para transfectar la célula
hospedadora adecuada, esta construcción permitirá la producción de
una proteína truncada de receptor de BMP que será secretada en el
medio, en vez de expresarse en la superficie de la célula
hospedadora. Esta reacción de amplificación específica puede
llevarse a cabo de forma similar a la descrita anteriormente en lo
referente a la proteína truncada CFK1-23a de
receptor de BMP. En este caso, se utilizan oligonucleótidos que
comprenden la secuencia de nucleótidos nº 247 a 266 de la SEC ID nº:
3 y un cebador oligonucleotídico distinto que comprende la cadena
complementaria de la secuencia de nucleótidos nº 599 a 618 de la SEC
ID nº: 3 para amplificar de forma específica un fragmento de ADN
que comprende los nucleótidos nº 247 a 618 de la SEC ID nº: 3.
Estos oligonucleótidos y un ADN molde que codifica la
correspondiente proteína de receptor de BMP de la invención tal
como pMV43a, se sustituyen en la mezcla de reacción de amplificación
específica de ADN descrita anteriormente.
Además, otros receptores con actividad
serina/treonina-quinasa de la invención tales como
W-101, W-120 o
CFK1-10a pueden producirse en forma truncada. Las
formas truncadas de estas moléculas de receptores pueden expresarse
en células de mamífero de modo que las correspondientes proteínas
truncadas se secreten en el medio de cultivo, en vez de expresarse
en la superficie de la célula hospedadora. La expresión de estas
proteínas solubles de receptores puede lograrse amplificando
fragmentos de ADN que codifican el dominio de unión al ligando, pero
no los dominios transmembranario y de
serina/treonina-quinasa, de cada molécula respectiva
de receptor con actividad serina/treonina-quinasa,
como se ha descrito anteriormente para el caso de las proteínas
truncadas de receptores de BMP.
La utilización de células estromales de médula
ósea W-20-17 como línea celular
indicadora se basa en la conversión de dichas células en células
del tipo de los osteoblastos tras el tratamiento con una proteína
BMP [Thies et al., Journal of Bone and Mineral Research,
5:305 (1990); y Thies et al., Endocrinology, 130:1318
(1992)]. Específicamente, las células
W-20-17 son una línea clonal de
células estromales de médula ósea derivada de ratones adultos
generada por los investigadores del laboratorio del Dr. D. Nathan,
Children's Hospital, Boston, MA. El tratamiento de las células
W-20-17 con ciertas proteínas dar
lugar a (1) un aumento en la producción de fosfatasa alcalina, (2)
la inducción de AMPc estimulado por PTH, y (3) la inducción de la
síntesis de osteocalcina por las células. Mientras que (1) y (2)
representan características asociadas con el fenotipo de los
osteoblastos, la capacidad de sintetizar osteocalcina es una
propiedad fenotípica que presentan sólo los osteoblastos maduros.
Es más, hasta la fecha se ha observado conversión de células
estromales W-20-17 en células del
tipo de los osteoblastos sólo tras el tratamiento con BMP. De este
modo, las actividades in vitro presentadas por las células
W-20-17 tratadas con BMP
correlacionan con la actividad osteogénica in vivo que
presentan las BMP.
A continuación se describen dos ensayos in
vitro útiles para comparar las actividades de BMP de
formulaciones de BMP con la actividad de BMP conocidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se siembran células
W-20-17 en placas de cultivo de
tejidos de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células por pocillo
en 200 \mul de medio (DME con suero termoinactivado de ternero
fetal al 10%, glutamina 2 mM y 100 unidades/ml de penicilina + 100
\mug/ml de estreptomicina. Se deja que las células se adhieran
durante toda la noche en un incubador con 95% de aire, 5% de
CO_{2}, a 37ºC.
Los 200 \mul de medio se eliminan de cada
pocillo con una pipeta de múltiples canales y se sustituyen por un
volumen igual de la muestra problema en DME con suero
termoinactivado de ternero fetal al 10%, glutamina 2 mM y 1% de
penicilina-estreptomicina. Las sustancias problema
se ensayan por triplicado.
Las muestras problema y los patrones se someten
a un período de incubación de 24 horas con las células indicadoras
W-20-17. Después de las 24 horas, se
retiran las placas del incubador a 37ºC y se extrae el medio
problema de las células.
Las capas de células
W-20-17 se lavan 3 veces con 200
\mul por pocillo de solución salina tamponada con fosfato exenta
de calcio/magnesio, y se desechan estos lavados.
Se añaden 50 \mul de agua destilada con vidrio
a cada pocillo, y las placas de ensayo se colocan después en un
baño de hielo seco/etanol para congelarlas rápidamente. Una vez
congeladas, las placas de ensayo se retiran del baño de hielo
seco/etanol y se descongelan a 37ºC. Esta etapa se repite 2 veces
más hasta un total de 3 ciclos de
congelación-descongelación. Una vez completado este
paso, la fosfatasa alcalina unida a la membrana está lista para su
medición.
Se añaden 50 \mul de la mezcla de ensayo
(glicina 50 mM, Triton X-100 al 0,05%, MgCl_{2} 4
mM, 5 mM p-nitrofenol-fosfato, pH =
10,3) a cada pocillo de ensayo, y las placas de ensayo se incuban
después durante 30 minutos a 37ºC en un baño de agua con agitación
de 60 oscilaciones por minuto.
Al final de período de incubación de 30 minutos,
la reacción se para añadiendo 100 \mul de NaOH 0,2 N a cada
pocillo, y colocando las placas de ensayo en hielo.
Se lee la absorbancia espectrofotométrica de
cada pocillo a una longitud de onda de 405 nanómetros. Después se
comparan estos valores con los patrones conocidos, para obtener una
estimación de la actividad de fosfatasa alcalina en cada muestra.
Por ejemplo, utilizando cantidades conocidas de
p-nitrofenol-fosfato se generan los
valores de absorbancia que se muestran en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores de absorbancia de cantidades
conocidas de BMP pueden determinarse y convertirse en moles de
p-nitrofenol-fosfato escindido por
unidad de tiempo, como se muestra en la Tabla 3.
Estos valores se utilizan después para comparar
las actividades de cantidades conocidas de nuevas formulaciones de
BMP con formulaciones conocidas de BMP activas.
Se siembran células
W-20-17 a una densidad de 10^{6}
células por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos
en 2 ml de DME con suero termoinactivado de ternero fetal al 10%,
glutamina 2 mM. Las células se dejan adherir durante toda la noche
en atmósfera de 95% de aire, 5% de CO_{2} a 37ºC.
Al día siguiente se cambia el medio a DME con
suero de ternero fetal al 10%, glutamina 2 mM, y la sustancia
problema en un volumen total de 2 ml. Cada sustancia problema se
añade a los pocillos por triplicado. Las sustancias problema se
incuban con las células W-20-17
durante un total de 96 horas, con una sustitución a las 48 horas
empleando los mismos medios problema.
Al final de las 96 horas, se extraen 50 \mul
del medio problema de cada pocillo, y se analiza para determinar la
producción de osteocalcina utilizando un radioinmunoensayo para la
osteocalcina de ratón. Los detalles del ensayo se describen en el
kit fabricado por Biomedical Technologies Inc., 378 Page Street,
Stoughton, MA 02072. Los reactivos del ensayo tienen los siguientes
números de catálogo: BT-431 (patrón de osteocalcina
de ratón), BT-432 (anticuerpo caprino contra la
osteocalcina de ratón), BT-431R (osteocalcina de
ratón yodada), BT-415 (suero caprino normal) y
BT-414 (anticuerpo de asno contra la IgG caprina).
El RIA para la osteocalcina sintetizada por las células
W-20-17 en respuesta al tratamiento
con BMP se lleva a cabo como se describe en el protocolo
suministrado por el fabricante.
Veinticuatro ratas Long Evans, machos, se
dividen en 6 grupos problema. Cada una recibe un implante
subcutáneo, de un tamaño de 200 \mul, con una dosis de 0 ó 20
\mug/100 \mul de una muestra particular de BMP/matriz, por
ejemplo BMP/partículas porosas de PLGA/coágulo sanguíneo, como se
describe en la patente US nº 5.171.579. Después se 14 días, las
ratas se sacrifican y se evalúa la formación de hueso en cada
animal.
Tres conejos reciben inyecciones de proteína
purificada truncada de receptor de BMP. Los anticuerpos policlonales
procedentes del suero de dichos conejos se purifican por
cromatografía en una columna de proteína A. Los anticuerpos se
analizan para determinar su capacidad de unirse a receptores de
BMP.
Se inmunizan tres grupos de tres ratones con
proteína purificada truncada de receptor de BMP. Los bazos de los
ratones se utilizan para generar múltiples líneas celulares de
hibridomas. Los medios condicionados de las líneas de hibridoma de
ratón no clonal se analizan para medir su capacidad de unirse a
receptores de BMP. Las líneas clonales pueden generarse a partir de
los anteriores mediante clonación secuencial en serie y en
diluciones limitantes. Cuando las líneas no clonales se convierten
en clonales, aquellas líneas que presentan actividad positiva en el
estado no clonal mantendrán la capacidad de producir un anticuerpo
que se une al receptor de BMP. A la inversa, las líneas que son
negativas se mantendrán negativas durante todo el procedimiento de
clonación. Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse a partir
del líquido ascítico procedente de clones de hibridoma tanto
positivos como negativos.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: GENETICS INSTITUTE, INC.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS DE RECEPTORES
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Genetics Institute Inc.- Legal Affairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 87 CambridgePark Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02140
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: por determinar
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: ADJUNTA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/123.934
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 17-SEP-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: LAZAR, Steven R
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.618
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ARCHIVO: 5203-PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617) 498-8260
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (617) 876-5851
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1813 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CFK1-23a
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 61..1656
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 532 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2076 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CFK1-43a
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 247..1752
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 502 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3238 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CFK1-10a
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 474..2000
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 509 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1647 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: W-101
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 80..1594
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 505 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1794 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: W-120
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 83..1591
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 503 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 341 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: KDA-B5
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 25..318
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 98 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR A
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGATCCGA RTAYGTNGCN GTNAAR
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- GENOTECA: CEBADOR B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTGTAGAR CTYTTDATRT CYCTRTG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR C
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTCTAGAR CTYTTDATRT CNCGRTG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR D
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTCTAGNG AYTTDATRTC YCTRTG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR E
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTCTAGAN GAYTTDATRT CNCGRTG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SECUENCIA PEPTÍDICA DE KDA-B5 UTILIZADA PARA DISEÑAR EL CEBADOR A
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Glu Tyr Val Ala Val Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SECUENCIA PEPTÍDICA DE KDA-B5 UTILIZADA PARA DISEÑAR LOS CEBADORES B HASTA E
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Arg Asp Ile Lys Ser}
Claims (14)
1. Molécula de ADN que comprende una secuencia
de ADN que codifica una proteína de receptor de proteínas
morfogénicas óseas (BMP) con actividad
serina/treonina-quinasa, o una forma truncada de la
misma, que tiene la capacidad de unirse a BMP en un ensayo de unión,
en la que dicha secuencia de ADN se selecciona a partir de:
- (a)
- la secuencia de ADN CFK1-43a expuesta en la SEC ID nº: 3;
- (b)
- nucleótidos 247 hasta 1752 de la SEC ID nº: 3;
- (c)
- una secuencia de ADN que codifica los aminoácidos 8 hasta 502 de la SEC ID nº: 4;
- (d)
- nucleótidos 247 hasta 618 de la SEC ID nº: 3;
- (e)
- una secuencia de ADN que codifica los aminoácidos 8 hasta 124 de la SEC ID nº: 4; y
- (f)
- una secuencia de ADN que codifica el dominio de unión al ligando de una variante alélica presente en la naturaleza de cualquiera de (a) a (e).
2. Vector que comprende la molécula de ADN según
la reivindicación 1.
3. Vector según la reivindicación 2, asociado
funcionalmente a una secuencia para el control de la expresión del
mismo.
4. Célula hospedadora transformada con el vector
según la reivindicación 2 ó 3.
5. Método para producir una proteína de receptor
de BMP con actividad serina/treonina-quinasa, o una
forma truncada de la misma, que tiene la capacidad de unirse a BMP
en un ensayo de unión, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar en un medio de cultivo la célula hospedadora de la reivindicación 4; y
- (b)
- recuperar dicha proteína, o forma truncada de la misma, a partir del medio de cultivo.
6. Proteína de receptor de BMP con actividad
serina/treonina-quinasa, o forma truncada de la
misma, que tiene la capacidad de unirse a BMP en un ensayo de unión,
en la que dicha proteína está codificada por la molécula de ADN
según la reivindicación 1.
7. Anticuerpo monoclonal que tiene la capacidad
de unirse a la forma truncada de la proteína de receptor de BMP con
actividad serina/treonina-quinasa según la
reivindicación 6.
8. Utilización de una proteína de receptor de
BMP, o forma truncada de la misma, según la reivindicación 6 en un
ensayo de unión para la identificación de un ligando que se une a la
misma, en la que dicho ligando es un anticuerpo monoclonal similar a
BMP, un pequeño péptido que es análogo a BMP, o una pequeña molécula
orgánica que es análoga a BMP.
9. Composición que comprende células
transformadas con una o más moléculas de ADN según la reivindicación
1.
10. Composición que comprende la proteína
truncada de receptor de BMP según la reivindicación 6.
11. Proteína truncada de receptor de BMP según
la reivindicación 6, para su utilización como medicamento.
12. Utilización de una composición según la
reivindicación 9 para la preparación de un medicamento destinado a
la estimulación del crecimiento de hueso y/o el cartílago.
13. Utilización de una composición según la
reivindicación 10 para la preparación de un medicamento destinado a
la inhibición de los efectos de BMP.
14. Proteína codificada por una molécula de ADN
que se hibrida en condiciones restrictivas de hibridación a una
molécula de ADN según la reivindicación 1, estando dicha proteína
caracterizada porque tiene la capacidad de unirse
selectivamente a BMP-2 y 4, pero no a
TGF-\beta.
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