ES2289985T3 - Derivados de eritropoyetina. - Google Patents
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Abstract
Un conjugado de eritropoyetina, dicho conjugado comprende una glucoproteína, la eritropoyetina, que presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y análogos de la misma que presenten la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glicosilación o mediante una nueva disposición de al menos un sitio de glicosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida covalentemente a "n" grupos de poli(etilenglicol) de la fórmula -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR con el -CO de cada grupo de poli(etilenglicol) formando un enlace amida con uno de dichos grupos amino; en donde R es alquilo inferior; x es 2 ó 3; m se encuentra entre 450 y 900; n se encuentra entre 1 y 3; y n y m se eligen de modo que el peso molecular del conjugado menos la glucoproteína eritropoyetina se encuentre entre 20 kilodaltons y 100 kilodaltons.
Description
Derivados de eritropoyetina.
La eritropoyesis es la producción de glóbulos
rojos, que se produce con el objetivo de contrarrestar la
destrucción celular. La eritropoyesis es un mecanismo fisiológico
controlado, que proporciona los suficientes glóbulos rojos
necesarios para una oxigenación tisular adecuada. La eritropoyetina
humana producida de forma natural (hEPO), se produce en el riñón y
es el factor plasmático humoral que estimula la producción de
glóbulos rojos (Carnot, P and Deflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci.
143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood
5: 372; Jacobson, LO, Goldwasser, E, Freid, W and Plzak, LF (1957)
Nature 179: 6331-4). La EPO que se produce de forma
natural estimula la división y diferenciación de los progenitores
eritrocíticos específicos en la médula ósea y ejerce su actividad
biológica mediante la unión a receptores en los precursores
eritrocíticos (Krantz, BS (1991) Blood 77: 419).
La eritropoyetina se ha producido
biosintéticamente mediante el uso de la tecnología del DNA
recombinante (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J et al.
(1986) Immunobiol. 72: 213-224) y es el producto del
gen EPO humano clonado, insertado y expresado en células de tejido
de ovario de hámster chino (células CHO). La estructura primaria de
la forma completamente procesada y predominante de hEPO se ilustra
en SEQ ID NO:1. Hay dos puentes disulfuro entre
Cys^{7}-Cys^{161} y
Cys^{29}-Cys^{33}. El peso molecular de la
cadena polipeptídica de EPO sin las porciones de los azúcares es
18.236 Da. En la molécula intacta de EPO, aproximadamente el 40%
del peso molecular viene dado por los grupos de carbohidrato que
glicosilan la proteína en los sitios de glicosilación de la proteína
(Sasaki, H. Bothner, B, Dell, A and Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem.
262: 12059).
Debido a que la eritropoyetina humana es
esencial en la formación de glóbulos rojos, la hormona es útil en
el tratamiento de los trastornos sanguíneos caracterizados por la
baja o defectiva producción de glóbulos rojos. Clínicamente, la EPO
es utilizada en el tratamiento de la anemia en pacientes con fallo
renal crónico (CRF) (Eschbach, JEW, Egri, JC, Downing, MR et
al. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, JEW,
Abdulhadi, MH, Browne, JK et al. (1989) Ann. Intern. Med.
111: 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T. Adamson, JEW (1988)
Kidney Intl. 33: 262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D et al.
(1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) y en
pacientes con SIDA y cáncer que han sido tratados con
quimioterapia (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI In: MB, Garnick,
ed. Erythropoietin in Clinical Applications-An
International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: p.
301-324). Sin embargo, la disponibilidad biológica
de agentes terapéuticos basados en proteínas disponibles
comercialmente tales como EPO, se encuentra limitada por su corta
vida media en el plasma y por su susceptibilidad a la degradación
por parte de proteasas. Estos defectos impiden que se pueda alcanzar
una potencia clínica máxima.
La WO 99/11781 describe polipéptidos que tienen
parte o todo de la conformación estructural primaria y propiedad
biológica de la eritropoyetina y con una vida media in vivo
mejorada y actividad bilógica debido a un perfil de glicosilación
modificado.
Esta invención proporciona un conjugado de
eritropoyetina, dicho conjugado comprende una glucoproteína, la
eritropoyetina, que presenta al menos un grupo amino libre, que
presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue
que las células de la médula ósea incrementen la producción de
reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del grupo de la
eritropoyetina humana y la eritropoyetina humana modificada mediante
la adición de entre 1 y 6 sitios de glicosilación o mediante una
nueva disposición de al menos un sitio de glicosilación; dicha
glucoproteína se encuentra unida covalentemente a "n" grupos de
poli(etilenglicol) de la fórmula
-CO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR,
con el -CO (por ejemplo carbonilo) de cada grupo de
poli(etilenglicol) formando un enlace amida con uno de dichos
grupos amino; en donde R es alquilo C_{1}-C_{6};
x es 2 ó 3; m se encuentra entre alrededor de 450 y alrededor de
900; n se encuentra entre 1 y 3; y n y m se eligen de modo que el
peso molecular del conjugado menos la glucoproteína eritropoyetina
se encuentre entre 20 kilodaltons y 100 kilodaltons. Esta invención
también proporciona composiciones que contienen conjugados
descritos aquí en las cuales el porcentaje de conjugados en la
composición en la que n es 1 es al menos del noventa por ciento.
Si se comparan con las EPO no modificadas (es
decir, EPO sin un PEG unido) y con los conjugados
EPO-PEG convencionales, los presentes conjugados
tienen tanto una vida media de circulación como un tiempo de
residencia en el plasma mayores, un menor aclaramiento, y una mayor
actividad clínica in vivo. Los conjugados de esta invención
presentan los mismos usos que EPO. En concreto, los conjugados de
esta invención son útiles para tratar pacientes mediante la
estimulación de la división y diferenciación de los progenitores
eritrocíticos específicos en la médula ósea por la misma vía por la
que se utiliza EPO para el tratamiento de los pacientes.
Esta invención proporciona conjugados, dichos
conjugados comprenden una glucoproteína, la eritropoyetina, que
presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad
biológica in vivo con la que consigue que las células de la
médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos
rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y
análogos de la misma que presenten la secuencia de la eritropoyetina
humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de
glicosilación o mediante una nueva disposición de al menos un sitio
de glicosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida
covalentemente a "n" grupos de poli(etilenglicol) de la
fórmula
-CO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR,
con el -CO (es decir, carbonilo) de cada grupo de
poli(etilenglicol) formando un enlace amida con uno de dichos
grupos amino; en donde R es alquilo inferior; x es 2 ó 3; m se
encuentra entre alrededor de 450 y alrededor de 900; n se encuentra
entre 1 y 3; y n y m se eligen de modo que el peso molecular del
conjugado menos la glucoproteína eritropoyetina se encuentre entre
20 kilodaltons y 100 kilodaltons.
Se ha descubierto que los conjugados de esta
invención se pueden usar del mismo modo que la EPO no modificada.
Sin embargo, los conjugados de esta invención presentan tanto una
vida media de circulación como tiempo de residencia en el plasma
mayores, una menor aclaramiento y una mayor actividad clínica in
vivo. Debido a la mejora de estas propiedades, los conjugados
de esta invención se pueden administrar una vez a la semana, en
lugar de administrar tres veces a la semana la EPO no modificada. Se
espera que esta menor frecuencia de administración dé como
resultado un mejor cumplimiento del paciente lo cual mejore los
resultados del tratamiento, así como la calidad de vida del
paciente. Si se comparan con los conjugados convencionales de EPO
unidos a poli(etilen glicol), se ha descubierto que los
conjugados que presentan un peso molecular y una estructura de
unión de los conjugados de esta invención tienen una potencia,
estabilidad, ABC y vida media en circulación mejorados y un perfil
de coste
menor.
menor.
Los conjugados de acuerdo con esta invención, se
pueden administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva a
pacientes del mismo modo en que se administra EPO. La cantidad
terapéuticamente efectiva es la cantidad de conjugado necesaria
para dar la actividad biológica in vivo que consigue que las
células de la médula ósea incrementen la producción de
reticulocitos y de glóbulos rojos. La cantidad exacta de conjugado
es una cuestión de preferencia sujeta a factores tales como el tipo
exacto de trastorno a tratar, el estado del paciente a tratar, así
como otros ingredientes en la composición. Por ejemplo, entre 0,01 y
10 \mug por kg de peso corporal, preferiblemente entre 0,1 y 1
\mug por kg de peso corporal, se pueden administrar por ejemplo
una vez a la semana.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el
conjugado se pueden formular con una potencia efectiva para la
administración por varios medios a un paciente humano que
experimente trastornos sanguíneos caracterizados por la baja o
defectiva producción de glóbulos rojos. La media de las cantidades
efectivas terapéuticamente del conjugado pueden variar y en
concreto deben estar basadas en las recomendaciones y prescripción
de un médico cuali-
ficado.
ficado.
Los productos de la glucoproteína eritropoyetina
preparados de acuerdo con esta invención, se pueden preparar en
composiciones farmacéuticas adecuadas para la inyección con un
vehículo o portador farmacéuticamente aceptable mediante métodos
conocidos en el campo. Por ejemplo, se han descrito composiciones
adecuadas en W097/09996, W097/40850, W098/58660, y WO99/07401.
Entre los portadores farmacéuticamente aceptables preferidos para la
formulación de los productos de la invención se encuentran la
albúmina de suero humano, proteínas de plasma humano, etc. Los
compuestos de la presente invención se podrían formular en tampón de
fosfato de sodio/potasio 10 mM a pH 7 que contiene un agente de
tonicidad, por ejemplo cloruro de sodio 132 mM. De forma opcional la
composición farmacéutica puede contener un conservante. La
composición farmacéutica puede contener diferentes cantidades de
eritropoyetina, por ejemplo 10-1000 \mug/ml, por
ejemplo 50 \mug or 400 \mug.
El término "eritropoyetina" o "EPO" se
refiere a una glucoproteína que presenta la secuencia aminoacídica
expuesta en (SEQ ID NO: 1) ó (SEQ ID NO: 2) o una secuencia
aminoacídica substancialmente homóloga a las mismas, cuyas
propiedades biológicas se refieren a la estimulación de la
producción de glóbulos rojos y a la estimulación de la división y
diferenciación de los progenitores eritrocíticos específicos en la
médula ósea. Tal como se emplean aquí, estos términos incluyen
dichas proteínas modificadas de forma deliberada, como por ejemplo,
por mutagénesis dirigida o de forma accidental, por mutaciones.
Estos términos también incluyen análogos que presentan entre 1 y 6
sitios adicionales para la glicosilación, análogos que presentan al
menos un aminoácido adicional en el extremo carboxilo de la
glucoproteína, en donde el aminoácido adicional incluye al menos un
sitio de glicosilación y análogos que presentan una secuencia
aminoacídica que incluye una nueva disposición de al menos un sitio
para la glicosilación. Estos términos incluyen tanto la
eritropoyetina humana producida de forma natural como la producida
de forma recombinante.
Los conjugados de eritropoyetina de esta
invención se pueden representan mediante la Fórmula 1:
(I)P-[NHCO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR]_{n}
en donde x, m, n y R son tal como
se han descrito anteriormente. En la Fórmula I, P es el residuo de
la glucoproteína eritropoyetina descrita aquí (es decir, sin el
grupo o grupos amino que forman un enlace amida con el carbonilo
mostrado en la Fórmula I), con una actividad biológica in
vivo que consigue que las células de la médula ósea incrementen
la producción de reticulocitos y glóbulos
rojos.
En una realización preferida de la presente
invención, R es metilo. Preferiblemente, m se encuentra entre
alrededor de 650 y alrededor de 750 y n preferiblemente es 1.
\newpage
En la realización más preferida de la presente
invención, R es metilo, m se encuentra entre alreddor de 650 y
alrededor de 750, y n es 1, es decir el conjugado es como se ha
definido anteriormente con la fórmula
[CH_{3}O(CH_{2}CH_{2}O)_{m}CH_{2}CH_{2}CH_{2}CO-NH]_{n}-P
en donde m se encuentra entre 650 y
750, n es 1 y P es como se ha definido anteriormente.
Preferiblemente m presenta un valor medio de alrededor de
680.
Preferiblemente, la glucoproteína de los
conjugados como se ha definido anteriormente es una eritropoyetina
humana. La eritropoyetina humana y proteínas análogas como se han
definido anteriormente se pueden expresar mediante una activación
génica endógena. Las glucoproteínas eritropoyetinas humanas
preferidas son aquéllas que presentan la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2,
más preferiblemente las que presentan la SEQ ID NO:1.
Además P se puede seleccionar del grupo que
consiste en residuos de eritropoyetina humana y análogos de la
misma que contienen entre 1 y 6 sitios adicionales para la
glicosilación. Tal como se expone en detalle a continuación, la
preparación y purificación de EPO son bien conocidas en el campo.
Mediante EPO se denota la proteína natural o recombinante,
preferiblemente humana, así como la obtenida de cualquier fuente
convencionales tales como tejidos, síntesis protéica, cultivo
celular con células naturales o recombinantes. Se incluye cualquier
proteína que presente actividad de EPO, tal como muteínas o
proteínas modificadas de otra manera. La EPO recombinante se puede
preparar mediante su expresión en líneas celulares CHO-, BHK- o HeLa
mediante la tecnología del DNA recombiante o mediante activación
génica endógena. La expresión de proteínas, incluyendo EPO, mediante
activación génica endógena es bien conocida en el campo y se
revela, por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.733.761,
5.641.670 y 5.733.746 y en la publicación de patente internacional
Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO
91/06667 y WO 91/09955, cuyos contenidos se incorporan aquí por
referencia. Las especies de EPO preferidas para la preparación de
productos de glucoproteína eritropoyetina son especies de EPO
humanas. La especie EPO más preferida es la EPO humana que presenta
la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO:2,
más preferiblemente la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:1.
En una realización, P puede ser el residuo de un
análogo de glucoproteína que tiene entre 1 y 6 sitios adicionales
para la glicosilación. La glicosilación de una proteína, con uno o
más grupos de oligosacárido, se produce en localizaciones
específicas a lo largo de la cadena polipeptídica y afecta en gran
medida a las propiedades físicas de la proteína tales como
estabilidad, secreción, localización subcelular y actividad
biológica de la proteína. Normalmente la glicosilación es de dos
tipos. Los oligosacáridos que presentan unión O se encuentran
unidos a residuos de serina o de treonina y los que presentan unión
N se encuentran unidos a residuos de asparagina. Un tipo de
oligosacárido hallado tanto en oligosacáridos con unión N como con
unión O es ácido N-acetilneuramínico (ácido
siálico), el cual es una familia de amino azúcares que contienen 9 o
más átomos de carbono. El ácido siálico normalmente es el residuo
terminal tanto de oligosacáridos con unión N como con unión O y
debido a que lleva carga negativa, confiere propiedades acídicas a
la glucoproteína. La eritropoyetina humana, que tiene 165
aminoácidos, contiene tres cadenas de oligosacáridos
N-unidos y una de oligosacárido con unión O, que
comprenden alrededor del 40% del peso molecular total de la
glucoproteína. La glicosilación con unión N se produce en los
residuos de asparagina localizados en las posiciones 24, 38, y 83 y
la glicosilación con unión O se produce en un residuo de serina
localizado en la posición 126. Las cadenas de oligosacáridas se
encuentran modificadas con residuos terminales de ácido siálico. La
separación enzimática de todos los residuos de ácido siálico de la
eritropoyetina glicosilada provoca la pérdida de actividad in
vivo pero no de actividad in vitro porque la sialilación
de la eritropoyetina evita su unión, y la posterior aclaramiento,
por la proteína de unión hepática.
Las glucoproteínas de la presente invención
incluyen análogos de la eritropoyetina humana con uno o más cambios
en la secuencia aminoacídica de la eritropoyetina humana, que
resultan en un incremento en el número de sitios de unión del ácido
siálico. Estos análogos de glucoproteína se pueden generar por
mutagénesis dirigida con adiciones, deleciones o sbstituciones de
residuos aminoacídicos que incrementan o alteran sitios que están
disponibles para la glicosilación. Los análogos de glucoproteína con
mayores niveles de ácido siálico que los hallados en la
eritropoyetina humana, se generan mediante la adición de sitios de
glicosilación que no perturban la conformación secundaria o
terciaria necesaria para la actividad biológica. Las glucoproteínas
de la presente invención también incluyen análogos con mayores
niveles de unión a carbohidrato en un sitio de glicosilación que
normalmente involucra la substitución de uno o más aminoácidos
cercanos a un sitio con unión N o con unión O. Las glucoproteínas
de la presente invención también incluyen análogos que tienen uno o
más aminoácidos que se prolongan a partir del extremo carboxilo de
la eritropoyetina y que proporcionan al menos un sitio de unión a
carbohidrato adicional. Las glucoproteínas de la presente invención
también incluyen análogos que tienen una secuencia aminoacídica que
incluye una nueva disposición de al menos un sitio para la
glicosilación. Dicha nueva disposición del sitio de glicosilación
involucra la deleción de uno o más sitios de glicosilación en la
eritropoyetina humana y la adición de uno o más sitios de
glicosilación que no se dan de forma natural. El aumento del número
de cadenas de carbohidrato en la eritropoyetina y por lo tanto, el
número de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, puede
conferir propiedades beneficiosas tales como una mayor solubilidad,
una mayor resistencia a la proteólisis, una menor inmunogenicidad,
una mayor vida media en suero y una mayor actividad biológica. Los
análogos de eritropoyetina con sitios de glicosilación adicionales
se revelan con más detalle en la Aplicación de Patente Europea 640
619, de Elliot publicada el 1 de Marzo de 1995.
\newpage
En una realización preferida, las glucoproteínas
de la presente invención comprenden una secuencia aminoacídica que
incluye al menos un sitio adicional para la glicosilación tales
como, pero no limitadas a, eritropoyetinas que comprenden la
secuencia de la eritropoyetina humana modificada por una
modificación seleccionada de las siguientes:
Asn^{30}Thr^{32};
Asn^{51}Thr^{53},
Asn^{57}Thr^{59};
Asn^{69};
Asn^{69}Thr^{7l};
Ser^{68}Asn^{69}Thr^{7l};
Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Gly^{89}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Thr^{92};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Ala^{162};
Asn^{69}Thr^{71}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Asn^{89}Ile^{90}Thr^{91};
Ser^{87}Asn^{89}Ile^{90}Thr^{9l};
Asn^{136}Thr^{138};
Asn^{138}Thr^{140};
Thr^{125}; y
Pro^{124}Thr^{125}.
La notación que se ha utilizado para la
modificación de la secuencia aminoacídica indica que la posición de
la correspondiente proteína no modificada (por ejemplo hEPO de SEQ
ID NO:1 ó SEQ ID NO:2) indicada por el número en superíndice se
sustituye por el aminoácido que precede inmediatamente al número en
superíndice.
La glucoproteína también puede ser un análogo
con al menos un aminoácido adicional en el extremo carboxilo de la
glucoproteína, en donde el aminoácido adicional incluye al menos un
sitio de glicosilación, es decir, el conjugado tal como se ha
definido anteriormente también se refiere a un compuesto en donde la
glucoproteína tiene una secuencia que comprende la secuencia de
eritropoyetina humana y una segunda secuencia en el extremo
carboxilo de la secuencia de la eritopoyetina humana, en donde la
segunda secuencia contiene al menos un sitio de glicosilación. El
aminoácido adicional puede comprender un fragmento peptídico
derivado del extremo carboxilo de la gonadotropina coriónica.
Preferiblemente, la glucoproteína es un análogo seleccionado del
grupo que consiste en (a) eritropoyetina humana que tiene la
secuencia aminoacídica Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro IIe Leu Pro Gln
(SEQ ID NO:3), prolongándose desde el extremo carboxilo; (b) el
análogo en (a) también comprende EPO Ser^{87} Asn^{88}
Thr^{90}; y (c) el análogo en (a) también comprende EPO Asn^{30}
Thr^{32} Val^{87} Asn^{88} Thr^{90}.
La glucoproteína también puede ser un análogo
con una secuencia aminoacídica que incluya una nueva disposición de
al menos un sitio para la glicosilación. La nueva disposición puede
comprender una deleción de cualquiera de los sitios de unión N a
carbohidrato en la eritropoyetina humana y una adición de un sitio
de unión N de carbohidrato en la posición 88 de la secuencia
aminoacídica de la eritropoyetina humana. Preferiblemente, la
glucoproteína es una análogo seleccionado del grupo que consiste en
EPO Gln^{24} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}; EPO Gln^{38}
Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}; y EPO Gln^{83} Ser^{87}
Asn^{88} Thr^{90}.
Tal como se ha empleado aquí, el término
"alquilo inferior" significa un grupo alquilo lineal o
ramificado que presenta entre uno y séis átomos de carbono.
Ejemplos de grupos alquilo inferior incluyen metilo, etilo e
isopropilo. De acuerdo con esta invención, R es cualquier alquilo
inferior. Se prefieren los conjugados en los que R es metilo.
El símbolo "m" representa el número de
residuos de óxido de etileno (OCH_{2}CH_{2}) en el grupo de
poli(etileno óxido). Una única subunidad de PEG de óxido de
etileno tiene un peso molecular de alrededor de 44 daltons. Así, el
peso molecular del conjugado (excluyendo el peso molecular de la
EPO) depende del número "m". En los conjugados de esta
invención, "m" se encuentra entre alrededor de 450 y alrededor
de 900 (correspondiendo al peso molecular de entre 20 kDa y
alrededor de 40 kDa), preferiblemente entre alrededor de 650 y
alrededor de 750 (correspondiendo al peso molecular de alrededor de
30 kDa). El número m se selecciona de forma que el conjugado
resultante de esta invención tenga una actividad fisiológica
comparable a la EPO no modificada, cuya actividad puede representar
igual o más que una fracción de la correspondiente actividad de la
EPO no modificada. Un peso molecular de "alrededor" de un
cierto número, significa que está dentro de un rango razonable de
dicho número determinado mediante técnicas analíticas
convencionales. El número "m" se selecciona de forma que el
peso molecular de cada grupo poli(etilenglicol) unido de
forma covalente a la glucoproteína eritropoyetina se encuentre
entre alrededor de 20 kDa a alrededor de 40 kDa, y se encuentre
preferiblemente entre alrededor de 30 kDa.
En los conjugados de esta invención, el número
"n" es el número de grupos de polietilenglicol unidos
covalentemente a grupos amino libres (incluyendo grupos
\varepsilon-amino de un aminoácido de lisina y/o
el grupo amino del extremo amino) de la proteína eritropoyetina
mediante uniones amida. Un conjugado de esta invención puede tener
uno, dos o tres grupos PEG por molécula de EPO. "n" es un
entero que se encuentra entre 1 y 3, preferiblemente "n" es 1 ó
2, y más preferiblemente "n" es 1.
El compuesto de la Fórmula I se puede preparar a
partir de material polimérico conocido:
en el cual R y m son como se han
descrito anteriormente, por condensación del compuesto de Fórmula II
con la glucoproteína eritropoyetina. Los compuestos de Fórmula II
en los cuales x es 3 son alfa-alcoxilo inferior,
ácido butírico succinimidíl ésteres de poli(etilenglicol)
(alcoxilo inferior-PEG-SBA). Los
compuestos de Fórmula II en los cuales x es 2 son
alfa-alcoxilo inferior, ácido propiónico ésteres
succinimidíl de poli(etilenglicol) (alcoxilo
inferior-PEG-SPA). Se puede utilizar
cualquier método convencional para hacer reaccionar un éster
activado con una amina para formar una amida. En la reacción
descrita anteriormente, el éster succinimidílico ejemplificado es
un grupo saliente causante de la formación de la amida. El uso de
los ésteres succinimidílicos tales como los compuestos de la
fórmula II para producir conjugados con proteínas se revelan en la
Patente Estadounidense No. 5.672.662, publicada el 30 de Septiembre
de 1997 (Harris, et
al.).
La EPO humana contiene nueve grupos amino
libres, el grupo amino del extremo amino más los grupos
\varepsilon-amino de 8 residuos de lisina. Cuando
el reactivo de pegilación se combinó con un compuesto SBA de Fórmula
II, se halló que a pH 7,5, una relación proteína: PEG de 1:3 y una
temperatura de reacción de alrededor de 20-25ºC, se
obtuvo una mezcla de especies mono-, di-tripegiladas
y pequeñas cantidades de especies tri-pegiladas.
Cuando el reactivo de pegilación era un compuesto SPA de la Fórmula
II, en condiciones similares excepto que la relación de
proteína:PEG era de 1:2, se produjeron principalmente las especies
mono-pegiladas. La EPO pegilada se puede
administrar en forma de mezcla, o como diferentes especies pegiladas
separadas a través de cromatografía de intercambio catiónico.
Mediante la manipulación de las condiciones de reacción (por ejemplo
la relación de reactivos, pH, temperatura, concentración de la
proteína, tiempo de reacción, etc.) se pueden variar las cantidades
relativas de las diferentes especies pegiladas.
La eritropoyetina humana (EPO) es una
glucoproteína que estimula la formación de eritrocitos. Su
preparación y aplicación terapéutica están descritas en detalle por
ejemplo en la Patente Estadounidense Nos. 5.547.933 y 5.621.080,
EP-B 0 148 605, Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1984) 2708-2712, EP-B 0 205
564, EP-B 0 209 539 y EPB 0 411 678 así como por
Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986)
3116-3121, y Sasaki, H. et al., J. Biol.
Chem. 262 (1987) 12059-12076. La eritropoyetina para
usos terapéuticos se puede producir de forma recombinante
(EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 y
Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al. (1986)
Immunobiol. 72: 213-224).
Los métodos para la expresión y preparación de
la eritropoyetina en medio sin suero están descritas por ejemplo en
WO 96/35718, to Burg publicado el 14 de Noviembre de 1996, y en
European Patent Publication No. 513 738, to Koch publicado el 12 de
Junio de 1992. En adición a las publicaciones mencionadas
anteriormente, se sabe que se puede llevar a cabo una fermentación
libre de suero de células CHO recombinantes que contengan un gen
EPO. Tales métodos están descritos por ejemplo en
EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 y de
forma general por Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem.
130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656,
Kowar, J. y Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986)
277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981)
45-51, EP-A 0 481 791,
EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO
88/00967.
En EP-A 0 267 678 se describe
una cromatografía de intercambio iónico en
S-Sefarosa, un HPLC en fase reversa preparativo en
una columna C_{8} y una cromatografía de filtración en gel para la
purificación de EPO producida en cultivo libre de suero tras
realizar una diálisis. En esta relación, el paso de cromatografía de
filtración en gel se puede sustituir por cromatografía de
intercambio iónico en S-Sefarosa fast flow. También
se propone realizar una cromatografía con pigmento en una columna
de Azul de Trisacrilo previamente a la cromatografía de intercambio
iónico.
Se describe un proceso para la purificación de
la EPO recombinante en Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107
(1990) 352-359. En este proceso, la EPO se trata
con una solución de Tween® 20, fluoruro de fenilmetilsulfonilo,
etilmaleimida, pestatina A, sulfato de cobre y ácido oxámico de
forma previa a los pasos de purificación. Las publicaciones,
incluyendo WO 96/35718, a Burg publicado el 14 de Noviembre de 1996,
revela un proceso para la preparación de eritropoyetina en un
proceso de fermentación libre de suero (EPOsf).
La actividad específica de EPO o conjugados de
EPO de acuerdo con esta invención, se puede determinar mediante
varios ensayos conocidos en el campo. La actividad biológica de las
proteínas EPO purificadas de esta invención es tal que la
administración de la proteína EPO por inyección a pacientes humanos
consigue que las células de la médula ósea incrementen la
producción de reticulocitos y glóbulos rojos comparado con los
sujetos no inyectados o grupos control. La actividad biológica de
las proteínas EPO, o fragmentos de las mismas, obtenidos y
purificados de acuerdo con esta invención se pueden determinar por
métodos de acuerdo con Annable, et al., Bull. Wld. Hlth.
Org. (1972) 47: 99-112 y Pharm. Europa Spec. Issue
Erythropoietin BRP Bio 1997(2). Otro ensayo biológico para
determinar la actividad de la proteína EPO, el ensayo normocitémico
de ratón, se describe en el Ejemplo 4.
Esta invención proporciona una composición
formada por conjugados tal como se ha descrito anteriormente. Se
puede preparar una composición que contiene al menos el noventa por
ciento de conjugados mono-PEG, es decir en la cual
n es 1, tal como se muestra en el Ejemplo 5. Normalmente se
prefieren los conjugados mono-PEG de glucoproteínas
eritropoyetinas porque tienden a tener una mayor actividad que los
conjugados di-PEG. El porcentaje de conjugados
mono-PEG así como la relación de especies mono y
di-PEG se pueden controlar mediante la combinación
de las fracciones anchas del pico de elución para disminuir el
porcentaje de mono-PEG, o de las fracciones
estrechas para incrementar el porcentaje de mono-PEG
en la composición. Alrededor del noventa por ciento de conjugados
mono-PEG es un buen balance de rendimiento y
actividad. Se pueden preferir algunas composiciones en las cuales,
por ejemplo, al menos un noventa y dos por ciento o al menos noventa
y seis por ciento de los conjugados sean especies
mono-PEG (n igual a 1). En una realización de esta
invención, el porcentaje de conjugados en donde n es 1 se encuentra
entre el noventa por ciento y el noventa y séis por ciento.
La invención también se refiere a las
correspondientes composiciones farmacéuticas que comprenden un
conjugado o una composición tal como se ha descrito anteriormente y
un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los conjugados y composiciones de la presente
invención son especialmente útiles para la preparación de
medicamentos para el tratamiento o profilaxis de enfermedades
relacionadas con la anemia en pacientes con fallo renal crónico
(CRF), y para el tratamiento de pacientes con SIDA y cáncer que han
sido sometidos a quimioterapia.
Una realización adicional de la presente
invención se refiere a un método para el tratamieto profiláctico
y/o terapéutico de trastornos relacionados con la anemia en
pacientes con fallo renal crónico (CRF), y pacientes con SIDA y
cáncer que han sido sometidos a quimioterapia, comprende el paso de
la administración a un paciente de una composición tal como se ha
descrito anteriormente.
Además, la invención se refiere a un proceso
para la preparación de compuestos como se ha descrito anteriormente,
cuyo proceso comprende la condensación del compuesto de Fórmula
II
con la glucoproteína eritropoyetina
y en la cual R, m y x son como se han definido
anteriormente.
La invención se refiere también a compuestos
como se han definido anteriormente para el tratamiento de
enfermedades las cuales están asociadas con anemia en pacientes con
fallo renal crónico (CRF), y pacientes con SIDA y cáncer que han
sido sometidos a quimioterapia.
La invención se entenderá mejor con los
siguientes ejemplos que ilustran, pero no por ello limitan la
invención descrita hasta aquí.
Se toma un vial del Working Cell Bank, originada
a partir de una línea celular CHO que produce EPO (se puede usar
ATCC CRL8695, revelada en EP 411 678 (Genetics Institute)) a partir
de la fase gas del depósito de almacenamiento de nitrógeno líquido.
Las células se transfirieron en tubos de centrífuga de vidrio y se
cultivaron en un medio tamponado de hidrógeno carbonato en un
incubador humidificado de CO_{2}. Los medios sin suero típicos
usados para la preparación del inóculo y la fermentación se revelan
en la Aplicación de Patente Europea 513 738, de Koch publicado el
12 Junio de 1992, o WO 96/35718, de Burg publicado el 14 de
Noviembre de 1996, por ejemplo contienen como medio DMEM/F12 (por
ejemplo JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, No. 57736)
y de modo adicional hidrógenocarbonato sódico, L+glutaminna,
D+glucosa, insulina recombinante, selenita sódica, diaminobutano,
hidrocortisona, sulfato de hierro (II), asparagina, ácido aspártico,
serina y un estabilizante para células de mamífero tales como por
ejemplo alcohol de polivinilo, metil celulosa, polidextrano,
polietilenglicol, Pluronic F68, expansor de plasma poligelina
(HEMACCEL®) o polivinil pirrolidona (WO 96/35718).
Los cultivos se comprobaron microscópicamente
para detectar la ausencia de microorganismos contaminantes y se
determinaron las densidades celulares. Estos ensayos se realizaron
en cada paso de fraccionamiento.
Tras el período de crecimiento inicial, el
cultivo celular se diluyó con medio fresco hasta conseguir la
densidad celular inicial y comenzar otro ciclo celular. Este
procedimiento se repitió hasta que se obtuvo un volumen de cultivo
de aproximadamente 2 litros por tubo de centrífuga de vidrio. Tras
aproximadamente 12 duplicaciones, se usó de 1 a 5 litros de este
cultivo como inóculo para la fermentación de 10 litros.
Tras entre 3 y 5 días, el cultivo del
fermentador de 10 litros se puede usar como inóculo para el
fermentador de inóculo de 100 litros.
Tras otros 3-5 días de cultivo,
el cultivo en los 100 litros de fermentación se puede usar como
inóculo para el fermentador de inóculo de 1000 litros.
Se usó un proceso de realimentación en lote, es
decir cuando se alcanza la densidad celular deseada, aproximadamente
el 80% del cultivo se recoge. El cultivo remanente es rellenado con
medio de cultivo fresco y se hace crecer hasta la siguiente
recogida. Una ronda de producción consiste en un máximo de 10 ciclos
de recogida: 9 ciclos de recogidas parciales y 1 ciclo de recogida
completa al final de la fermentación. El ciclo de recogida se da al
cabo de entre 3 y 4 días.
El volumen de cultivo recogido es transferido a
un recipiente enfriado. Las células son separadas por centrifugación
o filtración y eliminadas. La EPO que contiene el sobrenadante del
paso de la centrifugación se filtró en línea y se recogió en un
segundo recipiente enfriado. Cada cultivo recogido se procesa de
modo separado durante la purificación.
Un proceso típico para la purificación de la
proteína EPO se revela en WO 96/35718, de Burg publicado el 14 de
Noviembre de 1996. El proceso de purificación se explica a
continuación.
La Sefarosa azul (Pharmacia) consiste en bolitas
de Sefarosa, en la superficie de las cuales el colorante Cibacron
azul se encuentra unido covalentemente. Como la EPO se une con más
fuerza a la Sefarosa Azul que muchos de los contaminantes no
protéicos, algunas impurezas protéicas y pVA, la EPO se puede
enriquecer en este paso. La elución de la columna de Sefarosa Azul
se lleva a cabo incrementando la concentración de sales, así como el
pH.
La columna se empaqueta con entre
80-100 litros de Sefarosa Azul, se regenera con NaOH
y se equilibra con tampón de equilibración (cloruro de sodio/calcio
y acetato sódico). Se carga el sobrenadante de la fermentación
acidificado y filtrado. Tras finalizar la carga, la columna se lava
primero con un tampón similar al tampón de equilibrado, que
contiene una mayor concentración de cloruro de sodio y
posteriormente con un tampón Tris-base. El producto
se eluye con un tampón Tris-base y se recoge en una
fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón.
El Butil Toyopearl 650 C (Toso Haas) es una
matriz basada en poliestireno a la cual están acoplados residuos
alifáticos de butilo. Como la EPO se une con más fuerza a este gel
que muchas de las impurezas y PVA, se eluye con un tampón que
contiene isopropanol.
La columna se empaqueta con entre
30-40 litros de Butil toyopearl 650 C, se regenera
con NaOH, se lava con un tampón Tris-base y se
equilibra con un tampón Tris-base que contiene
isopropanol.
El eluído de Sefarosa Azul se ajusta a la
concentración de isopropanol en el tampón de quilibración de la
columna y se carga en la columna. Entonces la columna se lava con el
tampón de equilibración siguiendo una concentración creciente de
isopropanol. El producto se eluye con el tampón de elución (tampón
Tris-base con un mayor contenido de isopropanol) y
se recoge en una fracción única de acuerdo con el perfil de elución
patrón.
El Ultrogel Hidroxiapatita (Biosepra) consiste
en Hidroxiapatita que se incorpora en una matriz de agarosa para
mejorar las propiedades mecánicas. La EPO tiene una menor afinidad
por la Hidroxiapatita y se puede eluir por tanto a concentraciones
menores de fosfato que las impurezas protéicas.
La columna se rellena con entre
30-40 litros de Ultrogel Hidroxiapatita y se
regenera con un tampón de fosfato potásico/cloruro cálcico y NaOH
seguido por un tampón Tris-base. Entonces se
equilibra con un tampón Tris-base que contiene una
cantidad menor de isopropanol y cloruro sódico.
La EPO contenida en el eluído de la
cromatografía Butil Toyopearl se introduce en la columna.
Posteriormente la columna se lava con tampón de equilibrado y un
tampón Tris-base sin isopropanol y cloruro sódico.
El producto se eluye con un tampón Tris-base que
contiene una menor concentración de fosfato potásico y se recoge en
una fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón.
El material RP-HPLC Vydac C4
(Vydac) consiste en partículas de gel de sílice, las superficies de
las cuales llevan cadenas C4-alquilo. La separación
de EPO de las impurezas protéicas se basa en las diferencias en
cuanto a la fuerza de las interacciones hidrofóbicas. La elución se
lleva a cabo con un gradiente de acetonitrilo en ácido
trifluoroacético diluído.
El HPLC preparativo se realiza mediante una
columna de acero inoxidable (rellenada con entre 2,8 y 3,2 litros
de gel de sílice Vydac C4). El eluído Hidroxiapatita Ultrogel se
acidificó mediante la adición de ácido trifluoroacético y se
introdujo en la columna Vydac C4. Para el lavado y la elución se
utilizó un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético. Las
fracciones se recogieron e inmediatamente se neutralizaron con
tampón fosfato. Las fracciones EPO que se encontraron dentro de los
límites IPC se combinaron.
El material de Sefarosa DEAE (Pharmacia)
consiste en grupos dietilaminoetil (DEAE) que se encuentran
covalentemente unidos a la superficie de bolas de Sefarosa. La
unión de EPO a los grupos DEAE está mediada por interacciones
iónicas. El acetonitrilo y el ácido trifluoroacético pasan a través
de la columna sin ser retenidos. Después de que estas substancias
han sido lavadas, se eliminan las trazas de impurezas mediante el
lavado de la columna con tampón acetato a bajo pH. Entonces la
columna se lavó con tampón fosfato neutro y la EPO se eluyó con un
tampón con fuerza iónica creciente.
La columna se empaquetó con Sefarosa DEAE fast
flow. El volumen de la columna se ajustó para asegurar una carga de
EPO en el rango de 3-10 mg EP/ml gel. La columna se
lavó con agua y tampón de equilibrado (fosfato sódico/potásico).
Las fracciones combinadas del eluído de HPLC se cargaron y la
columna se lavó con tampón de equilibración. Entonces la columna se
lavó con tampón de lavado (tampón de acetato sódico) y
posteriormente con tampón de equilibrado. Posteriormente, la EPO se
eluyó de la columna con tampón de elución (cloruro sódico, fosfato
sódico/potásico) y se recogió en un fracción única de acuerdo con el
perfil de elución patrón.
El eluído de la columna Sefarosa DEAE se ajustó
a la conductividad especificada. La substancia resultante se filtró
para quedar estéril en botellas de Teflon y se conservó a -70ºC.
La EPO purificada de acuerdo con el
procedimiento sin suero del Ejemplo 1 (EPOsf) fue homogéneo tal como
se determinó mediante métodos analíticos y mostró el patrón típico
isoforma consistente en 8 isoformas. Tuvo una actividad biológica
específica de 190.000 IU/mg, tal como se determinó mediante el
ensayo normocitémico de ratón. El reactivo de pegilación usado fue
metoxi-PEG-SBA, el cual es un
compuesto de Fórmula II en el cual R es metilo; x es 3; y m se
encuentra entre 650 y 750 (valor medio entre alrededor de 680,
correspondiente a una peso molecular medio de alrededor de 30
kDa).
A cien miligramos de EPOsf (9,71 ml de una
solución madre de EPOsf de 10,3 mg/ml, 5,48 \mumol) se añadieron
10 ml de un tampón de fosfato de potasio, pH, 7,5, conteniendo 506
mg de metoxi-PEG-SBA (16,5 \mumol)
(obtenido a partir de Shearwater Polymers, Inc., Huntsville,
Alabama) y se mezcló durante 2 horas a temperatura ambiente
(20-23ºC). La concentración de proteína final fue de
5 mg/ml y la relación proteína: reactivo PEG fue de 1:3. Tras dos
horas, la reacción se paró mediante el ajuste del pH a 4,5 con ácido
acético glacial y se conservó a -20ºC, hasta el momento de la
purificación.
1. Mecla del conjugado: Aproximadamente
28 ml de SP-SEPHAROSE FF (resina de intercambio
catiónico de sulfo-propilo) se empaquetaron en una
columna de vidrio AMICON (2,2 x 7,5 cm) y se equilibró con tampón de
acetato 20 mM, pH 4,5 a un flujo de 150 ml/h. Seis mililitros de la
mezcla de reacción que contenían 30 mg de proteína se diluyeron 5
veces con el tampón de equilibración y se aplicaron a la columna.
Los materiales no adsorbidos se lavaron con el tampón y la mezcla
del conjugado con PEG adsorbida se eluyó de la columna con NaCl
0,175 M en el tampón de equilibrado. La EPOsf no modificada aún
remanente en la columna se eluyó con NaCl 750 mM. La columna se
volvió a equilibrar en el tampón de inicio. Las muestras se
analizaron mediante SDS-PAGE y se determinó su
nivel de pegilación. Se halló que el eluído de NaCl 0,175 M contenía
especies mono- así como di-pegiladas y pequeñas
cantidades de especies tri-pegiladas, mientras que
el eluído de NaCl 750 mM contenía la EPOsf sin modificar.
2. Di-PEG y
Mono-PEG-EPOsf: La mezcla del
conjugado purificada eluída de la columna en el paso anterior se
diluyó 4 veces con el tampón, se volvió a aplicar en la columna y se
lavó como se ha descrito anteriormente. La
Di-PEG-EPOsf y
mono-PEG-EPOsf se eluyeron de modo
separado de la columna con NaCl 0,1 M y NaCl 0,175 M
respectivamente. La elución también se realizó con NaCl 750 mM con
la finalidad de eluir cualquier EPOsf remanente no modificado.
Por otro lado, la mezcla de reacción se diluyó 5
veces con el tampón de acetato y se aplicó en la columna de
SP-Sefarosa (\sim0.5 mg proteína/ml gel). La
columna se lavó y las
mono-PEG-EPOsf,
di-PEG-EPOsf adsorbidas y EPOsf no
modificada se eluyeron como se ha descrito en la sección
anterior.
Se sintetizó PEG-EPOsf mediante
la conjugación química de una molécula de PEG lineal con un valor de
peso molecular medio de 30 KDa. La EPO-EPOsf se
derivó de la reacción entre los grupos amino primarios de EPOsf y
el éster de succinimidilo derivado de un ácido
PEG-butírico de 30 kDa, resultando en un enlace
amida.
Los resultados se resumen en la Tabla 2. La
mezcla de conjugado purificada estaba formada por mono y
di-PEG-EPOsf y estaba libre de
EPOsf no modificada como se determinó mediante análisis por
SDS-PAGE. La mezcla del conjugado resultó en 23,4
mg o 78% del material de partida. La separación cromatográfica por
intercambio catiónico de mono y
di-PEG-EPsf indicó que la relación
mono a di-PEG en la mezcla de conjugado fue de casi
1:1. Tras la finalización de la reacción, la relación de los
componentes individuales de Mono:Di: No modificada fueron de
40:38:20 (%). El rendimiento global fue casi cuantitativo.
Una alícuota diferente de EPOsf utilizada en el
Ejemplo 2 se hizo reaccionar con
metoxi-PEG-SPA de 30 kDa
(Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama). La reacción se
llevó a cabo a una relación de proteína: reactivo de 1: 2 y las
técnicas de purificación utilizadas están de acuerdo con el Ejemplo
2. Se produjeron principalmente las especies
mono-pegiladas.
\vskip1.000000\baselineskip
El bioensayo normocitémico de ratón es conocido
en el campo (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio
1997(2)) y se describe un método en la monografía de
eritropoyetina de Ph. Eur. BRP. Las muestras se diluyeron con
BSA-PBS. A ratones sanos normales, de
7-15 semanas de edad, se les administraron s.c. 0,2
ml de la fracción de EPO que contenía EPO no pegilada o EPO tri-,
di- o mono-pegilada del ejemplo 2 ó 3. Durante un
período de 6 días, se les extrajo sangre por punción de la vena de
la cola y se diluyó de forma que 1 \mul de sangre se encontraba
presente en 1 ml de una solución de tinción naranja de acridina 0,15
\mumol. El tiempo de tinción fue de entre 3 y 10 minutos. Los
contajes de reticulocito se llevaron a cabo de forma
microfluorométrica en un citómetro de flujo mediante análisis del
histograma de fluorescencia rojo. Los contajes de reticulocito se
dieron en términos de figuras absolutas (por 30.000 células
sanguíneas analizadas). Para los datos presentados, cada grupo
consistió en 5 ratones por día, y los ratones fueron sangrados sólo
una vez.
En experimentos separados, se administraron a
ratones una única dosis de EPO no modificada (25 ng de EPO), la
mezcla de PEG(SBA)-EPO del ejemplo 2 (10 ng
de conjugado), EPOs mono- y di-pegiladas del Ejemplo
2 (10 ng del conjugado), el PEG(SPA)-EPO del
Ejemplo 3 (10 ng del conjugado) y solución tampón. Los resultados se
muestran en la Tabla 2. Los resultados muestran una mayor actividad
y una vida media prolongada de las especies de EPO pegiladas, lo
cual viene indicado por las cantidades significativamente
incrementadas de reticulocitos y el cambio del máximo número de
reticulocitos usando la misma dosis por ratón (10 ng), comparado con
una dosis de 25 ng para EPO no modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se inició con 100 mg (5,48 \mumol) de EPOsf en
tampón de fosfato de potasio pH 7,5, preparado de acuerdo con el
Ejemplo 1, se anadió 329 mg (10,96 \mumol) de reactivo de
PEG-SBA 30 kDa disueltos en 30 ml de HCl 1 mM. Se
añadió el suficiente tampón de fosfato de potasio 100 mM para llevar
el volumen de la mezcla de reacción a 20 ml. La concentración de
proteína final fue de 5 mg/ml y la relación de proteína: reactivo de
PEG fue de 1:2. La mezcla de reacción se mezcló durante 2 h a
temperatura ambiente (20-2ºC). Tras 2 h, la reacción
se paró mediante el ajuste del pH a 4,5 con ácido acético glacial y
se conservó congelada a -20ºC hasta su purificación.
La mezcla de reacción del paso anterior se
diluyó 1:5 con acetato de sodio 10 mM, pH 4,5 y se aplicó a 300 ml
de SP-Sefarosa FF (resina de intercambio catiónico
de sulfopropilo) empaquetada en una columna de 4,2 x 19 cm. La
columna se equilibró previamente con el mismo tampón. Se hizo un
seguimiento de los efluyentes de la columna a 280 nm con un monitor
UV Gilson y se grabó con un grabador Kipp y Zonen. La columna se
lavó con 300 ml o un volumen de residencia de tampón de equilibrado
para eliminar los reactivos en exceso, los productos colaterales de
reacción y PEG-EPO oligoméricos. Esto fue seguido
por un lavado con 2 volúmenes de residencia de NaCl 100 mM para
eliminar di-PEG-EPO. El
Mono-PEG-EPO fue entonces eluído con
NaCl 200 mM. Durante la elución de
mono-PEG-EPO, los primeros 50 ml del
pico de proteína fueron eliminados y el
mono-PEG-EPO fue recogido como una
fracción de 150 ml. Las EPOsf no modificadas que permanecieron en la
columna fueron eluídas con NaCl 750 mM. Todos los tampones de
elución se elaboraron con tampón de equilibrado. Todas las muestras
eluídas se analizaron mediante SDS-PAGE y mediante
Cromatografía de Exclusión por tamaño de alta resolución (SEC). El
conjunto de mono-PEG-EPO obtenido de
la fracción de 150 ml, que no presentaba EPOsf no modificado
detectable, fue entonces concentrado a entre
\sim4.5-7,5 mg/ml y diafiltrado en tampón de
conservación, fosfato de potasio 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,6. La
concentración/ Diafiltración se llevó a cabo con el Millipore
Labscale^{TM} TFF System con una membrana de tamaño de poro de 50
kDa off Millipore Pellicon XL Biomax 50 a temperatura ambiente. El
mono-PEG-EPO concentrado se filtró
para quedar estéril y se conservó a -20ºC.
Aproximadamente el 75% de las EPOsf se
pegilaron. Tras la purificación, el rendimiento total fue de
\sim30% de mono-PEG-EPO con EPOsf
no modificada no detectable y alrededor del 25% de
di-PEG-EPO. Oligómeros y EPOsf no
pegilada quedaron en la proteína remanente. El
mono-PEG-EPO obtenido de la fracción
de 150 ml contuvo aproximadamente 90% de
mono-PEG-EPO y aproximadamente el
10% de di-PEG-EPO.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: F. Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 124 Grenzacherstrasse
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4070
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (61) 688 11 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: (61) 688 13 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 962 292 hlr ch
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Conjugados de Eritropoyetina
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE OPERACIÓN: WORD
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Un conjugado de eritropoyetina, dicho
conjugado comprende una glucoproteína, la eritropoyetina, que
presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad
biológica in vivo con la que consigue que las células de la
médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos
rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y
análogos de la misma que presenten la secuencia de la eritropoyetina
humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de
glicosilación o mediante una nueva disposición de al menos un sitio
de glicosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida
covalentemente a "n" grupos de poli(etilenglicol) de la
fórmula
-CO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR
con el -CO de cada grupo de
poli(etilenglicol) formando un enlace amida con uno de dichos
grupos amino; en
donde
R es alquilo inferior;
x es 2 ó 3;
m se encuentra entre 450 y 900;
n se encuentra entre 1 y 3; y
n y m se eligen de modo que el peso molecular
del conjugado menos la glucoproteína eritropoyetina se encuentre
entre 20 kilodaltons y 100 kilodaltons.
2. El conjugado de la reivindicación 1, de la
fórmula:
(I)P-[NHCO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR]_{n}
en donde x, m, n y R son como se
han definido en la reivindicación 1, y P es el residuo de la
glucoproteína sin el grupo o grupos n amino que forman el enlace o
enlaces con el grupo o grupos de poli(etilen
glicol).
3. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente, en donde R es metilo.
4. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente, en donde m está comprendido entre 650 y 750.
5. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente, en donde n es 1.
6. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente, en donde R es metilo; m está comprendido entre 650 y
750; y n es 1.
7. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente que presente la fórmula
[CH_{3}O(CH_{2}CH_{2}O)_{m}CH_{2}CH_{2}CH_{2}CO-NH]_{n}-P
en donde m se encuentra entre 650 y
750, n es 1 y P es como se ha definido en la reivindicación
2.
8. El conjugado de cualquier reivindicación
precedente, en donde la glicroproteína es una eritropoyetina
humana.
9. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde la glucoproteína eritropoyetina
humana es expresada mediante activación génica endógena.
10. El conjugado de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en donde la glucoproteína presenta la
secuencia SEQ ID NO:1.
11. El conjugado de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en donde la glucoproteína tiene la
secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición
de entre 1 y 6 sitios de glicosilación.
12. El conjugado de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, en donde la glucoproteína tiene la
secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante una
modificación seleccionada del grupo que consiste en:
Asn^{30}Thr^{32};
Asn^{51}Thr^{53},
Asn^{57}Thr^{59};
Asn^{69};
Asn^{69}Thr^{7l};
Ser^{68}Asn^{69}Thr^{7l};
Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Gly^{89}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Thr^{92};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Ala^{162};
Asn^{69}Thr^{71}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Asn^{89}Ile^{90}Thr^{91};
Ser^{87}Asn^{89}Ile^{90}Thr^{9l};
Asn^{136}Thr^{138};
Asn^{138}Thr^{140};
Thr^{125}; y
Pro^{124}Thr^{125}.
13. El conjugado de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, en donde la glucoproteína presenta una
secuencia que comprende la secuencia de la eritropoyetina humana y
una segunda secuencia en el extremo carboxilo de la secuencia de la
eritropoyetina humana, en donde la segunda secuencia contiene al
menos un sitio de glicosilación.
14. El conjugado de la reivinidicación 13, en
donde la segunda secuencia comprende una secuencia derivada de la
secuencia del extremo carboxilo de la gonadotropina coriónica
humana.
15. El conjugado de la reivindicación 13, en
donde la glucoproteína pressenta una secuencia seleccionada del
grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de la eritropoyetina humana y la secuencia SEQ ID NO:3 en el extremo carboxilo de la secuencia de la eritropoyetina humana;
- (b)
- la secuencia en (a) modificada por Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}; y
- (c)
- la secuencia en (a) modificada por Asn^{30} Thr^{32} Val^{87} Asn^{88} Thr^{90}.
16. El conjugado de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en donde la glucoproteína tiene la
secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la nueva
disposición de al menos un sitio de glicosilación.
17. El conjugado de la reivindicación 16, en
donde la nueva disposición comprende la deleción de cualquiera de
los sitios de glicosilación con unión N en la eritropoyetina humana
y la adición de un sitio de glicosilación con unión N en la posición
88 de la secuencia de la eritropoyetina humana.
18. El conjugado de la reivindicación 17, en
donde la glucoproteína tiene la secuencia de la eritropoyetina
humana modificada mediante una modificación seleccionada del grupo
que consiste en:
Gln^{24} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90};
Gln^{38} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90};
y
Gln^{83} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}.
19. Una composición que comprende conjugados,
cada uno de dichos conjugados comprendiendo una glucoproteína
eritropoyetina que tiene al menos un grupo amino libre y que
presenta una actividad biológica in vivo que hace que las
células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos
y glóbulos rojos y que se seleccionan del grupo que consiste en
eritropoyetina humana y eritropoyetina humana modificada mediante la
adición de entre 1 y 6 sitios de glicosilación o una nueva
disposición de al menos un sitio de glicosilación; la glucoproteína
en cada uno de dichos conjugados está covalentemente unida a
"n" grupos de poli(etilen glicol) de la fórmula
-CO-(CH_{2})_{x}(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR
con el -CO de cada grupo poli(etilen glicol) formando un
enlace amida con uno de dichos grupos amino; en donde en cada uno de
dichos conjugados R es alquilo inferior; x es 2 ó 3; m se encuentra
entre 450 y 900; n se encuentra entre 1 y 3; n y m son seleccionados
de forma que el peso molecular de cada conjugado menos la
glucoproteína eritropoyetina se encuentre entre 20 kilodaltons y 100
kilodaltons; el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos el
noventa por ciento.
20. La composición que comprende conjugados tal
como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en
donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos el
noventa por ciento.
21. La composición de acuerdo con las
reivindicaciones 19 ó 20, en donde el porcentaje de conjugados donde
n es 1 es al menos el noventa y dos por ciento.
22. La composición de la reivindicación 21 en
donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos el
noventa y séis por ciento.
23. La composición de la reivindicación 19 ó 20
en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es entre el
noventa por ciento y el noventa y seis por ciento.
24. Una composición farmacéutica que comprende
un conjugado o una composición de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23 y un excipiente farmacéuticamente
acetable.
25. El uso de un conjugado o una composición de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para la
preparación de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de
enfermedades relacionadas con la anemia en pacientes con fallo renal
crónico (CRF), SIDA y para el tratamiento de pacientes de cáncer que
han sido tratados con quimioterapia.
26. Un proceso para la preparación de conjugados
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, cuyo
proceso comprende la condensación del compuesto de la Fórmula II
con la glucoproteína eritropoyetina
y en la cual R, m y x son como se han definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a
6.
27. Conjugados de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23 para el tratamiento de enfermedades
asociadas con anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF),
SIDA y pacientes con cáncer que han sido tratados con
quimioterapia.
28. Un conjugado, dicho conjugado comprende
una glicoproteína eritropoyetina, que presenta al menos un grupo
amino libre, que presenta una actividad biológica in vivo con
la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la
producción de reticulocitos y glóbulos rojos, dicha glucoproteína se
encuentra unida covalentemente a "n" grupos de
poli(etilenglicol) de la fórmula
-CO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR
con el -CO de cada grupo de
poli(etilenglicol) formando un enlace amida con uno de dichos
grupos amino; en
donde
R es metilo;
x es 3;
m se encuentra entre 650 y 750;
n es 1; y
n y m se eligen de modo que el peso molecular
del conjugado menos la glicoproteína eritropoyetina es de unos 30
kilodaltons.
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