PT1409016E

PT1409016E - Anticorpos opgl

Info

Publication number: PT1409016E
Application number: PT02749660T
Authority: PT
Inventors: Francis H Martin; Jose Ramon Corvalan; William J Boyle; Geoffrey C Davis
Original assignee: Amgen Fremont Inc; Amgen Inc
Priority date: 2001-06-26
Filing date: 2002-06-25
Publication date: 2010-06-11
Also published as: JP2016216464A; JP2012140430A; JP5065529B2; MY143582A; CN1547486A; EA021242B1; PL222211B1; PT2295081T; CN103232539A; ES2342820T5; JP2015057408A; CY1120658T1; US20120087923A1; RS20120347A3; EA021242B9; NO2019048I1; DK2087908T3; JP2009022280A; AU2008261137B2; JP2015078205A

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPOS OPGL

OBJECTO DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada com anticorpos que ligam o ligando osteoprotegerina (OPGL). Descrevem-se igualmente composições e métodos para o tratamento de doenças ósseas tais como osteoporose, perda óssea resultante de artrite, doença de Paget, e osteopenia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os tecidos ósseos constituem um suporte do corpo e incluem minerais (entre os quais cálcio e fósforo), uma matriz de proteínas colagéneas e não colagéneas e células. 0 tecido vivo do osso apresenta um equilíbrio dinâmico entre a formação do osso, denominada deposição, e a fractura do osso, denominada reabsorção. Neste equilíbrio estão envolvidos três tipos de células que se podem encontrar no osso, osteócitos, osteoblastos e osteoclastos. Os osteoblastos promovem a formação do tecido ósseo, enquanto os osteoclastos estão associados à reabsorção. A reabsorção, ou dissolução da matriz óssea e dos minerais, é um processo rápido e eficiente comparado com a formação óssea e pode provocar a libertação de grandes quantidades de minerais do osso. Os osteoclastos estão envolvidos na regulação da remodelação normal do tecido esquelético e na reabsorção induzida por hormonas. A título de exemplo, a reabsorção é estimulada pela secreção da hormona paratiróide em resposta a concentrações decrescentes do ião cálcio em fluidos extracelulares. Em contrapartida, a inibição da reabsorção é uma função da calcitonina. Além disso, os metabolitos da vitamina D alteram a capacidade de resposta do osso à hormona paratiróide e à calcitonina. 1 0 ligando osteoprotegerina (OPGL), que faz parte da família TNF de citoquinas, promove a formação de osteoclastos através da ligação do receptor activador de NF-κΒ (RANK, também denominado receptor de diferenciação e activação de osteoclasto, ou ODAR). A osteoprotegerina (OPG), por outro lado, inibe a formação de osteoclastos sequestrando OPGL e impedindo a associação da OPGL com ODAR. Assim, a quantidade de OPGL associada a ODAR apresenta uma correlação com o equilíbrio entre a deposição e a reabsorção óssea.

Uma vez atingida a maturidade esquelética, a quantidade de osso no esqueleto reflecte o equilíbrio (ou o desequilíbrio) da formação óssea e da reabsorção óssea. 0 pico da massa óssea ocorre após a maturidade esquelética antes da quarta década. Entre a quarta e a quinta décadas, o equilíbrio altera-se a dominância passa a ser da reabsorção óssea. A inevitável diminuição da massa óssea com a progressão da idade inicia-se mais cedo nas mulheres do que nos homens e sofre uma aceleração marcada após a menopausa em algumas mulheres (sobretudo as de ascendência caucasiana e asiática). A osteopenia é uma condição relacionada de uma forma geral com qualquer diminuição na massa óssea para níveis inferiores aos normais. Tal condição pode resultar de uma diminuição na velocidade de síntese óssea ou de um aumento na velocidade de destruição óssea ou de ambos. Uma forma comum de osteopenia é a osteoporose primária, também denominada de osteoporose pós-menopáusica e senil. Esta forma de osteoporose é uma consequência da perda generalizada de osso com a idade e constitui frequentemente resultado do aumento na reabsorção óssea com uma velocidade normal de formação óssea. Inúmeras mulheres brancas nos Estados Unidos desenvolvem osteoporose sintomática. Há uma relação directa entre osteoporose e a incidência de fracturas da anca, do fémur, do pescoço e inter-trocantérica em mulheres de idade igual ou superior a 2 45 anos. A osteoporose sintomática desenvolve-se em homens mais velhos, de idades compreendidas entre os 50 e os 70. A osteoporose pode, em alguns casos, resultar de niveis mais elevados ou mais actividade da OPGL. Assim sendo, seria útil dispor de moléculas que pudessem regular a actividade da OPGL em osteoclastogénese.

Foram identificados vários factores que podem contribuir para a osteoporose pós-menopáusica e senil. Entre eles contam-se alterações nos niveis de hormonas que acompanham o envelhecimento e o consume inadequado de cálcio atribuído a uma diminuição da absorção intestinal de cálcio e outros minerais. Alguns tratamentos incluíram terapia hormonal ou suplementos alimentares numa tentativa para retardar o processo. Mais recentemente, surgiram agentes anti-reabsortivos tais como bifosfonatos e modificadores selectivos de receptores de estrogénio (SERMs) para a prevenção e o tratamento da massa óssea reduzida. Deste modo, poderia ser útil associar aqueles tratamentos a moléculas que pudessem regular a actividade de OPGL no tratamento de algumas perturbações osteopénicas.

Tsukii et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications (1998), vol. 246, páginas 336-341) divulgam um anticorpo policlonal direccionado contra a murina ODF (= OPGL, RANKL) que se revela eficaz na inibição da osteoclastogénese e da reabsorção óssea in vitro. A eficácia in vivo, ou seja, um efeito prolongado ao longo de várias semanas não é objecto de divulgação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção encontra-se definida nas reivindicações.

Em determinadas configurações, a invenção permite obter um anticorpo constituído por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de 3 aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 2 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 4.

Em determinadas configurações, a invenção permite obter um anticorpo constituído por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região variável que inclui uma sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 13 e a cadeia leve compreende uma região variável que inclui uma sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 14.

Em determinadas configurações, a divulgação permite obter um anticorpo constituído por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma.

Em determinadas configurações, a invenção divulgada permite obter um anticorpo constituído por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região variável que inclui uma sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 13 ou um fragmento da mesma.

Em determinadas configurações, a divulgação permite obter um anticorpo constituído por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 4 ou um fragmento da mesma.

Em determinadas configurações, a divulgação permite obter um anticorpo constituído por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região variável que inclui uma sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 14 ou um fragmento da mesma. 4

Em determinadas configurações, a divulgação permite obter um anticorpo constituído por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, (a) em que a cadeia pesada compreende uma primeira região variável, e em que a primeira região variável inclui uma sequência que possui pelo menos 90% de identidade para a sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 13, e (b) em que a cadeia leve compreende uma segunda região variável, e em que a segunda região variável inclui uma sequência que possui pelo menos 90% de identidade para a sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 14, e (c) em que o anticorpo interage com um ligando de osteoprotegerina (OPGL).

Em determinadas configurações, a primeira região variável compreende uma sequência que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 13, e a segunda região variável compreende uma sequência que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência de aminoácidos nos termos definidos < sm SEQ ID NO: 14. Em determinadas configurações, a primeira região variável compreende uma sequência que possui pelo menos 99% de identidade para a sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 13. e a segunda região variável compreende uma sequência que possui pelo menos 99% de identidade para a sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 14.

Em determinadas configurações, a divulgação permite obter uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência da mesma. Em determinadas configurações, a invenção permite obter uma cadeia pesada que compreende uma região variável e uma região constante, em que a região variável inclui uma sequência de 5 aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 13 ou um fragmento da mesma.

Em determinadas configurações, a divulgação permite obter uma cadeia leve, que compreende uma sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 4 ou um fragmento da mesma, em determinadas configurações, a invenção permite obter uma cadeia leve, que compreende uma sequência de aminoácidos nos termos definidos em SEQ ID NO: 14 ou um fragmento da mesma.

Em determinadas configurações da divulgação, obtêm-se anticorpos de cadeia simples. Em determinadas configurações da invenção, obtêm-se anticorpos Fv de cadeia simples. Em determinadas configurações da invenção, obtêm-se anticorpos Fab. Em determinadas configurações da invenção, obtêm-se anticorpos (Fab') 2.

Em determinadas configurações, obtém-se uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da invenção. Em determinadas configurações, obtém-se uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico de um anticorpo para OPGL.

Em determinadas configurações, uma composição farmacêutica compreende um anticorpo para OPGL e pelo menos um agente terapêutico seleccionado a partir de um factor morfogénico ósseo; factor-β de transformação do crescimento (TGF-β), e inibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-lra, Kineret ™ Anakinra um inibidor TNFa, um receptor solúvel TNFa; Enbrel™ etanercept, um anticorpo anti-TNFa, Remicade™ infliximab, um anticorpo D2E7, uma hormona paratiróide, um análogo de uma hormona paratiróide, uma proteína relacionada com uma hormona paratiróide, um análogo de uma proteína relacionada com uma hormona paratiróide, uma prostaglandina, um bifosfonato, um alendronato, flúor, cálcio, um fármaco anti-inflamatório não esteróide (ΑΙΝΕ), um inibidor de COX-2, Celebrex™ celecoxib 6

Vioxx™, rofecoxib, um imunossupressor, metotrexato, leflunomida, um inibidor de serina protease, um inibidor da protease dos leucócitos (SLPI ou secretory leukocyte protease inhibitor), um inibidor de IL-6, um anticorpo para IL-6, um inibidor de IL-8, um anticorpo para IL-8, um inibidor de IL-18, uma proteina de ligação IL-18, um anticorpo IL-18, um modulador da enzima conversora de interleucina-1 (ICE), um factor de crescimento de fibroblastos (FGF), um modulador FGF, um antagonista PAF, um factor de crescimento de queratinócitos (KGF), uma molécula relacionada com o KGF, um modulador de KGF; um modulador de matriz de metaloproteinase (MMP), um modulador da sintase do óxido nitrico (NOS), um modulador do receptor de glucocorticóide, um modulador do receptor de glutamato, um modulador de niveis de lipopolisacarideo (LPS), uma noradrenalina, uma noradrenalina mimetizada, e um modulador de noradrenalina.

Em determinadas configurações da invenção, o anticorpo da invenção é para um método de tratamento de uma perturbação osteopénica, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo. Em determinadas configurações, a composição farmacêutica da invenção é para um método de tratamento de uma perturbação osteopénica que inclui administrar a composição farmacêutica.

Em determinadas configurações, a composição farmacêutica é para um método de tratamento de uma condição inflamatória com perda óssea concomitante num paciente que inclui administrar a composição farmacêutica.

Em determinadas configurações, a composição farmacêutica é para um método de tratamento de uma condição de auto imunidade com perda óssea concomitante num paciente que inclui administrar a composição farmacêutica. 7

Em determinadas configurações a composição farmacêutica é para um método de tratamento de uma artrite reumatóide num paciente, que inclui administrar a composição farmacêutica da invenção.

Em determinadas configurações da invenção, apresenta-se um método de detector o nivel de OPGL numa amostra biológica, que inclui colocar a amostra em contacto com um anticorpo da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra uma sequência de cADN que codifica a cadeia pesada do anticorpo oíOPGL-1 (SEQ ID NO: 1). [028] A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo oíOPGL-1 (SEQ ID NO: 2). A Figura 3 mostra a sequência de cADN que codifica a cadeia leve do anticorpo aOPGL-1 (SEQ ID NO: 3). A Figura 4 mostra a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo aOPGL-1 (SEQ ID NO: 4) A Figura 5 mostra um diagrama esquemático do plasmideo de expressão da cadeia leve kapa aOPGL-1 aOPGL-l-Kapa/pDSRal9. A Figura 6 mostra um diagrama esquemático do plasmideo de expressão da cadeia pesada oíOPGL-1 IgG2, aOPGL-1-

IgG2/pDSRal9. A Figura 7 mostra a ligação dependente da dose de oíOPGL-1 para placas de EIA revestidas com OPGL. A Figura 8 mostra uma ligação especifica de oíOPGL-1 ao OPGL ligado à membrana A Figura 9 mostra inibição da ligação de aOPGL-1 a placas de EIA revestidas com OPGL por OPGL solúvel. 8 A Figura 10 mostra a ligação especifica de oíOPGL-1 a placas de EIA revestidas com OPGL. A Figura 11 mostra a inibição dependente da dose da formação de osteoclasto por aOPGL-1. A Figura 12 mostra a inibição dependente da dose da ligação OPGL a ODAR por aOPGL-1. A Figura 13 mostra a evolução com o tempo dos perfis de concentração média do soro após administração de uma dose simples de aOPGL-1 a macacos Cynomolgus. A Figura 14 mostra a alteração percentual média da concentração de N-Tx no soro após administração de uma dose simples de aOPGL-1 a macacos Cynomolgus. A Figura 15 mostra a alteração percentual média da concentração de N-Tx na urina após administração de uma dose simples de oíOPGL-1 a macacos Cynomolgus. A Figura 16 mostra a evolução com o tempo dos perfis de concentração no soro de anticorpos positivos e negativos após administração Cynomolgus. de uma dose simples de aOPGL-1 a macacos A Figura 17 mostra a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de anticorpos aOPGL-1 13) . (SEQ ID NO: A Figura 18 mostra a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de anticorpos aOPGL-1 (SEQ ID NO: 14) . A Figura 19 mostra um processo de cultura de células para produção de aOPGL-1. 9 A Figura 20 mostra a alteração percentual de cálcio no soro após administração de uma dose simples de cxOPGL-l a macacos Cynomolgus. A Figura 21 mostra a alteração percentual média da fosfatase alcalina no soro após administração de uma dose simples de oíOPGL-1 a macacos Cynomolgus.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE DETERMINADAS CONFIGURAÇÕES RECOMENDADAS

Os titulos das secções usados no presente documento têm apenas propósitos organizativos e não devem ser interpretados como limitando o tema apresentado.

Definições

Podem ser usadas técnicas padronizadas para ADN recombinante, sintese de oligonucleotideos, e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, electroporação, lipofecção). Podem ser executadas reacções enzimáticas e técnicas de purificação em conformidade com as especificações do fabricante ou tal como normalmente se executam pelos especialistas ou ainda conforme descrito no presente. As técnicas e procedimentos descritos podem ser de uma forma geral executados em conformidade com métodos convencionais bem conhecidos dos especialistas e de acordo com as descrições feitas em várias referências genéricas e outras mais especificas citadas e debatidas ao longo da presente especificação. Ver, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Salvo no caso de serem apresentadas definições especificas, as nomenclaturas usadas em ligação com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de, quimica analitica, quimica orgânica sintética, e quimica medicinal e farmacêutica descritas no presente documento são as já bem conhecidas e correntemente usadas na especialidade. Podem ser 10 usadas técnicas padronizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e administração farmacêuticas, e tratamento de pacientes.

Na utilização que lhes é dada na presente divulgação, os seguintes termos, salvo indicação em contrário, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados: A expressão "polinucleotídeo isolado" tal como utilizada no presente documento pretende significar um polinucleotídeo de origem genómica, cADN, ou sintética ou uma combinação entre estas, a qual devido à sua origem o "polinucleotídeo isolado" (1) não esteja associado com a totalidade ou parte de um polinucleotídeo em que o "polinucleotídeo isolado" se encontra na natureza, (2) esteja ligado a um polinucleotídeo ao qual não se encontre ligado na natureza, ou (3) não ocorra na natureza como pertencendo a uma sequência maior. A expressão "proteína isolada" usada no presente documento significa uma proteína codificada por cADN, ARN recombinante, ou de origem sintética ou uma combinação destas, que (1) está isenta de pelo menos algumas proteínas com as quais é normalmente encontrada, (2) está no essencial isenta de outras proteínas provenientes da mesma origem, por exemplo, da mesma espécie, (3) exprime-se por uma célula proveniente de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza. 0 termo "polipeptídeo" é usado no presente documento como um termo genérico para designar proteínas nativas, ou sequências que apresentam supressões, adições, e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da sequência nativa. 0 termo "polipeptídeo" abrange igualmente cxOPGL-l (nos termos abaixo descritos SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4), ou sequências que apresentam supressões, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de aOPGL-1. Segundo determinadas configurações, a invenção compreende a molécula da 11 imunoglobulina humana de cadeia pesada representada pela Figura 2 (SEQ ID NO: 2) e a molécula da imunoglobulina humana de cadeia leve representada pela Figura 4 (SEQ ID NO: 4). A expressão "de ocorrência natural" tal como usada no presente documento aplicada a um objecto remete para o facto de este objecto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptideos ou polinucleotideos presente num organismo (incluindo virus) que possa ser isolada de uma origem na natureza e que não tenha sido objecto de modificação intencional pelo homem em laboratório ou outra é de ocorrência natural. A expressão "ligado(a) operacionalmente" tal como usada no presente documento remete para componentes que se encontram numa relação que lhes permite funcionarem da forma desejada. Por exemplo, uma sequência de controlo "ligada operacionalmente" a uma sequência de codificação está ligada de tal modo que é possivel obter a expressão da sequência de codificação sob condições compatíveis com as sequências de controlo. A expressão "sequência de controlo" tal como usada no presente documento remete para sequências de polinucleotideos que podem exercer algum efeito sobre a expressão e o processamento de sequências de codificação às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controlo pode diferir consoante o organismo hospedeiro. Segundo determinadas configurações, as sequências de controlo para procariotas podem incluir sequências de promoção, de sitio de ligação ribossómica, e de cessação da transcrição. Segundo determinadas configurações, as sequências de controlo para eucariotas podem incluir sequências de promotores e cessação de transcrição. Em determinadas configurações, as "sequências 12 de controlo" podem incluir sequências principais e/ou sequências parceiras de fusão. 0 termo "polinucleotideo" tal como usado no presente documento significa uma forma polimérica de nucleotideos de comprimento não inferior a 10 bases. Em determinadas configurações, as bases podem ser ribonucleotideos ou desoxirribonucleotideos ou uma forma modificada de qualquer um dos tipos de nucleotideos. O termo inclui formas de ADN de cordão simples e duplo. O termo "oligonucleotídeo" usado no presente documento inclui nucleotideos de ocorrência natural e modificados, ligados entre si por ligações de oligonucleotideos de ocorrência natural e/ou não natural. Os oligonucleotideos são um subconjunto de polinucleotídeos que em geral apresentam um comprimento máximo de 200 bases. Em determinadas configurações, os oligonucleotideos apresentam um comprimento entre 10 e 60 bases. Em determinadas configurações, os oligonucleotideos apresentam comprimentos de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 bases. Os oligonucleotideos podem ser de cordão simples ou de cordão duplo, para utilização, por exemplo, na construção de um gene mutante. Os oligonucleotideos da invenção podem ser oligonucleotideos sense ou antisense. A expressão "nucleotideos de ocorrência natural" inclui desoxirribonucleotideos e ribonucleotideos. A expressão "nucleotideos modificados" inclui nucleotideos com grupos açúcar substituídos e outros semelhantes. A expressão "ligações de oligonucleotideos" inclui ligações de oligonucleotideos tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoaniltioato, fosforoaniladato, fosforoamidato, e outras semelhantes. Ver, por exemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein 13 et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. patente EUA No. 5 151 510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Um oligonucleotídeo pode incluir uma etiqueta para detecção. A identidade e a similaridade de polipeptídeos e afins podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos. Tais métodos incluem, entre outros, os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); e Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

Foram elaborados métodos preferenciais para determinar a identidade, tendo em vista obter a máxima correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade encontram-se descritos em programas informáticos disponíveis ao público. Nos métodos de programas informáticos para determinar a identidade entre duas sequências contam-se, entre outros, a aplicação informática GCG, incluindo GAP (Devereux et ai., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl, BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul et al. , J. Mot. Biol., 215:403-410 (1990)). O programa BLASTX está disponível ao público no National Center for Biotechnology Information (NCBI) e noutras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al. , supra (1990)). Pode 14 também utilizar-se o bem conhecido algoritmo Smith Waterman para determinar a identidade.

Determinados esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos podem resultar na correspondência de apenas uma pequena região das duas sequências, e esta pequena região alinhada pode apresentar uma identidade de sequência muito elevada, ainda que não haja qualquer relação significativa entre todo o comprimento das duas sequências. Assim sendo, em determinadas configurações, o método de alinhamento seleccionado (programa GAP) dá origem a um alinhamento que abrange pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipeptídeo alvo.

Por exemplo, recorrendo ao algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group, Universidade de Wisconsin, Madison, WI), dois polipeptídeos para os quais se pretende determinar um valor percentual de identidade de sequências são alinhados para optimizar a correspondência dos respectivos aminoácidos (o "intervalo combinado", tal como definida pelo algoritmo). Em determinadas configurações, recorre-se a uma penalidade da abertura do espaçamento (que se calcula como 3X a diagonal média; a "diagonal média" é o valor médio da diagonal da matriz de comparação utilizada; a "diagonal" é o resultado ou o número atribuído a cada correspondência perfeita de aminoácidos pela matriz de comparação específica) e a uma penalidade da abertura do espaçamento (que corresponde geralmente a 1/10 da penalidade da abertura do espaçamento), bem como a uma matriz de comparação como PAM 250 ou BLOSUM 62 em conjunto com o algoritmo. Em determinadas configurações, o algoritmo usa também uma matriz de comparação Standard (ver Dayhoff et al, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al, Proc. Natl. Aca., Sei USA, 89:10915-10919 (1992) para a matriz de comparação BLOSUM 62). 15

Em determinadas configurações, os parâmetros para comparação de uma sequência de polipeptídeos inclui o seguinte:

Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970) ;

Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., supra (1992);

Penalidade do intervalo: 12 Penalidade da abertura do espaçamento: 4

Limiar de similaridade: 0 O programa GAP pode ser útil com os parâmetros acima indicados. Em determinadas configurações, os supra mencionados parâmetros são os valores predefinidos dos parâmetros para comparações de polipeptideos (sem qualquer penalidade para intervalos terminais) usando o algoritmo GAP.

Tal como usados no presente documento, os vinte aminoácidos convencionais e respectivas abreviaturas seguem os usos convencionais. Ver Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Estereoisómeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tais como aminoácidos a-, a-dissubstituídos e N-alquilo, ácido láctico, e outros aminoácidos não convencionais podem igualmente ser componentes adequados para polipeptideos da presente invenção. Entre os exemplos de aminoácidos não convencionais contam-se: 4-hidroxiprolina, γ- carboxiglutamato, ε-Ν,N,N-trimetilisina, ε-Ν-acetilisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina, e outros aminoácidos e iminoácidos similares (por exemplo, 4-hidroxiprolina) . Na notação dos polipeptideos usada no presente documento, a direcção para a esquerda indica a 16 direcção do terminal amina e a direcção para a direita indica a direcção do terminal carboxi, em conformidade com os usos normais e as convenções.

De igual modo, e salvo especificação em contrário, a extremidade esquerda de sequências de polinucleotídeos de cordão simples é a extremidade 5'; a direcção para a esquerda de sequências de polinucleotídeos de cordão duplo é referida como a direcção 5'. A direcção da adição de transcrições de ARN nascente de 5' para 3' é referida como a direcção de transcrição; regiões sequenciais no cordão de ADN com a mesma sequência de ARN e que são 5' para a extremidade 5' da transcrição de ARN são referidas como "sequências ascendentes"; regiões sequenciais no cordão de ADN com a mesma sequência de ARN e que são 3' para a extremidade 3' da transcrição de ARN são referidas como "sequências descendentes".

As substituições conservadoras de aminoácidos podem abranger resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, que são normalmente incorporados por síntese química de peptídeos em vez da síntese em sistemas biológicos. Estes incluem peptidomiméticos e outras formas opostas ou inversas de metades de aminoácidos.

Os resíduos que ocorrem classes tendo por base laterais: naturalmente podem dividir-se em propriedades comuns das cadeias D hidrófobo: norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie; 2) hidrófilo neutral: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; 3) ácido: Asp, Glu; 4) básico: His, Lys, Arg; 17 5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e 6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Por exemplo, as substituições não conservadoras podem envolver a permuta de um membro de uma destas classes por um membro de outra classe. Tais resíduos substituídos podem ser introduzidos em regiões do anticorpo humano que são homólogas de anticorpos não humanos, ou em regiões não homólogas da molécula.

Ao efectuar tais alterações, segundo determinadas configurações, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A cada aminoácido é atribuído um índice hidropático tendo por base as suas características de hidrofobicidade e carga. Estas são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (—3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5). A importância do índice hidropático dos aminoácidos resultante de conferir uma função biológica interactiva a uma proteína é analisada no artigo Kyte et al, J. Mol. Biol, 157:105-131 (1982). Sabe-se que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos com um índice ou resultado hidropático similar mantendo ainda assim uma actividade biológica similar. Ao efectuar alterações com base no índice hidropático, em determinadas configurações, está incluída a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estejam dentro do intervalo de ±2, em determinadas configurações, estão incluídos os que estejam 18 dentro do intervalo de ±1, e em determinadas configurações, estão incluidos os que estejam dentro do intervalo de ±0,5. É também do conhecimento dos especialistas que a substituição de aminoácidos parecidos pode fazer-se eficazmente na base da hidrofilicidade, particularmente quando se pretende que a proteina biologicamente funcional ou peptideo assim criado seja usado em configurações imunológicas, como no caso presente. Em determinadas configurações, a hidrofilicidade média local mais elevada de uma proteina, determinada pela hidrofilicidade dos respectivos aminoácidos adjacentes, apresenta uma correlação com a sua imunogenicidade e antigenicidade, ou seja, com uma propriedade biológica da proteina.

Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuidos a estes resíduos de aminoácidos: arginina (±3,0); lisina (±3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina ( + 0,3); asparagina ( + 0,2); glutamina ( + 0,2); glicina (0) ; treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisterna (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Ao efectuar alterações com base no índice hidropático, em determinadas configurações, está incluída a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estejam dentro do intervalo de ±2, em determinadas configurações, estão incluídos os que estejam dentro do intervalo ±1, e em determinadas configurações, estão incluídos os que estejam dentro do intervalo ±0,5. É também possível identificar epítopos provenientes de sequências primárias de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Estas regiões são igualmente designadas por "regiões epitópicas essenciais".

Na Tabela 1 apresentam-se substituições exemplificativas de aminoácidos 19

Tabela 1: Substituições de aminoácidos

Resíduos originais Substituições exemplificativas Substituições recomendadas Ala Vai, Leu, lie Vai Arg Lys, Gin, Asn Lys Asn Gin Gin Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gin Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gin, Lys, Arg Arg lie Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu

Leu Norleucina, lie, Vai, Met, Ala, Phe lie Lys Arg, 1,4 Ácido diaminobutírico, Gin, Asn Arg Met Leu, Phe, lie Leu Phe Leu, Vai, lie, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Vai lie, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu 20

Um técnico experiente será capaz de determinar variantes adequadas do polipeptídeo tal como definidas no presente documento recorrendo a técnicas bem conhecidas. Em determinadas configurações, um especialista pode identificar áreas adequadas da molécula que podem ser modificadas sem que haja destruição da actividade visando regiões que se considere não serem importantes para a actividade, em determinadas configurações, é possivel identificar residuos e porções das moléculas que se conservaram entre polipeptídeos similares. Em determinadas configurações, até mesmo áreas que possam ser importantes para a actividade biológica ou para a estrutura podem estar sujeitas a substituições conservadoras de aminoácidos sem destruição da actividade biológica ou sem prejudicar a estrutura do polipeptideo. Adicionalmente, um especialista pode rever estudos de estrutura-função identificando residuos em polipeptideos similares que sejam importantes para a actividade ou para a estrutura. Atendendo a tal comparação, é possivel prever a importância dos residuos de aminoácidos numa proteína que correspondem a resíduos de aminoácidos importantes para a actividade ou estrutura em proteínas similares. Um especialista pode optar por substituições de aminoácidos similares do ponto de vista químico para estes resíduos de aminoácidos importantes previstos.

Um especialista pode igualmente analisar a estrutura tridimensional e a sequência de aminoácidos relativamente a essa estrutura em polipeptídeos similares. Atendendo a tal informação, um especialista pode prever o alinhamento de resíduos de aminoácidos de um anticorpo relativamente à sua estrutura tridimensional. Em determinadas configurações, um especialista pode optar por não introduzir alterações radicais nos resíduos de aminoácidos previstos para a 21 superfície da proteína, uma vez que tais resíduos podem estar envolvidos em interacções importantes com outras moléculas. Além do mais, um especialista pode criar diferentes ensaios que contenham uma única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido pretendido. As variantes podem então ser examinadas minuciosamente recorrendo a ensaios de actividade conhecidos dos especialistas. Tais variantes podem ser usadas para recolher informação sobre variantes adequadas. Por exemplo, se se descobrir que uma modificação do resíduo de um dado aminoácido dá origem a uma actividade OF inadequada, destruída, indesejavelmente reduzida, as variantes com tal modificação são de evitar. Por outras palavras, tendo por base as informações recolhidas a partir destas experiências de rotina, um especialista pode facilmente determinar os aminoácidos nos quais devem ser evitadas novas substituições, quer isoladas quer em combinação com outras mutações. Há um conjunto de publicações científicas dedicadas à previsão de estruturas secundárias. Ver Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou etal, Adv. Enzymol. Relat. Area. Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al, Ann. Rev. Biochem. , 47:251-276 e Chou et al, Biophys. J., 26:367-384 (1979). Além disto, estão actualmente disponíveis programas informáticos para apoiar a previsão de estruturas secundárias. Um método de prever estruturas secundárias baseia-se na modelação da homologia. Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas que apresentam uma identidade de sequências superior a 30%, ou similaridade superior a 40% apresentam frequentemente topologias estruturais similares. A recente elaboração da base de dados estrutural de proteínas (PDB) permitiu uma melhor previsibilidade de estruturas secundárias, incluindo o 22 potencial número de dobras no interior da estrutura de um polipeptideo ou de uma proteina. Ver Holm et al, Nuci Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Alguns autores (Brenner et a 1 , Curr. Op. Struct Bioi, 7(3):369-376 (1997)) sugeriram que há um número limitado de dobras num dado polipeptideo ou proteina e uma vez resolvido um número critico de estruturas, a precisão estrutural torna-se muitíssimo mais rigorosa. Outros métodos adicionais para prever estruturas secundárias incluem "enroscamento" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol, 7(3):377-87 (1997); Sippl et a 1 , Structure, 4(1):15-19 (1996)), "análise de perfil" (Bowie et al, Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et a 1 , Meth. Enzym., 183:146- 159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sei, 84(13):4355-4358 (1987)), e "ligação evolutiva" (ver Holm, supra (1999), e Brenner, supra (1997)).

Em determinadas configurações, as variantes de anticorpos incluem variantes de glicosilação em que o número e/ou tipo de sítios de glicosilação foi alterado em comparação com as sequências de aminoácidos do polipeptideo matriz. Em determinadas configurações, as variantes de proteínas compreendem um número de sítios de N-glicosilação que pode ser superior ou inferior ao da proteína original. Um sítio de N-glicosilação é caracterizado pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, em que o resíduo de aminoácido designado por X pode ser qualquer resíduo de aminoácido excepto prolina. A substituição de resíduos de aminoácidos para criar esta sequência permite obter um novo sítio potencial para a adição de uma cadeia de N-carboidratos. Em alternativa, as substituições que eliminam esta sequência removem uma cadeia de N-carboidratos existente. Está igualmente previsto um rearranjo de cadeias de N-carboidratos em que um ou mais sítios de N-glicosilação (normalmente, os que ocorrem naturalmente) são eliminados e são criados um ou mais novos sítios com ligação N-. Variantes adicionais recomendadas de 23 anticorpos incluem variantes de cisteina em que um ou mais residuos de cisteina são removidos ou substituidos por outro aminoácido (por exemplo, serina) em comparação com a sequência matriz do aminoácido. As variantes de cisteina podem ser úteis quando os anticorpos têm de ser redobrados numa conformação biologicamente activa como sucede após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. As variantes de cisteina podem, em geral, ter menos residuos de cisteina do que a proteina original, e normalmente possuem um número par para minimizar as interacções resultantes de cisteínas desemparelhadas.

Segundo determinadas configurações, as substituições de aminoácidos são as que: (1) diminuem a susceptibilidade à proteólise, (2) diminuem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram afinidades de ligação para formar complexos proteicos, (4) alteram afinidades de ligação, e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades fisico-quimicas ou funcionais de tais polipeptideos. Segundo determinadas configurações, podem ser feitas substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (em determinadas configurações, substituições conservadoras de aminoácidos) na sequência de ocorrência natural (em determinadas configurações, na porção do polipeptideo exterior ao(s) dominio(s) que constituem os contactos intermoleculares). Em determinadas configurações, normalmente, uma substituição conservador de aminoácidos pode não alterar significativamente as caracteristicas estruturais da sequência matriz (por exemplo, um aminoácido substituto não deve apresentar tendência para quebrar uma hélice que ocorra na sequência matriz, ou interromper outro tipo de estrutura secundária que caracteriza a sequência matriz). Exemplos reconhecidos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptideos encontram-se descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to 24

Protein Structure (C. Branden and J Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton et al. Nature 354:105 (1991). A expressão "fragmento de polipeptídeo" tal como usada no presente documento remete para um polipeptídeo que possui uma supressão do terminal amino e/ou do terminal carboxi. Em determinadas configurações, os fragmentos apresentam um comprimento compreendido entre 5 e 467 aminoácidos. É de referir que, em determinadas configurações, os fragmentos apresentem comprimentos não inferiores a 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ou 450 aminoácidos.

Os análogos de peptídeos são normalmente usados na indústria farmacêutica como fármacos não peptídicos com propriedades análogas às do peptideo modelo. Estes tipos de compostos não peptídicos são denominados de "miméticos de peptídeos" ou "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); e Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Tais compostos são frequentemente desenvolvidos com o auxílio de ferramentas informáticas de modelação molecular. Os miméticos de peptídeos que são estruturalmente similares a peptídeos úteis do ponto de vista terapêutico podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico similar. De uma forma geral, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipeptídeo paradigmático (ou seja, um polipeptídeo que possui uma propriedade bioquímica ou uma actividade farmacológica) , como um anticorpo humano, mas apresentam uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação seleccionada de: -CH2 NH-, -CH2 S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis e trans) , -COCH2-, -CH (OH) CH2-e -CH2 SO-, por métodos bem conhecidos dos especialistas. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência consensual por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D- 25 lisina em vez de L-lisina) pode ser usada em determinadas configurações para criar peptídeos mais estáveis. Adicionalmente, é possível criar peptídeos constrangidos que compreendem uma sequência consensual ou uma variação substancialmente idêntica da sequência consensual por métodos bem conhecidos (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992); por exemplo, adicionando resíduos internos de cisteína capazes de formar pontes dissulfureto intramoleculares que ciclizam o peptídeo. "Anticorpo" ou "peptídeo(s) anticorpo" remetem para um anticorpo intacto, ou um fragmento de ligação do mesmo que compete com o anticorpo intacto para uma ligação específica. Em determinadas configurações, os fragmentos de ligação produzem-se por técnicas de ADN recombinante. Em determinadas configurações, os fragmentos de ligação produzem-se por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação incluem, entre outros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, e anticorpos de cadeia simples. A expressão "cadeia leve" inclui qualquer polipeptídeo com uma sequência de região variável suficiente para conferir especificidade para um OPGL. Uma cadeia pesada com comprimento integral inclui um domínio de região variável, VH, e três domínios de regiões constantes, CH1, CH2, e CH3. 0 domínio VH encontra-se no terminal amina do polipeptídeo, e o domínio Ch3 encontra-se no terminal carboxi. A expressão "cadeia pesada", tal como usada no presente documento, abrange uma cadeia pesada com comprimento integral e fragmentos da mesma. Uma cadeia pesada com comprimento integral inclui um domínio de região variável, VL, e um domínio de região constante, CL. Tal como na cadeia pesada, o domínio da região variável da cadeia leve encontra-se no terminal amina do polipeptídeo. A expressão "cadeia leve" tal como usada no presente documento, abrange uma cadeia leve com 26 comprimento integral e fragmentos da mesma. Um fragmento Fab é compreendido por uma cadeia leve e o CH1 e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação dissulfureto com outra molécula de cadeia pesada. Um fragmento Fab' contém uma cadeia leve e uma cadeia pesada que contém uma porção maior da região constante, entre os domínios ChI e CH2, de modo que seja possível formar uma ligação dissulfureto intercadeia entre duas cadeias pesadas para formar uma molécula F(ab')2. A região Fv compreende as regiões variáveis quer da cadeia pesada quer da cadeia leve, mas não tem as regiões constantes. Os anticorpos de cadeia simples são moléculas Fv em que as regiões variáveis das cadeias pesada e leve foram unidas por uma ligação flexível para formar uma cadeia simples de polipeptídeos que constitui uma região de ligação do antigénio. Os anticorpos de cadeia simples são analisados em pormenor em WO 88/01649 e nas patentes EUA N.° 4 946 778 e 5 260 203.

Um anticorpo bivalente que não seja um anticorpo "multiespecífico" ou "multifuncional", em determinadas configurações, é normalmente considerado como tendo todos os seus sítios de ligação idênticos.

Um anticorpo inibe substancialmente a adesão de um ligando a um receptor quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de receptor ligado ao contra receptor de pelo menos cerca de20%, 40%, 60%, 80%, 85%, ou mais (conforme medição num teste de ligação competitiva in vitro) . 0 termo "epitopo" inclui qualquer determinante polipeptídeo capaz de uma ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Em determinadas configurações, os determinantes de epitopo incluem agrupamentos de moléculas com a superfície quimicamente activa tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforilo, ou sulfonilo, e, em determinadas configurações, podem apresentar características 27 especificas de estrutura tridimensional, e/ou caracteristicas especificas de carga. Um epitopo é uma região de um antigénio que se encontra ligada por um anticorpo. Em determinadas configurações, diz-se que um anticorpo liga especificamente um antigénio quando ele reconhece preferencialmente o seu antigénio alvo numa mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em determinadas configurações, diz-se que um anticorpo liga especificamente um antigénio se a constante de dissociação for <1 nM, em determinadas configurações, se a constante de dissociação for <100 nM, e em determinadas configurações, se a constante de dissociação for <10 nM. O termo "agente" é usado no presente documento para indicar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extracto obtido a partir de materiais biológicos.

Tal como usado no presente documento, o termo "rótulo" ou "rotulado" remete para a incorporação de um marcador detectável, por exemplo, por incorporação de um aminoácido rádio rotulado ou ligação a um polipeptídeo de metades de biotina que pode ser detectado por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou com actividade enzimática que possa ser detectado por métodos ópticos ou colorimétricos). Em determinadas configurações, o rótulo ou marcador podem também ser terapêuticos. São bem conhecidos, e podem ser usados, vários métodos de rotulagem de polipeptídeos e glicoproteinas. Exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, entre outros, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, substâncias fosforescentes de lantanídeos), rótulos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano, (β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimiluminiscentes, grupos biotinilo, epitopos polipeptídicos predefinidos reconhecidos por um 28 relator secundário (por exemplo, sequências de pares de leucina zipper, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínio de ligação de metais, marcadores de epitopo) . Em determinadas configurações, os rótulos são fixados por braços espaçadores de diferentes comprimentos para diminuir uma eventual resistência estérica. A expressão "amostra biológica" tal como usada no presente documento, inclui, entre outras, qualquer quantidade de uma substância proveniente de um ser vivo ou anteriormente vivo. Estes seres vivos incluem, entre outros, seres humanos, ratos, macacos, ratazanas, coelhos e outros animais. Tais substâncias incluem, entre outras, sangue, soro, urina, células, órgãos, tecidos, ossos, medula óssea, gânglios linfáticos, e pele. A expressão "doença osteopénica" inclui, entre outras, osteoporose, osteopenia, doença de Paget, metástases ósseas líticas, periodontite, artrite reumatóide, e perda óssea por motivo de imobilização. Para além destas doenças ósseas, sabe-se que determinados cancros aumentam a actividade dos osteoclastos e induzem a reabsorção óssea, tais como o cancro da mama, o cancro da próstata, e o mieloma múltiplo. Sabe-se hoje que estes cancros produzem factores que dão origem à sobre expressão de OPGL no osso, e conduzem a um aumento do número e da actividade dos osteoclastos. A expressão "agente farmacêutico ou fármaco" tal como usado no presente documento remete para um compostos químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico pretendido quando administrado adequadamente a um paciente. 0 termo "modulador" tal como usado no presente documento, é um composto que muda ou altera a actividade ou função de uma molécula. Por exemplo, um modulador pode provocar um aumento ou diminuição na magnitude de uma certa actividade ou função de uma molécula por comparação com a actividade ou função observada na ausência do modulador. Em determinadas 29 configurações, um modulador é um inibidor, que diminui a magnitude de pelo menos uma actividade ou função de uma molécula. Determinadas actividades e funções de uma molécula incluem, entre outras, afinidade de ligação, actividade enzimática, e transdução de sinal. Determinados inibidores exemplificativos incluem, entre outros, proteínas, peptídeos, anticorpos, pepticorpos, carboidratos ou pequenas moléculas orgânicas. Os pepticorpos encontram-se descritos em, por exemplo, WO01/83525.

Tal como usado no presente documento, "substancialmente pura" significa que uma espécie de objectos é a espécie predominante presente (ou seja, numa base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição). Em determinadas configurações, uma fracção substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objecto compreende pelo menos 50 % (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em determinadas configurações, uma composição substancialmente pura compreende mais de 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de todas as espécies macromolares presentes na composição.

Em determinadas configurações, a espécie objecto é purificada para uma homogeneidade essencial (não podem ser detectadas espécies contaminantes na composição por métodos convencionais de detecção) sendo a composição constituída no essencial por uma única espécie macromolecular. O termo "paciente" inclui tanto sujeitos humanos como animais.

No presente pedido, o uso do singular inclui o plural, salvo especificação em contrário. No presente pedido, o uso de "ou" significa "e/ou", salvo especificação em contrário. Além do mais, o uso do termo "incluindo", bem como de outras formas semelhantes tais como "inclui" e "incluído", não é limitativo. De igual modo, termos como "elemento" ou 30 "componentes" abrangem tanto elementos e componentes que compreendem uma unidade, como elementos e componentes que compreendem mais do que uma subunidade, salvo especificação em contrário. 0 ligando osteoprotegerina (OPGL), um elemento da familia do receptor TNF (factor de necrose tumoral) das citoquinas, está envolvido na formação de osteoclastos. Uma maior actividade dos osteoclastos está correlacionada com um conjunto de perturbações osteopénicas, incluindo osteoporose pós-menopáusica, doença de Paget, metástases ósseas liticas, e artrite reumatóide. Por conseguinte, uma diminuição da actividade de OPGL pode dar origem a uma diminuição na actividade dos osteoclastos e pode reduzir a gravidade das perturbações osteopénicas. Segundo determinadas configurações da invenção, é possível recorrer a anticorpos direccionados para OPGL para tratar perturbações osteopénicas, incluindo, entre outras, as mencionadas acima.

Em determinadas configurações da presente invenção, é apresentado um anticorpo monoclonal totalmente humano contra o ligando de osteoprotegerina humana (OPGL). Em determinadas configurações, são apresentadas sequências de nucleotídeos de codificação, e sequências de aminoácidos que incluem, moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e leve, particularmente sequências que correspondem a regiões variáveis. Em determinadas configurações, são apresentadas sequências que correspondem a regiões definidoras de complementaridade (CDR's), especificamente de CDR1 a CDR3. Segundo determinadas configurações, é igualmente apresentada uma linhagem celular de hibridoma que exprime uma molécula de imunoglobulina e um anticorpo monoclonal. Em determinadas configurações, é apresentado um anticorpo monoclonal humano purificado contra OPGL humana. A capacidade para clonar e reconstruir locl humanos de grande dimensão em cromossomas artificiais de levedura (YACs) e para 31 as introduzir na linha germinal do rato constitui uma abordagem para elucidar os componentes funcionais de loci muito grandes ou grosseiramente representados bem como para produzir modelos úteis de doenças humanas. Além disso, a utilização de tal tecnologia para substituição de loci do rato pelos seus equivalentes humanos pode proporcionar conhecimentos únicos sobre a expressão e regulação de produtos genéticos humanos durante a evolução, respectiva comunicação com outros, e respectivo envolvimento na indução e progressão de doenças.

Uma aplicação prática importante desta estratégia é a "humanização" do sistema imunitário humoral do rato. A introdução dos loci da imunoglobulina humana (Ig) em ratos nos quais foram desactivados os genes Ig endógenos oferece a oportunidade de estudar os mecanismos subjacentes à expressão e montagem programada de anticorpos bem como a sua função no desenvolvimento de células B. Além disso, tal estratégia pode constituir uma fonte para produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos (MAbs). Em determinadas configurações, espera-se que os anticorpos totalmente humanos minimizem as respostas imunogénicas e alérgicas intrínsecas para Mabs do rato ou derivados do rato, e assim, em determinadas configurações, aumentem a eficácia e a segurança dos anticorpos administrados. Em determinadas configurações, podem ser usados anticorpos totalmente humanos no tratamento de doenças humanas crónicas e recorrentes, como osteoporose, inflamação, auto imunidade, e cancro, o que pode envolver a administração repetida de anticorpos. É possível produzir estirpes de rato com deficiência na produção de anticorpos do rato com grandes fragmentos dos loci Ig humanos antecipando o facto de tais ratos poderem produzir anticorpos humanos na ausência de anticorpos do rato. Grandes fragmentos de Ig humano podem preservar a diversidade muito variável dos genes bem como a regulação 32 adequada da produção e expressão de anticorpos. Ao explorar a organização do rato para a diversificação e selecção de anticorpos e a falta de tolerância imunológica às proteínas humanas, o reportório reproduzido de anticorpos humanos nestas estirpes de ratos pode produzir anticorpos com elevada afinidade contra um qualquer antigénio com interesse, incluindo antigénios humanos. Recorrendo à tecnologia de hibridoma, é possivel produzir e seleccionar MABs humanos específicos de antigénios com a especificidade desejada.

Em determinadas configurações, podem usar-se regiões constantes de outras espécies que não humanas juntamente com regiões variáveis humanas.

Estrutura de anticorpo de ocorrência natural

As unidades estruturais de anticorpos de ocorrência natural compreendem normalmente um tetrâmero. Cada um destes tetrâmeros é normalmente constituído por dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeos, possuindo cada par uma cadeia "leve"de comprimento integral (em determinadas configurações, cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" de comprimento integral (em determinadas configurações, cerca de 50-70 kDa). A porção terminal amina de cada cadeia inclui normalmente uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que é normalmente responsável pelo reconhecimento de antigénios. A porção do terminal carboxi de cada cadeia define normalmente uma região constante que pode ser responsável pela função efectora. As cadeias leves humanas classificam-se normalmente como cadeias leves kapa e lambda. As cadeias leves classificam-se normalmente como mu, delta, gama, alfa, ou épsilon, e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. IgG possui várias classes, incluindo, entre outras, IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. IgM possui subclasses que incluem, entre outras, IgMl e IgM2. IgA está de igual modo dividida em subclasses que incluem, entre 33 outras, IgAl e IgA2. Dentro das cadeias leve e pesada de comprimento integral, normalmente, as regiões variável e constante estão ligadas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, incluindo ainda a cadeia pesada uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos. Ver, por exemplo, Fundamental Immunology Ch 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N Y (1939) ) . As regiões variáveis de cada par cadeia leve/pesada formam normalmente o sitio de ligação do antigénio.

As regiões variáveis apresentam normalmente a mesma estrutura genérica de regiões estruturais (FR) relativamente conservadas ligadas por três regiões hiper variáveis, também denominadas regiões determinantes da complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par estão normalmente alinhadas pelas regiões estruturais, que podem possibilitar a ligação a um epítopo especifico. A partir do terminal N para o terminal C, quer as regiões variáveis da cadeia leve quer as da cadeia pesada compreendem normalmente os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio está normalmente em conformidade com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk J. Mol. Biol.. 196:901-917 (1987); Chothiaetal. Nature 342:877-883 (1989).

Anticorpos biespecíficos ou bifuncionais

Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é normalmente um anticorpo híbrido artificial com dois pares diferentes de cadeias leve/pesada e dois sítios de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos segundo uma variedade de métodos entre os quais se podem incluir, nomeadamente, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos de Fab'. Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. 34

Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).

Preparação de anticorpos

Segundo determinadas configurações, a invenção abrange certos anticorpos que se ligam especificamente ao OPGL. Em determinadas configurações, os anticorpos podem ser produzidos por imunização com OPGL de comprimento integral, formas solúveis de OPGL, ou um fragmento deste. Em determinadas configurações, os anticorpos da invenção podem ser policlonais ou monoclonais, e/ou anticorpos recombinantes. Em determinadas configurações, os anticorpos da invenção são anticorpos humanos preparados, por exemplo, por imunização de animais transgénicos capazes de produzirem anticorpos humanos (ver, por exemplo, pedido publicado PCT N.° WO 93/12227) .

Em determinadas configurações, as regiões determinantes da complementaridade (CDRs) das regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um áOPGL-1 podem ser enxertadas em regiões estruturais (FRs) da mesma espécie, ou de outra. Em determinadas configurações, as CDRs das regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um áOPGL-1 podem ser enxertadas em FRs humanas consensuais. Para criar FRs humanas consensuais, em determinadas configurações, alinham-se FRs provenientes de várias sequências humanas de aminoácidos de cadeia pesada ou cadeia leve para identificar uma sequência consensual de aminoácidos. Em determinadas configurações, as FRs das cadeias pesada ou leve do áOPGL-1 são substituídas pelas FRs provenientes de uma cadeia pesada ou de uma cadeia leve diferente. Em determinadas configurações, aminoácidos raros nas FRs das cadeias pesada e leve do áOPGL-1 não são substituídos, enquanto os restantes aminoácidos da FR são substituídos. Aminoácidos raros são aminoácidos específicos que se encontram em posições que habitualmente não ocupam nas 35 FRs. Em determinadas configurações, as regiões variáveis enxertadas de um áOPGL-1 podem ser usadas com uma região constante que seja diferente da região constante do áOPGL-1. Em determinadas configurações, as regiões variáveis enxertadas fazem parte de um anticorpo Fv de cadeia simples. 0 enxerto de CDR encontra-se descrito, por exemplo, nas patentes EUA N.° 6 180 370, 5 693 762, 5 693 761, 5 585 089, e 5 530 101.

Segundo determinadas configurações, os anticorpos da invenção são preparados usando um rato transgénico no qual foi introduzido uma porção substancial do genoma produtor do anticorpo humano mas no qual foi criada uma certa deficiência na produção de anticorpos murinos endógenos. Estes ratos são, pois, capazes de produzirem moléculas de imunoglobulina humana e anticorpos e são deficientes na produção de moléculas de imunoglobulina murina e anticorpos. As tecnologias usadas para obter este resultado são divulgadas nas patentes, pedidos, e referências reveladas nas especificações constantes do presente documento. Em determinadas configurações, é possivel usar métodos tais como os divulgados no pedido publicado PCT N.° WO 98/24893. Ver também Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

Segundo determinadas configurações, anticorpos monoclonais integralmente humanos específicos para OPGL são produzidos do seguinte modo. . Os ratos transgénicos que contêm genes de imunoglobulina humana sãc > imunizados com o antigénio em causa. Obtêm- se células linfáticas (como as células B) provenientes dos ratos que exprimem anticorpos. Tais células recuperadas são fundidas com uma linhagem celular do tipo mielóide para preparar linhagens celulares imortais de hibridoma, e tais linhagens celulares de hibridoma são filtradas e seleccionadas para identificar linhagens celulares que produzem anticorpos específicos para antigénio 36

em causa. Em determinadas configurações, é apresentada a produção de uma linhagem celular de hibridoma que produz anticorpos específicos para OPGL

Em determinadas configurações, os anticorpos da invenção são produzidos por linhagens de hibridoma AMG 6.1, AMG 6.4, AMG 6.5, AMG 7.1, e AMG 7.2. Em determinadas configurações, anticorpos da invenção são produzidos por linhagens de hibridoma AMG 6.1, AMG 6.4, e AMG 6.5. Em determinadas configurações, os anticorpos da invenção ligam-se ao OPGL com uma constante de dissociação (Kd) compreendida entre, aproximadamente, 0,23 e 0,29 nM. Em determinadas configurações da invenção, os anticorpos ligam-se ao OPGL com uma Kd inferior a 0,23 nM.

Em determinadas configurações, os anticorpos da invenção são do isótipo IgG2. Em determinadas configurações da invenção, os anticorpos compreendem uma cadeia leve humana kapa e uma cadeia pesada IgG2. Em determinadas configurações, os anticorpos da invenção foram clonados para expressão em células de mamíferos. Em determinadas configurações, as regiões variáveis dos anticorpos estão ligadas a uma região constante diferente da região constante para o isótipo IgG2. Em determinadas configurações, as modificações conservadoras das cadeias pesada e leve de áOPGL-1 (e correspondentes modificações dos nucleotideos codificadores) produzem anticorpos para OPGL com caracteristicas funcionais e quimicas similares à do áOPGL-1. Em contrapartida, modificações substanciais nas caracteristicas funcionais e/ou quimicas do áOPGL-1 podem ser concretizadas seleccionando as substituições na sequência de aminoácidos das cadeias pesada e leve que diferem significativamente no seu efeito de manter (a) a estrutura da base molecular na área da substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sitio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. 37

Uma "substituição conservadora de aminoácidos", por exemplo, pode envolver uma substituição de um residuo de aminoácido nativo por um residuo não nativo de tal modo que o efeito sobre a polaridade ou carga do residuo de aminoácido nessa posição seja reduzido ou nulo. Além disso, qualquer residuo nativo no polipeptídeo pode também ser substituído por alanina, como foi anteriormente descrito para "mutagénese de procura de alanina".

As substituições de aminoácidos pretendidas (quer sejam conservadoras ou não) podem ser determinadas pelos especialistas no momento em que tais substituições se pretendem. Em determinadas configurações, as substituições de aminoácidos podem ser usadas para identificar resíduos importantes de áOPGL-1, ou para aumentar ou diminuir a afinidade dos anticorpos para OPGL descrita no presente documento

Em determinadas configurações, os anticorpos da presente invenção podem exprimir-se em linhagens celulares diferentes das linhagens celulares de hibridoma. Em determinadas configurações, podem ser usadas anticorpos específicos de codificação de sequências para transformação de uma célula hospedeira de mamífero adequada. Segundo determinadas configurações, a transformação pode fazer-se por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotideos numa célula hospedeiro, incluindo, por exemplo, acondicionar o polinucleotideo num virus (ou num vector virico) e procedendo à transdução de uma célula hospedeiro com o virus (ou o vector) ou por procedimentos de transfecção bem conhecidos, como se exemplifica nas patentes EUA N.° 4 399 216, 4 912 040, 4 740 461, e 4 959 455. Em determinadas configurações, o procedimento de transformação usado pode depender do hospedeiro a transformar. Os métodos para introdução de polinucleotideos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos dos especialistas e incluem, entre outros 38 transfecção mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão do protoplasto, electroporação, encapsulação do(s) polinucleotideo(s) em lipossomas, e micro injecção directa do ADN nos núcleos

As linhagens celulares de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas dos especialistas e incluem, entre outros, inúmeras linhagens celulares imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, entre outras, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), e diversas outras linhagens celulares. Em determinadas configurações, as linhagens celulares podem ser seleccionadas através da determinação das linhagens celulares que possuem niveis de expressão elevados e produzem anticorpos com propriedades constitutivas de ligação ao OPGL.

Segundo determinadas configurações, os anticorpos da invenção são úteis para detectar OPGL em amostras biológicas. Em determinadas configurações, isto permite a identificação de células ou tecidos que produzem a proteina. Em determinadas configurações, os anticorpos que ligam ao OPGL e bloqueiam a interacção com outros compostos de ligação podem possuir um uso terapêutico na modulação da diferenciação de osteoclastos e reabsorção óssea. Em determinadas configurações, os anticorpos para OPGL podem bloquear a ligação do OPGL ao ODAR, de que pode resultar um bloqueio na cascata de transdução do sinal e perda de activação de transcrição mediada de NF-kB. Os ensaios para medir a activação de transcrição mediada de NF-kB usando, por exemplo, um ensaio relator de luciferase, são bem conhecidos dos especialistas. São revelados métodos de tratamento de uma perturbação óssea que compreende a administração de uma quantidade eficaz do ponto de 39 vista terapêutico de um anticorpo para OPGL. São revelados métodos de tratamento de uma perturbação óssea que compreende a administração de uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico de um anticorpo para OPGL e outro agente terapêutico. Em alguns destes métodos o agente terapêutico adicional é administrado numa quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico. Em determinados métodos, a perturbação óssea caracteriza-se por uma perda óssea liquida, incluindo entre outras osteopenia e osteólise. Em determinados métodos, usa-se um tratamento com um anticorpo para OPGL para suprimir a velocidade de reabsorção óssea. Assim, em determinados métodos o tratamento pode ser usado para reduzir a velocidade de reabsorção óssea quando a velocidade de reabsorção óssea é superior ao normal, ou para reduzir a reabsorção óssea para valores inferiores ao nivel normal, para compensar os niveis de formação óssea inferiores ao normal. Em determinados métodos, é possivel testar a ligação dos anticorpos ao OPGL na ausência ou na presença de OPG e analisar a sua capacidade para inibir a osteoclastogénese mediada do OPGL e/ou reabsorção óssea.

As condições que podem ser tratadas em conformidade com determinadas configurações incluem, entre outras, as seguintes: A osteoporose, incluindo, entre outras, a osteoporose primária, a osteoporose endócrina (incluindo entre outras hipertiroidismo, hiperparatiroidismo, síndroma de Cushing, e acromegalia), formas hereditárias e congénitas de osteoporose (incluindo entre outras, osteogénese imperfeita, homocistinúria, síndroma de Menkes, síndroma de Riley-Day), e a osteoporose devida à imobilização das extremidades, doença óssea de Paget (osteitis deformans) em adultos e jovens;

Osteomielite, ou seja, uma lesão infecciosa do osso, que provoca perda óssea; 40

Hipercalcemia, incluindo, entre outras, hipercalcemia resultante de tumores sólidos (incluindo, entre outros, mama, pulmão e rim) e doenças hematológicas malignas (incluindo, entre outros, mieloma múltiplo, linfoma e leucemia), hipercalcemia idiopática, e hipercalcemia associada a hipertiroidismo e perturbações da função renal;

Osteopenia, incluindo, entre outras, osteopenia subsequente a uma cirurgia, osteopenia induzida por administração de esteróides, osteopenia associada a perturbações dos intestinos grosso e delgado, e osteopenia associada a doenças hepáticas e renais crónicas; osteonecrose, ou seja, morte de células ósseas, incluindo, entre outras, osteonecrose associada a lesões traumáticas, osteonecrose associada à doença de Gaucher, osteonecrose associada à anemia da célula falciforme, osteonecrose associada a lúpus eritematoso sistémico, osteonecrose associada a artrite reumatóide, osteonecrose associada a doença periodontal, osteonecrose associada a metástase osteolítica, e osteonecrose associada a outras condições; e perda de cartilagem e erosão da articulação associada a artrite reumatóide.

Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL pode ser usado só ou pelo menos com um agente terapêutico adicional para o tratamento de perturbações ósseas. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL pode ser usado em conjunto com uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico de um agente terapêutico adicional. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser administrados com um anticorpo para OPGL incluem, entre outros, os factores morfogénicos do osso designados BMP-1 a BMP-12; factor-β de transformação do crescimento (TGF-β) e elementos da familia do TGF-β; inibidores de interleucina-1 (IL-1), incluindo, entre outros, IL-lra e derivados da mesma e inibidores Kineret™ anakinra TNFá, incluindo, entre outros, receptores solúveis de TNFá, Enbrel™ etanercept anticorpos anti-TNFá, Remicade™ 41 infliximab e anticorpos D2E7; hormona paratiróide e análogos da mesma; proteína relacionada com paratiróide e análogos da mesma; prostaglandinas da série E; bifosfonatos (tais como alendronato e outros); minerais de reforço ósseo tais como flúor e cálcio; fármacos anti inflamatórios não esteróides (AINEs), incluindo, entre outros, inibidores COX-2, tais como imunosupressores Celebrex celecoxib e Vioxx™ rofecoxib, tais como metotrexato ou leflunomida; inibidores de serina protease, incluindo, entre outros, inibidor da protease dos leucócitos (SLPI); inibidores de 1L-6 (incluindo, entre outros, anticorpos para IL-6), inibidores de IL-8 (incluindo, entre outros, anticorpos para IL-18); inibidores de IL-18 (incluindo, entre outros, proteina de ligação IL-18 e anticorpos IL-18); moduladores da enzima conversora de interleucina-1 (ICE); factores de crescimento de fibroblasto FGF-1 a FGF-10 e moduladores FGF; antagonistas PAF; factor de crescimento de queratinócito (KGF), moléculas relacionadas com KGF, e moduladores de KGF; moduladores de matriz de metaloproteinase (MMP); moduladores da sintase do óxido nitrico (NOS), incluindo, entre outros, moduladores de NOS induzivel; moduladores de receptor de glucocorticóide; moduladores de receptor de glutamato; moduladores de niveis de lipopolisacarideo (LPS) ; e noradrenalina e moduladores e miméticos da mesma.

Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL é usado com agentes terapêuticos específicos para tratar diversas condições inflamatórias, condições de auto imunidade ou outras condições com perda óssea concomitante. Em determinadas configurações, tendo em vista a condição a tratar e o nivel de tratamento pretendido, podem ser administrados dois, três ou mais agentes. Em determinadas configurações, tais agentes podem ser fornecidos em conjunto por inclusão na mesma formulação.. Em determinadas configurações, tais agentes e um anticorpo para OPGL podem 42 ser fornecidos em conjunto por inclusão na mesma formulação. Em determinadas configurações, tais agentes podem ser fornecidos em conjunto por inclusão num kit de tratamento. Em determinadas configurações, tais agentes e um anticorpo para OPGL podem ser fornecidos em conjunto por inclusão num kit de tratamento. Em determinadas configurações, tais agentes podem ser fornecidos separadamente. Em determinadas configurações, quando administrados por terapia genética, os genes que codificam agentes proteicos e/ou um anticorpo para OPGL podem ser incluídos no mesmo vector. Em determinadas configurações, os genes que codificam agentes proteicos e/ou um anticorpo para OPGL podem estar sob o controlo da mesma região promotora, em determinadas configurações, os genes que codificam agentes proteicos e/ou um anticorpo para OPGL podem estar em vectores separados.

Em determinadas configurações, a presente invenção é direccionada para um anticorpo para OPGL e pelo menos um inibidor de interleucina-1 (IL-1) para uso em terapias e métodos de tratamento que usam tais terapias. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL e um inibidor de IL-1 e pelo menos uma molécula adicional são usados numa terapia. Em determinadas configurações, inibidores IL-1 e/ou inibidores TNF-á são usados em conjunto com um anticorpo para OPGL em métodos de tratamento em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL em combinação com inibidores IL-1 e/ou inibidores TNF-á é para o tratamento de condições como a asma, artrite reumatóide e esclerose múltipla. A interleucina-1 (IL-1) é uma citoquina anti-inflamatória. Em alguns exemplos, IL-1 é um mediador em inúmeras doenças e condições médicas. Em alguns exemplos, IL-1 é fabricado por células da linhagem macrófago/monócito. Em alguns exemplos, IL-1 é produzido em duas formas: IL-1 alfa (IL-1 á) e IL-1 beta (IL-Ιβ) . 43

Uma doença ou condição médica é considerada uma "doença mediada por interleucina-1" se a doença espontânea ou experimental ou a condição médica estiverem associadas a elevados niveis de IL-1 nos fluidos ou no tecido corporal e/ou se as células ou tecidos retirados do corpo produzirem elevados niveis de IL-1 em cultura. Em determinadas configurações, tais doenças mediadas por interleucina-1 podem também ser reconhecidas pelas seguintes duas condições adicionais: (1) os resultados patológicos associados à doença ou condição médica podem ser mimetizados experimentalmente em animais por administração de IL-1 ou regulação ascendente de expressão de IL-1; e (2) uma patologia induzida em modelos animais experimentais da doença ou da condição médica pode ser inibida ou abolida por tratamento com agentes que inibem a acção de IL-1. Em determinadas configurações, uma ou mais das condições supra são satisfeitas numa doença mediada por IL-1. Em determinadas configurações, todas as três condições são satisfeitas numa doença mediada por IL-1.

Doenças agudas ou crónicas mediadas por interleucina-1 (IL-1) incluem, entre outras, as seguintes: pancreatite aguda; esclerose lateral amiotrófica (ALS, ou doença de Lou Gehrig); doença de Alzheimer; caquexia/anorexia, incluindo, entre outras, caquexia induzida por SIDA; asma e outras doenças pulmonares; aterosclerose; vasculite auto imune; sindrome da fadiga crónica; doenças associadas ao Clostridium, incluindo, entre outras, diarreia associada ao Clostridium; condições e indicações coronárias, incluindo, entre outras, insuficiência cardíaca congestiva, reestenose coronária, enfarte do miocárdio, disfunção do miocárdio (por exemplo, relacionado com sepsia), e cirurgia de revascularização com bypass das artérias coronárias; cancro, incluindo, entre outras, leucemias, incluindo, entre outras, leucemia de mieloma múltiplo e mielogénica (por exemplo, AML e CML), e metástases de tumores; diabetes (incluindo, entre outras, diabetes 44 endometriose; insulino-dependente); endometriose; febre; fibromialgia; glomerulonefrite; doença do transplante contra o hospedeiro e/ou rejeição de transplantes; choque hemorrágico; hiperalgesia; doença inflamatória do intestino; condições inflamatórias de uma articulação, incluindo, entre outras, osteoartrite, artrite psoriática, e artrite reumatóide; doença ocular inflamatória, incluindo, entre outras, as associadas com, por exemplo, transplante da córnea; isquemia, incluindo, entre outras, isquemia cerebral (incluindo, entre outras, lesões cerebrais em resultado, por exemplo, de trauma, epilepsia, hemorragia ou acidente vascular cerebral, cada um dos quais pode provocar neurodegeneração) ; doença de Kawasaki; deficiências de aprendizagem; doenças pulmonares (incluindo, entre outras, sindrome de insuficiência respiratória do adulto, ou ARDS); esclerose múltipla; miopatias (por exemplo, metabolismo de proteina muscular, incluindo, entre outras, metabolismo de proteína muscular em sepsia); neurotoxicidade (incluindo, entre outras, condições induzidas pelo HIV); osteoporose; dor, incluindo, entre outras, dor relacionada com cancro; doença de Parkinson; doença periodontal; parto prematuro; psoríase; lesão de reperfusão; choque séptico; efeitos secundários de radioterapia; disfunção da articulação temporomandibular; perturbações do sono; uveite; e uma condição inflamatória resultante, por exemplo de distensão, entorse, degradação da cartilagem, trauma, cirurgia ortopédica ou outros processos de doença.

Em determinadas configurações, um inibidor de IL-1 pode ser qualquer proteina ou molécula capaz de especificamente impedir a activação de receptores celulares para IL-1, o que pode ser o resultado de qualquer número de mecanismos. Os exemplos de mecanismos incluem, entre outros, regulação descendente da produção de IL-1, ligação isenta IL-1, interferindo com a ligação de IL-1 ao seu receptor, 45 interferindo com a formação do complexo receptor IL-1 (ou seja, associação do receptor IL-1 com a proteina acessória do receptor IL-1), e interferindo com a modulação da sinalização de IL-1 depois da ligação ao seu receptor.

Determinados inibidores de interleucina-lincluem, entre outros, antagonistas receptores de IL-1, incluindo, entre outros, variantes de Kineret™ anakinra IL-lrat IL-lra, e derivados de IL-lra, designados no seu conjunto por ''proteinas IL-lra;" anticorpos monoclonais do receptor anti-IL-1 (ver, por exemplo, EP 623674), proteinas de ligação IL-1, incluindo, entre outros, receptores IL-1 solúveis (ver, por exemplo, Pat. EUA N.° 5 492 888, Pat. EUA N.° 5 488 032, e Pat. EUA N.° 5 464 937, Pat. EUA N.° 5 319 071, e Pat. EUA N.° 5 180 812, anticorpos monoclonais anti-IL-1 (ver, por exemplo, WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, Pat. EUA N.° 4 935 343, EP 364778, EP 26761-1 e EP 220063, proteinas acessórias do receptor IL-1 e anticorpos das mesmas (ver, por exemplo, WO 98/23067 e WO 99/37773 inibidores da enzima conversora da interleucina-1 beta (ICE) ou caspase I (ver, por exemplo, WO 99/46248, WO 99/47545, e WO 99/47154 que podem ser usadas para inibir a produção e secreção de IL-1 beta; inibidores de beta protease de interleucina-1; e outros compostos e proteinas que bloqueiam a sintese in vivo ou a libertação extracelular de IL-1. São divulgados exemplos de inibidores de IL-1, por exemplo, nas patentes EUA N.° 5 747 444; 5 359 032; 5 608 035; 5 843 905; 5 359 032; 5 866 576; 5 869 660; 5 869 315; 5 872 095; 5 955 480; 5 965 564; pedidos de patentes internacionais (WO) 98/21957, 96/09323, 91/17184, 96/40907, 98/32733, 98/42325, 98/44940, 98/47892, 98/56377, 99/03837, 99/06426, 99/06042, 91/17249, 98/32733, 33/17661, 97/08174, 95/34326, 99/38426, 99/36415. Pedidos de patentes europeias (EP) 534978 e 894795; e pedidos de patentes francesas FR 2762514. 46 0 antagonista receptor da interleucina-1 (IL-lra) é uma proteína humana que funciona como um inibidor natural de interleucina-1 e é membro da família dos IL-1, que inclui IL-la e IL-1 p. Determinados antagonistas receptores, incluindo IL-lra e variantes e derivados dos mesmos, bem como métodos e os fazer e utilizar, estão descritos na Pat. EUA N.° 5 075 222; WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221; WO 93/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626, WO 94/20517; WO 96/22793; WO 97/28828; e WO 99/36541. Em determinadas configurações, é possível que um antagonista receptor IL-1 seja glicosilado. Em determinadas configurações, é possível que um antagonista receptor IL-1 não seja glicosilado.

As três formas de IL-lra e variantes da mesma estão descritas na patente EUA N.° 5 075 222 (a patente '222) . A primeira forma, denominada "IL-1" na patente '222, é caracterizada com uma molécula 22-23 kD em SDS-PAGE com um ponto isoeléctrico aproximado de 4 8, cuja eluição se faz a partir de uma coluna Mono Q FPLC em cerca de 52 mM NaCl em tampão Tris, pH 7,6. A segunda forma, IL-1 rap, caracteriza-se como uma proteína 22-23 kD, cuja eluição se faz a partir de uma coluna Mono Q em 48 mM NaCl. Tanto IL-lraá como IL-lrah são glicosilados. A terceira forma, IL-1 rax, caracteriza-se como uma proteína 20 kD, cuja eluição se faz a partir de uma coluna Mono Q em 48 mM NaCl e é não glicosilada. A patente '222 descreve igualmente determinados métodos para isolar genes que codificam para os inibidores, clonando esses genes em vectores adequados, transformando e transferindo esses genes para determinados tipos de células, e para exprimir esses genes para produzir os inibidores.

Em determinadas configurações, são feitas supressões, inserções e/ou substituições (individual ou colectivamente designadas por variante (s) 'j dentro das sequências de 47 aminoácidos de IL-lra. Em determinadas configurações, uma variante de IL-lra está biologicamente activa (por exemplo, possui a capacidade de inibir IL-1).

Em determinadas configurações, a presente invenção é direccionada para um anticorpo para OPGL e pelo menos um inibidor TNFá para usar em terapias e métodos de tratamento que usam tais terapias. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL e um inibidor TNFá e pelo menos uma molécula adicional descrita no presente documento são para uso numa terapia.

Determinadas doenças e condições médicas são mediadas por TNF e podem ser classificadas como condições inflamatórias. Tal como usada no presente documento, uma "doença mediada por TNF" inclui, entre outras, uma doença ou condição médica associada a niveis elevados de TNF em fluidos ou tecidos corporais e/ou em que as células ou tecidos retirados do corpo produzem niveis elevados de TNF em cultura. Em determinadas configurações, uma doença é uma doença mediada por TNF se (1) os resultados patológicos associados à doença ou condição médica puderem ser mimetizados experimentalmente em animais pela administração ou regulação ascendente de expressão de TNF e/ou (2) uma patologia da doença ou condição médica induzida em modelos animais experimentais puder ser inibida ou abolida por tratamento com agentes que inibem a acção de TNF.

Determinadas doenças agudas e crónicas mediadas por TNF incluem, entre outras: caquexia e anorexia; cancro, incluindo, entre outras, leucemia; sindrome de fadiga crónica; condições e/ou indicações coronárias, incluindo, entre outras, insuficiência cardíaca congestiva, reestenose coronária, enfarte do miocárdio, disfunção do miocárdio (incluindo, entre outras, estando tal condição relacionada com sepsia), e cirurgia de revascularizção com bypass das artérias coronárias; depressão; diabetes, incluindo, entre 48 outras, diabetes tipo 1 em crianças e jovens, diabetes mellitus, e resistente à insulina (incluindo, entre outras, resistência à insulina associada a obesidade); endometriose, endometrite, e condições conexas; fibromialgia e analgesia; rejeição do transplante contra o hospedeiro; hiperalgesia; doenças inflamatórias do intestino, incluindo, entre outras, doença de Crohn e diarreia associada a Clostridium difficile; isquemia, incluindo, entre outras, isquemia cerebral, que inclui, entre outras, leões cerebrais em resultado de trauma, epilepsia, hemorragia, e/ou acidente vascular cerebral; doenças pulmonares, incluindo, entre outras, sindrome de insuficiência respiratória do adulto, asma, e fibrose pulmonar; esclerose múltipla; doenças neuroinflamatórias; doenças e condições oculares, incluindo, entre outras, transplante da córnea, degeneração ocular e uveite; dor, incluindo, entre outras, dor relacionada com cancro; pancreatite; doenças periodontais; pitiriase rubra pilaris (PRP); prostatite, incluindo prostatite bacteriana e não bacteriana, e condições conexas; psoríase e condições conexas; fibrose pulmonar; lesão de reperfusão; doenças reumáticas, incluindo, entre outras, artrite reumatóide, osteoartrite, artrite juvenil (incluindo, entre outras, artrite reumatóide juvenil), poliartrite seronegativa, espondilite anquilosante, sindrome de Reiter e artrite reactiva, doença de Still, artrite psoriática, artrite enteropática, polimiosite, dermatomiosite, esclerodermia, esclerose sistémica, vasculite (por exemplo, doença de Kawasaki), vasculite cerebral, doença de Lyme, artrite induzida por estafilococos ("séptica")/ sindrome de Sjõgren, febre reumática, policondrite e polimialgia reumática e doença de Horton); choque séptico; efeitos secundários de radioterapia; lupus eritematoso sistémico (SLE); disfunção da articulação temporomandibular; tiroidite; e transplantação de tecidos e/ou uma condição inflamatória, por exemplo, 49 resultante de distensão, entorse, degradação da cartilagem, trauma, cirurgia ortopédica, infecção (por exemplo, HIV,

Clostridium difficile e espécies conexas) ou outros processos de doença.

Em determinadas configurações, os inibidores de TNF podem funcionar por pelo menos um destes mecanismos: regulação descendente da produção de TNF, ligação do TNF livre, interferindo com a ligação de TNF ao seu receptor, e interferindo com a modulação da sinalização de TNF depois da ligação ao seu receptor. A expressão "inibidor de TNF" inclui, entre outros, receptores de TNF solubilizados, incluindo, entre outros, receptor solúvel do factor de necrose tumoral do tipo I (sTNF-RI; também denominado receptor p55), receptor solúvel do factor de necrose tumoral do tipo II (também denominado receptor p75), e anticorpos Enbrel™ etanercept para TNF, incluindo, entre outros,

Remicade™ infliximab e D2E7 (ver, por exemplo, patente EUA N.° 6 090 382 e 6 258 562); anticorpos para receptor TNF; sTNF-RI (ver, por exemplo, WO 98/24463), etanercept (Enbrel™), Avakine™; inibidores de enzima conversora de TNF-á (TACE); e outras moléculas que afectam a actividade do TNF. Exemplos de inibidores de TNF-á estão descritos, por exemplo, nos pedidos de patentes europeias EP 308 378; EP 422 339; EP 393 438; EP 398 327; EP 412 486; EP 418 014, EP4 1 7 563, EP433 900; EP 464 533; EP512 528; EP 526 905; EP 568 928; EP 607 776, que descreve a utilização de leflunomida para inibição de TNF-á; EP 663 210; EP 542 795; EP 818 439; EP 664 128; EP 542 795; EP 741 707; EP 874 819; EP 882 714; EP 880 970; EP 648 783; EP 731 791; EP 895 988; EP 550 376; EP 882 714; EP 853 083; EP 550 376; EP 943 616; EP 939 121; EP 614 984; EP 853 083; patentes EUA N.° 5 136 021; 5 929 117; 5 948 638; 5 807 862; 5 695,953; 5 834 435; 5 817 822; 5 830 742; 5 834 435; 5 851 556; 5 853 977; 5 359 037; 5 512 544; 5 695 953; 5 811 261; 5 633 145; 5 863 926; 5 866 616; 5 641 673; 5 50 869 677; 5 869 511; 5 872 146; 5 854 003; 5 856 161; 5 877 222; 5 877 200; 5 877 151; 5 886 010; 5 869 660; 5 859 207; 5 891 883; 5 877,180; 5 955 480; 5 955 476; 5 955 435; 5 994 351; 5 990 119; 5 952 320; 5 962 481; pedidos de patentes internacionais WO 90/13575, WO 91/03553, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/15221, WO 93/07863, WO 93/21946, WO 93/19777, WO 95/34326, WO 96/28546, WO 98/27298, WO 98/30541, WO 96/38150, WO 96/38150, WO 97/18207, WO 97/15561, WO 97/12902, WO 96/25861, WO 96/12735, WO 96/11209, WO 98/39326, WO 98/39316, WO 98/38859, WO 98/39315, WO 98/42659, WO 98/39329, WO 98/43959, WO 98/45268, WO 98/47863, WO 96/33172, WO 96/20926, WO 97/37974, WO 97/37973, WO 97/47599, WO 96/35711, WO 98/51665, WO 98/43946, WO 95/04045, WO 98/56377, WO 97/12244, WO 99/00364, WO 99/00363, WO 98/57936, WO 99/01449, WO 99/01139, WO 98/56788, WO 98/56756, WO 98/53842, WO 98/52948, WO 98/52937, WO 99/02510, WO 97/43250, WO 99/06410, WO 99/06042, WO 99/09022, WO 99/08683, WO 99/07679, WO 99/09965, WO 99/07704, WO 99/06041, WO 99/37818, WO 99/37625, WO 97/11668, WO 99/50238, WO 99/47672, WO 99/48491; pedidos de patentes japonesas 10147531, 10231285, 10259140, e 10130149, 10316570, 11001481, e 127 800/1991; pedido alemão n.° 19731521; e pedidos ingleses n.° 2 218 101, 2 326 881, 2 246 569. EP 393 438 e EP 422 339 descrevem as sequências de aminoácidos e ácido nucleico de um receptor solúvel de TNF do tipo I (também conhecido como sTNFR-I ou inibidor 30kDa TNF) e um receptor solúvel de TNF do tipo II (também conhecido como sTNFR-II ou inibidor 40kDa TNF), designados no seu conjunto como "sTNFRs". EP 393 438 e EP 422 339 descrevem também formas de sTNFR-I e sTNFR-II, incluindo, entre outros fragmentos, derivados funcionais e variantes. Além disso, EP 393 438 e EP 422 339 descrevem métodos para isolar genes que codificam para os inibidores, clonando os genes em vectores adequados, transformando ou transferindo os genes para 51 determinados tipos de células, e exprimindo os genes para produzir os inibidores. sTNFR-I e sTNFR-II são membros da super família de receptores do factor de crescimento do nervo/receptor TNF, que inclui o receptor do factor de crescimento do nervo (NGF), o antigénio da célula CD40B, 4-1BB, o antigénio MRC OX40da célula T do rato, o antigénio fas, e os antigénios CD27 e CD30 (Smith et al. (1990) Science, 248:1019-1023). Uma característica desse grupo de receptores de superfície da célula que se conservou é um domínio de ligação ao ligando extra celular rico em cisteína, que se pode dividir em quatro motivos repetidos de cerca de 40 aminoácidos que contêm 4-6 resíduos de cisteína em posições que estão bem conservadas (Smith et al. (1990), supra). EP 393 438 reporta um inibidor TNF 40kDa Δ51 e um inibidor TNF 40kDa Δ53, que são versões truncadas da proteína do inibidor de TNF recombinante 40kDa de comprimento integral. Δ 51 e Δ 53 possuem 51 ou 53 aminoácidos, respectivamente, eliminados do terminal carboxi da proteína madura. O pedido publicado PCT N.° WO 98/01555 descreve formas truncadas de sTNFR-I e sTNFR-II que não contêm o quarto domínio (resíduos de aminoácidos Thr127-Asn161 de sTNFR-I e resíduos de aminoácidos Pro141-Thr179 de sTNFR-II) ; uma porção do terceiro domínio (resíduos de aminoácidos Asnin-Cys126 de sTNFR-I e resíduos de aminoácidos Pro123-Lys140 de sTNFR-II) ; e, em opção, não contêm uma porção do primeiro domínio (resíduos de aminoácidos Asp1- Cys19 de sTNFR-I e resíduos de aminoácidos Leu^Cys32 de sTNFR-II) . Em determinadas configurações, os sTNFRs truncados incluem as proteínas representadas pela fórmula Ri- [Cys19-Cys103] -R2 e R4-[Cys32 Cys115]-R5. Estas proteínas são formas truncadas de sTNFR-I e sTNFR-II, respectivamente.

Nos termos usados no presente documento, "Ri- [Cys19-Cys103] -R2" representa uma ou mais proteínas em que [Cys19-Cys103] são 52 resíduos 19 a 103 de sTNFR-I, cuja sequência é apresentada na Figura 1 de WO 98/01555; em que Ri representa um grupo amino de Cys19 metionilado ou não metionilado ou um ou mais resíduos de aminoácidos de terminal amino seleccionados de Cys18 a Asp1; e em que R2 representa um grupo carboxi de Cys103 ou um ou mais resíduos de aminoácidos de terminal carboxi seleccionados a partir de Phe104 a Leu110

Exemplos truncados de sTNFR I' s para uso com a presente invenção incluem, entre outros, sTNFR-I 2 6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-Ι 26D/N105, sTNFR-Ι 23D/d8, sTNFR-I 2.3D/dl8, sTNFR-Ι 2.3D/dl5, metionilado ou não metionilado, e variantes e derivados dos mesmos. Determinados exemplos truncados de sTNFR-Ι's estão descritos, por exemplo, no pedido publicado PCT N.° WO 98/01555.

Nos termos do presente documento, "R3-[Cys32~Cys115]-R4" representa uma ou mais proteínas em que [Cys32-Cys115] são resíduos Cys32 a Cys115 de sTNFR-11, cuja sequência é apresentada na Figura 8 de WO 98/01555; em que R3 representa um grupo amina metionilado ou não metionilado de Cys32 ou um ou mais resíduos de aminoácidos de terminal amina seleccionados de Cys31 a Leul; e em que R4 representa um grupo carboxi de Cyst15 ou um ou mais resíduos de aminoácidos de terminal carboxi seleccionados de Ala116 a Arg122 Em determinadas configurações, a presente invenção está direccionada para um anticorpo para OPGL e pelo menos um inibidor de serina protease para uso numa terapia e métodos de tratamento que usam tais terapias. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL e um inibidor de serina protease e pelo menos uma molécula adicional descrita no presente documento são usadas numa terapia.

As enzimas proteolíticas endógenas podem degradar organismos invasores, complexos de antigénios-anticorpos, e determinadas proteínas de tecidos que deixaram de ser necessários ou úteis. Os agentes infecciosos podem introduzir enzimas 53 proteolíticas adicionais no organismo. Os inibidores de protease podem regular tanto as enzimas proteoliticas endógenas como as invasoras.

Em determinadas configurações, os inibidores de protease de ocorrência natural servem para controlar as proteases endógenas limitando as suas reacções local e temporalmente. Em determinadas configurações, os inibidores de protease podem inibir as proteases introduzidas no corpo por agentes infecciosos. Em determinados exemplos, os tecidos particularmente susceptiveis ao ataque e infecção proteolitica, incluindo, entre outros, os do aparelho respiratório, são ricos em inibidores de protease.

Os inibidores de protease compreendem cerca de 10% de proteínas do plasma humano. Pelo menos oito inibidores foram isolados a partir desta fonte e caracterizados na literatura. Estes incluem, entre outros, alfa 2-macroglobulina (alfa 2M), inibidor de alfa 1-protease (alfa 1PI), alfa 1-antiquimotripsina (alfa lAchy), alfa 1-anticolagenase (alfa 1AC), e inibidor de inter-alfa-tripsina (I-alfa-I),

Em determinados casos, uma perturbação do equilíbrio protease/inibidor de protease pode levar à destruição do tecido mediado pela protease, incluindo, entre outros, enfisema, artrite, glomerulonefrite, periodontite, distrofia muscular, invasão tumoral, e várias outras condições patológicas. Em determinadas situações, por exemplo, processos patológicos graves como sepsia ou leucemia aguda, a quantidade enzimas proteoliticas livre presentes pode aumentar por motivo da libertação de enzima por células secretoras.

Adicionalmente, em determinados casos, uma menor capacidade do organismo em regular o inibidor pode igualmente provocar alterações no equilíbrio protease/inibidor de protease. Um exemplo não limitativo de tal capacidade diminuída de regulação do inibidor é uma deficiência do inibidor alfa 1- 54 protease, que está correlacionada com o desenvolvimento de enfisema pulmonar.

Em determinados casos, o organismo pode sofrer danos graves caso se estas condições anómalas de verificarem, salvo se forem tomadas medidas para controlar as enzimas proteolíticas. Por conseguinte, procuraram-se inibidores de protease que pudessem ser administrados a um organismo no sentido de controlar as enzimas proteoliticas.

Elastase dos leucócitos, tripsina, catepsina G, e elastase pancreática são exemplos não limitativos de uma classe de proteases conhecidas como serina proteases.

Em determinados casos, a elastase dos leucócitos, quando libertada extra celularmente, degrada o tecido conectivo e outras proteínas importantes. Enquanto um organismo que funcione normalmente degrada uma certa quantidade de tecido conectivo e outras proteínas, a presença de uma quantidade excessiva de elastase de leucócitos pode estar associada a vários estados patológicos, incluindo, entre outros, enfisema e artrite reumatóide. Em determinadas configurações, para contrabalançar os efeitos de uma quantidade de elastase dos leucócitos superior à normal, procurou-se um inibidor de protease que fosse específico da elastase dos leucócitos. Um tal inibidor de protease pode ser útil se for possível isolá-lo ou prepará-lo numa forma pura e em quantidades suficientes para ter utilidade farmacêutica.

Determinados inibidores de elastase de leucócitos encontram-se descritos em, por exemplo, Schiessler et al., "Acid-Stable Inhibitors of Granulocyte Neutral Proteases in Human Mucous Secretions: Biochemistry and Possible Biological Function", em Neutral Proteases of Human Polymorphoneuclear Leucocytes, Havemann et al. (eds) , Urban and Schwarzenberg, Inc. (1978), e em Travis and Salvesen, Ann. Rev. Biochem. 52: 655-709 (1983). 55

Em determinados casos, a tripsina inicia a degradação do tecido mole de um dado órgão, como o tecido pancreático, por exemplo, no decurso de uma variedade condições aguda, incluindo, entre outras, pancreatite. Um inibidor de tripsina pode ser útil se for possível isolá-lo e prepará-lo numa forma pura e em quantidades suficientes para ter utilidade farmacêutica. A catepsina G é outra protease presente em leucócitos, em determinadas configurações, a catepsina G é capaz de degradar uma variedade proteínas in vitro, incluindo as da via complementar. A elastase pancreática é outra protease que pode desempenhar uma função na pancreatite. Assim, os inibidores destas proteases podem também possuir valor farmacêutico.

Em determinadas configurações, pensa-se que a especificidade e sensibilidade do substrato para diferentes inibidores de serina proteases resultam das alterações num reduzido número de resíduos de aminoácidos. Por analogia, pode ser possível preparar uma classe de inibidores de serina protease na qual as alterações de um número relativamente reduzido de aminoácidos resultam na inibição de diferentes proteases. Em determinadas configurações, um membro desta classe inibe qualquer serina protease.

Um exemplo de inibidor de serina protease é o inibidor da protease dos leucócitos (SLPI) e fragmentos e análogos do mesmo. Exemplos de inibidores de serina protease incluem também, entre outros, anti-leucoprotease (ALP), inibidor da protease mucosa (MPI), inibidor do plasma seminal humano-1 (HUSI-I), inibidor do mucus bronquial (BMI), e inibidor do mucus cervical (CUSI). Em determinadas configurações, um inibidor de serina protease pode também ser modulador de LPS. Ver, por exemplo, Jin et al. (1997), Cell 88 (3): 417-26. Em determinadas configurações, estão moléculas estão muito bem adaptadas para utilização em condições que provocam perda 56 óssea porque estão preferencialmente direccionadas para a cartilagem.

Exemplos de inibidores estão descritos em, por exemplo, patente EUA N.° 4 760 130; patente EUA N.° 5 900 400; e patente EUA N.° 5 633 227. As moléculas divulgadas nas referências anteriores bem como todas as variantes ou análogos das mesmas designam-se no seu conjunto por "inibidores de serina protease." O IL-18 é uma citoquina pró-inflamatória que se descobriu induzir interferon-ã e foi anteriormente denominada factor de indução de interferon gama (IGIF). Em determinados casos, mostrou-se que o IL-1 fazia a regulação ascendente da produção de IL-18, e o IL-18 induz a produção de um conjunto de citoquinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6 e MMP-1. Ver, por exemplo, Dinarello et al. (1998), J. Leukocyte Biol. 63: 655-64. Em determinados casos, a caspase I é também importante para a produção de IL-18. As experiências sugerem igualmente que TNF-á regula a produção de IL-18, e que a inibição simultânea de TNF-á e IL-18 constitui uma protecção contra a toxicidade hepática. Ver, por exemplo, Faggioni et al, (2000), PNAS 97: 2367-72. IL-18 actua in vivo através de um sistema receptor reminiscente do sistema IL-1. IL-18 interage com um receptor da superfície da célula (IL-18R), que interage com uma proteína acessória (IL-18RAcP). A sinalização mediada por IL-18 evolui após a formação do complexo de IL-18, IL-18R, e IL-18RAcP. Um inibidor natural para IL-18 é o IL-18bp. Em determinadas configurações, IL-18bp actua como um "receptor decoy" ligando-se a moléculas de IL-18 e impedindo a interacção com IL-18R.

Em determinadas configurações, a presente invenção está direccionada para um anticorpo para OPGL e pelo menos um inibidor IL-18 para uso numa terapia e métodos de tratamento que usam tais terapias. Em determinadas configurações, um 57 anticorpo para OPGL e um inibidor IL-18 e pelo menos uma molécula adicional descrita no presente documento são para usar numa terapia. Exemplos de condições que podem ser tratadas em conformidade com determinadas configurações incluem, entre outras, inflamação, doenças auto-imunes, doenças mediadas por IL-1, e doenças mediadas por TNF. Exemplos de condições que podem ser tratadas com um anticorpo para OPGL e pelo menos um inibidor IL-18 em conformidade com determinadas configurações incluem, entre outras, artrite, incluindo, entre outras, artrite reumatóide; lupus eritematoso sistémico (SLE); doença do transplante contra o hospedeiro (GvHD); hepatite; sepsia; e a perda de osso e cartilagem que acompanha estas doenças.

Exemplos de inibidores IL-18 incluem, entre outros, anticorpos que ligam a IL-18; anticorpos que ligam a IL-18R; anticorpos que ligam a IL-18RAcP; IL-18bp; fragmentos de IL-18R (por exemplo, um domínio extra celular solubilizado do receptor); peptídeos que ligam a IL-18 e reduzem ou impedem a sua interacção com IL-18R; peptídeos que ligam a IL-18R e reduzem ou impedem a sua interacção com IL-18 ou com IL-18RAcP; peptídeos que ligam a IL-18RAcP e reduzem ou impedem a sua interacção com IL-18R; e pequenas moléculas que reduzem ou impedem a produção de IL-18 ou a interacção entre IL-18, IL-18R,e IL-18RAcP

Determinados inibidores IL-18 estão descritos, por exemplo, na patente EUA N.° 5 912 324, emitida em 14 de Julho de 1994; EP 0 962 531, publicada em 8 de Dezembro de 1999; EP 712 931, publicada em 15 de Novembro de 1994; patente EUA N.° 5 914 253, emitida em 14 de Julho de 1994; WO 97/24441, publicada em 10 de Julho de 1997; patente EUA N.° 6 060 283, emitida em 9 de Maio de 2000; EP 850 952, publicada em 26 de Dezembro de 1996; EP 864 585, publicada em 16 de Setembro de 1998; WO 98/41232, publicada em 24 de Setembro de 1998; patente EUA N.° 6 054 487, emitida em 25 de Abril de 2000; WO 99/09063, 58 publicada em 14 de Agosto de 1997; WO 99/22760, publicada em 3 de Novembro de 1997; WO 99/37772, publicada em 23 de Janeiro de 1998; WO 99/37773, publicada em 20 de Março de 1998; EP 0 974 600, publicada em 26 de Janeiro de 2000; WO 00/12555, publicada em 9 de Março de 2000; pedido de patente japonesa JP 111,399/94, publicado em 31 de Outubro de 1997; pedido de patente israelita IL 121554 AO, publicado em 8 de Fevereiro de 1998).

Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL pode ser usado com pelo menos um agente terapêutico para inflamação. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL pode ser usado com pelo menos um agente terapêutico para uma doença imunitária. Exemplos de agentes terapêuticos para inflamações e perturbações imunitárias incluem, entre outros, corticosteróides, incluindo, entre outros, prednisolona; fármacos anti-inflamatórios não esteróides (AINEs), incluindo, entre outros, inibidores ciclooxigenase tipo 1 (COX-1) e ciclooxigenase tipo 2 (COX-2); fármacos anti-reumáticos modificadores da doença (DMARDs), incluindo, entre outros, metotrexato, hidroxicloroquina, cloroquina, ciclosporina, compostos de ouro (tais como auranofina, aurotiomalato e aurotioglucose), e leflunomida; inibidores fosfodiesterase tipo IV, incluindo, entre outros, Rolipram e Pentoxifylline; Tacrolimus (FK-506); Sirolimus (rapamicina); ácido micofenólico; inibidores 5-lipoxigenase, incluindo, entre outros, Zileuton; moduladores de interleucina-6 (1L-6); moduladores de molécula pequena de quinase proteina activada pelo mitogénio 38 kDa (p38-MAPK) ; moduladores de molécula pequena de moléculas intracelulares envolvidas em vias inflamatórias, incluindo tais moléculas intracelulares, entre outras, jnk, IKK, NF-κΒ, ZAP70, e Ick. Alguns exemplos de agentes terapêuticos estão descritos, por exemplo, em C.A. Dinarello and L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-inf lammatorv Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for 59

Clinicians Third Edition (2001). Amgen Inc. Thousand Oaks OA. Alguns exemplos de agentes terapêuticos para inflamação e doenças auto-imunes incluem, entre outros, moduladores interferon gama (IFN-γ); moduladores de OX40/OX40L (incluindo formas solúveis de 0X40); moduladores do ligando 4-1BB/4-1BB (incluindo formas solúveis de 4-1BB); e moduladores de vias co-estimuladoras de células B - células T, incluindo, entre outros, moduladores dos pares receptor ligando CD28/B7, CD40/CD40L, ICOS/B7RP1, e AGP-3/TACI/BAFFR (AGP-3 liga-se tanto ao receptor TACI como ao receptor BAFFR). Alguns exemplos de moduladores de vias co-estimuladoras de células B - células T incluem, entre outros, inibidores de CD28, B7.1, e B7.2 (incluido formas solúveis de B7.1 ou B7.2 e formas solúveis de CTLA4, podendo ambas ser fundidas para dar um peptideo heterólogo ou proteina que reduz ou impede a degradação e/ou aumenta a semi-vida, reduz a toxicidade, reduz a imunogenicidade, ou aumenta a actividade biológica de uma proteina terapêutica aumentando a solubilidade ou a semi-vida circulatória); inibidores de CD40 e CD40L (incluindo formas solúveis de CD40 podendo ser fundidas para dar um peptideo heterólogo ou proteina); inibidores de ICOS e B7RP1 (incluindo formas solúveis de ICOS podendo ser fundidas para dar um peptideo heterólogo ou proteina) e inibidores de AGP-3, TACI e BAFFR (incluindo formas solúveis de TACI e BAFFR). Os inibidores ICOS, B7RP1 e outros estão descritos, por exemplo, em WO00/46240. Os inibidores AGP-3, TACI e BAFFR e outros estão descritos, por exemplo, em WOOO/47740, WOOl/85872, WO02/15273, W098/39361, e von Bulow e Bram (1997) Science 278:138-140.

Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL é usado para tratar perda óssea, incluindo, entre outras, perda óssea resultante de destruição osteolitica do osso causada por tumores malignos ou metastizados. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL pode ser usado para 60 perda óssea associada a cancro. Exemplos de cancros incluem, entre outros, cancros da mama, da próstata, da tiróide, do rim, do pulmão, do esófago, do recto, da bexiga, cervical, dos ovários, e do figado, para além do cancro do aparelho gastrointestinal. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL é usado para tratar perda óssea associada, por exemplo, a certas doenças hematológicas malignas, incluindo, entre outros, mieloma múltiplo e linfoma, incluindo doença de Hodgkin.

Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL é apenas para administração. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL é para administração com pelo menos um outro agente terapêutico, incluindo, entre outros, pelo menos um outro agente anticancerigeno. Exemplos de agentes anticancerigenos incluem, entre outros, radioterapia e quimioterapia. Em determinadas configurações, a quimioterapia pode envolver tratamento com um ou mais dos seguintes: antraciclinas, taxol, tamoxifeno, doxorubicina, 5-fluorouracil, e outros fármacos conhecidos dos especialistas. Em determinadas configurações, um agente anticancerigeno é um antagonista da hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH). Em determinadas configurações, um antagonista LHRH é um antagonista peptidico.

Em determinadas configurações, um antagonista LHRH compreende o peptideo: Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D-Phe-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-lys (iPr) -Pro-D-Ala NH2 (SEQ ID NO: 20), em que Nal é 3-(2-naftil) alaninilo; 4-CI-Phe é (4'- clorofenil) alaninilo; Pal é 3-(3'-piridil) alaninilo; e Lys(iPr) é N-epsilon-2-propil-lisinilo.

Em determinadas configurações, um antagonista LHRH é um antagonista decapeptídico LHRH. Determinados exemplos de decapeptideos estão descritos, por exemplo, na patente EUA N.° 5 843 901. 61

Exemplos de anticorpos terapêuticos segundo determinadas configurações incluem, entre outros, rato, quimérico rato-humano, CDR-enxertado, anticorpos humanizados e integralmente humanos, e anticorpos sintéticos, incluindo, entre outros, os seleccionados por pesquisa em bibliotecas de anticorpos. Exemplos de anticorpos incluem, entre outros, os que ligam proteínas da superfície celular Her2, CDC20, CDC33, glicoproteína do tipo mucina, e receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) presente em células tumorais, e induzem em opção um efeito citostático e/ou citotóxico sobre células tumorais que apresentam estas proteínas. Exemplos de anticorpos incluem também HERCEPT1N™ (trastuzumab) , que pode ser usado para tratar cancro de mama e outras formas de cancro, e RITUXAN™ (rituximab), ZEVALIN™ (ibritumomab tiuxetan) , e LYMPHOCIDE™ (epratuzumab, que pode ser usado para tratar linfoma não Hodgkin e outras formas de cancro. Certos exemplos de anticorpos incluem também ERBITUX™ (IMC-C225), BEXXAR™ (iodo 131 tositumomab), e Campath.

Em determinadas configurações, os agentes anticancerígenos são polipeptídeos que induzem selectivamente a apoptose em células tumorais, incluindo, entre outros, o polipeptídeo TRAIL relacionado com o TNF. Em determinadas configurações, um anticorpo ao OPGL pode ser administrado pelo menos antes de, em simultâneo com, ou subsequentemente ao tratamento com um agente anticancerígeno. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL pode ser administrado profilacticamente para impedir ou mitigar o início da perda óssea por cancro metastizado. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL pode ser administrado para o tratamento de uma condição existente de perda óssea devida a metástases.

Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL é usado para impedir e/ou tratar perda óssea associada a mieloma múltiplo e/ou impedir e/ou tratar a própria doença. 0 mieloma múltiplo é um tumor derivado de uma célula B que pode dar 62 origem a uma morbilidade e/ou mortalidade elevadas. Em determinados casos, uma manifestação clinica do mieloma múltiplo é a perda óssea focalizada, que se pode dever a uma maior activação de osteoclastos em regiões localizadas. Muitos pacientes com mieloma apresentam lesões ósseas visíveis em análise radiológica e sofrem dores esqueléticas. Em determinados casos, os pacientes com mieloma apresentam susceptibilidade a fracturas patológicas do osso envolvido, que podem ocorrer espontaneamente ou devido a lesão. Em determinadas casos, as lesões esqueléticas que ocorrem durante o mieloma conduzem não só a fracturas ósseas, mas também e deformidades e, ocasionalmente, compressão de nervos, particularmente na coluna vertebral. Em alguns pacientes, ocorre um aumento patológico de cálcio no soro (hipercalcemia) , e pode criar problemas significativos durante o tratamento da doença. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL pode ser administrado a pacientes para reduzir ou bloquear a reabsorção óssea e libertar cálcio, o que pode reduzir o risco de fracturas e deformações raquidianas.

Em determinados casos, as células do mieloma não participam directamente na destruição óssea, mas em vez disso produzem sinais extra celulares que levam à diferenciação e activação de osteoclastos. Em determinados casos, os osteoclastos produzem elevados níveis da citoquina IL-6, particularmente quando são activados. IL-6 é um factor de crescimento das células B, e contribui para o crescimento in vitro tanto da murina como das células do mieloma humano. As células do mieloma podem também produzir OPGL directa ou indirectamente, de que pode resultar uma lise óssea local circundante às células do mieloma incorporado nos espaços da medula óssea. Em determinados casos, por seu lado, os osteoclastos normais adjacentes às células do mieloma produzem IL-6, o que pode levar a uma expansão local das células tumorais. As células 63 do mieloma expandem-se de uma forma clonal e podem ocupar espaços ósseos que se criam devido a uma reabsorção óssea inadequada.

Observou-se que a administração de OPG a roedores induz a morte rápida de população de osteoclastos (ver, por exemplo, Lacey et al. (2000) Am. J. Pathol. 157:435-448). Uma redução no número de osteoclastos pode compensar o efeito da produção crescente de IL-6 por essas células e pode, por conseguinte, afectar o crescimento e a sobrevivência das células do mieloma dentro do osso trabecular. Assim, em determinadas configurações, a administração de um anticorpo para OPGL a um paciente com mieloma pode não só bloquear a hiper reabsorção do osso, mas também afectar a expansão e sobrevivência do próprio tumor.

As células B exprimem o receptor para OPGL, ODAR. As células do mieloma também exprimem ODAR, e podem adicionalmente produzir OPGL. Em determinados casos, a expressão tanto de OPGL como de ODAR na mesma população de células pode criar um estimulo autócrino que afecta a sobrevivência das células do mieloma. Assim, em determinadas configurações, a administração de um anticorpo para OPGL pode reduzir a sobrevivência das células tumorais, diminuindo assim ou eliminando a carga do tumor que se observa em pacientes com mieloma.

Em determinadas configurações, a invenção disponibiliza composições farmacêuticas que incluem uma quantidade com eficácia terapêutica de um anticorpo para OPGL em conjunto com diluente, suporte, solubilizante, emulsionante, conservante e/ou adjuvante com aceitação farmacêutica.

Em determinadas configurações, a invenção disponibiliza composições farmacêuticas que incluem uma quantidade com eficácia terapêutica de um anticorpo para OPGL da invenção e uma quantidade com eficácia terapêutica de pelo menos um agente terapêutico adicional, em conjunto com diluente, 64 suporte, solubilizante, emulsionante, conservante e/ou adjuvante com aceitação farmacêutica. Em determinadas configurações, o agente terapêutico eventualmente presente é seleccionado a partir de factores morfogénicos do osso designados BMP-1 a BMP-12; factor-β de transformação do crescimento (TGF-β) e elementos da família do TGF-β; inibidores de interleucina-1 (IL-1), incluindo, entre outros, IL-lra e derivados do mesmo e inibidores Kineret™ anakinra TNFá, incluindo, entre outros, receptor solúvel TNFá, Enbrel, etarnercept, anticorpos anti-TNFá. Remicade™, infliximab e anticorpo CJ2E7; hormona paratiróide e análogas da mesma, proteína relacionada com a paratiróide e análogas da mesma; prostaglandinas da série E; bifosfonatos (tais como alendronato e outros); minerais de reforço ósseo tais como flúor e cálcio; fármacos anti-inflamatórios não esteróides (AINEs), incluindo inibidores COX-2, tais como imunossupressores Celebrex, celecoxib e Vioxx™ rofecoxib, tais como metotrexato ou leflunomida; inibidores de serina protease tais como inibidor da protease dos leucócitos (SLPI); inibidores IL-6 (por exemplo, anticorpos para IL-6), inibidores IL-8 (por exemplo, anticorpos para IL-8); inibidores IL-18 (por exemplo, proteína de ligação IL-18 ou anticorpos IL-18); moduladores da enzima conversora de interleucina-1 (ICE); factores de crescimento de fibroblasto FGF-1 para FGF-10 e moduladores FGF; antagonistas PAF; factor de crescimento de queratinócito (KGF), moléculas relacionadas com KGF, ou moduladores KGF; moduladores de matriz de metaloproteinase (MMP); moduladores de sintase de óxido nítrico (NOS), incluindo moduladores de NOS induzível; moduladores de receptor de glucocorticóide; moduladores de receptor de glutamato; moduladores de níveis de lipopolisacarídeo (LPS); e noradrenalina e moduladores e miméticos da mesma. 65

Em determinadas configurações, os materiais de formulação aceitáveis são preferencialmente aqueles que não se revelarem tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas.

Em determinadas configurações, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, a osmolaridade, a viscosidade, a transparência, a cor, a isotonicidade, o odor, a esterilidade, a estabilidade, a taxa de dissolução ou de libertação, a adsorpção ou a penetração da composição. Em determinadas configurações, os materiais de formulação adequados incluem, entre outros, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); aditivos de volume (como manitol ou glicina); aditivos quelantes (como ácido etilenodiamino-tetracético (EDTA)); aditivos complexantes (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacarídeos; disacarídeos; e outros carboidratos (como glucose, manose ou dextrinas); proteínas (como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas); aditivos corantes, aromatizantes e diluentes; aditivos emulsionantes; polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contraiões formadores de sal (como sódio); conservantes (como cloreto de benzalcónio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool de fenetil, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogénio); solventes (como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol); álcoois de açúcar (como manitol ou sorbitol); aditivos de suspensão; aditivos surfactantes ou molhantes (tais como plurónicos, PEG, ésteres 66 de sorbitan, polissorbatos tais como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); aditivos para melhorar a estabilidade (como sacarose ou sorbitol); aditivos para melhorar a tonicidade (como halogenetos de metais alcalinos, preferencialmente cloreto de sódio ou potássio, manitol sorbitol); veiculos de administração; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed. Mack Publishing Company (1990).

Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL e/ou uma molécula terapêutica está ligada a um veiculo que prolonga a semi-vida conhecido dos especialistas. Tais veiculos incluem, entre outros, o dominio Fc, polietilenoglicol, e dextrano. Tais veiculos são descritos, por exemplo, no pedido de séria EUA N.° 09/428,082 e pedido publicado PCT N.° WO 99/25044.

Em determinadas configurações, a composição farmacêutica óptima pode ser definida por um especialista em função, por exemplo, da via de administração pretendida, do formato de administração e da dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Em determinadas configurações, tais composições podem influenciar o estado fisico, a estabilidade, a velocidade de libertação in vivo e a velocidade de eliminação in vivo dos anticorpos da invenção.

Em determinadas configurações, o veiculo primário ou suporte numa composição farmacêutica pode ser aquoso ou não aquoso. Por exemplo, em determinadas configurações, um veiculo adequado pode ser água para injecção, soro fisiológico ou fluido cerebrospinal artificial, eventualmente complementado com outros materiais correntes em composições para administração parenteral. Em determinadas configurações, solução salina tamponada ou misturada com albumina do soro constituem outros exemplos de veiculos. Em determinadas 67 configurações, as composições farmacêuticas compreendem tampão Tris com um pH aproximado de 7,0-8,5, ou tampão acetato com um pH aproximado de 4,0-5,5, que pode ainda incluir sorbitol ou um substituto apropriado do mesmo. Em determinadas configurações, uma composição que compreende um anticorpo para OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional pode ser preparada para armazenagem misturando a composição seleccionada com o grau desejado de pureza com aditivos de formulação opcionais (Remington ' s Pharmaceutical Sciences, supra,) sob a forma de bolo liofilizado ou de solução aquosa. Além disso, em determinadas configurações, uma composição que compreenda um anticorpo para OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser formulada como um produto liofilizado usando excipientes adequado como a sacarose.

Em determinadas configurações, as composições farmacêuticas da invenção podem ser seleccionadas para administração parenteral. Em determinadas configurações, as composições podem ser seleccionadas para inalação ou para administração através do aparelho digestivo, nomeadamente por via oral. A preparação destas composições farmacêuticas aceitáveis está no âmbito dos conhecimentos da especialidade.

Em determinadas configurações, os componentes da formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis para o local da administração. Em determinadas configurações, usam-se tampões para manter a composição no pH fisiológico ou ligeiramente inferior, normalmente num intervalo de pH entre 5 e 8.

Em determinadas configurações, se a administração prevista for por via parenteral, a composição terapêutica pode assumir a forma de uma solução aquosa isenta de pirogénio, aceitável do ponto de vista parenteral que compreende o anticorpo desejado para OPGL, com ou sem agentes terapêuticos adicionais, num veiculo com aceitação farmacêutica. Em 68 determinadas configurações, um veiculo para injecção parenteral é constituído por água esterilizada na qual o anticorpo para OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, é formulado sob a forma de solução esterilizada e isotónica, devidamente preservada. Em determinadas configurações, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tais como microesferas injectáveis, partículas biodegradáveis, compostos poliméricos (como ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), pérolas ou lipossomas, que possam efectuar a libertação controlada ou sustentada do produto que se possa então administrar por via de uma injecção depot. Em determinadas configurações, é também possível usar ácido hialurónico, que pode ter o efeito de promover uma duração sustentada na circulação. Em determinadas configurações, é possível usar dispositivos implantáveis de administração dos fármacos para introduzir a molécula desejada.

Em determinadas configurações, é possível formular uma composição farmacêutica para inalação. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser formulado para inalação sob a forma de pó seco. Em determinadas configurações, é possível formula uma solução de inalação que compreende um anticorpo para OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional com um propulsor para administração por aerossol. Em determinadas configurações, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar está também descrita no pedido PCT n.° PCT/US94/001875, que descreve a administração pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.

Em determinadas configurações, está previsto que as formulações sejam administradas por via oral. Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, que seja 69 administrado desta forma pode ser formulado com ou sem esses suportes habitualmente usados na preparação de formas sólidas de dosagem, tais como comprimidos e cápsulas. Em determinadas configurações, é possível preparar uma cápsula para libertar a fracção activa da formulação no ponto do aparelho gastrointestinal que permite maximizar a biodisponibilidade e minimizar a degradação presistémica. Em determinadas configurações, pode ser incluído pelo menos um agente adicional para facilitar a absorção do anticorpo ao OPGL e/ou qualquer agente terapêutico adicional. Em determinadas configurações, podem também ser usados diluentes, aromatizantes, ceras com baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, aditivos de suspensão, aditivos de desintegração de comprimidos, e ligantes.

Em determinadas configurações, uma composição farmacêutica podem envolver uma quantidade efectiva de anticorpos ao OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, numa mistura com excipientes não tóxicos que sejam adequados para o fabrico de comprimidos. Em determinadas configurações, a dissolução dos comprimidos em água esterilizada ou noutro veículo apropriado, permite a preparação de soluções na forma de dose unitária. Em determinadas configurações, os excipientes adequados incluem, entre outros, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose, ou fosfato de cálcio; ou agentes ligantes, tais como amido, gelatina, ou acácia; ou aditivos lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, ou talco.

Outras composições farmacêuticas serão evidentes para os especialistas, incluindo formulações que envolvem anticorpos ao OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, em formulações de administração sustentada ou controlada. Em determinadas configurações, as técnicas para formular uma variedade de outros meios para administração 70 sustentada ou controlada, tais como suportes de lipossoma, micropartículas biodegradáveis ou pérolas porosas e injecção depot, são também bem conhecidas na especialidade. Ver, por exemplo, pedido PCT N.° PCT/US93/00829 que descreve a libertação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a administração de composições farmacêuticas. Em determinadas configurações, as preparações para libertação sustentada podem incluir matrizes poliméricas semipermeáveis sob a forma de artigos moldados, por exemplo películas, ou microcápsulas. As matrizes de libertação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (EUA 773 919 e EP 058,481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxi-etil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) e Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), acetato de vinil etileno (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133 988). Em determinadas configurações, as composições para libertação sustentada podem incluir também lipossomas, que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos na especialidade. Ver, por exemplo, Eppstein et al, Proc. Natl . Acad. Sei. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036 676; EP 088 046 e EP 143 949. A composição farmacêutica a utilizar na administração in vivo é normalmente esterilizada. Em determinadas configurações, isto pode obter-se por filtração através de membranas de filtração esterilizadas. Em determinadas configurações em que a composição está liofilizada, a esterilização recorrendo a este método pode ser feita antes ou depois da liofilização e reconstituição. Em determinadas configurações, a composição para administração parenteral pode ser guardada sob forma liofilizada ou em solução. Em determinadas configurações, as composições parenterais são geralmente colocadas num recipiente com uma porta de acesso 71 esterilizada, por exemplo, um saco ou pequeno frasco de solução intravenosa dispondo de uma tampa perfurável por uma agulha hipodérmica de injecção.

Em determinadas configurações, depois de formulada a composição farmacêutica, esta pode ser guardada em pequenos frascos esterilizados como solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, ou pó desidratado ou liofilizado. Em determinadas configurações, tais formulações podem ser guardadas quer sob uma forma pronta a utilizar, quer sob uma forma (por exemplo, liofilizada) que permita a sua reconstituição antes da administração. A presente divulgação inclui kits para preparar uma unidade de administração unidose. Em determinadas configurações, cada um dos kits pode conter tanto um primeiro recipiente contendo uma proteina seca, como um segundo recipiente com uma formulação aquosa. Em determinadas configurações da presente invenção, estão incluídos kits que contêm seringas previamente cheias com uma ou mais câmaras (por exemplo, seringas para líquidos e seringas lyo).

Em determinadas configurações, a quantidade efectiva de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo para OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, a usar para fins terapêuticos dependerá, por exemplo, do contexto e dos objectivos da terapia. Assim, um especialista verificará que os níveis adequados da dosagem para tratamento em conformidade com determinadas configurações, variam consoante, em parte, a molécula a administrar, a indicação para a qual se vai usar o anticorpo para OPGL, com ou sem a utilização de pelo menos um agente terapêutico adicional, a via de administração, e o tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e/ou condição (idade e estado geral de saúde) do paciente. Em determinadas configurações, o clínico pode regular a dosagem e modificar a via de administração para optimizar o efeito terapêutico. Em 72 determinadas configurações, uma dosagem tipica pode começar em cerca de 0,1 ig/kg até cerca de 100 ig/kg ou mais, dependendo dos factores acima mencionados, em determinadas configurações, a dosagem pode variar de 0,1 ig/kg até cerca de 100 ig/kg; ou 1 ig/kg até cerca de 100 mg/kg; ou 5 ig/kg até cerca de 100 ig/kg.

Em determinadas configurações, a frequência da dosagem toma em consideração os parâmetros farmacocinéticos do anticorpo para OPGL e/ou qualquer agente terapêutico adicional na formulação usada. Em determinadas configurações, o clinico administra a composição até alcançar uma dosagem que proporcione o efeito desejado. Em determinadas configurações, a composição pode pois ser administrada com dose única, ou em duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão continua por via da implantação de um dispositivo ou cateter. O refinamento adicional da dosagem adequada é efectuado por rotina pelos técnicos da especialidade e encontra-se no âmbito das tarefas normalmente executadas por eles. Em determinadas configurações, as dosagens adequadas podem ser avaliadas recorrendo a dados adequados de dosagem-resposta .

Em determinadas configurações, a via de administração da composição farmacêutica está conforme os métodos conhecidos, por exemplo, oralmente, através de injecção intravenosa, intra-peritoneal, intra-cerebral (intra-parenquimal), intra-cerebroventricular, intra-muscular, intra-ocular, intra-arterial, intra-portal, ou intralesional; por dispositivos de libertação sustentada ou por dispositivos de implantação. Em determinadas configurações, as composições podem ser administradas por injecção de bólus ou continuamente por infusão, ou através de dispositivos de implantação.

Em determinadas configurações, a composição pode ser administrada localmente por via de implantação de uma 73 membrana, esponja ou outro material adequado no qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Em determinadas configurações, caso seja usado um dispositivo de implantação, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e administração da molécula desejada pode ser feitas por via de difusão, bólus de libertação temporizada, ou administração continua.

Em determinadas configurações, pode ser desejável usar uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo para OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, de uma forma ex vivo. Em tais casos, as células, os tecidos e/ou os órgãos que tenham sido retirados do paciente são expostos a uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo para OPGL, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, após o que as células, os tecidos e/ou os órgãos são subsequentemente reimplantados no paciente.

Em determinadas configurações, um anticorpo para OPGL e/ou qualquer agente terapêutico adicional pode ser administrado implantando certas células que foram geneticamente modificadas, recorrendo a métodos tais como os descritos no presente, para exprimir e segregar os polipeptideos. Em determinadas configurações, tais células podem ser animais ou humanas, e podem ser autólogas, heterólogas, ou xenogénicas. Em determinadas configurações, as células podem ser imortalizadas. Em determinadas configurações, tendo em vista reduzir a possibilidade de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar a infiltração de tecidos circundantes. Em determinadas configurações, os materiais de encapsulação são normalmente invólucros poliméricos ou membranas biocompativeis, semi-permeáveis que permitem a libertação do(s) produto (s) proteicos mas impedem a destruição das células pelo sistema imunitário do paciente ou por outros factores lesivos dos tecidos circundantes. EXEMPLOS 74

Os exemplos seguintes, incluindo as experiências conduzidas e os resultados obtidos são apresentados apenas a titulo exemplificativo e não devem ser interpretados como limitando a presente invenção.

Exemplo 1

Clonagem das cadeias pesada e leve de áOPGL-1

As células de CHO que exprimem OPGL cADN humano de comprimento integral são utilizadas para imunizar ratos transgénicos contendo genes de imunoglobulina humana. Os nodos linfáticos dos ratos imunizados são fundidos com células de mieloma de murina para dar origem a hibridomas. Os sobrenadantes das linhagens do hibridoma são ensaiados num teste ELISA para detectar anticorpos que reajam com OPGL humano. Encontram-se anti-OPGL exprimindo linhagem de hibridoma AMG 6.5, AMG 6.4, e AMG 6.1 para exprimir anticorpos com elevada afinidade para OPGL (Kd's de 0,28 nM, 0,29 nM, e 0,23 nM, respectivamente), e selecciona-se AMG 6.5 para clonagem. Clones de cADN de cadeia pesada e leve provenientes de AMG 6.5 e AMG 6.4 são idênticos, e usa-se AMG 6.5 para clonar o cADN de cadeia leve áOPGL-1, enquanto o AMG 6.4 é usado para clonar o cADN de cadeia pesada áOPGL-1.

Clonagem da cadeia leve de áOPGL-1 A região variável da cadeia leve kapa do áOPGL-1 é obtida usando métodos de amplificação PCR a partir do primeiro cordão de cADN preparado a partir de AMG 6.5 total ARN. O primeiro cordão de cADN é preparado a partir de AMG 6.5 total ARN usando um primer aleatório com um adaptador 5' prolongado (5'-GGCCGGATAGGCCTCACNNNNNNT-3' (SEQ ID NO: 15)) e os materiais e métodos disponibilizados pelo kit Gibco Superscript II ™ Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (cat. n.° 18089-011). Os oligonucleotideos abaixo são usados para o PCR:

Primer RACE kapa 5': 75

5' - GAT GAC CCA GTC TCC AGC CAC CCT G - 3' (SEQ ID NO: 5) 3' kapa RACE primer: 5' - AAG GGT GAG AGG CCA AAG GAT GG - 3' (SEQ ID NO: 6) [0203] Os ADNs amplificados são clonados em pCRII-TOPO (Invitrogen) e os plasmídeos resultantes são sequenciados. A sequência consensual da cadeia kapa é usada para preparar primers para amplificação de PCR da cadeia kapa de áOPGL-1 de comprimento integral. O primer kapa 5' áOPGL-1 incorpora um sitio Xbal (TCTAGA) para clonagem e uma sequência "CCACC" Kozak antes do codão Met iniciador. O primer kapa 3' áOPGL-1 incorpora um sitio Sa/1 (GTCGAC) a seguir ao codão de paragem para clonagem.

Primer kapa 5' áOPGL-1: 5 ' -CAA CTC TAG A CC ACC ATG GAA ACC CCA GCG-3' (SEQ ID NO: 7)

Xbal Site Kozak ΜΕΤΡΑ (SEQ ID NO: 16)

Primer kapa 3' áOPGL-1 5i-TTT GAC GTC GAC TTA TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA G -3' (SEQ ID NO: 8)

Sa/1 Site * * C E G R N F (SEQ ID NO: 17) O clone cADN da cadeia kapa áOPGL-1 de comprimento integral é obtido usando o AMG 6.5 primeiro cordão cADN, acima descrito, por amplificação PCR com os primers kapa 5' e 3' áOPGL-1. A reacção PCR dá origem a um fragmento de 738 bp que codifica os 235 resíduos de aminoácidos (incluindo a sequência de sinal da cadeia kapa de 20 aminoácidos) da cadeia kapa do áOPGL-1 (Figura 4, SEQ ID NO: 4). Na sequência da purificação usando um kit de purificação QIAquick PCR (Qiagen cat. n.° 76 28104), este fragmento é usado para construir o vector de expressão da cadeia leve kapa. O fragmento kapa de comprimento integral de 738 bp produzido acima é cortado com Xbal e SaJl, é purificado usando o Promega Wizard DNA Clean-Up System (Promega cat. n.° A7100), e é clonado em pDSRál9 para gerar o plasmídeo áOPGL-1-kapa/pDSRál9 (Figura 5) . pDSRál9 foi anteriormente descrito (ver WO 90/14363 (ver, por exemplo, Figura 12}). Resumidamente, para fazer pDSRál9, pDSRá2 é modificado das seguintes formas: o polyA FSH é encurtado de aproximadamente 1400 pares base para 885 pares base, e acaba agora no sitio Ndel; o promotor dihidrofolato reductase (DHFR) contém agora 209 pares base, tendo sido encurtado a partir da extremidade 5' de aproximadamente 1 kilobase; e é eliminado da sequência DHFR polyA um fragmento BglII de aproximadamente 550 pares base. O clone de expressão da cadeia leve kapa áOPGL-1 é sequenciado para confirmar que está codificado para o mesmo peptideo que está identificado no hibridoma AMG 6.5. O vector da expressão final, áOPGL-l-kapa/pDSRal9, é 5476 bp e contém as 7 regiões funcionais apresentadas na Tabela 2.

Tabela 2: Caracteristicas de áOPGL-l-kapa/pDSRál9

Plasmídeo Base Par Número 2 a 881

Um sinal de terminação da transcrição/poliadenilação da subunidade á da hormona da glicoproteina da pituitária de bovino (á-FSH) (Goodwin, et al, Nucleic Acids 77

Res . 1983 11: 6873-82; número de acesso

Genbank X00004) 882 a 2027

Um minigene de dihidrofolato reductase (DHFR) do rato contendo o promotor endógeno DHFR do rato, as sequências de codificação do cADN, e os sinais de terminação da transcrição/poliadenilação do DHFR (Gasser et al, Proc Natl Acad Sei USA. 1982 79:6522-6.; Nunberg et at,

Cell 1980 19: 355-64; Setzer et al, J

Biol Chem. 1982 257: 5143-7; McGrogan et al, J Biol Chem. 1985 260: 2307- 14) . 2031 a 3947 Sequências pBR322 contendo o gene marcador da resistência de ampicilina e a origem para replicação do plasmídeo em E. Coli (número de acesso Genbank J01749) 3949 a 4292 Um rápido promotor, estimulador e origem de replicação SV40 (Takebe et al, Mol Cell Biol. 1988 8: 466-72., número de acesso Genbank J02400) 4299 a 4565

Um elemento estimulador translaccional a partir do dominio HTLV-1 LTR (Seiki et al, Proc Natl Acad Sei USA . 1983 80: 3618-22, número de acesso Genbank J02029) 4574 a 4730

Um intrão a partir dos sinais dador/receptor da junção SV40 16S, 19S 78 (Okayama and Berg, Mol Cell Biol 1983 3: 280-9, número de acesso Genbank J02400) 4750 a 5476 O cADN cadeia leve kapa aOPGL-1 entre os sítios Xbal e Sall

Na Figura 5 apresenta-se um mapa do plasmídeo circular do vector.

Clonagem da cadeia pesada do áOPGL-1

A cadeia pesada IgG2 do áOPGL-1 é clonada a partir de AMG 6.4 hibridoma duplo cordão cADN produzido com o kit de amplificação Clontech Marathon™ cADN (cat. n.° K1802-1). A amplificação de AMG 6.4 cadeia pesada cDNA é concretizada por técnicas de amplificação rápida das extremidades 5' e 3' do cADN (RACE) executadas com os primers específicos da região constante da cadeia pesada da linha germinal humana IgG2 (que se pode ver abaixo) e primers RACE e outros materiais e

métodos disponibilizados no kit de amplificação Marathon™ cDNA

primer 5' ligG2 RACE

5'- GGC ACG GTC ACC ACG CTG CTG AG -3' (SEQ ID NO: 9) primer 3' IgG2 RACE 5'- CCT CCA CCA AGG GCC CAT CGG TCT -3' (SEQ ID NO: 10) O produto 600 bp 5' RACE e o produto 1200 bp 3' RACE são clonados em pCR2.1 (Invitrogen) e são sequenciados. A informação desta sequência é usada para projector os primers específicos da cadeia pesada do áOPGL-1 para a clonagem da sequência de comprimento integral. O primer 5' da cadeia pesada (5' áOPGL-1 IgG2 Primer) é direccionado contra o cordão sense e tem um sítio HindIII e uma sequência 79 consensual Kozak antes do sítio de arranque natural. 0 primer 3' da cadeia pesada (3' áOPGL-1 IgG2 Primer) é um primer antisense que contém um sítio Sail e um codão de paragem depois do último aminoácido da sequência IgG2 da cadeia pesada

Primer 5' áOPGL-1 IgG2: 5'- CAGAAGCTTGACCACC ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG CTT TTT CTT GTG GC - 3' (SEQ ID NO: 11)

HindIII Kozak ME F G L

S W L F L V A (SEQ (D NO: 18)

Primer 3' áOPGL-1 IgG2: 5'- GCA TGTCGAC TTA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG - 3' (SEQ ID NO: 12)

Sail * * K G PS L S L (SEQ ID NO: 19) 0 cADN de duplo cordão descrito acima é usado para criar a cadeia pesada de comprimento integral cADN por amplificação PCR com os primers 5'- e 3'- áOPGL-l IgG2. 0 PCR produz um fragmento de 1433 bp que codifica os 467 resíduos de aminoácidos (incluindo a sequência de sinais IgG de 19 aminoácidos) da proteína de cadeia pesada de áOPGL-l IgG2 (Figura 2, SEQ ID NO: 2). Depois da purificação com um kit de purificação QIAquick PCR (Qiagen cat. n.° 28104), este fragmento é usado para construir o vector de expressão da cadeia pesada como segue. O ADN que codifica o fragmento pesado IgG2 de comprimento integral criado acima é cortado com HindIII e Sa/1, purificado usando um kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen cat. n.° 28704), e este fragmento é clonado em pDSRál9. O plasmídeo de expressão resultante denomina-se áOPGL-1-IgG2/pDSRál9 (Figura 6) . Todos os componentes do vector são 80 idênticos ao vector áOPGL-l-kapa/pDSRál9, acima descrito, excepto que a áOPGL-1 IgG2 cadeia pesada cADN substitui a áOPGL-1 kapa cadeia leve cADN entre os sitios Xbal e Sa/1. 0 clone de expressão da cadeia pesada áOPGL-1 IgG2 é sequenciado para confirmar que codificou o mesmo polipeptídeo que está identificado no hibridoma AMG 6.4.

Exemplo 2

Expressão de áOPGL-1 em células CHO A expressão estável do anticorpo de áOPGL-1 concretiza-se por co-transfecção de plasmideos áOPGL-l-kapa/pDSRál9 e áOPGL-1 -IgG2/pDSRál9 em células de ovário de hamster chinês deficitárias em dihidrofolato reductase (DHFR“) (CHO AM-l/D, patente EUA N.° 6 210 924) seguido de isolamento e teste de clones individuais.

Uma placa de cultura de tecido de 100 mm é revestida com l,5xl06 AM-l/D células que cresceram em meio CHO d" (glucose com DMEM elevado, 10% soro bovino fetal, 1% de penicilina/estreptomicina/glutamina, IX Piruvato Na, 1% aminoácidos não essenciais (NEAA)) (Gibco®) e 1% suplemento ht (Gibco®)) no dia anterior às transfecções (dia 0). No dia 1, 400 il de meio RPMI 1640 isento de soro (Gibco®) é aliquotado num tubo de polipropileno de 12x75 mm. 24 microlitros de reagente TranslT®-LTl (Mirus Corporation) são adicionados gota a gota ao meio e a mistura fica a incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. Um total de 15 ig de plasmideo linearizado ADN (7,5 ig de áOPGL-l-kapa/pDSRál9 e 7,5 ig de áOPGL-1 -IgG2/pDSRál9, digerido com Pvul) adiciona-se então gota a gota à mistura e deixa-se a incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. O meio CHO d“ é removido das células, que são lavadas com 10 ml de solução salina tamponada de Dulbecco (Gibco®). Seis mililitros de meio MEM isento de soro complementado com HT, 81 L-glu , NEAA, e piruvato de Na (Gibco®) são acrescentados às células. 0 complexo ADN/LT1 é então adicionado gota a gota às placas, que são agitadas suavemente para promover a distribuição regular do ADN pelas células. Após 5 horas numa incubadora de cultura de tecidos, o meio é substituido por meio CHO d“ fresco. 48 horas depois, as células são divididas em 10 placas de cultura de 100 mm em meio CHO seleccionado (glucose com DMEM elevado, 10% soro bovino fetal dialisado (FBS), 1% penicilina/estreptomicina/glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais e IX piruvato Na) (Gibco®). O meio é mudado duas vezes por semana até aparecerem colónias.

[0215] Após 10-14 dias, as colónias são escolhidas usando discos de clonagem de 5 mm (Labcore®) embebidos em lx tripsina-EDTA (Gibco®) e são cultivadas em 24 placas de cultura de tecido perfurado com um meio seleccionado de CHO. Quando as células se tornam confluentes, meio isento de soro (meio seleccionado CHO menos FBS) é adicionado e recolhido 48 horas depois. Estes meios condicionados são analisados para expressão de anticorpos por Western blot com anticorpo anti-humano IgG Fc de cabra conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (Pierce, Rockford, IL) para detectar a cadeia pesada do áOPGL-1, e anticorpo de cadeia kapa de cabra anti-humano (Pierce, Rockford, IL) seguido de anticorpo de coelho anti-cabra IgG (H+L) conjugado com HRP (Pierce, Rockford, IL) para detectar a cadeia leve do áOPGL-1. Os clones de expressão mais elevada são expandidos e armazenados em azoto liquido. Exemplo 3

Produção de áOPGL-1

Preparação e criação de Cell Line 125Q

As células CHO que produzem áOPGL -1 são clonadas por dois conjuntos de diluição limitada em placas de 96 orifícios em condições isentas de soro. Os clones são seleccionados com base nas caracteristicas de produção e crescimento em vários recipientes de suspensão. EIAs são executadas para 82 seleccionar o clone que produz o nível mais elevado de áOPGL-1. As características de crescimento, incluindo tempos e densidades de duplicação são então medidas fazendo crescer os clones em balões de centrifugação de 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1 L, e 3 L, bem como em bioreactores Aplikon de 3 L. O clone com o tempo de duplicação mais rápido que atinge a densidade mais elevada em cultura é seleccionado, e é designado Cell Line 125Q. Quando o clone se tiver expandido para dar células suficientes para congelar 360 ampolas a aproximadamente lxlO7 cetls/mL, as células são de novo suspensas num meio criopreservante, isento de soro (90% VM-Soy Batch Médium (ver mais pormenores na Tabela 3) complementado com 10 ml/L de aminoácidos não essenciais e 10 ml/L L-Glutamina (Gibco/LTI/Invitrogen), e 10% dimetilsulfóxido (JT Baker)) e congeladas. As ampolas são guardadas numa instalação de acesso controlado e mergulhadas em azoto líquido em reservatórios adequados (Dewars).

Tendo por base o crescimento e a produção em pequenas centrífugas e bioreactores de escala maior, Cell Line 125Q é escolhida como a linhagem celular para o fabrico de áOPGL-1. Cultura de células áOPGL-1 é produzido por expressão em Cell Line 125Q, uma linha clonal de células CHO que exprime o áOPGL-1 a partir de plasmídeos áOPGL-l-kapa/pDSRál9 e áOPGL-1 -lgG2/pDSRál9. O processo de cultura de células para áOPGL-1 é apresentado na Figura 19. Para cada lote de produção, as células provenientes de um frasco de Cell Line 125Q crescem inicialmente em 50 mL de VM-Soy Batch Médium (ver composição na Tabela 3) complementado com 10 ml/L de aminoácidos não essenciais e 10 ml/L de L-glutamina (Gibco/LTI/Invitrogen) (VM-Soy Supp) em frascos Erlenmeyer de 125 ml agitados a 100 rpm durante 5 dias. Toda a cultura é então usada para inocular VM-Soy Supp num balão de centrifugação de 500 ml para dar 3xl05 células viáveis/ml (3E5 vc/ml), crescendo com 83 uma velocidade de rotação de 70 rpm durante 3-4 dias. Toda a cultura proveniente do balão de centrifugação de 500 ml é então usada para inocular VM-Soy Supp num balão de centrifugação de 3L para dar 3E5 vc/ml, e cresce com uma velocidade de rotação de 70 rpm durante 3-4 dias. A cultura proveniente do balão de centrifugação de 3L é então dividida em dois balões de centrifugação de 3 L para 3E5 vc/ml em VM-Soy Supp com vermelho fenol e cresce nas mesmas condições. Estas culturas dos balões de centrifugação são então usadas para inocular quatro outros balões de centrifugação para 3E5 vc/ml em VM-Soy Supp sem vermelho fenol, e crescem nas mesmas condições. Quatro litros de cultura provenientes dos quatro balões de centrifugação de 3L são usados para inocular 10 L de VM-Soy Supp sem vermelho fenol num bioreactor de 20 L, e o bioreactor funciona em modo de alimentação fechada durante 7-10 dias. No modo de alimentação fechada, adiciona-se uma alimentação de nutrientes que contém componentes do meio concentrado ("Alimentação", nos termos abaixo definidos na Tabela 3) para manter o crescimento das células e a viabilidade da cultura. Toda a cultura proveniente do bioreactor de 20L é então usada para inocular 7 0 L de VM-Soy Supp sem vermelho fenol num bioreactor de 150L, e o bioreactor trabalha em modo de alimentação fechada durante 9-10 dias. Finalmente, toda a cultura proveniente do bioreactor de 150L é usada para inocular cerca de 880 L de VM-Soy (sem suplemento ou vermelho fenol) num bioreactor de 2000L, e o bioreactor trabalha em modo de alimentação fechada. A velocidade de alimentação no decurso do modo de alimentação fechada é definida de tal forma que o nivel de glucose na cultura se mantenha em 0,6 g/L por cada bioreactor. A densidade de células e a concentração de glucose são medidas diariamente e a velocidade de alimentação é ajustada em conformidade. 84 A produção no bioreactor de 2000L dura aproximadamente duas semanas, período durante o qual o áOPGL-1 é produzido de modo constitutivo pelas células e segregado no meio de cultura das células. 0 reactor de produção é controlado de acordo com níveis definidos em termos de pH, temperatura, e oxigénio dissolvido: o pH é 7,0 e é controlado por adição de dióxido de carbono gasoso e carbonato de sódio; o oxigénio dissolvido é de 120 mm Hg e é controlado por caudais de ar, azoto e oxigénio gasoso. As células são mantidas a 37°C ao longo de todo o processo. Todos os gases são passados através de filtros de membrana com um tamanho de poro igual ou inferior a 0,22 im.

No final de produção, o caldo de células é alimentado numa centrífuga de discos e a cultura sobrenadante é separada das células. O concentrado é clarificado ainda mais através de um filtro de profundidade Cuno 90SP seguido de um filtro Posidyne de 0,2 im (Pall Co.). O meio condicionado e clarificado é então concentrado por ultra filtração de escoamento tangencial (UF) usando membranas 50kD NMWL (Millipore Biomax 50). 0 meio condicionado é concentrado 15-a 30- vezes. O meio condicionado e concentrado resultante (CCM) é então processado através de purificação ou congelado para purificação posterior. O processo de produção está resumido na Figura 19.

Meio de cultura de células O meio de cultura de células para usar ao longo de todo o processo de cultura de células baseia-se em Modified Eagle's Médium /Ham's Nutrient F12 (DMEM/F12, 1:1) de Dulbecco, e contém níveis complementares de aminoácidos, nutrientes e sais adicionais, como um hidrolisato de soja e insulina humana recombinante (Nucellin®Zn, Eli Lilly). Os componentes encontram-se listados na Tabela 3. Este meio é referido como 85 VM-Soy. Antes de serem usadas, as soluções de meios são filtradas através de filtros de membrana de com um tamanho de poro de 0,2 pm.

Tabela 3. Componentes do meio de cultura das células COMPONENTE VMSoy Batch Médium (mg/L) ALIMENTAÇÃO (mg/L) COMPONENTES DMEM/F12 Sais inorgânicos CaCl2 (anid.) 116,60 233,2 CuS04.5H20 0,0026 0.,0052 Fe (N03) 3.9H20 0,1000 0,2 FeSO4.7H20 0,8340 1, 668 KC1 311,80 623, 6 MgCl2 (anid.) 57,280 114,56 MgS04 (anid.) 97,680 195,36 NaCl 905,990 1811,98 NaH2P04 . H20 125,00 250 142,040 284,08 Na2HP04 0,8640 1,728 ZnS04.7H20 Outros componentes 12302 D-Glucose 3151,00 10,8 Hipoxantina Na 5,40 0, 18 Ácido linoleico 0, 090 0,412 Ácido lipóico 0,2060 16,2 Vemelho Fenol 8,10 0, 324 Putrescina. 2HCI 0,1620 220 Piruvato de sódio 110,00 .Aminoácidos 86 L-Alanina L-Arginina HC1 L-Asparagina. H2O L-Ácido aspártico L-Cisteína. HC1. .H2O L-Cistina.2HCl L-Ácido glutâmico L-Glutamina Glicina L-Histidina. HC1 .H2O L-Isoleucina L-Leucina L-Lisina HC1 L-Metionina L-Fenilalanina L-Prolina L-Serina L-Treonina L-Triptofano L-Tirosina.2Na.2H2O L-Valina Vitaminas Biotina D-Pantotenato de Ca Cloreto de colina Ácido fólico i-Inositol Niacinamida Piridoxal HC1 Piridoxina HC1 Riboflavina 26.70 295.00 45, 00 39, 90 35,120 62.580 44.10 657.00 52.50 62,950 108,940 118.10 182.50 34,480 70,960 57.50 73.50 106,90 18,040 111.580 105.70 0,0073 4,480 17,960 5,30 25,20 4, 040 4, 00 0,0620 0,4380 53.4 590 90 79, 8 70,24 125.16 88,2 1314 105 125, 9 217,88 236,2 365 68, 96 141.92 115 147 213, 8 36.08 223.16 211.4 0,0146 8, 96 35, 92 10,6 50, 4 8,08 8 0, 124 0,876 87

Tiamina HC1 4,340 8, 68 Timidina 0,3635 0, 727 Vitamina B12 1,360 2, 72 COMPONENTES ADICIONAIS Nucellin Zn, (rhu 5, 00 15 insulina) Ácido selenoso 0,0050 0,015 Etanolamina 0,0012 0,0037 Triiodotironina 0,000040 0,00012 Hidrocortisona 0, 020 0,06 Citrato férrico 122,450 122,450 Plurónico F-68 1000,00 500 Hidrolisato de soja 6000,00 6000,00 NaHC03 3000,00 3000,00 NaCl 3500,00

Processo de purificação 0 áOPGL-1 expresso em células CHO é segregado num meio extracelular. É possível recorrer a uma série de passos para produzir material puro. 0 processo usa indução de carga hidrofóbica, permuta catiónica, e cromatografia de interacção hidrofóbica juntamente com uma fase de pH baixo e um filtro vírico. Estes procedimentos encontram-se descritos abaixo. A. Cromatografia de indução de carga hidrofóbica (HCIC)

Esta fase de cromatografia remove a maioria das proteínas das células hospedeiras e ADN. 0 meio condicionado concentrado (CCM) é filtrado através de um filtro Cuno 30SP e depois através de um filtro Cuno VR07 carregado de base celulósica, e só então carregado na resina MEP HyperCel. Depois de carregada, a coluna é lavada com tampão de equilíbrio (Tris 20 mM, pH 7,2). O anticorpo é eluído a partir da resina 88 usando um tampão de pH baixo (acetato de sódio 20 mM, pH 5.0). À medida que é eluido a partir da coluna, o produto é recolhido com base na absorbância a 280 nm do efluente da coluna. B. Inactivaçao virica O banho de MEP é titulado para pH 3,7 e é retido durante aproximadamente 60 minutos para inactivar retrovirus potencialmente contaminantes. A seguir ao passo de retenção, o pH é ajustado para cerca de 6,0. C. Filtração virica O banho com pH ajustado é filtrado através de um filtro Millipore Viresolve NFR ou equivalente. O anticorpo passa através do filtro ao passo que virus h50 nm potencialmente contaminadores ficam retidos. D. Cromatografia de permuta catiónica (CEX) O anticorpo é purificado ainda mais por cromatografia de permuta catiónica usando SP Sepharose HP (Amersham Pharmacia) ou equivalente. O passo da cromatografia de permuta catiónica remove proteínas adicionais de células CHO, ADN, proteínas de menor peso molecular, e formas agregadas de cxOPGL-l. O banho vírico filtrado é carregado na resina de permuta catiónica. Depois de carregada, a coluna é lavada com tampão de equilíbrio (20 mM NaMES pH 6,2) . O anticorpo é então eluido com um gradiente linear de sal crescente (20 mM NaMES pH 6,2, NaCl 0 M a 20 mM NaMES pH 6,2, NaCl 0,3M) . À medida que é eluido a partir da coluna, o produto é recolhido com base na absorbância a 280 nm do efluente da coluna. E. Cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC) 89 0 anticorpo é purificado ainda mais por cromatografia de interacção hidrofóbica usando Phenyl Toyopearl 650S (Tosoh Biosep) ou equivalente. A fase de cromatografia de interacção hidrofóbica é usada como uma fase de acabamento e remove proteínas adicionais de células CHO, ADN, proteínas de menor peso molecular, e forma agregadas de aOPGL-1. 0 banho de permuta catiónica é condicionado antes de ser carregado na coluna por adição de sulfato de amónio para uma condutividade de >105 mS/cm a 15-25°C. Depois de carregada, a coluna é lavada com o tampão de equilíbrio (fosfato de potássio 1M, pH 8). O anticorpo é então eluído com um gradiente linear de concentração decrescente de sal (de fosfato de potássio 1M, OmM Tris pH 8 a fosfato de potássio 0M, 20 mM Tris pH 8) . À medida que é eluído a partir da coluna, o produto é recolhido com base na absorbância a 280 nm do efluente da coluna. F. Concentração e diafiltração

O banho da coluna HIC é concentrado e diafiltrado para o tampão da formulação por ultra filtração de escoamento tangencial usando membranas 50kD NMWL (Millipore Biomax 50). A formulação tampão inclui 10 mM de acetato, 5% de sorbitol, pH 5,2 e o aOPGL-1 é de 30 mg/mL

Filtração final e armazenagem A massa purificada passa através de um filtro de 0,22 pm PVDF (Millipore), é retirada uma amostra, e é guardado a aproximadamente -30 °C num congelador seguro.

Exemplo 4

Especificidade de ligação de aOPGL-

Os anticorpos produzidos em células CHO que são transfectados com os dois vectores de expressão nos termos analisados nos Exemplos 1 e 2 podem ser usados nos seguintes exemplos 4, 5 e 6. 90 0 OPG humano liga e neutraliza OPGL em ratazanas, ratos e macacos cynomolgus, bem como em humanos. áOPGL-1 liga OPGL humano com elevada afinidade mas a ligação ao OPGL murino (Tabela 4) não é significativa.

Tabela 4: Afinidade de aOPGL-1 para OPGL expresso de membrana celular de humanos, macacos cynomolgus, ou sequência de ratos.

Espécies de OPGL áOPGL -1 ED50 (ng/ml) Humano 16 Cynomolgus 1 9 Rato Sem ligação específica 0 OPGL destas espécies está expresso em células CHO como a proteina ligada à membrana, de comprimento integral. A ligação de aOPGL-1 ao OPGL expresso da superficie da célula é avaliada por análise FACS de células incubadas com aOPGL-1 e um anticorpo secundário com rótulo FITC para lgG2 humano. 0 aOPGL-1 liga OPGL humano e cynomolgus mas não há qualquer ligação especifica a OPGL do rato.

Além disso, o OPG humano foi reportado como apresentando fraca ligação ao ligando que induz a apoptose relacionado com o factor de necrose tumoral (TRAIL) (Truneh et al, 2000), um elemento relacionado com a família TNF, que apresenta homologia de ADN e sequência de aminoácidos ao OPGL (Lacey et al., 1998). Contudo, não se detectou que o OPG se ligasse a outras proteínas relacionadas com TNF tais como TNFá, TNFB, ou ligando CD40. aOPGL-1 liga-se especificamente a OPGL em placas EIA (Figura 7) . OPGL solúvel recombinante (2 pg/ml) é aplicado sobre 91 placas EIA de 96 orifícios à temperatura ambiente durante 16 a 24 horas. Depois de bloquear com 1% BSA em PBS, adicionam-se concentrações variáveis de aOPGL-1 (aproximadamente 2 ng/ml a 1000 ng/ml) diluídas em 1% BSA/PBS aos orifícios e as placas são incubadas durante cerca de 2 horas à temperatura ambiente. O anticorpo ligado é detectado com IgG (Fab')-HRP anti-humano de cabra usando o cocktail de substratos TMB-H202 (tetrametilbenzidina e peróxido de hidrogénio). A absorbância é lida a 450nm e 650nm. O aOPGL-1 liga-se especificamente ao OPGL expresso na superfície das células transfectadas (Figura 8). aOPGL-1 (100 ng/ml) diluído em FACS Buffer (PBS, 0,1% BSA, 0,01% azeto de sódio) é preincubado com concentrações variáveis de OPGL, TNFa, TNFb, TRAIL, ou ligando CD40 (aproximadamente 0,1 ng/ml a 1000 ng/ml), e é então adicionado a aproximadamente 200.000 células CHO REN 218-9, que são células CHO que exprimem com estabilidade OPGL ligado à membrana na superfície da células. Após 1 hora a 2-8°C, o anticorpo não ligado é removido por centrifugação e lavagem. As células são então incubadas durante 30 minutos a 2-8°C com rótulo FITC F(ab')2 anti-humano IgG de cabra (específico de fragmento Fey) . Após centrifugação e lavagem, mede-se a fluorescência da superfície das células usando citometria de fluxo. A Figura 8 mostra que a ligação de aOPGL-1 a células CHO REN 218-9 é especifica, e é reduzida competitivamente por adição de OPGL solúvel, mas não por adição de TNFa, TNFb, TRAIL, ou ligando CD40. em experiências concorrentes, a ligação de aOPGL-1 ao OPGL em placas EIA é inibida por adição de OPGL exógena (Figura 9) , mas não por adição de TNFa, TNFB, TRAIL, ou ligando CD40 (Figura 10). Este procedimento é executado, no essencial, da mesma forma do anterior, para ligação de aOPGL-1 ao OPGL em placas EIA, salvo no que respeita a uma concentração 92 constante de oíOPGL-1 (lOOng/mL) que é pré-incubada com concentrações variáveis de OPGL solúvel ou outros ligandos (aproximadamente 1 ng/ml a 1000 ng/ml para cada) antes de ser adicionada às placas revestidas com OPGL.

Exemplo 5

Actividade de neutralização do áOPGL Inibição da formação de osteoclastos RAW 264.7 (ATCC No. TIB-71, Manassas, VA) é uma linhagem celular macrófaga de murina que derivou de um tumor de leucemia murina de Abelson induzido por virus. As células de RAW 264.7 diferenciam-se para células do tipo de osteoclastos na presença de OPGL. O ensaio básico para criação de osteoclastos em cultura a partir de células RAW na presença de OPGL foi descrita em pormenor por Simonet et al (1997) Cell 89 p. 309, e Lacey et al (1998) Cell 93 p. 165—

As células RAW são estimuladas por ligando a diferenciarem-se em células do tipo de osteoclastos, e a diferenciação pode medir-se por actividade TRAP, uma propriedade dos osteoclastos. Deste modo, é possivel medir o efeito do áOPGL-1 na osteoclastogénese.

As células RAW são incubadas durante 4 dias na presença de uma quantidade constante de OPGL (40 ng/ml) e quantidades variáveis de aOPGL-1 (6,3 pg/ml a 200 ng/ml) no meio de cultura celular (DMEM, 10% FBS, 0,292 mg/ml L-Glut, 100 unidades/ml Penicilina G, 100 pg/ml sulfato de estreptomicina). Decorridos 4 dias, as células são marcadas para detectar actividade de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) por permeabilização e acidificação, a que se segue um tratamento com para-nitrofenilfosfato durante 5 minutos. Resumidamente, o meio é retirado das células por aspiração, e adiciona-se 100 μΐ de tampão citrato (410 ml de ácido citrico 0,1M, 590 ml de citrato 0,1 M, sal trissódico, 93 1 mL de triton X-100) a cada orifício e as placas são incubadas durante 3 a 5 minutos à temperatura ambiente. Acrescenta-se então cem microlitros de solução PNPP (157,8 mg de reagente de fosfatase ácida (Sigma 104-100), 7,2 ml de solução de tartarato (Sigma cat. n.° 387-3), e 22,8 ml de tampão citrato), e as placas são incubadas durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente. A reacção é terminada com a adição de 50 μΐ de solução de NaOH 0,5 M. A TRAP converte o para-nitrofenilfosfato em para-nitrofenol, que pode ser quantificado por medição da densidade óptica a 405 nm. A actividade TRAP, que é um marcador substituto para o desenvolvimento de osteoclastos, apresenta, pois, correlação com a densidade óptica a 405 nm. A Figura 11 mostra uma representação da densidade óptica em função da concentração de aOPGL-1, e demonstra que o aOPGL-1 inibe a formação de osteoclastos neste ensaio.

Inibição da ligação de OPGL ao seu receptor A força do aOPGL-1 demonstra-se pela sua capacidade em bloquear a ligação do ligando OPG ao seu receptor cognato, o receptor de diferenciação e activação de osteoclastos (ODAR, também conhecido como RANK). Este ensaio recorre a uma tecnologia de ressonância HTRF (homogeneous time resolved fluorescent resonance) para detectar a ligação de cxOPGL-1 ao ligando de osteoprotegerina conjugado com Europium (Eu-OPGL). Se o aOPGL-1 inibir a ligação de Eu-OPGL ao to ODAR, o resultado fluorescente diminui, e a quantidade de aOPGL-1 presente está inversamente relacionada com a quantidade de fluorescência. O OPGL é rotulado com europium, que emite luz a 620 nm quando excitado com luz a 337 nm. ODAR é fundido com FLAG e com Fc, e a proteína de fusão Fc-ODAR-FLAG é rotulada com um anticorpo anti-FLAG ligado a aloficocianina (APC), um 94 fluoróforo que emite luz de 665 nm quando excitado por luz de 620 nm. Assim, quando o ligando OPG rotulado com europium se liga ao complexo Fc-ODAR-FLAG/anti-FLAG-APC, o complexo terciário emite luz de 665 nm quando excitado com luz de 337 nm.

Eu-OPGL a 0,05 pg/ml é pré-incubado com várias concentrações (0,1 a 150 ng/ml) de aOPGL-1 em tampão de ensaio (50 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 0,05% NaN3, 0,1% BSA, e 0,05% Tween 20) à temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora (mistura Preincubation). Uma mistura de Fc-ODAR-FLAG (1 pg/ml) e anti-FLAG-APC (2,5 pg/ml) é também preparada em tampão de ensaio e incubada à temperatura ambiente durante uma hora (mistura Fluorochrome). Combinam-se então volumes iguais das misturas Preincubation e Fluorochrome e incuba-se a mistura à temperatura ambiente durante 3 horas. A fluorescência é medida por leitura de placas no analisador de microplacas Packard Discovery HTRF usando um comprimento de onda de excitação de 337 nm e um comprimento de onda de emissão de 665 nm.

Quando áOPGL-1 é pré-incubado com ligando Eu-OPG e depois misturado com Fc-ODAR-FLAG/anti-FLAG-APC, a intensidade da fluorescência a 665 nm diminui de uma forma que depende da dose, como se vê na Figura 12, o que demonstra que o áOPGL 162 pode efectivamente inibir a ligação do OPGL ao ODAR.

Exemplo 6

Farmacocinética em macacos Cynomolgus

Seis machos e seis fêmeas de macacos cynomolgus, com idades inferiores a 4,5 anos e pesos compreendidos entre 2 e 4 kg foram distribuídos por 4 grupos de dosagens. O grupo 1 era constituído por 3 machos e 3 fêmeas. Cada um dos restantes grupos 2, 3 e 4 era constituído por 1 macho e 1 fêmea. Aos animais do grupo 1 foi administrada uma dose SC única de 1 95 mg/kg de oíOPGL-1, enquanto aos animais dos grupos 2, 3 e 4 foram administradas doses IV únicas de 0,1, 1,0, ou 10,0 mg/kg de aOPGL-1, respectivamente.

Os animais são doseados com áOPGL-1 expresso a partir de células de ovário de hamster chinês transfectado (CHO). Foram retiradas amostras de soro para determinação de niveis de áOPGL-1, análise de anticorpos, e análise do N-telopeptideo do soro marcador da renovação óssea (N-Tx do soro), fosfatase alcalina (ALP) , e cálcio no soro (Ca no soro) . Foi também recolhida urina para análise de N-telopeptideo (N-Tx na urina) e creatinina.

Os perfis de concentração-tempo do soro na sequência da administração IV caracterizam-se por uma distribuição trifásica (Figura 13) . Inicialmente há uma fase de distribuição rápida, a que se segue um fase de plateau bastante mais lenta, que parece estar dependente da concentração. A terceira fase observada é uma fase de eliminação rápida.

Utilizam-se análises não comportamentais de perfis completos de soro concentração-tempo com WinNonlin Professional (vl.5), e análises exponenciais dos dados até um máximo de 14 dias após administração do produto em ensaio e acima de 10.000 ng/mL usando SAAM II (vl.1.2) para investigar a farmacocinética do áOPGL-1 em macacos. O volume inicial médio de distribuição a partir de todas as doses IV é de 28,9 ml/kg, similar ao volume de plasma. O volume médio de distribuição em estado estacionário (Vss) é de 39 ml/kg para todas as doses IV. A análise exponencial indica que o áOPGL-1 apresenta uma semi-vida média de distribuição (t^a) de 6, 02 horas, uma fase secundária prolongada com uma semi-vida que aumenta com a dosagem passando de 86,9 horas a uma dosagem de 0,1 mg/kg para um máximo de 444 horas a uma dosagem de 10,0 mg/kg. A semi-vida de eliminação terminal (t^íz) estimada não comportamentalmente atinge em média 31 96 horas em todos os grupos de dosagem IV. Descobriu-se que a eliminação (CL, CL/F) do áOPGL-1 é não linear, com animais que receberam doses IV de 10 mg/kg apresentando uma eliminação média (0,120 ml/hr/kg) que é 3,3 vezes inferior a outros que receberam 0,1 mg/kg (0,401 ml/hr/kg).

Após administração subcutânea, a absorção é lenta, com picos de concentração média (Cmax) de 11 600 ng/ml em 132 hr. Há uma grande variabilidade no intervalo de exposição após administração SC, resultando uma eliminação média de 0,387 ± 0,281 ml/hr/kg e um tempo médio de residência de 202 ± 80,1 horas. A biodisponibilidade média é de 89%.

Os dados anteriores encontram-se resumidos na Tabela 5

Tabela 5: Parâmetros farmacocinéticos não comportamentais médios (± DP)3 em macacos Cynomolgus após administração de uma dose única de áOPGL-1 IV e SC

Estimativas de parâmetros não comportamentais

Parâmetr 0 Unidade 1,0 mg/kg 0,1 mg/kg 1,0 mg/kg 10 mg/kg SC (n=6) IV (n=2) IV (n=2) IV (n=2) Média DP Média Média Média T máx hr 132 60,2 0 0 0 C máx ng/ml 11600 3410 4330 38200 326000 hr 34, 9 11,1 30,7 31,4 NDb AUC (0_») ig*hr/m 3520 1750 253 3950 99900 1 CL, CL/F ml 0,387 0,281 0,401 0,256 0,120 /hr/kg MRT hr 202 80,1 84,8 124 519 97

Vss ml /kg N/Ac

N/A 33, 7 31,7 55, 9 aVaiores apresentados com 3 algarismos significativos bNão determinado, as amostras PK acabam na fase do plateau (p) pelo que a fase terminal não é observada °Não aplicável

0 áOPGL-1 provoca uma rápida diminuição nos niveis de N-Tx no soro num período de 24 horas após a dosagem (Figura 14) . Observa-se que o tempo médio de efeito máximo ocorre entre 12 horas e 7 dias após a dosagem à medida que as doses IV aumentam de 0,1 para 10 mg/kg, e entre 12 horas e 11 dias em animais que receberam uma dose SC de 1,0 mg/kg. O efeito máximo aumenta com a dose de aproximadamente 80 para 91% ao longo do intervalo de dosagem de 0,1 a 1 mg/kg. Contudo, para dosagens mais elevadas não se observa qualquer supressão adicional com inibição máxima de 91%. Os níveis médios de N-Tx no soro retornam à linha de base no 28° dia após a administração de 0,1 mg/kg IV e no 70° dia após a administração de 1 mg/kg SC. Os níveis de N-Tx na urina apresentam tendências similares às de N-Tx no soro, salvo que todos os grupos regressam aos valores da linha de base no 105° dia do estudo (Figura 15). A supressão do Ca do soro aumenta com a dose para um nadir médio de 31,6% abaixo da linha de base média sete dias após a IV administração de 10,0 mg/kg. Todos os restantes grupos de dosagem apresentam decréscimos médios no Ca do soro inferiores a 26,4% das respectivas linhas de base médias. Pelo 17° dia, todos os níveis de Ca no soro em animais tratados regressam a um intervalo de 10% das respectivas linhas de base médias (Figura 20).

Uma vez que a reabsorção e formação ósseas estão infimamente ligadas, são também observadas alterações nos marcadores de 98 formação óssea (ALP) com uma diminuição muito mais lenta nos niveis de ALP e uma supressão mais prolongada do que o marcador de formação N-Tx (Figura 21) . Observando a diminuição dos marcadores de reabsorção óssea antes dos marcadores de formação óssea (ALP) na sequência de uma dosagem com áOPGL -1 confirma que o áOPGL -1 é um agente antireabsortivo ósseo. A maioria dos animais (9 de 12) desenvolve anticorpos ao áOPGL -1. A incidência de anticorpos ao áOPGL -1 não está dependente da dose ou da via. Não é possível avaliar o efeito de anticorpos ao áOPGL -1 na farmacocinética de áOPGL -1 acima de 0,1 mg/kg se nenhum conjunto de doses tiver anticorpos animais negativos e positivos. A 0,1 mg/kg IV, a maioria do áOPGL -1 é eliminado antes do desenvolvimento do anticorpo, pelo que não se observam efeitos sobre a disposição de áOPGL -1 (Figura 16). 99

SEQUENCE LISTING <110> Boyle, William J Martin, Francis H Corvalan, Jose R Davis, C. Geoffrey

<120> Antibodies to OPGL <130> 06843.0049-00000 <150> 60/301,172 <151 >2001-06-26 <160> 20 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 1426

<212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 aagcttgacc tgtccagtgt cctgagactc ccgccaggct tacatactac cacgctgtat accatggagt gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga ttgggctgag tgttggagtc cotctggatt ggctggagtg tgaagggccg acagcctgag ctggcttttt. tgggggaggc cacctttagc ggtctcaggt gttcaccatc agccgaggac cttgtggcta ttggtacagc agctatgcca attactggga tccagagaca acggccgtat ttttaaaagg ctggggggtc tgagctgggt gtggtggtag attccaagaa attactgtgc gaaagatcca gggactacgg tgattatgag ttggttcgac ccctggggcc agggaaccct 420 ggtcaccgtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc 480 caggagcacc tccgagagca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga 540 accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc 600 tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcaa 660 cttcggcacc cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga 720 caagacagtt gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccagcac cacctgtggc 780 aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac 840 ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa 900 ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt 960 caacagcacg ttccgtgtgg tca'gcgtcct caccgttgtg caccaggact ggctgaacgg 1020 caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca gcccccatcg agaaaaccat 1080 ctccaaaacc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga 1140 ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga 1200 catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc 1260 catgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag 1320 gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1380 cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgataa gtcgac 1426 <210> 2 <211 >467

<212> PRT <213> Mus musculus <400 2

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Vai Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 .15

Vai Gin Cys Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin 20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 101

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Vai 50 55

Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 60

Glu Trp Vai Ser Gly Ile Thr Gly 65 70

Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 75 80

Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr 85

Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser 100

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Pro Gly 115 120

Thr Thr Vai Ile Met Ser Trp Phe 125

Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu 130 135

Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr 140

Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu 145 150

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 155 160

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 165

Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 170 175

Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser 180

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His 185 190

Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 195 200

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 205

Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn 210 215

Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys 220

Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn 225 230

Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai Glu 235 240

Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro 245

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala 250 255

Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 260

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr

Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His 102 275 280 285

Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 305 310 315 320

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 . Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 355 360 · 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser 370 375 380

Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460

Pro Gly Lys 465 <210> 3 <211 >728

<212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 103 tctagaccac catggaaacc ccagcgcagc ttctcttcct cctgctactc tggctcccag 60 ataccaccgg agaaattgtg ttgacgcagt ctccaggcac cctgtctttg tctccagggg 120 aaagagccac cctctcctgt agggccagtc agagtgttcg cggcaggtac ttagcctggt 180 accagcagaa acctggccag gctcccaggc tcctcatcta tggtgcatcc agcagggcca 240 ctggcatccc agacaggttc agtggcagtg ggtctgggac agacttcact ctcaccatca 300 gcagactgga gcctgaagat tttgcagtgt tttactgtca gcagtatggt agttcacctc 360 ggacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct 420 tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc 480 tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat 540 cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca 600 gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag 660 tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttgat 720 aagtcgac 728 <210 4 <211 >235

<212> PRT <213> Mus musculus <400 4

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Vai Arg Gly Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 104 65 70 75 Β0

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 85

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 90 95

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe 100

Ala Vai Phe Tyr Cys Gin Gin Tyr 105 110

Gly Ser Ser Pro Arg Thr Phe Gly 115 120

Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 125

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai 130 135

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 140

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 145 150

Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin 165

Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 170 175

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai 180

Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 195 200

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 205

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu 210 215

Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 220

Gly Glu Cys 235

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg 225 230

<210> 5 <211 >25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5’ kappa RACE primer <400> 5 gatgacccag tctccagcca ccctg 25

<210> 6 <211 >23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3’ kappa RACE primer <400>6 105 23 aagggtcaga ggccaaagga tgg

<210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5’ anti-OPGL-1 kappa primer <400> 7 caactctaga ccaccatgga aaccccagcg 30

<210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3’ anti-OPGL-1 kappa primer <400> 8 tttgacgtcg acttatcaac actctcccct gttgaag 37

<210> 9 <211 >23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5’ lgG2 RACE primer <400> 9 ggcacggtca ccacgctgct gag 23

<210> 10 <211 >24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3’ lgG2 RACE primer <400> 10 cctccaccaa gggcccatcg gtct 24

<210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5’ anti-OPGL-1 lgG2 Primer <400> 11 cagaagcttg accaccatgg agtttgggct gagctggctt tttcttgtgg c 51 <210> 12 106

<211 >37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3’ anti-OPGL-1 lgG2 Primer <400> 12 gcatgtcgac ttatcattta cccggagaca gggagag 37 <210> 13 <211>122

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 13

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly 50 55

Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Vai 100

Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp 105 110

Ser Ser

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai 115 120 <210> 14 <211> 108

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 107

Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Arg Gly Arg 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Vai Phe Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105

<210> 15 <211 >24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> random primer <220> <221 > misc_feature <222> (18)..(23)

<223> N is A, C, G, or T <400 15 ggccggatag gcctcacnnn nnnt 24

<210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> translation of portion of 5’ anti-OPGL-1 kappa primer <400 16

Met Glu Thr Pro Ala 1 5

<210> 17 <211>6 <212> PRT 108 <213> Artificial Sequence <220> <223> translation of portion of 3’ anti-OPGL-1 kappa primer <400> 17

Cys Glu Gly Arg Asn Phe 1 5

<210> 18 <211 > 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> translation of portion of 5’ anti-OPGL-1 lgG2 Primer <400> 18

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Vai Ala 15 10

<210> 19 <211>7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> translation of portion of 3’ anti-OPGL-1 lgG2 Primer <400> 19

Lys Gly Pro Ser Leu Ser Leu 1 5

<210> 20 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LHRH antagonist peptide <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ac-D-Nal, where Nal is 3-(2-napthyl)alaninyl <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is (4’-chlorophenul)alaninyl <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (3) .. (3) <223> Xaa is D-Pal, where Pal is 3-(3’-pyridyl)alaninyl <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (5) .. (5’) <223> Xaa is N-methyl tyrosine <220> <221 > MISC_FEATORE <222> (6) .. (6) <223> Xaa is D-asparagine <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (8)..(B) <223> Xaa is N-epsilon-2-propyl-lysinyl <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is D-alanine-NH2 <400> 20

Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Xaa Pro Xaa 15 10

Lisboa, 2 de Junho de 2010.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo, que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, no qual: a) a cadeia pesada compreende: 1) uma sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID NO: 2; ou 2) uma sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID NO: 13; e b) a cadeia leve compreende: 1) uma sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID NO: 4; ou 2) uma sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID NO: 14; e na qual o anticorpo se liga a um ligando de osteoprotegerina (OPGL) e inibe a ligação de OPGL a um receptor de diferenciação e activação de osteoclastos (ODAR).
2. Anticorpo da reivindicação 1, no qual a cadeia pesada e a cadeia leve estão ligadas por uma ligação flexível para formar um anticorpo de cadeia única.
3. Anticorpo da reivindicação 2, que é um anticorpo Fv de cadeia única.
4. Anticorpo da reivindicação 1, que é um anticorpo Fab.
5. Anticorpo da reivindicação 1, que é um anticorpo Fab'. 1
6. Anticorpo da reivindicação 1, que é um anticorpo (Fab')2.
7. Anticorpo da reivindicação 1, que é integralmente humano.
8. Método de detectar o nivel de OPGL numa amostra biológica que inclui colocar a amostra em contacto com o anticorpo da reivindicação 1.
9. Anticorpo da reivindicação 1, que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
10. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID NO: 2, e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID NO: 4.
11. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada consiste numa sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID NO: 2, e em que a cadeia leve consiste numa sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID NO: 4.
12. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada consiste numa sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID IMO: 2 do residuo 20 ao residuo 467, e em que a cadeia leve consiste numa sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID NO: 4 do residuo 21 ao residuo 235. 2
13. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada consiste numa sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID IMO: 2 do resíduo 20 ao resíduo 467, e em que a cadeia leve consiste numa sequência de aminoácidos nos termos indicados em SEQ ID NO: 4 do resíduo 21 ao resíduo 235.
14. Composição farmacêutica que compreende um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13.
15. Uso de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14, para o fabrico de um medicamento para administração com pelo menos um anticorpo terapêutico seleccionado a partir do anticorpo anti-Her2, um anticorpo anti-CDC20, um anticorpo anti-EGFR, um anticorpo que se liga à proteína da superfície celular CDC 33, um anticorpo que se liga à proteína da superfície celular, glicoproteína do tipo mucina, trastuzumab, rituximab, ibritumomab tiuxetan, epratuzumab, IMC-C225, iodine 131 tositumomab, e alemtuzumab.
16. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para usar no tratamento de perda óssea.
17. Anticorpo ou composição farmacêutica da reivindicação 16 para usar no tratamento de perda óssea associada a pelo menos uma das seguintes condições: osteoporose, doença de Paget, osteomielite, hipercalcemia, osteopenia, osteonecrose, uma condição inflamatória, uma condição de auto-imunidade, artrite reumatóide e cancro. 3
18. Uso de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de perda óssea.
19. 0 uso da reivindicação 18, em que a perda óssea está associada a pelo menos uma das seguintes condições: osteoporose, doença de Paget, osteomielite, hipercalcemia, osteopenia, osteonecrose, uma condição inflamatória, uma condição de auto-imunidade, artrite reumatóide e cancro.
20. Uso de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o fabrico de um medicamento para administração com pelo menos um agente terapêutico seleccionado entre os seguintes: factor morfogénico ósseo, factor-β de transformação do crescimento (TGF-β), uma hormona paratiróide, um análogo de uma hormona paratiróide, uma proteína relacionada com uma hormona paratiróide, uma prostaglandina, um bifosfonato, um alendronato, flúor, cálcio, e um factor de crescimento de fibroblasto (FGF), para o tratamento de perda óssea.
21. Uso de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o fabrico de um medicamento para administração com pelo menos um agente terapêutico seleccionado entre os seguintes: um inibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1 ra, anakinra, um inibidor de TNFá, um receptor solúvel de TNFa, etanercept, um anticorpo anti- TNFá, infliximab, um anticorpo D2E7, um fármaco anti-inflamatório não esteróide (ΑΙΝΕ), um inibidor de COX-2, celecoxib, rofecoxib, e ieflunomide, para o tratamento de perda óssea associada a uma condição inflamatória. 4
22. Uso de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o fabrico de um medicamento para administração com pelo menos um agente terapêutico seleccionado entre os seguintes: um inibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1 ra, anakinra, um inibidor de TNFá, um receptor solúvel de TNFá, etanercept, um anticorpo anti-TNFá, infliximab, um anticorpo D2E7, metotrexato, uma forma solúvel de CTLA4, e um modulador de receptor glucocorticóide, para o tratamento de perda óssea associada a uma condição de auto-imunidade.
23. Uso de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o fabrico de um medicamento para administração com pelo menos um agente terapêutico seleccionado entre os seguintes: um inibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1 ra, anakinra, um inibidor de TNFa, um receptor solúvel de TNFá, etanercept, um anticorpo anti-TNFá, infliximab, um anticorpo D2E7, um fármaco anti-inflamatório não esteróide (ΑΙΝΕ), um inibidor de COX-2, celecoxib, rofecoxib, leflunomide, metotrexato, uma forma solúvel de CTLA4, e um modulador de receptor glucocorticóide, para o tratamento de perda óssea associada a artrite reumatóide.
24. Uso de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o fabrico de um medicamento para administração em conjunto com radioterapia ou quimioterapia, para o tratamento de perda óssea associada a cancro.
25. Um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o tratamento de perda óssea por administração com pelo menos um agente terapêutico seleccionado entre os seguintes: 5 factor morfogénico ósseo, factor-β de transformação do crescimento (TGF-β), uma hormona paratiróide, um análogo de uma hormona paratiróide, uma proteina relacionada com uma hormona paratiróide, um análogo de uma proteina relacionada com uma hormona paratiróide, uma prostaglandina, um bifosfonato, um alendronato, flúor, cálcio, e um factor de crescimento de fibroblasto (FGF).
26. Um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o tratamento de perda óssea associada a uma condição inflamatória por administração com pelo menos um agente terapêutico seleccionado entre os seguintes: um inibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1 ra, anakinra, um inibidor de TNFá, um receptor solúvel de TNFá, etanercept, um anticorpo anti-TNFá, infliximab, um anticorpo D2E7, um fármaco anti-inflamatório não esteróide (ΑΙΝΕ), um inibidor de COX-2, celecoxib, rofecoxib, e leflunomide.
27. Ant icorpo de qualquer umas das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o tratamento de perda óssea associada a uma condição de auto-imunidade por administração com pelo menos um agente terapêutico seleccionado entre os seguintes: um inibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1 ra, anakinra, um inibidor de TNFá, um receptor solúvel de TNFá, etanercept, um anticorpo anti-TNFá, infliximab, um anticorpo D2E7, metotrexato, uma forma solúvel de CTLA4, e um modulador de receptor glucocorticóide.
28. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para tratamento de perda óssea associada a artrite reumatóide por 6 administração com pelo menos um agente terapêutico seleccionado entre os seguintes: um inibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1 ra, anakinra, um inibidor de TNFá, um receptor solúvel de TNFá, etanercept, um anticorpo anti-TNFá, infliximab, um anticorpo D2E7, um fármaco anti-inflamatório não esteróide (ΑΙΝΕ), um inibidor de COX-2, celecoxib, rofecoxib, leflunomide, metotrexato, uma forma solúvel de CTLA4, e um modulador de receptor glucocorticóide.
29. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o tratamento de perda óssea associada a cancro por administração ou com radioterapia ou quimioterapia.
30. O uso da reivindicação 24, em que a forma de cancro é uma das seguintes: cancro da mama, cancro da próstata, cancro da tiróide, cancro do rim, cancro do pulmão, cancro do esófago, cancro do recto, cancro da bexiga, cervical, cancro dos ovários, cancro do figado, cancro gastrointestinal, mieloma múltiplo, linfoma, e doença de Hodgkin.
31. Anticorpo da reivindicação 29, em que a forma de cancro é uma das seguintes: cancro da mama, cancro da próstata, cancro da tiróide, cancro do rim, cancro do pulmão, cancro do esófago, cancro do recto, cancro da bexiga, cervical, cancro dos ovários, cancro do figado, cancro gastrointestinal, mieloma múltiplo, linfoma, e doença de Hodgkin.
32. 0 uso da reivindicação 24, em que a quimioterapia envolve o tratamento como pelo menos um agente seleccionado entre os seguintes: antraciclina, taxol, tamoxifeno, doxorubicina, 5-fluorouracil, e um antagonista da hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH). 7
33. Anticorpo da reivindicação 29, em que a quimioterapia envolve o tratamento como pelo menos um agente seleccionado entre os seguintes: antraciclina, taxol, tamoxifeno, doxorubicina, 5-fluorouracil, e um antagonista da hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH).
34. Uso de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 13 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 14 para o fabrico de um medicamento para administração com TRAIL. 100 8