ES2298052A1 - Procedimiento para la proliferacion de celulas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la proliferación de células. Procedimiento in vitro para la proliferación o cultivo de células de tejido conjuntivo seleccionadas de entre el grupo que consiste en condrocitos, osteoblastos, células condroprogenitoras, células osteoprogenitoras, tenocitos y células de ligamento que comprende la etapa de poner en contacto dichas células con un aminoazúcar seleccionado de entre el grupo que consiste en manosamina, N-acetilmanosamina, sales de manosamina y sus mezclas. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden el aminoazúcar en combinación con las células. Estas composiciones son útiles para el tratamiento de defectos o lesiones de cartílago, huesos, tendones, ligamentos, pérdidas de masa ósea y defectos o lesiones osteocondrales.
Description
Procedimiento para la proliferación de
células.
La presente invención se refiere a un
procedimiento in vitro para la proliferación o cultivo de
células. De igual modo, la presente invención se refiere a nuevas
composiciones, así como a su uso para el tratamiento de defectos o
lesiones de cartílago, pérdidas de masa ósea, lesiones de los
huesos, lesiones osteocondrales, lesiones de los tendones y lesiones
de los ligamentos.
Los defectos o lesiones en la superficie
articular se pueden clasificar como lesiones o defectos condrales y
osteocondrales, dependiendo de si penetran o no en el hueso
subcondral.
Las lesiones condrales, también conocidas como
lesiones de cartílago, son desde hace muchos años un problema de
difícil solución.
El cartílago es una forma especializada de
tejido conjuntivo que se encuentra en el adulto en las
articulaciones, costillas, orejas y tracto respiratorio. El
cartílago articular permite que los huesos se muevan deslizándose
unos sobre otros. También absorbe la tensión que produce el
movimiento físico. En la artrosis, la superficie del cartílago se
rompe y desgasta causando que los huesos se muevan unos contra
otros, produciendo fricción, dolor, hinchazón y pérdida de
movimiento en la articulación. Con el paso del tiempo la
articulación puede deformarse.
Numerosos estudios han confirmado que el
cartílago, huesos y partes blandas tales como ligamentos y
tendones, especialmente en personas adultas, presentan una
habilidad limitada de regeneración. En condiciones normales, la
renovación del cartílago es un proceso muy lento que consiste en
una constante síntesis (anabolismo) y degradación (catabolismo) de
los componentes de la matriz extracelular. Los condrocitos son las
células responsables de este metabolismo, y por lo tanto, de la
formación, mantenimiento y reparación de la matriz extracelular en
la que se encuentran inmersos.
En 1987 se llevó a cabo en Suecia el primer
implante de condrocitos autólogos en humanos (técnica ACI), como
una alternativa terapéutica a otros tratamientos para reparar
defectos de cartílago. La articulación más frecuentemente tratada
mediante esta técnica es la rodilla.
El implante de condrocitos autólogos es una
técnica que se realiza en dos tiempos. En una primera intervención
quirúrgica se extraen láminas de cartílago articular. Esta muestra
se cultiva hasta alcanzar un número suficiente de condrocitos para
el implante. En una segunda intervención quirúrgica se extraen los
trozos sueltos de tejido y se cubre con un parche de periostio al
que se deja una pequeña apertura para inyectar los condrocitos
cultivados. Una vez implantados los condrocitos, se cierra y se
sella el periostio. Recientemente se ha descrito la utilización de
una membrana de colágeno tipo I/III en lugar del periostio (C.R.
Gooding et al., The Knee, 13 (3),
203-210 (2006)).
Desde el primer implante de condrocitos
autólogos en humanos, el interés por el tratamiento o reparación de
defectos o lesiones de cartílago utilizando células ha ido en
aumento.
En 1994 se publicó un estudio clínico en el que
se había utilizado la técnica ACI. Dicho estudio se llevó a cabo
con 23 pacientes con defectos de cartílago en la rodilla (M.
Brittberg et al., N. Engl. J. Med., 331,
889-895 (1994)).
En numerosas publicaciones se describen nuevos
procedimientos de proliferación de condrocitos mediante la
utilización de diversas matrices o estructuras (scaffolds) o bien
de medios de cultivo alternativos a los convencionales (WO
2005/082433; WO 2005/054446; K.F. Almqvist et al., Ann.
Rheum. Dis., 60, 781-790 (2001)).
El tejido óseo es un tejido conjuntivo
especializado que, como los restantes tejidos conjuntivos, está
formado por células, fibras y sustancia fundamental, pero, a
diferencia de los otros, sus componentes extracelulares están
calcificados y le convierten en un material duro, firme y adecuado
para su función de soporte y protección. Proporciona apoyo interno
al cuerpo y ofrece lugares de inserción a los músculos y tendones
que son esenciales para el
movimiento.
movimiento.
En los huesos que crecen activamente se
distinguen cuatro tipos de células óseas: células
osteoprogenitoras, osteoblastos, osteocitos y osteoclastos. Las
células osteoprogenitoras son células que se originan a partir de
células mesenquimales y pueden proliferar y diferenciarse
únicamente hacia osteoblastos u osteoclastos. Los osteoblastos están
involucrados en la formación de hueso.
Los defectos óseos representan un gran reto
médico y socio-económico. Actualmente se están
desarrollando y aplicando diferentes tipos de biomateriales para la
reconstrucción de los tejidos óseos dañados. (U. Kneser, et
al, Tissue engineering of bone: the reconstructive surgeon's
point of view, J. Cell. Mol. Med. 10 (1),
7-19 (2006)).
Los tendones son estructuras anatómicas que unen
músculos a huesos y los ligamentos son estructuras similares que
unen huesos a otros huesos. Son estructuras cilíndricas, elongadas,
formadas de tejido conjuntivo denso y adaptadas a la tensión en una
dirección, con fibras de colágeno paralelas.
Las células predominantes en los tendones se
llaman tenocitos. Los tenocitos tienen la función de mantener la
estructura de la matriz a través de procesos de degradación y
síntesis que comprenden la remodelación y también podrían
contribuir hasta cierto punto a la curación. Sin embargo, el tendón
tiene una densidad relativamente baja de células con baja actividad
mitótica lo cual explica la baja tasa de recambio de este tejido y
cuestiona el grado en que estas células pueden promover la curación
intrínseca. Esto hace que el tratamiento con células exógenas pueda
ser una estrategia importante en la ingeniería de tejidos de
tendón.
En 1994 se hicieron investigaciones preliminares
con fibras de un polímero sintético y tenocitos para desarrollar
implantes para ingeniería de tendones (Y. Cao et al.
"Generation of neo-tendon using synthetic
polymers seeded with tenocytes". Transplant. Proc. 26,
3390-3391 (1994)). Desde entonces se han publicado
diversos trabajos sobre implantes de tenocitos (WO 01/26667; US
2005060033).
Las lesiones de tendón son las lesiones
ortopédicas más comunes. Por ejemplo, al menos 100.000 lesiones de
Tendón de Aquiles son diagnosticadas y tratadas anualmente en USA
(A. Praemer et al, "Musculoskeletal condition in the
United States", 1st ed. American Academy of Orthopaedic
Surgeons, Park Ridge, IL, 1992). Se estimó también que había de
75.000 a 125.000 lesiones de Ligamento Anterior Cruzado (ACL) cada
año en USA (D.L. Butler et al, "Anterior Cruciate
Ligament: Its normal response and replacement", Journal of
Orthopaedic Research 7(6), 910-912
(1989) y unas 300.000 eran reportadas en todo el mundo. Todas estas
condiciones pueden producir una incapacidad importante en los
pacientes.
Los ligamentos, al igual que los tendones y los
tejidos cartilaginoso y óseo, tienen capacidad limitada de
auto-reparación. Por este motivo, la ingeniería de
tejidos con terapia basada en células representa un campo de gran
interés como terapia de nueva generación para este tipo de tejidos.
Recientemente se han publicado trabajos referentes a implantes para
ligamentos (K. Tsuchiya et al., "Effects of cell adhesion
molecules on adhesion of chondrocytes, ligament cells and
mesenchymal stem cells", Materials Science and Engineering
C 17, 79-82 (2001); J. A. Cooper, Jr,
"Evaluation of the anterior cruciate ligament, medial collateral
ligament, Achilles tendon and patellar tendon as cell sources for
tissue-engineered ligament", Biomaterials
27, 2747-2754 (2006)).
Los tejidos conjuntivos del cartílago, hueso,
tendón y ligamento, citados anteriormente, son componentes
fundamentales del sistema muscoesquelético.
La D-manosamina
(2-amino-2-desoxi-D-manosa)
es un aminoazúcar que se utiliza en la síntesis del ácido siálico y
derivados.
Existen documentos en los que se menciona o
describe la proliferación de condrocitos mediante la utilización de
otros aminoazúcares.
En la solicitud de patente PCT WO2004/104183 se
reivindica el cultivo de condrocitos en presencia del aminoazúcar
glucosamina.
En la patente US 6479469 se describe el
incremento en la proliferación de condrocitos cuando se utiliza un
N-acilderivado de glucosamina.
Por todo lo dicho, el problema a solucionar por
la presente invención es proporcionar un procedimiento alternativo
para la proliferación o cultivo de células de tejido conjuntivo
seleccionadas de entre el grupo que consiste en condrocitos,
osteoblastos, células condroprogenitoras, células
osteoprogenitoras, tenocitos y células de ligamento, así como
proporcionar composiciones alternativas para ser utilizadas en el
tratamiento de defectos o lesiones de cartílago, pérdidas de masa
ósea, lesiones de los huesos, lesiones osteocondrales, lesiones de
los tendones y lesiones de los ligamentos.
La presente invención describe un procedimiento
in vitro para la proliferación o cultivo de células de
tejido conjuntivo seleccionadas de entre el grupo que consiste en
condrocitos, osteoblastos, células condroprogenitoras, células
osteoprogenitoras, tenocitos y células de ligamento que comprende
la etapa de poner en contacto dichas células con un aminoazúcar
seleccionado de entre el grupo que consiste en manosamina,
N-acetilmanosamina, sales de manosamina y sus mezclas.
En una realización preferida las células de
tejido conjuntivo se encuentran en una matriz soporte
biocompatible, la cual preferentemente comprende un material
polimérico y es adecuada para el implante en el cuerpo humano
o
animal.
animal.
En una realización más preferida el aminoazúcar
es clorhidrato de manosamina.
En una realización igualmente preferida las
células de tejido conjuntivo son condrocitos. Igualmente preferidos
son los osteoblastos. Igualmente preferidas son las células
condroprogenitoras. Igualmente preferidas son las células
osteoprogenitoras. Igualmente preferidos son los tenocitos e
igualmente preferidas son las células de ligamento.
La presente invención también describe
composiciones que comprenden un aminoazúcar seleccionado de entre
el grupo que consiste en manosamina, N-acetilmanosamina,
sales de manosamina y sus mezclas en combinación con células de
tejido conjuntivo seleccionadas de entre el grupo que consiste en
condrocitos, osteoblastos, células condroprogenitoras, células
osteoprogenitoras, tenocitos y células de ligamento. En una
realización preferida las composiciones contienen además una matriz
soporte biocompatible, preferentemente de material polimérico,
siendo el aminoazúcar más preferido el clorhidrato de
manosamina.
En una realización igualmente preferida las
composiciones contienen condrocitos. Igualmente preferidas son las
composiciones que contienen osteoblastos. Igualmente preferidas son
las composiciones que contienen células condroprogenitoras.
Igualmente preferidas son las composiciones que contienen células
osteoprogenitoras. Igualmente preferidas son las composiciones que
contienen tenocitos e igualmente preferidas son las composiciones
que contienen células de ligamento.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de las composiciones de la invención en las que las células son
condrocitos o células condroprogenitoras para la preparación de un
medicamento para implante para el tratamiento o profilaxis de
defectos o lesiones de cartílago. En una realización preferida los
defectos o lesiones de cartílago se presentan en la enfermedad
artrósica.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de las composiciones de la invención en las que las células son
condrocitos, osteoblastos, células condroprogenitoras o células
osteoprogenitoras para la preparación de un medicamento para
implante para el tratamiento o profilaxis de pérdidas de masa
ósea.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de las composiciones de la invención en las que las células son
condrocitos, osteoblastos, células condroprogenitoras o células
osteoprogenitoras para la preparación de un medicamento para
implante para el tratamiento de defectos o lesiones de los
huesos.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de las composiciones de la invención en las que las células son
condrocitos, osteoblastos, células condroprogenitoras o células
osteoprogenitoras para la preparación de un medicamento para
implante para el tratamiento de defectos o lesiones
osteocondrales.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de las composiciones de la invención en las que las células son
tenocitos o células de ligamento para la preparación de un
medicamento para implante para el tratamiento de lesiones de los
tendones.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de las composiciones de la invención en las que las células son
tenocitos o células de ligamento para la preparación de un
medicamento para implante para el tratamiento de lesiones de los
ligamentos.
Preferentemente los aminoazúcares manosamina,
N-acetilmanosamina y sales de manosamina utilizados en la
presente invención son de la serie D.
Dichos aminoazúcares pueden existir en formas
anoméricas \alpha y \beta. La presente invención incluye la
utilización tanto de los anómeros individuales \alpha y \beta
separados como de sus mezclas.
Las sales de manosamina con ácidos
farmacéuticamente aceptables, incluye, sin límite, las sales con
los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, yodhídrico, bromhídrico,
fosfórico, sulfúrico, metanosulfónico, acético, fórmico, tartárico,
maleico, cítrico, succínico, láctico, glucónico, pirúvico,
fumárico, propiónico, aspártico, glutámico, benzoico, ascórbico,
glucurónico y málico.
Las sales de manosamina se pueden preparar
siguiendo procedimientos estándares de preparación de sales de
aminoazúcares. Un procedimiento consiste en obtener previamente la
manosamina base a partir del clorhidrato de manosamina, para
después añadir el ácido correspondiente dependiendo de la sal que
se desee obtener. Otro procedimiento consiste en obtener las sales
directamente a partir del clorhidrato de manosamina utilizando una
resina de intercambio aniónico previamente acondicionada con el
ácido que contiene el anión de la sal que se desea obtener o bien
una sal de metal del ácido. También se pueden obtener utilizando la
técnica de electrodiálisis.
El clorhidrato de manosamina es un producto
comercial (NZP, New Zealand Pharmaceutical), pero si se desea se
puede preparar mediante la epimerización de la
N-acetilglucosamina con una disolución acuosa de
Ca(OH)_{2} seguida de separación de los isómeros,
tratamiento con ácido clorhídrico, decoloración y precipitación con
disolventes (Sugai et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 68,
3581-3589 (1995); Sugai et al.,
Tetrahedron, 53 (7), 2397-2400 (1997)).
Cuando en la presente invención se habla de
procedimiento in vitro, también se está incluyendo el
procedimiento denominado ex vivo.
Cuando en la presente invención se habla de
células condroprogenitoras y de células osteoprogenitoras se hace
referencia a células que ya han conseguido una diferenciación
parcial y que han perdido la capacidad pluripotencial de la célula
madre. Es decir, son células que en su progresión evolutiva, se han
comprometido con un determinado linaje celular para dar lugar a
células especializadas específicas. Así, las células
condroprogenitoras darán lugar a condrocitos y las células
osteoprogenitoras darán lugar a osteoblastos y osteoclastos.
Cuando en la presente invención se habla de
matrices soporte se incluyen también las denominadas estructuras
soporte (support scaffolds).
Preferentemente las matrices o estructuras
soporte biocompatibles utilizadas en la presente invención están
compuestas de un material biodegradable, como por ejemplo ácido
poliglicólico, ácido poliláctico, celulosa, gelatina, colágeno,
pectina, alginato, dextrano, ácido hialurónico o derivados de los
mismos.
También se pueden utilizar matrices constituidas
por materiales no biodegradables tales como teflón, poliestireno,
poliacrilato o polivinilo. En este caso, si se desea, se puede
recubrir de un segundo material tal como la gelatina para aumentar
la unión de las células al polímero.
La matriz puede ser flexible o rígida. La
estructura tipo esponja también puede utilizarse.
Para proliferar o cultivar condrocitos,
osteoblastos, células condroprogenitoras, células
osteoprogenitoras, tenocitos o células de ligamento, según el
procedimiento de la presente invención, se ponen en contacto las
células con el aminoazúcar seleccionado de entre el grupo que
consiste en manosamina, N-acetilmanosamina, sales de
manosamina o sus mezclas. Las células antes de añadirles el
aminoazúcar pueden estar inmersas en un medio de cultivo que puede
contener nutrientes, antibióticos, factores de crecimiento e
inductores de diferenciación o de desdiferenciación. Opcionalmente
el aminoazúcar puede formar parte de un medio de cultivo que puede
contener nutrientes, antibióticos, factores de crecimiento e
inductores de diferenciación o de desdiferenciación. Las células
una vez proliferadas se pueden implantar, o bien, opcionalmente, se
pueden transferir a una matriz soporte para su posterior implante.
Esto es útil en el caso de que después del cultivo las células se
hayan desdiferenciado, ya que al transferirlas a una matriz soporte
se producirá su rediferenciación y síntesis de componentes de la
matriz extracelular.
Alternativamente, las células a proliferar se
pueden transferir previamente a una matriz soporte, para
posteriormente añadir el medio de cultivo que contiene el
aminoazúcar, para que tenga lugar la proliferación de las células
en la matriz soporte.
Antes de realizar el implante, se pueden lavar
las células o las matrices soporte que contienen las células,
eliminando el medio de cultivo. Alternativamente, se pueden
implantar composiciones que comprendan las células proliferadas y
el aminoazúcar o bien las células proliferadas, la matriz soporte y
el aminoazúcar (manosamina, N-acetilmanosamina, sales de
manosamina o sus mezclas). Las composiciones pueden contener además
nutrientes u otras sustancias que formen parte del medio de
cultivo.
Las células se pueden hacer proliferar in
vitro hasta que se haya desarrollado un volumen celular
adecuado, y posteriormente se pueden implantar las células (con o
sin matriz) junto con el aminoazúcar, para que las células puedan
continuar proliferando in vivo. Alternativamente, si se
desea, también se pueden implantar directamente las células, con o
sin matriz, y el aminoazúcar para que la proliferación tenga lugar
in vivo.
Se pueden seguir técnicas de cultivo y de
implante conocidas por expertos en cultivos celulares e implantes
quirúrgicos.
Las composiciones objeto de la invención son una
alternativa al implante de células con o sin matriz para reparar
y/o regenerar el cartílago, el hueso, el tendón o el ligamento
dañado.
La células y el aminoazúcar pueden estar
presentes en las composiciones de la invención a diferentes
concentraciones.
Las composiciones de la invención que contienen
condrocitos y/o células condroprogenitoras (con o sin matriz) y el
aminoazúcar seleccionado de entre el grupo que consiste en
manosamina, N-acetilmanosamina, sales de manosamina y sus
mezclas son útiles para tratar defectos o lesiones de cartílago que
se puedan presentar en cualquier articulación del cuerpo. Dichos
defectos pueden ser el resultado de un traumatismo, de un defecto
de nacimiento o de una enfermedad tal como la artrosis.
Las composiciones de la invención que contienen
condrocitos, osteoblastos, células condroprogenitoras y/o células
osteoprogenitoras (con o sin matriz) y el aminoazúcar seleccionado
de entre el grupo que consiste en manosamina,
N-acetilmanosamina, sales de manosamina y sus mezclas son
útiles para tratar defectos o lesiones de hueso u osteocondrales
que pueden ser el resultado de un traumatismo, defecto genético o
enfermedad. También son útiles para tratar pérdidas de masa ósea
que se puedan presentar, por ejemplo con la edad, la menopausia o
como consecuencia de enfermedades.
\newpage
Las composiciones de la invención que contienen
tenocitos y/o células de ligamento (con o sin matriz) y el
aminoazúcar seleccionado de entre el grupo que consiste en
manosamina, N-acetilmanosamina, sales de manosamina y sus
mezclas son útiles para tratar lesiones de los tendones o lesiones
de los ligamentos.
Una ventaja de la presente invención radica en
que al utilizar clorhidrato de manosamina la proliferación de
condrocitos es mayor que cuando se utiliza un medio de cultivo
estándar o cuando se utilizan los aminoazúcares clorhidrato de
glucosamina y N-acetilglucosamina.
Otra ventaja radica en que al utilizar
clorhidrato de manosamina en un cultivo de condrocitos, se reduce
la liberación de GAGs, así como la actividad metaloproteasa en
comparación con un medio de cultivo estándar.
Otra ventaja importante de la presente invención
es que al utilizar la N-acetilmanosamina en un cultivo de
condrocitos, se produce un incremento en la síntesis de GAGs. Esta
actividad estimuladora del anabolismo es importante ya que los GAGs
forman parte de la matriz extracelular.
En la Figura 1 se representa a tres
concentraciones (1, 5 y 10 mM) el efecto del clorhidrato de
manosamina, clorhidrato de glucosamina y N-acetilglucosamina
sobre los niveles de ácido desoxiribonucleico (ADN) por bola de
alginato.
En la Figura 2 se representa a dos
concentraciones (1 y 10 mM) el efecto del clorhidrato de
manosamina, clorhidrato de glucosamina y N-acetilglucosamina
sobre el porcentaje de glicosaminoglicanos (GAGs) liberados
respecto a GAGs totales por los condrocitos en bolas de alginato,
después de la estimulación con IL-1\beta.
En la Figura 3 se representa a dos
concentraciones (5 y 10 mM) el efecto del clorhidrato de
manosamina, clorhidrato de glucosamina y N-acetilglucosamina
sobre la actividad metaloproteasa (MMP) de los condrocitos en bolas
de alginato, después de estimulación con IL-1\beta
y activación con APMA (acetato de
4-aminofenilmercurio).
En la Figura 4 se representa a dos
concentraciones (5 y 10 mM) el efecto de la
N-acetilmanosamina y N-acetilglu-
cosamina sobre los niveles de GAGs respecto a los niveles de ADN.
cosamina sobre los niveles de GAGs respecto a los niveles de ADN.
Los siguientes ejemplos son meramente
ilustrativos y no representan una limitación del alcance de la
presente invención.
Ejemplo
1
El objetivo era determinar el efecto del
clorhidrato de manosamina sobre la proliferación de condrocitos en
un modelo de cultivo in vitro.
Se comparó la actividad del clorhidrato de
manosamina con los siguientes compuestos: clorhidrato de
glucosamina y N-acetilglucosamina.
Para cuantificar el incremento de condrocitos se
determinó el aumento de los niveles de ácido desoxiribonucleico
(ADN).
Los condrocitos de origen bovino se aislaron
mediante digestión con colagenasa siguiendo un procedimiento
descrito previamente (B. Beekman et al., Exp. Cell Res.,
237, 135-141 (1997)).
Los condrocitos bovinos aislados se cultivaron
siguiendo una metodología descrita en la literatura (J. DeGroot,
et al., 266, 303-310 (2001). Los condrocitos
se transfirieron a una matriz soporte de alginato, formando bolas
de alginato que contenían las células a una concentración de 2,5 x
10^{6} células/ml y se les añadió DMEM (Dulbecco's Modified
Eagle's Medium) con Glutamax suplementado con ácido ascórbico,
penicilina, estreptomicina y FCS (suero bovino fetal). Después de 24
horas, se renovó el medio, y los condrocitos contenidos en bolas de
alginato (5 bolas/pocillo, con 250 \mul de medio/pocillo, en
placas de 48 pocillos) se cultivaron en ausencia (control) o
presencia del compuesto a ensayar (a concentraciones de 1, 5 y 10
mM). Se regeneró el medio dos veces por semana. Al cabo de 10 días,
se recogieron las bolas (5 bolas en cada pocillo, n=3 pocillos por
condición) y se almacenaron a una temperatura de -20°C hasta
efectuar los análisis.
Para cuantificar los niveles de ADN se
digirieron las bolas con papaína, y se utilizó el colorante Hoechst
33258 (bis-benzimida). Se determinaron los niveles
de ADN por bola de alginato.
La evaluación de las diferencias entre todos los
compuestos y la condición control se ensayó mediante análisis de la
varianza (ANOVA). Después se realizó el ensayo LSD para determinar
las diferencias entre cada compuesto y la condición control. Se
consideraron estadísticamente significativas cuando p \leq
0,05.
A las tres concentraciones ensayadas (1, 5 y 10
mM) los niveles más altos de ADN/bola medidos se obtuvieron en las
células cultivadas con clorhidrato de manosamina (Figura 1).
Tanto el clorhidrato de manosamina como el
clorhidrato de glucosamina causaron un incremento dosis dependiente
en los niveles de ADN. Se encontraron diferencias significativas
entre el clorhidrato de manosamina y el clorhidrato de glucosamina
a las tres concentraciones ensayadas. A la concentración de 10 mM,
el clorhidrato de manosamina causó un incremento 10 veces superior
al control (sin compuesto), mientras que el incremento producido
por el clorhidrato de glucosamina fue 4 veces superior.
Con la N-acetilglucosamina no se observó
ningún efecto significativo sobre el contenido de ADN.
Podemos concluir que el clorhidrato de
manosamina estimula la proliferación de condrocitos, siendo mucho
más eficaz que el clorhidrato de glucosamina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El objetivo era determinar el efecto del
clorhidrato de manosamina sobre la liberación de
glicosaminoglicanos (GAGs) de los condrocitos en bolas de alginato,
después de haber sido estimulados con
IL-1\beta.
La liberación de GAGs es un ensayo utilizado
para evaluar los efectos de los compuestos en la degradación de
proteoglicanos inducida por IL-1\beta en los
condrocitos. Permite evaluar la actividad catabólica de los
condrocitos. La liberación de GAGs inducida por
IL-1\beta está principalmente mediada por
agrecanasas.
Se comparó la actividad del clorhidrato de
manosamina con los siguientes compuestos: clorhidrato de
glucosamina y N-acetilglucosamina.
Los condrocitos de origen bovino se cultivaron
durante 21 días en bolas de alginato como matriz soporte;
aproximadamente 100 bolas en frascos de cultivo de 75 cm^{2} en
25 ml de medio, sin adición de los compuestos a ensayar. Dos veces
por semana, el medio se regeneró. Después de 21 días de cultivo,
las bolas se transfirieron a placas de 48 pocillos, 5 bolas por
pocillo, 250 \mul de medio por pocillo. A día 21 se añadieron los
compuestos a ensayar (clorhidrato de manosamina, clorhidrato de
glucosamina y N-acetilglucosamina) para evaluar el efecto
sobre la degradación de la matriz extracelular después de la
estimulación con IL-1\beta (20 ng/ml). Cada
compuesto se ensayó a las concentraciones de 1 y 10 mM. En cada
experimento cada concentración se ensayó a n=3 pocillos, excepto en
el control (n=8 pocillos). Una vez incubadas las bolas de alginato
con IL-1\beta (20 ng/ml) y los compuestos durante
48 horas, se recogió el medio de cultivo (día 21 hasta día 23). Se
midió el contenido en GAGs en las bolas y en el medio de cultivo
del día 23 (liberación de GAGs mediada por agrecanasa). El
contenido de GAGs se determinó, previa digestión con papaína, con
el ensayo (kit) Blyscan^{TM} de Biocolor Ltd.
Los resultados se expresaron como porcentaje de
GAGs liberados respecto a GAGs totales.
La evaluación de las diferencias entre todos los
compuestos y la condición control se ensayó mediante análisis de la
varianza (ANOVA). Después se realizó el ensayo LSD para determinar
las diferencias entre cada compuesto y la condición control. Se
consideraron estadísticamente significativas cuando p \leq
0,05.
A la concentración superior (10 mM), el
clorhidrato de manosamina, igual que el clorhidrato de glucosamina,
redujo la liberación de GAGs por los condrocitos (Figura 2).
El clorhidrato de manosamina redujo la
liberación de GAGs en un 30% respecto al control (cultivo sin
compuesto).
La liberación de GAGs en el cartílago artrósico
es mayor en comparación con el cartílago normal, lo cual conlleva
un menor contenido en proteoglicanos en el tejido afectado, por
tanto, una reducción de la liberación de GAGs es beneficiosa porque
se traduce en una reducción de la pérdida de proteoglicanos en la
patología artrósica.
\newpage
Ejemplo
3
El objetivo era determinar el efecto del
clorhidrato de manosamina sobre la actividad metaloproteasa de los
condrocitos en bolas de alginato, después de la estimulación con
IL-1\beta.
La actividad metaloproteasa es utilizada para
evaluar los efectos de los compuestos en la liberación de
metaloproteasas (MMPs) inducida con IL-1\beta en
los condrocitos. Se trata de un ensayo útil para evaluar la
actividad catabólica del condrocito. Las metaloproteasas son
secretadas por los condrocitos como pro-enzimas
inactivos y son activadas previamente utilizando APMA (acetato de
4-aminofenilmercurio).
La primera causa de la destrucción patológica
del cartílago es la elevada actividad proteolítica. Las
metaloproteasas son un tipo de enzimas que degradan la matriz
extracelular del cartílago articular. Estas enzimas tienen una gran
capacidad para degradar la triple hélice del colágeno. En pacientes
con osteoartritis se han encontrado altos niveles de colagenasas y
también una relación entre esos niveles y la severidad de las
lesiones osteoartríticas.
Se comparó la actividad del clorhidrato de
manosamina con los siguientes compuestos: clorhidrato de
glucosamina y N-acetilglucosamina.
Se partió de condrocitos bovinos y se siguió la
misma metodología explicada en el Ejemplo 2, pero en este caso cada
compuesto se ensayó a dos concentraciones (5 y 10 mM).
Los condrocitos se cultivaron durante 21 días en
alginato para producir matriz extracelular. Después de 2 días de
estimulación con IL-1\beta y sin o con
compuestos, se renovó el medio. A continuación se determinó la
actividad metaloproteasa en el medio de cultivo a las 2 horas de
incubación con 20 ng/ml de IL-1\beta, 1 mM de APMA
y sin o con los compuestos. La actividad metaloproteasa se
cuantificó utilizando el sustrato para metaloproteasas TNO
211-F (I. Tchetverikov et al., Clin. Exp.
Rheumatol. 21, 711-8 (2003).
La evaluación de las diferencias entre todos los
compuestos y la condición control se ensayó mediante análisis de la
varianza (ANOVA). Después se realizó el ensayo LSD para determinar
las diferencias entre cada compuesto y la condición control. Se
consideraron estadísticamente significativas cuando p \leq
0,05.
Como se puede observar en la Figura 3, de todos
los compuestos ensayados el clorhidrato de manosamina es el único
que redujo la actividad metaloproteasa.
A la concentración de 10 mM el clorhidrato de
manosamina causó una reducción de la actividad metaloproteasa del
30% respecto al control.
Ejemplo
4
El objetivo era determinar el efecto del
clorhidrato de manosamina sobre el contenido de GAGs por ADN, es
decir, corregido por número de condrocitos.
Es un ensayo que permite evaluar los efectos de
los compuestos en la deposición de GAGs por condrocito, siendo útil
para evaluar la actividad anabólica del condrocito.
Se comparó la N-acetilmanosamina con la
N-acetilglucosamina.
Se partió de condrocitos bovinos y se siguió la
misma metodología explicada en el Ejemplo 1 (proliferación de
condrocitos medida a través de los niveles de ADN), pero en este
caso cada compuesto se ensayó a dos concentraciones (5 y 10
mM).
El contenido de GAGs se determinó, previa
digestión con papaína, con el ensayo (kit) Blyscan^{TM} de
Biocolor Ltd.
La evaluación de las diferencias entre todos los
compuestos y la condición control se ensayó mediante análisis de la
varianza (ANOVA). Después se realizó el ensayo LSD para determinar
las diferencias entre cada compuesto y la condición control. Se
consideraron estadísticamente significativas cuando p \leq
0,05.
Como se puede observar en la Figura 4, la
N-acetilmanosamina causó un incremento dosis dependiente en
los niveles de GAGs por condrocito.
A la concentración de 10 mM la
N-acetilmanosamina incrementó el contenido de GAGs por
condrocito en un 63% respecto al control (cultivo sin
producto).
Con la N-acetilglucosamina no se observó
ningún efecto sobre el contenido de GAGs por condrocito.
Claims (29)
1. Procedimiento in vitro para la
proliferación o cultivo de células de tejido conjuntivo
seleccionadas de entre el grupo que consiste en condrocitos,
osteoblastos, células condroprogenitoras, células osteoprogenitoras,
tenocitos y células de ligamento que comprende la etapa de poner en
contacto dichas células con un aminoazúcar seleccionado de entre el
grupo que consiste en manosamina, N-acetilmanosamina, sales
de manosamina y sus mezclas.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que las células de tejido conjuntivo se encuentran en una
matriz soporte biocompatible.
3. El procedimiento según la reivindicación 2,
en el que la matriz soporte biocompatible comprende un material
polimérico.
4. El procedimiento según la reivindicación 2 ó
3, en el que la matriz soporte biocompatible es adecuada para el
implante en el cuerpo humano o animal.
5. El procedimiento según la reivindicación 1 a
4, en el que el aminoazúcar es clorhidrato de manosamina.
6. El procedimiento según la reivindicación 1 a
5, en el que las células de tejido conjuntivo son condrocitos.
7. El procedimiento según la reivindicación 1 a
5, en el que las células de tejido conjuntivo son osteoblastos.
8. El procedimiento según la reivindicación 1 a
5, en el que las células de tejido conjuntivo son células
condroprogenitoras.
9. El procedimiento según la reivindicación 1 a
5, en el que las células de tejido conjuntivo son células
osteoprogenitoras.
10. El procedimiento según la reivindicación 1 a
5, en el que las células de tejido conjuntivo son tenocitos.
11. El procedimiento según la reivindicación 1 a
5, en el que las células de tejido conjuntivo son células de
ligamento.
12. Una composición que comprende un aminoazúcar
seleccionado de entre el grupo que consiste en manosamina,
N-acetilmanosamina, sales de manosamina y sus mezclas en
combinación con células de tejido conjuntivo seleccionadas de entre
el grupo que consiste en condrocitos, osteoblastos, células
condroprogenitoras, células osteoprogenitoras, tenocitos y células
de ligamento.
13. La composición según la reivindicación 12,
que contiene además una matriz soporte biocompatible.
14. La composición según la reivindicación 13,
en la que la matriz soporte biocompatible comprende un material
polimérico.
15. La composición según la reivindicación 12 a
14, en la que el aminoazúcar es clorhidrato de manosamina.
16. La composición según la reivindicación 12 a
15, en la que las células de tejido conjuntivo son condrocitos.
17. La composición según la reivindicación 12 a
15, en la que las células de tejido conjuntivo son
osteoblastos.
18. La composición según la reivindicación 12 a
15, en la que las células de tejido conjuntivo son células
condroprogenitoras.
19. La composición según la reivindicación 12 a
15, en la que las células de tejido conjuntivo son células
osteoprogenitoras.
20. La composición según la reivindicación 12 a
15, en la que las células de tejido conjuntivo son tenocitos.
21. La composición según la reivindicación 12 a
15, en la que las células de tejido conjuntivo son células de
ligamento.
22. Uso de una composición según la
reivindicación 16, para la preparación de un medicamento para
implante para el tratamiento o profilaxis de un defecto o lesión de
cartílago.
23. Uso de una composición según la
reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para
implante para el tratamiento o profilaxis de un defecto o lesión de
cartílago.
\newpage
24. Uso según la reivindicación 22 ó 23, en el
que el defecto o lesión de cartílago se presenta en la enfermedad
artrósica.
25. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 19, para la preparación de un medicamento
para implante para el tratamiento o profilaxis de una pérdida de
masa ósea.
26. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 19, para la preparación de un medicamento
para implante para el tratamiento de un defecto o lesión de
hueso.
27. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 19, para la preparación de un medicamento
para implante para el tratamiento de un defecto o lesión
osteocondral.
28. Uso de una composición según la
reivindicación 20 ó 21, para la preparación de un medicamento para
implante para el tratamiento de una lesión de tendón.
29. Uso de una composición según la
reivindicación 20 ó 21, para la preparación de un medicamento para
implante para el tratamiento de una lesión de ligamento.
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