ES2299601T3 - Toxinas cry3a modificadas y secuencias de acidos nucleicos que las codifican. - Google Patents

Abstract

Una toxina Cry3A modificada, que comprende un sitio de reconocimiento de proteasa que no se presenta de modo natural, en donde dicho sitio de reconocimiento de proteasa modifica una toxina Cry3A y está localizado en una posición seleccionada del grupo que consiste en: a) una posición entre aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 107 y 115 de la SEQ NO: 4; b) una posición entre aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4; y una posición entre aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 107 y 115 de la SEQ ID NO: 4, y c) entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4; en donde dicho sitio de reconocimiento de proteasa es reconocible por una proteasa intestinal del gusano de la raíz del maíz del oeste, y en donde dicha toxina Cry3A modificada causa mayor mortalidad al gusano de la raíz del maíz del oeste que la mortalidad causada por dicha toxina Cry3A al gusano de la raíz del maíz el oeste en una valoración biológica con dieta artificial.

Description

Toxinas Cry3A modificadas y secuencias de ácidos nucleicos que las codifican.

La presente invención se refiere a los campos de la ingeniería de las proteínas, a la biología molecular de las plantas y al control de plagas. Más particularmente, la presente invención se refiere a nuevas toxinas Cry3A modificadas y a las secuencias de ácidos nucleicos cuya expresión da como resultado las toxinas Cry3A modificadas, y a los métodos para preparar y a los métodos de usar las toxinas Cry3A modificadas y a las correspondientes secuencias de ácidos nucleicos para controlar insectos.

Las especies del gusano de la raíz de maíz se consideran las plagas más destructivas de los cereales. En los Estados Unidos las tres especies más importantes son Diabrotica virgifera virgifera, que es el gusano de la raíz del maíz del oeste; D. longicornis barberi, que es el gusano de la raíz del maíz del norte y D. undecimpunctata howardi, que es el gusano de la raíz del maíz del sur. Únicamente los gusanos de la raíz del maíz del oeste y del norte son considerados plagas primarias del maíz en el US Corn Belt (Zona del maíz de Estados Unidos). Las larvas del gusano de la raíz del maíz que se alimentan casi exclusivamente de las raíces del maíz causan el daño más importante en las plantas. Este daño ha demostrado que aumenta el encamamiento de las plantas, reduce la producción del cereal y el rendimiento vegetativo al mismo tiempo que altera el contenido de nutrientes del cereal. La alimentación de las larvas produce también efectos indirectos sobre el maíz al abrir avenidas a través de las raíces para las infecciones bacterianas y fúngicas que conducen a enfermedades de la raíz y pudrición del tallo. Los gusanos adultos de la raíz del maíz son activos en los maizales a finales del verano cuando se alimentan de espigas, estigmas y polen, interfiriendo con la polinización normal.

Los gusanos de la raíz del maíz son controlados principalmente mediante aplicaciones intensivas de plaguicidas químicos, que son activos a través de la inhibición del desarrollo o crecimiento del insecto, el impedimento de la alimentación o de la reproducción del insecto o causan la muerte. Por lo tanto, puede obtenerse un buen control del gusano de la raíz del maíz, pero estos productos químicos algunas veces también afectan a otros organismos beneficiosos. Otro problema resultante del amplio uso de plaguicidas químicos es la aparición de variedades resistentes del insecto. Un problema más se debe al hecho de que las larvas del gusano de la raíz del maíz se alimentan subterráneamente lo cual hace difícil aplicar tratamientos de rescate de los insecticidas. Por lo tanto, la mayor parte de las aplicaciones de insecticidas se efectúa profilácticamente en el momento de la siembra. Esta práctica ocasiona una gran carga ambiental. Esto ha sido parcialmente aliviado mediante diversas prácticas de gestión de instalaciones agrícolas, pero existe una creciente necesidad de descubrir mecanismos alternativos de control de plagas.

Los agentes biológicos para el control de plagas, tales como cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) que expresan toxinasplaguicidas similares a las \delta-endotoxinas, han sido aplicados también a plantas de cultivo con resultados satisfactorios principalmente contra plagas de insectos lepidópteros. Las \delta-endotoxinas son proteínas mantenidas dentro de una matriz cristalina que se sabe que poseen actividad insecticida cuando son ingeridas por ciertos insectos. Las diversas \delta-endotoxinas han sido clasificadas en base a su espectro de actividad y homología de secuencias. Antes de 1990, las principales clases fueron definidas por su espectro de actividad con las proteínas Cry1 activas contra lepidópteros (polillas y mariposas), las proteínas Cry2 activas tanto contra tanto lepidópteros como dípteros (moscas y mosquitos), las proteínas Cry3 activas contra coleópteros (escarabajos) y las proteínas Cy4 activas contra dípteros (Hofte y Whitely, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255. Recientemente, se ha desarrollado una nueva nomenclatura que clasifica sistemáticamente las proteínas Cry en base a la homología de sus secuencias de aminoácidos en vez de las especificidades contra el insecto diana (Crickmore et al. 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813).

El espectro de actividad insecticida de una \delta-endotoxina individual de Bt es bastante estrecho, siendo una \delta-endotoxina determinada activa únicamente contra unas pocas especies dentro de un orden. Por ejemplo, se sabe que la proteína Cry3A es muy tóxica contra el escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, pero tiene muy poca o ninguna toxicidad contra los escarabajos relacionados del género Diabrotica (Johnson et al., 1993, J. Econ. Entomol. 86:330-333). De acuerdo con Slaney et al. (1992, Insect Biochem. Molec. Biol. 22:9-18) la proteína Cry3A es por lo menos 2000 veces menos tóxica para las larvas del gusano de la raíz del maíz del sur que para el escarabajo de la patata de Colorado. También se sabe que la Cry3A tiene muy poca o ninguna toxicidad para el gusano de la raíz del maíz del oeste.

La especificidad de las \delta-endotoxinas es el resultado de la eficacia de las diversas etapas implicadas en la producción de la proteína que es una toxina activa y su subsiguiente interacción con las células epiteliales en el intestino medio del insecto. Para que sean insecticidas, la mayor parte de las \delta-endotoxinas conocidas deben ser ingeridas primero por el insecto y activadas proteolíticamente para formar una toxina activa. La activación de las proteínas cristalinas del insecticida es un proceso de multi-etapas. Después de la ingestión, los cristales deben solubilizarse primeramente en el intestino del insecto. Una vez solubilizadas las \delta-endotoxinas son activadas mediante disociaciones proteolíticas específicas. Las proteasas del intestino del insecto pueden jugar un papel en cuanto a la especificidad determinando donde se procesa la \delta-endotoxina. Una vez que la \delta-endotoxina ha sido solubilizada y procesada, se une a receptores específicos sobre la superficie del epitelio del intestino medio del insecto y subsiguientemente se integra en la bicapa lipídica de la membrana de borde piloso. Luego se forman canales iónicos que interrumpen la función normal del intestino medio conduciendo finalmente a la muerte del insecto.

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En los lepidópteros, las proteasas intestinales procesan las \delta-endotoxinas a partir de protoxinas de 130-140 kDa, a proteínas tóxicas de aproximadamente 60-70 kDa. Se ha descrito que el procesamiento de la protoxina a toxina prosigue por medio de la eliminación tanto de los aminoácidos N- como C-terminales, dependiendo la ubicación exacta del procesamiento de los fluidos específicos del intestino del insecto implicado (Qgiwara et al., 1992, J. Invert. Pathol. 60:121-126). La activación proteolítica de una \delta-endotoxina puede desempeñar un papel significativo para determinar su especificidad. Por ejemplo, una \delta-endotoxina de la variedad de Bt aizawa, denominada IC1, ha sido clasificada como una proteína Cry1Ab en base a su homología de secuencia con otras proteínas Cry1Ab conocidas. Las proteínas Cry1Ab son típicamente activas contra insectos lepidópteros. Sin embargo, la proteína IC1 tiene actividad tanto contra los insectos lepidópteros como contra los dípteros, dependiendo de la forma en que se procesa la proteína (Haider et al. 1986, Euro. J. Biochem. 156:531-540). En el intestino de los dípteros, se obtiene una toxina IC1 activa de 53 kDa, mientras que en el intestino de los lepidópteros, se obtiene una toxina IC1 activa de 55kDa. La IC1 difiere de la proteína del holotipo HP-1 Cry1Ab únicamente en cuatro aminoácidos, de manera que los grandes cambios en la región de unión del receptor no parecen explicar las diferencias de actividad. Las diferentes escisiones proteolíticas en los dos diferentes intestinos de insectos permiten posiblemente que las moléculas activadas se plieguen de forma diferente exponiendo por tanto diferentes regiones capaces de unirse a diferentes receptores. Por lo tanto, la especificidad parece residir en las proteasas del intestino de los diferentes insectos.

Los insectos coleópteros tienen intestinos que son más neutros a los ácidos, y las \delta-endotoxinas específicas de coleópteros son similares al tamaño de las toxinas específicas de lepidópteros activadas. Por lo tanto, el procesamiento de las \delta-endotoxinas específicas de coleópteros fue considerado anteriormente innecesario para la toxicidad. Sin embargo, recientes datos sugieren que las \delta-endotoxinas activas de coleópteros son solubilizadas y proteolizadas formando polipéptidos tóxicos más pequeños. La proteína de \delta-endotoxina Cry3A de 73 kDA producida por B. thuringiensis variedad tenebrionis es fácilmente procesada en la bacteria en el extremo N, perdiendo 49-57 residuos durante o después de la formación de los cristales para producir la forma comúnmente aislada de 67 kDa (Caroll et al., Biochem. J. 261:99-105). McPherson et al., 1988 (Biotechnology 6:61-66) también demostraron que el gen cry3A natural contiene dos codones funcionales de iniciación de la traducción en el mismo marco de lectura, uno que codifica la proteína de 73 kDa y el otro que codifica la proteína de 67 kDa a partir de Met-1 y Met-48 respectivamente, de la secuencia de aminoácidos deducida (véase la SEQ ID NO: 2). Ambas proteínas pueden considerarse proteínas Cry3A naturales de longitud completa. El tratamiento de la proteína soluble Cry3A de 67 kDa con tripsina o bien con extracto de intestino de insecto da como resultado un producto de escisión de 55 kDa, con Asn-159 de la secuencia de aminoácidos deducida en el extremo N. Se halló que este polipéptido era tan tóxico para un insecto coleóptero susceptible como la toxina natural Cry3A de 67 kDa. (Carroll et al., Ibid). Por lo tanto, existe un sitio de reconocimiento de la tripsina natural entre Arg-158 y Asn-159 de la secuencia de aminoácidos deducida de la toxina Cry3A natural (SEQ ID NO: 2). La Cry3A puede escindirse también mediante quimotripsina, lo cual da como resultado tres polipéptidos de 49, 11 y 6 kDa. El análisis N-terminal de los componentes de 49 y 6 kDa mostró que el primer residuo de aminoácido era Ser-162 y Tyr-588, respectivamente (Carroll et al., 1997 J. Invert. Biol. 70:41-49).Por lo tanto, existen sitios naturales de reconocimiento de quimotripsina en Cry3A entre His-161 y Ser-162 y entre Tyr-587 y Tyr-588 de la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 2). El producto de quimotripsina de 49 kDa parece ser más soluble a pH neutro que la proteína natural de 67 kDa o el producto de tripsina de 55 kDa y retiene la actividad insecticida total contra los insectos susceptibles a Cry3A, el escarabajo de la patata de Colorado y el escarabajo de la mostaza (Phaedon cochleariae). Las proteasas intestinales del insecto funcionan típicamente ayudando al insecto a obtener los aminoácidos necesarios de las proteínas de la dieta. Las proteasas digestivas de insecto mejor entendidas son las serina-proteasas que parecen ser las más comunes (Englemann y Geraerts, 1980, J. Insect Physiol. 261:703-710), particularmente en las especies de lepidópteros. La mayoría de adultos y larvas de los coleópteros, por ejemplo del escarabajo de la patata de Colorado, tienen intestinos medios ligeramente ácidos, y las cisteína-proteasas proporcionan la principal actividad proteolítica (Wolfson y Mudock, 1990, J. Chem. Ecol. 16:1089-1102). Más precisamente, Thie y Houseman (1990, Insect Biochem. 20:313-318) identificaron y caracterizaron las cisteína-proteasas, catepsinas B y H y la aspartil-proteasa, catepsina D en el escarabajo de la patata de Colorado. Gillekin et al., (1992, Arch. Insect Biochem. Physiol. 19:285-298) caracterizaron la actividad proteolítica en los intestinos de las larvas del gusano de la raíz del maíz del oeste y encontraron 15, proteasas principalmente cisteína-proteasas. Hasta la descripción en esta invención, no existe ningún informe que indique que la serina-proteasa, catepsina G, existe en el gusano de la raíz del maíz del oeste. La diversidad y diferentes niveles de actividad de las proteasas del intestino de los insectos pueden influenciar la sensibilidad de un insecto a una toxina Bt particular.

Durante los últimos cinco años se han descrito muchas nuevas y novedosas cepas Bt y \delta-endotoxinas con actividades biológicas mejoradas o nuevas incluyendo cepas que son activas contra nemátodos (Patente Europea 0517367A1). Sin embargo, relativamente muy pocas de estas cepas y toxinas tienen actividad contra los insectos coleópteros. Además, ninguna de las \delta-endotoxinas activas contra coleópteros, por ejemplo Cry3A, Cry3B, Cry3C, Cry7A, Cry8A, Cry8B y Cry8C, tiene suficiente toxicidad oral contra el gusano de la raíz del maíz para proporcionar un adecuado control del campos si son administradas, por ejemplo, a través de microbios o plantas transgénicas. Por lo tanto, es necesario explorar otros enfoques para producir nuevas toxinas activas contra el gusano de la raíz del maíz.

A medida que se ha obtenido más conocimiento con respecto a la función de las \delta-endotoxinas, han aumentados los intentos para manipular las \delta-endotoxinas de modo que tengan nuevas actividades. La manipulación por ingeniería genética de las \delta-endotoxinas tuvo más posibilidades al resolverse la estructura tridimensional de Cry3A en1991 (Li et al., 1991, Nature 353:815-821). La proteína tiene tres dominios estructurales: el dominio I N-terminal con los residuos 1-290, consiste en 7 hélices alfa, el dominio II con los residuos 291-500, contiene tres láminas beta y el dominio III C-terminal con los residuos 501-644, es un sándwich beta. En base a esta estructura, se ha formulado la hipótesis con respecto a la relación de estructura/función de las \delta-endotoxinas. Generalmente se cree que el dominio I es principalmente responsable de la formación de los poros en la membrana intestinal del insecto (Gazit y Shai, 1993, Appl. Environ. Microbiol. 57:2816-1820), el dominio II es principalmente responsable de la interacción con el receptor intestinal (Ge et al., 1991, J. Biol. Chem. 32:3429-3436) y que el dominio III está muy probablemente implicado en la estabilidad de la proteína. (Li et al., 1991, supra), así como también que tiene un impacto regulador sobre la actividad del canal iónico (Chen et al., 1993, PNAS 90:9041-9045).

Las \delta-endotoxinas activas en lepidópteros han sido manipuladas genéticamente en intentos para mejorar la actividad específica o para ampliar el espectro de actividad insecticida. Por ejemplo, el dominio de especificidad para la polilla de los estigmas (Bombyx mori) de Cry1Aa, se traspasó a Cry1Ac, impartiendo de esta manera una nueva actividad insecticida a la proteína quimérica resultante (Ge et al., 1989, PNAS (86:4037-4041). También Bosch et al. 1998 (Patente de EE.UU. 5.736.131), crearon una nueva toxina activa contra lepidópteros mediante el reemplazamiento del dominio III de Cry1E por el dominio III de Cry1C produciendo de esta manera la toxina híbrida Cry1E-Cry1C con un espectro más amplio de actividad en lepidópteros.

Se ha informado sobre varios intentos de manipulación genética de las \delta-endotoxinas activas en coleópteros. Van Rie et al., 1997, (Patente de EE.UU. nº 5.659.123) manipularon la Cry3A reemplazando aleatoriamente aminoácidos, que se consideraban importantes para la accesibilidad al disolvente, en el dominio II con el aminoácido alanina. Varios de estos reemplazamientos aleatorios confinados al dominio II de unión al receptor estuvieron implicados en el aumento de la toxicidad del gusano de la raíz del maíz del oeste. Sin embargo, otros han demostrado que algunos reemplazamientos con alanina en el dominio II de Cry3A dan como resultado la interrupción de la unión del receptor o inestabilidad estructural (Wu y Dean, 1996, J. Mol. Biol. 255:628-640). English et al., 1999, (publicación de solicitud de patente internacional No. WO 99/31248) describieron sustituciones de aminoácidos en Cry3Bb que causaban aumentos en la toxicidad para el gusano de la raíz del maíz del sur y del oeste. Sin embargo, de los 35 mutantes de Cry3Bb mencionados, únicamente tres, con mutaciones principalmente en el dominio II, y en la interfase dominio II-dominio I, fueron activos contra el gusano de la raíz del maíz del oeste. Además, las diferencias de toxicidad de las Cry3Bb de tipo natural contra el gusano de la raíz del maíz del oeste en los mismos ensayos, fueron superiores que cualquiera de las diferencias entre las toxinas Cry3Bb mutadas y las Cry3Bb de tipo natural. Por lo tanto, las mejoras en la toxicidad de los mutantes Cry3Bb parecen estar confinadas principalmente al gusano de la raíz del maíz del sur.

Sigue existiendo la necesidad de diseñar nuevos y más eficaces agentes para el control de plagas que proporcionen un beneficio económico para los agricultores y que sean ambientalmente aceptables. En particular se necesitan toxinas Cry3A modificadas que controlen el gusano de la raíz del maíz del oeste, que es la principal plaga del maíz en los Estados Unidos, que sean o que puedan ser resistentes a los agentes de control de insectos existentes. Además, son necesarios agentes cuya aplicación minimice la carga sobre el ambiente, tal como a través de plantas transgénicas.

En vista de estas necesidades, es un objeto de la presente invención proporcionar nuevas secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen toxinas Cry3A modificadas que tengan mayor toxicidad para el gusano de la raíz del maíz. Mediante la inserción de un sitio de reconocimiento de proteasas, que es reconocido por la proteasa intestinal de un insecto diana en por lo menos una posición de la toxina Cry3A, de acuerdo con la presente invención, se diseña una toxina Cry3A modificada que tiene una toxicidad significativamente superior, particularmente para el gusano de la raíz del maíz del oeste y del norte. La invención se refiere adicionalmente a la nuevas toxinas Cry3A modificadas resultantes de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos, y a las composiciones y formulaciones que contienen las toxinas Cry3A modificadas, que son capaces de inhibir la capacidad de las plagas de insectos para sobrevivir, crecer y reproducirse, o de limitar el daño relacionado con los insectos o la pérdida de plantas de cultivo. La invención se refiere además a un método de preparación de toxinas Cry3A modificadas y a métodos de uso de las secuencias de ácidos nucleicos de cry3A modificadas, por ejemplo en microorganismos para controlar insectos o en plantas transgénicas para conferir protección contra el deterioro causado por los insectos, y a un método de uso de las toxinas Cry3A modificadas, y a las composiciones y formulaciones que comprenden las toxinas Cry3A modificadas, por ejemplo aplicando las toxinas o composiciones o formulaciones de Cry3A modificadas a zonas infestadas por insectos, o para tratar profilácticamente plantas o zonas susceptibles a los insectos con el fin de conferir protección contra las plagas de insectos.

Las nuevas toxinas Cry3A modificadas descritas en la presente invención, son muy activas contra los insectos. Por ejemplo, las toxinas Cry3A modificadas de la presente invención pueden usarse para controlar plagas de insectos económicamente importantes, tales como el gusano de la raíz del maíz del oeste (Diabrotica virgifera virgifera) y el gusano de la raíz del maíz del norte (D. longicornis barberi). Las toxinas Cry3A modificadas pueden usarse solas o en combinación con otras estrategias para el control de insectos, para conferir una eficacia de control máxima de las plagas con un mínimo impacto ambiental.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada, en donde la toxina Cry3A modificada comprende por lo menos un sitio de reconocimiento de proteasa adicional que no se presenta de forma natural en una toxina Cry3A. El sitio de reconocimiento de proteasa adicional, que es reconocido por una proteasa intestinal de un insecto diana está insertado aproximadamente en la misma posición que el sitio de reconocimiento de la proteasa natural en la toxina Cry3A. La toxina Cry3A modificada causa mayor mortalidad a un insecto diana que la mortalidad causada por una toxina Cry3A al mismo insecto diana. Preferiblemente la toxina Cry3A modificada causa por lo menos aproximadamente 50% de mortalidad para un insecto diana en el cual una toxina Cry3A causa solo aproximadamente hasta 30% de mortalidad.

En una realización de este aspecto, la proteasa intestinal del insecto diana se selecciona del grupo que consiste en serina-proteasas, cisteína-proteasas y proteasas aspárticas. Preferiblemente las serina-proteasas de acuerdo con esta realización incluyen catepsina G, tripsina, quimotripsina, carboxipeptidasa, endopeptidasa y elastasa, más preferiblemente catepsina G.

En otra realización de este aspecto, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I o en el dominio III o tanto en el dominio I como en el dominio III en la toxina Cry3A. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I o en el dominio III o tanto en el dominio I como en el dominio III en una posición que reemplaza a, está adyacente a, o que está dentro del sitio de reconocimiento de la proteasa natural.

En otra realización, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a los números de aminoácido 154 y 162 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado entre los aminoácidos números 154 y 162 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 107 y115 de la SEQ ID NO: 4.

En todavía otra realización, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 160 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado entre los aminoácidos números 154 y 160 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 107 y 113 de la SEQ ID NO: 4.

En otra realización adicional, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 158 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el domino I entre los aminoácidos números 154 y 158 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 107 y 111 de la SEQ ID NO: 4.

En otra realización, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 583 y 589 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos números 583 y 589 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4.

En todavía otra realización, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 583 y 588 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de proteasa adicional está insertado entre los aminoácidos números 583 y 588 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 536 y 541 de la SEQ ID NO: 4.

En todavía otra realización el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4.

En una realización, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I y en el dominio III de la toxina Cry3A no modificada. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I en una posición que reemplaza o que está adyacente a un sitio de reconocimiento de proteasa natural y en el dominio III en una posición que está dentro, reemplaza a, o está adyacente a un sitio de reconocimiento de proteasa natural.

En otra realización, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 160 y en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 154 y 160 y en el dominio III entre los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2 o en el dominio I entre los aminoácidos números 107 y 113 y en el dominio III entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4.

En todavía otra realización, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está situado en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 158 y en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 154 y 158 y en el dominio III entre los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2 o en el dominio I entre los aminoácidos números 107 y 111 y en el dominio III entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4.

En otra realización, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está situado en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 158 y en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 583 y 588 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 154 y 158 y en el dominio III entre los aminoácidos números 583 y 558 de la SEQ ID NO: 2 o en el dominio I entre los aminoácidos números 107 y 111 y en el dominio III entre los aminoácidos números 536 y 541 de la SEQ ID NO: 4.

En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 6, los nucleótidos 1-1806 de la SEQID NO: 8, los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 10, los nucleótidos 1-1794 de la SEQ ID NO: 12, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 14, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 16, los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 18 o los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 20.

En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención codifica una toxina Cry3A modificada que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 21.

De acuerdo con una realización de la invención, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una toxina Cry3A modificada que es activa contra un insecto coleóptero. Preferiblemente, la toxina Cry3A modificada tiene actividad contra el gusano de la raíz del maíz del oeste.

La presente invención proporciona un gen quimérico que comprende una secuencia promotora heteróloga unida operativamente a la molécula de ácido nucleico de la invención. La presente invención proporciona también un vector recombinante que comprende dicho gen quimérico. Además, la presente invención proporciona una célula hospedante no humana transgénica, tal como un gen quimérico. Una célula hospedante transgénica de acuerdo con este aspecto de la invención puede ser una célula bacteriana o una célula vegetal, preferiblemente, una célula vegetal. La presente invención proporciona además una planta transgénica que comprende dicha célula vegetal. Una planta transgénica de acuerdo con este aspecto de la invención puede ser sorgo, trigo, girasol, tomate, patata, cultivo de coles, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza de semilla oleaginosa o maíz, preferiblemente maíz. La presente invención proporciona también semillas del grupo de plantas transgénicas que consisten en sorgo, trigo, girasol, tomate, patata, cultivos de col, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza de semilla oleaginosa y maíz. En una realización particularmente preferida, la semilla es de una planta transgénica de maíz. En otro aspecto, la presente invención proporciona toxinas producidas por la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención. En una realización preferida, la toxina se produce mediante la expresión de la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 6, los nucleótidos 1-1806 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 10, los nucleótidos 1-1794 de la SEQ ID NO: 12, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 14, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 16, los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 18 o los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 20.

En otra realización, las toxinas de la invención son activas contra insectos coleópteros, preferiblemente contra el gusano de la raíz del maíz del oeste.

En una realización una toxina de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 21.

La presente invención proporciona también una composición que comprende una cantidad eficaz controladora de insectos de una toxina de acuerdo con la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una toxina que se activa contra insectos, que comprende: (a) obtener una célula hospedante que comprende un gen quimérico, que comprende por sí mismo una secuencia promotora heteróloga unida operativamente a la molécula de ácido nucleico de la invención: y (b) expresar la molécula de ácido nucleico en la célula hospedante transgénica, lo cual da como resultado por lo menos una toxina que es activa contra insectos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una planta transgénica resistente a insectos, que comprende introducir una molécula de ácido nucleico de la invención en la planta transgénica, en donde la molécula de ácido nucleico es expresable en la planta transgénica en una cantidad eficaz para controlar insectos. En una realización preferida, los insectos son insectos coleópteros, preferiblemente el gusano de la raíz del maíz del oeste.

En todavía un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para controlar insectos, que comprende administrar a los insectos una cantidad eficaz de una toxina de la invención. De acuerdo con una realización, los insectos son insectos coleópteros, preferiblemente el gusano de la raíz del maíz del oeste. Preferiblemente, la toxina se administra a los insectos oralmente. En una realización preferida, la toxina se administra oralmente a través de una planta transgénica que comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa una toxina de la presente invención.

Asimismo se proporciona mediante la presente invención un método para preparar una toxina Cry3A modificada, que comprende: (a) obtener un gen cry3A de toxina que codifica una toxina Cry3A; (b) identificar una proteasa intestinal de un insecto diana; (c) obtener una secuencia de nucleótidos que codifica un secuencia de reconocimiento para la proteasa intestinal; (d) insertar la secuencia de nucleótidos de (c) en el dominio I o en el dominio III o tanto en el dominio I como en el dominio II en una posición que reemplaza a, está dentro de, o está adyacente a, una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de reconocimiento de proteasa natural en un gen cry3A de toxina, creando de esta manera un gen cry3A de toxina modificado; (e) insertar el gen de toxina cry3A modificado en un casete de expresión; (f) expresar el gen cry3A de toxina modificado en una célula hospedante no humana lo cual da como resultado que la célula hospedante produzca una toxina Cry3A modificada; y (g) valorar biológicamente la toxina Cry3A modificada contra un insecto diana, con la cual la toxina Cry3A modificada causa mayor mortalidad al insecto diana que la mortalidad causada por una toxina Cry3A. En una realización preferida, la toxina Cry3A modificada causa por lo menos aproximadamente 50% de mortalidad al insecto diana cuando la toxina Cry3A causa hasta aproximadamente 30% de mortalidad.

La presente invención proporciona también un método para controlar insectos en donde la planta transgénica comprende además una segunda secuencia de ácido nucleico o grupos de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un segundo principio plaguicida. Las segundas secuencias de ácidos nucleicos particularmente preferidas son las que codifican una \delta-endotoxina, las que codifican una toxina proteínica insecticida vegetativa, descrita en las Patentes de EE.UU. 5.849.870 y 5.877.012, que se incorporan como referencia en la presente memoria, o las que codifican una vía para la producción de un principio plaguicida no proteínico.

Un aspecto más de la presente invención es la creación de un método para mutagenizar una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en donde la molécula de ácido nucleico ha sido escindida en poblaciones de fragmentos bicatenarios aleatorios de un tamaño deseado, que comprende: (a) añadir a la población de fragmentos bicatenarios aleatorios uno o más oligonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, en donde los oligonucleótidos comprenden cada uno una zona de identidad y una zona de heterología para un molde de polinucleótido bicatenario; (b) desnaturalizar la mezcla resultante de fragmentos bicatenarios aleatorios y oligonucleótidos en fragmentos monocatenarios; (c) incubar la población resultante de fragmentos monocatenarios con polimerasa en condiciones que dan como resultado la reasociación de los fragmentos monocatenarios en las zonas de identidad para formar pares de fragmentos reasociados, siendo las zonas de identidad suficientes para que un miembro del par cebe (inicie) la replicación del otro, formando de esta manera un polinucleótido bicatenario mutagenizado; y (d) repetir la segunda y tercera etapas por lo menos dos ciclos más, en donde la mezcla resultante en la segunda etapa de un ciclo posterior incluye el polinucleótido bicatenario mutagenizado de la tercera etapa del ciclo previo, y en donde el ciclo posterior forma un polinucleótido bicatenario adicional mutagenizado.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de un estudio de la siguiente descripción de la invención y de los ejemplos no limitativos.

SEQ ID NO: 1

es la región codificadora del gen cry3A natural.

SEQ ID NO: 2

es la secuencia de aminoácidos de la toxina Cry3A codificada por el gen cry3A natural.

SEQ ID NO: 3

es la región codificadora del gen cry3A del maíz optimizada que comienza en el nucleótido 144 de la región codificadora del gen cry3A natural.

SEQ ID NO: 4

es la secuencia de aminoácidos de la toxina Cry3A codificada por el gen cry3A del maíz optimizado.

SEQID NO: 5

es la secuencia de nucleótidos de pCIB6850.

SEQ ID NO: 6

es la secuencia codificadora del gen cry3A054 del maíz modificada y optimizada.

SEQ ID NO: 7

es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 8

es la secuencia codificadora del gen cry3A055 del maíz modificada y optimizada.

SEQ ID NO: 9

es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 10

es la secuencia codificadora del gen cry3A085 del maíz modificada y optimizada.

SEQ ID NO: 11

es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 12

es la secuencia codificadora del gen cry3A082 del maíz modificada y optimizada.

SEQ ID NO: 13

es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12.

SEQ ID NO: 14

es la secuencia codificadora del gen cry3A058 del maíz modificada y optimizada.

\newpage

SEQ ID NO: 15

es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 14.

SEQ ID NO: 16

es la secuencia codificadora del gen cry3A057 del maíz modificada y optimizada.

SEQ ID NO: 17

es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 16.

SEQ ID NO: 18

es la secuencia codificadora del gen cry3AO56 del maíz modificada y optimizada.

SEQ ID NO: 19

es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18.

SEQ ID NO: 20

es la secuencia codificadora del gen cry3A083 del maíz modificada y optimizada.

SEQ ID NO: 21

es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQID NO: 20.

SEQ ID NOS: 22-34

son los cebadores de PCR útiles en la presente invención.

SEQ ID NO: 35

es una secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de reconocimiento de catepsina G.

SEQ ID NO: 36

es una secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de reconocimiento de catepsina G.

SEQ ID NO: 37

es una secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de reconocimiento de catepsina G

SEQ ID NO: 38

es una secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de reconocimiento de catepsina G.

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Por razones de claridad, ciertos términos usados en la memoria se definen y presentan de la manera siguiente:

"Actividad" de las toxinas Cry3A modificadas de la invención significa que las toxinas Cry3A modificadas funcionan como agente oralmente activo para el control de insectos, tienen un efecto tóxico, o son capaces de impedir o interrumpir la alimentación del insecto, lo cual puede o no causar la muerte del insecto. Cuando una toxina Cry3A modificada de la invención se administra al insecto, el resultado es típicamente la muerte del insecto, o el insecto deja de alimentarse de la fuente que hace que la toxina Cry3A modificada esté disponible para el insecto.

"Adyacente a"- De acuerdo con la presente invención, un sitio de reconocimiento de proteasa adicional está "adyacente a" un sitio de reconocimiento de proteasa natural cuando el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está dentro de cuatro residuos, preferiblemente dentro de tres residuos, más preferiblemente dentro de dos residuos, y aún más preferiblemente dentro de un residuo de un sitio de reconocimiento de proteasa natural. Por ejemplo, un sitio de reconocimiento de proteasa adicional insertado entre Pro-154 y Arg-158 de la secuencia de aminoácidos deducida de una toxina Cry3A (SEQ ID NO: 2) está "adyacente" al sitio de reconocimiento de tripsina natural ubicado entre
Arg-158 y Asn-159 de la secuencia de aminoácidos deducida de la toxina Cry3A (SEQ ID NO: 2).

La frase "aproximadamente la misma posición", tal como se usa en la presente memoria para describir el lugar en donde está insertado el sitio de reconocimiento de proteasa adicional en una toxina Cry3A en relación a un sitio de reconocimiento de proteasa natural, significa que el lugar está como máximo cuatro residuos lejos de un sitio de reconocimiento de proteasa natural. El lugar puede estar también alejado tres o dos residuos de un sitio de reconocimiento de proteasa natural. El lugar puede estar también un residuo alejado de un sitio de reconocimiento de proteasa natural. "Aproximadamente la misma posición" puede significar también que el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado dentro de un sitio de reconocimiento de proteasa natural.

"Asociada con/unida operativamente" se refiere a dos secuencias de ácido nucleico que están relacionadas física o funcionalmente. Por ejemplo, una secuencia de DNA promotora o reguladora se dice que está "asociada con" una secuencia de DNA que codifica un RNA o una proteína si las dos secuencias están unidas operativamente, o están situadas de manera que la secuencia de DNA reguladora afectará el nivel de expresión de la secuencia de DNA estructural o codificadora.

Un "gen quimérico" o "construcción quimérica" es una secuencia de ácido nucleico recombinante en la cual una secuencia de ácido nucleico promotora o reguladora está unida operativamente a, o asociada con, una secuencia de ácido nucleico que codifica un RNAm o que se expresa como una proteína, de modo que la secuencia de ácido nucleico reguladora es capaz de regular la transcripción o expresión de la secuencia codificadora de ácido nucleico asociada. La secuencia de ácido nucleico reguladora del gen quimérico no está normalmente unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico asociada tal como se encuentra en la naturaleza.

\newpage

Una "secuencia codificadora" es una secuencia de ácido nucleico que es transcrita en RNA, tal como RNAm, rRNA, tRNA, snRNA, RNA con sentido o RNA antisentido. Preferiblemente el RNA es luego traducido en un organismo para producir una proteína.

"Controlar" insectos significa inhibir, a través de un efecto tóxico, la capacidad de una plaga de insectos para sobrevivir, desarrollarse, alimentarse y/o reproducirse, o para limitar el deterioro relacionado con los insectos o la pérdida de plantas de cultivo.

"Controlar" insectos puede significar o no la muerte de los insectos, aunque preferiblemente significa la muerte de los insectos.

"Corresponder a": en el contexto de la presente invención, "corresponder a" significa que cuando las secuencias de aminoácidos de las \delta-endotoxinas Cry3A variantes están alineadas una con la otra, los aminoácidos que "corresponden a" ciertas posiciones enumeradas en la presente invención son los que están alineados con estas posiciones en la toxina Cry3A (SEQ ID NO: 2), pero no están necesariamente en estas posiciones numéricas exactas en relación a la secuencia de aminoácidos de Cry3A particular de la invención. Por ejemplo, el gen cry3A del maíz optimizado (SEQ ID NO: 3) de la invención codifica una toxina Cry3A (SEQ ID NO: 4) que comienza en Met-48 de la toxina Cry3A (SEQ ID NO: 2) codificada por el gen cry3A natural (SEQ ID NO: 1). Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, los aminoácidos números 107-115, incluyendo todos los números entre los mismos, y 536-541, incluyendo todos los números entre los mismos, de la SEQID NO: 4 corresponden a los aminoácidos números 154-163, y todos los números entre los mismos, y 583-588, y todos los números entre los mismos, respectivamente, de la SEQID NO: 2.

Una "toxina Cry3A", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una proteína activa contra coleópteros de (Bt) (Sekar et al., 1987, Proc, Nalt. Acad. Sci. 84:7036-7040), de Bacillus thurigiensis variedad tenebrionis de aproximadamente 73 kDa (Kreig et al., 1983, Z. Angew. Entomol. 96:500-508), por ejemplo la SEQ ID NO: 2, así como también cualesquiera variantes truncadas de peso molecular inferior, derivable de una toxina Cry3A, por ejemplo la SEQ ID NO: 4, y que retiene sustancialmente la misma toxicidad que la toxina Cry3A. Las variantes de menor peso molecular pueden obtenerse mediante la escisión de la proteasa de sitios de reconocimiento de la proteasa natural de la toxina Cry3A o mediante un segundo codón de iniciación de la traducción en el mismo marco que el codón de iniciación de traducción que codifica la toxina Cry3A de 73 kDa. La secuencia de aminoácidos de una toxina Cry3A y sus variantes de peso molecular inferior pueden hallarse en una toxina que se presenta de forma natural en Bt. Una toxina Cry3A puede estar codificada por un gen Bt natural, tal como la SEQ ID NO: 1 o por una secuencia codificadora sintética, tal como en la SEQ ID NO: 3. Una "toxina Cry3A2" no tiene sitios de reconocimiento de proteasa adicionales con respecto a los sitios de reconocimiento de proteasa que se presentan naturalmente en la toxina Cry3A. Una toxina Cry3A puede aislarse, purificarse o expresarse en un sistema heterólogo.

Un "gen cry3A", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la secuencia de nucleótidos de la SEQID NO: 1 ola SEQ ID NO: 3. Un gen cry3A(Sekar et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7036-7040) puede presentarse de forma natural, tal como el que se encuentra en Bacillus thuringiensis variedad tenebrionis (Kreig et al., 1983, Z. Angew. Entomol. 96:500-508), o puede ser sintético y codifica una toxina Cry3A. El gen cry3A de esta invención puede denominarse un gen cry3A natural, tal como en la SEQ ID NO: 1 o como el gen cry3A del maíz optimizado, tal como en la SEQ ID NO: 3.

"Administrar" una toxina significa que la toxina entra en contacto con un insecto, lo cual da como resultado un efecto tóxico y control del insecto. La toxina puede administrarse de muchas formas reconocidas, por ejemplo, oralmente por ingestión por el insecto o por contacto con el insecto a través de la expresión en plantas transgénicas, en una(s) composición(es) de proteínas formuladas, en una(s) composición(es) de proteína rociable(s), en una matriz para cebo, o en cualquier otro sistema de administración de toxinas reconocido en la técnica.

"Cantidad eficaz controladora de insectos" significa la concentración de toxina que inhibe, a través de un efecto tóxico, la capacidad de los insectos para sobrevivir, desarrollarse, alimentarse y/o reproducirse, o para limitar el daño relacionado con los insectos o la pérdida de plantas de cultivo. "Cantidad eficaz controladora de insectos" puede o no puede significar matar los insectos, aunque preferiblemente significa matar los insectos.

"Casete de expresión" tal como se usa en la presente memoria significa una secuencia de ácido nucleico que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula hospedante apropiada, que comprende un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés que a su vez está unida operativamente a señales de terminación. Típicamente también comprende las secuencias requeridas para una correcta traducción de la secuencia de nucleótidos. El casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, lo cual significa que por lo menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a por lo menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión puede ser también natural pero que se ha obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Típicamente, sin embargo, el casete de expresión es heterólogo con respecto al hospedante, es decir, la secuencia particular de ácido nucleico del casete de expresión no se presenta de forma natural en la célula hospedante y debe haber sido introducida en la célula hospedante o en un antecesor de la célula hospedante mediante un episodio de transformación. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción únicamente cuando la célula hospedante es expuesta a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, tal como una planta, el promotor puede ser también específico para un tejido particular u órgano o etapa de desarrollo.

Un "gen" es una región definida que está situada dentro de un genoma y que, además de la secuencia de ácido nucleico codificadora antes mencionada, comprende otras secuencias de ácido nucleico principalmente reguladoras responsables del control de la expresión, es decir de la transcripción y de la traducción de la porción codificadora. Un gen puede comprender también otras secuencias 5' y 3' no traducidas y secuencias de terminación. Otros elementos que pueden estar presentes son, por ejemplo, intrones.

"Gen de interés" se refiere a cualquier gen que, cuando es transferido a una planta, confiere a la planta una característica deseada, tal como resistencia a antibióticos, resistencia a virus, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades o resistencia a otras plagas, tolerancia a los herbicidas, valor nutricional mejorado, mejor rendimiento en un proceso industrial o capacidad reproductiva alterada. El "gen de interés" puede ser también uno que es transferido a plantas para la producción en la planta de metabolitos o enzimas comercialmente valiosos.

Una "proteasa intestinal" es una proteasa que se encuentra naturalmente en el tracto digestivo de un insecto. Esta proteasa usualmente está implicada en la digestión de las proteínas ingeridas.

Una secuencia de ácido nucleico "heteróloga" es una secuencia de ácido nucleico que no está naturalmente asociada con una célula hospedante dentro de la cual es introducida, incluyendo copias múltiples que no están presentes en forma natural de una secuencia natural de ácido nucleico.

Una secuencia de ácido nucleico "homóloga" es una secuencia de ácido nucleico naturalmente asociada con una célula hospedante dentro de la cual es introducida.

"Recombinación homóloga" es el intercambio recíproco de fragmentos de ácido nucleico entre moléculas de ácido nucleico homólogas.

"Insecticida" se define como una actividad biológica tóxica capaz de controlar insectos, preferiblemente exterminándolos.

Una secuencia de ácido nucleico es "iso-codificadora con" una secuencia de ácido nucleico de referencia cuando la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de referencia.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" o una toxina aislada es una molécula de ácido nucleico o toxina que, por la acción del hombre, existe fuera de su ambiente natural y por lo tanto no es un producto de la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico o toxinaaislada puede existir en una forma purificada o puede existir en un ambienten natural, tal como, por ejemplo, una célula hospedante recombinante.

Una "toxina Cry3A modificada" de esta invención, se refiere a una toxina derivada de Cry3A que tiene por lo menos un sitio de reconocimiento de proteasa adicional que es reconocido por una proteasa intestinal de un insecto diana, que no está presente naturalmente en una toxina Cry3A. Una toxina Cry3A modificada no existe de forma natural y, por la acción del hombre, comprende una secuencia de aminoácidos que no es idéntica a una toxina natural que se encuentra en Bacillus thuringiensis. La toxina Cry3A modificada produce una mortalidad más elevada de un insecto diana que la mortalidad causada por una toxina Cry3A al mismo insecto diana.

Un "gen cry3A modificado" de acuerdo con esta invención, se refiere a un gen derivado de cry3A que comprende la secuencia codificadora de por lo menos un sitio de reconocimiento de proteasa adicional que no existe de forma natural en el gen cry3A no modificado. El gen cry3A modificado puede derivar de un gen cry3A natural o de un gen cry3A sintético.

Un "sitio de reconocimiento de proteasa natural". es un lugar dentro de la toxina Cry3A que es escindido mediante una proteasa que no procede de un insecto o mediante una proteasa o extracto intestinal de una especie de insectos susceptible a la toxina Cry3A. Por ejemplo, un sitio de reconocimiento de una proteasa natural, reconocido por tripsina y proteasas que se encuentran en un extracto intestinal de insecto susceptible, existe entre Arg-158 y Asn-159 de la secuencia de aminoácidos de la toxina Cry3A deducida (SEQ ID NO: 2). Los sitios de reconocimiento de proteasa naturales, reconocidos por quimotripsina, existen entre His-161 y Ser-162, así como también entre Tyr-587 y Tyr-588 de la secuencia de aminoácidos de la toxina Cry3A deducida (SEQ ID NO: 2).

Una "molécula de ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" es un segmento lineal de un DNA o RNA monocatenario o bicatenario que puede aislarse de cualquier fuente. En el contexto de la presente invención, la molécula de ácido nucleico es preferiblemente un segmento de DNA.

Una "planta" es cualquier planta en cualquier de desarrollo, particularmente una planta de semilla.

Una "célula vegetal" es una unidad estructural y fisiológica de una planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula vegetal puede tener la forma de una sola célula aislada o de una célula cultivada, o puede formar parte de una unidad organizada superior, tal como por ejemplo tejido de planta, órgano de planta, o una planta entera.

"Cultivo de célula vegetales" significa cultivo de unidades de plantas, tales como por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células de tejidos de plantas, polen, tubos de polen, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en varias etapas de desarrollo.

"Material vegetal" se refiere a hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutos, polen, óvulos, cigotos, semillas, esquejes, cultivos de células o tejidos, o cualquier otra parte o producto de una planta.

"Un órgano vegetal" es una parte distinta y visiblemente estructurada y diferenciada de un vegetal, tal corno una raíz, un tallo, una hoja, un brote de flor o un embrión.

"Tejido vegetal" tal como se usa en la presente memoria se refiere a un grupo de células vegetales organizadas en una unidad estructural y/o funcional. Incluye cualquier tejido de una planta in planta o de cultivo. Este término incluye, pero sin limitación, plantas enteras, órganos vegetales, semillas de vegetales, cultivos de tejidos y cualquier grupo de células vegetales organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. El uso de este término conjuntamente con, o en ausencia de cualquier tipo específico de tejido vegetal, tal como se enumera anteriormente o en otra parte abarcado por esta definición no pretende excluir cualquier otro tipo de tejido vegetal.

Un "promotor" es una secuencia de DNA no traducida situada hacia el extremo 5' de la región codificadora que contiene el sitio de unión para la RNA-polimerasa e inicia la transcripción del DNA. La región promotora puede incluir también otros elementos que actúan como reguladores de la expresión génica.

Un "protoplasto" es una célula vegetal aislada sin pared celular o únicamente con partes de la pared celular.

"Elementos reguladores" se refiere a las secuencias implicadas en controlar la expresión de una secuencia de nucleótidos. Los elementos reguladores comprenden un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés y a las señales de terminación. Típicamente abarcan las secuencias necesarias para una adecuada traducción de la secuencia de nucleótidos.

"Reemplaza" a un sitio de reconocimiento de proteasa natural - De acuerdo con la presente invención, un sitio de reconocimiento de proteasa adicional "reemplaza" a un sitio de reconocimiento de proteasa natural cuando la inserción del sitio de reconocimiento de proteasa adicional elimina el sitio de reconocimiento de proteasa natural. Por ejemplo, un sitio de reconocimiento de proteasa adicional entre Pro-154 y Pro-160 de la secuencia de aminoácidos deducida de una toxina Cry3A (SEQ ID NO: 2) que elimina los residuos Arg-158 y Asn-159 "reemplaza" al sitio de reconocimiento de tripsina natural situado entre Arg-158 y Asn-159 de la secuencia de aminoácidos deducida de la toxina Cry3A (SEQ ID NO: 2).

"Serina-proteasas", describe el mismo grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos covalentes usando un mecanismo basado en el ataque nucleófilo del enlace peptídico diana mediante una serina. Las serina-proteasas son específicas de secuencia. Es decir, cada serina-proteasa reconoce una sub-secuencia específica dentro de una proteína en donde ocurre el reconocimiento enzimático.

Un "insecto diana" es una especie de plaga de insectos que tiene muy poca o ninguna susceptibilidad a una toxina Cry3A y se identifica porque es candidato para usar la tecnología de la presente invención como control. Este control puede lograrse a través de diversos medios, pero el más preferible es a través de la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención en plantas transgénicas.

Una "proteasa intestinal del insecto diana" es una proteasa que se encuentra en el intestino de un insecto diana cuyo sitio de reconocimiento puede estar insertado en una toxina Cry3A para crear una toxina Cry3A modificada de la invención.

"Transformación" es un procedimiento para introducir ácido nucleico heterólogo en una célula u organismo hospedante. En particular, "transformación" significa la integración estable de una molécula de DNA en el genoma de un organismo de interés.

"Transformado/transgénico/recombinante" se refiere a un organismo hospedante, tal como una bacteria o una planta en el cual se ha introducido una molécula heteróloga de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico puede estar establemente integrada en el genoma del hospedante o la molécula de ácido nucleico puede estar también presente como molécula extracromosómica. Dicha molécula extracromosómica puede ser auto-replicante. Se entiende que las células, tejidos o plantas transformados abarcan no solamente el producto final de un proceso de transformación, sino también su progenie transgénica. Un hospedante "no transformado", "no transgénico", o "no recombinante" se refiere a un organismo de tipo natural, por ejemplo una bacteria o una planta; que no contiene la molécula de ácido nucleico heteróloga.

"Dentro" de un sitio de reconocimiento de proteasa natural - De acuerdo con la presente invención un sitio de reconocimiento de proteasa adicional está "dentro" de un sitio de reconocimiento de proteasa natural cuando el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está entre el residuo de aminoácido que viene antes y el residuo de aminoácido que viene después del sitio de reconocimiento de proteasa natural. Por ejemplo, un sitio de reconocimiento de proteasa adicional insertado entre Tyr-587 y Tyr-588 de la secuencia de aminoácidos deducida de una toxina Cry3A (SEQ ID NO: 2) está "dentro" de un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural situado entre Try-587 y Tyr-588 de la secuencia de aminoácidos deducida de la toxina Cry3A (SEQ ID NO: 2). La inserción de un sitio de reconocimiento de proteasa adicional dentro del sitio de reconocimiento de proteasa natural puede cambiar o no el sitio de reconocimiento de la proteasa natural mediante una proteasa.

Los nucleótidos están indicados por sus bases mediante las siguientes abreviaturas convencionales: adenina (A), citosina (C), timina (T) y guanina (G). Los aminoácidos están también indicados mediante las siguientes abreviaturas: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparraguina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys, C), glutamina (Gln; O), ácido glutámico (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His, H), isoleucina (Ile; 1), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T); triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y), y valina (Val; V).

Esta invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos cry3A modificadas cuya expresión da como resultado las toxinas Cry3A modificadas, y a la preparación y uso de las toxinas Cry3A modificadas para controlar plagas de insectos. La expresión de la secuencias de ácidos nucleicos cry3A modificadas dan como resultado toxinas Cry3A modificadas que pueden usarse para controlar insectos coleópteros, tales como el gusano de la raíz del maíz del oeste y el gusano de la raíz del maíz del norte. Una toxina Cry3A modificada de la presente invención comprende por lo menos un sitio de reconocimiento de proteasa adicional que no está presente de forma natural en una toxina Cry3A El sitio de reconocimiento de proteasa adicional, que es reconocido por una proteasa intestinal de un insecto diana, está insertado aproximadamente en la misma posición que el sitio de reconocimiento de la proteasa natural en una toxina Cry3A. La toxina Cry3A modificada produce una mortalidad mayor para un insecto diana que la mortalidad causada por una toxina Cry3A en el mismo insecto diana. Preferiblemente, la toxina Cry3A modificada produce por lo menos aproximadamente 50% de mortalidad en el insecto diana en el que una toxina Cry3A produce hasta aproximadamente 30% de mortalidad.

En una realización preferida, la invención comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una toxina Cry3A modificada, en donde el sitio de reconocimiento de proteasa adicional es reconocido por la proteasa intestinal del insecto diana, catepsina G. Se determina que la actividad de la catepsina G está presente en el intestino del insecto diana, del gusano de la raíz del maíz del oeste, tal como se describe en el Ejemplo 2. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos sustrato, AAPF (SEQ ID NO: 35) usada para determinar la presencia de la actividad de la catepsina G está insertada en la toxina Cry3A de acuerdo con la presente invención. También pueden usarse otros sitios de reconocimiento de catepsina G de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, AAPM (SEQ ID NO: 36); AVPF (SEQ ID NO: 37), PFLF (SEQ ID NO: 38) u otros sitios de reconocimiento de catepsina G, tal como se determina mediante el método de Tanaka et al., 1985 (Biochemistry 24:2040-2047), que se incorpora en la presente memoria como referencia. Pueden usarse por ejemplo sitios de reconocimiento de proteasa de otras proteasas identificadas en un intestino de un insecto diana, por ejemplo, los sitios de reconocimiento de proteasa reconocidos por otras serina-proteasas, cisteína-proteasas y proteasas aspárticas. Las serina-proteasas preferidas abarcadas por esta realización incluyen tripsina, quimotripsina, carboxipeptidasa, endopeptidasa y elastasa.

En otra realización preferida, la invención abarca una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una toxina Cry3A modificada, en donde el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I o en el dominio III o tanto en el dominio I como en el dominio III de la toxina Cry3A. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I, dominio III o tanto dominio I y como dominio III en una posición que reemplaza, está adyacente a, o está dentro de, un sitio de reconocimiento de una proteasa natural en una toxina Cry3A. Específicamente ejemplificadas en la presente invención están las moléculas de ácido nucleico que codifican las toxinas Cry3A modificadas que comprenden un sitio de reconocimiento de catepsina G insertado en el dominio I, en el dominio III o tanto en el dominio I como en el dominio III en una posición que reemplaza a, está adyacente a, o está dentro, de un sitio de reconocimiento de proteasa natural en la toxina Cry3A no modificada.

Las enseñanzas específicamente ejemplificadas de los métodos para preparar moléculas modificadas de ácido nucleico de cry3A que codifican las toxinas Cry3A modificadas pueden hallarse en el Ejemplo 3. Los expertos en la técnica reconocerán que pueden usarse también otros métodos conocidos en la técnica para insertar sitios de reconocimiento de proteasa adicionales en las toxinas Cry3A de acuerdo con la presente invención.

En otra realización preferida, la invención abarca una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una toxina Cry3A modificada en donde el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 162 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado entre los aminoácidos números 154 y 162 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 107 y 115 de la SEQ ID NO: 4. En una realización preferida, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 160 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado entre los aminoácidos números 154 y 160 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 107 y 113 de la SEQ ID NO: 4. Específicamente se ilustra como ejemplo en esta memoria una molécula de ácido nucleico denominada cry3A054 (SEQ ID NO: 6), que codifica la toxina Cry3A054 modificada (SEQ ID NO: 7) que comprende un sitio de reconocimiento de catepsina G insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 107 y 113 de la SEQ ID NO: 4. El sitio de reconocimiento de catepsina G reemplaza a un sitio de reconocimiento de tripsina natural y está adyacente a un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural. Cuando se expresa en un hospedante heterólogo, la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 6 da como resultado una actividad para el control de insectos contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y el gusano de la raíz del maíz del norte, que muestra que la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID NO: 6 es suficiente para la actividad de dicho control de insectos.

En otra realización preferida, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 158 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 154 y 158 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 107 y 111 de la SEQ ID NO: 4. Específicamente se ilustran como ejemplo en esta memoria las moléculas de ácido nucleico denominadas cry3A055 (SEQ ID NO: 8), que codifican la toxina Cry3A055 modificada (SEQ ID NO: 9), cry3A085 (SEQ ID NO: 10), que codifica la toxina Cry3A085 modificada (SEQ ID NO: 11), que comprenden el sitio de reconocimiento de catepsina G insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 107 y 111 de la SEQ ID NO: 4. El sitio de reconocimiento de catepsina G está adyacente a los sitios de reconocimiento de tripsina y quimotripsina naturales. Cuando se expresa en un hospedante heterólogo, la molécula de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 da como resultado una actividad del control de insectos contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y el gusano de la raíz del maíz del norte, lo cual demuestra que la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 es suficiente para dicha actividad de control de insectos.

En una realización preferida, la invención abarca una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una toxina Cry3A modificada en donde el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 583 y 598 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos números 583 y 589 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4.

En otra realización preferida, la invención abarca una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una toxina Cry3A modificada en donde el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 583 y 588 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente el sitio de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos números 583 y 588 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 536 y 541 de la SEQ ID NO: 4. Está específicamente ejemplificada en la presente memoria una molécula de ácido nucleico denominada cry3A082 (SEQ ID NO: 12), que codifica la toxina Cry3A082 modificada (SEQ ID NO: 13) que comprende un sitio de reconocimiento de catepsina G insertado en el dominio III entre los aminoácidos números 536 y 541 de la SEQ ID NO: 4. El sitio de reconocimiento de catepsina G reemplaza a un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural. Cuando se expresa en un hospedante heterólogo, la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 12 da como resultado una actividad de control de insectos contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y el gusano de la raíz del maíz del norte, que demuestra que la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID NO: 12 es suficiente para dicha actividad de control de insectos.

En otra realización preferida, un sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio III entre los aminoácidos números 587 y588 de la SEQ ID NO: 2 o entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4. Específicamente se ilustra como ejemplo en esta memoria una molécula de ácido nucleico denominada cry3A058 (SEQ ID NO: 14), que codifica la toxina Cry3A058 modificada (SEQ ID NO: 15) que comprende un sitio de reconocimiento de catepsina G insertado en el dominio III entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4. El sitio de reconocimiento de catepsina G está dentro de un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural. Cuando se expresa en un hospedante heterólogo, la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 14 da como resultado una actividad de control de insectos contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y el gusano de la raíz del maíz del norte, que demuestra que la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID NO: 14 es suficiente para dicha actividad de control de insectos.

En todavía otra realización preferida, la invención abarca una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una toxina Cry3A modificada, en donde el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 160 y en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 154 y 160 y en el dominio III entre los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2 o en el dominio I entre los aminoácidos III 107 y 113 y en el dominio III entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4.

Específicamente se ilustra como ejemplo en esta memoria una molécula de ácido nucleico, denominada cry3A057 (SEQ ID NO: 16), que codifica la toxina Cry3A057 modificada (SEQ ID NO: 17) que comprende un sitio de reconocimiento de catepsina G insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 107 y 113 y en el dominio III entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4. El sitio de reconocimiento de catepsina G reemplaza a un sitio de reconocimiento de tripsina natural y está adyacente a un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural en el dominio I y está dentro de un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural en el dominio III. Cuando se expresa en un hospedante heterólogo, la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 16 da como resultado la actividad de control de insectos contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y el gusano de la raíz del maíz del norte, que demuestra
que la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID NO: 16 es suficiente para la actividad de control de insectos.

En todavía otra realización preferida, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está situado en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 158 y en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 154 y 158 y en el dominio III entre los aminoácidos números 587 y 588 de la SEQ ID NO: 2 o en el dominio I entre los aminoácidos números 107 y 111 y en el dominio III entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4. Específicamente se ilustra como ejemplo en esta memoria la molécula de ácido nucleico denominada cry3A056 (SEQ ID NO: 18), que codifica la toxina Cry3A056 modificada (SEQ ID NO: 19) que comprende un sitio de reconocimiento de catepsina G insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 107 y 111 y en el dominio III entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4. El sitio de reconocimiento de catepsina G está adyacente a los sitios de reconocimiento de tripsina y quimotripsina naturales en el dominio I y está dentro de un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural en el dominio III. Cuando se expresa en un hospedante heterólogo, la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 18 da como resultado una actividad de control de insectos contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y el gusano de la raíz del maíz del norte, que demuestra que la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID NO: 18 es suficiente para dicha actividad de control de insectos.

En todavía otra realización preferida, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está situado en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 154 y 158 y en el dominio III entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 583 y 588 de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento de proteasa adicional está insertado en el dominio I y entre los aminoácidos números 154 y 158 y en el dominio III entre los aminoácidos números 583 y 588 de la SEQ ID NO: 2 o en el dominio I entre los aminoácidos números 107 y 111 y en el dominio III entre los aminoácidos números 536 y 541 de la SEQ ID NO: 4. Específicamente se ilustra como ejemplo en esta memoria una molécula de ácido nucleico denominada cry3A083 (SEQ ID NO: 20), que codifica la toxina Cry3A083 modificada (SEQ ID NO: 21) que comprende un sitio de reconocimiento de catepsina G insertado en el dominio I entre los aminoácidos números 107 y 111 y el dominio III entre los aminoácidos números 536 y 541 de la SEQ ID NO: 4. El sitio de reconocimiento de catepsina G está adyacente a los sitios de reconocimiento de tripsina y quimotripsina naturales en el dominio I y reemplaza a un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural en el dominio III. Cuando se expresa en un hospedante heterólogo, la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 20 da como resultado una actividad de control de insectos contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y el gusano de la raíz del maíz del norte, que demuestra que la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID NO: 20 es suficiente para dicha actividad de control de insectos.

En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende los nucleótidos 1-179 de la SEQ ID NO: 6, los nucleótidos 1-1806 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 10, los nucleótidos 1-1794 de la SEQ ID NO: 12, los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 14, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 16, los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 18 y los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 20.

En otra realización preferida, la invención abarca la molécula de ácido nucleico aislada que codifica una toxina Cry3A modificada que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en las SEQ ID NO 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO: 19 o SEQ I D NO: 21.

La presente invención abarca también los vectores recombinantes que comprenden la secuencia de ácido nucleico de esta invención. En dichos vectores, las secuencias de ácidos nucleicos están preferiblemente contenidas en casetes de expresión que comprenden elementos reguladores para la expresión de las secuencias de nucleótidos en una célula hospedante capaz de expresar las secuencias de nucleótidos. Dichos elementos reguladores comprenden usualmente señales promotoras y de terminación y comprenden también preferiblemente elementos que permiten una traducción eficaz de los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico de la presente invención. Los vectores que comprenden las secuencias de ácido nucleico usualmente son capaces de replicación en células hospedante particulares, preferiblemente como moléculas extracromosómicas, y por lo tanto se usan para amplificar las secuencias de ácido nucleico de esta invención en las células hospedantes. En una realización, las células hospedante para dichos vectores son microorganismos, tales como bacterias en particular Bacillus thuringiensis o E. coli. En otra realización, las células hospedantes para dichos vectores recombinantes son endofitas o epifitas. Una célula hospedante preferida para dichos vectores es una célula eucariota, tal como una célula vegetal. Las células vegetales tales como células de maíz son las células hospedantes más preferidas. En otra realización preferida, dichos vectores son vectores virares y se usan para la replicación de las secuencias de ácidos nucleicos, en particular células hospedante, por ejemplo células de insecto o células vegetales. También se usan vectores recombinantes para la transformación de las secuencias de nucleótidos de esta invención en células hospedante, mediante lo cual las secuencias de nucleótidos quedan establemente integradas en el DNA de las células hospedante. En una de realizaciones, las células hospedantes son células procariotas. En una realización preferida, dichas células hospedantes son células eucariotas, tal como células vegetales. En una realización más preferida, las células hospedantes son células vegetales, tales como células de maíz.

En otro aspecto, la presente invención abarca toxinas Cry3A modificadas producidas mediante la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención.

En realizaciones preferidas, las toxinas Cry3A modificadas de la invención comprenden un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de la invención. En otra realización preferida, la toxina Cry3A modificada se produce mediante la expresión de la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 6, los nucleótidos 1-1806 de la SEQ ID. NO: 8, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 10, los nucleótidos 1-1794 de la SEQ ID NO: 12,los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 14, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 16, los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 18, y los nucleótidos 1-1818 de la SEQ I D NO: 20.

En una realización preferida, una toxina Cry3A modificada de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos indicada en las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21.

Las toxinas Cry3A modificadas de la presente invención tienen actividad de control de insectos cuando se ensayan contra plagas de insectos en valoraciones biológicas. En otra realización preferida, las toxinas Cry3A modificadas de la invención son activas contra insectos coleópteros, preferiblemente contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y el gusano de la raíz del maíz del norte. Las propiedades controladoras de insectos de las toxinas Cry3A modificadas de la invención se ilustran adicionalmente en los Ejemplos 4 y 6.

La presente invención abarca también una composición que comprende una cantidad eficaz para el control de insectos de una Cry3A modificada de acuerdo con la invención.

En otra realización preferida, la invención abarca un método para producir una toxina Cry3A modificada que es activa contra insectos, que comprende: (a) obtener una célula hospedante que comprende un gen quimérico, que por sí misma comprende una secuencia promotora heteróloga unida operativamente a la molécula de ácido nucleico de la invención; y (b) expresa la molécula de ácido nucleico en la secuencia hospedante transgénica, lo que da como resultado por lo menos una toxina Cry3A modificada que es activa contra insectos.

En otra realización preferida, la invención abarca un método para producir una planta transgénica resistente a los insectos, que comprende introducir una molécula de ácido nucleico de la invención en la planta transgénica, en donde la molécula de ácido nucleico es expresable en la planta transgénica en una cantidad eficaz para controlar insectos. En una realización preferida, los insectos son insectos coleópteros, preferiblemente gusano de la raíz del maíz del oeste y gusano de la raíz del maíz del norte.

En todavía otra realización preferida, la invención abarca un método para controlar insectos, que comprende administrar a los insectos una cantidad eficaz de una toxina Cry3A modificada de la invención. De acuerdo con esta realización, los insectos son insectos coleópteros, preferiblemente gusano de la raíz del maíz del oeste y gusano de la raíz del maíz del norte. Preferiblemente, la toxina Cry3A modificada se administra a los insectos oralmente. En un aspecto preferido, la toxina se administra oralmente a través de una planta transgénica que comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa una toxina Cry3A modificada de la presente invención.

La presente invención abarca también un método para preparar una toxina Cry3A modificada que comprende: (a) obtener un gen cry3A de toxina que codifica una toxina Cry3A; (b) identificar una proteasa intestinal de un insecto diana; (c) obtener una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de reconocimiento para la proteasa intestinal; (d) insertar la secuencia de nucleótidos de (c) en el dominio I o en el dominio III o en tanto el dominio I como en el dominio III en una posición que reemplaza a, está dentro de, o es adyacente a, una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de reconocimiento de proteasa natural en el gen cry3A de toxina, creando de esta manera un gen cry3A de toxina modificado; (e) insertar el gen cry3A de toxina modificado en un casete de expresión; (f) expresar el gen cry3A de toxina modificado en una célula hospedante no humana, lo cual da como resultado que la célula hospedante produzca una toxina Cry3A modificada; y (g) valorar biológicamente la toxina Cry3A modificada contra un insecto diana, la cual causa mayor mortalidad para el insecto diana que la mortalidad causada por una toxina Cry3A. En una realización preferida, la toxina Cry3A modificada causa por lo menos aproximadamente 50% de mortalidad en el insecto diana mientras que la toxina Cry3A causa hasta aproximadamente 30% de mortalidad.

La presente invención abarca además un método para controlar insectos en donde la planta transgénica comprende además una segunda secuencia de ácido nucleico o grupos de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un segundo principio plaguicida. Las secuencias particularmente preferidas del segundo ácido nucleico son las que codifican una \delta-endotoxina, las que codifican una toxina de proteína insecticida vegetativa, descrita en las patentes de EE.UU. nº 5.849.870 y 5.877.012, que se incorporan en la presente memoria como referencia, o las que codifican una vía para la producción de un principio no proteínico.

En otras realizaciones, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden estar adicionalmente modificadas mediante la incorporación de mutaciones aleatorias en una técnica conocida como recombinación in vitro o barajado de DNA. Esta técnica ha sido descrita por Stemmer et al., Nature 370:389-391 (1994) y en la patente de EE.UU. Nº 5.605.793, que se incorpora en la presente memoria como referencia. Se producen millones de copias mutantes de una secuencia de nucleótidos en base a una secuencia de nucleótidos original de esta invención y se recuperan variantes con propiedades mejoradas, tal como un incremento de la actividad insecticida, mayor estabilidad o diferentes gamas o especificidades de plagas de insecto diana. El método comprende formar un polinucleótido bicatenario mutagenizado a partir de un molde, que comprende una secuencia de nucleótidos de esta invención, en donde el polinucleótido bicatenario molde ha sido escindido en fragmentos bicatenarios aleatorios de un tamaño deseado, y comprende las etapas de añadir a la población resultante fragmentos bicatenarios aleatorios uno o más oligonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, en donde dichos oligonucleótidos comprenden una zona de identidad y una zona de heterología para el polinucleótido molde bicatenario; desnaturalizar la mezcla resultante de fragmentos bicatenarios aleatorios y oligonucleótidos en fragmentos monocatenarios; incubar la población resultante de fragmentos monocatenarios con una polimerasa en condiciones que dan como resultado la re-asociación de dichos fragmentos monocatenarios en dichas zonas de identidad para formar pares de fragmentos asociados, siendo dichas zonas de identidad suficientes para que un miembro de un par cebe (inicie) una replicación del otro, formando de esta manera un polinucleótido bicatenario mutagenizado; y repetir la segunda y tercera etapas durante por lo menos dos ciclos más, en donde la mezcla resultante en la segunda etapa de otro ciclo incluye el polinucleótido bicatenario mutagenizado de la tercera etapa del ciclo previo, y el ciclo posterior forma otro polinucleótido bicatenario mutagenizado. En una realización preferida, la concentración de una sola especie de fragmentos bicatenarios aleatorios en la población de fragmentos bicatenarios aleatorios es inferior a 1% en peso del DNA total. En otra realización preferida, el polinucleótido bicatenario molde comprende por lo menos aproximadamente 100 especies de polinucleótidos. En otra realización preferida, el tamaño de los fragmentos bicatenarios aleatorios es de aproximadamente 5 pb a 5 kb. En otra realización preferida, la cuarta etapa del método comprende repetir la segunda y tercera etapas durante por lo menos 10 ciclos.

Expresión de las secuencias de nucleótidos en hospedantes microbianos heterólogos

Como agentes biológicos para control de insectos, las toxinas Cry3A insecticidas modificadas se producen mediante la expresión de secuencias de nucleótidos en células hospedante heterólogas capaces de expresar las secuencias de nucleótidos. En una primera realización, se preparan células de B. thuringiensis que comprenden modificaciones de una secuencia de nucleótidos de esta invención. Dichas modificaciones abarcan las mutaciones o deleciones de los elementos reguladores existentes, lo cual conduce a la expresión alterada de la secuencia de nucleótidos o a la incorporación de nuevos elementos reguladores que controlan la expresión de la secuencia de nucleótidos. En otra realización, se añaden copias adicionales de una o más de las secuencias de nucleótidos a las células de Bacillus thuringiensis mediante la inserción en el cromosoma o bien mediante la introducción de moléculas extracromosómicamente replicantes que contienen las secuencias de nucleótidos.

En otra realización, por lo menos una de las secuencias de nucleótidos de la invención está insertada en un casete de expresión apropiado que comprende un promotor y una señal de terminación. La expresión de la secuencia de nucleótidos es constitutiva o se usa un promotor inducible que responde a varios tipos de estímulos para iniciar la transcripción. En una realización preferida, la célula en la cual se expresa la toxina es un microorganismo, tal como un virus, una bacteria o un hongo. En una realización preferida, un virus tal como un baculovirus, contiene una secuencia de nucleótidos de la invención en su genoma y expresa grandes cantidades de la correspondiente toxina insecticida después de la infección de células eucariotas apropiadas que son adecuadas para la replicación del virus y la expresión de la secuencia de nucleótidos. La toxina insecticida así producida se usa como agente insecticida. Alternativamente, los baculovirus manipulados por ingeniería genética para incluir la secuencia de nucleótidos se usan para infectar insectos in vivo y para eliminarlos, ya sea mediante la expresión de la toxina insecticida o bien mediante una combinación de infección viral y expresión de la toxina insecticida.

Las células bacterianas son también hospedantes para la expresión de las secuencias de nucleótidos de la invención. En una realización preferida, se usan bacterias simbióticas no patógenas, que son capaces de vivir y replicarse dentro de tejidos vegetales denominadas endofitas o bacterias simbióticas no patógenas que son capaces de colonizar la filosfera o la rizosfera, denominadas epifitas. Dichas bacterias incluyen bacterias de los géneros Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces y Xanthomonas. Loshongos simbióticos tales como Trichoderma y Gliocladium son también posibles hospedantes para la expresión de las secuencias de nucleótidos de la invención para el mismo propósito.

Los métodos para estas manipulaciones genéticas son específicos para los diferentes hospedantes disponibles y son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los vectores de expresión pKK223-3 y pKK223-2 pueden usarse para expresar genes heterólogos en E. coli, ya sea en fusión transcripcional o traduccional, detrás del promotor tac o trc. Para la expresión de los operones que codifican múltiples marcos de lectura abiertos (abreviadamente ORF por la expresión inglesa Open Reading Frames) el procedimiento más sencillo consiste en insertar el operón en un vector tal como pKK223-3 en fusión transcripcional, permitiendo que se use el sitio de unión de ribosoma correspondiente de los genes heterólogos. Los métodos para la sobreexpresión en las especies gram-positivas tales como Bacillus también son conocidos en la técnica y pueden usarse en el contexto de esta invención (Quax et al. en Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Sistemas alternativos para la sobreexpresión se basan por ejemplo en vectores de levadura e incluyen el uso de Pichia, Saccharomyces y Kluyveromyces (Sreekrishna, en: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Baltz, Hegeman, and Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173-177 (1994); van der Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)).

Transformación de vegetales

En una realización particularmente preferida, por lo menos una de las toxinas Cry3A modificadas de la invención se expresan en un organismo superior, por ejemplo un vegetal. En este caso, las plantas transgénicas que expresan cantidades eficaces de las toxinas Cry3A modificadas se protegen a sí mismas contras las plagas de insectos. Cuando el insecto comienza a comer dicha planta transgénica, ingiere también las toxinas Cry3A modificadas expresadas. Esto impedirá que el insecto siga mordiendo el tejido de la planta o incluso puede dañar o matar al insecto. Una secuencia de nucleótidos de la presente invención se inserta en un casete de expresión, el cual luego es preferiblemente integrado de forma estable en el genoma de dicha planta. En otra realización preferida, se incluye la secuencia de nucleótidos en un virus auto-replicante no patógeno. Las plantas transformadas de acuerdo con la presente invención pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas e incluyen, pero sin limitación, maíz, trigo, cebada, centeno, batata, judías, guisante, achicoria, lechuga, col, coliflor, brécol, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimiento, apio, calabacín, calabaza, cáñamo, calabacín de verano, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, melocotón, nectarina, albaricoque, fresa, uva, frambuesa, zarzamora, piña, aguacate, papaya, mango, plátano, soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha, girasol, colza, clavo, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, arroz, patata, berenjena, pepino, Arabidopsis, y plantas leñosas, tales como coníferas y árboles de hoja caduca.

Una vez que la secuencia de nucleótidos deseada ha sido transformada en una especie vegetal particular, puede ser propagada en esa especie o ser pasada a otras variedades de la misma especie, particularmente incluyendo variedades comerciales, usando técnicas de cría tradicionales.

Una secuencia de nucleótidos de esta invención se expresa preferiblemente en plantas transgénicas, produciendo de esta manera la biosíntesis de la correspondiente toxina Cry3A modificada en las plantas transgénicas. De esta manera, se generan plantas transgénicas con mayor resistencia a los insectos. Para su expresión en plantas transgénicas, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden requerir otras modificaciones y optimización. Aunque en muchos casos pueden expresarse genes de organismos microbianos en plantas a altos niveles sin modificación, la baja expresión en plantas transgénicas puede ser el resultado de secuencias de nucleótidos microbianas que tienen codones que no se prefieren en plantas. Se sabe en la técnica que todos los organismos tienen preferencias específicas para el uso de codones, y los codones de las secuencias de nucleótidos descritos en esta invención pueden cambiarse para adaptarse a las preferencias de las plantas manteniendo al mismo tiempo los aminoácidos codificados por los mismos. Además, se logra mejor una elevada expresión en plantas a partir de secuencias codificadoras que tienen por lo menos 35% de contenido de GC, preferiblemente más de aproximadamente 45%, más preferiblemente más de aproximadamente 50%, y más preferiblemente más de aproximadamente 60%. Las secuencias de nucleótidos microbianas que tienen bajos contenidos de GC, pueden expresarse muy pobremente en plantas debido a la existencia de los restos ATTTA que pueden desestabilizar los mensajes, y los restos AATAAA que pueden causar poliadenilación inapropiada. Aunque las secuencias génicas preferidas pueden expresarse adecuadamente tanto en especies de plantas vegetales monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias pueden modificarse para tener en cuenta las preferencias específicas de codones y las preferencias de contenido de GC de las monocotiledóneas o dicotiledóneas, ya que estas preferencias han demostrado que difieren (Murray et al., Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Además, las secuencias de nucleótidos se escrutan para determinar la existencia de sitio de corte y empalme ilegítimos que pueden causar el truncamiento del mensaje. Todos los cambios requeridos para ser efectuados dentro de las secuencias de nucleótidos, tal como los descritos anteriormente se efectúan usando técnicas bien conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, PCR, y construcción de genes sintéticos usando los métodos descritos en las solicitudes de patentes europeas publicadas EP 0385962 (de Monsanto), EP 0359472 (de Lubrizol), y la solicitud de patente internacional WO 93/07278 (de Ciba-Geigy).

En una realización de la invención, se prepara un gen cry3A de acuerdo con el procedimiento descrito en la patente de EE.UU.Nº 5.625.136, que se incorpora aquí como referencia. En este procedimiento, se usan los codones preferidos de maíz, es decir, el único codón que codifica más frecuentemente ese aminoácido en el maíz. El codón de maíz preferido para un aminoácido particular podría derivarse por ejemplo de secuencias génicas conocidas del maíz. El uso de codones del maíz para 28 genes a partir de plantas de maíz se encuentra en Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), cuya descripción se incorpora en la presente memoria como referencia. Una secuencia sintética preparada con codones de maíz optimizados se representa en la SEQ ID NO: 3.

De esta manera, las secuencias de nucleótidos pueden optimizarse para la expresión en cualquier planta. Se reconoce que la totalidad o cualquier parte de la secuencia génica puede ser optimizada o sintetizada. Es decir, también se pueden usar secuencias sintéticas o parcialmente optimizadas.

Para una eficaz iniciación de la traducción, las secuencias adyacentes a la metionina iniciadora pueden requerir modificación. Por ejemplo, pueden modificarse mediante la inclusión de secuencias que se sabe que son eficaces en plantas. Joshi ha sugerido un consenso apropiado para plantas (NAR 15:6643-6653 (198.7)) y Clonetech sugiere un iniciador de traducción de consenso adicional (catálogo de 1993/1994, página 210). Estos consensos son apropiados para ser usados con las secuencias de nucleótidos de esta invención. Las secuencias se incorporan en las construcciones que comprenden las secuencias de nucleótidos hasta e incluyendo el ATG (mientras se deja el segundo aminoácido sin modificar, o alternativamente hasta e incluyendo el GTC subsiguiente al ATG (con la posibilidad de modificar el segundo aminoácido del transgen).

La expresión de las secuencias de nucleótidos en las plantas transgénicas es dirigida por promotores que funcionan en las plantas. La elección del promotor variará dependiendo de los requisitos temporales y espaciales para la expresión, y dependiendo también de la especie que constituye la diana. Por lo tanto, se prefiere la expresión de las secuencias de nucleótidos de esta invención en hojas, en tallos o vástagos, en espigas, en inflorescencias (por ejemplo, púas, panojas, mazorcas, etc), en raíces, y/o plántulas. En muchos casos, sin embargo, se desea protección contra más de un tipo de plaga de insecto, y por consiguiente es deseable la expresión en múltiples tejidos. Aunque muchos promotores de dicotiledones han demostrado que eran operacionales en monocotiledones y viceversa, idealmente los promotores de dicotiledones se seleccionan para la expresión en dicotiledones, y los promotores de monocotiledones para la expresión en monocotiledones. Sin embargo, no hay ninguna restricción en cuanto al origen de los promotores seleccionados; es suficiente que sean operacionales para dirigir la expresión de las secuencias de nucleótidos en la célula deseada.

Los promotores preferidos que se expresan constitutivamente incluyen promotores de genes que codifican actina o ubicuitina y los promotores CaMV 35S y 19S. Las secuencias de nucleótidos de esta invención pueden expresarse también bajo la regulación de promotores que están químicamente regulados. Esto permite que sean sintetizar solamente las toxinas de insecticidas Cry3A modificadas cuando se tratan las plantas de cultivo con productos químicos inductores. La tecnología preferida para la inducción química de expresión génica se detalla en la solicitud de patente europea publicada EP 0332104 (de Ciba-Geigy) y la patente de EE.UU. Nº 5.614.395. Un promotor preferido para la inducción química es el promotor PR-1a del tabaco.

Una categoría de promotores preferida es la que es inducible por lesiones. Se han descrito numerosos promotores que se expresan en sitios lesionados y también en los sitios de infección fitopatógena. Idealmente dicho promotor debe ser activo localmente en los sitios de infección, y de este modo las toxinas insecticidas Cry3A modificadas se acumularían solamente en células que necesitan sintetizar las toxinas insecticidas Cry3A modificadas para matar la plaga de insecto invasor. Los promotores preferidos de esta clase incluyen los descritos por Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573.588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant. Molec. Biol. 22:129-142 (1993) y Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993).

Los promotores específicos de tejido o preferenciales de tejido útiles para la expresión de los genes de toxina Cry3A modificadas en plantas, particularmente el maíz, son los que dirigen la expresión en la raíz, el carozo, las hojas o el polen, particularmente en la raíz. Dichos promotores, por ejemplo los que se aíslan a partir de PEPC o trpA, han sido descritos en la patente de EE.UU. Nº 5.625.136 o MTL, descrito en la patente de EE.UU. Nº 5.466.785. Ambas patentes estadounidenses se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Otras realizaciones preferidas son plantas transgénicas que expresan las secuencias de nucleótidos en una manera inducible por daño o inducible por infección de patógenos.

Además de los promotores, se encuentra también disponible una variedad de terminadores de la transcripción para uso en la construcción de genes quiméricos empleando los genes cry3A de toxina modificados de la presente invención. Los terminadores de la transcripción son responsables de la terminación de la transcripción más allá del transgen y de su correcta poliadenilación. Los terminadores de la transcripción apropiados y los que se sabe que funcionan en plantas incluyen el terminador CaMV 35S, el terminador tml, el terminador de nopalina-sintasa, el terminador rbcS E9 del guisante, y otros conocidos en la técnica. Estos pueden usarse tanto en plantas monocotiledóneas como en dicotiledóneas. En el contexto de esta invención puede usarse cualquier terminador disponible que se sabe que funciona en plantas.

Otras numerosas secuencias pueden incorporarse en los casetes de expresión descritos en esta invención. Estas incluyen secuencias que han demostrado que mejoran la expresión, tales como secuencias de intrones (por ejemplo de Adhl y bronzel) y secuencias virales líderes (por ejemplo de TMV, MCMV y AMV).

Puede ser preferible dirigir la expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención en diferentes localizaciones celulares en la planta. En algunos casos la localización en el citosol puede ser deseable, mientras que en otros casos puede preferirse la localización en algún orgánulo subcelular. La localización sub-celular de las enzimas codificadas por transgenes se llevan a cabo usando métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, el DNA que codifica el péptido diana a partir de un producto génico conocido localizado en los orgánulos es manipulado y fusionado en una posición situada hacia el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos. Muchas de dichas secuencias dianasson conocidas para el cloroplasto y se ha demostrado su funcionamiento en construcciones heterólogas. La expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención, está también localizada en el retículo endoplasmático o en las vacuolas de las células hospedantes. Los métodos para lograr esto son bien conocidos en la técnica.

Los vectores apropiados para la transformación de vegetales se han descrito en otra parte de esta memoria. Para la transformación intermediada por Agrobacterium, son apropiados los vectores binarios o los vectores portadores por lo menos de una secuencia de límite de T-DNA mientras que para cualquier transferencia directa de genes cualquier vector es apropiado y puede preferirse DNA lineal que contenga únicamente la construcción de interés. En el caso de una transferencia directa de genes, puede usarse la transformación con una única especie de DNA o la co-transformación (Shocher et al., Biotechnology 4:1093-1096 (1986)). Para la transferencia génica directa y la transferencia intermediada por Agrobacterium, la transformación usualmente (pero no necesariamente), se efectúa con un marcador seleccionable que puede proporcionar resistencia a un antibiótico (kanamicina, higromicina o metotrexato) o un herbicida (basta). Los vectores de transformación de vegetales que comprenden los genes cry3A de la toxina modificados de la presente invención pueden comprender también genes (por ejemplo, de fosfomanosa-isomerasa; PMI) que proporcionan una selección positiva de las plantas transgénicas, tal como se describen en las patentes de EE.UU. 5.767.378 y 5.994.629 que se incorporan en la presente memoria como referencia. Sin embargo, la elección del marcador apropiado no es crítica para la invención.

En otra realización, una secuencia de nucleótidos de la presente invención se transforma directamente en el genoma del plástido. Una ventaja importante de la transformación del plástido es que los plástidos generalmente son capaces de expresar genes bacterianos sin sustancial optimización de codones, y los plástidos son capaces de expresar múltiples marcos de lectura abiertos bajo el control de un solo promotor. La tecnología de transformación de plástidos ha sido extensamente descrita en las patentes de EE.UU. nº 5.451.513, 5.545.817, y 5.545.818, en la solicitud PCT Nº WO 95116783, y en McBride et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. La técnica básica para la transformación de cloroplastos implica introducir regiones de DNA plástido clonado que flanquea un marcador seleccionable conjuntamente con el gen de interés en un tejido diana apropiado usando, por ejemplo, transformación biolística o de protoplastos (por ejemplo, cloruro de calcio o transformación mediada por PEG). Las regiones flanqueadoras de 1 a 1,5 kb, denominadas secuencias diana facilitan la recombinación homóloga con el genoma del plástido y por lo tanto permiten el reemplazamiento o modificación de regiones específicas del plastoma. Inicialmente, se utilizan mutaciones puntuales en el cloroplasto de RNAr 16S y en los genes rps 12 que confieren resistencia a la espectinomicina y/o a la estreptomicina como marcadores seleccionables para la transformación (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P (1990) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 87, 8526-8530, Staub, J. M. and Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Esto dio como resultado transformantes homoplásmicos estables en una frecuencia de aproximadamente uno por cada cien bombardeos sobre las hojas dianas. La presencia de los sitios de clonación entre estos marcadores permitió la creación de un vector diana en el plástido para la introducción de genes extraños (Staub, J. M., and Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Se obtienen incrementos sustanciales en la frecuencia de transformación mediante el reemplazamiento de los genes recesivos de resistencia al RNAr o antibiótico de proteína r con un marcador seleccionable dominante, el gen bacteriano aadA que codifica la enzima cletoxificante espectinomicina, aminoglicósido-3'-adeníltransferasa (Svah, 7; and Maliga; P. 1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Previamente, este marcador había sido usado con éxito para la transformación de alta frecuencia del genoma del plástido de la alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Otros marcadores seleccionables útiles para la transformación de plástidos son conocidos en la técnica y están abarcados dentro del alcance de la invención. Típicamente, se requieren aproximadamente 15-20 ciclos de división celular después de la transformación para llegar a un estado homoplastídico. La expresión del plástido, en la cual se insertan genes por recombinación homóloga dentro de todos los varios centenares de copias del genoma del plástido circular presente en cada célula vegetal, aprovecha la ventaja de la enorme cantidad de copias con respecto a los genes expresados en forma nuclear para permitir niveles de expresión que puede exceder fácilmente el 10% de la proteína vegetal soluble total. En una realización preferida, se inserta una secuencia de nucleótidos de la presente invención en un vector diana de un plástido, y se transforma en el genoma del plástido de una planta hospedante deseada. Se obtienen plantas homoplásticas para genomas de plástidos que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, y que preferiblemente son capaces de alta expresión de la secuencia de nucleótidos.

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Combinaciones de principios de control de insectos

Las toxinas Cry3A modificadas de la invención pueden usarse en combinación con \delta-endotoxinas Bt u otros principios plaguicidas para aumentar la gama de dianas en la plaga. Además, el uso de las toxinas Cry3A modificadas de la invención en combinación con las \delta-endotoxinas Bt u otros principios plaguicidas de distinta naturaleza, tiene una utilidad particular para la prevención y/o para la manipulación de la resistencia a los insectos.

Otros principios insecticidas incluyen, por ejemplo, lectinas, \alpha-amilasa, peroxidasa y colesterol-oxidasa. Los genes de la proteína insecticida vegetativa, tales como vip1A(a) y vip2A(a) que se han descrito en la patente de EE.UU. Nº 5.889.174 y que se incorporan en la presente memoria como referencia, son también útiles en la presente invención.

Esta co-expresión de más de un principio insecticida en la misma planta transgénica puede lograrse por manipulación genética de una planta de manera que contenga y exprese todos los genes necesarios. Alternativamente, una planta, Progenitora 1, puede manipularse genéticamente para la expresión de genes de la presente invención. Una segunda planta, Progenitora 2, puede manipularse genéticamente para la expresión de un principio suplementario de control de insectos. Cruzando la plata Progenitora 1 con la planta Progenitora 2, se obtienen plantas de progenie que expresan todos los genes introducidos en las plantas Progenitoras 1 y 2. La semilla transgénica de la presente invención puede tratarse también con un revestimiento insecticida para semillas, tal como se describió en las patentes de EE.UU. nº 5.849.320 y 5.876.739, que se incorporan en la presente memoria como referencia. Cuando tanto el revestimiento insecticida para semillas como la semilla transgénica de la invención son activos contra el mismo insecto diana, la combinación es útil (i) en un método para mejorar la actividad de una toxina Cry3A modificada de la invención contra el insecto diana y (ii) en un método para evitar el desarrollo de resistencia a una toxina Cry3A modificada de la invención proporcionando un segundo mecanismo de acción contra el insecto diana. Por lo tanto la invención proporciona un método para mejorar la actividad o para prevenir el desarrollo de resistencia en un insecto diana, por ejemplo el gusano de la raíz del maíz, que comprende aplicar un revestimiento insecticida para semillas a una semilla transgénica que comprende una o más toxinas Cry3A modificada de la invención.

Incluso cuando el revestimiento insecticida para semillas es activo contra un insecto diferente, el revestimiento insecticida para semillas es útil para ampliar la gama de control de insectos, por ejemplo si se añade un revestimiento insecticida de semillas que tiene actividad contra insectos lepidópteros a la semilla transgénica de la invención, la cual tiene actividad contra insectos coleópteros, la semilla transgénica revestida produce controles tanto para plagas de insectos lepidópteros como coleópteros.

Ejemplos

La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos detallados. Estos ejemplos se proporcionan con propósitos ilustrativos solamente, y no se consideran limitativos a menos que se especifique lo contrario. Los métodos de DNA recombinantes estándares y de clonación molecular usados en la presente invención, son bien conocidos en la técnica y han sido descritos por J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed.,Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); por T. J. Silhavy, M.L, Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter, et al., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992), and Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998).

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Ejemplo 1

Construcción del gen cry3A del maíz optimizado

El gen cry3A del maíz optimizado se prepara de acuerdo con el procedimiento descrito en la patente de EE.UU. Nº 5.625.136. En este procedimiento se usan codones preferidos de maíz, es decir el codón único que más frecuentemente codifica ese aminoácido en el maíz. El codón preferido del maíz para un aminoácido particular se deriva de secuencias génicas conocidas del maíz. El uso de codón de maíz para 28 genes a partir de plantas de maíz se describe en Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989). La secuencia sintética preparada con codones de maíz optimizados se representa en la SEQ ID NO: 3.

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Ejemplo 2

Identificación de la actividad enzimática de catepsina G en intestinos del gusano de la raíz del maíz del oeste (abreviadamente WCR, por la expresión inglesa Western Corn Rootworm)

Las actividades enzimáticas de la (serina-proteasa) de tipo catepsina G, (cisteína-proteasa) de tipo catepsina B en los intestinos del gusano de la raíz del maíz del oeste se miden usando sustratos colorimétricos. Cada reacción de 1 ml contiene cinco intestinos medios homogeneizados del tercer estadio del gusano de la raíz del maíz del oeste y 1 mg de sustrato disuelto en tampón de reacción (Tris 10 mM, NaCl 5 mM, DTT 0,01M, pH 7,5). El sustrato de catepsina G analizado es Ala-Ala-Pro-Phe (SEQ ID NO: 35)-pNA y el sustrato de catepsina B, Arg-Arg-pNA. Las reacciones se incuban a 28ºC durante 1 hora. La intensidad de la formación de color amarillo, indicativa de la eficacia de una proteasa para reconocer el sustrato apropiado, se compara en tratamiento frente a controles. Las reacciones se califican como negativas (-) si no se detecta ningún color o un color de fondo claro. Las reacciones que están en 25%, 50%. 75% o 100% arriba del color base se califican como +, ++, +++, ó ++++, respectivamente.

Los resultados de los ensayos enzimáticos se muestran en la tabla siguiente

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TABLA 1

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Esta es la primera vez que se ha identificado la actividad de la serina-proteasa, catepsina G en intestinos del gusano de la raíz del maíz del oeste. Los intestinos del gusano de la raíz del maíz del oeste tienen claramente mayor actividad de la serina-proteasa, catepsina G en comparación con la actividad de la cisteína-proteasa, catepsina B. La secuencia AAPF (SEQ ID NO: 35) se selecciona como sitio de reconocimiento de la proteasa, catepsina G, para crear toxinas Cry3A modificadas de la presente invención.

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Ejemplo 3

Construcción de genes cry3A modificados

Los genes cry3A modificados que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica el sitio de reconocimiento de catepsina G en el dominio I, en el dominio III, o tanto en el dominio I como en el dominio III se preparan usando PCR con solapamiento. El gen cry3A de maíz optimizado (SEQ ID NO: 2), contenido en el plásmido pCIB6850 (SEQ ID NO: 5), se usa como molde inicial. Se preparan ocho construcciones de genes cry3A modificados, que codifican las toxinas Cry3A modificadas; cry3A054, cry3A055, y cry3A085, que comprenden la secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G en el dominio I; cry3A058, cry3A082, que comprenden la secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G en el dominio III; cry3A056, cry3A057, cry3A083, que comprenden la secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G en el dominio I y en el dominio III. Los ocho genes cry3A modificados y las toxinas Cry3A modificadas que codifican se describen a continuación.

Gen cry3A054 contenido en pCMS054

El gen cry3A054 (SEQ ID NO: 6) comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada. Se usan tres pares de cebadores de PCR con solapamiento para insertar la secuencia de nucleótidos que codifica el sitio de reconocimiento de catepsina G en el gen cry3A del maíz optimizado no modificado:

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El par de cebadores 1 y el par de cebadores 2 generan dos productos de PCR únicos. Estos productos se combinan luego en partes iguales y se usa un par de cebadores 3 para unir los productos para generar un fragmento de PCR que se clona nuevamente en el molde pCIB6850 original. Luego el gen cry3A054 modificado se transfiere a pBluescript (Stratagene). El plásmido resultante se denomina pCMS054 y contiene el gen cry3A054 (SEQ ID NO: 6).

La toxina Cry3A054 modificada (SEQ ID NO: 7), codificada por el gen cry3A modificado contenido en pCMS054, tiene un sitio de reconocimiento de catepsina G, que contiene la secuencia de aminoácidos AAPF (SEQ ID NO: 35), insertada en el dominio I entre los aminoácidos 107 y 113 de la toxina Cry3A no modificada (SEQ ID NO: 4). El sitio de reconocimiento de catepsina G reemplaza al sitio de reconocimiento de tripsina natural y está adyacente a un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural.

Gen cry3A055 contenido en pCMS055

El gen cry3A055 (SEQ ID NO: 8) comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada. Se usan tres pares de cebadores de PCR con solapamiento para insertar la secuencia de nucleótidos que codifica el sitio de reconocimiento de catepsina G en el gen cry3A de maíz optimizado no modificado:

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El par de cebadores 1 y el par de cebadores 2 generan dos productos de PCR únicos. Estos productos se combinan luego en partes iguales y se usa el par de cebadores 3 para unir los productos para generar un fragmento de PCR que se clona nuevamente en el molde pCIB6850. Luego se transfiere el gen cry3A055 modificado a pBluescript (Stratagene). El plásmido resultante se denomina pCMS055 y contiene el gen cry3A055 (SEQ ID NO: 8).

La toxina Cry3A055 modificada (SEQ ID NO: 9), codificada por el gen cry3A modificado contenido en pCMS055, tiene un sitio de reconocimiento de catepsina G, que comprende la secuencia de aminoácidos AAPF (SEQ ID NO: 35), insertada en el dominio I entre los aminoácidos 107 y 111 de la toxina Cry3A no modificada (SEQ ID NO: 4). El sitio de reconocimiento de catepsina G está adyacente a un sitio de reconocimiento de tripsina y quimotripsina natural.

Gen cry3A058 contenido en pCMS058

El gen cry3A058 (SEQ ID NO: 14) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada. Se usan tres pares de cebadores de PCR con solapamiento para insertar la secuencia de nucleótidos que codifica el sitio de reconocimiento de catepsina G en el gen cry3A de maíz optimizado no modificado:

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El par de cebadores 1 y el par de cebadores 2 generan dos productos de PCR únicos. Estos productos se combinan luego en partes iguales y se usa el par de cebadores 3 para unir los productos para generar un fragmento de PCR que se clona nuevamente en el molde pCIB6850. El gen cry3A058 modificado se transfiere luego a pBluescript (Stratagene). El plásmido resultante se denomina pCMS058 y contiene el gen cry3A058 (SEQ ID NO: 14).

La toxina Cry3A058 modificada (SEQ ID NO: 15), codificada por el gen cry3A modificado, tiene un sitio de reconocimiento de catepsina G, que comprende la secuencia de aminoácidos AAPF (SEQ ID NO: 35), insertada en el dominio III entre los aminoácidos 540 y 541 de la toxina Cry3A no modificada (SEQ ID NO: 4). El sitio de reconocimiento de catepsina G está dentro del sitio de reconocimiento de quimotripsina natural.

pCMS082 que comprende el gen cry3A082

El gen cry3A082 (SEQ ID NO: 12) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada. Se usa un par de cebadores de PCR de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change, para insertar la secuencia de nucleótidos que codifica el sitio de reconocimiento de catepsina G en el gen cry3A de maíz optimizado no modificado:

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El par de cebadores genera un producto de PCR único. Este producto se clona nuevamente en el molde pCIB6850 original. El gen cry3A082 modificados se transfiere luego a pBluescript (Stratagene). El plásmido resultante se denomina pCMS082 y comprende el gen cry3A082 (SEQ ID NO: 12).

La toxina Cry3A082 modificada (SEQ ID NO: 13), codificada por el gen cry3A modificado, tiene un sitio de reconocimiento de catepsina G que comprende la secuencia de aminoácidos AAPF (SEQ ID NO: 35), insertada en el dominio III entre los aminoácidos 539 y 542 de la toxina Cry3A no modificada (SEQ ID NO: 4). El sitio de reconocimiento de catepsina G reemplaza a un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural.

El gen cry3A056 contenido en pCMS056

El gen cry3A056 (SEQ ID NO: 18) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada. Se usan seis pares de cebadores de PCR con solapamiento para insertar dos sitios de reconocimiento de catepsina G en el gen cry3A no modificado:

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El par de cebadores 1 y el par de cebadores 2 generan dos productos de PCR únicos. Estos productos se combinan en partes iguales y se usa el par de cebadores 3 para unir los productos para generar un fragmento de PCR que se clona nuevamente en el plásmido pCIB6850 original. El gen cry3A055 modificado se transfiere luego a pBluescript (Stratagene). El plásmido resultante se denomina pCMS055. El par de cebadores 4 y el par de cebadores 5 generan otro conjunto de fragmentos únicos que se unen mediante otra PCR con el par de cebadores 6. Este fragmento se clona en el dominio III del gen cry3A055 modificado contenido en pCMS055. El plásmido resultante se denomina pCMS056 y comprende el gen cry3A056 (SEQ ID NO: 18).

La toxina Cry3A056 modificada (SEQ ID NO: 19), codificada por el gen cry3A modificado, tiene un sitio de reconocimiento de catepsina G, que comprende la secuencia de aminoácidos AAPF (SEQ ID NO: 35), insertada en el dominio I entre los aminoácidos 107 y 111 y en el dominio III entre los aminoácidos 540 y 541 de la toxina cry3A no modificada (SEQ ID NO: 4). El sitio de reconocimiento de catepsina G está adyacente a un sitio de reconocimiento de tripsina y quimotripsina natural en el dominio I y está dentro de un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural en el dominio III.

El gen cry3A057 contenido en pCMS057

El gen cry3A057 (SEQ ID NO: 16) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada. Se usan seis pares de cebadores de PCR con solapamiento para insertar dos sitios de reconocimiento de catepsina G en el cry3A no modificado.

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El par de cebadores 1 y el par de cebadores 2 generan dos productos de PCR únicos. Estos productos se combinan en partes iguales y se usa un par de cebadores 3 para unir los productos para generar un fragmento de PCR que se clona nuevamente en el plásmido pCIB6850 original. El gen cry3A054 modificado se transfiere luego a pBluescript (Stratagene). El plásmido resultante se denomina pCMS054. El par de cebadores 4 y el par de cebadores 5 generan otro conjunto único de fragmentos que se unen mediante otra PCR con el par de cebadores 6. Este fragmento se clona en el dominio III del gen cry3A054 modificado contenido en pCMS054. El plásmido resultante se denomina pCMS057 y contiene el gen cry3A057 (SEQ ID NO: 16).

La toxina Cry3A057 modificada (SEQ ID NO: 17) codificada por el gen cry3A modificado, tiene un sitio de reconocimiento de catepsina G que comprende la secuencia de aminoácidos AAPF (SEQ ID NO: 35), insertada en el dominio I entre los aminoácidos 107 y 113 y en el dominio III entre los aminoácidos 540 y 541 de la toxina Cry3A no modificada (SEQ ID NO: 4). El sitio de reconocimiento de catepsina G reemplaza a un sitio de reconocimiento de tripsina natural y está adyacente a un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural en el dominio I y está dentro del sitio de reconocimiento de quimotripsina natural en el dominio III.

El gen cry3A083 contenido en pCMS083

El gen cry3A083 (SEQ ID NO: 20) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada. Se usan tres pares de cebadores de PCR con solapamiento y un par de cebadores de PCR de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange para insertar dos sitios de reconocimiento de catepsina G en el gen cry3A no modificado:

9

El par de cebadores 1 y el par de cebadores 2 generan dos productos de PCR únicos. Estos productos se combinan en partes iguales y se usa el par de cebadores 3 para unir los productos generando un fragmento de PCR que se clona nuevamente en el plásmido pCIB6850 original. Luego se transfiere el gen cry3A055 modificado a pBluescript (Stratagene). El plásmido resultante se denomina pCMS055. El par de cebadores 4 genera otro fragmento único que se clona en el dominio III del gen cry3A modificado contenido en pCMS055, El plásmido resultante se denomina pCMS083 y comprende el gen cry3A083 (SEQ ID NO: 20).

La toxina Cry3A083 modificada (SEQ ID NO: 21), codificada por el gen cry3A modificado, tiene un sitio de reconocimiento de catepsina G, que comprende la secuencia de aminoácidos AAPF (SEQ ID NO: 35), insertada en el dominio I entre los aminoácidos 107 y 111, y entre los aminoácidos 539 y 542 de la toxina Cry3A no modificada (SEQ ID NO:4). El sitio de reconocimiento de catepsina G está adyacente a un sitio de reconocimiento de tripsina y quimotripsina natural en el dominio I. y reemplaza a un sitio de reconocimiento de quimotripsina natural en el dominio III.

El gen cry3A085 contenido en pCMS085

El gen cry3A085 (SEQ ID NO:10) comprende una secuencia codificadora de catepsina G en la misma posición que el gen cry3A055 descrito anteriormente. El gen cry3A085 tiene 24 nucleótidos adicionales insertados en el extremo 5' que codifican los aminoácidos 41-47 de la secuencia de aminoácidos deducida indicada en la SEQ ID NO: 2 así como una metionina adicional. Los nucleótidos adicionales se insertan en el extremo 5' del gen cry3AO55 usando el siguiente par de cebadores de PCR:

10

La toxina Cry3A085 modificada (SEQ ID NO: 11), codificada por el gen cry3A modificado, tiene un sitio de reconocimiento de catepsina G, que comprende la secuencia de aminoácidos AAPF (SEQ ID NO: 35), insertada en el dominio I entre los aminoácidos que corresponden a 107 y 111 de la toxina Cry3A no modificada (SEQ ID NO: 4) y tiene ocho residuos de aminoácidos adicionales en el extremo N de los cuales el segundo residuo corresponde al aminoácido número 41 de la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 2.

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Ejemplo 4

Actividad insecticida de las toxinas Cry3A modificadas

Se ensayan las toxinas Cry3A modificadas para determinar la actividad insecticida contra el gusano de la raíz del maíz del oeste, el gusano de la raíz del maíz del norte y el gusano de la raíz del maíz del sur en valoraciones biológicas de insectos. Las valoraciones biológicas se efectúan usando un método de incorporación en la dieta. Se cultivan clones de E. coli que expresan una de las toxinas Cry3A modificadas de la invención durante una noche. Se tratan con ultrasonidos 500 \mul de un cultivo nocturno y luego se mezclan con 500 \mul de dieta artificial molida (Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293). Una vez que la dieta solidifica, se introduce en una placa Petri y se colocan en la dieta 20 gusanos neonatos de la raíz del maíz. Las placas Petri se mantienen a 30ºC. Se registra la mortalidad después de 6 días. Todas las toxinas Cry3A modificadas causan 5%-100% de mortalidad en los gusanos de la raíz del maíz del oeste y del norte mientras que la toxina Cry3A no modificada causa 0%-30% de mortalidad. Ninguna de las toxinas Cry3A modificada tiene actividad contra el gusano de la raíz del maíz del sur.

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Ejemplo 5

Creación de plantas de maíz transgénico que comprenden secuencias codificadoras modificadas de cry3A

Seeligen para la transformación enplantas de maíz tres genes cry3A modificados, el cry3A055, representante de una modificación del dominio I, el cry3A058, representante de una modificación de un dominio III, y el cry3A056, representante de una modificación tanto del dominio I como del dominio III. Un casetede expresión que comprende una secuencia codificadora cry3A modificada se transfiere a un vector apropiado para la transformación de maíz mediada por Agrobacterium. Para este ejemplo, un casete de expresión comprende, además del gen cry3A modificado, el promotor MTL (Patente de EE.UU. Nº 5.466.785) y el terminador nos que es conocido en la técnica.

La transformación de embriones de maíz inmaduros se efectúa esencialmente tal como se ha descrito por Negrotto et al., (2000), Plant Cell Reports 19:798-803. Para este ejemplo, todos los constituyentes del medio son tal corno se han descrito en Negrotto et al., supra. Sin embargo, pueden ser sustituidos por diversos medios constituyentes conocidos en la técnica.

Los genes usados para la transformación se clonan en un vector apropiado para la transformación de maíz. Los vectores usados en este ejemplo contienen el gen de fosfomanosa-isomerasa (PMI) para la selección de líneas transgénicas (Negrotto et al (2000) Plant Cell Reports 19: 798-803).

La cepa Agrobacterium LBA4404 (pSB1) que contiene el plásmido de transformación de vegetales se cultiva en un medio sólido de YEP (extracto de levadura (5 g/L), peptona (10 g/L), NaCl (5 g/L), 15 g/l de agar, pH 6,8) durante 2 a 4 días a 28ºC. Aproximadamente 0,8x10^{9} Agrobacterium se ponen en suspensión en medios LS-inf suplementado con As 100 \muM (Negrotto et al., (2000) Plant Cell Rep. 19: 798-803). Las bacterias se pre-inducen en este medio durante 30-60 minutos.

Se extraen embriones inmaduros de A188 o de otro genotipo apropiado de mazorcas de 8-12 días, en LS-inf + As100 \muM. Los embriones se lavan una vez con un medio de infección reciente. Se añade una solución de Agrobacterium y los embriones se somete a vórtice durante 30 segundos y se dejan sedimentar con las bacterias durante 5 minutos. Los embriones se transfieren luego con el escutelio hacia arriba a un medio LSA y se cultivan en la oscuridad durante 2 a 3 días. Subsiguientemente, entre 20 y 25 embriones por placa Petri se transfieren a un medio con LSDc suplementado con cefotaxima (250 mg/l) y nitrato de plata (1,6 mg/l) y se cultivan en la oscuridad durante 10 días a 28ºC. Los embriones inmaduros, productores de callos embriogénicos se transfieren a un medio LSD1M05S. Los cultivos en este medio se seleccionan durante 6 semanas con una etapa de sub-cultivo a las tres semanas.

Los callos sobrevivientes se transfieren a un medio Reg1 suplementado con manosa. Después de cultivar bajo la luz (régimen de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad), los tejidos verdes se transfieren a un medio Reg2 sin reguladores de crecimiento y se incuban durante 1-2 semanas. Las plántulas se transfieren a cajas magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago Illinois) que contienen un medio Reg3 y se cultivan bajo la luz. Después de 2-3 semanas las plantas se analizan mediante PCR para determinar la presencia de genes PMI, y genes cry3A modificados. Las plantas positivas en el ensayo de PCR se transfieren a un invernadero y se someten a ensayos para determinar la resistencia al gusano de la raíz del maíz.

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Ejemplo 6

Análisis de plantas de maíz transgénico Eficacia en el gusano de la raíz del maíz Valoración biológica de la extirpación de la raíz

Se toman muestras de plantas que se trasplantan desde las cajas magenta GA-7 al suelo. Esto permite tomar muestras de las raíces de un ambiente razonablemente estéril en relación con las condiciones del suelo. La toma de muestras consiste en cortar un pequeño trozo de raíz (aproximadamente 2-4 cm de longitud) y colocarlo en una pequeña placa Petri sobre phytagar (phytagar, 12 g, sacarosa, 9 g, sales MS, 3 ml, vitaminas MS, 3 ml, nistatina
(25 mg/ml), 3 ml, cefotaxima 50 mg/ml), 7 ml, aureomicina (50 mg/ml), 7 ml, estreptomicina (50 mg/ml), 7 ml, dH_{2}O, 600 ml). Los controles negativos son plantas transgénicas que son negativas a la PCR para el gen cry3A modificado a partir del mismo experimento, o de plantas no transgénicas (de un tamaño similar a las plantas de ensayo), que se cultivan en el phytotron. Si las muestras de control se toman de raíces del suelo, las muestras de raíces se lavan con agua para eliminar cualquier residuo de suciedad, se sumergen en una solución de nistatina (5 mg/ml), se sacan del baño, se absorbe la humedad con toallitas de papel y se colocan en una placa de phytagar.

Las muestras de raíces se inoculan con gusanos de la raíz del maíz del oeste colocando 10 larvas de primer estadio sobre la superficie interna de la tapa de cada placa de phytagar y luego se sellan de nuevo herméticamente las tapas. Las larvas se manipulan usando un pincel con una punta fina. Después de inocular todas las placas, se coloca la bandeja con las placas en la oscuridad a temperatura ambiente hasta el momento de la recogida de datos.

A los 3-4 días después de la inoculación, se toman datos. El porcentaje de mortalidad de las larvas se calcula junto con una evaluación visual del daño de la raíz. El daño causado por alimentación se clasifica como elevado, moderado, bajo o ausente y se le da un valor numérico de 3, 2, 1 ó 0 respectivamente. Las muestras de raíz que causan por lo menos una mortalidad del 40% y las que tienen una clasificación de daño de 2 o menos se consideran positivas.

Los resultados de la tabla siguiente muestran que las plantas que expresan una toxina Cry3A causan de 40-100% de mortalidad en los gusanos de la raíz del maíz del oeste mientras que las plantas de control causan 0-30% de mortalidad. Asimismo, las plantas que expresan una toxina Cry3A modificada mantienen significativamente menos daño por alimentación que las plantas de control.

TABLA 2

11

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Valoración biológica de plantas enteras

Algunas plantas positivas identificadas usando la valoración biológica de extracción de raíz descrita anteriormente se evalúan para determinar la resistencia del gusano de la raíz del maíz del oeste usando una valoración biológica de planta entera. Las plantas se infectaron en general después de tres días después de completar el ensayo de extirpación de la raíz.

Se preincuban huevos del gusano de la raíz del maíz del oeste de manera que la puesta ocurra 2-3 días después de la inoculación de la planta. Los huevos se suspenden en 0,2% de agar y se aplican al suelo alrededor de las plantas de ensayo aproximadamente a razón de 200 huevos/planta.

Dos semanas después de la puesta de huevos, las plantas se evalúan para determinar el daño causado por las larvas del gusano de la raíz del maíz del oeste. Los criterios que se usan para determinar si las plantas son resistentes al daño por alimentación causado por el gusano de la raíz del maíz del oeste son la altura alcanzada por la planta, el encamamiento, y la masa de la raíz. En el momento de la evaluación, las plantas de control son típicamente más pequeñas que las plantas con la toxina Cry3a modificada. Asimismo, las plantas de control no transgénicas y las plantas que expresan la toxina Cry3A modificada codificada por el gen de maíz cry3A optimizado se han encamado durante este tiempo debido a una severa poda de la mayor parte de las raíces que da como resultado que no se produzca acumulación de masa en la raíz. En el momento de la evaluación, las plantas que expresan una toxina Cry3A modificada de la invención son más altas que las plantas de control, no se han encamado, y tienen una mayor masa de raíz intacta debido a la actividad insecticida de la toxina Cry3A modificada.

Ensayo ELISA

Para la determinación cuantitativa del nivel de proteína Cry3A modificada y no modificada en plantas transgénicas se usó el análisis por ELISA de acuerdo con el método descrito en la patente de EE.UU. Nº 5.625.136.

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TABLA 3 Resultados de la valoración biológica de plantas enteras y niveles de proteína

12

<110> Syngenta Participations AG

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<120> Toxinas CryA modificadas y secuencias de ácidos nucleicos que las codifican

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 60065/PCT

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\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/616421

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-08-31

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 34

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 3.0

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1932

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1932)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora natural de Cry3A de acuerdo con Sekar et al. 1987. Proc. Acad. Sci. 84:7036-7040.

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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13

14

15

16

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<210> 2

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<211> 644

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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17

18

19

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 1803

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1794)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora de cry3A del maíz optimizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

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<210> 4

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<211> 597

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cry3A codificada por SEQ ID NO: 3.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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23

24

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 7208

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<223> pCIB6850

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1801

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1791)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora de cry3A modificada y optimizada del maíz.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

29

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 596

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1806)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora de cry3A055 del maíz modificada y optimizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 598

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1818

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(1818)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora de cry3A085 del maíz modificada y optimizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (346)..(357)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

42

43

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 606

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (346)..(357)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

46

47

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1794

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1794)

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<223> Secuencia codificadora de cry3A082 del maíz modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1609)..(1620)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

49

50

51

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 597

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1609)..(1620)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

53

54

55

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<210> 14

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<211> 1816

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1812)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora de cry3A058 del maíz modificada y optimizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1621)..(1632)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

56

57

58

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 601

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1621)..(1632)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

60

61

62

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1813

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1812)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora de cry3A057 modificada y optimizada del maíz

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1618)..(1629)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

64

65

66

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 600

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

68

69

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1819

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1818)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora de cry3A056 modificada y optimizada del maíz

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1624)..(1635)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

71

72

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 602

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1624)..(1625)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

74

75

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1797

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1791)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora de cry3A083 del maíz modificada y optimizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1612)..(1623)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

77

78

79

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 597

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1612)..(1623)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificadora del sitio de reconocimiento de catepsina G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

81

82

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador BamExt1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccacca tgacggccga c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador AAPFtail13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaacggtgca gcggggttct tctgccagc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador AAPFtail14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgcaccgt tcccccacag ccagggccg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador XbaExt2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctagaccca cgttgtacca c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Tail5mod

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgcaccgt tccgcaaccc ccacagcca

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1).. (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SalExt

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagcgtcgac ttcttcaac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1).. (30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador AAPF-Y2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaacggtgca gcgtattggt tgaagggggc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador AAPF-Y1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgcaccgt tctacttcga caagaccatc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SacExt

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagctcagat ctagttcacg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador BBmodl

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggggccccc gctgcaccgt tctacttcga ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador BBmod2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtcgaagta gaacggtgca gcgggggccc cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador mo3Aext

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccacca tgaactacaa ggagttcctc cgcatgaccg ccgacaac

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador CMS16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctccacctg ctccatgaag

\hfill

20

Claims (36)

1. Una toxina Cry3A modificada, que comprende un sitio de reconocimiento de proteasa que no se presenta de modo natural, en donde dicho sitio de reconocimiento de proteasa modifica una toxina Cry3A y está localizado en una posición seleccionada del grupo que consiste en:

a)

una posición entre aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 107 y 115 de la SEQ NO: 4;

b)

una posición entre aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4; y una posición entre aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 107 y 115 de la SEQ ID NO: 4, y

c)

entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4;

en donde dicho sitio de reconocimiento de proteasa es reconocible por una proteasa intestinal del gusano de la raíz del maíz del oeste, y en donde dicha toxina Cry3A modificada causa mayor mortalidad al gusano de la raíz del maíz del oeste que la mortalidad causada por dicha toxina Cry3A al gusano de la raíz del maíz el oeste en una valoración biológica con dieta artificial.

2. La toxina Cry3A modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteasa intestinal es una serina-proteasa.

3. La toxina Cry3A modificada de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha proteasa intestinal es catepsina G.

4. La toxina Cry3A modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho sitio de reconocimiento de proteasa esta:

(i)

localizado entre los aminoácidos números 107 y 115 de la SEQ ID NO: 4; o

(ii)

localizado entre los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4; o

(iii)

localizado entre los aminoácidos números 107 y 115 y entre los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4.

5. La toxina Cry3A modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho sitio de reconocimiento de proteasa está:

(i)

localizado entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 107 y 113 de la SEQ ID NO: 4; o

(ii)

localizado entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 107 y 111 de la SEQ ID NO: 4; o

(iii)

localizado entre los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 536 y 541 de la SEQ ID NO: 4; o

(iv)

localizado entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4; o

(v)

localizado entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 107 y 113 de la SEQ ID NO:4 y entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4; o;

(vi)

localizado entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 107 y 111 de la SEQ ID NO: 4 y entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 536 y 541 de la SEQ ID NO: 4; o;

(vii)

localizado entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 107 y 111 de la SEQ ID NO: 4 y entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4.

6. La toxina Cry3A modificada de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho sitio de reconocimiento de proteasa está:

(i)

localizado entre los aminoácidos números 107 y 113 de la SEQ ID NO: 4; o

(ii)

localizado entre los aminoácidos números 107 y 111 de la SEQ ID NO: 4; o

(iii)

localizado entre los aminoácidos números 536 y 541 de la SEQ ID NO: 4; o

(iv)

localizado entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4; o

(v)

localizado entre los aminoácidos números 107 y 113 de la SEQ ID NO: 4 y entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4; o

(vi)

localizado entre los aminoácidos números 107 y 111 de la SEQ ID NO: 4 y entre los aminoácidos números 536 y 541 de la SEQ ID NO: 4; o

(vii)

localizado entre los aminoácidos números 107 y 111 de la SEQ ID NO: 4 y entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4.

7. La toxina Cry3A modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha toxina Cry3A modificada causa por lo menos 50% de mortalidad al gusano de la raíz del maíz del oeste al que dicha toxina Cry3A causa hasta 30% de mortalidad.

8. La toxina Cry3A modificada de acuerdo con la reivindicación 1, que:

(i)

está codificada por los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 6, los nucleótidos 1-1806 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 10, los nucleótidos 1-1794 de la SEQ ID NO: 12, los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 14, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 16, los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 18 o los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 20; o

(ii)

comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 21.

9. La toxina Cry3A modificada de acuerdo con la reivindicación 1, que es activa contra el gusano de la raíz del maíz del norte.

10. Una molécula aislada de ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9.

12. Un gen cry3A modificado, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada, que comprende un sitio de reconocimiento de proteasa que no se presenta de modo natural, en donde dicha gen modificado cry3Acomprende una secuencia codificadora que codifica un sitio de reconocimiento de proteasa, en donde dicha secuencia codificadora modifica un gen cry3A y está insertado en una posición seleccionada del grupo que consiste en:

a)

una posición entre los codones que codifican los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 107 y 115 de la SEQ ID NO: 4;

b)

una posición entre los codones que codifican los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4; y

c)

una posición entre los codones que codifican los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 107 y 115 de la SEQ ID NO: 4, y entre los codones que codifican los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4,

en donde dicho sitio de reconocimiento de proteasa es reconocible por una proteasa intestinal del gusano de la raíz del maíz del oeste, y en donde dicha toxina Cry3A modificada causa mayor mortalidad al gusano de la raíz del maíz del oeste que la mortalidad causada por dicha toxina Cry3A al gusano de la raíz del maíz del oeste en una valoración biológica con dieta artificial.

13. El gen cry3A modificado de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha proteasa intestinal es una serina-proteasa.

14. El gen cry3A modificado de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha proteasa intestinal es

\hbox{catepsina G.}

15. El gen cry3A modificadode acuerdo con la reivindicación 12, en donde:

(i)

dicha secuencia de nucleótidos comprende los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 6, los nucleótidos 1-1806 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 10, los nucleótidos 1-1794 de la SEQ ID NO: 12, los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 14, los nucleótidos 1-1812 de la SEQ ID NO: 16, los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 18, o los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 20; o

(ii)

dicha toxina Cry3A modificada comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO:. 15, SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 19, o la SEQ ID NO: 21.

16. El gen cry3A modificadode acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha toxina Cry3A modificada es activa contra el gusano de la raíz del maíz del norte.

17. Una planta de maíz transgénica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha planta transgénica expresa dicha toxina Cry3A modificada en el tejido de la raíz a un nivel que causa la mortalidad de gusano de la raíz de maíz del oeste.

18. Una planta de maíz transgénica que comprende un gen cry3A modificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina Cry3A modificada, siendo dicho gen cry3A modificado como se ha definido en la reivindicación 12, en donde dicha planta transgénica expresa dicha toxina Cry3A modificada en el tejido de la raíz a un nivel que causa la mortalidad de gusano de la raíz de maíz del oeste.

19. La planta de maíz transgénica de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho sitio de reconocimiento de proteasa está:

(i)

localizado entre los aminoácidos números 107y 111 de la SEQ ID NO: 4; o

(ii)

localizado entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4; o

(iii)

localizado entre los aminoácidos números 107 y 111 de la SEQ ID NO: 4 y entre los aminoácidos números 540 y 541 de la SEQ ID NO: 4.

20. La planta de maíz transgénica de acuerdo con la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en donde:

(i)

dicha secuencia de nucleótidos comprende los nucleótidos 1-1806 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1-1818 de la SEQ ID NO: 14, o los nucleótidos 1-1791 de la SEQ ID NO: 18; o

(ii)

dicha toxina Cry3A modificada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 19.

21. La planta de maíz transgénica de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicho tejido de la raíz causa 40% de mortalidad al gusano de la raíz del maíz del oeste.

22. La planta de maíz transgénica de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicha planta transgénica expresa dicha toxina Cry3A modificada a un nivel suficiente para:

(i)

impedir que el gusano de la raíz del maíz del oeste reduzca acusadamente las raíces de la planta transgénica; o

(ii)

impedir el daño por alimentación del gusano de la raíz del maíz del oeste que hace que la planta se encame.

23. Un método de controlar la infestación de plantas de maíz por el gusano de la raíz del maíz del oeste, comprendiendo dicho método:

(a)

crear la planta de maíz transgénica de acuerdo con la reivindicación 17; y

(b)

poner en contacto dicho gusano de la raíz del maíz del oeste con la planta.

24. Un método de producir una toxina Cry3A modificada, que comprende:

(a)

obtener una célula hospedante bacteriana transgénica que comprende una construcción quimérica que comprende una secuencia promotora heteróloga unida operativamente al ácido nucleico de la reivindicación 10;

(b)

cultivar la célula hospedante bacteriana transgénica en condiciones que permiten la expresión de la toxina Cry3A modificada; y

(c)

recuperar la toxina Cry3A modificada expresada.

25. Un método de producir una planta resistente a insectos, que comprende:

(a)

integrar establemente la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10 en el genoma de células vegetales; y

\newpage

(b)

regenerar plantas establemente transformadas de dichas células vegetales transformadas, en donde dichas plantas establemente transformadas expresan una cantidad eficaz de una toxina Cry3A modificada para hacer que dicha planta transformada sea resistente a por lo menos el gusano de la raíz del maíz del oeste.

26. Un método de controlar por lo menos el gusano de la raíz del maíz del oeste, que comprende administrar por vía oral al gusano de la raíz del maíz del oeste una cantidad eficaz de una toxina de acuerdo con la reivindicación 1.

27. Un método de obtener una toxina Cry3A modificada, que comprende:

(a)

obtener un gen cry3A que codifica una toxina Cry3A;

(b)

identificar una proteasa intestinal del gusano de la raíz del maíz del oeste;

(c)

obtener una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de reconocimiento para dicha proteasa intestinal;

(d)

insertar dicha secuencia de nucleótidos en dicho gen cry3A, de tal modo que dicho sitio de reconocimiento esté localizado en dicha toxina Cry3A en una posición entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 107 y 115 de la SEQ ID NO: 4, o en una posición entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4, o en una posición entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 107 y 115 de la SEQ ID NO: 4 y entre los aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números 536 y 542 de la SEQ ID NO: 4, creando de este modo un gen cry3A modificado;

(e)

insertar dicho gen cry3A modificado en un casete de expresión; y

(f)

transformar dicho casete de expresión en una célula hospedante no humana, en donde dicha célula hospedante produce una toxina Cry3A modificada.

28. Una construcción de gen quimérico que comprende una secuencia de promotor heteróloga unida operativamente a:

(i)

la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10; o

(ii)

el gen cry3A modificado de la reivindicación 12.

29. Un vector recombinante que comprende la construcción quimérica de la reivindicación 28.

30. Una célula hospedante transgénica no humana que comprende la construcción quimérica de la reivindicación 28.

31. La célula hospedante transgénica de acuerdo con la reivindicación 30, que es una célula bacteriana o una célula vegetal.

32. Una planta transgénica que comprende la célula de planta transgénica de la reivindicación 31.

33. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicha planta es una planta de maíz.

34. La planta de maíz transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, que es:

(i)

una planta endogámica; o

(ii)

una planta híbrida.

35. Semilla transgénica de la planta transgénica de la reivindicación 32 o de la planta de maíz transgénica de la reivindicación 33 o la reivindicación 34.

36. Una composición que comprende una cantidad eficaz de la toxina de la reivindicación 1 para causar la mortalidad del gusano de la raíz del maíz del oeste.