RS65658B1 - Kriokonzervirane nk ćelije prethodno punjene konstruktom antitela - Google Patents

Kriokonzervirane nk ćelije prethodno punjene konstruktom antitela

Info

Publication number
RS65658B1
RS65658B1 RS20240687A RSP20240687A RS65658B1 RS 65658 B1 RS65658 B1 RS 65658B1 RS 20240687 A RS20240687 A RS 20240687A RS P20240687 A RSP20240687 A RS P20240687A RS 65658 B1 RS65658 B1 RS 65658B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
cdr
cells
antibody
cell
Prior art date
Application number
RS20240687A
Other languages
English (en)
Inventor
Uwe Reusch
Joachim Koch
Martin Treder
Holger J Dulat
Original Assignee
Affimed Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Affimed Gmbh filed Critical Affimed Gmbh
Publication of RS65658B1 publication Critical patent/RS65658B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A01N1/125—Freeze protecting agents, e.g. cryoprotectants or osmolarity regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/16—Physical preservation processes
    • A01N1/162—Temperature processes, e.g. following predefined temperature changes over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/15—Natural-killer [NK] cells; Natural-killer T [NKT] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4214—Receptors for cytokines
    • A61K40/4215—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4254—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4261—Proteoglycans, e.g. glypican, brevican or CSPG4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska:
[0001] Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovane humane NK ćelije u kriokonzerviranom stanju, koje su prethodno napunjene konstruktom antitela pre zamrzavanja, pri čemu konstrukt antitela sadrži najmanje prvi vezujući domen koji se vezuje za antigen receptora na površini ćelije imunološke efektorske ćelije, posebno onaj koji je eksprimiran na NK ćelijama, i drugi vezujući domen koji vezuje za površinu ćelije antigen na površini ciljne ćelije.
Stanje tehnike:
[0002] Prirodne ćelije ubice (NK) su moćne citotoksične imune efektorske ćelije urođenog imunog sistema. One su sposobne da prepoznaju i unište ćelije tumora, kao i ćelije koje su inficirane virusima ili bakterijama. NK ćelije mogu indukovati antigen nezavisan imuni odgovor protiv malignih ćelija. Dodatno, pored NK ćelija postoje i druge imunološke efektorske ćelije, npr. monociti, makrofagi, neutrofili itd., koji su sposobni da ubijaju ćelije tumora ili ćelije inficirane virusima ili bakterijama. Generalno, ovo se shvata kao urođeni imunitet.
[0003] Sve veći broj naučnih radova i kliničkih studija pokazuju obećavajuće i moćne antitumorske efekte kada se koristi imunoterapija zasnovana na NK ćelijama. Trenutno se istražuju različiti pristupi sa ciljem povećanja broja i funkcije NK ćelija. Jedan od navedenih pristupa koristi ili bi- ili multi-specifične konstrukte antitela sa ciljem da se poboljša specifičnost endogenih NK ćelija tako što će ih umrežiti sa odgovarajućim ciljnim ćelijama. Da bi se iskoristile takve sinergije, primena adoptivne ćelijske terapije u kombinaciji sa terapijom zasnovanom na antitelima je kombinovana u različitim indikacijama. Različiti izvori NK ćelija za adaptivni transfer su u fazi evaluacije i uključuju alogene haplo-identične NK ćelije koje su bile podvrgnute kratkoročnoj ili dugotrajnoj aktivaciji ili ekspanziji, NK ćelije pupčane vrpce, koje su takođe podvrgnute ekspanziji/aktivirane pod definisanim uslovima, NK ćelijske linije ili NK ćelije izvedene/diferencirane iz matičnih ćelija. Svi izvori se teoretski takođe mogu koristiti za generisanje CAR-NK ćelija, koje su izvedene iz novog tipa genetske modifikacije sa lenti- ili retrovirusima za proizvodnju stabilnih antigen specifičnih NK ćelija. Prvi primeri uključuju CD19-CAR-NK ćelijski pristup koji se trenutno testira na NHL pacijentima.
[0004] Međutim, kada se kombinuju konstrukti antitela sa bilo kojim od gore navedenih izvora NK ćelija za adaptivni transfer, uvek je neophodno pripremiti ćelije na mestu upotrebe, odnosno u bolnici u kojoj se terapija primenjuje kod dotičnog pacijenta, i, zatim, da se pomenutom pacijentu zajedno daju potrebne doze odgovarajućih konstrukata antitela. Pored činjenice da bi ovo moglo biti logistički problem za većinu bolnica, takođe je važno napomenuti da svi radni paketi potrebni za pripremu ćelija za administraciju moraju biti izvedeni u skladu sa strogo kontrolisanim protokolima kako bi se isključio bilo kakav problem koji se može izbeći što povećava takav rizik.
[0005] REUSCH U ET AL.. (MABS 2014, 6(3): 727-738) opisuju anti-CD30/anti-CD16A antitelo za angažovanje NK ćelija za lizu CD30<+>Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) ćelija limfoma.
[0006] YAMASHITA ET AL. (Scientific Reports 6: 19772) opisuju upotrebu zamrznutih NK ćelija za in vitro test citotoksičnosti sa trastuzumabom, koji je IgG1 mAb protiv HER2
[0007] WO 2011/004201 opisuje aktivirane zamrznute NK ćelije bez aktivacionog agensa.
[0008] Shodno tome, postoji potreba za sredstvima i postupcima za pojednostavljenje takve terapije kako bi se omogućila primenljivost za veću grupu pacijenata, posebno u nespecijalizovanim bolnicama ili medicinskim centrima.
Slike prikazuju:
[0009]
Slika 1: 4 h test citotoksičnosti oslobađanja kalceina na ciljnim ćelijama MM.1S (A) ili DK-MG (B) NK ćelije kao efektorske ćelije u naznačenom E:T odnosu koje su prethodno napunjene sa 10 µg/mL navedenih antitela i isprane (zapr /) ili nije oprano (sa/bez) pre jednog ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Kao kontrola, iste NK ćelije nisu prethodno napunjene, već isprane i podvrgnute jednom ciklusu zamrzavanja/odmrzavanja, a naznačeno antitelo je dodato u test citotoksičnosti (sveže; puni sivi dijamanti).
Slika 2: Vezivanje različitih anti-CD16 antitela za obložene varijante CD16 antigena analizirano u ELISA testu. ELISA ploče sa 96 bunarčića su obložene rekombinantnim varijantama antigena prikazanim u legendi panela A. Različita antitela prikazana u (A)-(D) su serijski razblažena i inkubirana na pločama u naznačenom opsegu koncentracija. Vezana antitela su otkrivena sa anti-His-HRP u (A)-(C), ili proteinom L-HRP. Reakcije TMB supstrata su merene na 450 nm (Ext (450 nm)). Krive vezivanja su postavljene korišćenjem četvoroparametarske logističke (4PL) krive model log(agonist) u odnosu na odziv - promenljivi nagib u Graphpad Prism.
Slika 3: Reaktivnost različitih anti-CD16 scFv antitela ili kontrolnih scFv ili mAbs sa rekombinantnim varijantama CD16 antigena ili kontrolnim EGFR antigenom eksprimiranim na CHO ćelijama sa EGFR transmembranskim domenom (TM) ili GPI-sidrom.
Slika 4: Poravnanje sekvenci ekstracelularnih domena humanih i makaki CD16A i humanih CD16B varijanti korišćenih kao rekombinantni antigeni u eksperimentima rezimiranim u tabeli 3. Varijacije u sekvenci makaki CD16A ECD označene su sivom bojom. Za poravnanje je korišćen alat CLUSTAL O (1.2.4) za poravnavanje više sekvenci.
Slika 5: Vezivanje različitih anti-CD16 antitela za varijante CD16 antigena nakon odvajanja pomoću SDS-PAGE i Western blotting-a.2 µg rekombinantnog antigen proteina je napunjeno po traci, razdvojeno SDS-PAGE, blotovano na PVDF membranama i inkubirano sa naznačenim primarnim i sekundarnim antitelima. Signali kolorimetrijskog razvoja sa DAB supstratom pokazuju jasno prepoznavanje varijanti CD16A i CD16B antigena.
Slika 6: Konkurencija vezivanja različitih anti-CD16 scFv antitela sa mAb 3G8 za CD16A u ELISA testu. Ploče obložene antigenom CD16A (48R, 158V)-mFc.67 su inkubirane sa smešom 1nM mAb 3G8 i serijskim razblaženjima različitih anti-CD16 scFv u naznačenom opsegu koncentracija. 3G8 vezan za CD16A je detektovan sa kozjim anti-mišjim IgG(H+L)-HRPO. Reakcije TMB supstrata su merene na 450 nm (Ekt (450 nm)). Krive vezivanja su postavljene korišćenjem četvoroparametarske logističke (4PL) krive model log(agonist) u odnosu na odziv - promenljivi nagib u Graphpad Prism.
Slika 7: Titracija scFv_CD16-1 koji sadrži humane Fv domene iz klona CD16-1 (A), scFv_CD16-2 koji sadrži humane anti-CD16 Fv domene iz klona CD16-2 (B), i scFv_3G8, koji sadrži mišje Fv domene iz mAb 3G8 (C) na primarnim humanim NK ćelijama na 37°C u prisustvu ili odsustvu 10 mg/mL poliklonskog humanog IgG.
Figura 8: 4 h test citotoksičnosti oslobađanja kalceina na ciljnim ćelijama COLO 205 (A) ili KARPAS-299 (B) NK ćelije kao efektorske ćelije u naznačenom E:T odnosu koje su prethodno napunjene sa 10 µg/mL navedenih antitela i zamrznute na -80 °C. Kao kontrola, alikvoti istih NK ćelija nisu prethodno napunjeni (bez antitela) već su takođe podvrgnuti jednom ciklusu zamrzavanja/odmrzavanja, a navedena antitela (EpCAM/NKG2D scFv-lgAb_75 ili CD30/CD16A TandAb) su sveže dodata na koncentraciju od 10 µg/mL za test citotoksičnosti. Na grafiku je prikazana srednja vrednost i SD duplih vrednosti lize. Eksp. broj: RBL 1464.
Definicije
[0010] Termin "konstrukt antitela" se odnosi na molekul u kome je struktura i/ili funkcija zasnovana na strukturi i/ili funkciji antitela, na primer, molekula imunoglobulina pune dužine ili celog i/ili je/su izvučeni iz domena varijabilnog teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog lakog lanca (VL) antitela ili njegovog fragmenta. Konstrukt antitela je stoga sposoban da se veže za svoju specifičnu metu ili antigen. Dalje, domen vezivanja konstrukta antitela definisan u kontekstu pronalaska obuhvata minimalne strukturne zahteve antitela koji omogućavaju vezivanje ciljne strukture. Ovaj minimalni zahtev može npr. biti definisan prisustvom najmanje tri CDR laka lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR teška lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona), poželjno svih šest CDR. Alternativni pristup za definisanje minimalnih zahteva za strukturom antitela je definicija epitopa antitela unutar strukture specifične mete, odnosno, proteinskog domena ciljnog proteina koji čini epitopni region (epitopski klaster) ili pozivanjem na specifično antitelo koje je u kompeticijin sa epitopom definisanog antitela. Antitela na kojima se zasnivaju konstrukti definisani u kontekstu pronalaska uključuju na primer monoklonska, rekombinantna, himerna, deimunizovana, humanizovana i humana antitela.
[0011] Vezujući domen konstrukta antitela definisan u kontekstu pronalaska može npr. obuhvatati prethodno navedene grupe CDR. Poželjno, ovi CDR su sadržani u okviru varijabilnog regiona lakog lanca antitela (VL) i varijabilnog regiona teškog lanca antitela (VH); međutim, ne moraju sadržati oba. Fd fragmenti, na primer, imaju dva VH regiona i često zadržavaju neku funkciju vezivanja antigena intaktnog domena za vezivanje antigena. Dodatni primeri za format fragmenata antitela, varijanti antitela ili vezujućih domena uključuju (1) Fab fragment, monovalentni fragment koji ima VL, VH, CL i CH1 domene; (2) a F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji ima dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (3) Fd fragment koji ima dva VH i CH1 domena; (4) Fv fragment koji ima VL i VH domene jednog kraka antitela, (5) dAb fragment (Vard et al., (1989) Nature 341:544-546), koji ima VH domen; (6) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) i (7) jednolančani Fv (scFv), pri čemu je poslednji poželjan (na primer, izveden iz scFV-biblioteke).
[0012] Takođe, u okviru definicije „domena vezivanja“ ili „domena koji se vezuje“ su fragmenti antitela pune dužine, kao što su VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab' )2ili "r IgG" ("polu antitelo"). Konstrukti antitela kako su definisani u kontekstu pronalaska mogu takođe da sadrže modifikovane fragmente antitela, takođe nazvane varijante antitela, kao što su scFv, discFv ili bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-zipper, scFab, Fab2, Fab3, dijatela, jednolančana dijatela, tandem dijatela (Tandab), tandem di-scFv, tandem tri-scFv, „multitela“ kao što su trijatela ili tetratela, i jednodomenska antitela kao što su nanotela ili antitela sa jednim varijabilnim domenom koja sadrže samo jedan varijabilni domen, koji mogu biti VHH, VH ili VL, koji specifično vezuju antigen ili epitop nezavisno od drugih V regiona ili domena.
[0013] Kako se ovde koristi, termini "jednolančana Fv", "jednolančana antitela" ili "scFv" odnose se na fragmente antitela jednog polipeptidnog lanca koji sadrže varijabilne regione i iz teškog i iz lakog lanca, ali nemaju konstantne regione. Generalno, jednolančano antitelo dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji mu omogućava da formira željenu strukturu koja bi omogućila vezivanje antigena. Jednolančana antitela su detaljno razmotrena od strane Plueckthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.1 13, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Poznati su različiti postupci generisanja jednolančanih antitela, uključujući one opisane u U.S. Pat. br. 4,694,778 i 5,260,203; Publikacija međunarodne prijave patenta br. WO 88/01649; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 85:5879-5883; Vard et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041. U specifičnim primerima izvođenja, jednolančana antitela takođe mogu biti bispecifična, multispecifična, humana i/ili humanizovana i/ili sintetička.
[0014] Dodatno, definicija pojma "konstrukt antitela" uključuje monovalentne, dvovalentne i polivalentne/multivalentne konstrukte i, prema tome, bispecifične konstrukte, koji se specifično vezuju za samo dve antigenske strukture, kao i polispecifične/multispecifične konstrukte, koji specifično vezuju više od dva antigena strukture, npr. tri, četiri ili više, kroz različite domene vezivanja. Dodatno, definicija pojma „konstrukt antitela“ uključuje molekule koji se sastoje od samo jednog polipeptidnog lanca, kao i molekule koji se sastoje od više od jednog polipeptidnog lanca, pri čemu lanci mogu biti ili identični (homodimeri, homotrimeri ili homo oligomeri) ili različiti (heterodimer, heterotrimer ili heterooligomer). Primeri za gore identifikovana antitela i njihove varijante ili derivate opisani su između ostalog u Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) i Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed.
2010 and Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009
[0015] Termin "valentni" označava prisustvo određenog broja domena koji vezuju antigen u proteinu koji vezuje antigen. Prirodni IgG ima dva domena za vezivanje antigena i bivalentan je. Proteini koji vezuju antigen kako su definisani u kontekstu pronalaska su najmanje trovalentni. Ovde su opisani primeri tetra-, penta- i heksavalentnih proteina koji vezuju antigen.
[0016] Termin "bispecifičan" kako se ovde koristi odnosi se na konstrukt antitela koji je "barem bispecifičan", tj. sadrži najmanje prvi vezujući domen i drugi vezujući domen, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za jedan antigen ili cilj (ovde : receptor NK ćelije, npr. CD16a), a drugi vezujući domen se vezuje za drugi antigen ili cilj (ovde: antigen površine ciljne ćelije). Shodno tome, konstrukti antitela kako su definisani u kontekstu pronalaska sadrže specifičnosti za najmanje dva različita antigena ili mete. Na primer, prvi domen se poželjno vezuje za ekstracelularni epitop NK ćelijskog receptora jedne ili više vrsta odabranih od ljudi, vrsta makaki majmuna i vrste glodara.
[0017] Termin "receptor NK ćelija" kako se koristi u kontekstu pronalaska definiše proteine i proteinske komplekse na površini NK ćelija. Dakle, termin definiše površinske molekule ćelije, koji su karakteristični za NK ćelije, ali nisu neophodno eksprimirani isključivo na površini NK ćelija već i na drugim ćelijama kao što su makrofagi ili T ćelije. Primeri za NK ćelijske receptore obuhvataju, ali nisu ograničeni na CD16a, CD16b, NKp46 i NKG2D.
[0018] "CD16A" se odnosi na aktivirajući receptor CD16A, takođe poznat kao FcγRIIIA, eksprimiran na površini ćelije NK ćelija. CD16A je aktivirajući receptor koji pokreće citotoksičnu aktivnost NK ćelija. Afinitet antitela za CD16A direktno korelira sa njihovom sposobnošću da pokrenu aktivaciju NK ćelija, tako da veći afinitet prema CD16A smanjuje dozu antitela potrebnu za aktivaciju. Mesto za vezivanje antigena proteina koji vezuje antigen vezuje se za CD16A, ali ne i za CD16B. Na primer, mesto za vezivanje antigena koje sadrži varijabilne domene teškog (VH) i lakog (VL) lanca koji se vezuju za CD16A, ali se ne vezuju za CD16B, može biti obezbeđeno mestom za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za epitop CD16A koji sadrži aminokiselinske ostatke C-terminalne sekvence SFFPPGIK (SEQ ID NO:172) i/ili ostatke G130 i/ili I141 CD16A (SEQ ID NO:23)) koji nisu prisutni u CD16B.
[0019] "CD16B" se odnosi na receptor CD16B, takođe poznat kao FcγRIIIB, eksprimiran na neutrofilima i eozinofilima. Receptor je usidren za glikozilfosfatidil inozitol (GPI) i smatra se da ne pokreće bilo kakvu citotoksičnu aktivnost imunih ćelija pozitivnih na CD16B.
[0020] "NKp46" se odnosi na receptor koji aktivira citotoksičnost koji može doprineti povećanju efikasnosti aktiviranih ćelija prirodnih ubica (NK) da posreduju u lizi tumorskih ćelija. Takođe je poznat kao NCR1 ili CD335.
[0021] „NKG2D se odnosi na aktivirajući i kostimulatorni receptor uključen u imuno-nadzor nakon vezivanja za različite ćelijske ligande izazvane stresom prikazane na površini autolognih tumorskih ćelija i ćelija inficiranih virusom. Obezbeđuje i stimulatorne i kostimulatorne urođene imune odgovore na ćelije prirodne ubice (NK ), što dovodi do citotoksične aktivnosti. Deluje kao koštani receptor za T-ćelijski receptor (TCR) u adaptivnim imunim odgovorima posredovanim T-ćelijama pojačavanjem aktivacije T-ćelija. Stimuliše perforin posredovanu eliminaciju tumorskih ćelija koje eksprimiraju ligand. Poznat je i kao receptor sličan lektinu ćelija ubica K1, KLRK1 ili CD314.
[0022] Izraz "antigen površine ciljne ćelije" se odnosi na antigensku strukturu koju eksprimira ćelija i koja je prisutna na površini ćelije tako da je dostupna za konstrukt antitela kao što je ovde opisano. To može biti protein, poželjno ekstracelularni deo proteina, peptid koji je predstavljen na površini ćelije u kontekstu MHC (uključujući HLA-A2, HLA-A11, HLA-A24, HLA-B44, HLA-C4) ili struktura ugljenih hidrata, poželjno ugljenohidratna struktura proteina, kao što je glikoprotein. Poželjno je da tumor povezani ili tumor restriktivni antigen.
[0023] Termin "konstrukt bispecifičnog antitela" kako je definisan u kontekstu pronalaska takođe obuhvata multispecifične konstrukte antitela kao što su trispecifična antitela, pri čemu poslednji uključuju tri vezujuća domena, ili konstrukte koji imaju više od tri (npr. četiri, pet...) specifičnosti. Primeri za bi- ili multispecifične konstrukte antitela dati su npr. u WO 2006/125668, WO 2015/158636, WO 2017/064221, PCT/EP2019/056516, PCT/IB2019/ 053040 i Ellvanger et al. (Mabs. 2019. jul; 11(5):899-918).
[0024] Imajući u vidu da su konstrukti antitela kako su definisani u kontekstu pronalaska (barem) bispecifični, oni se ne javljaju prirodno i značajno se razlikuju od proizvoda koji se javljaju u prirodi. Konstrukt "bispecifičnog" antitela ili imunoglobulin je stoga veštačko hibridno antitelo ili imunoglobulin koji ima najmanje dve različite strane vezivanja sa različitim specifičnostima. Konstrukti bispecifičnih antitela mogu se proizvesti različitim metodama uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr. Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990.).).
[0025] Najmanje dva vezujuća domena i varijabilni domeni (VH/VL) konstrukta antitela iz ovog pronalaska mogu, ali ne moraju da sadrže peptidne linkere (spejser peptide). Termin "peptidni linker" obuhvata u skladu sa ovim pronalaskom aminokiselinsku sekvencu kojom su aminokiselinske sekvence jednog (varijabilnog i/ili vezujućeg) domena i drugog (varijabilnog i/ili vezujućeg) domena konstrukta antitela definisanog ovde međusobno povezani. Peptidni linkeri se takođe mogu koristiti za spajanje trećeg domena sa drugim domenima konstrukta antitela koji je ovde definisan. Suštinska tehnička karakteristika takvog peptidnog linkera je da ne sadrži nikakvu aktivnost polimerizacije.
[0026] Konstrukti antitela kao što su definisani u kontekstu pronalaska su poželjno "konstrukti antitela generisani in vitro". Ovaj termin se odnosi na konstrukt antitela prema gornjoj definiciji gde se ceo ili deo varijabilnog regiona (npr., najmanje jedan CDR) generiše u selekciji neimunih ćelija, na primer, in vitro prikaz faga, proteinski čip ili bilo koji drugi postupak u kome se sekvence kandidati mogu testirati u odnosu na njihovu sposobnost da se vežu za antigen. Ovaj termin stoga poželjno isključuje sekvence nastale isključivo genomskim preuređivanjem u imunoj ćeliji kod životinje. „Rekombinantno antitelo“ je antitelo napravljeno korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK ili genetskog inženjeringa.
[0027] Termin "monoklonsko antitelo" (mAb) ili konstrukt monoklonskog antitela kako se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi i/ili post-translacione modifikacije (npr. izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su protiv jedne antigenske strane ili determinante na antigenu, za razliku od konvencionalnih (poliklonskih) preparata antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (ili epitopa). Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela imaju prednost po tome što se sintetišu kulturom hibridoma, pa stoga nisu kontaminirana drugim imunoglobulinima. Modifikator "monoklonsko" ukazuje na karakter antitela kao dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba se tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom.
[0028] Za pripremu monoklonskih antitela, može se koristiti bilo koja tehnika koja obezbeđuje antitela proizvedena u kontinuiranim kulturama ćelijskih linija. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti mogu se napraviti hibridomskim postupkom koji je prvi put opisan od Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), ili može biti napravljen metodom rekombinantne DNK (videti, npr. U.S. Patent No.4,816,567). Primeri za dalje tehnike za proizvodnju humanih monoklonskih antitela uključuju trioma tehniku, tehniku hibridoma humanih B-ćelija (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) i tehniku EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).
[0029] Hibridomi se zatim mogu pregledati korišćenjem standardnih metoda, kao što su enzimski imunotest (ELISA) i rezonancija površinskog plazmona (BIACORE<™>) analize, za identifikaciju jednog ili više hibridoma koji proizvode antitelo koje se specifično vezuje za određeni antigen. Bilo koji oblik relevantnog antigena se može koristiti kao imunogen, npr., rekombinantni antigen, oblici koji se javljaju u prirodi, bilo koja njihova varijanta ili fragmenti, kao i njihov antigenski peptid. Rezonancija površinskog plazmona koja se koristi u sistemu BIAcore može se koristiti za povećanje efikasnosti antitela faga koja se vezuju za epitop površinskog antigena ciljne ćelije, (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Drugi primer postupka za pravljenje monoklonskih antitela uključuje skrining biblioteka ekspresije proteina, npr., prikaz faga ili biblioteka za prikaz ribozoma. Prikaz faga je opisan, na primer, u Ladner et al., U.S. Patent No.
5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991.) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991.).).
[0030] Pored upotrebe biblioteka za prikaz, relevantni antigen se može koristiti za imunizaciju životinja koje nisu ljudi, na primer, glodara (kao što su miš, hrčak, zec ili pacov). U jednom aspektu, životinja koja nije humana uključuje bar deo gena humanog imunoglobulina. Na primer, moguće je konstruisati sojeve miševa kojima nedostaje proizvodnja mišjih antitela sa velikim fragmentima lokusa humanog Ig (imunoglobulina). Koristeći hibridomsku tehnologiju, mogu se proizvesti i odabrati antigen-specifična monoklonska antitela izvedena iz gena sa željenom specifičnošću. Vidi, npr., XENOMOUSE<™>, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, i WO 96/33735.
[0031] Monoklonsko antitelo se takođe može dobiti od ne-humane životinje, a zatim biti modifikovano, npr., humanizovano, deimunizovano, pretvoreno u himerno itd., korišćenjem tehnika rekombinantne DNK poznate u tehnici. Primeri modifikovanih konstrukata antitela uključuju humanizovane varijante ne-humanih antitela, antitela „sazrela afinitetom“ (videti, npr. Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992.).) i Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991. )) i mutanti antitela sa izmenjenom (izmenjenim) efektorskom (efektorskim) funkcijom (funkcijama) (videti, npr. US Patent 5,648,260, Kontermann i Dubel (2010), loc. cit. i Little (2009), loc. cit).
[0032] U imunologiji, sazrevanje afiniteta je proces kojim B ćelije proizvode antitela sa povećanim afinitetom za antigen tokom imunog odgovora. Uz ponovljeno izlaganje istom antigenu, domaćin će proizvoditi antitela sukcesivno većeg afiniteta. Kao i prirodni prototip, in vitro sazrevanje afiniteta zasniva se na principima mutacije i selekcije. Sazrevanje afiniteta in vitro je uspešno korišćeno za optimizaciju antitela, konstrukta antitela i fragmenata antitela. Slučajne mutacije unutar CDR se uvode korišćenjem zračenja, hemijskih mutagena ili sa PCR sklonom greškama. Pored toga, genetska raznolikost se može povećati mešanjem lanca. Dva ili tri kruga mutacije i selekcije korišćenjem metoda prikaza kao što je prikaz faga obično rezultuju fragmentima antitela sa afinitetima u niskom nanomolarnom opsegu.
[0033] Poželjni tip supstitucionih varijacija aminokiselina konstrukata antitela uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultujuća varijanta (varijante) odabrane za dalji razvoj će imati poboljšana biološka svojstva u odnosu na roditeljsko antitelo iz kojeg su generisane. Pogodan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti uključuje sazrevanje afiniteta korišćenjem prikaza faga. Ukratko, nekoliko hipervarijabilnih strana regiona (npr.6-7 strana) su mutirane da bi se stvorile sve moguće supstitucije aminokiselina na svakoj strani. Ovako generisane varijante antitela su prikazane na monovalentan način od strane filamentoznih čestica faga kao fuzije sa proizvodom gena III M13 upakovanog unutar svake čestice. Varijante prikazane fagom se zatim pregledaju na njihovu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja) kao što je ovde otkriveno. Da bi se identifikovale kandidatske strane hipervarijabilnog regiona za modifikaciju, može se izvršiti mutageneza tehnikom skeniranja alanina da bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnog regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale kontaktne tačke između domena vezivanja i, na primer, antigena površine humane ciljne ćelije. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju u skladu sa tehnikama koje su ovde razrađene. Jednom kada se takve varijante generišu, panel varijanti se podvrgava skriningu kako je ovde opisano i antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više relevantnih testova mogu biti odabrana za dalji razvoj.
[0034] Monoklonska antitela i konstrukti antitela ovog pronalaska posebno uključuju "himerna" antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca (lanaca) identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (U.S. Patent No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 81 : 6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde obuhvataju "primatizovana" antitela koja sadrže sekvence za vezivanje antigena varijabilnog domena izvedene iz ne-humanog primata (npr. majmun iz starog sveta, majmun itd.) i sekvence humanog konstantnog regiona. Opisani su različiti pristupi za pravljenje himernih antitela. Videti npr. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.
81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., U.S. Patent No.4,816,567; Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494; i GB 2177096.
[0035] Antitelo, konstrukt antitela, fragment antitela ili varijanta antitela takođe mogu biti modifikovani specifičnim brisanjem epitopa humanih T ćelija (postupak koji se naziva "deimunizacija") postupcima otkrivenim na primer u WO 98/52976 ili WO 00/34317. Ukratko, varijabilni domeni teškog i lakog lanca antitela mogu se analizirati na peptide koji se vezuju za MHC klase II; ovi peptidi predstavljaju potencijalne epitope T ćelija (kao što je definisano u WO 98/52976 i WO 00/34317). Za detekciju potencijalnih epitopa T ćelija, može se primeniti pristup kompjuterskog modeliranja koji se naziva "peptidne niti", a pored toga, baza podataka o peptidima koji se vezuju za MHC klase II može se pretražiti za motive prisutne u VH i VL sekvencama, kao što je opisano u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ovi motivi se vezuju za bilo koji od 18 glavnih alotipova MHC klase II DR, i tako čine potencijalne epitope T ćelija. Otkriveni potencijalni epitopi T ćelija mogu se eliminisati supstitucijom malog broja aminokiselinskih ostataka u varijabilnim domenima, ili poželjno, supstitucijama jedne aminokiseline. Obično se vrše konzervativne zamene. Često, ali ne isključivo, može se koristiti aminokiselina koja je zajednička za poziciju u sekvencama humanih germinativnih antitela. Sekvence humane klicine linije su otkrivene npr. u Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol.
227:776-798; Kuk, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol.16 (5): 237-242; i Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638. V BASE direktorijum pruža sveobuhvatan direktorijum sekvenci varijabilnog regiona humanog imunoglobulina (sastavljen od Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)). Ove sekvence se mogu koristiti kao izvor humane sekvence, na primer, za okvirne regione i CDR. Konsenzusni regioni humanog okvira se takođe mogu koristiti, na primer kako je opisano u US Patent No.6,300,064.
[0036] „Humanizovana“ antitela, konstrukti antitela, njihove varijante ili fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2ili druge podsekvence antitela koji se vezuju za antigen) su antitela ili imunoglobulini uglavnom humanih sekvenci, koje sadrže (a) minimalnu sekvencu(e) izvedenu iz nehumanog imunoglobulina. Uglavnom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona (takođe CDR) primaoca zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona nehumane (npr. glodara) vrste (donorsko antitelo ) kao što su miš, pacov, hrčak ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima. Dodatno, "humanizovana antitela" kako se ovde koriste mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaoca ni u antitelu donora. Ove modifikacije su napravljene da bi se dodatno poboljšao i optimizovao učinak antitela. Humanizovano antitelo takođe može da sadrži bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj humanog imunoglobulina. Za više detalja, videti Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988.); i Presta, Curr. Op. Structure. Biol., 2: 593-596 (1992).).
[0037] Humanizovana antitela ili njihovi fragmenti mogu se generisati zamenom sekvenci Fv varijabilnog domena koje nisu direktno uključene u vezivanje antigena sa ekvivalentnim sekvencama iz humanih Fv varijabilnih domena. Primeri postupaka za generisanje humanizovanih antitela ili njihovih fragmenata su obezbeđeni od strane Morrison (1985) Science 229:1202-1207; od strane Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; i po US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205; i US 6,407,213. Ove metode uključuju izolovanje, manipulaciju i ekspresiju sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju sve ili deo varijabilnih domena imunoglobulina Fv iz najmanje jednog teškog ili lakog lanca. Takve nukleinske kiseline se mogu dobiti iz hibridoma koji proizvodi antitelo protiv unapred određene mete, kao što je prethodno opisano, kao i iz drugih izvora. Rekombinantna DNK koja kodira molekul humanizovanog antitela može se zatim klonirati u odgovarajući ekspresioni vektor.
[0038] Humanizovana antitela se takođe mogu proizvesti korišćenjem transgenih životinja kao što su miševi koji eksprimiraju gene za humane teške i lake lance, ali nisu u stanju da eksprimiraju endogene gene teškog i lakog lanca imunoglobulina miša. Winter opisuje primer metode CDR graftovanja koja se može koristiti za pripremu humanizovanih antitela opisanih ovde (U.S. Patent No.5,225,539). Svi CDR određenog humanog antitela mogu biti zamenjeni sa najmanje delom ne-humanog CDR, ili samo neki CDR mogu biti zamenjeni ne-humanim CDR. Potrebno je samo zameniti broj CDR potrebnih za vezivanje humanizovanog antitela za unapred određeni antigen.
[0039] Humanizovano antitelo može biti optimizovano uvođenjem konzervativnih supstitucija, konsenzusnih supstitucija sekvenci, supstitucija klicine linije i/ili povratnih mutacija. Takvi izmenjeni molekuli imunoglobulina mogu se napraviti bilo kojom od nekoliko tehnika poznatih u tehnici (npr. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzimol., 92: 3-16, 1982, i EP 239 400).
[0040] Izraz "humano antitelo", "konstrukt humanog antitela" i "humani domen za vezivanje " obuhvata antitela, konstrukte antitela i vezujuće domene koji imaju regione antitela kao što su varijabilni i konstantni regioni ili domeni koji u suštini odgovaraju sekvencama klicine linije humanog imunoglobulina poznatim u tehnici, uključujući, na primer, one koje su opisali Kabat et al. (1991) (loc. cit.). Humana antitela, konstrukti antitela ili vezujući domeni kako je definisano u kontekstu pronalaska mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane klicine linije (npr. mutacije uvedene nasumičnom ili bočno specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo) , na primer u CDR, a posebno u CDR3. Humana antitela, konstrukti antitela ili vezujući domeni mogu imati najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili više položaja zamenjenih aminokiselinskim ostatkom koji nije kodiran sekvencom imunoglobulina humane klicine linije. Međutim, definicija humanih antitela, konstrukcija antitela i vezujućih domena, kako se ovde koristi, takođe podrazumeva „potpuno humana antitela“, koja uključuju samo ne-veštački i/ili genetski izmenjene humane sekvence antitela koje se mogu izvesti korišćenjem tehnologija ili sistema. kao što je Xenomaus. Poželjno, "potpuno humano antitelo" ne uključuje aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama humanog imunoglobulina klicine linije.
[0041] U nekim primerima izvođenja, konstrukti antitela definisani ovde su "izolovani" ili "suštinski čisti" konstrukti antitela. "Izolovani" ili "suštinski čisti", kada se koriste za opisivanje konstrukta antitela koji su ovde otkriveni, označava konstrukt antitela koji je identifikovan, odvojen i/ili izvučen iz komponente svog proizvodnog okruženja. Poželjno, konstrukt antitela je slobodan ili suštinski slobodan od svih drugih komponenti iz njegovog proizvodnog okruženja. Zagađujuće komponente njegovog proizvodnog okruženja, kao što su one koje su rezultat rekombinantnih transfektovanih ćelija, su materijali koji bi tipično ometali dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu polipeptida, i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. Konstrukti antitela mogu, na primer, da čine najmanje oko 5%, ili najmanje oko 50% po masi ukupnog proteina u datom uzorku. Podrazumeva se da izolovani protein može da čini od 5% do 99.9% masenog udela ukupnog sadržaja proteina, u zavisnosti od okolnosti. Polipeptid se može napraviti u značajno višoj koncentraciji upotrebom inducibilnog promotera ili promotera visoke ekspresije, tako da se pravi pri povećanim nivoima koncentracije. Definicija uključuje proizvodnju konstrukta antitela u širokom spektru organizama i/ili ćelija domaćina koji su poznati u tehnici. U poželjnim izvođenjima, konstrukt antitela će biti prečišćen (1) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence korišćenjem sekvencera sa rotirajućim čašama, ili (2) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod neredukujućim ili redukujućim uslovima korišćenjem Coomassie plave ili, poželjno, srebrne boje. Obično, međutim, izolovani konstrukt antitela biće pripremljen najmanje jednim korakom prečišćavanja.
[0042] Termin "vezujući domen" karakteriše u vezi sa ovim pronalaskom domen koji se (specifično) vezuje za / interaguje sa / prepoznaje dati ciljni epitop ili datu ciljnu stranu na ciljnim molekulima (antigenima), npr. antigen receptora NK ćelija, npr. CD16, i antigen površine ciljne ćelije, respektivno. Struktura i funkcija prvog vezujućeg domena (prepoznavanje npr. CD16), i poželjno takođe struktura i/ili funkcija drugog vezujućeg domena (prepoznavanje antigena površine ciljne ćelije), zasnivaju se na strukturi i/ili funkciji antitela, npr. molekula imunoglobulina pune dužine ili celog molekula imunoglobulina i/ili su izvučeni iz domena varijabilnog teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog lakog lanca (VL) antitela ili njegovog fragmenta. Prvi vezujući domen karakteriše prisustvo tri CDR laka lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i tri CDR teška lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona). Drugi vezujući domen poželjno takođe sadrži minimalne strukturne zahteve antitela koji omogućavaju ciljno vezivanje. Još poželjnije, drugi vezujući domen sadrži najmanje tri CDR laka lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR teška lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona). Predviđeno je da se prvi i/ili drugi vezujući domen proizvede ili se može dobiti pomoću prikaza faga ili postupka skrininga biblioteke pre nego graftovanjem CDR sekvenci iz prethodno postojećeg (monoklonskog) antitela u potporni deo.
[0043] Prema ovom pronalasku, vezujući domeni su u obliku jednog ili više polipeptida. Takvi polipeptidi mogu uključivati proteinske delove i neproteinske delove (npr. hemijske linkere ili hemijske agense za unakrsno vezivanje kao što je glutaraldehid). Proteini (uključujući njihove fragmente, poželjno biološki aktivne fragmente, i peptide, koji obično imaju manje od 30 aminokiselina) sadrže dve ili više aminokiselina međusobno povezanih preko kovalentne peptidne veze (koja rezultuje lancem aminokiselina).
[0044] Termin "polipeptid" kako se ovde koristi opisuje grupu molekula, koja se obično sastoji od više od 30 amino kiselina. Polipeptidi mogu dalje da formiraju multimere kao što su dimeri, trimeri i viši oligomeri, tj. koji se sastoje od više od jednog polipeptidnog molekula. Molekuli polipeptida koji formiraju takve dimere, trimere itd. mogu biti identični ili neidentični. Odgovarajuće strukture višeg reda takvih multimera se, prema tome, nazivaju homo- ili heterodimeri, homo- ili heterotrimeri itd. Primer za heteromultimer je molekul antitela, koji se, u svom prirodnom obliku, sastoji od dva identična laka polipeptidna lanca i dva identična teška polipeptidna lanca. Izrazi "peptid", "polipeptid" i "protein" se takođe odnose na prirodno modifikovane peptide/polipeptide/proteine gde je modifikacija pogođena npr. posttranslacionim modifikacijama kao što su glikozilacija, acetilacija, fosforilacija i slično. "Peptid", "polipeptid" ili "protein" kada se ovde pominje može takođe biti hemijski modifikovan kao što je pegilovanje. Takve modifikacije su dobro poznate u tehnici i opisane su u nastavku.
[0045] Poželjno, vezujući domen koji se vezuje za antigen receptora NK ćelija, npr. CD16 i/ili vezujući domen koji se vezuje za antigen površine ciljne ćelije je/su humani vezujući domeni. Antitela i konstrukti antitela koji sadrže najmanje jedan humani domen za vezivanje izbegavaju neke od problema povezanih sa antitelima ili konstruktima antitela koji poseduju varijabilne i/ili konstantne regione koji nisu humani, kao što su glodari (npr. miš, pacov, hrčak ili zec). Prisustvo takvih proteina dobijenih od glodara može dovesti do brzog uklanjanja antitela ili konstrukta antitela ili može dovesti do stvaranja imunog odgovora na antitelo ili konstrukt antitela kod pacijenta. Da bi se izbegla upotreba antitela ili konstrukcija antitela dobijenih od glodara, humana ili potpuno humana antitela/konstrukti antitela mogu se generisati uvođenjem funkcije humanog antitela u glodara tako da glodar proizvodi potpuno humana antitela.
[0046] Sposobnost kloniranja i rekonstrukcije ljudskih lokusa veličine megabaze u YAC i njihovog uvođenja u klicinu liniju miša pruža moćan pristup razjašnjavanju funkcionalnih komponenti veoma velikih ili grubo mapiranih lokusa, kao i generisanju korisnih modela humanih bolesti. Dodatno, upotreba takve tehnologije za supstituciju mišjih lokusa sa njihovim humanim ekvivalentima mogla bi da pruži jedinstven uvid u ekspresiju i regulaciju proizvoda humanih gena tokom razvoja, njihovu komunikaciju sa drugim sistemima i njihovo učešće u indukciji i progresiji bolesti.
[0047] Važna praktična primena takve strategije je "humanizacija" humoralnog imunog sistema miša. Uvođenje lokusa humanog imunoglobulina (Ig) u miševe kod kojih su endogeni Ig geni inaktivirani pruža mogućnost proučavanja mehanizama koji su u osnovi programirane ekspresije i sklapanja antitela, kao i njihove uloge u razvoju B-ćelija. Dodatno, takva strategija bi mogla da obezbedi idealan izvor za proizvodnju potpuno humanih monoklonskih antitela (mAbs) – važna prekretnica ka ispunjenju obećanja o terapiji antitelima kod ljudskih bolesti. Očekuje se da će potpuno humana antitela ili konstrukti antitela minimizirati imunogene i alergijske odgovore svojstvene mišjim ili mAbs izvedenim iz miša i na taj način povećati efikasnost i bezbednost primenjenih antitela/konstrukta antitela. Može se očekivati da će upotreba potpuno humanih antitela ili konstrukta antitela obezbediti značajnu prednost u lečenju hroničnih i ponavljajućih ljudskih bolesti, kao što su zapaljenje, autoimunost i kancer, koji zahtevaju ponovljene primene jedinjenja.
[0048] Jedan pristup ka ovom cilju bio je da se konstruišu sojevi miša sa nedostatkom proizvodnje mišjih antitela sa velikim fragmentima humanih Ig lokusa u očekivanju da će takvi miševi proizvesti veliki repertoar humanih antitela u odsustvu mišjih antitela. Veliki humani Ig fragmenti bi očuvali veliki diverzitet varijabilnih gena, kao i pravilnu regulaciju proizvodnje i ekspresije antitela. Iskorišćavanjem mašinerije miša za diversifikaciju i selekciju antitela i nedostatak imunološke tolerancije na humane proteine, reprodukovani repertoar humanih antitela u ovim sojevima miševa treba da proizvede antitela visokog afiniteta protiv bilo kog antigena od interesa, uključujući i humane antigene. Koristeći hibridomsku tehnologiju, mogu se lako proizvesti i odabrati antigen-specifična humana mAb sa željenom specifičnošću. Ova opšta strategija je demonstrirana u vezi sa stvaranjem prvih sojeva miša XsenoMouse (videti Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Sojevi XsenoMouse su konstruisani sa veštačkim hromozomima kvasca (YAC) koji sadrže fragmente konfiguracije klicine linije veličine 245 kb i 190 kb lokusa humanog teškog lanca i lokusa kapa lakog lanca, koji su sadržali sekvence varijabilnog i konstantnog regiona jezgra. Pokazalo se da su YAC koji sadrže humani Ig kompatibilni sa mišjim sistemom i za preuređivanje i za ekspresiju antitela i bili su sposobni da zamene inaktivirane mišje Ig gene. Ovo je pokazano njihovom sposobnošću da indukuju razvoj B ćelija, da proizvedu humani repertoar potpuno humanih antitela sličnih adultnim i da generišu antigen-specifična humana mAb. Ovi rezultati takođe sugerišu da bi uvođenje većih delova humanih Ig lokusa koji sadrže veći broj V gena, dodatnih regulatornih elemenata i konstantnih regiona humanog Ig moglo da rekapitulira u suštini pun repertoar koji je karakterističan za humani humoralni odgovor na infekciju i imunizaciju. Rad Green et al. je nedavno proširen na uvođenje više od približno 80% repertoara humanih antitela kroz uvođenje YAC fragmenata konfiguracije klicine linije veličine megabaze lokusa humanog teškog lanca i lokusa kapa lakog lanca, respektivno. Videti Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i U.S. patent application Ser. No.08/759,620.
[0049] O proizvodnji miševa XsenoMouse se dalje govori i opisuje u U.S. patent applications Ser. No.07/466,008, Ser. No.07/610,515, Ser. No.07/919,297, Ser. No.07/922,649, Ser. No.
08/031,801, Ser. No. 08/1 12,848, Ser. No. 08/234,145, Ser. No. 08/376,279, Ser. No.
08/430,938, Ser. No. 08/464,584, Ser. No. 08/464,582, Ser. No. 08/463,191, Ser. No.
08/462,837, Ser. No. 08/486,853, Ser. No. 08/486,857, Ser. No. 08/486,859, Ser. No.
08/462,513, Ser. No.08/724,752, i Ser. No.08/759,620; i U.S. Pat. Nos.6,162,963; 6,150,584; 6,1 14,598; 6,075,181, i 5,939,598 i Japanese Patent Nos. 3068 180 B2, 3068 506 B2, i 3068 507 B2. Takođe videti Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998.).), EP 0 463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310, i WO 03/47336.
[0050] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc., koristili su „minilokusni“ pristup. U minilokusnom pristupu, egzogeni Ig lokus se oponaša kroz uključivanje delova (individualnih gena) iz Ig lokusa. Dakle, jedan ili više VH gena, jedan ili više DH gena, jedan ili više JH gena, mu konstantni region i drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) se formiraju u konstrukt za umetanje u životinju. Ovaj pristup je opisan u U.S. Pat. No. 5,545,807 Surani et al. i U.S. Pat. Nos. 5,545,806; 5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 5,770,429; 5,789,650; 5,814,318; 5,877,397; 5,874,299; i 6,255,458 svaki od Lonberg and Kay, U.S. Pat. Nos. 5,591,669 i 6,023.010 u Krimpenfort i Berns, U.S. Pat. Nos.5,612,205; 5,721,367; i 5,789,215 to Berns et al., i U.S. Pat. No.5,643,763 od Choi and Dunn, i GenPharm International U.S. patent application Ser. No. 07/574,748, Ser. No.
07/575,962, Ser. No. 07/810,279, Ser. No. 07/853,408, Ser. No. 07/904,068, Ser. No.
07/990,860, Ser. No. 08/053,131, Ser. No. 08/096,762, Ser. No. 08/155,301, Ser. No.
08/161,739, Ser. No. 08/165,699, Ser. No. 08/209,741. Takođe videti EP 0 546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884 i U.S. Pat. No.5,981,175. Videti dalje Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994), i Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).
[0051] Kirin je takođe pokazao stvaranje ljudskih antitela od miševa u koje su, fuzijom mikroćelija, uvedeni veliki delovi hromozoma ili celi hromozomi. Videt’i European Patent Application Nos.773 288 i 843961. Xsenerex Biosciences razvija tehnologiju za potencijalno stvaranje humanih antitela. U ovoj tehnologiji, SCID miševi se rekonstituišu sa ljudskim limfnim ćelijama, na primer, B i/ili T ćelijama.
[0052] Miševi se zatim imunizuju antigenom i mogu stvoriti imuni odgovor protiv antigena. Videti U.S. Pat. Nos.5,476,996; 5,698,767; i 5,958,765.
[0053] Odgovori na humana anti-mišja antitela (HAMA) naveli su industriju da pripremi himerna ili na drugi način humanizovana antitela. Međutim, očekuje se da će se primetiti određeni odgovori humanih antihimernih antitela (HACA), posebno kod hronične upotrebe antitela ili upotrebe više doza. Prema tome, bilo bi poželjno da se obezbede konstrukti antitela koji sadrže humani vezujući domen protiv antigena površine ciljne ćelije i humani vezujući domen protiv CD16 da bi se poništio rizik i/ili efekti HAMA ili HACA odgovora.
[0054] Izrazi „(posebno) se vezuje za“, (posebno) prepoznaje“, „je (posebno) usmereno na“ i „(posebno) reaguje sa“ znače u skladu sa ovim pronalaskom da vezujući domen interaguje ili specifično reaguje sa datim epitopa ili date ciljne strane na ciljnim molekulima (antigeni), ovde: receptor NK ćelije, npr. CD16a, i antigen ciljne ćelije, respektivno.
[0055] Termin "epitop" se odnosi na stranu na antigenu za koju se vezujući domen, kao što je antitelo ili imunoglobulin, ili derivat, fragment ili varijanta antitela ili imunoglobulina, specifično vezuje. "Epitop" je antigen i stoga se termin epitop ponekad ovde naziva i "antigenska struktura" ili "antigenska determinanta". Dakle, domen vezivanja je "strana interakcije antigena". Navedeno vezivanje/interakcija se takođe podrazumeva da definiše "specifično prepoznavanje".
[0056] "Epitopi" mogu da se formiraju i od susednih aminokiselina ili od nesusednih aminokiselina dovedenih međusobno susedno tercijarnim savijanjem proteina. "Linearni epitop" je epitop gde primarna sekvenca aminokiselina sadrži prepoznati epitop. Linearni epitop tipično uključuje najmanje 3 ili najmanje 4, a češće, najmanje 5 ili najmanje 6 ili najmanje 7, na primer, oko 8 do oko 10 aminokiselina u jedinstvenoj sekvenci.
[0057] "Konformacioni epitop", za razliku od linearnog epitopa, je epitop u kome primarna sekvenca aminokiselina koja sadrži epitop nije jedina definišuća komponenta epitopa koji je prepoznat (npr. epitop u kome je primarna sekvenca aminokiselina nije neophodno prepoznati domenom za vezivanje). Tipično, konformacioni epitop sadrži povećan broj aminokiselina u odnosu na linearni epitop. Što se tiče prepoznavanja konformacionih epitopa, domen vezivanja prepoznaje trodimenzionalnu strukturu antigena, poželjno peptid ili protein ili njihov fragment (u kontekstu ovog pronalaska, antigenska struktura za jedan od domena vezivanja je sadržana unutar proteina površinskog antigena ciljne ćelije). Na primer, kada se proteinski molekul savije da bi formirao trodimenzionalnu strukturu, određene aminokiseline i/ili polipeptidna okosnica koji formiraju konformacioni epitop postaju susedni, omogućavajući antitelu da prepozna epitop. Metode određivanja konformacije epitopa uključuju, ali nisu ograničene na, rendgensku kristalografiju, dvodimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu (2D-NMR) spektroskopiju i centrifugirano obeležavanje mesta i spektroskopiju elektronske paramagnetne rezonance (EPR).
[0058] Interakcija između domena vezivanja i epitopa ili regiona koji sadrži epitop implicira da domen vezivanja pokazuje značajan afinitet za epitop / region koji sadrži epitop na određeni protein ili antigen (ovde: receptor NK ćelije, npr. CD16a, i ciljni površinski antigen ćelije, respektivno) i, generalno, ne pokazuje značajnu reaktivnost sa proteinima ili antigenima koji nisu receptori NK ćelije, npr. CD16a i antigen površine ciljne ćelije. "Primetan afinitet" uključuje vezivanje sa afinitetom od oko 106 M (KD) ili jačim. Poželjno, vezivanje se smatra specifičnim kada je afinitet vezivanja oko 10-12 do 10-8 M, 10-12 do 10-9 M, 10-12 do 10-10 M, 10-11 do 10-8 M, poželjno od oko 10-11 do 10-9 M. Da li domen vezivanja specifično reaguje ili se vezuje za metu može se lako testirati, između ostalog, upoređivanjem reakcije pomenutog vezujućeg domena sa ciljnim proteinom ili antigenom sa reakcijom pomenutog vezivanja domen sa proteinima ili antigenima koji nisu receptor NK ćelija, npr. CD16a i antigen površine ciljne ćelije. Poželjno, vezujući domen kao što je definisan u kontekstu pronalaska ne vezuje se suštinski ili suštinski za proteine ili antigene osim za receptor NK ćelije, npr. CD16a, i antigen površine ciljne ćelije (tj., prvi vezujući domen nije sposoban da se veže za proteine osim za NK ćelijski receptor, npr. CD16a, a drugi vezujući domen nije sposoban da se veže za proteine koji nisu antigen površine ciljne ćelije).
[0059] Izraz "ne vezuje se suštinski / u značajnom stepenu" ili "nije sposoban da se vezuje" znači da vezujući domen ovog pronalaska ne vezuje protein ili antigen osim receptora NK ćelije, npr. CD16a, i antigen površine ciljne ćelije, tj., ne pokazuje reaktivnost veću od 30%, poželjno ne više od 20%, poželjnije ne više od 10%, posebno poželjno ne više od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% sa proteinima ili antigenima koji nisu receptori NK ćelija, npr. CD16a, i antigen površine ciljne ćelije, pri čemu se vezuje za NK ćelijski receptor, npr. CD16a, a ciljni površinski antigen ćelije, respektivno, postavljen je na 100%.
[0060] Veruje se da na specifično vezivanje utiču specifični motivi u aminokiselinskoj sekvenci domena vezivanja i antigena. Tako se vezivanje postiže kao rezultat njihove primarne, sekundarne i/ili tercijarne strukture, kao i kao rezultat sekundarnih modifikacija navedenih struktura. Specifična interakcija strane interakcije antigena sa njenim specifičnim antigenom može dovesti do jednostavnog vezivanja pomenute strane za antigen. Dodatno, specifična interakcija strane interakcije antigena sa njenim specifičnim antigenom može alternativno ili dodatno rezultovati inicijacijom signala, npr. usled indukcije promene konformacije antigena, oligomerizacije antigena itd.
[0061] Termin "varijabilna" se odnosi na delove antitela ili domena imunoglobulina koji pokazuju varijabilnost u svojoj sekvenci i koji su uključeni u određivanje specifičnosti i afiniteta vezivanja određenog antitela (tj. "varijabilni domen(i)"). Uparivanje varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) zajedno formira jednu stranu koja se vezuje za antigen.
[0062] Varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz varijabilne domene antitela; koncentrisana je u pod-domenima svakog od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca. Ovi poddomeni se nazivaju "hipervarijabilni regioni" ili "regioni koji određuju komplementarnost" (CDR). Očuvaniji (tj., ne-hipervarijabilni) delovi varijabilnih domena nazivaju se „okvirnim“ regionima (FRM ili FR) i obezbeđuju potporu za šest CDR-ova u trodimenzionalnom prostoru da formiraju površinu koja se vezuje za antigen. Svaki od varijabilnih domena teških i lakih lanaca koji se javljaju u prirodi obuhvata četiri FRM regiona (FR1, FR2, FR3 i FR4), koji u velikoj meri usvajaju konfiguraciju β-listova, povezanih sa tri hipervarijabilna regiona, koji formiraju petlje koje se povezuju, a u nekim slučajevima i formiraju deo strukture β-nabrane ploče. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini pomoću FRM i, sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose formiranju strane koja se vezuje za antigen (videti Kabat et al., loc. cit.).
[0063] Izrazi "CDR" i njegova množina "CDR" odnose se na region koji određuje komplementarnost od kojih tri čine karakter vezivanja varijabilnog regiona lakog lanca (CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3) i tri čine karakter vezivanja varijabilnog regiona teškog lanca (CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3). CDR sadrže većinu ostataka odgovornih za specifične interakcije antitela sa antigenom i stoga doprinose funkcionalnoj aktivnosti molekula antitela: oni su glavne determinante specifičnosti antigena.
[0064] Tačne definicije CDR granica i dužine podležu različitim sistemima klasifikacije i numerisanja. Na CDR se stoga može pozivati preko Kabat, Chothia, kontakt ili bilo koje druge definicije granica, uključujući ovde opisani sistem numerisanja. Uprkos različitim granicama, svaki od ovih sistema ima određeni stepen preklapanja u onome što čini takozvane „hipervarijabilne regione“ unutar varijabilnih sekvenci. CDR definicije prema ovim sistemima se stoga mogu razlikovati po dužini i graničnim oblastima u odnosu na susedni okvirni region. Videti na primer Kabat (pristup zasnovan na varijabilnosti sekvenci među vrstama), Chothia (pristup zasnovan na kristalografskim studijama kompleksa antigen-antitelo) i/ili MacCallum (Kabat et al., loc. cit; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; i MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Još jedan standard za karakterizaciju strane vezivanja antigena je definicija AbM koju koristi softver za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. Videti, npr. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). U meri u kojoj dve tehnike identifikacije ostataka definišu regione preklapanja, ali ne i identične regione, oni se mogu kombinovati da bi se definisao hibridni CDR. Međutim, preferira se numerisanje u skladu sa takozvanim Kabat sistemom.
[0065] Tipično, CDR formiraju strukturu petlje koja se može klasifikovati kao kanonska struktura. Termin "kanonska struktura" odnosi se na konformaciju glavnog lanca koju usvajaju petlje za vezivanje antigena (CDR). Iz uporednih strukturnih studija, otkriveno je da pet od šest petlji za vezivanje antigena imaju samo ograničen repertoar dostupnih konformacija. Svaka kanonska struktura se može okarakterisati uglovima torzije polipeptidne kičme. Odgovarajuće petlje između antitela mogu, prema tome, imati veoma slične trodimenzionalne strukture, uprkos velikoj varijabilnosti sekvence aminokiselina u većini delova petlji (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Dodatno, postoji veza između usvojene strukture petlje i aminokiselinskih sekvenci koje je okružuju. Konformacija određene kanonske klase određena je dužinom petlje i aminokiselinskim ostacima koji se nalaze na ključnim pozicijama unutar petlje, kao i unutar očuvanog okvira (tj. izvan petlje). Dodeljivanje određenoj kanonskoj klasi se stoga može izvršiti na osnovu prisustva ovih ključnih aminokiselinskih ostataka.
[0066] Termin "kanonska struktura" takođe može uključiti razmatranje linearne sekvence antitela, na primer, kako je katalogizirao Kabat (Kabat et al., loc. cit.). Kabat šema (sistem) numerisanja je široko prihvaćen standard za numerisanje aminokiselinskih ostataka varijabilnog domena antitela na konzistentan način i poželjna je šema primenjena u ovom pronalasku kao što je takođe pomenuto ovde na drugim mestima. Dodatna strukturna razmatranja se takođe mogu koristiti za određivanje kanonske strukture antitela. Na primer, te razlike koje se u potpunosti ne odražavaju u Kabat numerisanju mogu se opisati numeracionim sistemom Chothia et al. i/ili biti otkrivene drugim tehnikama, na primer, kristalografijom i dvoili trodimenzionalnim računarskim modeliranjem. Shodno tome, data sekvenca antitela može biti stavljena u kanonsku klasu koja omogućava, između ostalog, identifikaciju odgovarajućih sekvenci šasije (npr. na osnovu želje da se u biblioteku uključe različite kanonske strukture). Kabat numerisanje aminokiselinskih sekvenci antitela i strukturna razmatranja kako su opisali Chothia et al., loc. cit. i njihove implikacije za konstruisanje kanonskih aspekata strukture antitela, opisane su u literaturi. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate u tehnici. Za pregled strukture antitela, videti Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988. Globalna referenca u imunoinformatici je baza podataka trodimenzionalne (3D) strukture IMGT (međunarodni informacioni sistem ImMunoGenetics) (Ehrenmann et al., 2010, Nucleic Acids Res., 38, D301-307). Strukturni podaci IMGT/3Dstructure-DB su ekstrahovani iz Protein Data Bank (PDB) i označeni u skladu sa IMGT konceptima klasifikacije, koristeći interne alate. Dakle, IMGT/3Dstructure-DB obezbeđuje najbliže gene i alele koji su eksprimirani u sekvencama aminokiselina 3D struktura, usklađivanjem ovih sekvenci sa referentnim direktorijumom IMGT domena. Ovaj direktorijum sadrži, za receptore antigena, aminokiselinske sekvence domena kodiranih konstantnim genima i translaciju varijablnih i spojnih gena klicine linije. CDR regioni naših aminokiselinskih sekvenci poželjno su određeni korišćenjem baze podataka IMGT/3Dstructure.
[0067] CDR3 lakog lanca i, posebno, CDR3 teškog lanca mogu predstavljati najvažnije determinante u vezivanju antigena unutar varijabilnih regiona lakog i teškog lanca. U nekim konstruktima antitela, CDR3 teškog lanca čini se da predstavlja glavnu oblast kontakta između antigena i antitela. Šeme in vitro selekcije u kojima se menja sam CDR3 mogu se koristiti za variranje svojstava vezivanja antitela ili određivanje koji ostaci doprinose vezivanju antigena. Dakle, CDR3 je tipično najveći izvor molekularne raznovrsnosti unutar strane koja se vezuje za antitelo. H3, na primer, može biti kratak tako da se sastoji od dva aminokiselinska ostatka ili veći od 26 aminokiselina.
[0068] U klasičnom antitelu ili imunoglobulinu pune dužine, svaki laki (L) lanac je vezan za težak (H) lanac jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca povezana jedan sa drugim jednom ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. CH domen koji je najbliži VH obično se označava kao CH1. Konstantni ("C") domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što su citotoksičnost zavisna od antitela, ćelijski posredovana citotoksičnost i aktivacija komplementa. Fc region antitela se nalazi unutar konstantnih domena teškog lanca i može na primer da stupi u interakciju sa Fc receptorima koji se nalaze na površini ćelije.
[0069] Sekvenca gena za antitela nakon sklapanja i somatske mutacije je veoma raznolika, a procenjuje se da ovi različiti geni kodiraju 10<10>različitih molekula antitela (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Shodno tome, imuni sistem obezbeđuje repertoar imunoglobulina. Termin "repertoar" se odnosi na najmanje jednu nukleotidnu sekvencu izvedenu u potpunosti ili delimično iz najmanje jedne sekvence koja kodira najmanje jedan imunoglobulin. Sekvenca(e) mogu biti generisane preraspoređivanjem in vivo V, D i J segmenata teških lanaca i V i J segmenata lakih lanaca. Alternativno, sekvenca(e) se može generisati iz ćelije kao odgovor na koji dolazi do preuređivanja, na primer, in vitro stimulacija. Alternativno, deo ili cela sekvenca(e) se mogu dobiti spajanjem DNK, sintezom nukleotida, mutagenezom i drugim metodama, vidi npr. U.S. Patent 5,565,332. Repertoar može uključivati samo jednu sekvencu ili može uključivati više sekvenci, uključujući one u genetski raznolikoj kolekciji.
[0070] Konstrukt antitela definisan u kontekstu pronalaska može takođe da sadrži dodatne domene, koji su npr. pomažu u izolaciji molekula ili se odnose na prilagođeni farmakokinetički profil molekula. Domeni korisni za izolaciju konstrukta antitela mogu biti izabrani između peptidnih motiva ili sekundarno uvedenih delova, koji se mogu uhvatiti metodom izolacije, npr. izolacioni stub. Neograničavajuća ostvarenja takvih dodatnih domena obuhvataju peptidne motive poznate kao Mic-tag, HAT-tag, HA-tag, TAP-tag, GST-tag, hitin vezujući domen (CBD-tag), protein koji vezuje maltozu (MBP-tag) , Flag-tag, Strep-tag i njihove varijante (npr. Strepll-tag) i His-tag. Svi ovde otkriveni konstrukti antitela koje karakterišu identifikovani CDR-ovi mogu sadržati His-tag domen, koji je generalno poznat kao ponavljanje uzastopnih His ostataka u aminokiselinskoj sekvenci molekula, poželjno od pet, a poželjnije od šest His ostataka (heksa-histidin). His-tag može biti lociran npr. na N- ili C-kraju konstrukta antitela, poželjno je da se nalazi na C-kraju. Najpoželjnije, heksa-histidinski tag (HHHHHH) (SEQ ID NO:25) je povezan preko peptidne veze za C-terminus konstrukta antitela prema pronalasku. Dodatno, konjugovani sistem PLGA-PEG-PLGA može da se kombinuje sa poli-histidinskim tagom za primenu sa produženim oslobađanjem i poboljšani farmakokinetički profil.
[0071] Modifikacije aminokiselinske sekvence ovde opisanih konstrukata antitela su takođe razmatrane. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva konstrukta antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci konstrukata antitela se pripremaju uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u nukleinsku kiselinu konstrukta antitela, ili sintezom peptida. Sve dole opisane modifikacije sekvence aminokiselina treba da dovedu do konstrukta antitela koji i dalje zadržava željenu biološku aktivnost (vezivanje za NK ćelijski receptor, npr. CD16a, i antigen ciljne ćelijske površine) nemodifikovanog roditeljskog molekula.
[0072] Izraz "aminokiselina" ili "aminokiselinski ostatak" tipično se odnosi na aminokiselinu koja ima svoju definiciju priznatu u struci, kao što je aminokiselina izabrana iz grupe koju čine: alanin (Ala ili A); arginin (Arg ili R); asparagin (Asn ili N); asparaginska kiselina (Asp ili D); cistein (Cis ili C); glutamin (Gin ili K); glutaminska kiselina (Glu ili E); glicin (Gli ili G); histidin (His ili H); izoleucin (He ili I): leucin (Leu ili L); lizin (Lis ili K); metionin (Met ili M); fenilalanin (Phe ili F); proline (Pro ili P); serin (Ser ili S); treonin (Thr ili T); triptofan (Trp ili V); tirozin (Tir ili I); i valin (Val ili V), iako se po želji mogu koristiti modifikovane, sintetičke ili retke amino kiseline. Generalno, amino kiseline se mogu grupisati tako da imaju nepolarni bočni lanac (npr. Ala, Cis, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); negativno naelektrisani bočni lanac (npr. Asp, Glu); pozitivno naelektrisani bočni lanac (npr. Arg, His, Lis); ili nenaelektrisani polarni bočni lanac (npr. Asn, Cis, Gin, Gli, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp i Tir).
[0073] Modifikacije aminokiselina uključuju, na primer, delecije iz, i/ili insercije u, i/ili supstitucije, ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci konstrukata antitela. Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja i supstitucije je napravljena da bi se došlo do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike. Promene aminokiselina takođe mogu da promene post-translacione procese konstrukata antitela, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.
[0074] Na primer, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselina mogu biti umetnute, supstituisane ili deletriane u svaki od CDR (naravno, u zavisnosti od njihove dužine), dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili 25 aminokiselina mogu biti umetnute, supstituisane ili deletirane u svakom od FR. Poželjno, insercije aminokiselinske sekvence u konstrukt antitela uključuju fuzije amino- i/ili karboksil-terminala u rasponu dužine od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ostataka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvencionalne insercije pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Odgovarajuće modifikacije se takođe mogu izvršiti unutar trećeg domena konstrukta antitela definisanog u kontekstu pronalaska. Inserciona varijanta konstrukta antitela definisana u kontekstu pronalaska uključuje fuziju na N-terminus ili na C-terminus konstrukta antitela enzima ili fuziju sa polipeptidom.
[0075] Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju (ali nisu ograničena na) CDR teškog i/ili lakog lanca, posebno hipervarijabilne regione, ali se takođe razmatraju promene FR u teškom i/ili lakom lancu. Supstitucije su poželjno konzervativne supstitucije kao što je ovde opisano. Poželjno, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselina mogu biti supstituisane u CDR, dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili 25 aminokiselina mogu biti supstituisane u okvirnim regionima (FR), u zavisnosti od dužine CDR ili FR. Na primer, ako CDR sekvenca obuhvata 6 aminokiselina, predviđeno je da su jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina supstituisane. Slično, ako CDR sekvenca obuhvata 15 aminokiselina, predviđeno je da jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest od ovih aminokiselina budu supstituisane.
[0076] Koristan metod za identifikaciju određenih ostataka ili regiona konstrukta antitela koji su poželjne lokacije za mutagenezu naziva se "tehnika mutageneze skeniranja alalnina" kako je opisano u Cunningham and Vells u Science, 244: 1081-1085 (1989.). Ovde se identifikuje ostatak ili grupa ciljnih ostataka unutar konstrukta antitela (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lis i glu) i zamenjeni neutralnom ili negativno naelektrisanom amino kiselinom (najpoželjnije alanin ili polialanin ) da utiče na interakciju aminokiselina sa epitopom.
[0077] Te lokacije aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije se zatim rafinišu uvođenjem daljih ili drugih varijanti na, ili za mesta supstitucije. Prema tome, dok je mesto ili region za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određen, priroda mutacije sama po sebi ne mora biti unapred određena. Na primer, da bi se analizirao ili optimizovao učinak mutacije na datom mestu, skeniranje alanina ili nasumična mutageneza može da se sprovede na ciljnom kodonu ili regionu, a eksprimirane varijante konstrukta antitela se pregledaju u odnosu na optimalnu kombinaciju željene aktivnosti. Tehnike za pravljenje supstitucionih mutacija na unapred određenim mestima u DNK sa poznatom sekvencom su dobro poznate, na primer, mutageneza M13 prajmera i PCR mutageneza. Skrining mutanata se vrši korišćenjem testova aktivnosti vezivanja antigena, kao što je receptor NK ćelija, npr. CD16a, i vezivanje antigena na površini ciljne ćelije.
[0078] Generalno, ako su aminokiseline supstituisane u jednom ili više ili u svim CDR teškog i/ili lakog lanca, poželjno je da tada dobijena "supstituisana" sekvenca bude najmanje 60% ili 65%, poželjnije 70% ili 75%, još poželjnije 80% ili 85%, a posebno poželjno 90% ili 95% identična "originalnoj" CDR sekvenci. To znači da zavisi od dužine CDR u kom stepenu je identičan „supstituisanoj“ sekvenci. Na primer, CDR koji ima 5 aminokiselina je poželjno 80% identičan svojoj supstituisanoj sekvenci da bi imao najmanje jednu supstituisanu amino kiselinu. Shodno tome, CDR konstrukta antitela mogu imati različite stepene identičnosti sa njihovim supstituisanim sekvencama, npr. CDRL1 može imati 80%, dok CDRL3 može imati 90%.
[0079] Poželjne zamene (ili zamene) su konzervativne zamene. Međutim, svaka supstitucija (uključujući nekonzervativnu supstituciju ili jednu ili više od „primernih supstitucija“ navedenih u Tabeli 3, dole) je predviđena sve dok konstrukt antitela zadrži svoju sposobnost da se veže za receptor NK ćelije, npr. CD16a preko prvog domena i na antigen ciljne ćelijske površine preko drugog domena i/ili njegovi CDR imaju identičnost sa tada supstituisanom sekvencom (najmanje 60% ili 65%, poželjnije 70% ili 75%, još poželjnije 80 % ili 85%, a posebno poželjno 90% ili 95% identična "originalnoj" CDR sekvenci).
[0080] Konzervativne supstitucije su prikazane u tabeli 1 pod naslovom "poželjne supstitucije". Ako takve supstitucije dovedu do promene biološke aktivnosti, tada se mogu uvesti značajnije promene, nazvane "primerne supstitucije" u Tabeli 1, ili kako je dalje opisano u nastavku u vezi sa klasama amino kiselina, a proizvodi se testiraju na željenu karakteristiku.
Tabela 1: Supstitucije aminokiselina
[0081] Značajne modifikacije u biološkim svojstvima konstrukta antitela iz ovog pronalaska se postižu izborom supstitucija koje se značajno razlikuju po njihovom uticaju na održavanje (a) strukture polipeptidne kičme u oblasti supstitucije, na primer, kao ploča ili spiralna konformacija, (b) naelektrisanje ili hidrofobnost molekula na ciljnom mestu, ili (c) najveći deo bočnog lanca. Prirodni ostaci su podeljeni u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca: (1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralni hidrofilni: cis, ser, thr, asn, gin; (3) kiseli: asp, glu; (4) osnovni: his, lis, arg; (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gli, pro; i (6) aromatični: trp, tir, phe.
[0082] Nekonzervativne zamene će podrazumevati zamenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu. Bilo koji cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanje pravilne konformacije konstrukta antitela može biti zamenjen, generalno, serinom, da bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula i sprečilo aberantno umrežavanje. Suprotno tome, cisteinska veza(e) se može dodati antitelu da bi se poboljšala njegova stabilnost (naročito kada je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment).
[0083] Za sekvence aminokiselina, identičnost sekvence i/ili sličnost se određuje korišćenjem standardnih tehnika poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lokalni algoritam identiteta sekvence Smith i Waterman, 1981, Adv. Appl. Math.2:482, algoritam za poravnanje identičnosti sekvence Needleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, metoda traženja sličnosti Pearson i Lipman, 1988, Proc. Nat. Akad. Sci. SAD 85:2444, kompjuterizovane implementacije ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u softverskom paketu Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Vis.), BEST FIT program za najbolje uklapanje sekvence koju opisuje Devereuk et al., 1984, Nucl. Acid Res.
12:387-395, poželjno koristeći podrazumevana podešavanja, ili inspekcijom.
[0084] Poželjno je da FastDB izračunava procenat identičnosti na osnovu sledećih parametara: kazna nepodudaranja od 1; kazna praznina od 1; kazna za veličinu praznine od 0,33; i spojna kazna od 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.
[0085] Primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP kreira višestruko poravnanje sekvenci iz grupe povezanih sekvenci koristeći progresivna poravnanja u paru. Takođe može iscrtati stablo koje pokazuje odnose grupisanja koji se koriste za kreiranje poravnanja. PILEUP koristi pojednostavljenje metode progresivnog poravnanja Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol.
35:351-360; metoda je slična onoj koju opisuje Higgins i Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Korisni PILEUP parametri uključujući podrazumevanu težinu praznine od 3,00, podrazumevanu težinu dužine praznine od 0,10 i ponderisane krajnje praznine.
[0086] Još jedan primer korisnog algoritma je BLAST algoritam, opisan u: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; i Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Posebno koristan BLAST program je VU-BLAST-2 program koji je dobijen od Altschul et al., 1996, Methods in Enzimologi 266:460-480. WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara pretrage, od kojih je većina podešena na podrazumevane vrednosti. Podesivi parametri se postavljaju sa sledećim vrednostima: raspon preklapanja=1, frakcija preklapanja=0,125, prag reči (T)=ll. Parametri HSP S i HSP S2 su dinamičke vrednosti i uspostavlja ih sam program u zavisnosti od sastava određene sekvence i sastava određene baze podataka prema kojoj se sekvenca od interesa traži; međutim, vrednosti se mogu podesiti da bi se povećala osetljivost.
[0087] Dodatni koristan algoritam je gapped BLAST kako je prijavio Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Gapped BLAST koristi rezultate zamene BLOSUM-62; parametar praga T postavljen na 9; metoda sa dva pogotka za pokretanje proširenja bez praznina, naplaćuje dužine praznina od k po ceni od 10+k; Xu je postavljen na 16, a Xg na 40 za fazu pretraživanja baze podataka i na 67 za izlaznu fazu algoritama. Poravnanja sa prazninama se aktiviraju rezultatom koji odgovara oko 22 bita.
[0088] Generalno, homologija, sličnost ili identičnost aminokiselina između pojedinačnih varijanti CDR ili VH/VL sekvenci su najmanje 60% u odnosu na sekvence koje su ovde prikazane, a tipičnije sa poželjnim povećanjem homologija ili identičnosti od najmanje 65% ili 70%, više poželjno najmanje 75% ili 80%, još poželjnije najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i skoro 100 %. Na sličan način, "procenat (%) identičnosti sekvence nukleinske kiseline" u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline vezujućih proteina identifikovanih ovde je definisan kao procenat nukleotidnih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa nukleotidnim ostacima u kodiranju sekvenca konstrukta antitela. Specifičan metod koristi BLASTN modul WU-BLAST-2 postavljen na podrazumevane parametre, sa rasponom preklapanja i frakcijom preklapanja postavljenim na 1 i 0,125, respektivno.
[0089] Generalno, homologija, sličnost ili identičnost sekvenci nukleotida koje kodiraju pojedinačne varijante CDR-a ili VH/VL sekvence i nukleotidnih sekvenci koje su ovde prikazane su najmanje 60%, a tipičnije sa poželjnim povećanjem homologija ili identičnosti od najmanje 65 %, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% i skoro 100%. Dakle, "varijanta CDR" ili "varijanta VH/VL regiona" je ona sa specificiranom homologijom, sličnošću ili identičnošću sa roditeljskim CDR/VH/VL definisanim u kontekstu pronalaska, i deli biološku funkciju, uključujući, ali ne ograničavajući se na, najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ili 99 % specifičnosti i/ili aktivnosti roditeljskog CDR ili VH / VL.
[0090] U jednom aspektu, procenat identičnosti sa ljudskom klicinom linijom konstrukata antitela prema pronalasku je ≥ 70% ili≥ 75%, poželjnije ≥ 80% ili≥ 85%, još poželjnije ≥ 90%, a najpoželjnije ≥ 91 %, ≥92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95% ili čak ≥ 96%. Smatra se da je identičnost sa proizvodima gena klicine linije humanih antitela važna karakteristika za smanjenje rizika od terapijskih proteina da izazovu imuni odgovor protiv leka kod pacijenta tokom lečenja. Hwang & Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) pokazuju da smanjenje ne-humanih delova konstrukata antitela na lek dovodi do smanjenja rizika od indukovanja antitela protiv lekova kod pacijenata tokom lečenja. Upoređivanjem iscrpnog broja klinički procenjenih lekova za antitela i odgovarajućih podataka o imunogenosti, pokazuje se trend da humanizacija V-regiona antitela čini protein manje imunogenim (u proseku 5,1% pacijenata) od antitela koja nose nepromenjene ne-humane V regione. (prosečno 23,59 % pacijenata). Viši stepen identičnosti sa humanim sekvencama je stoga poželjan za proteinske terapeutike zasnovane na V-regiji u obliku konstrukta antitela. Za ovu svrhu određivanja identičnosti klicine linije, V-regioni VL mogu se uskladiti sa sekvencama aminokiselina V segmenata humane klicine linije i J segmenata (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) koristeći Vector NTI softver i aminokiselinska sekvenca može se izračunati deljenjem identičnih aminokiselinskih ostataka sa ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka VL u procentima. Isto važi i za VH segmente (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) sa izuzetkom da VH CDR3 može biti isključen zbog svoje velike raznolikosti i nedostatka postojeće humane klicine linije VH CDR3 partnera za poravnanje. Rekombinantne tehnike se zatim mogu koristiti za povećanje identičnosti sekvence gena klicine linije humanih antitela.
[0091] Izraz "ćelija mijeloma" je maligna (kancerogena) plazma ćelija koja nastaje iz plazma ćelije u koštanoj srži neoplastičnom transformacijom. Kod mijeloma, maligne plazma ćelije proizvode velike količine abnormalnih antitela koja nemaju sposobnost da se bore protiv infekcije. Ova abnormalna antitela su takozvani monoklonski protein, ili M-protein, koji funkcioniše kao tumorski marker za mijelom. Ćelija mijeloma ima fenotip CD19-/CD38<+>/CD138<+>/BCMA<+>. Dakle, CD38, CD138 i BCMA predstavljaju antigene eksprimirane na ćeliji mijeloma. Takođe su uključeni i maligni fenotipovi u B ćelijskoj lozi koji su pozitivni na CD19/CD20/CD22/BCMA i druge antigene (ovo bi trebalo da uključuje fenotipove koji se ne shvataju klasično kao plazma ćelije, ali mogu biti evolucije iz memorijskih B ćelija ili preloza plazma ćelija).
[0092] Termin "EGFR" se odnosi na receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR; ErbB-1; HER1 kod ljudi, uključujući sve izoforme ili varijante opisane sa aktivacijom, mutacijama i uključene u patofiziološke procese. EGFR mesto vezivanja antigena prepoznaje epitop u ekstracelularni domen EGFR-a U određenim primerima izvođenja, mesto za vezivanje antigena se specifično vezuje za humani i makaki EGFR. Receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) je član HER porodice receptorskih tirozin kinaza i sastoji se od četiri člana: EGFR (ErbB1). /HER1), HER2/neu (ErbB2), HER3 (ErbB3) i HER4 (ErbB4) Stimulacija receptora vezivanjem liganda (npr. EGF, TGFa, HB-EGF, neuregulini, betacelulin, amfiregulin) aktivira intrinzični receptor kineze. u intracelularnom domenu kroz fosforilaciju tirozina i promoviše homo- ili heterodimerizaciju receptora sa članovima HER porodice. Ovi intracelularni fosfo-tirozini služe kao mesta za spajanje različitih adapterskih proteina ili enzima uključujući SHC, GRB2, PLCg i PI(3)K/Akt, koji. istovremeno iniciraju mnoge signalne kaskade koje utiču na proliferaciju ćelija, angiogenezu, otpornost na apoptozu, invaziju i metastaze.
[0093] MFI definiše srednji intenzitet fluorescencije.
Detaljan opis pronalaska:
[0094] Dakle, u prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovane humane NK ćelije u kriokonzerviranom stanju, prethodno napunjene konstruktom antitela pre zamrzavanja, pri čemu konstrukt antitela sadrži najmanje prvi vezujući domen koji se vezuje za antigen receptora NK ćelije na površini ćelije. imunološke efektorske ćelije, pomenuti prvi vezujući domen sadrži tri CDR teška lanca i tri CDR laka lanca, i drugi vezujući domen koji se vezuje za površinu ćelije antigen na površini ćelije ciljne ćelije.
[0095] Dodatno, u drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za rekonstituisanje/pripremanje takvih živih ljudskih NK ćelija prethodno napunjenih takvim konstruktom antitela iz kriokonzerviranog stanja.
[0096] U sadašnje vreme gotovi proizvodi (alogenski) su daleko iza individualizovanih (autolognih) pristupa. Dok je autologni prenos ćelija klinički validiran, proizvodnja ćelijskih proizvoda mora biti uspostavljena za svakog pojedinačnog pacijenta. Individualizovana proizvodnja zahteva 7 do 14 dana za izolaciju, ekspanziju i pripremu ćelija, iako se sprovode različite strategije za optimizaciju. Jedno ograničenje je da za neke pacijente autologna ekspanzija njihovih imunih ćelija ne daje dovoljan broj ćelija. Pored toga, opisano je da su imunološke efektorske ćelije pacijenata obolelih od raka funkcionalno oštećene zbog imunosupresije i izmenjenih fenotipova. Dakle, varijabilnost među pacijentima negativno utiče kako na individualizovanu proizvodnju, tako i na kliničku efikasnost.
[0097] Za razliku od autolognih pristupa, komercijalni alogeni proizvodi nude jedinstvene prednosti: takvi proizvodi se mogu odmah primeniti na pacijenta, odnosno odmah nakon odmrzavanja, što dramatično smanjuje vreme lanca snabdevanja/logistike i povećava dostupnost proizvoda preko jedne centralizovane bolnice. Velike serije alogenih imunih efektorskih ćelija mogu se proizvoditi u centralizovanom proizvodnom mestu, što ne samo da smanjuje troškove proizvodnje, već i povećava homogenost proizvoda imunoloških efektorskih ćelija, omogućavajući visok kvalitet regulatornih standarda. Ovakvi centralizovani objekti mogu takođe omogućiti odabir odgovarajućih zdravih donatora koji će koristiti najfunkcionalnije efektorske ćelije za proces proizvodnje.
[0098] Kao što je već gore navedeno, pronalazak obezbeđuje u prvoj realizaciji izolovane humane NK ćelije u kriokonzerviranom stanju, prethodno napunjene konstruktom antitela pre zamrzavanja, konstrukt antitela koji sadrži najmanje prvi vezujući domen koji se vezuje za antigen receptora NK ćelije na površine imunološke efektorske ćelije, pri čemu navedeni prvi vezujući domen sadrži tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca, i drugi vezujući domen koji se vezuje za površinu ćelije antigen na površini ćelije ciljne ćelije koji može biti izveden iz bilo kog od prethodnih izvora.
[0099] NK ćelije koje se koriste u kontekstu pronalaska su npr. izolovane iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) zdravih davalaca koje karakterišu različiti fenotipovi (npr. adaptivne memorijske NK100 ćelije), izolovane iz tkiva pupčane vrpce ili placente, indukovane pluripotentne NK ćelije koje potiču iz matičnih ćelija (iPSC izvedene) (npr. FT5106 ili FT506) ili NK ćelijske linije. Primeri pogodnih NK ćelijskih linija obuhvataju, ali nisu ograničeni na ćelijske linije NK-92 ćelije (ATCC<®>CRL-2407<™>), NK-IS ćelije (Tsuchiyama et al. 1998, Blood), ili NK-IT ćelije (Teshigavara et al.1985, J Immunol). Takođe, unutar grupe pogodnih NK ćelija su NK ćelije himernog receptora antigena (CAR) koje mogu biti izvedene iz bilo kog od gore navedenih izvora.
[0100] Termin "iPSC" definiše u kontekstu pronalaska indukovane pluripotentne matične ćelije koje se mogu koristiti za stvaranje diferenciranih i specijalizovanih tipova ćelija (npr. NK ćelije) korišćenjem principa genetskog inženjeringa, definisanih tretmana sa malim molekulima i ekspanzije ćelija.
[0101] U nekim primerima izvođenja pronalaska neophodno je izvršiti ekspanziji i/ili aktivirati NK ćelije pre koraka prethodnog punjenja ćelija pomenutim konstruktom antitela. Protokoli za takvo proširenje su poznati u tehnici, npr. iz WO2017/042393, WO2015/132415, US20110014162, US20120308986A1, US9062287B2, US8026097B2, US9260696B2; US20170119865.
[0102] U skladu sa pronalaskom, NK ćelije se mogu kultivisati pre inkubacije sa konstruktom antitela. Takav korak ćelijske kulture može biti neophodan za proširenje i/ili aktiviranje odgovarajućih ćelija. Tipični protokoli za proširenje mogu sadržati selekciju CD34<+>ćelija, CD3<+>depleciju ćelija i inkubaciju sa ćelijama za hranjenje koje nose 4-1BBL i/ili transmembranski IL-21 i opciono dodatna stimulacija sa limfoproliferativnim citokinima kao što je IL-2. U određenim primerima izvođenja serija NK ćelija prethodno napunjenih konstruktom antitela sadrži 10<6>i 10<11>ćelije. Broj preinkubiranih ćelija, koje se mogu davati pacijentu može biti u opsegu od 1×10<5>do 1×10<8>NK ćelija po kg telesne težine.
[0103] U kontekstu pronalaska "ćelije u kriokonzerviranom stanju" su ćelije koje su konzervirane hlađenjem na temperaturi ispod nule (stepeni Celzijusa). Kriokonzervirane ćelije mogu ili ne moraju biti sačuvane u prisustvu krioprotektivnog sredstva. Krioprotektivni agens, kao što je DMSO, glicerol, etilen glikol ili propilen glikol, je supstanca koja štiti ćelije od oštećenja povezanih sa skladištenjem na temperaturi ispod nule i/ili smrzavanjem, npr. oštećenje ćelijske membrane usled formiranja kristala leda.
[0104] Termin "prethodno napunjeno pre zamrzavanja" odnosi se na preinkubaciju ćelija pre hlađenja na temperaturu ispod nule sa identifikovanim konstruktom antitela.
[0105] Važno je napomenuti da se prvi vezujući domen opisanog konstrukta antitela, za koji antigenski receptor na ćelijskoj površini NK imunološke efektorske ćelije se vezuje za ovaj receptor na način, koji omogućava održavanje vezivanja na površini ćelije čak i tokom i nakon što je ova ćelija u kriokonzerviranom stanju. Kao što je pokazano u priloženom primeru 1, konstrukti antitela koji imaju prvi vezujući domen specifičan za CD16 (a ili b) vezuju se za specifični epitop različit od IgG vezujućeg domena FcRγIII. Pretpostavlja se da vezivanje za takav specifični epitop omogućava održavanje vezivanja čak i tokom procesa hlađenja NK ćelija prema jednom aspektu pronalaska na temperaturu ispod nule i naknadnu rekonstituciju ćelija za primenu na subjekta kome je to potrebno. Slični epitopi postoje i za druge antigene receptora NK ćelija na površini ćelije imunoloških efektorskih ćelija, npr. NKp46 ili NKG2D.
[0106] Prema jednom aspektu pronalaska, izolovane humane NK ćelije su izolovane iz tkiva pupčane vrpce ili PBMC od zdravih donora.
[0107] Takođe, u jednom aspektu izolovane humane NK ćelije prema jednom aspektu pronalaska su konzervisane u krio rastvoru. Krio rastvor u kontekstu pronalaska sadrži najmanje medijum za kulturu bazalnih ćelija i krioprotektivni agens. Dodatno, krio rastvor može dalje da sadrži izotonični rastvor kao što je Plazma-lyte i/ili serumski albumin.
[0108] Neograničavajući primeri za krioprotektivna sredstva su dati ovde prethodno. Određene primeri izvođenja krioprotektivnih sredstava u kontekstu pronalaska su DMSO i glicerol. Koncentracija krioprotektivnog agensa može biti u opsegu od 1% do 30% (zapr/zapr), u određenim primerima izvođenja u opsegu od 5% do 25% (zapr/zapr), u drugim primerima izvođenja u opsegu od 10% do 25% (zapr/zapr), takođe u nekim primerima izvođenja je koncentracija od 20% (zapr/zapr). Izraz "medijum za kulturu bazalnih ćelija" se u kontekstu pronalaska odnosi na tečne medijume za kulturu ćelija, koji su pogodni za ćelijsku kulturu ćelija sisara. Primeri za takve "medijume za kulturu bazalnih ćelija" su dobro poznati u tehnici. Koncentracija izotoničnog rastvora može biti u opsegu od 1% do 60% (zapr/zapr), u nekim primerima izvođenja u opsegu od 10% do 50% (zapr/zapr), u drugim primerima izvođenja u opsegu od 20% do 45% (zapr/zapr), a u jednom primeru izvođenja u koncentraciji od 40% (zapr/zapr). Serumski albumin može biti humani ili (fetalni) goveđi (poželjno ljudski) serum albumin, koji je izolovan od donora ili proizveden rekombinantno. Koncentracija albumina u krio rastvoru može biti u opsegu od 1% do 40% (zapr/zapr), u nekim primerima izvođenja u opsegu od 5% do 25% (zapr/zapr), takođe u nekim primerima izvođenja u opsegu od 10% do 20% (zapr/zapr). Primer za krio rastvor (medijum za zamrzavanje) može da sadrži bazalni medijum, 40% Plasma-lyte, humani serum albumin (HSA) i 10% dimetil sulfoksid (DMSO). Alternativno, fetalni goveđi serum (FBS) ili glicerol se mogu koristiti za zamenu HSA i/ili DMSO, respektivno. Najčešće korišćeni krio-protektor je DMSO. Iz nekih razloga DSMO može biti zamenjen alternativnim jedinjenjima kao što su glicerol, etilen glikol ili propilen glikol.
[0109] U skladu sa određenim aspektom, NK ćelije jednog aspekta pronalaska su prethodno napunjene u rastvor koji sadrži konstrukt antitela u koncentraciji od najmanje 5 nM. U određenim primerima izvođenja koncentracija je od najmanje 10nM, dodatno, u određenim primerima izvođenja koncentracija je od najmanje 25nM, takođe u određenim primerima izvođenja koncentracija je od najmanje 50nM, u određenim primerima izvođenja koncentracija je od najmanje 75nM, 90nM, 100nM, 125 nM ili 150 nM.
[0110] Antigen receptora NK ćelija za koji se vezuje prvi vezujući domen konstrukta antitela na površini izolovanih humanih NK ćelija prema jednom aspektu pronalaska je izabran iz grupe koju čine CD16a, CD16b, NKp46, NKG2D i CD16a CD16b.
[0111] Određene primeri izvođenja NK ćelijskih receptora su ovde prethodno definisani. Prvi vezujući domen pomenutog konstrukta antitela vezuje se tako ili specifično za CD16a, CD16b ili CD16a i CD16b. Dodatno, prvi vezujući domen može da se specifično vezuje za NKp46 ili NKG2D.
[0112] Antigen ćelijske površine na površini ćelije ciljne ćelije za koji se vezuje drugi vezujući domen konstrukta antitela je izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123 , CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, EGFRvlll, HER2, GD2.
[0113] Ovi površinski antigeni na površini ciljnih ćelija povezani su sa specifičnim entitetima bolesti. CD30 je antigen ćelijske površine karakterističan za maligne ćelije u Hodgkin limfomu. CD19, CD20, CD22, CD70, CD74 i CD79b su antigeni ćelijske površine karakteristični za maligne ćelije u ne-Hodgkin limfomima (Difuzni veliki B-ćelijski limfom (DLBCL), limfom ćelija plašta (MCL), Folikularni limfom (FL), T-ćelijski limfomi (i periferni i kožni, uključujući transformisanu gljivičnu mikozu/Sezary sindrom TMF/SS i anaplastični limfom velikih ćelija (ALCL) su površinski antigeni ćelije karakteristični za maligne ćelije leukemije (Chromp). (CLL), akutna limfoblastna leukemija (ALL), akutna mijeloidna leukemija (AML) su antigeni ćelijske površine karakteristični za maligne ćelije u multiplom mijelomu, HER2, GD2 su antigeni na površini ćelije (trostruko negativni kancer dojke (TNBC), kancer dojke BC, kolorektalni kancer (CRC), sitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), karcinom malih ćelija (SCLC takođe poznat kao „karcinom malih ćelija pluća“ ili karcinom „ovsenih ćelija“ karcinom"), kancer prostate (PC), glioblastom (takođe poznat kao multiformni glioblastom (GBM)).
[0114] U jednom aspektu humanih NK ćelija prema jednom aspektu pronalaska, konstrukt antitela sadrži u prvom vezujućem domenu tri CDR teška lanca i tri CDR laka lanca izabrana iz grupe koju čine:
(a) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 31, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 31 ID BR: 32, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 33, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 34;
(b) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 40, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 41, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 42, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 42 ID BR: 43, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 44, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 45;
(c) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 51, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 52, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 53, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 53 ID BR: 54, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 55, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 56;
(d) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 62, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 63, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 64, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 64 ID BR: 65, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 66, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 67;
(e) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 73, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 74, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 75, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 75 ID BR: 76, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 77, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 78;
(f) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 84, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 85, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 86, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 86 ID BR: 87, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 88, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 89; i
(g) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 95, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 96, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 97, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 97 ID BR: 98, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 99, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 100.
[0115] Takođe u jednom primeru izvođenja izolovanih humanih NK ćelija prema jednom aspektu pronalaska, konstrukt antitela se sastoji od prvih parova vezujućih domena VH- i VL-lanaca koji imaju sekvencu kako je prikazano u parovima sekvenci izabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 35 i SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68 i SEQ ID NO: 69, SEK ID BR: 79 i SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90 i SEQ ID NO: 91, i SEQ ID NO: 101 i SEQ ID NO: 102.
[0116] U jednom aspektu izolovanih humanih NK ćelija prema jednom aspektu pronalaska, konstrukt antitela sadrži u drugom domenu vezivanja tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca izabrana iz grupe koju čine:
(a) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 106, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 107, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 108, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 108 ID BR: 109, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 110, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 111;
(b) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 106, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 107, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 108, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 108 ID BR: 109, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 110, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 111; i
(c) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 117, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 118, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 119, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 119 ID BR: 120, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 121, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 122.
[0117] Takođe, u jednom primeru izvođenja izolovanih humanih NK ćelija u skladu sa jednim aspektom pronalaska, konstrukt antitela se sastoji od drugih parova domena vezivanja VH- i VL-lanaca koji imaju sekvencu kako je prikazano u parovima sekvenci izabranih iz grupe koji se sastoji od SEQ ID NO: 112 i SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 123 i SEQ ID NO: 124, i SEQ ID NO: 134 i SEQ ID NO: 135.
[0118] U jednom primeru izvođenja izolovane humane NK ćelije prema jednom aspektu pronalaska, konstrukt antitela sadrži proteinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NOs: 161-171.
[0119] U alternativnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu kriokonzerviranih unapred napunjenih humanih NK ćelija u kriokonzerviranom stanju, pri čemu postupak obuhvata
(i) inkubiranje NK ćelija sa konstruktom antitela, pri čemu konstrukt antitela sadrži najmanje prvi vezujući domen koji se vezuje za antigen receptora NK ćelije na površini ćelije imunološke efektorske ćelije, pri čemu navedeni prvi vezujući domen sadrži tri CDR teška lanca i tri laka CDR lanca, i drugi vezujući domen koji se vezuje za ćelijsku površinu antigena na površini ćelije ciljne ćelije; i
(ii) zamrzavanje NK ćelija.
[0120] Dodatno, pronalazak obezbeđuje takav postupak, gde su NK ćelije izolovane iz tkiva pupčane vrpce, iPSC ili PBMC od zdravih donora.
[0121] Kao što je gore opisano, NK ćelije navedene u postupku prema jednom aspektu pronalaska su prethodno napunjene u rastvor koji sadrži konstrukt antitela u koncentraciji od najmanje 5 nM. U određenim primerima izvođenja koncentracija je od najmanje 10 nM, u nekim primerima izvođenja je u koncentraciji od najmanje 25 nM, od najmanje 50 nM, ili od najmanje 75 nM. U određenim primerima izvođenja koncentracija je od najmanje 90 nM, 100 nM, 125 nM ili 150 nM.
[0122] U jednom primeru izvođenja postupka prema jednom aspektu pronalaska, antigen receptora NK ćelija za koji se vezuje prvi vezujući domen konstrukta antitela je izabran iz grupe koju čine CD16a, CD16b, NKp46, NKG2D i CD16a CD16b.
[0123] Takođe, prema određenim primerima izvođenja, antigen ćelijske površine na ćelijskoj površini ciljne ćelije za koji se vezuje drugi vezujući domen konstrukta antitela je izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, HER2, GD2.
[0124] U skladu sa postupkom prema jednom aspektu pronalaska za pripremu kriokonzerviranih unapred napunjenih humanih NK ćelija, korak zamrzavanja NK ćelija se izvodi korišćenjem medijuma za zamrzavanje/krio rastvora. Određene kompozicije i jedinjenja medijuma za zamrzavanje/krio rastvora u skladu sa pronalaskom su prethodno opisani.
[0125] U određenim primerima izvođenja ovog postupka, NK ćelije su izolovane iz tkiva pupčane vrpce, iPSC ili PBMC od zdravih donora.
[0126] Takođe je predviđeno za ovaj postupak u jednom aspektu pronalaska da su NK ćelije prethodno napunjene u rastvor koji sadrži konstrukt antitela u koncentraciji od najmanje 5 nM.
[0127] Pored toga, u skladu sa pronalaskom je da je antigen receptora NK ćelija za koji se vezuje prvi vezujući domen konstrukta antitela izabran iz grupe koja se sastoji od CD16a, CD16b, NKp46, NKG2D i CD16a CD16b.
[0128] Takođe je predviđeno za ovaj postupak u jednom aspektu pronalaska da je antigen ćelijske površine na ćelijskoj površini ciljne ćelije za koji se veže drugi vezujući domen konstrukta antitela izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD22, CD30, CD33, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, HER2, GD2.
[0129] Prema jednom primeru izvođenja ovog postupka u jednom aspektu pronalaska, korak zamrzavanja NK ćelija se izvodi upotrebom medijuma za zamrzavanje koji sadrži najmanje medijum za kulturu bazalnih ćelija i krioprotektivni agens.
[0130] U jednom aspektu postupka prema pronalasku, konstrukt antitela koji se koristi u postupku je jedan od konstrukata antitela opisanih ovde prethodno. U određenim primerima izvođenja postupka prema pronalasku, navedeni konstrukt antitela sadrži proteinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NOs: 161-171.
[0131] U alternativnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za rekonstituisanje/pripremanje vijabilnih unapred napunjenih humanih NK ćelija iz humanih NK ćelija u skladu sa jednim aspektom pronalaska u kriokonzerviranom stanju opisanom iznad ili pripremljenom prema postupku prema jednom aspektu pronalaska za pripremu kriokonzerviranih unapred napunjenih humanih NK ćelija u kriokonzerviranom stanju za primenu navedenih ćelija na subjekta kome je to potrebno, pri čemu postupak sadrži korak rekonstituisanja/pripremanja ćelija za primenu na pacijenta odmrzavanjem.
[0132] Odmrzavanje zamrznutih ćelija može se postići prema dobro poznatim postupcima. Opšti postupci odmrzavanja uključuju brzo prenošenje zamrznutih ćelija u vodeno kupatilo na 37°C i blago mešanje dok se aktivirane NK ćelije potpuno ne odmrznu. Posle odmrzavanja, odmrznute NK ćelije se mogu pripremiti za primenu na pacijenta dodavanjem, poželjno u kapima, farmaceutski prihvatljivih nosača na sobnoj temperaturi, na primer, da se razblaži koncentracija medijuma za zamrzavanje i/ili isperu prethodno aktivirane NK ćelije. Kao što je ovde pokazano, populacije ćelija ovog pronalaska zadržavaju svoje aktivirano stanje u kombinaciji sa konstruktom antitela nakon takve prezervacije. Priprema ćelija za primenu nakon konzervacije zavisi od postupka konzervacije. Na primer, ćelije se mogu pripremiti za primenu nakon konzervacije ćelijskom kulturom i/ili hlađenja pomoću jednog ili više od sledećeg: pranje ćelija, resuspendovanje ćelija u farmaceutski prihvatljivom nosaču, i/ili držanje ćelija u odgovarajućem uređaju za isporuku, na primer, špricu. U jednom primeru izvođenja, ćelije se pripremaju za primenu posle krioprezervacije odmrzavanje, na primer, blagim mešanjem u vodenom kupatilu na 37°C, a zatim stavljanjem ćelija u odgovarajući uređaj za isporuku, npr., špric. Ove populacije odmrznutih ćelija mogu se iznenađujuće koristiti u klinici skoro odmah po potrebi, na primer, bez reaktivacije ili druge opsežne i/ili dugotrajne manipulacije.
[0133] Shodno tome, iako nepotrebno, ćelije pripremljene za primenu nakon krioprezervacije mogu se dalje pripremiti dodavanjem, poželjno u kapima, farmaceutski prihvatljivog nosača na sobnoj temperaturi da se, na primer, razblaži koncentracija i/ili ispere ćelije bez medijuma za zamrzavanje. U jednom primeru izvođenja, farmaceutski prihvatljiv nosač je u suštini bez aktivacionog sredstva.
[0134] U sledećem alternativnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži humane NK ćelije koje su rekonstituisane iz humanih NK ćelija u krioperzerviranom stanju prema pronalasku ili pripremljene postupkom prema pronalasku.
[0135] Određeni primeri izvođenja obezbeđuju farmaceutske kompozicije koje sadrže prethodno napunjene NK ćelije definisane u kontekstu pronalaska i dodatno jedan ili više ekscipijenasa kao što su oni ilustrativno opisani u ovom odeljku i ovde na drugom mestu. Ekscipijensi se mogu koristiti u pronalasku u tom pogledu za širok spektar namena, kao što je prilagođavanje fizičkih, hemijskih ili bioloških svojstava formulacija, kao što je podešavanje viskoziteta, i/ili postupci jednog aspekta pronalaska da bi se poboljšala efikasnost i ili da bi se stabilizovale takve formulacije i postupci od degradacije i kvarenja usled, na primer, naprezanja do kojih dolazi tokom proizvodnje, transporta, skladištenja, pripreme pre upotrebe, primene i nakon toga.
[0136] U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može sadržati materijale za formulaciju u svrhu modifikacije, održavanja ili očuvanja, npr. pH, osmolariteta, viskoziteta, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili prodiranja kompozicije (videti, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company). U takvim primerima izvođenja, pogodni materijali za formulaciju mogu uključivati, ali nisu ograničeni na:
• aminokiseline kao što su glicin, alanin, glutamin, asparagin, treonin, prolin, 2-fenilalanin, uključujući naelektrisane aminokiseline, poželjno lizin, lizin acetat, arginin, glutamat i/ili histidin
• antimikrobna sredstva kao što su antibakterijska i antifungalna sredstva
• antioksidansi kao što su askorbinska kiselina, metionin, natrijum sulfit ili natrijum hidrogensulfit;
• puferi, puferski sistemi i puferski agensi koji se koriste za održavanje kompozicije na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH; primeri pufera su borat, bikarbonat,
• Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline, sukcinat, fosfat i histidin; na primer Tris pufer od oko pH 7.0-8.5;
• nevodeni rastvarači kao što su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje i organski estri za injekcije kao što je etil oleat;
• vodeni nosači uključujući vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferovane medijume;
• biorazgradivi polimeri kao što su poliestri;
• sredstva za povećanje zapremine kao što su manitol ili glicin;
• helatirajuća sredstva kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA);
• izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije;
• sredstva za stvaranje kompleksa kao što su kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin)
• punioci;
• monosaharidi; disaharidi; i drugi ugljeni hidrati (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); ugljeni hidrati mogu biti neredukcioni šećeri, poželjno trehaloza, saharoza, oktasulfat, sorbitol ili ksilitol;
• (niske molekulske težine) proteini, polipeptidi ili proteinski nosači kao što su humani ili goveđi serum albumin, želatin ili imunoglobulini, poželjno humanog porekla;
• sredstva za bojenje i arome;
• redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što su glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, α-monotioglicerol i natrijum tio sulfat
• sredstva za razblaživanje;
• emulgatori;
• hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon)
• protivjoni koji stvaraju soli kao što je natrijum;
• konzervansi kao što su antimikrobna sredstva, antioksidansi, helatirajuća sredstva, inertni gasovi i slično; primeri su: benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid);
• metalni kompleksi kao što su kompleksi Zn-proteina;
• rastvarači i ko-rastvarači (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); • šećeri i šećerni alkoholi, kao što su trehaloza, saharoza, oktasulfat, manitol, sorbitol ili ksilitol stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, mioinizitoza, galaktoza, laktitol, ribitol, mioinizitol, galaktitol, ciklitolcerolili. glikol; i polihidrični šećerni alkoholi;
• sredstva za suspendovanje;
• surfaktanti ili sredstva za vlaženje kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što je polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal; surfaktanti mogu biti deterdženti, poželjno sa molekulskom težinom >1.2 KD i/ili polietar, poželjno sa molekulskom težinom >3 KD; neograničavajući primeri za poželjne deterdžente su Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 i Tween 85; neograničavajući primeri za poželjne polietre su PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 i PEG 5000;
• sredstva za poboljšanje stabilnosti kao što su saharoza ili sorbitol;
• sredstva za povećanje toničnosti kao što su halogenidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol;
• sredstva za parenteralnu isporuku uključujući rastvor natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, laktatni Ringerov rastvor ili fiksna ulja;
• sredstva za intravensku isporuku uključujući sredstva za dopunjavanje tečnosti i hranljivih materija, sredstva za dopunjavanje elektrolita (kao što su oni zasnovani na Ringerovoj dekstrozi).
[0137] Stručnjacima je očigledno da različiti sastojci farmaceutske kompozicije (npr. oni gore navedeni) mogu imati različite efekte, na primer, i aminokiselina može delovati kao pufer, stabilizator i/ili antioksidant; manitol može delovati kao sredstvo za povećanje zapremine i/ili sredstvo za povećanje toničnosti; natrijum hlorid može delovati kao sredstvo za isporuku i/ili sredstvo za poboljšanje toničnosti; itd.
[0138] U određenim primerima izvođenja, optimalnu farmaceutsku kompoziciju će odrediti stručnjak u ovoj oblasti u zavisnosti od, na primer, nameravanog puta primene, formata isporuke i željene doze. Videti, na primer, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. Na primer, pogodan vehikulum ili nosač može biti voda za injekcije, fiziološki rastvor soli ili veštačka cerebrospinalna tečnost, eventualno dopunjena drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralnu primenu. Neutralni puferovani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa serumskim albuminom su dodatni primeri nosača.
[0139] U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije prema jednom aspektu pronalaska, kompozicija se primenjuje na pacijenta intravenski.
[0140] Postupci i protokoli za intravensku (iv) primenu ovde opisanih farmaceutskih kompozicija su dobro poznati u tehnici.
[0141] U jednom aspektu farmaceutske kompozicije pronalaska, pomenuta farmaceutska kompozicija se koristi u prevenciji, lečenju ili ublažavanju bolesti izabrane od proliferativne bolesti, tumorske bolesti ili imunološkog poremećaja. Poželjno, pomenuta tumorska bolest je maligna bolest, poželjno kancer.
[0142] U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije pronalaska, identifikovana maligna bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od Hodgkin limfoma, ne-Hodgkin limfoma, leukemije, multiplog mijeloma i solidnnih tumora.
[0143] Takođe, u jednom primeru izvođenja pronalazak obezbeđuje prethodno napunjene humane NK ćelije koje su rekonstituisane iz humanih NK ćelija u krioperzerviranom stanju prema pronalasku ili pripremljene postupkom u skladu sa aspektima pronalaska za rekonstituisanje/pripremanje vijabilnih prethodno napunjenih humanih NK ćelija iz krioperzerviranog stanja za upotrebu u lečenju ili ublažavanju bolesti.
[0144] U skladu sa jednim aspektom upotrebe za lečenje ili poboljšanje bolesti prema pronalasku, prethodno napunjene humane NK ćelije se primenjuju na pacijenta intravenski.
[0145] U jednom primeru izvođenja pomenute upotrebe, subjekt pati od proliferativne bolesti, tumorske bolesti ili imunološkog poremećaja.
[0146] Poželjno je da pomenuta tumorska bolest bude maligna bolest, poželjno kancer.
[0147] U jednom primeru izvođenja pomenute upotrebe pomenuta maligna bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od Hodgkin limfoma, ne-Hodgkin limfoma, leukemije, multiplog mijeloma i solidnih tumora.
[0148] Mora se napomenuti da, kako se ovde koriste, oblici jednine "a", "an" i "the" uključuju reference u množini osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Tako, na primer, referenca na "reagens" uključuje jedan ili više takvih različitih reagenasa, a upućivanje na "postupak" uključuje upućivanje na ekvivalentne korake i postupke poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike koji bi se mogli modifikovati ili zameniti za postupke opisane ovde.
[0149] Osim ako nije drugačije naznačeno, termin "najmanje" koji prethodi nizu elemenata treba shvatiti da se odnosi na svaki element u nizu. Stručnjaci će prepoznati, ili moći da utvrde koristeći samo rutinsko eksperimentisanje, mnoge ekvivalente specifičnim primerima izvođenja pronalaska opisanim ovde. Namera je da takvi ekvivalenti budu obuhvaćeni ovim pronalaskom.
[0150] Termin "i/ili" gde god se koristi ovde uključuje značenje "i", "ili" i "svih ili bilo koje druge kombinacije elemenata povezanih ovim terminom".
[0151] Termin "oko" ili "približno" kako se ovde koristi znači unutar 20%, poželjno unutar 10%, a poželjnije unutar 5% date vrednosti ili opsega. Međutim, uključuje i konkretan broj, na primer, oko 20 uključuje 20.
[0152] Termin "manje od" ili "veće od" uključuje konkretan broj. Na primer, manje od 20 znači manje ili jednako. Slično, više od ili veće znači više od ili jednako, odnosno veće ili jednako.
[0153] U celoj ovoj specifikaciji i zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „sadrže“ i varijacije kao što su „sadrži“ i „koji sadrži“, razumeće se da označavaju uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kada se ovde koristi, termin "sadrži" može biti zamenjen terminom "sadrži" ili "uključuje" ili ponekad kada se ovde koristi terminom "ima".
[0154] Kada se ovde koristi, „sastoji se od“ isključuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nije naveden u elementu zahteva. Kada se ovde koristi, "sastoji se u suštini od" ne isključuje materijale ili korake koji ne utiču materijalno na osnovne i nove karakteristike zahteva.
[0155] U svakom slučaju ovde, bilo koji od termina „sadrži“, „koji se u suštini sastoji od“ i „sastoji se od“ može biti zamenjen sa bilo kojim od druga dva termina.
[0156] Trebalo bi razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole, materijale, reagense i supstance, itd., koji su ovde opisani i kao takvi mogu da variraju. Terminologija koja se ovde koristi je samo u svrhu opisa određenih primera izvođenja i nije namenjena da ograniči obim ovog pronalaska, koji je definisan isključivo zahtevima.
[0157] Primeri konstrukata antitela koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom su opisani u MAbs. 2019 Jul;11(5):899-918.
[0158] Bolje razumevanje ovog pronalaska i njegovih prednosti biće dobijeno iz sledećih primera, koji su ponuđeni samo u ilustrativne svrhe. Primeri nemaju nameru da na bilo koji način ograniče obim ovog pronalaska.
Primer 1: Procena citotoksičnosti posredovane antitelima od strane NK ćelija nakon prethodnog punjenja i zamrzavanja/odmrzavanja
Kultura ćelijskih linija
[0159] MM.1S (ATCC, kat.: CRL2974) i DK-MG ćelije (DSMZ, kat.: ACC277) su kultivisane u medijumu RPMI 1640 sa dodatkom 10% toplotno inaktiviranog FCS, 2 mM L-glutamina i 100 IU/mL penicilinaG natrijuma i 100 µg/mL streptomicin sulfata. Sve ćelijske linije su kultivisane u standardnim uslovima i subkultivisane prema preporukama dobavljača na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2.
Izolacija PBMC iz „buffy coats“ i obogaćivanje humanih NK ćelija
[0160] PBMC su izolovane iz „buffy coats“ (German Red Cross, Mannheim, Germany) centrifugiranjem u gradijentu gustine. Uzorci „buffy coat“ su razblaženi sa dva do tri puta zapreminom PBS (Invitrogen, kat.: 14190-169), naneti na jastuk od Lymphoprep (Stem Cell Technologies, kat.: 07861) i centrifugirani na 800 × g tokom 25 min na sobnoj temperaturi bez kočnice. PBMC locirani u interfejsu su sakupljeni i isprani 3 puta sa PBS pre nego što su kultivisani u kompletnom medijumu RPMI 1640 (RPMI 1640 medijum je dopunjen 10% toplotno inaktiviranim FCS, 2 mM L-glutamina i 100 IU/mL penicilin G natrijuma i 100 µg /mL streptomicin sulfata (sve komponente kompanije Invitrogen)) preko noći bez stimulacije. Za obogaćivanje NK ćelija, PBMC su sakupljene iz kultura preko noći i korišćene za jedan krug negativne selekcije korišćenjem EasySep<™>Komplet za obogaćivanje humanih NK ćelija (Stem Cell Technologies, kat.: 17055) za imunomagnetnu izolaciju netaknutih humanih NK ćelija i Big Easy EasySep<™>Magnet (Stem Cell Technologies, kat.: 18001) prema uputstvima proizvođača.
Prethodno punjenje NK ćelija i zamrzavanje/odmrzavanje
[0161] Alikvote obogaćenih primarnih humanih NK ćelija su resuspendovane u kompletnom medijumu RPMI 1640 koji sadrži 10 µg/mL navedenih konstrukata antitela u ukupnoj zapremini od 0.5 mL i inkubirani 30 minuta na sobnoj temperaturi. Kao što je naznačeno, polovina alikvota je dva puta isprana sa 5 mL kompletnog RPMI 1640 medijuma, a zatim resuspendovana u 0.5 mL kompletnog RPMI 1640 medijuma, a druga polovina alikvota nije isprana pre nego što je dodat FCS sa dodatkom 20% DMSO (Sigma). Suspenzije ćelija su zatim prebačene u krio epruvete od 2 mL (Greiner bio-one) i zamrznute na -80°C u posudi za zamrzavanje na 1°C (Nalgene) tokom više od 12 h.
4 h testovi citotoksičnosti oslobađanja kalceina
[0162] Za testove citotoksičnosti oslobađanja kalceina, naznačene ciljne ćelije su sakupljene iz kultura, isprane medijumom RPMI 1640 bez FCS i obeležene sa 10 µM kalceina AM (Invitrogen/Molecular Probes, kat.: C3100MP) tokom 30 minuta u RPMI medijumu bez FCS na 37°C. Nakon blagog ispiranja, obeležene ćelije su resuspendovane u kompletnom medijumu RPMI 1640 do gustine 1×10<5>/mL, i alikvote od 1×10<4>ciljnih ćelija su zatim zasejane u pojedinačne bunarčiće mikro ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Paralelno, NK ćelije su odmrznute od -80°C inkubacijom krio epruveta u vodenom kupatilu na 37°C. Kada su poslednji kristali leda bili vidljivi, suspenzija ćelija je razblažena kompletnim RPMI 1640 medijumom, centrifugirana i isprana jednom pre nego što su ćelije dodate ciljnim ćelijama u naznačenom odnosu efektornih-prema-ciljnim (E:T) sa ili bez dodavanja svežeg antitela kao što je naznačeno u ukupnoj zapremini od 200 µL u duplikatu. Spontano oslobađanje je određeno inkubacijom ciljnih ćelija u odsustvu efektorskih ćelija i bez antitela, a maksimalno oslobađanje je indukovano dodatkom 1% Triton x-100 (konačna koncentracija, Roth) i takođe je mereno u četiri primerka na svakoj ploči.
[0163] Nakon centrifugiranja od 2 minuta na 200 g, test je inkubiran 4 h na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2.100 µL supernatanta ćelijske kulture je sakupljeno iz svakog bunarčića nakon dodatnog centrifugiranja tokom 5 minuta na 500 g, a fluorescencija oslobođenog kalceina je izmerena na 520 nm korišćenjem fluorescentnog čitača više ploča (Victor 3 ili EnSight, Perkin Elmer). Na osnovu izmerenog broja, specifična liza ćelija je izračunata prema sledećoj formuli: [fluorescencija (uzorak) - fluorescencija (spontana)] / [fluorescencija (maksimalna) - fluorescencija (spontana)] × 100%. Fluorescencija (spontana) predstavlja broj fluorescencije iz ciljnih ćelija u odsustvu efektorskih ćelija i antitela, a fluorescencija (maksimalna) predstavlja ukupnu ćelijsku lizu indukovanu dodatkom Triton X-100. Vrednosti lize su analizirane i srednja vrednost i standardna devijacija su prikazani na grafikonu korišćenjem softvera GraphPad Prism (GraphPad Prism verzija 7.04 za Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA).
[0164] Rezultati su prikazani na slici 1.
Primer 2: Analiza vezivanja anti-CD16 antitela za različite varijante antigena
[0165] FcgRIII (CD16), receptor niskog afiniteta za Fc deo IgG postoji u dve izoforme kodirane sa dva skoro identična gena: FCGR3A (CD16A) i FCGR3B (CD16B), što rezultira tkivno specifičnom ekspresijom alternativnih izoformi usidrenih na membrani (Ravetch i Perussia, 1989, J Exp Med.):
• FcgRIIIA (CD16A) se eksprimira kao transmembranski protein na NK ćelijama, makrofagama i podskupovima monocita i T-ćelija
• FcgRIIIB (CD16B) je eksprimiran glikozilfosfatidilinozitolom (GPI)-usidren neutrofilima i nakon stimulacije gama-interferonom od strane eozinofila.
[0166] Alelne varijante/polimorfizmi oba, CD16A i CD16B su dobro poznati (sumirani u tabeli 2).
[0167] CD16B alotipske varijante razlikuju se u pet aminokiselina ekstracelularnog domena (ECD) (Tabela 2). Dva od njih omogućavaju dodatnu glikozilaciju, što rezultira tri različite varijante GPI-usidrenih FcγRIIIB granulocitnih antigena HNA-1a, -1b i -1c (ranije označenih kao NA1, NA2 i SH).
[0168] Postoji samo nekoliko razlika u aminokiselinskim sekvencama CD16A i B. Njihove razlike su ograničene na dve alternativne aminokiseline u zrelom ECD (Tabela 2). Dodatne razlike leže u različitim načinima membranskog sidrišta CD16A i CD16B. C-terminalna propeptidna sekvenca CD16B koja je odcepljena u zrelom GPI-usidrenom obliku je visoko homologna sekvenci koja povezuje CD16A ECD sa njegovim transmembranskim domenom (Tabela 2).
Tabela 2: Rezime varijacija sekvence alela FcgRIIIA (CD16A) i FcgRIIIB (CD16B). Koristimo brojeve aminokiselina prikazane u levoj koloni. Odgovarajuća numeracija iz Uniprot prikazana je desno za poređenje. Pozicije na kojima se CD16A razlikuje od CD16B su označene u boldu i podvučene. Propeptidna sekvenca koja je uklonjena u zrelom obliku CD16B prikazana je precrtanim slovima.
[0169] Prethodno je opisana izolacija CD16A specifičnog antitela "LSIV21" kome nedostaje CD16B vezivanje (Reusch et al., 2014, MAbs).
[0170] Da bismo istražili koja od varijacija sekvence CD16A/CD16B određuje mesto vezivanja za naša CD16A-selektivna antitela, generisali smo i karakterisali skup rastvorljivih rekombinantnih varijanti CD16A- i CD16B-antigena.
[0171] CD16B(NA1) ECD rekombinantni protein je ili eksprimiran kao zreli oblik (bez propeptida) (CD16B<mat>), ili kao varijanta koja sadrži propeptidnu sekvencu (CD16B<pr>). Pored toga, CD16B ECD mutanti u kojima su CD16B-specifične aminokiseline zamenjene odgovarajućim ostacima CD16A su konstruisani, eksprimirani i testirani u testovima vezivanja: CD16B<D129G>, CD16B<H140Y>, CD16B<S185F>. Sve ove varijante antigena su fuzionisane preko glicinserin linkera sa rastvorljivim monomernim Fc (Ying et al, 2012, J. Biol. Chem.), eksprimiranim u CHO i prečišćenim iz supernatanata ćelijske kulture.
[0172] ScFv antitelo koje sadrži varijabilne sekvence teškog i lakog lanca objavljenih CD16A-i CD16B-reaktivnih antitela 3G8 prepoznaje sve testirane varijante CD16A i CD16B antigena (Slika 2, Tabela 3). Različita antitela koja sadrže varijabilne sekvence teškog i lakog lanca „LSIV21“ ili „P2C47“ sa poboljšanim afinitetom (u obliku monovalentnih scFv ili bivalentno vezujućih tetravalentnih bispecifičnih tandem dijatela antitela) prepoznaju CD16A, ali ne prepoznaju zreli ili antigen CD16B ECD koji sadrži propeptide. Međutim, ako je histidin (H) na poziciji 140 u CD16B ECD mutiran u tirozin (I) - aminokiselinu koja je prisutna na odgovarajućoj poziciji u CD16A - ovaj mutantni oblik CD16B (CD16B<H140Y>) je dobro prepoznat antitelima koja sadrže varijabilne domene „LSIV21“ ili „P2C47“ (Slika 2, Tabela 3).
Tabela 3: Rezime vezivanja različitih anti-CD16 antitela za obložene varijante CD16 antigena analizirane u ELISA testu. Vrednosti vezujuće EC50su izračunate korišćenjem četvoroparametarske logističke (4PL) krive modela log(agonist) naspram odgovora -Promenljivi nagib u Graphpad Prism.
[0173] Dodatna afinitetno sazrela anti-CD16 scFv antitela su na sličan način analizirana u ELISA testu. Rezultati pokazuju da osim scFv "CD16-5" koji pokazuje slabu unakrsnu reaktivnost sa CD16B, druga afinitetno sazrela anti-CD16 scFv antitela održavaju svojstvo selektivnog vezivanja CD16A roditeljskog antitela. Oni se ne vezuju za CD16B, osim ako CD16B ne sadrži prethodno opisanu izmenu aminokiselina CD16B<H140Y>(Tabela 4). Sva anti-CD16 antitela pokazuju veoma dobru unakrsnu reaktivnost sa makaki CD16A (Tabela 4), uprkos činjenici da se makaki CD16A ECD sekvenca razlikuje u ukupno 16 aminokiselina od humanog CD16A (vidi poravnanje na slici 4).
[0174] Značaj tirozina (I) na poziciji 140 u CD16 ECD za CD16A-specifično prepoznavanje od strane naših antitela takođe je potvrđen korišćenjem rekombinantnih CHO ćelija sa transgenom ekspresijom različitih varijanti CD16 antigena na površini ćelije. ECD sekvence su ili fuzionisane sa transmembranskim domenom humanog EGFR (Wang et al., 2011, Blood 118(5)1255) ili usidren preko GPI koristeći humanu CD16B endogenu sekvencu sa propeptidnom sekvencom pune dužine za post-translacionu obradu i lipidaciju za GPI-sidrenje.
[0175] scFv antitelo koje sadrži varijabilne sekvence teškog i lakog lanca objavljenih CD16A-i CD16B-reaktivnih antitela 3G8 prepoznaje sve varijante CD16A i CD16B antigena eksprimirane na površini ćelije (Slika 3), ali ne i rekombinantni EGFR eksprimiran kao kontrolu specifičnosti. scFv antitela koja sadrže varijabilne sekvence teškog i lakog lanca "LSIV21" ili "P2C47" sa poboljšanim afinitetom prepoznaju varijante CD16A eksprimirane na površini CHO ćelije, ali ne i zreli ili propeptid koji sadrži ECD CD16B(NA1). Međutim, ako je histidin (H) na poziciji 140 u CD16B ECD usidrenom CHO membranom mutiran u tirozin (I) -aminokiselinu koja je prisutna na odgovarajućoj poziciji u CD16A - ovaj mutantni oblik CD16B (CD16BH140I) je bio dobro prepoznat od strane scFv antitela koji sadrže promenljive domene „LSIV21“ ili „P2C47“ (slika 3).
[0176] Varijante antigena CD16A i CD16BH140Y, ali ne i antigen CD16B, takođe se prepoznaju nakon SDS-PAGE i Western blota kada se uzorci tretiraju u neredukcionim uslovima, pomoću antitela koja sadrže "LSIV21", "P2C47" ili afinitetno zrele varijabilne domene (Slika 5), dok antitelo 3G8 prepoznaje sve varijante antigena CD16A i CD16B. Kada se uzorci redukuju pre stavljanja na SDS-PAGE gelove, na Western blotovima se ne dobijaju signali (podaci nisu prikazani), što sugeriše nelinearnu sekvencu, već trodimenzionalnu strukturu kao epitop vezivanja. U slučaju prepoznavanja od strane "LSIV21", "P2C47" ili afinitetno zrelih varijanti ovih antitela, trodimenzionalnu strukturu epitopa verovatno određuje tirozin na poziciji 140 CD16.
50
EC pad
phćihra u G uj
u vez
ibsti
nag no
ivired
.Venlj m
testu
Pro A -ra
ELIS
ovo u
odgane
mizir
al pra n nas naa
st) ige
oniant
(ag 16 Dlog C la
ante
oderij m vaev e
en kri
)ložob(4PL za kela
tetičgis anti
lo 16 e Darskti-Cet m an haraiti
roplič
vo raz
čet njaiva jemen vez ć eriš im ko eat Rez 3: a čunel .
izra
ism Tab
su Pr
[0177] Vezujuće mesto FcgRIII za IgG je diskontinuirana oblast vezivanja na proksimalnom ekstracelularnom domenu membrane receptora. Ključne aminokiseline za interakciju niskog afiniteta FcgRIIIA (CD16A) sa Fc delom IgG su prethodno identifikovane i opisane (npr. Ahmed et al., 2016). Ostaci u CD16A uključeni u interakciju sa CH2 domenom Fc delova su K120, Y132, H134, H135 i K161. Dok je objavljeno da antitelo 3G8 vezuje CD16A i CD16B i blokira vezivanje IgG (Tamm and Schmidt, 1996), nismo primetili blokiranje vezivanja naših anti-CD16 antitela za CD16A od strane IgG. Da bismo podržali hipotezu da se mesto vezivanja naših anti-CD16A specifičnih antitela razlikuje od mesta vezivanja IgG na FcgRIIIA, izvršili smo kompetitivni ELISA test. Dok je vezivanje 3G8 mAb za CD16A blokirano povećanjem koncentracija scFv antitela koje sadrži varijabilne domene 3G8, druga anti-CD16 scFv antitela ne blokiraju ili zamenjuju 3G8 mAb na CD16A i vezuju se nezavisno (Slika 6). Pošto je poznato da mesto vezivanja 3G8 blokira vezivanje IgG, zaključujemo da se mesto vezivanja naših anti-CD16 antitela razlikuje od mesta vezivanja IgG.
Analiza vezivanja u ELISA testu
[0178] ELISA ploče sa 96 bunarčića (Immuno MaxiSorp; Nunc) su obložene preko noći na 4°C rekombinantno proizvedenim fuzionim proteinima varijanti antigena CD16 ekstracelularnog domena (ECD) fuzionisanim sa humanim IgG1 Fc ili monomernim mFc.67 (Ying et al, 2012, J. Biol. Chem.) u 100 mM karbonat-bikarbonatnom puferu u koncentraciji od 1.5 ili 3 µg/mL. Nakon koraka blokiranja sa 3% (tež./v) obranog mleka u prahu (Merck) rastvorenog u PBS, serijska razblaženja različitih antitela u PBS koja sadrže 0.3% (tež./v) obranog mleka u prahu su inkubirana na pločama 1.5 h na sobnoj temperaturi. Nakon tri puta ispiranja sa 300 µL po bunarčiću PBS koji sadrži 0.1% (zapr/zapr) Tween 20, ploče su inkubirane sa antitelima za detekciju 1 h na sobnoj temperaturi. Za detekciju His-obeleženih analita, Penta-HIS-HRP (Qiagen) je korišćen u razblaženju 1:3000. Za detekciju tetravalentnog bispecifičnog BCMA/CD16 TandAb antitela, T763, korišćen je protein L-HRP konjugat (Pierce) u razblaženju 1:20000 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon tri puta ispiranja sa 300 µL po bunarčiću PBS koji sadrži 0.1% (zapr/zapr) Tween 20, ploče su inkubirane sa tetrametilbenzidin (TMB) supstratom (Seramun) sve dok razvoj boje nije bio jasno vidljiv. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µL po bunarčiću 0.5 M H2SO4. Apsorbanca je merena na 450 nm korišćenjem čitača ploča sa više oznaka (Victor, Perkin Elmer). Vrednosti apsorpcije su prikazane na grafikonu i analizirane korišćenjem nelinearne regresije, sigmoidalnog dozaodgovora (promenljivi nagib), aproksimacije najmanjih kvadrata (uobičajenog) sa GraphPad Prism verzijom 6.07 (GraphPad Software, La Jolla California USA).
Analiza vezivanja nakon SDS-PAGE i Western blota
[0179] Prečišćene rekombinantne varijante CD16 antigena (humani CD16A<48R>,<158V->mFc.67, humani CD16B(NA1)<pr>-mFc.67 i huCD16B(NA1)<pr>H140Y-mFc.67 su razblažene u PBS do 0.5 µg/mL, pomešane sa jednakom zapreminom neredukcionog pufera za uzorke i 8 µl mešavine je stavljeno u bunarčiće 4-20% Criterion TGX Precast Gels (Biorad). Gelovi su vođeni na 300V u 1x TGS puferu (Biorad) tokom 22 minuta, a ukupni protein je snimljen korišćenjem Biorad Molecular Imager Gel Documentation sistema. Protein je prenet Western blot-om na PVDF Midi membrane (Biorad) korišćenjem Trans-Blot Turbo sistema (Biorad). Membrane su inkubirane 30 minuta sa 3% (tež./v) obranog mleka u prahu (Merck) rastvorenom u TBS da bi se blokirala nespecifična mesta vezivanja, a zatim inkubirane sa primarnim razblaženjima antitela: anti-CD16 antitela su razblažena u TBS koji sadrži 3% (tež./v) obrano mleko u prahu do koncentracije od 4 µg/mL i inkubirano na membranama 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa TBST (TBS koji sadrži 0.1% (zapr/zapr) Tween 20) i dva puta sa TBS, membrane su inkubirane sa sekundarnim konjugatima za detekciju antitela: Membrane inkubirane sa anti-CD16A koja sadrže scFv-IgAb antitela su inkubirane sa proteinom HRP (Pierce), 1:10 000 razblažene u TBS koji sadrži 3% (tež./v) obranog mleka u prahu, membrane inkubirane sa anti-CD16 scFv antitelima su inkubirane sa anti-Penta-His-HRP (QIAGEN) 1:3000 razblaženim u TBS koji sadrži 3% (tež./v) obranog mleka u prahu, 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja sa TBST i dva puta sa TBS, kolorimetrijski razvoj je započet dodavanjem sveže pripremljene smeše od 0.66 mg/mL DAB, 0.02% CoCl2, 0.015% H2O2 u TBS i inkubirano na membranama dok se ne razvije boja. Reakcija je zaustavljena pranjem membrana u vodi. Membrane su osušene i fotografisane.
CD16A kompetitivna ELISA
[0180] ELISA ploče sa 96 bunarčića (Immuno MaxiSorp; Nunc) su obložene preko noći na 4°C sa rekombinantno proizvedenim fuzionim proteinima CD16A(48R, 158V) ECD fuzionisanim sa monomernim mFc.67 (Ying et al, 2012, J. Biol. Chem.) u 100 mM karbonat-bikarbonatnom puferu u koncentraciji od 1.5 µg/mL. Nakon koraka blokiranja sa 3% (tež./v) obranog mleka u prahu (Merck) rastvorenog u PBS, serijska razblaženja različitih scFv-antitela u PBS koja sadrži 0.3% (tež./v) obranog mleka u prahu su pomešana sa 1 nM anti-CD16 mAb 3G8 (BD Bioscience) i koinkubirana na pločama 1.5 h na sobnoj temperaturi. Nakon tri puta ispiranja sa 300 µL po bunarčiću PBS koji sadrži 0.1% (zapr/zapr) Tween 20, ploče su inkubirane sa antitelima za detekciju 1 h na sobnoj temperaturi. Za detekciju 3G8 vezanog za CD16A, korišćen je kozji antimišji IgG(H+L)-HRPO (Dianova 115-035-003) u razblaženju 1:10 000. Nakon tri puta ispiranja sa 300 µL po bunarčiću PBS koji sadrži 0.1% (zapr/zapr) Tween 20, ploče su inkubirane sa tetrametilbenzidin (TMB) supstratom (Seramun) sve dok razvoj boje nije bio jasno vidljiv. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µL po bunarčiću 0.5 M H2SO4. Apsorbanca je merena na 450 nm korišćenjem čitača ploča sa više oznaka (Victor, Perkin Elmer). Vrednosti apsorpcije su prikazane na grafikonu i analizirane korišćenjem nelinearne regresije, sigmoidalnog doza-odgovora (promenljivi nagib), aproksimacije najmanjih kvadrata (uobičajenih) sa GraphPad Prism verzijom 6.07 (GraphPad Software, La Jolla California USA).
Primer 3: Vezivanje anti-CD16A scFv za primarne humane NK ćelije na 37°C u prisustvu ili odsustvu 10 mg/mL poliklonskog humanog IgG
Postupci:
Izolacija PBMC iz „buffy coats“ i obogaćivanje humanih NK ćelija
[0181] PBMC su izolovane iz „buffy coats“ (German Red Cross, Mannheim, Germany) centrifugiranjem u gradijentu gustine. Uzorci „buffy coat“ su razblaženi sa dva do tri puta zapreminom PBS (Invitrogen, kat.: 14190-169), naneti na jastuk od Lymphoprep (Stem Cell Technologies, kat.: 07861) i centrifugirani na 800 × g tokom 25 min na sobnoj temperaturi bez kočnice. PBMC locirane u interfejsu su sakupljene i isprane 3 puta sa PBS pre nego što su kultivisane u kompletnom medijumu RPMI 1640 (RPMI 1640 medijum je dopunjen 10% toplotno inaktiviranim FCS, 2 mM L-glutamina i 100 IU/mL penicilin G natrijuma i 100 µg/mL streptomicin sulfata (sve komponente iz Invitrogen) preko noći bez stimulacije Za obogaćivanje NK ćelija, PBMC su sakupljene iz kultura preko noći i korišćene za jedan krug negativne selekcije korišćenjem EasySep<™>kompleta za obogaćivanje humanih NK ćelija (Stem Cell Technologies, kat.: 19955) za imunomagnetnu izolaciju netaknutih humanih NK ćelija i Big Easy EasySep<™>Magnet (Stem Cell Technologies, kat.: 18001) prema uputstvima proizvođača.
Testovi vezivanja ćelija i protočne citometrijske analize
[0182] Alikvote 0.2-1 × 106 obogaćenih humanih NK ćelija su inkubirane sa 100 µL serijskih razblaženja naznačenih scFv konstrukata u FACS puferu (PBS, Invitrogen, kat.: 14190-169) koji sadrži 2% toplotno inaktiviranog FCS (Invitrogen, kat.: 10270-106), 0.1% natrijum azida (Roth, Karlsruhe, Germany, kat.: A1430.0100) u prisustvu 10 mg/mL poliklonskog humanog IgG (Gammanorm, Octapharma) ili odgovarajućeg pufera 45 min na 37°C. Nakon ponovljenog ispiranja sa FACS puferom, antitela vezana za ćelije su detektovana sa 10 µg/mL anti-His mAb 13/45/31-2 (Dianova, Hamburg, Germany, kat.: DIA910-1MG) zatim sa 15 µg/mL FITC -konjugovanog kozjeg anti-mišjeg IgG (Dianova, kat.: 115-095-062). Posle poslednjeg koraka bojenja, ćelije su ponovo isprane i resuspendovane u 0.2 mL FACS pufera koji sadrži 2 µg/mL propidijum jodida (PI) (Sigma, kat.: P4170) da bi se isključile mrtve ćelije. Fluorescencija 2-5 × 103 živih ćelija je merena korišćenjem Millipore Guava EasyCyte protočnog citometra (Merck Millipore, Schwalbach, Germany) ili CytoFlex citometra (Beckman Coulter, Krefeld, Germany) i određen je srednji intenzitet fluorescencije uzoraka ćelija. Nakon oduzimanja vrednosti intenziteta fluorescencije ćelija obojenih samo sekundarnim i tercijarnim reagensima, vrednosti su korišćene za analizu nelinearne regresije korišćenjem softvera GraphPad Prism (GraphPad Prism verzija 7.04 za Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA). Za izračunavanje KD korišćena je jednačina za vezivanje na jednom mestu (hiperbola).
Rezultati
[0183] Anti-CD16 scFv koji sadrži humane Fv domene iz klona CD16-1, scFv koji sadrži humane anti-CD16 Fv domene iz klona CD16-2, i scFv_3G8, koji sadrži mišje Fv domene iz mAb 3G8, titrirani su na primarnim humanim NK ćelijama na 37°C u prisustvu ili odsustvu 10 mg/mL poliklonskog humanog IgG. Odgovarajući rezultati su prikazani na slici 7.
Primer 4: Procena citotoksičnosti posredovane antitelom od strane NK ćelija nakon prethodnog punjenja anti-EpCAM i anti-CD30 antitelima i zamrzavanja/odmrzavanja
Postupci:
[0184]
Tabela 4: Konstrukti antitela
Kultura ćelijskih linija
[0185] COLO 205 (ljubazno obezbedio Dr. G. Moldenhauer, German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany) i ćelije KARPAS-299 (DSMZ, kat.: ACC31) su kultivisane u medijumu RPMI 1640 sa dodatkom 10% toplotno inaktiviranog FCS, 2 mM L-glutamina i 100 IU/mL penicilin G natrijuma i 100 µg/mL streptomicin sulfata. Sve ćelijske linije su kultivisane u standardnim uslovima i subkultivisane prema preporukama dobavljača na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2.
Izolacija PBMC iz „buffy coats“ i obogaćivanje humanih NK ćelija
[0186] PBMC su izolovane iz „buffy coats“ (German Red Cross, Mannheim, Germany) centrifugiranjem u gradijentu gustine. Uzorci „buffy coat“ su razblaženi sa dva do tri puta većom zapreminom PBS (Invitrogen, kat.: 14190-169), naneti na jastuk od Lymphoprep (Stem Cell Technologies, kat.: 07861) i centrifugirani na 800 × g za 25 min na sobnoj temperaturi bez kočnice. PBMC koji se nalaze u interfejsu su sakupljene i isprane 3 puta sa PBS pre nego što su kultivisane u kompletnom medijumu RPMI 1640 (RPMI 1640 medijum je dopunjen 10% toplotno inaktiviranim FCS, 2 mM L-glutamina i 100 IU/mL penicilin G natrijuma i 100 µg /mL streptomicin sulfata (sve komponente kompanije Invitrogen)) preko noći bez stimulacije. Za obogaćivanje NK ćelija, PBMC su sakupljene iz kultura preko noći i korišćene za jedan krug negativne selekcije korišćenjem EasySep<™>kompleta za obogaćivanje humanih NK ćelija (Stem Cell Technologies, kat.: 17055) za imunomagnetnu izolaciju netaknutih humanih NK ćelija i Big Easy EasySep<™>Magnet (Stem Cell Technologies, kat.: 18001) prema uputstvima proizvođača.
Prethodno punjenje NK ćelija i zamrzavanje/odmrzavanje
[0187] Alikvote obogaćenih primarnih humanih NK ćelija su resuspendovane u kompletnom medijumu RPMI 1640 koji sadrži 10 µg/mL navedenih konstrukata antitela u ukupnoj zapremini od 0.5 mL i inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon dodavanja 0.5 mL FCS dopunjenog sa 20% DMSO (Sigma) suspenzije ćelija su zatim prebačene u 2 mL krio epruvete (Greiner bio-one) i zamrznute na -80°C u posudi za zamrzavanje od 1°C (Nalgene) tokom više od 12 h.
4 h testovi citotoksičnosti oslobađanja kalceina
[0188] Za testove citotoksičnosti oslobađanja kalceina, naznačene ciljne ćelije su sakupljene iz kultura, isprane medijumom RPMI 1640 bez FCS i obeležene sa 10 µM kalceina AM (Invitrogen/Molecular Probes, kat.: C3100MP) tokom 30 minuta u RPMI medijumu bez FCS na 37°C. Nakon blagog ispiranja, obeležene ćelije su resuspendovane u kompletnom medijumu RPMI 1640 do gustine 1×10<5>/mL i alikvote od 1×10<4>ciljne ćelije su zatim zasejane u pojedinačne bunarčiće mikro ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Paralelno, NK ćelije su odmrznute od -80°C inkubacijom krio epruveta u vodenom kupatilu na 37°C. Kada su poslednji kristali leda bili vidljivi, suspenzija ćelija je razblažena kompletnim RPMI 1640 medijumom, centrifugirana i isprana jednom pre nego što su ćelije dodate ciljnim ćelijama u naznačenom odnosu efektornih-prema-ciljnim (E:T) sa ili bez dodavanja svežeg antitela kao što je naznačeno u ukupnoj zapremini od 200 µL u duplikatu. Spontano oslobađanje je određeno inkubacijom ciljnih ćelija u odsustvu efektorskih ćelija i bez antitela, a maksimalno oslobađanje je indukovano dodatkom 1% Triton x-100 (konačna koncentracija, Roth) i takođe je mereno u četiri primerka na svakoj ploči.
[0189] Nakon centrifugiranja od 2 minuta na 200 g, test je inkubiran 4 h na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2.100 µL supernatanta ćelijske kulture je sakupljeno iz svakog bunarčića nakon dodatnog centrifugiranja tokom 5 minuta na 500 g, a fluorescencija oslobođenog kalceina je izmerena na 520 nm korišćenjem fluorescentnog čitača više ploča (Victor 3 ili EnSight, Perkin Elmer). Na osnovu izmerenog broja, specifična liza ćelija je izračunata prema sledećoj formuli: [fluorescencija (uzorak) - fluorescencija (spontana)] / [fluorescencija (maksimalna) - fluorescencija (spontana)] × 100%. Fluorescencija (spontana) predstavlja broj fluorescencije iz ciljnih ćelija u odsustvu efektorskih ćelija i antitela, a fluorescencija (maksimalna) predstavlja ukupnu ćelijsku lizu indukovanu dodatkom Tritona X-100. Vrednosti lize su analizirane i srednja vrednost i standardna devijacija su prikazani na grafikonu upotrebom softvera GraphPad Prism (GraphPad Prism verzija 7.04 za Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA).
Rezultati:
[0190] Primarne humane NK ćelije koje su prethodno napunjene konstruktima anti-EpCAM antitela, kao što su EpCAM/NKp46 scFv-lgAb_73, EpCAM/NKG2D scFv-lgAb_75, EpCAM/CD16A scFv-lgAb_80 i IgG anti-EpCAM indukovale su specifičnu lizu EpCAM-pozitivnih COLO 205 ćelija, ali ne i EpCAM-negativnih KARPAS-299 ćelija. Među bispecifičnim anti-EpCAM konstruktima, NK ćelije sa prethodno napunjenim EpCAM/CD16A scFv-lgAb_80 pokazale su najveću efikasnost u COLO 205 ćelijskoj lizi, a NK ćelije napunjene EpCAM/NKG2D scFv-lgAb_75 najnižu. Nijedan od preparata NK ćelija prethodno napunjenih konstruktima anti-CD30 antitela nije posredovao u značajnoj lizi COLO 205 (Slika 8A i Tabela 5).
[0191] Nasuprot tome, NK ćelije koje su prethodno napunjene CD30/CD16A TandAb ili Fcpojačanim IgG anti-CD30 posredovale su lizu CD30-pozitivnih KARPAS-299 ćelija, ali ne i CD30-negativnih COLO 205 ćelija. NK ćelije prethodno napunjene divljim tipom IgG anti-CD30 nisu posredovale u lizi KARPAS-299, što sugeriše da se ovaj divlji tip IgG anti-CD30 prebrzo odvojio od NK ćelija tokom zamrzavanja, odmrzavanja i pranja, i da je broj preostalih IgG bio suviše nizak da bi posredovao značajna liza ciljnih ćelija (slika 8B i tabela 5).
[0192] Interesantno, NK ćelije koje su prethodno napunjene sa 10 µg/mL EpCAM/NKG2D scFv-lgAb_75 ili CD30/CD16A TandAb, zamrznute, odmrznute i oprane, izazvale su sličnu lizu COLO 205 ili KARPAS-299 ćelija, respektivno. Jer NK ćelije koje nisu bile prethodno napunjene, ali su dopunjene u testu citotoksičnosti sa 10 µg/mL svežeg EpCAM/NKG2D scFvlgAb_75 ili CD30/CD16A TandAb.
Tabela 5: Efikasnost lize ciljnih ćelija pomoću prethodno napunjenih i zamrznutih NK ćelija u E:T odnosu 5:1. NK ćelije su prethodno napunjene sa 10 µg/mL navedenih konstrukata antitela ili bez antitela (bez antitela) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim zamrznute na -80°C. Odmrznute NK ćelije su isprane i korišćene kao efektorske ćelije u 4 h testu citotoksičnosti oslobađanja kalceina na COLO 205 ili KARPAS-299 ciljnim ćelijama. Kao kontrola, EpCAM/NKG2D scFv-lgAb_75 i CD30/CD16A T116 su sveže dodati u koncentraciji od 10 µg/mL u NK ćelije koje nisu bile prethodno napunjene pre zamrzavanja (bez antitela). Prikazane su srednje vrednosti duplih vrednosti lize u E:T odnosu 5:1. Eksp. br. RBL 1464.

Claims (20)

Patentni zahtevi
1. Izolovane humane NK ćelije u krioprezerviranom stanju, prethodno napunjene konstruktom antitela pre zamrzavanja, pri čemu konstrukt antitela sadrži najmanje prvi vezujući domen koji se vezuje za antigen receptora NK ćelije na površini ćelije imunološke efektorske ćelije, pri čemu navedeni prvi vezujući domen sadrži tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca, i drugi vezujući domen koji se vezuje za antigen ćelijske površine na ćelijskoj površini ciljne ćelije.
2. Izolovane humane NK ćelije prema patentnom zahtevu 1, naznačene time što su NK ćelije izolovane iz tkiva pupčane vrpce ili placente, iPSC ili PBMC od zdravih donora.
3. Izolovane humane NK ćelije prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačene time što su NK ćelije konzervisane u krio rastvoru.
4. Izolovane humane NK ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačene time što su NK ćelije prethodno napunjene u rastvoru koji sadrži konstrukt antitela u koncentraciji od najmanje 5 nM.
5. Izolovane humane NK ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačene time što je antigen receptora NK ćelija za koji se vezuje prvi vezujući domen konstrukta antitela izabran iz grupe koja se sastoji od CD16a, CD16b, NKp46, NKG2D i CD16a CD16b.
6. Izolovane humane NK ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačene time što je antigen ćelijske površine na ćelijskoj površini ciljne ćelije za koju se vezuje drugi vezujući domen konstrukta antitela izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, EGFRvIII, HER2 i GD2.
7. Izolovane humane NK ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačene time što konstrukt antitela sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za CD16a i drugi vezujući domen koji se vezuje za antigen izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD30, CD33 , CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, EGFRvIII HER2 i GD2.
8. Izolovane humane NK ćelije prema patentnom zahtevu 7, naznačene time što konstrukt antitela sadrži u prvom vezujućem domenu tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca izabrana iz grupe koja se sastoji od:
(a) CDR-H1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 29, CDR-H2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 30, CDR-H3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 31, CDR-L1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 32, CDR-L2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 33, CDR-L3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 34;
(b) CDR-H1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 40, CDR-H2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 41, CDR-H3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 42, CDR-L1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 43, CDR-L2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 44, CDR-L3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 45;
(c) CDR-H1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 51, CDR-H2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 52, CDR-H3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 53, CDR-L1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 54, CDR-L2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 55, CDR-L3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 56;
(d) CDR-H1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 62, CDR-H2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 63, CDR-H3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 64, CDR-L1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 65, CDR-L2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 66, CDR-L3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 67;
(e) CDR-H1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 73, CDR-H2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 74, CDR-H3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 75, CDR-L1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 76, CDR-L2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 77, CDR-L3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 78;
(f) CDR-H1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 84, CDR-H2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 85, CDR-H3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 86, CDR-L1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 87, CDR-L2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 88, CDR-L3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 89; i
(g) CDR-H1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 95, CDR-H2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 96, CDR-H3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 97, CDR-L1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 98, CDR-L2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 99, CDR-L3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 100.
9. Izolovane humane NK ćelije prema patentnom zahtevu 8, naznačene time što konstrukt sadrži u prvom vezujućem domenu parove VH- i VL-lanaca koji imaju sekvencu kao što je prikazana u parovima sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35 i SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68 i SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79 i SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90 i SEQ ID NO: 91, i SEQ ID NO: 101 i SEQ ID NO: 102.
10. Izolovane humane NK ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 9, naznačene time što konstrukt antitela sadrži u drugom vezujućem domenu tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca izabrana iz grupe koja se sastoji od:
(a) CDR-H1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 106, CDR-H2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 107, CDR-H3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 108, CDR-L1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 109, CDR-L2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 110, CDR-L3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 111;
(b) CDR-H1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 128, CDR-H2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 129, CDR-H3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 130, CDR-L1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 131, CDR-L2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 132, CDR-L3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 133; i
(c) CDR-H1 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 117, CDR-H2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 118, CDR-H3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 119, CDR-L1 kao što je prikazan u SEQ ID BR: 120, CDR-L2 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 121, CDR-L3 kao što je prikazan u SEQ ID NO: 122.
11. Izolovane humane NK ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 10, naznačen time što konstrukt antitela sadrži u drugom vezujućem domenu parove VH- i VL-lanaca koji imaju sekvencu kako je prikazana u parovima sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 112 i SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 123 i SEQ ID NO: 124 i SEQ ID NO: 134 i SEQ ID NO: 135.
12. Izolovane humane NK ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 11, naznačena time što konstrukt antitela sadrži proteinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NOs: 161-171.
13. Postupak za pripremu krioprezerviranih unapred napunjenih humanih NK ćelija, naznačen time što postupak sadrži
(i) inkubiranje NK ćelija sa konstruktom antitela, pri čemu konstrukt antitela sadrži najmanje prvi vezujući domen koji se vezuje za antigen receptora NK ćelije na ćelijskoj površini imunološke efektorske ćelije, pri čemu navedeni prvi vezujući domen sadrži tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca, i drugi vezujući domen koji se vezuje za antigen ćelijske površine na ćelijskoj površini ciljne ćelije; i
(ii) zamrzavanje NK ćelija.
14. Postupak prema patentnim zahtevima 13, naznačen time što su NK ćelije izolovane iz tkiva pupčane vrpce, iPSC ili PBMC od zdravih donora.
15. Postupak prema patentnim zahtevima 13 i 14, naznačen time što su NK ćelije prethodno napunjene u rastvor koji sadrži konstrukt antitela u koncentraciji od najmanje 5 nM.
16. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 15, naznačen time što je antigen receptora NK ćelija za koji se vezuje prvi vezujući domen konstrukta antitela izabran iz grupe koja se sastoji od CD16a, CD16b, NKp46, NKG2D i CD16a CD16b.
17. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 16, naznačen time što antigen ćelijske površine na ćelijskoj površini ciljne ćelije za koji se veže drugi vezujući domen konstrukta antitela je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD22, CD30, CD33 , CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, HER2, GD2.
18. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 17, naznačen time što se korak zamrzavanja NK ćelija izvodi upotrebom medijuma za zamrzavanje koji sadrži najmanje medijum za kulturu bazalnih ćelija i krioprotektivni agens.
19. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 18, naznačen time što konstrukt antitela sadrži proteinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NOs: 161-171.
20. Postupak za rekonstituciju/pripremu vijabilnih unapred napunjenih humanih NK ćelija za primenu na subjekta kome je to potrebno, pri čemu postupak sadrži korak
(a) odmrzavanja krioprezerviranih NK ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12; ili (b) odmrzavanje krioprezerviranih NK ćelija pripremljenih postupkom prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 19.
RS20240687A 2018-08-27 2019-08-26 Kriokonzervirane nk ćelije prethodno punjene konstruktom antitela RS65658B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18191031 2018-08-27
EP19769715.4A EP3843757B1 (en) 2018-08-27 2019-08-26 Cryopreserved nk cells preloaded with an antibody construct
PCT/EP2019/072727 WO2020043670A1 (en) 2018-08-27 2019-08-26 Cryopreserved nk cells preloaded with an antibody construct

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65658B1 true RS65658B1 (sr) 2024-07-31

Family

ID=63578929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240687A RS65658B1 (sr) 2018-08-27 2019-08-26 Kriokonzervirane nk ćelije prethodno punjene konstruktom antitela

Country Status (24)

Country Link
US (1) US20210169936A1 (sr)
EP (2) EP3843757B1 (sr)
JP (2) JP2021534779A (sr)
KR (1) KR102967012B1 (sr)
CN (1) CN112789050A (sr)
AU (1) AU2019327155A1 (sr)
BR (1) BR112021003436A2 (sr)
CA (1) CA3109732A1 (sr)
DK (1) DK3843757T3 (sr)
ES (1) ES2980115T3 (sr)
FI (1) FI3843757T3 (sr)
HR (1) HRP20240821T1 (sr)
HU (1) HUE066774T2 (sr)
IL (1) IL281007A (sr)
LT (1) LT3843757T (sr)
MX (1) MX2021002332A (sr)
PL (1) PL3843757T3 (sr)
PT (1) PT3843757T (sr)
RS (1) RS65658B1 (sr)
SG (1) SG11202101708PA (sr)
SI (1) SI3843757T1 (sr)
SM (1) SMT202400256T1 (sr)
WO (1) WO2020043670A1 (sr)
ZA (1) ZA202101008B (sr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019165121A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for activation and expansion of natural killer cells and uses therof
US20220265716A1 (en) * 2019-07-26 2022-08-25 Nantkwest, Inc. Antibody pre-loaded cd16+nk-92 cells as an effective therapeutic product for tumor lysis
EP4225792A1 (en) * 2020-10-08 2023-08-16 Affimed GmbH Trispecific binders
CN114437205A (zh) * 2020-11-05 2022-05-06 多玛医药科技(苏州)有限公司 抗冠状病毒抗体及其应用
KR20230128488A (ko) * 2020-12-17 2023-09-05 아스가르드 테라퓨틱스 아베 세포 재프로그래밍을 위한 조성물, 작제물 및 벡터
WO2022173737A1 (en) * 2021-02-09 2022-08-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for freezing and thawing mammalian cells
AU2022246607A1 (en) * 2021-03-31 2023-11-16 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for immune effector cells redirection
EP4319814A4 (en) * 2021-04-08 2025-03-26 Board of Regents, The University of Texas System Methods for activation and expansion of natural killer cells and combinations with bispecific antibodies
JP2024529381A (ja) 2021-07-30 2024-08-06 アフィメド ゲーエムベーハー デュプレックスボディ
WO2023079493A1 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Affimed Gmbh Bispecific cd16a binders
TW202334221A (zh) * 2021-11-03 2023-09-01 德商安富美德有限公司 雙特異性cd16a結合劑
EP4426350A4 (en) * 2021-11-04 2025-09-24 Artiva Biotherapeutics Inc Treatment of cancer with nk cells and multispecific engagers
EP4504222A4 (en) * 2022-04-07 2026-04-15 Univ Texas METHODS FOR ACTIVATING AND EXPANDING MODIFIED NATURAL KILLER CELLS AND COMBINATIONS WITH ANTIBODIES
CN118994409B (zh) * 2024-07-30 2025-07-22 郑州市乘黄生物医药科技有限公司 结合CD16A和Trop2的双特异性抗体-NK细胞偶联物及其用途
CN118791616A (zh) * 2024-09-14 2024-10-18 苏州为度生物技术有限公司天津分公司 一种抗人cd16工程抗体及应用
WO2026087751A1 (en) 2024-10-24 2026-04-30 Affimed Gmbh Combination of immune cell engager and nk cell products
EP4751731A1 (en) 2024-11-29 2026-06-03 Affimed GmbH Combination of a bispecific antibody construct, an immune checkpoint inhibitor and a taxane
EP4751777A1 (en) 2024-11-29 2026-06-03 Affimed GmbH Combination of a bispecific antibody construct, an immune checkpoint inhibitor and a vegfr-2 inhibitor
EP4751734A1 (en) 2024-11-29 2026-06-03 Affimed GmbH Bispecific antibody construct dosage regimen for treating nsclc

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
EP0320015B1 (en) 1987-12-09 1994-07-20 Omron Tateisi Electronics Co. Inductive data communicating apparatus
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2090473A1 (en) 1990-08-29 1992-03-01 Robert M. Kay Homologous recombinatin in mammalian cells
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
WO1994000569A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
EP0773288A3 (en) 1995-08-29 1997-07-09 Kirin Brewery Chimera animal and its method of manufacture
EP1972194A1 (en) 1996-12-03 2008-09-24 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US7254167B2 (en) 1998-10-30 2007-08-07 Broadcom Corporation Constellation-multiplexed transmitter and receiver
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
US7230167B2 (en) 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
ES2645563T3 (es) 2001-11-30 2017-12-05 Amgen Fremont Inc. Animales transgénicos que portan genes de cadena ligera de Ig humana
US8486859B2 (en) 2002-05-15 2013-07-16 Bioenergy, Inc. Use of ribose to enhance plant growth
US7904068B2 (en) 2003-06-06 2011-03-08 At&T Intellectual Property I, L.P. System and method for providing integrated voice and data services utilizing wired cordless access with unlicensed spectrum and wired access with licensed spectrum
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
EP1703348B1 (en) 2005-03-14 2010-10-13 Omron Corporation Programmable controller system
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
US8234145B2 (en) 2005-07-12 2012-07-31 International Business Machines Corporation Automatic computation of validation metrics for global logistics processes
JP2007122396A (ja) 2005-10-27 2007-05-17 Hitachi Ltd ディスクアレイ装置及びその障害対応検証方法
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
US7574748B2 (en) 2006-03-07 2009-08-18 Nike, Inc. Glove with support system
US8430938B1 (en) 2006-07-13 2013-04-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Control algorithm for autothermal reformer
KR101146588B1 (ko) 2006-08-11 2012-05-16 삼성전자주식회사 Ｆｉｎ 구조체 및 이를 이용한 핀 트랜지스터의 제조방법
CN100589507C (zh) 2006-10-30 2010-02-10 华为技术有限公司 一种拨号提示系统及方法
US7466008B2 (en) 2007-03-13 2008-12-16 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. BiCMOS performance enhancement by mechanical uniaxial strain and methods of manufacture
JP2010220479A (ja) * 2007-06-15 2010-10-07 Medeinetto:Kk Ｎｋ細胞の培養方法及びｎｋ細胞の利用
US8209741B2 (en) 2007-09-17 2012-06-26 Microsoft Corporation Human performance in human interactive proofs using partial credit
US8464584B2 (en) 2007-10-19 2013-06-18 Food Equipment Technologies Company, Inc. Beverage dispenser with level measuring apparatus and display
DE102008057648A1 (de) 2007-11-29 2009-06-04 Luk Lamellen Und Kupplungsbau Beteiligungs Kg Kraftübertragungsvorrichtung, insbesondere zur Leistungsübertragung zwischen einer Antriebsmaschine und einem Abtrieb
US8376279B2 (en) 2008-01-23 2013-02-19 Aurora Flight Sciences Corporation Inflatable folding wings for a very high altitude aircraft
EP2404668B1 (en) 2009-03-04 2014-05-07 Nissan Motor Co., Ltd. Exhaust gas purification catalyst and process for producing same
US8463191B2 (en) 2009-04-02 2013-06-11 Qualcomm Incorporated Beamforming options with partial channel knowledge
CN102575230A (zh) 2009-07-10 2012-07-11 马克·洛戴尔 活化的nk细胞的经保存的组合物及其使用方法
WO2011030851A1 (ja) 2009-09-11 2011-03-17 タカラバイオ株式会社 ナチュラルキラー細胞の製造方法
US20140200511A1 (en) * 2009-10-30 2014-07-17 Searete Llc Systems, devices, and methods for making or administering frozen particles
IT1396539B1 (it) * 2009-11-26 2012-12-14 Qs Group S P A Procedimento e attrezzatura per la realizzazione di un cesto espanso per lavabiancheria, lavasciuga ed asciugatore.
JP5766619B2 (ja) 2010-02-08 2015-08-19 株式会社日本バイオセラピー研究所 Ｎｋ細胞強化型血液製剤の製造方法
EP2658739B1 (de) 2010-12-30 2017-02-22 Johnson Controls Metals and Mechanisms GmbH & Co. KG Längsverstellvorrichtung eines kraftfahrzeugsitzes mit zwei schienenpaaren
TWI679212B (zh) * 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
WO2013163171A1 (en) 2012-04-24 2013-10-31 Kaufman Dan S Method for developing natural killer cells from stem cells
EP3114215B1 (en) 2014-03-07 2021-04-14 Emercell SAS Pooled nk cells from ombilical cord blood and their uses for the treatment of cancer and chronic infectious disease
EP2930188A1 (en) 2014-04-13 2015-10-14 Affimed Therapeutics AG Trifunctional antigen-binding molecule
US10105142B2 (en) 2014-09-18 2018-10-23 Ethicon Llc Surgical stapler with plurality of cutting elements
CA2983706C (en) * 2015-05-04 2024-01-02 Affimed Gmbh Combination of a cd30xcd16 antibody with a pd-1 antagonist for therapy
KR101851270B1 (ko) 2015-07-10 2018-04-25 고려대학교 산학협력단 자연 살해세포의 대량증식 방법 및 배양용 조성물
WO2017042393A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Emercell Sas Pooled nk cells from umbilical cord blood associated with antibodies and their uses for the treatment of disease
EP3156417A1 (en) 2015-10-13 2017-04-19 Affimed GmbH Multivalent fv antibodies
CN109715196A (zh) * 2016-06-13 2019-05-03 转矩医疗股份有限公司 用于促进免疫细胞功能的组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021534779A (ja) 2021-12-16
MX2021002332A (es) 2021-08-11
KR102967012B1 (ko) 2026-05-21
DK3843757T3 (da) 2024-06-10
EP4431597A2 (en) 2024-09-18
EP3843757A1 (en) 2021-07-07
KR20210052494A (ko) 2021-05-10
WO2020043670A1 (en) 2020-03-05
LT3843757T (lt) 2024-07-10
EP3843757B1 (en) 2024-04-24
FI3843757T3 (fi) 2024-06-06
AU2019327155A1 (en) 2021-03-18
US20210169936A1 (en) 2021-06-10
PL3843757T3 (pl) 2024-08-05
EP4431597A3 (en) 2025-03-05
SG11202101708PA (en) 2021-03-30
SI3843757T1 (sl) 2024-08-30
JP2024081678A (ja) 2024-06-18
BR112021003436A2 (pt) 2021-05-18
ES2980115T3 (es) 2024-09-30
PT3843757T (pt) 2024-07-08
ZA202101008B (en) 2021-09-29
HRP20240821T1 (hr) 2024-09-27
CN112789050A (zh) 2021-05-11
IL281007A (en) 2021-04-29
CA3109732A1 (en) 2020-03-05
HUE066774T2 (hu) 2024-09-28
SMT202400256T1 (it) 2024-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3843757B1 (en) Cryopreserved nk cells preloaded with an antibody construct
CN112512581B (zh) 针对cldn18.2和cd3的抗体构建体
EP4039709A1 (en) Bcma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
US20230365709A1 (en) Trispecific binders
KR20180030852A (ko) Flt3 및 cd3을 위한 항체 작제물
AU2018394255A1 (en) Bispecific antibody construct directed to MUC17 and CD3
JP2023547662A (ja) Ｃｌｄｎ６及びｃｄ３に選択的に結合するポリペプチド構築物
WO2019219765A1 (en) Antibodies targeting glycoprotein vi
US20240376208A1 (en) Duplexbodies
RU2819927C2 (ru) Криоконсервированные клетки-естественные киллеры, предварительно нагруженные конструкцией антитела
HK40042149A (en) Cryopreserved nk cells preloaded with an antibody construct
CA3107192C (en) Antibody constructs for cldn18.2 and cd3
HK40077212A (en) Bcma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs