ES2299251T3 - Inhibidores del factor de transcripcion nf-kappa b. - Google Patents

Abstract

Un compuesto que es: N-(4-acetilfenil)-2-hidroxi-5-yodofenilcarboxamida; N-(2, 4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-nitrofenilcarboxamida; N-(2, 4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-yodofenilcarboxamida; o una sal, hidrato o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable

Description

Inhibidores del factor de transcripción NF-\kappaB.

Campo de la invención

Esta invención se refiere de manera general a inhibidores de salicilanilida del factor de transcripción NF-\kappaB. Dichos compuestos son particularmente útiles para tratar enfermedades en las que está implicada la activación de NF-\kappaB. De manera más específica, estos compuestos inhiben la fosforilación de \kappaB y la posterior degradación. Dichos compuestos son útiles en el tratamiento de una variedad de enfermedades asociadas con la activación de NF-\kappaB incluyendo trastornos inflamatorios; de manera concreta la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria del intestino, y el asma; la dermatosis, que incluye la psoriasis y la dermatitis atópica; las enfermedades autoinmunes; rechazo de tejido y de órgano; enfermedad de Alzheimer; apoplejía; aterosclerosis; restenosis, cáncer, que incluye la enfermedad de Hodgkins; y algunas infecciones víricas, que incluyen SIDA; osteoartritis; osteoporosis; y ataxia telangiestasia.

Antecedentes de la invención

Recientes avances en la comprensión científica de los mediadores implicados en las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas y el cáncer han conducido a nuevas estrategias en la investigación de terapéuticas efectivas. Las soluciones tradicionales incluyen la intervención dirigida directa, tal como el uso de anticuerpos específicos, antagonistas del receptor, o inhibidores enzimáticos. Recientes avances en la elucidación de los mecanismos reguladores implicados en la transcripción y la traducción de una variedad de mediadores han conducido a un aumento de interés en las soluciones terapéuticas dirigidas al nivel de la transcripción génica.

NF-\kappaB pertenece a una familia de complejos de factores de transcripción diméricos estrechamente relacionados, compuestos por diversas combinaciones de polipéptidos de la familia Rel/NF-\kappaB. La familia está constituida por cinco productos génicos individuales en mamíferos, ReIA (p65), NF-\kappaB1 (p50/p105), NF-\kappaB2 (p49/p100), c-ReI, y ReIB, todos los cuales pueden formar hetero u homodímeros. Estas proteínas tienen en común una "región de homología ReI" compuesta por 300 aminoácidos altamente homólogos que contiene el enlace del ADN y las regiones de dimerización. En el término C del extremo de la región de homología ReI existe una secuencia de translocación nuclear, importante en el transporte de NF-\kappaB entre el citoplasma y el núcleo. De manera adicional, p65 y cReI poseen potentes regiones de transactivación en sus extremos C-terminales.

La actividad de NF-\kappaB está regulada por su interacción con un miembro del inhibidor de la familia \kappaB de proteínas. Esta interacción bloquea de manera efectiva la secuencia de localización nuclear en las proteínas NF-\kappaB, evitando de esta manera la migración del dímero al núcleo. Una amplia variedad de estímulos activan NF-\kappaB a través de los cuales es muy posible multiplicar las rutas de transducción de la señal. Están incluidos los productos bacterianos (LPS), algunos virus (HIV-1, HTLV-1), citoquinas inflamatorias (TNF\alpha, IL-1), y el estrés ambiental. Aparentemente común a todos los estímulos sin embargo, es la fosforilación y posterior degradación de \kappaB. \kappaB se fosforila en dos serinas N terminales mediante las recientemente identificadas \kappaB quinasas (IKK-\alpha e IKK-\beta). Los estudios de la mutagénesis dirigida al emplazamiento indican que estas fosforilaciones son críticas para la posterior activación de NF-\kappaB en que una vez fosforilada la proteína se marca para la degradación mediante la ruta del ubiquitin-proteasoma. Libres de \kappaB, los complejos NF-\kappaB activos son capaces de translocarse en el núcleo en el que se enlazan de manera selectiva con secuencias mejoradoras preferidas específicas del gen. Incluidas en los genes regulados por NF-\kappaB están numerosas citoquinas, moléculas de adhesión celular, y proteínas de fase aguda.

Se sabe bien que NF-\kappaB juega un papel clave en la regulación de la expresión de un gran número de mediadores proinflamatorios que incluyen citoquinas tales como IL-6 e IL-8, moléculas de adhesión celular, tales como ICAM y VCAM, y la óxido nítrico sintasa inducible (ONSi). Se sabe que dichos mediadores juegan un papel en la incorporación de leucocitos en los emplazamientos de inflamación y en el caso de ONSi, puede conducir a la destrucción del órgano en algunas enfermedades inflamatorias y autoinmunes.

La importancia de NF-\kappaB en los transtornos inflamatorios se reafirma de manera adicional con los estudios de inflamación de las vías aéreas incluyendo asma, en los que se ha demostrado que NF-\kappaB está activado. Esta activación puede sustentar el aumento de la producción de citoquina y la infiltración de leucocitos característica de estos transtornos. De manera adicional, se sabe que los esteroides inhalados reducen la hipersensibilidad de las vías aéreas y suprimen la respuesta inflamatoria en las vías aéreas asmáticas. A la luz de los recientes hallazgos con respecto a la inhibición glucocorticoidea de NF-\kappaB, se puede especular que estos efectos están mediados a través de una inhibición de NF-\kappaB.

La evidencia adicional de un papel de NF-\kappaB en los transtornos inflamatorios viene de los estudios del sinovio reumatoide. Aunque NF-\kappaB está normalmente presente en forma de complejo citoplásmico inactivo, recientes estudios inmunohistoquímicos han indicado que NF-\kappaB esta presente en los núcleos, y por lo tanto, activo en las células que comprenden el sinovio reumatoide. Además, se ha demostrado que NF-\kappaB está activado en las células sinoviales humanas en respuesta a la estimulación con TNF-\alpha. Dicha distribución puede ser el mecanismo subyacente del aumento en la producción de citoquina y eicosanoide característico de este tejido. Véase Roshak, A. K., y col., J. Biol. Chem., 271, 31496-31501 (1996).

Es probable también que las proteínas NF-\kappaB/ReI y \kappaB jueguen un papel clave en la transformación neoplásica. Los miembros de la familia están asociados con la transformación celular in vitro e in vivo como un resultado de sobreexpresión, amplificación génica, reordenaciones o translocaciones génicas. De manera adicional, se observa la reordenación y/o la amplificación de los genes que codifican estas proteínas en un 20-25% de algunos tumores linfoides humanos. De manera adicional, se ha informado un papel para NF-\kappaB en la regulación de la apóptosis afianzándose el papel de este factor de transcripción en el control de la proliferación celular.

Se describen diversos inhibidores de NF-\kappaB en C. Wahl, y col. J. Clin. Invest. (101)(5), 1163-1174 (1998), R. W. Sullivan, y col. J. Med. Chem. 41, 413-419 (1998), J. W. Pierce, y col. J. Biol. Chem. 272, 21096-21103 (1997).

Las salicilanilidas son compuestos conocidos. Se describe una preparación de solución general por M. T. Clark. R. A. Coburn. R. T. Evans, R. J. Genco, J. Med. Chem., 1986, 29, 25-29.

Los inventores han descubierto ahora un nuevo procedimiento de inhibición de la activación del factor de transcripción NF-\kappaB usando salicilanilidas.

Resumen de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para tratar enfermedades que pueden ser terapéuticamente modificadas alterando la actividad del factor de transcripción NF-\kappaB.

De acuerdo con esto, en el primer aspecto, esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto que es:

N-(4-acetilfenil)-2-hidroxi-5-yodofenilcarboxamida;

N-(2,4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-nitrofenilcarboxamida;

N-(2,4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-yodofenilcarboxamida;

o una sal, hidrato o solvato de los mismos farmacéuticamente aceptable;

En otro aspecto adicional, esta invención proporciona el uso de un compuesto, tal como se ha indicado anteriormente, para la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades en las que la patología de la enfermedad puede ser terapéuticamente modificada inhibiendo NF-\kappaB.

En un aspecto concreto, esta invención proporciona el uso de un compuesto tal como se ha indicado anteriormente para la fabricación de un medicamento para tratar una variedad de enfermedades asociadas con la activación de NF-\kappaB que incluyen transtornos inflamatorios; concretamente artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, y asma: dermatosis, que incluye psoriasis y dermatitis atópica; enfermedades autoinmunes; rechazo de tejido y de órgano; enfermedad de Alzheimer; apoplejía; aterosclerosis; restenosis; cáncer, que incluye la enfermedad de Hodgkins; y algunas infecciones víricas, que incluyen SIDA; osteoartritis; osteoporosis; y ataxia telangiestasia.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un compuesto que es:

N-(4-acetilfenil)-2-hidroxi-5-yodofenilcarboxamida;

N-(2,4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-nitrofenilcarboxamida;

N-(2,4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-yodofenilcarboxamida;

o una sal, hidrato o solvato de los mismos farmacéuticamente aceptable;

Procedimientos de preparación

Se pueden preparar de manera conveniente los compuestos de la presente invención mediante los procedimientos que se muestran en los Esquemas 1 y 2 siguientes. M. T. Clark, R. A. Coburn, R. T. Evans, R. J. Genco; J. Med. Chem; 1986; 29; 25-29 describen una preparación de solución general de salicilanilidas. Estos compuestos también se pueden de manera conveniente mediante técnicas de fase sólida, incluyendo en forma de una biblioteca.

Preparación general:

Se muestra en el Esquema 1 y 2 la preparación de solución general. Se prepara una salicilanilida mediante la condensación de un ácido salicílico sustituido con una anilina sustituida en presencia de tricloruro de fósforo en clorobenceno seco (Esquema 1). Se puede preparar también una salicilanilida mediante la conversión de un ácido salicílico sustituido en su cloruro de ácido correspondiente con cloruro de tionilo en tolueno con DMF catalítico. A continuación se calientan el cloruro de ácido salicílico resultante y una anilina sustituida en tolueno para formar una salicianilida (Esquema 2).

Esquema 1

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Esquema 2

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Los materiales de partida usados en el presente documento están comercialmente disponibles o se preparan mediante procedimientos rutinarios bien conocidos por aquellas personas normalmente expertas en la técnica y se pueden encontrar en los libros habituales de referencia, tales como el COMPENDIUM OF ORGANIC SYNTHETIC METHODS. Vol. I-VI (publicado por Wiley-Interscience).

Las sales de adición de ácido de los compuestos reivindicados se preparan de manera convencional en un solvente adecuado a partir del compuesto padre y un exceso de un ácido, tal como el clorhídrico, brómico, fluorídico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, maleico, succínico o metanosulfónico. Algunos de los compuestos forman sales inertes o zwitteriones que pueden ser aceptables. Las sales catiónicas se preparan tratando el compuesto padre con un exceso de un reactivo alcalino, tal como un hidróxido, carbonato o alcóxido, que contiene el catión apropiado; o con una amina orgánica apropiada. Los cationes tales como Li^{+}, Na^{+}, K^{+}, Ca^{++}, Mg^{++} y NH_{4}^{+} son ejemplos específicos de cationes presentes en sales farmacéuticamente aceptables. Haluros, sulfato, fosfato, alcanoatos (tales como acetato y trifluoroacetato), benzoatos, y sulfonatos (tales como mesilato) son ejemplos de aniones presentes en las sales farmacéuticamente aceptables.

Esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con esto, se pueden usar los compuestos de la invención en la fabricación de un medicamento. Las composiciones farmacéuticas preparadas tal como se describe anteriormente en el presente documento se pueden formular como soluciones o polvos liofilizados para la administración parenteral. Los polvos pueden reconstituirse mediante la adición de un diluyente adecuado u otro vehículo farmacéuticamente aceptable antes del uso. La formulación líquida puede ser una solución acuosa isotónica tamponada. Los ejemplos de diluyentes adecuados son soluciones salinas isotónicas normales, dextrosa estándar al 5% en agua o solución tamponada de acetato de amonio o sodio. Dicha formulación es especialmente adecuada para la administración parenteral, pero se puede usar también para la administración oral o contenida en un inhalador o nebulizador de dosis medida para insuflación. Puede ser deseable añadir excipientes tales como polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxi celulosa, acacia, polietilén glicol, manitol, cloruro de sodio o citrato de sodio.

Alternativamente, estos compuestos pueden estar encapsulados, comprimidos o preparados en una emulsión o jarabe para la administración oral. Se pueden añadir vehículos sólidos o líquidos farmacéuticamente aceptables para mejorar o estabilizar la composición, o para facilitar la preparación de la composición. Los vehículos sólidos incluyen almidón, lactosa, sulfato dihidrato de calcio, terra alba, estearato de magnesio o ácido esteárico, talco, pectina, acacia, agar o gelatina. Los vehículos líquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, solución salina y agua. El vehículo puede incluir también un material de liberación mantenida tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, sólo o con una cera. La cantidad de vehículo sólido varía pero, de manera preferible, estará entre aproximadamente 20 mg y 1 g por dosis unitaria. Las preparaciones farmacéuticas se preparan siguiendo las técnicas convencionales de farmacia que implican molienda, mezcla, granulación, y compresión, cuando sea necesario, para formas de comprimido; o molienda, mezcla y relleno para formas de cápsulas de gelatina dura. Cuando se usa un vehículo líquido, la preparación estará en forma de un jarabe, elíxir, emulsión o una suspensión acuosa o no acuosa. Se puede administrar dicha formulación líquida directamente p.o. o rellena en una cápsula de gelatina blanda.

Para la administración rectal, se pueden combinar también los compuestos de esta invención con excipientes tales como manteca de cacao, glicerina, gelatina o polietilén glicoles y moldearse también en un supositorio.

Los procedimientos de la presente invención incluyen la administración tópica de los compuestos según se reivindican. Por administración tópica se entiende administración no sistémica, que incluye la aplicación de un compuesto de la invención externamente en la epidermis, en la cavidad bucal para la instilación de dicho compuesto en la oreja, ojo y nariz, en el que los compuestos no penetran de manera significativa en la corriente sanguínea. Por administración sistémica se entiende administración oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. La cantidad de un compuesto de la invención (denominado a partir de ahora en el presente documento como el ingrediente activo) requerida para un efecto terapéutico o profiláctico tras la administración tópica variará, por supuesto, con el compuesto escogido, la naturaleza y la gravedad de la dolencia que está siendo tratada y el tratamiento que experimenta el animal, y está, de manera última, a la discreción del médico.

Aunque es posible que un ingrediente activo se administre sólo como producto químico original, es preferible presentar éste como formulación farmacéutica. El ingrediente activo puede comprender, para la administración tópica, entre 0,01 y 5,0% en peso de la formulación.

Las formulaciones tópicas de la presente invención, para uso veterinario y para uso médico humano, comprenden un ingrediente activo conjuntamente con uno o más vehículos aceptables del anterior, y opcionalmente cualquier otro ingrediente terapéutico. El vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para el receptor de los anteriores.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas adecuadas para la penetración a través de la piel en el emplazamiento en el que se requiere el tratamiento tal como: linimentos, lociones, cremas, ungüentos o pastas, y gotas adecuadas para la administración en el ojo, oreja o nariz.

Las gotas de acuerdo con la presente invención pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleosas estériles y se pueden preparar disolviendo el ingrediente activo en una solución acuosa adecuada de un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado, e incluyen de manera preferible un agente tensioactivo. A continuación puede clasificarse la solución resultante mediante filtración, transferirse a un contenedor adecuado que a continuación se sella y esteriliza mediante autoclavado o manteniendo a 90-100ºC durante una hora y media. De manera alternativa, se puede esterilizar la solución mediante filtración y transferirse al contenedor mediante una técnica aséptica. Los ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para la inclusión en las gotas son nitrato o acetato fenilmercúrico (0,002%), cloruro de benzalconio (0,01%) y acetato de clorhexidina (0,01%). Los solventes adecuados para la preparación de una solución aceitosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilén glicol.

Las lociones de acuerdo con la presente invención incluyen aquellas adecuadas para la aplicación en la piel o el ojo. Una loción para ojos puede comprender una solución acuosa estéril que contiene de manera opcional un bactericida y puede prepararse mediante procedimientos similares a aquellos para la preparación de las gotas. Las lociones o linimentos para la aplicación a la piel pueden incluir también un agente para acelerar el secado y para enfriar la piel, tal como un alcohol o acetona, y/o un hidratante tal como glicerol o un aceite tal como aceite de ricino o aceite de cacahuete.

Las cremas, ungüentos o pastas de acuerdo con la presente invención son formulaciones semisólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Pueden fabricarse mezclando el ingrediente activo en forma de polvo o finamente dividido, sólo o en solución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con la ayuda de la maquinaria adecuada, con una base grasienta o no grasienta. La base puede comprender hidrocarburos tales como parafina dura, blanda o líquida, glicerol, cera de abejas, un jabón metálico; un mucílago; un aceite de origen natural tal como aceite de almendra, maíz, cacahuete, ricino u oliva; grasa de lana o sus derivados, o un ácido graso tal como ácido esteárico u oleico conjuntamente con un alcohol tal como propilén glicol o macrogoles. La formulación puede incorporar cualquier agente tensioactivo adecuado tal como un agente tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico tal como los ésteres de sorbitán o los derivados de polioxietileno de los mismos. Pueden incluirse también agentes suspensores tales como gomas naturales, derivados de celulosa o en materiales orgánicos tales como sílices silicáceos, y otros ingredientes tales como lanolina.

Utilidad de la presente invención

Los compuestos de la invención son útiles como inhibidores de NF-\kappaB. La presente invención proporciona composiciones y formulaciones útiles de dichos compuestos, que incluyen composiciones y formulaciones farmacéuticas de dichos compuestos.

La presente invención proporciona también su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades asociadas con la activación de NF-\kappaB. La presente invención proporciona de manera particular un uso para tratar transtornos inflamatorios; concretamente la artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, y asma; dermatosis, que incluye psoriasis y dermatitis atópica; enfermedades autoinmunes; rechazo de tejido y de órgano; enfermedad de Alzheimer; apoplejía; aterosclerosis; restenosis; cáncer, que incluye la enfermedad de Hodgkins; y algunas infecciones víricas, que incluyen SIDA; osteoartritis; osteoporosis; y Ataxia Telangiestasia.

Para uso agudo, se prefiere la administración parenteral de un compuesto de la invención reivindicada. Una infusión intravenosa del compuesto en dextrosa al 5% en agua o solución salina normal, o, es más efectiva una formulación similar con excipientes adecuados, aunque también es útil una inyección de bolo intramuscular. Normalmente, la dosis parenteral será aproximadamente de 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg; de manera preferible entre 0,1 y 20 mg/kg, con el fin de mantener la concentración de fármaco en el plasma a una concentración efectiva para inhibir la activación de NF-\kappaB. Los compuestos se administran de una a cuatro veces al día a un nivel para alcanzar una dosis diaria total de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 80 mg/kg/día. La cantidad precisa de un compuesto inventivo que es terapéuticamente efectivo, y la ruta por la cual dicho compuesto se administra mejor, se determina fácilmente por una persona normalmente experta en la técnica, comparando el nivel en sangre del agente con la concentración requerida para tener un efecto terapéutico.

Se pueden administrar también los compuestos de la invención por vía oral al paciente, de tal manera que la concentración de fármaco sea suficiente para inhibir NF-\kappaB.

Normalmente, una composición farmacéutica que contiene el compuesto se administra en una dosis oral de entre aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg de manera consistente con la dolencia del paciente. De manera preferible, la dosis oral sería de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 mg/kg.

Se pueden administrar también los compuestos de la invención tópicamente al paciente, de una manera tal que la concentración del fármaco sea suficiente para inhibir NF-\kappaB o para conseguir cualquier otra indicación terapéutica tal como se describe en el presente documento. Normalmente, se administra una composición farmacéutica que contiene el compuesto en una formulación tópica de entre aproximadamente 0,001% a aproximadamente 5% p/p.

No se esperan efectos toxicológicos inaceptables cuando los compuestos de la presente invención se administran de acuerdo con la presente invención.

La capacidad de los compuestos descritos en el presente documento para inhibir la activación de NF-\kappaB se evidencia claramente en su capacidad para inhibir la actividad del gen indicador controlado por NF-\kappaB (véase Tabla 1). La utilidad de los presentes inhibidores de NF-\kappaB en la terapia de enfermedades está basada en la importancia de la activación de NF-\kappaB en una variedad de enfermedades.

TABLA 1

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NF-\kappaB juega un papel clave en la expresión regulada de un gran número de mediadores proinflamatorios que incluyen citoquinas tales como IL-6 e IL-8 (Mukaida y col., 1990; Liberman y Baltimore, 1990; Matsusaka y col., 1993), moléculas de adhesión celular, tales como ICAM y VCAM (Marui y col., 1993; Hawai y col., 1995; Ledebur y Parks, 1995), y la óxido nítrico sintasa inducible (ONSi) (Xie y col., 1994; Addock y col., 1994). (Al final de esta sección hay un listado completo de referencias). Se sabe que dichos mediadores juegan un papel en la incorporación de leucocitos en los emplazamientos de la inflamación y en el caso de la ONSi, puede conducir a la destrucción del órgano en algunas enfermedades inflamatorias y autoinmunes (McCartney-Francis y col., 1993; Kleemann y col., 1993). De manera importante, los compuestos descritos en el presente documento inhiben la síntesis de IL-8 y la producción de óxido nítrico, un producto de la actividad de la ONSi (véase la Tabla 2).

TABLA 2

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Se obtuvo la evidencia de un importante papel de NF-\kappaB en los transtornos inflamatorios en estudios de pacientes asmáticos. Las biopsias bronquiales tomadas de pacientes asmáticos atópicos leves muestran aumentos significativos en el número de células en la tinción de la submucosa para NF-\kappaB activado, NF-\kappaB total y las citoquinas reguladas por NF-\kappaB tales como GM-CSF y TNF\alpha en comparación con las biopsias de controles no atópicos normales (Wilson y col., 1998). Además, está aumentado el porcentaje de vasos que expresan inmunoreactividad de NF-\kappaB así como inmunoreactividad de IL-8 en el epitelio de los especimenes de biopsia (Wilson y col., 1998). Como tal, podría predecirse por ser beneficiosa la inhibición de la producción de IL-8 mediante la inhibición de NF-\kappaB, según se ha demostrado mediante estos compuestos, podría predecirse ser beneficiosa en la inflamación de las vías aéreas.

Recientes estudios sugieren que NF-\kappaB puede jugar también un papel crítico en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD). Se observan NF-\kappaB activados en los especímenes de biopsia colónica de los pacientes con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (Ardite y col., 1998; Rogler y col., 1998; Schreiber y col., 1998). Es evidente la activación en la mucosa inflamada pero no en la mucosa sin inflamar (Ardite y col., 1998; Rogler y col., 1998) y se asoció con un aumento de la expresión del ARNm de IL-8 en los mismos emplazamientos (Ardite y col., 1998). Además, el tratamiento con corticoesteroide inhibe fuertemente la activación de NF-\kappaB intestinal y reduce la inflamación colónica (Ardite y col., 1998; Schreiber y col., 1998). De nuevo, la inhibición de la producción de IL-8 mediante la inhibición de NF-\kappaB, según se ha demostrado mediante estos compuestos podría predecirse ser beneficiosa en la inflamación de las vías aéreas.

Los modelos animales de inflamación gastrointestinal proporcionan apoyo adicional para NF-\kappaB como regulador clave de la inflamación colónica. Se observó un aumento de la actividad de NF-\kappaB en los macrófagos de la lámina propia en la colitis inducida por ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS) en ratones con p65 siendo un componente principal de los complejos activados (Neurath y col., 1996; Neurath y Petterson, 1997). La administración local de p65 de sentido contrario abroga los signos de colitis establecida en los animales tratados sin signos de toxicidad (Neurath y col., 1996; Neurath y Pettersson, 1997). De esta manera, se podría predecir que los inhibidores de molécula pequeña de NF-\kappaB podrían ser útiles en el tratamiento de IBD.

Una evidencia adicional del papel de NF-\kappaB en los transtornos inflamatorios proviene de los estudios del sinovio reumatoide. Aunque NF-\kappaB está normalmente presente como complejo citoplásmico inactivo, recientes estudios inmunohistoquímicos han indicado que NF-\kappaB está presente en los núcleos, y por tanto activo, en las células que comprenden el sinovio reumatoide humano (Andel y col., 1995; Marok y col., 1996; Sioud y col., 1998) y en modelos animales de la enfermedad (Tsao y col., 1997): La tinción se asocia con los sinoviocitos de tipo A y el endotelio vascular (Marok y col., 1996). Además, se observa la activación constitutiva de NF-\kappaB en sinoviocitos cultivados (Roshak y col., 1996; Miyazawa y col., 1998) y en cultivos celulares sinoviales estimulados con IL-1\beta o TNF\alpha (Roshak y col., 1996; Fujisawa y col., 1996; Roshak y col., 1997). De esta manera, la activación de NF-\kappaB puede experimentar el aumento de la producción de citoquina y la infiltración de leucocitos característica del sinovio inflamado. Podría predecirse la capacidad de estos compuestos de inhibir NF-\kappaB e inhibir por tanto la producción de eicosanoides por estas células para dar como resultado un beneficio en la artritis reumatoide (véase la Tabla 2).

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Ensayos biológicos

Se pueden ensayar los compuestos de esta invención en uno de los diversos ensayos biológicos para determinar la concentración de compuesto que se requiere para tener un efecto farmacológico dado.

Se llevaron a cabo ensayos de la actividad de NF-\kappaB usando un ensayo indicador de la luciferasa basado en células tal como se describe en Breton, J. J y Chabot-Fletcher, M. C., JPET, 282, 459-466 (1997). De manera breve, se cultivó la línea celular del linfoma histiocítico humano U937 transfectada permanentemente con los plásmidos indicadores de NF-\kappaB (véase a continuación) en el medio anterior con la adición de 250 \mug/ml de Geneticina (sulfato G418, Life Technologies, Grand Island, NY). Se llevó a cabo el ensayo del indicador de la luciferasa en los clones U937 transfectados. Se centrifugaron éstos dos veces a 300 x g durante 5 min y se volvieron a suspender en RPMI 1640 con FBS al 10% hasta una densidad de 1 x 10^{4} células/ml. Se añadieron alícuotas de un ml a los pocillos de placas con 24 pocillos. Se añadió el compuesto o el vehículo de dimetil sulfóxido (DMSO) (1 \mul) a los pocillos apropiados y se incubaron las placas a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 30 min. Se añadió el estímulo (5 ng/ml de TNF\alpha, 100 ng/ml de LPS, o 0,1 \muM de PMA) y se incubaron las muestras durante 5 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%, se transfirieron a tubos de polipropileno de 1,9 ml, y se centrifugaron a 200 x g durante 5 min. Se lavaron los residuos celulares dos veces en 1 ml de PBS sin Ca^{2+} y Me^{2+}, y se centrifugaron tal como se ha indicado anteriormente. Se lisaron los residuos celulares resultantes en 50 \mul 1 x tampón de lisis (Promega corporation, Madison, WI), se sometieron a vortización y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 20 \mul de cada lisado a una placa de 96 pocillos blanca opaca (Wallac Inc, Galthersburg. MD) y se evaluaron para la producción de luciferasa en un luminómetro MicroLumat LB 96 P (EG&G Berthold, Bad Silbad, Alemania) El luminómetro dispensa 100 \mul de reactivo de ensayo de la luciferasa (Promega Corporation, Madison, WI) en cada pocillo y se registró la salida de luz integrada durante 20 s. Se midió la salida de luz en unidades de luz relativa (RLU).

Puede medirse también la actividad de NF-\kappaB en un ensayo electroforético de cambio de movilidad (EMSA) para evaluar la presencia de proteína NF-\kappaB en el núcleo. Se cultivaron las células de interés hasta una densidad de 1 x 10^{6} ml. Se cosecharon las células mediante centrifugación, se lavaron en PBS sin Ca^{2+} y Mg^{2+} y se volvieron a suspender en PBS con Ca^{2+} y Mg^{2+} a 1 x 10^{7} células/ml. Para examinar el efecto del compuesto sobre la activación de NF-\kappaB, se trataron las suspensiones celulares con diversas concentraciones de fármaco o vehículo (DMSO, 0,1%) durante 30 min a 37ºC antes de la estimulación con TNF\alpha (5,0 ng/ml) durante 15 min. más. Se prepararon los extractos celulares y nucleares como sigue. De manera breve, al final del período de incubación se lavaron las células (1 x 10^{7} células) 2 x en PBS sin Ca^{2+} y Mg^{2+}. Se volvieron a suspender los residuos celulares resultantes en 20 \mul de Tampón A (Hepes 10 mM (pH 7,9), KCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, ditiotreitol 0,5 mM (DTT) y NP-40 al 0,1%) y se incubaron sobre hielo durante 10 min. Se aglutinaron los núcleos mediante centrifugación a 3500 rpm durante 10 min a 4ºC. Se recogió el sobrenadante resultante como extracto celular y se volvió a suspender el residuo nuclear en 15 \mul de Tampón C (Hepes 20 mM (pH 7,9), NaCl 0,42 M, MgCl_{2} 1,5 mM, glicerol al 25%, EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM (PMSF)). Se mezclaron con cuidado las suspensiones durante 20 min a 4ºC, a continuación se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 min a 4ºC. Se recogió el sobrenadante y se diluyó hasta 60 \mul con Tampón D (Hepes 20 mM (pH 7,9), KCl 50 mM, glicerol al 20%, EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM, y PMSF 0,5 mM). Se almacenaron todas las muestras a -80ºC hasta su análisis. Se determinó la concentración de proteína de los extractos de acuerdo con el procedimiento de Bradford (Bradford, 1976) con reactivos BioRad.

Se evaluó el efecto de los compuestos sobre la activación del factor de transcripción en un ensayo electroforético de cambio de movilidad (EMSA) usando extractos nucleares procedentes de células tratadas tal como se ha descrito anteriormente. Se marcaron los oligonucleótidos consenso NF-\kappaB de doble cadena (5'-AGTTGAGGGGCTTTCCAGGC-3') con la quinasa del polinucleótido T_{4} y [g-^{32}P]ATP. La mezcla de enlace (25 \mul) contiene Hepes-NaOH 10 mM (pH 7,9), Tris-HCl 4 mM (pH 7,9), KCl 60 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol 1 mM, glicerol al 10%, 0,3 mg/ml de albúmina de suero bovino, y 1 \mug de poli(dl-dC)-poli(dl-dC). Se incubaron las mezclas de enlace (10 \mug de proteína de extracto nuclear) durante 20 min a temperatura ambiente con 0,5 ng de oligonucleótido marcado con ^{32}P (50.000-100.000 cpm) en presencia o ausencia de competidor no marcado después que se cargó la mezcla en gel de poliacrilamida al 4% preparado en 1 X Tris borato/EDTA y se sometió a electroforesis a 200 V durante 2 h. Se secaron los geles tras la electroforesis y se expusieron a película para la detección de la reacción de enlace.

Se puede monitorizar el efecto de los compuestos sobre la fosforilación de \kappaB mediante inmunotransferencia. Se sometieron los extractos celulares a electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) sobre geles al 10% (BioRad, Hercules, CA) y se transfirieron las proteínas a láminas de nitrocelulosa (Hybond^{TM}-ECL, Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Se llevaron a cabo ensayos de inmunoemborronado usando un anticuerpo policlonal de conejo frente a IxB\alpha o IxB\beta seguido con anticuerpo secundario de burro anti-conejo conjugado con peroxidasa (Amersham Corp., Arlington Heights, IL).

Se evaluaron los efectos de la producción de eicosanoide por los fibroblastos sinoviales humanos (RSF) usando cultivos primarios de RSF humanos. Se obtuvieron estos mediante digestión enzimática del sinovio obtenido de pacientes adultos con sinovio reumatoide. Se cultivaron las células en Medio Mínimo Esencial de Earl (EMEM) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) 100 unidades/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (GIBCO, Grand Island, NY), a 37ºC y CO_{2} al 5%. Se usaron los cultivos en los pasos 4 a 9 con el fin de obtener una población más uniforme de fibroblastos de tipo I. Para algunos estudios, se plaquearon los fibroblastos a 5 x 10^{4} células/ml en placas de 24 pocillos de 16 mm (diámetro) (Costar, Cambridge, MA). Se expusieron las células en forma de arco a una dosis óptima de IL-1\beta (1 ng/ml; Roshak y col. 1996a) (Genzyme, Cambridge, MA) durante el tiempo designado. Se añadieron los fármacos en vehículo DMSO (1%) a los cultivos celulares 15 minutos antes de la adición de IL-1. Se midieron directamente los niveles de prostaglandina E2 recogidos en medio libre de células a la finalización del período de cultivo usando los kits de inmunoensayo del enzima (EIA) adquiridos de Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI). La muestra o las diluciones estándar se hicieron con medio experimental.

Se evaluó la actividad antiinflamatoria in vivo usando el modelo de inflamación de la oreja en ratones inducido por el éster de forbol. Se aplicó miristato acetato de forbol (PMA) (4 \mug/20 \mul de acetona) a las superficies internas y externas de la oreja izquierda de ratones Balb/c machos (6/grupo) (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA). Cuatro horas más tarde se aplicó el compuesto disuelto en 25 \mul de acetona a la misma oreja. Se midió el espesor de ambas orejas con un micrómetro de dial (Mitutoyo, Japón) y tras 20 horas se aplicó una segunda dosis tópica del compuesto. Veinticuatro horas más tarde, se tomaron las medidas de espesor de la oreja y se expresaron los datos como cambio en el espesor (x 10^{-3} cm) entre las orejas tratadas y no tratadas. A continuación se retiraron las orejas izquierdas inflamadas y se almacenaron a -70ºC hasta que se evaluaron para la actividad de la mieloperoxidasa (MPO), una medida de la infiltración celular inflamatoria.

Se evaluó la infiltración celular inflamatoria a través de la medida de la actividad de la mieloperoxidas presente en el tejido inflamado de la oreja. Se picaron los tejido de la oreja parcialmente congelados y a continuación se homogeneizaron (10% p/v) con un homogeneizador Tissumizer (Tekmar Co., Cincinnatti, OH) en tampón fosfato 50 mM (pH 6) que contenía HTAB al 0,5%. Se tomaron los homogenados de tejidos a lo largo de tres ciclos de congelación-descongelación, seguido por una breve sonicación (10 s). Se determinó la actividad MPO en el homogenado tal como sigue. Se midió espectofotométricamente la apariencia del producto coloreado procedente de la reacción de la o-dianisidina dependiente de MPO (0,167 mg/ml, Sigma Chemical, San Luis, MO) y el peróxido de hidrógeno (0,0005%) a 460 nm. Se cuantificó cinéticamente la actividad MPO del sobrenadante (cambio en la absorbancia medida durante 3 min, muestreada a intervalos de 15 s) usando un espectofotómetro Beckman DU-7 y el paquete de análisis cinético (Beckman Instruments, Inc., Sommerset, NJ). Se definió una unidad de actividad MPO como la que degrada un micromol de peróxido por minuto a 25ºC.

Se midieron los efectos sobre el colapso del cartílago mediado por la inflamación en un sistema explante de cartílago in vitro. En este modelo de cartílago articular bovino se incubaron los explantes durante 4 días/96 horas con o sin rHulL-1 alfa para estimular el colapso del cartílago en presencia o ausencia del compuesto de ensayo. Se eliminaron los sobrenadantes de los ensayos del óxido nítrico. Se midió el óxido nítrico usando la reacción de Greiss y se leyó espectrofotométricamente a 530 nm. Esta reacción mide el nitrito (NO_{2}) que es el producto final estable del óxido nítrico.

General

Se registró el espectro de resonancia magnética nuclear a cualquiera de 250, 300 o 400 MHz usando, de manera respectiva, un espectrómetro Bruker AM 250, Bruker ARX 300 o Bruker AC 400. CDCl_{3} es deuteriocloroformo, DMSO-d_{6} es hexadeuteriodimetilsulfóxido, y CD_{3}OD es tetradeuteriometanol. Se registraron los desplazamientos químicos en partes por millón (d) campo abajo desde el patrón interno de tetrametilsilano. Las abreviaturas de los datos de RMN son como sigue: S = singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuartete, m = multiplete, dd = doblete o dobletes, dt = doblete de tripletes, app = aparente, br = amplio. J indica la constante de acoplamiento de RMN medido en Hertzios. Se registraron los espectros infrarrojos de onda continua (IR) en un espectrómetro infrarrojo Perkin-Elmer 638, y se registraron los espectros infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) en un espectrómetro infrarrojo Nicolet Impact 400 D. Se registraron los espectros IR y FTIR en modo transmisión, y se informó de las posiciones de las bandas en inversos del número de onda (cm^{-1}). Se tomaron los espectros de masas en cualquier instrumento VG 70 FE, PE Syx API III, o VG ZAB HF usando el bombardeo rápido de átomos (FAB) o las técnicas de ionización por electroespray (ES). Se obtuvieron los análisis elementales usando un analizador elemental Perkin-Elmer 240C. Se tomaron los puntos de fusión en un equipo de punto de fusión Thomas-Hoover y no se corrigieron. Se informaron todas las temperaturas en grados celsius.

Se usaron placas de capa fina Analtech Silica Gel GF y E. Merck Silica Gel 60 F-254, para cromatografía en capa fina. Se llevaron a cabo la cromatografía instantánea y por gravedad en un gel de sílice E. Merck Kieselgel 60 (malla de 230-400).

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Donde se indica, se adquirieron algunos de los materiales de Aldrich Chemical co., Milwaukee, Wisconsin, TCI America, Pórtland, OR.

Ejemplos

En los siguientes ejemplos sintéticos, la temperatura está en grados Centígrados (ºC). A no ser que se indique otra cosa, todos los materiales de partida se obtuvieron de fuentes comerciales. Sin elaboración adicional, se cree que una persona experta en la técnica puede, usando la descripción precedente, utilizar la presente invención en su extensión más completa. Se proporcionan estos Ejemplos para ilustrar la invención. Se hace referencia a las reivindicaciones para lo que queda reservado a los inventores a tenor del presente documento.

Ejemplo 1 Preparación de N-(4-acetilfenil)-2-hidroxi-5-yodocarboxamida

Se trató una solución de ácido yodosalicílico (1,9 g, 7,4 mmol) y 4-aminocetofenona (0,97 g, 7,4 mmol) en clorobenceno (40 mL) con PCl_{3} (0,323 mL, 3,7 mmol). Se calentó la solución a reflujo bajo atmósfera de argón. Tras 2 h., se filtró la solución caliente y el filtrado se dejó reposar a temperatura ambiente. Tras 18 h se filtró la solución y se recristalizó el sólido a partir de MeOH para dar el compuesto del título (0,095 g, rendimiento del 5%): ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 2,5-2,6 (s, 3H), 6,8-8,2 (m, 7H), 10,1-10,2 (s, 1H).

Ejemplo 2 Preparación de N-(2,4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-nitrofenilcarboxamida

Se trató una solución de ácido 5-nitrosalicílico (1,4 g, 7,7 mmol) y 2,4-difluoroanilina (0,8 mL, 7,7 mmol) en clorobenceno (40 mL) con Pcl_{3} (0,338 mL, 3,8 mmol). Se calentó la solución a reflujo bajo atmósfera de argón. Tras 2 h, se filtró la solución caliente y el filtrado se dejó reposar a temperatura ambiente. Tras 18 h se filtró la solución y se recristalizó el sólido a partir de MeOH para dar el compuesto del título (0,733 g, rendimiento del 35%): ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 2,5-2,6 (s, 3H), 7,1-8,9 (m, 6H), 10,6-10,7 (s, 1H).

Ejemplo 3 Preparación de N-(2,4-difluorofenil)-2-hidroxi-5yodofenilcarboxamida a) Cloruro del ácido 5-yodosalicílico

Se trató ácido 5-yodosalicílico (2,0 g, 7,58 mmol) en tolueno SOCl2 (1,66 mL, 22,7 mmol) y DMF catalítico a reflujo durante 1 h. Se evaporó la mezcla de reacción hasta sequedad y el cloruro del ácido en la siguiente etapa sin purificación.

b) (2,4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-yodofenilcarboxamida

Se calentaron a reflujo durante 24 h el compuesto del Ejemplo 3(a) (3,79 mmol) y 2,4-difluoroanilina (380 \muL, 3,79 mmol) en tolueno. Se evaporó la mezcla de reacción, se lavó el residuo con éter y el residuo sólido recristalizado a partir de MeOH para dar 159 mg de N-(2,4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-yodofenilcarboxamida. ES MS (M + H)^{-} m/e 373,7.

Claims (10)

1. Un compuesto que es:

N-(4-acetilfenil)-2-hidroxi-5-yodofenilcarboxamida;

N-(2,4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-nitrofenilcarboxamida;

N-(2,4-difluorofenil)-2-hidroxi-5-yodofenilcarboxamida;

o una sal, hidrato o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable.

2. El uso de un compuesto tal como se ha definido en la reivindicación 1 o una sal, hidrato o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para inhibir una enfermedad caracterizada por una activación excesiva de NF-\kappaB.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 en el que dicha enfermedad es un transtorno inflamatorio.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicha enfermedad se selecciona entre el grupo constituido por: artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, y asma.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicha enfermedad es dermatosis.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5 en el que dicha enfermedad se seleccionas entre el grupo constituido por: psoriasis y dermatitis atópica.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicha enfermedad se selecciona entre el grupo constituido por: enfermedades autoinmunes; rechazo de tejido y de órgano; enfermedad de Alzheimer; apoplejía; aterosclerosis; restenosis; osteoartritis; osteoporosis; y ataxia telangiestasia.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicha enfermedad es cáncer.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8 en el que dicho cáncer es la enfermedad de Hodgkins.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicha enfermedad es SIDA.