ES2298402T3 - Eritropoyetina pegilada y diglicosilada. - Google Patents
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Abstract
Una muteína de eritropoyetina la cual tiene la actividad biológica in vivo de inducir que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos, caracterizada por estar N-glicosilada en Asn38 y Asn83 pero no estar N-glicosilada en Asn24, en donde un fragmento N-terminal de eritropoyetina que consta de los aminoácidos 1-28 de eritropoyetina y que ha conservado los Asn24 y Gly28 y un fragmento C-terminal de eritropoyetina que consta de los aminoácidos 29-165 ó 166 de eritropoyetina que está glicosilada en Asn38 y Asn83 y ha conservado el Cys29, se unen mediante un enlace químico entre Gly28 y Cys29 y se aisla la muteína de eritropoyetina.
Description
Eritropoyetina pegilada y diglicosilada.
La invención se refiere a nuevas variantes de
eritropoyetina que están diglicosiladas, métodos para la producción
y uso así como también con composiciones farmacéuticas de las
mismas.
La eritropoyetina es la producción de glóbulos
rojos que tienen lugar para compensar la destrucción de células. La
eritropoyesis es un mecanismo fisiológico controlado que permite que
estén disponibles suficientes glóbulos rojos para una apropiada
oxigenación de los tejidos. La eritropoyetina humana natural (hEPO)
es una glicoproteína que contiene 165 aminoácidos que es producida
en el riñón y es el factor humoral plasmático que estimula la
producción de glóbulos rojos. La EPO humana estimula la división y
diferenciación de los progenitores eritroides específicos
(committed erythroid progenitors) en la médula ósea. La EPO humana
ejerce su actividad biológica uniéndose a receptores en los
precursores eritroides. La eritropoyetina humana natural es una
glicoproteína ácida presente en bajas concentraciones en el plasma
para estimular el reemplazo de glóbulos rojos que se pierden por
envejecimiento.
La eritropoyetina ha sido producida
biosintéticamente usando tecnología de ADN recombinante (Egrie,
J.C., et al., Immunobiol. 72 (1986) 213-224)
y es el producto de un gen de la EPO humana clonado insertado y
expresado en células de tejido ovárico del hámster chino (células
CHO). Primero se traslada la EPO humana natural a una cadena
polipeptídica que contiene 166 aa con arginina 166. En una
modificación post-traslacional, la arginina 166 es
escindida por una carboxipeptidasa. La estructura primaria de la EPO
humana (165 aa y 166 aa) se muestra en las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID
NO: 2. Hay dos puentes disulfuro entre
Cys^{7}-Cys^{161} y
Cys^{29}-Cys^{33}. El peso molecular de la
cadena polipeptídica de la EPO humana sin las porciones de azúcares
es 18.236 Da. En la molécula de EPO intacta, aproximadamente el 40%
del peso molecular está dado por los grupos de hidratos de carbono
(Sasaki, H., et al., J. Biol. Chem. 262 (1987)
12059-12076).
Dado que la eritropoyetina es esencial en la
formación de glóbulos rojos, la hormona es útil en el tratamiento
de trastornos sanguíneos caracterizados por una producción de
glóbulos rojos baja o defectuosa. Clínicamente, la EPO e utiliza en
el tratamiento de, por ejemplo, anemia en pacientes con
insuficiencia renal crónica (CRF) y en pacientes con SIDA y cáncer
sometidos a quimioterapia (Danna, R.P., et al., In: MB,
Granick, ed. Erythropoietin in Clinical
Applications-An International Perspective. New York,
NY: Marcel Dekker; 1990, pp. 301-324). Sin embargo,
la biodisponibilidad de los agentes terapéuticos proteicos
actualmente disponibles tales como la EPO está limitada por su
corta vida media en el plasma y por su susceptibilidad a la
degradación por parte de proteasas. Estos defectos impiden que se
pueda alcanzar una potencia clínica máxima.
En la Patente Norteamericana Nº 4.835.260, WO
94/25055, WO 94/24160. WO 94/02611, WO 95/05465, y en muchas otras
publicaciones en el estado de la técnica, se sugieren modificaciones
de la secuencia de aminoácidos de la EPO.
Ambas eritropoyetinas, la eritropoyetina humana
proveniente de la orina y la eritropoyetina recombinante (expresada
en células de mamíferos) contienen tres cadenas de oligosacáridos
N-enlazadas y una cadena de oligosacáridos
O-enlazada que juntas representan aproximadamente el
40% del peso molecular total de la glicoproteína. La
N-glicosilación tiene lugar sobre residuos de
asparagina ubicados en las posiciones 24, 38 y 83, mientras que la
O-glicosilación tiene lugar sobre un radical de
serina ubicado en la posición 126 (Lai, et al., J. Biol.
Chem. 261 (1986) 3116; Broudy, V.C., et al., Arch. Biochem.
Biophys. 265(1988) 329). Se ha demostrado que las cadenas de
oligosacáridos están modificadas con radicales terminales de ácido
siálico. El tratamiento enzimático de eritropoyetina glicosilada
para eliminar todos los radicales de ácido siálico da lugar a una
pérdida de actividad in vivo pero no afecta la actividad
in vitro (Lowry et al., Nature 185 (1960) 102;
Goldwasser, E., et al., J. Biol. Chem. 249 (1974)
4202-4206). Este comportamiento ha sido explicado
por un rápido aclaración de la asialoeritropoyetina de la
circulación en interacción con la proteína hepática enlazante con la
asialoglicoproteína (Morrell et al., J. Biol. Chem. 243
(1968) 155; Briggs, D.W., et al., Am. J. Physiol. 227 (1974)
1385-1388; Ashwell G., and Kawasaki, T., Methods
Enzymol. 50 (1978) 287-288). De este modo, la
eritropoyetina posee in vivo actividad biológica sólo cuando
está sialilada para evitar su unión por la proteína hepática
enlazante.
El papel de los otros componentes en las cadenas
de oligosacáridos de la eritropoyetina no está bien definido. Se ha
demostrado que la eritropoyetina parcialmente deglicosilada ha
reducido en gran medida la actividad in vivo en comparación
con la forma glicosilada pero retiene la actividad in vitro
(Dordal, M.S., et al., Endocrinology 116 (1985)
2293-2299). Sin embargo, en otro estudio, la
eliminación de cadenas de oligosacáridos
N-enlazadas u O-enlazadas por
separado o en conjunto, por mutagénesis de radicales de asparagina o
serina que son sitios de glicosilación, reduce abruptamente la
actividad in vitro de la eritropoyetina alterada que se
produce en las células de mamíferos (Dube, S., et al., J.
Biol. Chem. 263 (1988) 17516-17521).
La mutagénesis dirigida de oligonucleótidos ha
sido utilizada para preparar mutantes estructurales de EPO carentes
de sitios específicos para glicosilación (Yamaguchi, K., et
al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 20434-20439; e
Higuchi, M., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992)
7703-7709). Lee-Huang, S., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 61 (1984) 2708-2712; y la
Patente Norteamericana Nº 5.641.663.
La EP 0 640 619 se refiere a análogos de
eritropoyetina humana que comprenden una secuencia de aminoácidos
que incluye al menos un sitio adicional para la glicosilación Los
sitios añadidos para la glicosilación pueden dar como resultado un
mayor número de cadenas de hidratos de carbono, y un contenido más
alto de ácido siálico, que en la eritropoyetina humana. También se
proporcionan los análogos de la eritropoyetina que comprenden
secuencias de aminoácidos que incluyen el reordenamiento de al menos
un sitio de glicosilación. También están incluidos los análogos que
comprenden una adición de uno o más aminoácidos al extremo carboxi
terminal de la eritropoyetina en donde la adición proporciona al
menos un sitio de glicosilación.
La PEGilación de EPO glicosilada se describe en
la WO 01/02017. Tales moléculas exhiben una actividad biológica
mejorada. La WO 00/32772 y Francis, G.E., et al., Int. J.
Hem. 68 (1988) 1-18, describen EPO no glicosilada
modificada con polietilenglicol. Las moléculas de la WO 00/32772
están modificadas adicionalmente en las posiciones 166. Tales
moléculas se describen como no causantes de un incremento
significativo en los hematocrito. La porción
PEG-polímero está formada por 1-5
cadenas poliméricas. La WO 00/32772 sugiere controlar el grado y
sitio de PEGilación disminuyendo el pH y reduciendo la relación
PEG:amina. Las reacciones se efectúan a pH 7 y una relación molar
de 1,5:1 de grupos PEG-aldehído:amina,
preferentemente reacciona con el grupo
\alpha-amino N-terminal.
A pesar de las numerosas modificaciones que se
conocen para la EPO aún existe la necesidad de más muteínas de EPO
con propiedades modificadas, especialmente con aclaración modificado
y métodos simples y reproductivos para su producción.
La invención proporciona una nueva clase de
muteínas de EPO. Las muteínas de EPO de acuerdo con la invención
tienen la actividad biológica in vivo de hacer que las
células de la médula ósea incrementen la producción de
reticulocitos y glóbulos rojos.
La invención proporciona una muteína de
eritropoyetina que ha retenido los sitios potenciales de
N-glicosilación en Asn^{24}, Asn^{28},
Asn^{83}, que está N-glicosilada en Asn^{38} y
Asn^{83} pero que no está N-glicosilada en
Asn^{24} y que preferentemente está unida en el grupo amino
N-terminal y/o el grupo
\varepsilon-amino de la Lys^{20} al
grupo(s) poli(etilenglicol) (PEG), preferentemente al
grupo(s) alcoxi(etilenglicol), más preferentemente al
grupo(s) metoxipoli(etilenglicol) inferior.
Las muteínas de esta invención tienen los mismos
uso que la EPO. En particular, las muteínas de esta invención son
útiles para tratar pacientes estimulando la división y
diferenciación de los progenitores eritroides específicos en la
médula ósea. La EPO se utiliza para tratar paciente en la misma
forma.
La presente invención también incluye un método
para el tratamiento de anemia en humanos el uso de las muteínas
para la producción de un agente farmacéutico preferentemente para
tal tratamiento.
La presente invención también incluye un método
para preparar muteínas de eritropoyetina de acuerdo con la
invención, que comprende la producción de un fragmento de EPO
glicosilada formado por los aminoácidos 26-165 (EPO
26-165) y posterior fusión de dicho fragmento con un
fragmento de EPO no glicosilada pero preferentemente PEGilada
formado por los aminoácidos 1-28 (EPO
1-28).
El término "eritropoyetina" (EPO) se
refiere a una proteína que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 ó 2 SEQ
ID NO: 2 o una proteína o polipéptido sustancialmente homólogo a
esa, cuyas propiedades biológicas se relaciona con la estimulación
de la producción de glóbulos rojos y la estimulación de la división
y diferenciación de progenitores eritroides específicos en la
médula ósea.
El término "Sustancialmente homólogo"
significa que una secuencia particular en cuestión, por ejemplo, una
secuencia mutante, varía de una secuencia de referencia en una a
cinco sustituciones, supresiones o adiciones, cuyo efecto neto no
da como resultado una diferencia funcional adversa entre las
secuencias de referencia y en cuestión. Sin embargo, como se
menciona anteriormente, se retienen los sitios potenciales de
glicosilación ASN^{24}, ASN^{38} y ASN^{83}.
La EPO humana tiene un sitio de
O-glicosilación (en Ser^{126} de la SEQ ID NO: 1)
y tres sitio de N-glicosilación (en ASN^{24},
ASN^{38} y ASN^{83} de la SEQ ID NO: 1). Los radicales glicosilo
en estos sitios están sialilados y son importantes para la vida
media in vivo y posteriormente para eficacia de la EPO. La
eliminación de los sitios de glicosilación Asn^{24} da como
resultado una muteína de EPO con mejor eficacia in vivo. Sin
embargo, tales muteínas de la EPO solamente pueden producirse de
acuerdo con el estado de la técnica reemplazando Asn^{24} por
otro aminoácido que no puede estar glicosilado. Por lo tanto, estas
muteínas difieren de la EPO natural por tener un aminoácido
modificado en una posición sensible de la secuencia. Tales muteínas
de EPO con secuencia de aminoácidos modificada y glicosilación
modificada están descritas, por ejemplo, en Nimtz, M., et
al., Eur. J Biochem. 213 (1993) 39-56; Sasaki,
H. et al., Biochemistry 27 (1988)
8.618-8.626; Delorme, C., et al.,
Biochemistry 31 (1992) 9.871-9.876; Fibi, M.R.,
et al., Blood 85 (1995) 1.229-1.236; y WO
99/11781 (ver también EP o 411 678; Takeuchi, M., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 7.819-7.822; EP
0 427 189; EP 0 409 113>; Dube, S., et al., J. Biol.
Chem. 263 (1988) 17.516-17.521; Yagamuchi, K., et
al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 20.434-20.439;
EP 0 640 619; y Fibi, M.R., et al., Applied Microbiol.
Biotechnol. 35 (1991) 622-630).
Por lo tanto, de acuerdo con el estado de la
técnica, se puede impedir la glicosilación en Asn^{24} solamente
por supresión, modificación o sustitución de este aminoácido. Las
muteínas de eritropoyetina que han retenido los aminoácidos
Asn^{24}, Asn^{38} y Asn^{83} pero que están solamente
glicosiladas en Asn^{38} y Asn^{83} y no glicosiladas en
Asn^{24} no están descritas en el estado de la técnica y no existe
guía alguna acerca de cómo producir tales moléculas.
La presente invención proporciona un método
simple para la producción de muteínas de EPO que retienen la
glicosilación, preferentemente la glicosilación natural, en la
parte del C-terminal de la molécula que comienza con
Cys^{29}, no estando glicosilada en la parte del
N-terminal hasta Gly^{28}, por lo que, además,
dicha parte del N-terminal puede modificarse muy
fácilmente y en forma general, si se desea. Tal modificación es, por
ejemplo, una unión definida y reproducible de cadenas laterales
tales como polietilenglicoles.
El término "fragmento de EPO
N-terminal" o "EPO 1-28" se
refiere a un fragmento de EPO que está formado esencialmente por
aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
Como se menciona anteriormente, el término también comprende
fragmentos con modificaciones leves en la secuencia de aminoácidos
(hasta aproximadamente dos intercambios, adiciones, supresiones)
siempre que las propiedades farmacéuticas de la EPO en la molécula
ligada no estén esencialmente influenciadas y siempre y cuando se
retenga Asn^{24} y se retenga Gly^{28} en el
C-terminal de la secuencia del fragmento.
El término "fragmento de EP
C-terminal" o "EPO 29-165"
se refiere a un fragmento de EPO que está formado esencialmente por
los aminoácidos 29-165 de SEQ ID NO: 1 o de los
aminoácidos 29-166 de la SEQ ID NO: 2. Como se
menciona anteriormente, el término también comprende fragmentos con
leves modificaciones en la secuencia de aminoácidos (hasta
aproximadamente tres intercambios, adiciones, supresiones) siempre
que las propiedades farmacéuticas de la EPO en la molécula ligada
no sean esencialmente influenciadas y siempre y cuando se retengan
Asn^{38} y Asn^{83} y se retenga Cys^{29} como aminoácido
N-terminal de dicho fragmento.
De acuerdo con la invención la parte
C-terminal de la eritropoyetina que comienza con
Cys^{29} se produce en forma recombinante en células
eucarióticas, por lo que Asn^{38} y Asn^{83} están
glicosiladas, mientras que la parte N-terminal
desde el comienzo hasta Gly^{28} se sintetiza in vitro por
reacción química.
Por lo tanto, la invención proporciona un método
para la producción de un mutante de EPO que está caracterizado
porque se ligan por enlace químico entre Gly^{28} y Cys^{29} un
fragmento de EPO N-terminal que está formado por
los aminoácidos 1-28 de la EPO que ha retenido
Asn^{24} y Gly^{28} y un fragmento de EPO
C-terminal que está formado por los aminoácidos
29-165 ó 166 de la EPO que está glicosilada en
Asn^{38} y Asn^{83} y que ha retenido Cys^{29}, y se aísla de
muteína de EPO.
El fragmento C-terminal de EPO
recombinante puede prepararse vía expresión en células eucarióticas,
por ejemplo en las líneas celulares CHO, BHK o HeLa por tecnología
de ADN recombinante o por activación de genes endógenos, es decir,
la glicoproteína eritropoyetina e expresa por activación de genes
endógenos. Las muteínas preferidas de la eritropoyetina de cuerdo
con la invención se basan en la secuencia de la EPO humana. Más
preferentemente, la EPO humana tiene la secuencia de aminoácidos
representada en (SEQ ID NO: 1) o (SEQ ID NO: 2), en forma más
preferida la EPO humana tiene la secuencia de aminoácidos
representada en la (SEQ ID NO: 1).
El fragmento C-terminal de EPO
se produce preferentemente en células CHO en la misma forma en la
que se produce la EPO en su longitud total, o también
preferentemente por activación de genes endógenos de células humanas
de acuerdo con la WO 99/5268 y la EP 1 037 821.
El fragmento N-terminal de EPO
puede sintetizarse usando métodos por etapas en fase sólida,
separarse de la resina y desprotegerse. Puede purificarse por
cromatografía, por ejemplo por cromatografía líquida de alta
resolución y caracterizarse por espectrometría de masas con
ionización por vaporización (ion-spray mass
spectrometry) como se describe, por ejemplo, en Schnoelzer, M.,
et al., Int. J. Pept. Protein Res. 40 (1992)
180-193; Dawson, P.E., et al., Science 266
(1994) 776-779; and Schnoelzer et al., G.G.
Fields (ed.), Solid Phase Peptide Synthesis, Methods Enzymology 289
(1977), ver todo el volumen. En el C-terminal, el
fragmento preferentemente contiene un grupo tiocarboxiéster para
unirse con Cys^{29} del fragmento C-terminal.
La ligación o unión de los fragmentos
N-terminal y C-terminal de la EPO
puede realizarse por unión química natural en forma simple siempre
y cuando el fragmento C-terminal tenga un radical de
cisteína amino terminal, que preferentemente es Cys^{29} (Dawson,
P.E., et al., Science 266 (1994) 776-779). De
acuerdo con este principio, el fragmento N-terminal
contiene un tioéster en el grupo \alpha-carboxilo
y sufre el ataque nucleofílico por parte de la cadena lateral del
residuo de Cys en el extremo amino del fragmento
C-terminal. El producto de unión inicial del
tioéster sufre una reacción intramolecular rápida que da un producto
con un enlace peptídico natural en el sitio de unión. Tales métodos
para la unión química de péptidos están revisados en Dawson, P.E.,
and Kent, S.B.H., Annual Review of Biochemistry 60 (2000)
923-960.
Preferentemente el fragmento
N-terminal de EPO y el fragmento
C-terminal de EPO fueron preferentemente
solubilizados durante la unión en una solución desnaturalizante tal
como clorhidrato de guanidina o urea y ligandos de acuerdo con
Dawson, P.E., et al., Science 266 (1994)
776-779 o Dawson, P.E., et al., J. Am. Chem.
Soc., 119 (1997) 4.325-4.329.
La purificación de la muteína de EPO ligada se
realiza por métodos convencionales tales como cromatografía de
afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de
intercambio iónico.
El término "PEGilación" significa un enlace
covalente de un radical de (polietilen)glicol en el
N-terminal del polipéptido y/o lisina 20. La
PEGilación de proteínas es ampliamente conocida en el estado de la
técnica y está revisada por, por ejemplo, Veronese, F.M.,
Biomaterials 22 (2001) 405-417. El PEG puede unirse
usando diferentes grupos funcionales y
polietilen-glicoles con diferente peso molecular,
PEGs lineales ramificados así como también diferentes grupos
enlazantes (ver también Francis, G.E., et al., Int. J.
Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C., et
al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992)
249-304).
La PEGilación del fragmento
N-terminal puede realizarse en solución acuosa con
reactivos de PEGilación como los descritos, por ejemplo, en WO
00/44785, preferentemente usando moléculas de PEG lineales o
ramificadas NHS-activadas de un peso molecular
entre 5 y 40 kDa. La PEGilación también puede realizarse en fase
sólida de acuerdo con Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22
(1994) 221-229.
Tales métodos dan lugar a un fragmento
N-terminal de EPO que está PEGilado en el grupo
\varepsilon-amino de Lys^{20} y/o en el grupo
amino N-terminal. La PEGilación electiva en el
aminoácido N-terminal puede realizarse de acuerdo
con Felix, A.M., et al. ACS Symp. Ser. 680
(Poly(etilen glicol)) (1997) 218-238. La
PEGilación selectiva en el N-terminal puede
llevarse a cabo durante síntesis en fase sólida por acoplamiento de
un derivado de aminoácido N^{\alpha}-PEGilado al
aminoácido N-1 terminal de la cadena peptídica. La
PEGilación de la cadena lateral puede realizarse durante síntesis
en fase sólida por acoplamiento de derivados de lisina
N^{\varepsilon}-PEGilada a la cadena que está
creciendo. La PEGilación combinada del N-terminal y
de la cadena lateral es factible ya sea como se describe
anteriormente dentro de la síntesis en fase sólida o por síntesis
en fase de solución aplicando reactivos de PEG activados al péptido
amino desprotegido.
Los derivados de PEG adecuados son moléculas de
PEG activadas con un peso molecular promedio preferido de
aproximadamente 5 a aproximadamente 40 kDa, más preferentemente de
aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, y en la forma más
preferidas aproximadamente 30 kDa. Los derivados de PEG pueden ser
PEGs lineales o ramificados. Una gran v variedad de derivados de
PEG adecuados para uso en la preparación de conjugados
PEG-proteína y PEG-péptido se puede
obtener de Shearwater Polymers (Huntsville, AL U.S.A.;
www.swpolymers.com).
Los derivados de PEG activados son conocidos en
la técnica y están descritos en, por ejemplo, Morpurgo, M., et
al., J. Bioconj. Chem. 7 (1996) 363-368, para
PEG-vinilsulfona. Las especies de PEG de cadena
lineal y cadena ramificada son adecuadas para la preparación de los
fragmentos PEGilados. Ejemplos de reactivos de PEG reactivo son
yodo-acetil-metoxi-PEG
y metoxi-PEG-vinilsulfona (m es
preferentemente un entero de aproximadamente 450 a aproximadamente
900 y R es alquilo inferior, lineal o ramificado, que tiene uno a
seis átomos de carbono tal como metilo, etilo, isopropilo, etc.,
prefiriéndose metilo):
El uso de estas sustancias
yodo-activadas es conocido en la técnica y está
descrito por ejemplo por Hermanson, G.T., en Bioconjugate
Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p.
147-148.
En la forma más preferida, las especies de PEG
son activadas por N-hidroxi succinimida éster
usando
(alcoxi-PEG-N-hidroxisuccinimida,
tal como
Metoxi-PEG-N-hidroxisuccinimida
(PM 30000; Shearwater Polymers,
Inc.)),
en donde R y m son como se definieran
anteriormente.
El término "alcoxi" se refiere a un grupo
alquiléter en el cual, el término "alquilo" significa un grupo
alquilo de cadena lineal o cadena ramificada, el cual contiene un
máximo de 4 átomos de carbono, tal como metoxi, etoxi,
n-propoxi y similares, se preferencia, metoxi.
La purificación adicional de los fragmentos
N-terminal PEGilados, incluyendo la separación de
especies mono- o di-PEGiladas, puede hacerse por
métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, cromatografía en
columna.
Además, la presente invención se refiere a una
composición acuosa y una composición farmacéutica que comprende una
muteína de EPO o una composición como se definiera anteriormente y
un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como un tampón y al
uso de una muteína de EPO o una composición como se definiera
anteriormente para la preparación de medicamentos para el
tratamiento o profilaxis de enfermedades asociadas con anemia en
pacientes con insuficiencia renal crónica (CRF), SIDA o para el
tratamiento de pacientes con cáncer sometidos a quimioterapia.
Además, la invención se refiere a un método para el tratamiento
profiláctico y/o terapéutico de trastornos relacionados con anemia
en pacientes con insuficiencia renal crónica (CRF), SIDA y pacientes
con cáncer sometidos a quimioterapia, que comprende la etapa de
administrarle a un paciente una composición como la definida
anteriormente en una cantidad terapéuticamente efectiva.
El término "cantidad terapéuticamente
efectiva" es aquella cantidad de la muteína de eritropoyetina de
acuerdo con la invención necesaria para la actividad biológica
in vivo que hace que las células de la médula ósea aumenten
la producción de reticulocitos y glóbulos rojos. La cantidad exacta
de muteína de eritropoyetina es una cuestión de preferencia sujeta
a factores tales como el tipo exacto de trastorno que está siendo
tratado, el estado del paciente que está siendo tratado, así como
los otros ingredientes de la composición. Las composiciones
farmacéuticas que contienen las muteínas de eritropoyetina pueden
formularse con una potencia efectiva para la administración por
varias vías a un paciente humano que esté experimentando trastornos
sanguíneos caracterizados por una producción de glóbulos rojos baja
o defectuosa. Las cantidades promedio terapéuticamente efectivas
del producto de la glicoproteína eritropoyetina pueden variar y en
particular deben estar basadas en las recomendaciones y
prescripción de un médico calificado.
Además, la invención se refiere a muteínas de
EPO y composiciones como las definidas anteriormente preparadas por
los procesos anteriormente descritos y a muteínas de EPO y
composiciones como las definidas anteriormente para el tratamiento
de enfermedades que están asociadas con anemia en pacientes con
insuficiencia renal crónica (CRF), SIDA y pacientes con cáncer
sometidos a quimioterapia.
Los fragmentos de EPO y las muteínas de EPO de
acuerdo con la invención pueden purificarse de acuerdo con el
estado de la técnica.
En la EP-A 0.267.678 se
describen para la purificación de EPO una cromatografía de
intercambio iónico sobre S-Sepharose, una HPLC
preparativa de fase reversa en una columna C8 y una cromatografía de
filtración sobre geles. En cuanto a esto, la etapa de cromatografía
de filtración sobre geles puede reemplazarse por cromatografía de
intercambio iónico sobre S-Sepharose con flujo
rápido. También se propone que se lleve a cabo una cromatografía
con colorante en una columna con Blue Trisacryl antes de la
cromatografía de intercambio iónico. Nobuo, I., et al., J.
Biochem. 107 (1990) 352-359 también descrie un
procedimiento para la purificación de EPO recombinante. Sin
embargo, en este procedimiento la EPO es tratada con una solución de
Tween® 20, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, etilmaleimida,
pepstatina A, sulfato de cobre y ácido oxámico antes de las etapas
de purificación.
La actividad específica de la EPO o muteínas de
EPO de acuerdo con esta invención puede determinarse por varios
ensayos conocidos en la técnica. La actividad biológica de las
proteínas EPO purificadas de esta invención es tal que la
administración de la proteína EPO mediante inyección a pacientes
humanos hace que las células de la médula ósea incrementen la
producción de reticulocitos y glóbulos rojos en comparación con
grupos de sujetos control o no inyectados. La actividad biológica
de las muteínas de EPO, o fragmentos de las mismas, obtenidas y
purificadas de acuerdo con esta invención puede evaluarse por
métodos de acuerdo con Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP
Bio 1997(2).
Otro ensayo biológico para determinar la
actividad de la EPO, el ensayo con ratón normocitémico, se describe
en el Ejemplo 5.
La muteína de eritropoyetina preparada de
acuerdo con esta invención puede prepararse en composiciones
farmacéuticas adecuadas para inyección con un portador o vehículo
farmacéuticamente aceptable mediante métodos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, en las WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660 y
WO 99/07401 se han descrito composiciones apropiadas. Entre los
portadores farmacéuticamente aceptables preferidos para formular los
productos de la invención están la albúmina sérica humana,
proteínas plasmáticas humanas, etc. Los compuestos de la presente
invención pueden formularse en un tampón de fosfato de potasio/sodio
10 mM a pH 7 que contiene un agente de tonicidad, por ejemplo
cloruro de sodio 132 mM. Opcionalmente, la composición farmacéutica
puede contener un conservante. La composición farmacéutica puede
contener diferentes cantidades de eritropoyetina, por ejemplo
10-1.000 \mug/ml, por ejemplo 50 \mug o 400
\mug.
La administración de los productos de la
glicoproteína eritropoyetina de la presente invención da lugar a la
formación de glóbulos rojos en humanos. Por lo tanto, la
administración de los productos de la glicoproteína eritropoyetina
reabastece esta proteína EPO que es importante en la producción de
glóbulos rojos. Las composiciones farmacéuticas que contienen los
productos de la glicoproteína eritropoyetina pueden formularse con
una potencia efectiva para la administración por arias vías a un
paciente humano que experimente trastornos sanguíneos
caracterizados por una producción de glóbulos rojos baja o
defectuosa, ya sea sola o como parte de una enfermedad o estado.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante
inyección tal como por inyección subcutánea o intravenosa. Las
cantidades promedio del producto de la glicoproteína eritropoyetina
pueden variar y en particular deben basarse en las recomendaciones
y prescripción de un médico calificado. La cantidad exacta de
conjugado es una cuestión de preferencia sujeta a factores tales
como el tipo exacto de trastorno que está siendo tratado, el estado
del paciente que está siendo tratado, así como los otros
ingredientes en la composición. Por ejemplo, se pueden administrar
0,01 a 10 mg por Kg. de peso corporal, preferentemente 0,1 a 1 mg
por Kg. de peso corporal, por ejemplo una vez por semana.
A lo largo de esta solicitud, se han citado
varias publicaciones. Lo divulgado en estas publicaciones se
incorpora a la presente como referencia a fin de describir en forma
más completa el estado de la técnica.
Los siguientes ejemplos, referencias y listado
de secuencias se proporcionan para contribuir a la comprensión de
la presente invención, cuyo alcance verdadero está dado por las
reivindicaciones que se adjuntan. Se comprende que pueden
realizarse varias modificaciones en los procedimientos descritos sin
apartarse del espíritu de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El péptido se sintetizó usando métodos en etapas
en fase sólida, se separó de la resina y desprotegió, se purificó
por cromatografía líquida de alta resolución y se caracterizó por
espectrometría de masa con ionización por vaporización como se
describe en la literatura (ver Schnolzer, M., et al., Int. J.
Pept. Protein Res. 40 (1992) 180; Schnölzer, P.M., et al.,
G.G. Fields, ed., Solid-Phase Peptide Synthesis,
Meth. Enzymol. 289 (1997), todo el volumen), en donde para la
formación del bencil tioéster C-terminal se siguió
la ruta de Lu, W., et al., J. Am Chem. Soc., 118 (1996)
8.518-8.523.
Se activó
mPEG-CH_{2}-COOH
(CH_{3}(O-CH_{2}-CH_{2})_{n}-O-CH_{2}-COOH)
con N-hidroxisuccinimida según lo descrito por Lu,
Y.A., Int. J. Pept. Protein Res. 43 (1994) 127-138.
Las unidades repetitivas de óxido de etileno estaban en el rango de
n \approx 110 para dar un peso molecular de 5.000 (PEG_{5000}),
n \approx 440 (PEG_{20k}) o n \approx 880 (PEG_{40k}).
El péptido N-terminal se preparó
mediante síntesis en etapas en fase sólida de acuerdo con Lu, W.,
et al., J. Am. Chem. Soc. 118 (1996)
8.518-8.523. Se utilizó
BOC-Gly-(tioéster
enlazante)-aminometil-resina para la
unión en etapas de aminoácidos. El péptido obtenido se desprotegió y
separó de la resina.
Se agregó bromuro de bencilo para preparar el
tioéster que luego se purificó por HPLC. Las fracciones conteniendo
tioéster se combinaron y purificación por HPLC.
Se agregó
PEG-CH_{2}-CO-NHS
para N-acilar el péptido en el
\alpha-NH_{2} de la alanina
N-terminal y en el
\varepsilon-NH_{2} de la lisina en la posición
20. Los tioésteres de EPO (1-28) mono y diPEGilada
se separaron y purificaron por HPLC y se liofilizaron.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Este ejemplo describe la determinación de las
condiciones de reacción para el enlace covalente de grupos tilo al
fragmento. Para determinar las condiciones, se agregaron diferentes
cantidades de un reactivo que contiene un grupo tilo bloqueado, en
este caso SATA (succinimidil acetiltioacetato) o SATP (succinimidil
acetiltiopropionato) (disuelto en DMSO hasta 10 mg/ml) a una
solución del fragmento
EPO(1-28)\alphaCOSBzl, en este caso
a 1 ml de fragmento 5 mg/ml en fosfato de potasio 10 mM, NaCl 50
mM, pH 7,3. La mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente
30 minutos (25ºC) y la reacción se detuvo por agregado de una
solución de lisina 1 M en 10 M. Las cantidades en exceso de SATA y
SATP se eliminaron por diálisis contra fosfato de potasio 10 mM,
NaCl 50 mM y EDTA 2 mM, pH 6,2. Después de la eliminación del grupo
acetilo protector con hidroxilamina, el número de grupos tilo
covalentemente unidos al fragmento se determinó fotométricamente con
ditiodipiridina de acuerdo con el método descrito por Grasetti,
D.R. y Murray, J.F., en J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967)
41-49.
Se disolvieron 380 mg de
metoxi-PEG-maleimida (PM 30.000;
Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Alabama, USA)) en una
solución que contenía 95 mg de EPO activada (4,5 mg/ml en fosfato de
potasio 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,2). La relación molar
resultante entre el fragmento activado y
metoxi-PEG-maleimida en la solución
fue 1:4. Mediante la adición a la solución anterior de una solución
acuosa de hidroxilamina 1 M hasta 30 mM, pH 6,2, se desbloquearon
los grupos tiol bloqueados, covalentemente unidos del fragmento
activado. El fragmento activado resultante en la mezcla de reacción
de la solución contenía grupos tiol libres (-SH). Inmediatamente
después del desbloqueo de los grupos tiol se llevó a cabo la
reacción de acoplamiento entre el fragmento activado ahora
conteniendo grupos tilo libres (-SH) y
metoxi-PEG-maleimida durante 90
minutos (agitación, 25ºC). La reacción de acoplamiento se
interrumpió mediante adición a la mezcla de reacción, de una
solución acuosa de cisteína 0,2 M hasta 2 mM. Luego de 30 minutos,
los grupos tiol libres en exceso del fragmento activado que no
reaccionaron con
metoxi-PEG-maleimida se bloquearon
mediante el agregado de una solución de
N-metilmaleimida 0,5 M en DMSO hasta alcanzar una
concentración de 5 mM. Después de 30 minutos la mezcla de reacción
resultante ahora conteniendo el fragmento PEGilado se purificó por
cromatografía de intercambio iónico y se dializó contra fosfato de
potasio 10 mM, pH 7,5 durante \geq 15 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se preparó EPO (29-165) de
acuerdo con el Ejemplo 1 de la WO 99/05268.
Se utiliza un proceso discontinuo realimentado,
es decir cuando se alcanza la densidad de células deseada, se
recolecta aproximadamente 80% del cultivo. El cultivo restante se
reabastece con medio de cultivo recién preparado y se cultiva hasta
la próxima recolección. Un proceso de producción está formado por un
máximo de 10 recolecciones consecutivas: 9 recolecciones parciales
y 1 recolección total al final de la fermentación. La recolección
tiene lugar cada 3-4 días.
El volumen de recolección determinado es
transferido a un recipiente enfriado. Las células se sacan por
centrifugación o filtración y se descartan. El sobrenadante de la
etapa de centrifugación que contiene al fragmento se filtra en
línea y se recoge en un segundo recipiente enfriado. Cada
recolección es procesada en forma separada durante la
purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Cantidades equimolares de
PEG-EPO (1-28) COSBzl preparada de
acuerdo con los Ejemplos 1 y 2, y EPO (29-165) se
solubilizaron a aproximadamente 6 mg/ml en un tampón de fosfato 0,1
M y guanidina-HCl 6 M a pH 7,5. Se agregaron
tiofenol 3% y bencil mercaptano 1% (en vol.), así como también
exceso de DTT para mantener la proteína reducida y ligada durante
aproximadamente 36 horas hasta la finalización. Luego se separaron
los reactivos en exceso por cromatografía de intercambio iónico. El
replegamiento de la proteína (protein refolding) se logró mediante
el ajusta del tampón y pH a aproximadamente una concentración de
proteína de 1 mg/ml con guanidina-HCl 6 M y
dilución a aproximadamente 0,2 mg/ml. El producto de la ligación fue
purificado de acuerdo con el Ejemplo 1 de la WO 01/02017.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se le administraron a ratones,
PEG-EPO, EPO sin modificar y solución tampón. Los
resultados demuestran la actividad superior y la vida media
prolongada de la especie EPO PEGilada con respecto a la EPO sin
modificar indicadas por las cantidades significativamente
incrementadas de reticulocitos y el cambio del máximo en el
recuento de reticulocitos usando la misma dosis por ratón.
El bioensayo con ratón normocitémico es conocido
en la técnica (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio
1997(2)) y un método en la monografía de eritropoyetina de
pH. Eur. BRP. Las muestras están diluidas con
BSA-PBS. A ratones normales, sanos, de
7-15 semanas de vida, se le administran s.c. 0,2 ml
de EPO PEGilada como se describe en el Ejemplo 4. Durante un
período de 4días comenzando 72 horas después de la administración,
se extrae sangre por punción de la vena caudal y se diluye de modo
tal que 1 \mul de sangre esté presente en 1 ml de una solución de
tinción de 0,15 mmol de naranja de acridina. El tiempo de tinción es
de 3 a 10 minutos. El recuento de reticulocitos se lleva a cabo
microfluorométricamente en un citómetro de flujo por análisis del
histograma o fluorescencia roja (por 30.000 células sanguíneas
analizadas). Cada grupo investigado estaba formado por 5 ratones
por día, y a los ratones se les extrajo sangre sólo una vez.
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<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE
AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Eritropoyetina Diglicosilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 20971
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP01122555.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-09-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (15)
1. Una muteína de eritropoyetina la cual tiene
la actividad biológica in vivo de inducir que las células de
la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos
rojos, caracterizada por estar N-glicosilada
en Asn38 y Asn83 pero no estar N-glicosilada en
Asn24, en donde un fragmento N-terminal de
eritropoyetina que consta de los aminoácidos 1-28
de eritropoyetina y que ha conservado los Asn24 y Gly28 y un
fragmento C-terminal de eritropoyetina que consta
de los aminoácidos 29-165 ó 166 de eritropoyetina
que está glicosilada en Asn38 y Asn83 y ha conservado el Cys29, se
unen mediante un enlace químico entre Gly28 y Cys29 y se aisla la
muteína de eritropoyetina.
2. Una muteína de eritropoyetina de acuerdo con
la reivindicación 1, caracterizada por estar unida al grupo
amino N-terminal y/o el grupo
\varepsilon-amino de Lys20 a un(os)
grupo(s) inferior(es) de
alcoxipoli(etilenglicol).
3. Una muteína de eritropoyetina de acuerdo con
la reivindicación 2, en donde el peso molecular medio de cada grupo
poli(etilenglicol) es de aproximadamente 5 kilodaltons a
aproximadamente 40 kilodaltons.
4. Una muteína de eritropoyetina de acuerdo con
la reivindicación 2, en donde el peso molecular medio de cada grupo
poli(etilenglicol) es de aproximadamente 30 kilodaltons.
5. Una muteína de eritropoyetina de acuerdo con
las reivindicaciones 2 a 4, en donde los grupos
poli(etilenglicol) están coronados por un metoxilo.
6. Una muteína de eritropoyetina de acuerdo con
una cualquiera reivindicación precedente, la cual tiene la
secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO:
2.
7. Una composición acuosa que comprende una
muteína de eritropoyetina que tiene la actividad biológica in
vivo de inducir que las células de médula ósea aumenten la
producción de reticulocitos y glóbulos rojos, caracterizada
por estar N-glicosilada en Asn38 y Asn83 pero no
estar N-glicosilada en Asn24, en la cual un
fragmento N-terminal de la eritropoyetina que
consta de los aminoácidos 1-28 de la eritropoyetina
que ha conservado los Asn24 y Gly28, y un fragmento
C-terminal de la eritropoyetina que consta de los
aminoácidos 29-165 ó 166 de la eritropoyetina que
está glicosilada en Asn38 y Asn83 y ha conservado el Cys29, están
unidos por un enlace químico entre Gly28 y Cys29, y la muteína de
eritropoyetina se aisla, y un tampón farmacéuticamente
aceptable.
8. Una composición acuosa de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizada porque dicha muteína de
eritropoyetina está unida al grupo amino N-terminal
y/o el grupo \varepsilon-amino de Lys20 a
un(os) grupo(s) de alcoxipoli(etilenglicol)
inferior(es).
9. Una composición farmacéutica que comprende
una muteína o una composición de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
10. Empleo de una muteína o una composición de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la
preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de
trastornos asociados con la anemia.
11. Empleo de una muteína o una composición de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la
preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de
trastornos asociados con la anemia en pacientes de insuficiencia
renal crónica (CRF), SIDA y pacientes de cáncer sometidos a
quimioterapia.
12. Método para la producción de una muteína de
eritropoyetina caracterizada porque un fragmento de
eritropoyetina N-terminal no glicosilada, que
consta de los amino-ácidos 1-28 de la eritropoyetina
que ha conservado los Asn24 y Gly28, y un fragmento de
eritropoyetina C-terminal que consta de los
aminoácidos 29-165 ó 166 de la eritropoyetina que
está glicosilada en Asn38 y Asn83 y ha conservado el Cys29, están
unidos mediante una unión química entre el Gly28 y el Cys29, y la
muteína de eritropoyetina se aísla.
13. Método de acuerdo con la reivindicación 12,
caracterizado porque dicho fragmento
N-terminal está PEGilado en el terminal N y/o
lisina 20 de la secuencia de eritropoyetina.
14. Método de acuerdo con la reivindicación 12 ó
13, caracterizado porque dicho fragmento
N-terminal está producido por síntesis química.
15. Método de acuerdo con las reivindicaciones
12 a 14, caracterizado porque dicho fragmento
C-terminal está producido por expresión génica
recombinante.
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