ES2297526T3 - Utilizacion de un liofilizado de celulas vegetales desdiferenciadas con el fin de despigmentar y/o aclarar la piel. - Google Patents

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Abstract

Utilización en una composición cosmética de al menos un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, para despigmentar y/o aclarar y proteger la epidermis.

Description

Utilización de un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas con el fin de despigmentar y/o aclarar la piel.
Utilización en una composición cosmética o farmacéutica al menos de un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, con el fin de despigmentar y/o aclarar, proteger y regenerar la epidermis.
La invención se refiere a la utilización al menos de un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, en una composición cosmética o farmacéutica con fines de despigmentación y/o aclarado de la epidermis acompañada de un efecto protector y regenerador. La invención tiene, además, por objeto una composición cosmética o farmacéutica de uso tópico que incluye al menos tal liofilizado.
La piel es un sobreprotector que representa la interfaz entre el medio exterior y los otros órganos internos. No obstante no es hermética y, como órgano de absorción, permite a las sustancias disueltas penetrar por medio de los poros y folículos pilosos.
La piel protege contra el frío, el calor, la radiación; contra la presión, la fricción; contra las lesiones químicas; contra la penetración de los microorganismos; de la pérdida de agua y calor.
La protección natural de la piel contra la radiación ultravioleta pasa por un pigmento marrón, la melanina. La melanina está presente en células de las capas básicas de la epidermis: los melanocitos. Se sintetiza a partir de un aminoácido, la tirosina, modificado por una enzima, la tirosinasa. La síntesis de la melanina es inducida por los rayos UV. La coloración oscura de la piel es una primera protección natural contra el sol, que es bien insuficiente para las pieles más claras. El bronceado es la consecuencia, bajo la acción de la UV, del aumento de la actividad melanocítica de síntesis de la melanina y del almacenamiento de la melanina en los queratinocitos.
La cantidad de melanina y el número de melanocitos son factores programados genéticamente que dan su color a la piel.
Una producción excesiva y localizada de melanina causa la aparición de manchas: pecas, máscara de embarazo, lentigos solares o seniles, etc. En efecto, según las últimas nomenclaturas, las manchas de vejez corresponden a los lentigos seniles y los lentigos solares son las otras manchas.
Las "manchas de vejez" son pequeñas manchas marrón pálido, planas y generalmente redondas, generalmente sobre la cara, la espalda de las manos, el cortada, los antebrazos. Son causadas por la combinación del sol y el envejecimiento. Su número aumenta con la edad. Bajo la acción repetida de los rayos UV, los melanocitos terminan por producir la melanina.
Los lentigos son "pecas" que no desaparecen en invierno, marrones, minúsculos y numerosos, muy cercanos una de los otros. Se los encuentra generalmente sobre la cara, los hombros y el cortada. Son causadas por una sobredosis de ultravioletas y pueden formarse a partir de la más joven edad.
La "máscara de embarazo" se manifiesta por grandes manchas marrones de contorno irregular, generalmente sobre la cara, que toman a veces el aspecto de una máscara. Cuando estas manchas aparecen durante el embarazo, se habla de cloasma, si no se habla de melasma. Son causadas por un estímulo hormonal (embarazo, hormonoterapia) combinado con la exposición a los rayos UV.
Todos estos tipos de manchas pueden también vincularse con el patrimonio genético y en consecuencia con la herencia.
Ante el aspecto desfavorable de estas concentraciones máximas de melanina, es de un interés especialmente importante el tener acceso a preparaciones de uso tópico que permitan prevenir su aparición y/o reducirlos.
Los fabricantes de preparaciones cosméticas y farmacéuticas están constantemente en busca de principios activos no agresivos que permiten inhibir o bloquear la síntesis de la melanina, directa o indirectamente, o inhibir o bloquear la transferencia de los melanosomas a los queratinocitos, y en consecuencia aclarar estas manchas protegiendo al mismo tiempo estas zonas de una pigmentación solar. Del mismo modo, los fabricantes de preparaciones cosméticas buscan principios activos despigmentantes no agresivos ante el deseo creciente de las poblaciones negras y asiáticas de aclarar su piel, proponiéndoles al mismo tiempo un producto protector de la piel.
Para atenuar a las molestias de los otros tratamientos disponibles engorrosos y/o agresivos (láser, crioterapia) de despigmentación, estos principios activos deben proteger la piel y/o al mismo tiempo estimular la regeneración de las células que la constituyen.
En efecto, la protección de la piel y/o el estímulo de la regeneración de las células de la piel permiten luchar al mismo tiempo contra un factor agravante de las manchas: el envejecimiento cutáneo por múltiples causas.
La primera causa del envejecimiento cutáneo es el envejecimiento "programado" que puede ser acelerado por la tensión, el tabaquismo y algunas enfermedades. Con los años, la piel pierde su elasticidad ya que la dermis produce siempre menos fibras de colágeno y elastina. De ahí el debilitamiento progresivo del tejido conjuntivo y la relajación de la piel. La capacidad de renovación de la epidermis tiende también a disminuir, ésta se vuelve más seca y más fina ya que se altera su metabolismo. La piel toma también con el tiempo un aspecto grisáceo que da un tinte mate contra el cual también puede aplicarse un tratamiento de aclarado.
La segunda causa del envejecimiento es la disminución de la producción hormonal que implica la disminución progresiva de las funciones de los tejidos orgánicos, celulares y orgánicos. Las hormonas como la hormona de crecimiento (HGH), la testosterona, el DHEA y la melatonina se producen en grandes cantidades hasta la edad de 20 años y favorecen la renovación celular.
La consecuencia de estas distintas causas del envejecimiento combinadas con los efectos del medio ambiente (distintas contaminaciones: gas de escape, humos de cigarrillos, humos de fábricas, productos químicos...) llevan a la superproducción de radicales libres que tienen como objetivo los distintos componentes de la célula: proteínas, lípidos, azúcares y el ADN y que constituyen así otra causa del envejecimiento cutáneo. Algunas influencias exteriores les impulsan a entrar en reacción ya que buscan constantemente otras moléculas a las cuales pueden enlazarse. Atacan entonces las fibras de colágeno, las membranas celulares y la capa grasa de la piel. Alteran el patrimonio genético de las células, de modo que la calidad de las nuevas células de la piel disminuye.
El cuerpo se protege contra estos agresores mediante sistemas enzimáticos que se oponen a estas reacciones de oxidación (antioxidantes). Pero a partir de la edad de veinte años, los mecanismos de defensa naturales se debilitan progresivamente, de modo que la piel no puede ya defenderse completamente sola.
El Solicitante descubrió de manera sorprendente e inesperada que un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, permite alcanzar esta combinación de efectos buscada: despigmenta y/o aclara la epidermis con una perfecta inocuidad protegiéndola al mismo tiempo que regenerándola.
Las células desdiferenciadas conservan todas las potencialidades celulares como las células existentes. Expresan todos los genes de su genoma pues sintetizan todas las proteínas que permiten a cada tipo de célula especializada protegerse del medio exterior.
La invención tiene pues por primer objeto la utilización en o para la fabricación de una composición cosmética o farmacéutica al menos de un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, permitiendo dicho liofilizado despigmentar y/o aclarar, proteger y regenerar la epidermis.
Se entiende por "célula vegetal desdiferenciada" toda célula vegetal que no presenta ningún carácter de especialización y que puede regenerar por sí sola una planta entera de vegetal del que procede. Puede aislarse a partir de toda muestra de planta entera u órgano como las hojas, los troncos, las raíces, las semillas, las flores, los pétalos, las anteras, los frutos, etc, mediante el llamado explante.
De manera preferida, se utilizan un trozo de hoja o una semilla como explante.
Se prefiere muy especialmente cultivar el explante "in vitro". Se entiende por "cultivo ``in vitro''" el conjunto de las técnicas del arte previo conocidas por el experto en el arte, que permiten en condiciones perfectamente controladas regenerar un órgano o una planta entera a partir de un explante cultivado en o sobre un medio nutritivo definido. Estas condiciones perfectamente controladas permiten una perfecta reproductividad y homogeneidad de las plantas. En particular, este método de cultivo proporciona clones idénticos ad infinitum. Entre los métodos y medios de cultivo "in vitro" descritos en el arte previo, se pueden citar como ejemplos los medios de Gamborg (1968), de Murashige et Skoog (1962), de Morel (1970), etc..dont la formulation est décrite dans "Plant Culture Media : Formulations and uses" de E.F. George, DJM Puttock et H.J. George (Exegetics Ltd 1987).
En particular, se prefiere utilizar células vegetales desdiferenciadas de vegetal halófilo como las especies Salicornia ramossisima (Salicorne), Sueda vera, Beta maritima, Obione portulacoides, Armeria maritima, Crithmum maritimum (Criste Marina), Ophrys sphegodes, Artemia vulgaris, Muscaris comosum, Eryngium maritimum, Sanguisorba minor, Cochlearia officinalis, Fumaria officinalis, Vincetoxicum fullonum, Dipsacus fullonum, Heracleum spondylium, Inula crithmoides, Inula brittanica, Inula viscosa, muy especialmente células vegetales desdiferenciadas de Criste Marine (Crithmum maritimum). Los vegetales halófilos, también nombrados halófitos, son vegetales que toleran suelos ricos en sal. Desarrollaron sistemas de defensa contra el medio exterior agresivo que colonizan. En particular, los halófitos son vegetales del borde del mar, capaces de soportar un suelo rico en sal, la humedad y el viento. Luchan permanentemente para mantener la presión osmótica en sus células, tendiendo el agua a atravesar la membrana plásmica hacia el compartimento extracelular más salado.
En el caso de la utilización de vegetal halófilo, es especialmente importante desarrollar un cultivo "in vitro" de células que proporciona una biomasa infinita y reproductible para proteger estas especies, estando los halófitos en peligro ante la contaminación de los mares.
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En una realización particular de la invención, es también posible modificar algunas condiciones de cultivo (pH, temperatura, composición gaseosa ambiente, composición del medio de cultivo, luminosidad). Las células desdiferenciadas tenderán entonces a producir más o menos de algunas sustancias intracelulares.
El segundo objeto de la invención es una composición cosmética o farmacéutica de uso tópico caracterizada porque incluye, en una base fisiológicamente aceptable, 0,05 al 2%, preferiblemente 0,1 al 1%, de manera especialmente preferida 0,5% al menos de un liofilizado tal como describe anteriormente.
En efecto, tal liofilizado puede utilizarse como único principio activo de la composición según la invención. Sin embargo, pueden añadirse varios liofilizados a la base de la composición según la invención.
En un primer método de realización particular de la invención, se utiliza al menos un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, para la fabricación de una composición cosmética o farmacéutica, destinadas a renovar el aspecto de la piel.
En un segundo método de realización particular de la invención, se utiliza al menos un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, para la fabricación de una composición cosmética o farmacéutica destinada al tratamiento de las manchas llamadas lentigos.
En un tercer método de realización particular de la invención, se utiliza al menos un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, para la fabricación de una composición cosmética o farmacéutica, destinada a aclarar las pieles negras o asiáticas.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención sin por ello limitar el alcance.
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Leyenda de las Figuras
Figura 1: morfología general, coloración con hematoxilina/eosina (HES) sobre epidermis reconstituida
SKINETHIC® simple (queratinocitos).
Figura 2: Morfología general, coloración al hematoxilina/eosina (HES) sobre epidermis reconstituida
SKINETHIC® que integra melanocitos.
Figura 3: Marcado de la filaggrina.
Figura 4: Marcado de KI-67 (evaluación del índice mitótico) Ejemplo 1: Cultivo "in vitro" de células desdiferenciadas de Criste Marina a partir de tejido vegetal: 1 obtención de callus primarios.
Con ayuda de tijeras se toman pedazos de tejidos en la zona elegida (3 cm mínimo) de tronco, hojas. A partir de esta fase de la de la manipulación, todo debe desarrollarse en atmósfera estéril bajo una campana de flujo laminar.
Para esterilizar el material vegetal, se sumergen los tejidos 30 s en etanol, luego se elimina el solvente, se enjuagan con 3 x 100 ml de H_{2}O estéril, se sumergen 15 minutos en hipoclorito de sodio añadiendo algunas gotas de Tween 20 y se enjuagan con 3 x 100 ml de H_{2}O estéril. Para poner los tejidos en cultivo, se depositan los fragmentos de tejidos en una caja de Petri estéril (125 mm.), se recortan fragmentos de tejidos (2 a 3 mm.) teniendo cuidado de eliminar las partes blanqueadas por el agua de lejía. Los explantes así obtenidos se inciden ligeramente y se depositan medio-insertados en el medio nutritivo gelosado (Tabla 1).
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2 Trasplante del callus
En esta fase de manipulación, todo debe desarrollarse en atmósfera estéril bajo una campana de flujo laminar. Se toman al nivel del callus 2 a 3 aglomerados aglomerados celulares (1 a 2 cm) con ayuda de una espátula.
Se depositan y se distribuyen estos aglomerados sobre el nuevo medio.
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Composición del medio de cultivo sólido: Tabla 1
1 
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2 
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3- Extensión de las células del callus en medio líquido Inóculo de mantenimiento
Las células del callus se transfieren a un medio líquido idéntico al medio sólido sin agar (Tabla 1). Se cultivan bajo agitación (110 revoluciones por minuto), a 25ºC en luz blanca continua (3500 lux, tubos fluorescentes de "luz día") en erlenmeyers de 250 mL, en torno al 50 mL por erlenmeyer. Se les diluye del 10 a 11 días a 1/4 es decir, 100 mL en 400 mL.
Producción de materia seca
Las células se cultivan a partir de una dilución a 1/4 del inoculante de mantenimiento en erlenmeyers de 5L, a razón de 2L de cultivo por erlenmeyer, bajo agitación (110 revoluciones por minuto), a 25ºC en luz blanca continua (3500 lux, tubos fluorescentes de "luz día") y esto durante 12 a 13 días.
Hay que señalar que el ácido 2,4 diclorofenoxiacético es metabolizado enteramente y no se encontrará en el producto final.
Ejemplo 2 Preparación de un liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marina
El cultivo celular líquido en suspensión se centrifuga para depositar las células.
Las células se pasan sobre un tamiz de 150 a 200 mm., son congeladas y luego liofilizadas en un liofilizador de placas.
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Ejemplo 3
Puesta en evidencia sobre epidermis reconstituida SKINETHIC® de la ausencia de toxicidad de una reparación cosmética que contiene un liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marina.
La epidermis reconstituida SKINETHIC® es un modelo de epidermis humano desarrollado y comercializado por la Sociedad SkinEthic Laboratories (Niza, Francia).
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1. Sobre epidermis reconstituida SKINETHIC® simple (constituido solamente de queratinocitos):
Se siembran algunos queratinocitos de origen humano sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2} en un medio definido (MCDB 153 modificado) complementado. Las células se cultivan durante 14 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que se cambia el medio de cultivo cada dos días.
Las epidermis así formadas se utilizaron para la realización del estudio a partir del 17º día de cultivo.
Se efectuó una prueba preliminar con el fin de determinar el tiempo de contacto y la cantidad de producto aplicado sobre la epidermis reconstituida que no implica citotoxicidad. Se condujeron todas las pruebas en duplicado con:
Lote 1: epidermis testigo que no reciben producto
Lote 2: epidermis tratadas que reciben crema PXTS + 0,1% AK205
Lote 3: epidermis tratadas que reciben crema PXTS + 0,5% AK205
Lote 4: epidermis tratadas que recibían el producto liofilizado de células (AK 205)
AK205 = liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marina obtenido según los Ejemplos 1 y 2. PXTS = para pieles muy secas.
Las epidermis fijadas en una solución de aldehído fórmico al 10% se incluyeron en bloques en parafina. Los cortes verticales de 4 micrones fueron coloreados con hematoxilina/eosina y fotografiados bajo un microscopio óptico.
Los cultivos deben presentar capas celulares básicas, espinosas, granulosas y córneas intactas, ortoqueratósicas, y la estratificación epidérmica debe ser regular y normal. Las células de la capa básica deben ser polarizadas verticalmente. Numerosos granos de queratohialina deben ser visibles (en púrpura) en la capa granulosa justo bajo la capa córnea.
Los productos, crema PXTS+0,1% AK205, crema PXTS+0,5% AK205 y el producto liofilizado de células de Criste Marina (AK 205) depositados en torno al 2 mL por cm^{2}, sobre epidermis reconstituidas tratadas durante las 24, comparativamente a epidermis testigo, no indujo ninguna toxicidad. Las imágenes histológicas, después de coloración hematoxilina/éo, de epidermis tratadas son comparables a las de las epidermis testigo (véase Figura 1).
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2. Sobre epidermis reconstituida SKINZTHIC® que integra melanocitos:
Queratinocitos de origen humano y los melanocitos se siembran sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2}s en un medio definido (MCDB 153 modificado) y complementado. Las células se cultivan durante 10 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que se cambia el medio de cultivo todos los días.
Las epidermis de tipo VI (= negroide) así formadas se utilizaron a partir del 10.o día de cultivo.
Se efectuó una prueba preliminar con el fin de determinar el tiempo de contacto y la cantidad de producto aplicado sobre la epidermis reconstituida que no implicaba citotoxicidad.
La prueba se condujo en duplicado con:
Lote 1: epidermis testigo que no reciben producto
Lote 2: epidermis testigo positivas que reciben el ácido kójico, 2%
Lote 3: epidermis tratadas que reciben crema PXTS + 0,1% AK205
Lote 4: epidermis tratadas que recibían crema PXTS + 0,5% AK205
AK205 = liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marina obtenido según los Ejemplos 1 y las 2.
Epidermis fijadas en una solución aldehído fórmico 10% se incluyó en bloques en parafina. Los cortes verticales de 4 micrones fueron coloreados con hematoxilina/eosina y fotografiadas bajo un microscopio óptico.
Los cultivos deben presentar capas celulares básicas, espinosas, granulosas y córneas intactas, ortoqueratósicas, y la estratificación epidérmica deben ser regulares y normales. Las células de la capa básica deben ser polarizadas verticalmente. Numerosos granos de queratohialina deben ser visibles (en púrpura) en la capa granulosa justa bajo la capa córnea.
Los productos, crema PXTS+0,1% AK205 y crema PXTS+0,5% AK205 depositados en torno a 2 mL por cm^{2}, sobre epidermis reconstituidas tratadas durante 24 h, comparativamente con la epidermis testigo, no indujeron ninguna toxicidad. Las imágenes histológicas, después de coloración con hematoxilina/eosina, de epidermis tratadas son comparables a las de las epidermis testigo (véase Figura 2).
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Ejemplo 4
Evaluación del efecto despigmentante de una preparación cosmética que contiene un liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marina sobre epidermis reconstituidas SKINETHIC® que integran melanocitos:
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1. Protocolos experimentales
Queratinocitos de origen humano y melanocitos se siembran sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2} en un medio definido (MCDB 153 modificado) y complementado. Las células se cultivan durante 10 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que se cambia el medio de cultivo todos los días.
Las epidermis de tipo VI (= negroide) así formadas se utilizaron a partir del 10.o día de cultivo.
Se condujeron Todas las pruebas en duplicado con:
Lote 1: epidermis testigo que no reciben producto
Lote 2: epidermis testigo positivas que reciben el ácido kójico, 2%
Lote 3: epidermis tratadas que reciben crema PXTS + 0,1% AK205
Lote 4: epidermis tratadas que recibían crema PXTS + 0,5% AK205
AK205 = liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marina obtenido según los Ejemplos 1 y 2.
La evaluación de la síntesis de la melanina (estudio cualitativo) intracelular fue efectuada por espectrometría a 475 nm después de que las células se pusieron en suspensión luego disueltas en NaOH (1N) y dimetil sulfóxido durante 30 minutos.
Al final del período de incubación, se puso el medio de cultivo, se tomaron luego las epidermis, se aclararon con el PBS (Fosfato Parachoques Salina) y se puso en contacto con Tritón X-100 (Sigma, Francia) a 1% y luego se incubaron durante 10 minutos. La reacción enzimática fue iniciada por la adición de L-Dopamina (Sigma, Francia) a 10 mM en el PBS desprovisto de Ca^{2+} y de Mg^{2+}. Después de 1 hora de incubación a 37ºC protegida de la luz, la actividad de la tirosinasa fue evaluada por la medida de la absorción en 475 nm con ayuda de un espectrofotómetro.
\newpage
2- Resultados a) Dosificación de melanina
Los resultados obtenidos se presentan en forma de tabla:
3
Los resultados obtenidos revelaron que la crema PXTS+0,5% AK205 implicó una disminución significativa del tipo de melanina en las epidermis reconstituidas integrales de los melanocitos (-37%). La crema PXTS+0,1% AK205 redujo ligeramente este porcentaje (-13%) comparativamente al testigo positivo ácido kojique 2% (-44%).
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b) Evaluación de la actividad tirosinásica
Los resultados obtenidos se presentan en forma de tabla:
4
Los resultados obtenidos revelaron que el producto crema PXTS+0,5% AK205 implicó una disminución significativa de la actividad de la tirosinasa en las epidermis reconstituidas integrales de los melanocitos (-32%) comparativamente al testigo positivo (-38%). Se observó una ligera disminución (-19%) después de tratamiento por el producto crema PXTS+0,1% AK205.
En conclusión, en las condiciones experimentales elegidas el producto crema PXTS+0,5% AK205 presentó una actividad despigmentante neta frente a las epidermis reconstituyentes integrantes de los melanocitos. Se observó una actividad más limitada pero más real con la crema PXTS+0,1% AK205.
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Ejemplo 5
Puesta en evidencia sobre epidermis reconstituida SKINETHIC® del efecto antihomolítico de una preparación cosmética que contiene un liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marina:
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1. ¿Porqué proporcionar el malondialdehído?
En los sistemas biológicos, el oxígeno molecular es estable y poco reactivo. Se implica como aceptante de electrones y su reducción consigue la producción de agua. Pero la reducción incompleta del O_{2} consigue la producción de radicales libres y metabolitos como el anión superóxido O_{2}-, el radical perhidróxi HO_{2}- tóxico (en presencia de hierro ferroso, la reacción puede conducir a OH-, muy agresivo) o el peróxido de hidrógeno H_{2}O_{2}.
La superóxido dismutasa (SOD) protege las membranas dismutantes muy rápidamente O_{2}- en H_{2}O_{2}. El H_{2}O_{2}, relativamente estable, se reduce en agua (H2O) por la catalasa y la peroxidasa. Estos radicales libres resultantes de la reducción incompleta del O_{2} son sensibles en las dobles conexiones, lo que favorece la aparición de otros radicales libres por deslocalización electrónica. La iniciación de la reacción en cadena homolítica se produce en los ácidos grasos poliinsaturadoss. La reacción en cadena se desencadena entonces, dentro de la membrana celular conduciendo a la liberación del malondialdehído (MDA) así como otros aldehídos y de alcanos que son productos de degradación. Estos últimos pueden ser puestos de relieve por reacción con el ácido tiobarbitúrico (TBA).
Al proporcionar el MDA, que es uno de los marcadores esenciales de la citotoxicidad por los procesos oxidativos y la tensión, se dispone entonces de un índice que informa sobre la actividad antirradical de una sustancia dada. 2 protocolo experimental:
Se siembran algunos queratinocitos de origen humano sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2} en un medio definido (MCDB 153 modificado) y complementado. Las células se cultivan durante 14 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que se cambia el medio de cultivo cada dos días.
Las epidermis así formadas se utilizaron para la realización del estudio a partir del 17º día de cultivo.
La prueba se condujo en triplicado después de 24 h de contacto del producto con las epidermis:
-
Lote 1: epidermis testigo negativas que no reciben ningún producto.
-
Lote 2: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,1% AK205
-
Lote 3: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,5% AK205
-
Lote 4: epidermis tratadas que recibían el producto liofilizado de células (Criste Marina)
Los productos que deben estudiarse se aplicaron a la superficie de cada epidermis tratada, en torno a 2 \muL/cm^{2}
\vskip1.000000\baselineskip
=> Extracción del malondialdehído
Después de 24 h de contacto del producto con las epidermis, estos últimos se volvieron a poner en suspensión en:
-
250 \muL de tampón Tris 50 mM, pH 8 que contiene NaCl 0,1 M; EDTA 20 mM
-
25 \muL de SDS al 7%
-
300 \muL de HCl (0,1 N)
-
38 \muL de ácido fosfotúngstico al 1% en agua
-
300 \muL de ácido tiobarbitúrico al 0,67% en agua
Después de 1 hora de incubación en la oscuridad a 50ºC y un enfriamiento en agua con hielo, se añadieron 300 ml n-butanol en cada tubo. Éstos se centrifugaron a 10.000 g a 0ºC durante 10 minutos. La fase superior se recuperó para la dosificación de MDA.
=> Dosificación del malondialdehído
El MDA fue proporcionado por medida de la fluorescencia después de separación del complejo MDA-TBA por HPLC (Cromatografía Líquida Alta Presión).
-
Bomba Bischoff Modelo 2.200
-
Inyector automático Alcoot Model 788 autosampler
-
Columna Ultrasep C18 (30 cm x 0,18 cm) 6 mm. de porosidad
-
Detector de fluorescencia, Jasco 821-FI
Se efectuó la detección de la fluorescencia con una excitación a 515 nm y una emisión a 553 nm. El eluyente utilizado está formado por metanol:agua, 40:60 (v/v) cuyo pH se ajustó con KOH 1M.
La cuantificación se hizo con relación a estándares tratados como las muestras (0,125; 0,25; 0,5 y 1 mM) con ayuda de un programa informático ICS (Pico 3) (Instrumentationón, Consommable Service). => Dosificación de las proteínas
La dosificación de las proteínas se realizó según el método de BRADFORD. El aumento de la absorbancia a 595 nm es proporcional a la concentración de las proteínas determinadas con ayuda de un espectrofotómetro UNICAM8625.
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3. Resultados a) Lipoperoxidación fisiológica
Los resultados obtenidos se presentan en forma de tabla:
5
Los resultados ponen de manifiesto que los productos estudiados no inducen ninguna liberación del MDA en las condiciones fisiológicas, con relación al testigo no tratado.
\vskip1.000000\baselineskip
b) Lipoperoxidación causada por UVB
Los resultados obtenidos se presentan en forma de tabla:
6
Los resultados obtenidos revelaron una protección significativa de los productos, crema PXTS+0,1% AK205, crema PXTS+0,5% AK205 y liofilizado de células (Criste Marina), aplicados a la superficie de la epidermis reconstituida SKINETHIC ®, frente a lipoperoxidación causada por los rayos ultravioletas B (150 mJ/cm^{2}).
El porcentaje de reducción de la producción de MDA es del -21, -25 y -28% respectivamente para crema PXTS+
0,1% AK205, crema PXTS+0,5% AK205 y el producto liofilizado de células (Criste Marina) en comparación con las epidermis irradiadas.
La irradiación WB (testigo positivo) que causa + un 28% de aumento de la producción de MDA, la aplicación de los productos crema PXTS+0,1% AK205, crema PXTS+0,5% AK205 y produce liofilizado de células (Criste Marina) antes de la irradiación permitió mantener la producción de MDA a su nivel fisiológico.
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Ejemplo 6
Puesta en evidencia sobre epidermis reconstituida SKINETHIC® del efecto que estimula de una reparación cosmética que contiene un liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marina:
1. Criterios de evaluación del estímulo
El cultivo celular de los queratinocitos humanos permitió describir más en detalle los efectos específicos de los derivados de la vitamina A sobre los marcadores de la diferenciación graduada de la epidermis: la expresión de KI-67 en la capa suprabásica se estimula, se induce la expresión de queratinas típicas de la hiperproliferación epidérmica (K19, K13), hay pérdida de la polaridad de las células de la capa básica, mientras que se inhibe la síntesis de filaggrina, proteína responsable del embalaje de las queratinas en la capa córnea. Los granos de queratohialina, situados en la capa granulosa y ricos en filaggrina, desaparecen en 24 h en presencia de ácido retinóico, de un 0,05% (ácido de la vitamina A) en el medio de cultivo. Los retinoides inducen pues globalmente un estímulo de la proliferación y una inhibición de la diferenciación epidérmica. (Rosdy, M. et al., In vitro Toxicology, Vol. 10 nº 1, p. 39-47, 1997, "Retinoic acid inhibits epidermal differentiation when applied topically on the stratum corneum of epidermis formed in vitro by human keratinocytes grown on defined medium").
La filaggrina y la proteína KI-67 puede pues utilizarse como marcadores de la diferenciación epidérmica.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Estudio de la diferenciación epidérmica \bullet Protocolo
Se siembran algunos queratinocitos de origen humano sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2} en un medio definido (MCDB 153 modificado) y complementado. Las células se cultivan durante 14 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que se cambia el medio de cultivo cada dos días.
Las epidermis así formadas se utilizaron para la realización del estudio a partir del 17º día de cultivo.
La prueba se conduce en triplicado después de 24 horas de contacto de los productos con las epidermis:
-
Lote 1: epidermis testigo negativas que no reciben ningún producto.
-
Lote 2: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,1% AK205
-
Lote 3: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,5% AK205
-
Lote 4: epidermis tratadas que recibían el producto liofilizado de células (Criste Marina)
Las epidermis testigo que no recibían ningún producto y las epidermis tratadas que recibían los productos en estudio durante 24 horas de contacto, se congelaron a -80ºC. Después de inclusión en bloques de parafina, las epidermis se cortaron y luego se trataron con immunohistoquímica.
Esta reacción se realizó con un anticuerpo monoclonal que recombinaba la filaggrina.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Resultados: Inhibición de la diferenciación de las células epidérmicas
La observación comparativa de las epidermis reconstituidas testigo y tratadas con los productos, crema PXTS+0,1% AK205, crema PXTS+0,5% AK205 y liofilizado de células (Criste Marina), reveló una diferencia de densidad de marcado de la filaggrina en la capa granulosa (véase Figura 3). En efecto, en las condiciones fisiológicas, el tratamiento de las epidermis por:
- crema PXTS+0,1% AK205: a inducido una neta disminución de la diferenciación epidérmica que se traduce en la neta disminución del marcado de la filaggrina en comparación con los testigos no tratados,
- crema PXTS+0,5% AK205: a inducido una neta disminución de la diferenciación epidérmica que se traduce en la neta disminución del marcado de la filaggrina en comparación con los testigos no tratados,
- liofilizado de células (Criste Marina): a inducido una disminución significativa de la diferenciación epidérmica que se traduce en la neta disminución del marcado de la filaggrina en comparación con el testigo no tratado.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Estudio de la actividad proliferadora de las células de la capa básica de las epidermis \bullet Protocolo
Queratinocitos de origen humano se siembran sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2} en un medio definido (MCDB 153 modificado) y complementado. Las células se cultivan durante 14 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que se cambia el medio de cultivo cada dos días.
Las epidermis así formadas se utilizaron para la realización del estudio a partir del 17º día de cultivo.
La actividad de los productos fue revelada por un marcado immunohistoquímico.
La prueba se conduce en triplicado después de 24 horas de contacto del producto con las epidermis:
-
Lote 1: epidermis testigo negativas que no reciben ningún producto.
-
Lote 2: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,1% AK205)
-
Lote 3: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,5% AK205 - Lote 4: epidermis tratadas que recibían el producto liofilizado de células (Criste Marina)
Las epidermis testigo que no recibían ningún producto y las epidermis tratadas que recibían los productos en estudio durante 24 horas de contacto, se fijaron con aldehído fórmico 10%. Después de inclusión en bloques de parafina, se cortaron estas epidermis y luego se trataron con immunohistoquímica.
Esta reacción se realizó con el anticuerpo MIB1 (Immunotech), péptido recombinante del antígeno nuclear KI-67.
El revelado fue hecho por el método peroxidasa-antiperóxido después de desenmascaramiento antigénico por tratamiento al calor.
El marcado por cromógeno DAD revela en marrón los lugares nucleares KI-67 de la fracción de las células en crecimiento expresado en fases:
=> G1 y S = fases de latencia y síntesis de la célula
=> G2 = fase de desdoblamiento de los constituyentes celulares
=> M = mitosis
El índice mitótico fue evaluado por recuento de los lugares nucleares coloreados, en torno a los 10 campos por lámina al microscopio óptico, ampliación x 250, comparativamente con los cortes de epidermis testigos.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados: estímulo de la proliferación de las células epidérmicas
Los resultados obtenidos se presentan en forma de tabla:
7
El recuento de los lugares nucleares coloreados al marrón de todas las muestras, después de tratamiento immunohistoquímica, reveló que el producto:
- crema PXTS+0,1% AK205: implicó un escaso aumento, pero significativo, de la multiplicación de las células de la capa básica. El número de lugares nucleares coloreados es comparable a el de los testigos no tratados (véase Figura 4).
- crema PXTS+0,5% AK205: implicó un escaso aumento, pero significativo, de la multiplicación de las células de la capa básica en comparación con el testigo no tratado. El número de lugares nucleares coloreados es superior a el de los testigos no tratados (véase Figura 4).
- liofilizado de células (Criste Marina): implicó un aumento significativo de la multiplicación de las células de la capa básica en comparación con el testigo no tratado. El número de lugares nucleares coloreados es ampliamente superior a el de los testigos no tratados (véase Figura 4).

Claims (16)

1. Utilización en una composición cosmética de al menos un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, para despigmentar y/o aclarar y proteger la epidermis.
2. Utilización de al menos un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a una utilización para despigmentar y/o aclarar, proteger y regenerar la epidermis.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque las células vegetales desdiferenciadas son obtenidas por cultivo "in vitro".
4. Utilización según la reivindicación 3, caracterizada porque las células vegetales desdiferenciadas obtenidas por cultivo "in vitro" son cepas.
5. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la planta halófila es el Criste Marina.
6. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque el liofilizado despigmenta y/o aclara la epidermis bloqueando la actividad de la tirosinasa.
7. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el liofilizado protege la epidermis por un efecto antihomolítico.
8. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque el liofilizado regenera la epidermis por un efecto que estimula la proliferación de las células de la capa básica de la epidermis.
9. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque el liofilizado regenera la epidermis por un efecto que inhibe la diferenciación epidérmica.
10. Composición cosmética o farmacéutica de uso tópico caracterizada porque incluye, en una base fisiológicamente aceptable, al menos un liofilizado tal como se describe según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Composición cosmética o farmacéutica de uso tópico caracterizada porque incluye, en una base fisiológicamente aceptable, del 0,05% al 2% al menos de un liofilizado tal como describe según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
12. Composición cosmética o farmacéutica de uso tópico caracterizada porque incluye, en una base fisiológicamente aceptable, del 0,1% al 1% al menos de un liofilizado como describe según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. Composición cosmética o farmacéutica de uso tópico caracterizada porque incluye, en una base fisiológicamente aceptable, un 0,5% al menos de un liofilizado tal como describe según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
14. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, destinada a renovar el aspecto de la piel.
15. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, destinada al tratamiento de las manchas pigmentarias.
16. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, destinada a aclarar las pieles negras o asiáticas.
ES04805628T 2003-12-29 2004-12-03 Utilizacion de un liofilizado de celulas vegetales desdiferenciadas con el fin de despigmentar y/o aclarar la piel. Expired - Lifetime ES2297526T3 (es)

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