ES2299623T3

ES2299623T3 - Agentes de lavado y de limpieza con alfa-amilasas hibridas.

Info

Publication number: ES2299623T3
Application number: ES02794523T
Authority: ES
Inventors: Beatrix Kottwitz; Roland Breves; Karl-Heinz Maurer
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2001-08-07
Filing date: 2002-07-27
Publication date: 2008-06-01
Anticipated expiration: 2022-07-27
Also published as: DE10138753B4; WO2003014358A2; DE10138753A1; JP2005527640A; US20050049165A1; DK1414977T3; EP1414977B1; DE50211470D1; WO2003014358A3; ATE382700T1; EP1414977A2; CN1541272A

Abstract

Agente de lavado o de limpieza, caracterizado porque contiene una proteína híbrida amilolítica, estando constituida la proteína híbrida por aquella es idéntica a la AL76 (SEQ ID NO. 8) al menos en un 98%, de manera preferente en un 99%, de manera especialmente preferente en un 100%.

Description

Agentes de lavado y de limpieza con \alpha-amilasas híbridas.

La presente invención se refiere a agentes de lavado y de limpieza con \alpha-amilasas híbridas, que se derivan de las \alpha-amilasas de las especies bacterianas Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus licheniformis, a procedimientos para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras con participación de tales proteínas o de agentes correspondientes y al empleo de tales proteínas o de los agentes correspondientes para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras. La invención se refiere, además, a un procedimiento para mejorar los agentes de lavado y de limpieza en cuanto a su rendimiento, formándose amilasas híbridas de las \alpha-amilasas de las especies bacterianas B. amyloliquefaciens y B. licheniformis y añadiéndolas a los agentes correspondientes.

Las \alpha-amilasas (E.C. 3.2.1.1) hidrolizan los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos, internos, de los almidones y de los polímeros similares a los almidones tales como la amilosa, la amilopectina o el glicógeno, con formación de dextrinas y de oligosacáridos \beta-1,6-ramificados. Éstas pertenecen a los enzimas absolutamente más importantes, utilizados en la industria. Esto se debe a dos motivos: por un lado, a que son desprendidos en el medio circundante por microorganismos de tal manera, que pueden ser obtenidos a escala industrial por medio de la fermentación y de la purificación a partir del medio de cultivo con un coste comparativamente bajo. Por otro lado las amilasas son necesarias para un amplio espectro de aplicaciones.

Un empleo industrial importante de la \alpha-amilasa consiste en su aplicación como componentes activos en los agentes de lavado y de limpieza. Su contribución al rendimiento de lavado y respectivamente de limpieza del agente correspondiente consiste en la degradación de las suciedades que contienen almidón. Los productos de hidrólisis son atacados, disueltos, emulsionados o suspendidos por los componentes restantes de los agentes de lavado o de limpieza o son separados por flotación debido a su mayor solubilidad en el baño de lavado de tal manera, que se producen efectos sinérgicos en el caso más favorable entre el enzima y los componentes restantes de estos agentes.

Existe una búsqueda intensa de \alpha-amilasa a partir de fuentes naturales, que puedan ser adecuadas para el empleo en los agentes de lavado y de limpieza. Se han identificado enzimas disociadores de los almidones, por ejemplo a partir de Pimelobacter, Pseudomonas y Thermus para la fabricación de artículos comestibles, productos cosméticos y productos farmacéuticos (EP 636693), así como a partir de Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium y Micrococcus (EP 628630), a partir de Pyrococcus (WO 94/19454) y Sulfolobus para la licuación de los almidones a elevadas temperaturas, o bien a condiciones de la reacción fuertemente ácidas (EP 727485 y WO 96/02633). Se han encontrado amilasas a partir de Bacillus sp. (WO 95/26397 y WO 97/00324) para el empleo a valores alcalinos del pH. Otras amilasas procedentes de diversos Bacilli (EP 670367) son adecuadas para el empleo en los agentes de lavado o de limpieza debido a su baja sensibilidad frente a los detergentes. Y la amilasa procedente de Thermoalcalibacter (WO 98/13481) es ampliamente insensible frente a los iones calcio de tal manera, que presenta, en principio, buenas condiciones previas para el empleo en los agentes de lavado.

Una \alpha-amilasa empleada con frecuencia en los agentes de lavado y de limpieza es la que procede de Bacillus licheniformis. El producto correspondiente de la firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca, porta, por ejemplo, el nombre comercial Termamyl®; el de la firma Genencor Int., Rochester, New York, USA, se llama Purastar®. La \alpha-amilasa formada por B. amyloliquefaciens, y que puede prepararse por fermentación por ejemplo según la publicación US 1227374 a través de B. subtilis, es comercializada por la firma Novozymes A/S bajo el nombre BAN®. Las secuencias de las \alpha-amilasas procedentes de B. licheniformis, de B. amyloliquefaciens así como las de la \alpha-amilasa procedente de B. stearothermophilus están dadas, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 96/23874.

Estas moléculas de amilasa, o bien sus parientes próximos, han sido desarrollados en un gran número de invenciones, especialmente a través de modificaciones efectuadas por medio de la biología molecular para optimizarlas con respecto a aplicaciones específicas, especialmente desde el punto de vista de su empleo en los agentes de lavado y de limpieza. Tales optimaciones pueden corresponder, por ejemplo, a las especificidades del substrato, a la estabilidad del enzima bajo diversas condiciones o la propia actividad enzimática.

Un principio de estos desarrollos consiste en mejorar las propiedades por medio de mutaciones puntuales. A título de ejemplo, se desprenden de la solicitud WO 96/23873 variantes mejoradas de dichas \alpha-amilasas, destinadas al empleo en agentes de lavado y de limpieza, que eran conocidas como enzimas de tipo silvestre o que procedían de microorganismos, que habían sido descritos precedentemente como productores de proteasas alcalinas. A título de ejemplo, el procedimiento de mutagénesis de la solicitud WO 99/20768 conduce a variantes de \alpha-amilasa, que son especialmente estables en presencia de los componentes de los agentes de limpieza. En la práctica una modificación de las propiedades enzimáticas individuales, en tales modificaciones, tiene un efecto sobre otras propiedades y sobre el rendimiento del enzima correspondiente. Un ejemplo de un producto de optimización, obtenido por esta vía, que entretanto ha sido comercializado, es el producto Duramyl® (WO 94/02597) con una sensibilidad frente a la oxidación disminuida (firma Novozymes; SÖFW-Journal 123, (1997), páginas 723-731).

Otros ejemplos son: las amilasas de la solicitud WO 99/02702 que son más estables temperaturas elevadas que la molécula de partida. Los enzimas de la solicitud WO 99/23211 son estables a valores elevados del pH, en presencia de iones calcio y a temperaturas elevadas. Las \alpha-amilasas, de la solicitud WO 97/43424, muestran un comportamiento modificado al enlace de los iones calcio y, por lo tanto, presentan propiedades enzimáticas modificadas.

Otro método de optimización o método de optimización empleado de manera adicional, consiste, por ejemplo, en modificaciones químicas (DE 4013142).

A título de ejemplo se emplea en la solicitud de patente WO 99/43793 otro principio para el desarrollo de las \alpha-amilasas conocidas. Según esta publicación se aprovechan las similitudes secuenciales entre el producto Novamyl® y las conocidas ciclodextrinaglucanotransferasas (CGTasas), para formar nuevas combinaciones de partes moleculares de mayor tamaño con ayuda de la ingeniería de la biología molecular y, de este modo, construir una multitud de moléculas emparentadas. Estas moléculas están constituidas por \alpha-amilasas con secuencias de consenso (cajas) y funciones adicionales específicas de la CGTasa o, a la inversa, se trata de CGTasas con regiones y con funciones adicionales típicas de las \alpha-amilasas o se trata de quimeras de ambas moléculas.

En la solicitud WO 99/57250 un método comparable divulga el modo en que puede aumentarse el rendimiento de lavado de los enzimas para los agentes de lavado. El principio allí descrito consiste en enlazar de manera covalente a los enzimas correspondientes de origen bacteriano a través de un enlazante de tipo no aminoácido sobre los dominios de enlace de la celulosa (CBD). Éstos se encargan de que el enzima tenga una actividad reforzada sobre la superficie del artículo textil. En la publicación WO 99/57252 se incorporan a este concepto otros posibles enlazantes y con la publicación WO 99/57254 se incorporan otros enzimas, tales como por ejemplo las glicosil-transferasas o las acil-transferasas, que se enlazan sobre los CBD bien mediante la formación de una proteína quimérica o a través de los enlazantes citados en la publicación WO 99/57252.

La necesidad de todos estos desarrollos de las \alpha-amilasas establecidas para el empleo en los agentes de lavado y de limpieza se desprende, por ejemplo, de los componentes de nuevo desarrollo que, por ejemplo como los agentes de blanqueo, influencian drásticamente las condiciones correspondientes y tienen un efecto negativo sobre los enzimas en cuanto a su productividad. Sin embargo ésta se desprende también de las diversas finalidades de limpieza, de las costumbres y de las exigencias, en modificación, del usuario, según las cuales existe, por ejemplo, una necesidad cada vez mayor de agentes de lavado para la limpieza a temperaturas bajas y medias.

La técnica para la obtención de proteínas por fusión y de proteínas híbridas se ha establecido perfectamente en el estado de la técnica. De este modo se ha descrito, por ejemplo, en la solicitud EP 208491 un procedimiento in vivo para la obtención de proteínas híbridas, que está basado en que se clonan en un vector sucesivamente los segmentos correspondientes de ADN. Entre éstas se encuentran por ejemplo también las amilasas híbridas, cuya región N-terminal corresponde a la de la \alpha-amilasa procedente de B. stearothermophilus y cuya región C-terminal corresponde a la de la \alpha-amilasa procedente de B. licheniformis.

En la solicitud WO 96/23874 se han divulgado híbridos constituidos por \alpha-amilasas procedentes de Bacillus licheniformis, de B. amyloliquefaciens, de B. stearothermophilus y de Aspergillus oryzae. Entre éstas se encuentra concretamente una cuyos aminoácidos 1 a 300 proceden de la \alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens y 301 a 483 proceden de la \alpha-amilasa de B. licheniformis; según la terminología de la presente solicitud (véase más adelante) pueden designarse por lo tanto como AL300. De igual modo se ha citado en dicha publicación una variante AL37. Tales amilasas híbridas pueden prepararse según las enseñanzas de esta solicitud para determinar la estructura tridimensional de las amilasas similares a la Termamyl para reconocer por medio de las mismas aquellas posiciones que sean importantes para la actividad enzimática. Éstas pueden modificarse a continuación de manera específica mediante mutagénesis localmente dirigida y pueden enviarse a aplicaciones correspondientes. Por lo tanto se citan para estas posiciones tanto posiciones individuales así como también intercambios concretos, con las cuales pueden variarse las propiedades enzimáticas. En esta publicación no se han divulgado otras posibilidades industriales de aplicación para las propias amilasas híbridas, no sometidas a mutaciones puntuales.

Tomando como base estos conocimientos se divulgan en la publicación WO 97/41213 otras variantes, que se obtienen por medio de mutagénesis puntual tanto de los enzimas de tipo silvestre así como también de las amilasas híbridas individuales, entre las cuales se encuentra la AL37, también para el empleo en los agentes de lavado y de limpieza.

En la solicitud WO 00/60059 se divulgan variantes que han sido desarrolladas en lo que se refiere a un cuadro modificado de disociación sobre el substrato constituido por almidones y que, por lo tanto, son especialmente adecuadas para la elaboración de los almidones; con esta finalidad la generación de oligosacáridos ramificados, largos, sería más ventajosa que la de los oligosacáridos ramificados, cortos. En esta publicación se divulga un gran número de mutaciones puntuales tanto de las \alpha-amilasas nativas así como también de las amilasas híbridas, tales como por ejemplo la AL33 y la AL37 (que tienen una secuencia idéntica), que pueden contener, entre otras cosas, también una mutación en la posición 412 (según la enumeración de B. licheniformis), de manera preferente la T412A; además debe estar presente sin embargo, al menos, una segunda mutación en una de las posiciones 13, 48 hasta 54, 57, 107, 108, 111, 168 y 197; son preferentes las mutaciones múltiples con otros intercambios adicionales.

En ninguna de las tres publicaciones citadas en último lugar se han divulgado como puntos de fusión, en la numeración según B. amyloliquefaciens, las posiciones 17, 34 (que corresponden a la 36 en la numeración según B. licheniformis), 76, 108, 112, 142, 147, 149, 151, 163, 174, 179, 185, 191, 198, 207, 231, 234, 244, 256, 263, 276, 431, 84, 99, 429, 201, 19, 433 o 153. De igual modo tampoco se han divulgado amilasas híbridas con variaciones secuenciales en las posiciones 134 o 320 (en la enumeración según B. licheniformis), y la divulgación de una mutación en la posición 412 se llevó a cabo en combinación con otra variación definida y en relación con una modificación especial de la actividad enzimática.

Por lo tanto se plantea la tarea de poner a disposición agentes de lavado y de limpieza con nuevos enzimas amilolíticos o que al menos no fuesen conocidos previamente para este campo de aplicación, preferentemente con aquellos que presenten rendimientos de lavado o de limpieza mejores que los de las \alpha-amilasas establecidas.

Una tarea parcial consistía en poner a disposición procedimientos para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras, que presentasen resultados mejorados en lo que se refiere al rendimiento de lavado o bien al rendimiento de limpieza por medio de tales amilasas.

Una segunda tarea parcial consistía en proporcionar posibilidades de empleo correspondientes con un rendimiento mejorado.

Una tercera tarea parcial consistía en proporcionar procedimientos, según los cuales pudiese mejorarse el rendimiento de un agente de lavado y de limpieza mediante el desarrollo de nuevas amilasas.

Esta tarea se resuelve por medio de la preparación de proteínas híbridas, que pueden formarse a través de la fusión de las correspondientes partes, que se adapten entre sí, a partir de las \alpha-amilasas procedentes de las especies bacterianas Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus licheniformis.

Lo sorprendente de esta solución consiste en que pueden obtenerse ya simplemente por medio de la recombinación de las secuencias de las \alpha-amilasas naturales y establecidas desde hace mucho tiempo, amilasas para los agentes de lavado y respectivamente para los agentes de limpieza más productivas. Las amilasas híbridas pueden servir como punto de partida para desarrollos específicos en lo que se refiere a este campo de aplicación.

Por lo tanto, un objeto de la invención consiste en agentes de lavado o de limpieza, caracterizados porque contienen una proteína híbrida amilolítica, cuya secuencia de aminoácidos contiene, al menos, una secuencia parcial, que comprenda más de un aminoácido, en la correspondiente posición homóloga, que sea idéntica a la de la \alpha-amilasa procedente de Bacillus amyloliquefaciens, y que contenga al menos una secuencia parcial, que comprenda más de un aminoácido, en la posición homóloga correspondiente, que sea idéntica a la de la \alpha-amilasa procedente de Bacillus licheniformis. En este caso son preferentes aquellos agentes en los que las secuencias parciales de las amilasas híbridas, procedentes de las moléculas de partida, tengan una longitud mayor que 7, preferentemente mayor que 14, de forma especialmente preferente comprendida entre 21 y 462 aminoácidos y/o en los que la proteína híbrida esté compuesta por 3 o por 2 secuencias parciales que se complementen entre sí de acuerdo con las secuencias de
partida.

Representan soluciones preferentes de esta tarea aquellos agentes, cuyas híbridas presenten puntos de fusión próximos a las posiciones 17, 34, 76, 108, 112, 142, 147, 149, 151, 163, 174, 179, 185, 191, 198, 207, 231, 234, 244, 256, 263, 276, 431, 84, 99, 429, 201, 19, 433 y 153 de conformidad con la numeración de la \alpha-amilasa procedente de B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4); y, concretamente, de mantera más preferente dentro de las regiones de 10, y respectivamente de 5 aminoácidos por delante y por detrás de estas posiciones, o bien exactamente en estas posiciones. Entre éstas son especialmente preferentes las amilasas híbridas AL17, AL108, AL142, AL147, AL149, AL151, AL163, AL174, AL179, AL185, AL191, AL198, AL207, AL231, AL234, AL244, AL263, AL276, AL431, ALA17-151, ALA76-151, ALA99-429, ALA12-151, ALA112-201, LA19 y LA431.

Son soluciones especialmente preferentes de esta tarea aquellos agentes, cuyas amilasas híbridas presenten puntos de fusión próximos a las posiciones 34, 256, 84, 19 y 153 de conformidad con la numeración de la \alpha-amilasa procedente de B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4); y concretamente de una manera más preferente dentro de los intervalos de 10, y respectivamente 5 aminoácidos por delante y por detrás de estas posiciones, o bien exactamente en estas posiciones. Entre éstas son especialmente preferentes las amilasas híbridas AL34 (SEQ ID NO. 6), AL256 (SEQ ID NO. 12), ALA34-84 (SEQ ID NO. 14) y LAL19-153 (SEQ ID NO. 18).

Son soluciones muy especialmente preferentes de esta tarea aquellos agentes, cuyas amilasas híbridas presenten como secuencia parcial aquella secuencia parcial de las posiciones de aminoácidos 19 hasta 76 de la \alpha-amilasa procedente de Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) y como otra secuencia parcial aquella secuencia parcial de las posiciones de aminoácidos 433 hasta 483 de la \alpha-amilasa procedente de Bacillus licheniformis (SEQ ID NO. 2). Entre éstas son especialmente preferentes las amilasas híbridas AL76 (SEQ ID NO. 8), AL112 (SEQ ID NO. 10) y LAL19-433 (SEQ ID NO. 16), así como las moléculas que tengan una identidad con las mismas respectivamente de un 98% como mínimo, de manera preferente de un 99%, de manera especialmente preferente de un 100%. A éste respecto corresponden las variantes, que pueden ser obtenidas por mutagénesis puntual, por ejemplo mediante substitución de aminoácidos individuales.

Otras soluciones de esta tarea consisten en agentes, cuyas amilasas híbridas puedan ser obtenidas mediante deleciones de regiones cortas, que no comprendan más de 5 aminoácidos, por mutagénesis por inserción o por derivatización o que tengan en común un determinante antígeno generado por medio de la formación del híbrido, con las proteínas precedentemente citadas.

De manera preferente, los agentes de lavado o de limpieza de este objeto de la invención contienen las amilasas híbridas en proporciones comprendidas entre un 0,000001 por ciento en peso hasta un 5% en peso, de manera especial entre un 0,00001 hasta un 3% en peso y/o otros enzimas; éstos pueden presentarse en formas de administración o de agregados en sí conocidos o en varias fases, o en los mismos puede cumplir la actividad amilolítica una función para la liberación de los componentes del agente o incluso puede controlarla.

Una solución de la tarea parcial y, por lo tanto, del segundo objeto de la invención, está constituida por procedimientos para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras, que se caracterizan porque se emplea al menos en una de las etapas del procedimiento una amilasa híbrida, o bien un agente del primer objeto de la invención. De manera preferente la amilasa híbrida se emplea en la correspondiente etapa del procedimiento en una cantidad comprendida entre 0,01 mg y 400 mg, de manera preferente comprendida entre 0,02 mg y 200 mg, de forma especialmente preferente comprendida entre 0,02 y 100 mg por aplicación.

Una solución de la segunda tarea parcial y, por lo tanto, del tercer objeto de la invención consiste en las correspondientes posibilidades de empleo de las amilasas híbridas de relevantes para la invención para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras o para la liberación de los componentes de los agentes correspondientes; de manera preferente se emplea por aplicación en una máquina lavavajillas o en una máquina lavadora, en una cantidad comprendida entre 0,01 mg y 400 mg, de manera preferente comprendida entre 0,02 mg y 200 mg, de manera especialmente preferente comprendida entre 0,02 y 100 mg por aplicación.

Todos los procedimientos para mejorar el rendimiento de los agentes de lavado o de limpieza, que están basados en el desarrollo de las amilasas híbridas que, por su parte, se fusionan mediante fusión de, respectivamente, al menos una secuencia parcial, que comprenda más de un aminoácido, de las \alpha-amilasas procedentes de Bacillus amyloliquefaciens y de Bacillus licheniformis en posición respectivamente homóloga con respecto a una amilasa híbrida con actividad amilolítica, y se añaden al agente, representan soluciones de la tercera tarea parcial y un objeto propio de la invención.

De manera correspondiente son preferentes aquellas soluciones que están basadas en las amilasas híbridas que han sido tratadas precedentemente y, de una manera muy particular, aquellas que están basadas sobre las informaciones secuenciales proporcionadas por la presente solicitud sobre los genes naturales procedentes de B. amyloliquefaciens y de B. licheniformis (SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 1).

En el sentido de la presente solicitud se entenderá por una proteína un polímero compuesto por los aminoácidos naturales, construido ampliamente de manera lineal, que toma la mayoría de las veces una estructura tridimensional para ejercer su función. En la presente solicitud se denominarán los 19 L-aminoácidos proteinógenos, de origen natural, con el código usado internacionalmente con 1 letra y con 3 letras.

En el sentido de la presente solicitud se entenderá por un enzima, una proteína que ejerza una determinada función bioquímica. Se entenderán por proteínas amilolíticas o enzimas con función amilolítica aquellas que hidrolicen los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos de los polisacáridos, especialmente aquellas que se encuentren en el interior de los polisacáridos. Por lo tanto, se denominan también como \alpha-1,4-amilasas (E.C. 3.2.1.1) o abreviadamente \alpha-amilasas.

Se forma un gran número de proteínas como las denominadas preproteínas (proteínas precursoras), es decir junto con un péptido de señal o con un péptido líder. Se entenderá por este concepto, entonces, la parte N-terminal de la proteína, cuya función consiste, en la mayoría de los casos, en garantizar la secreción de la proteína formada a partir de la célula productora en el periplasma o en el medio circundante y/o su plegado correcto. Sin embargo, son preferentes para las aplicaciones industriales, por ejemplo, también en el ámbito de la presente invención, por el contrario, los péptidos maduros, debido a su actividad enzimática, es decir los enzimas procesados tras su obtención, frente a las preproteínas.

En el sentido de la presente solicitud se entenderán por ácidos nucleicos aquellas moléculas constituidas de manera natural por nucleótidos, que sirven como portadoras de información, que codifican las series lineales de aminoácidos en proteínas o en enzimas. Éstos pueden presentarse como cadena única, como cadena única complementaria de esta cadena única o como cadena doble. El ácido nucleico ADN es preferente para los trabajos de biología molecular como portador de informaciones natural, persistente. Por el contrario se formará un ARN para la realización de la invención en un medio natural, tal como por ejemplo en una célula expresante.

En el caso del ADN deben tenerse en consideración las secuencias de ambas cadenas complementarias respectivamente en las tres pautas de lectura posibles. Además debe tenerse en consideración que diversos tripletes de codón pueden codificar los mismos aminoácidos de tal manera, que, puede derivarse una determinada serie de aminoácidos de varias secuencias de nucleótidos diferentes y que presenten, posiblemente, sólo una pequeña identidad (degenerabilidad del código genético). Además, diversos organismos presentan diferencias en la utilización de estos codones. Por estos motivos deben considerarse incluidos en el ámbito de la región de protección tanto las secuencias de los aminoácidos como también las secuencias de los nucleótidos y las secuencias de nucleótidos indicadas deben considerarse respectivamente sólo como una codificación ejemplificativa de una determinada serie de aminoácidos.

La unidad de información, que corresponde a una proteína, se denominará también en el sentido de la presente invención, como gen.

Un técnico en la materia tiene la posibilidad, por medio de los métodos conocidos en general actualmente, tales como, por ejemplo, la síntesis química o la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), en combinación con los métodos patrón de la biología molecular y/o de la química de proteínas, de preparar los ácidos nucleicos correspondientes hasta llegar al gen completo, por medio de las secuencias conocidas de ADN y/o de aminoácidos. Tales métodos son conocidos, por ejemplo, por la publicación "Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, tomo 1, páginas 267-271 y tomo 2, páginas 227-229.

Se denominarán mutaciones a aquellas modificaciones de la secuencia de los nucleótidos como las que pueden provocarse por ejemplo por medio de los métodos de la biología molecular en sí conocidos. Según el tipo de la modificación se distingue, por ejemplo, entre mutaciones por deleción, por inserción o por substitución o aquellas en las cuales se fusionan entre sí diversos genes o partes de genes (shuffling); éstas son mutaciones genéticas. Los organismos correspondientes se denominarán mutantes. Las proteínas, derivadas de los ácidos nucleicos mutados, se denominarán variantes. De este modo, por ejemplo, las mutaciones por deleción, por inserción, por substitución o las fusiones conducen a genes mutados por deleción, por inserción, por substitución o a genes de fusión y en el plano de las proteínas conducen a las correspondientes variantes por deleción, por inserción o por substitución, o bien las proteínas de fusión. Las mutaciones se indicarán en la presente solicitud por medio de los códigos usuales de una letra. De este modo, en el caso de la mutación puntual T410A se trata, por ejemplo, de un intercambio en la posición 410 de la proteína correspondiente, en la que se ha substituido el aminoácido formado por la treonina por el aminoácido formado por la alanina.

Se entenderán por fragmentos todas aquellas proteínas o péptidos que sean menores que la proteína natural o que aquellas proteínas que correspondan a los genes completamente traducidos y que, por ejemplo, también pueden ser obtenidos de manera por vía de síntesis. Debido a sus secuencias de aminoácidos pueden asociarse con la correspondiente proteína completa. A modo de ejemplo pueden tomar las mismas estructuras o pueden ejercer las actividades amilolíticas o las actividades parciales tal como por ejemplo la transformación en complejo de un substrato. En principio son equivalentes los fragmentos y las variantes de deleción de las proteínas de partida; mientras que los fragmentos representan fragmentos más bien pequeños, los mutantes por deleción carecen, por el contrario, sólo de regiones cortas y, por lo tanto, sólo de algunas funciones parciales.

Las secuencias parciales corresponden a los fragmentos en el plano de los ácidos nucleicos.

En el sentido de la presente solicitud se entenderán por proteínas quiméricas o híbridas, aquellas proteínas que estén constituidas por elementos que procedan de manera natural de diversas cadenas polipéptidas procedentes del mismo organismo o procedentes de organismos diversos. Este modo de proceder se denominará también shuffling o mutagénesis por fusión. El objeto de una fusión de este tipo puede consistir, por ejemplo, en la introducción o en la modificación de una determinada función enzimática con ayuda de la parte de la proteína que ha sido introducida por fusión o en la obtención de enzimas, que presenten propiedades mejoradas desde cualquier punto de vista.

Se entenderán por proteínas, obtenidas por medio de la mutación por inserción, aquellas variantes que hayan sido obtenidas a través de métodos en sí conocidos por medio de la introducción en las secuencias de partida de un fragmento de ácido nucleico o bien de un fragmento de proteína. Debido a su equivalencia de principio deben asociarse con las proteínas quiméricas. Éstas se diferencian de aquellas únicamente en la relación de tamaño entre la parte de la proteína no modificada y el tamaño de la proteína en su conjunto. La parte de la proteína foránea es en tales proteínas mutadas por inserción, menor que en las proteínas quiméricas.

Puede considerarse una mutagénesis por inversión, es decir una inversión parcial de la secuencia, como forma especial tanto de la deleción así como también de la inserción. Lo mismo es válido para un nuevo agrupamiento de diversas partes de la molécula que se desvíe de la serie original de los aminoácidos. Ésta puede considerarse tanto como variante por deleción, como variante por inserción, así como también como variante shuffling de la proteína original.

En el sentido de la presente solicitud se entenderán por derivados aquellas proteínas cuya cadena original de los aminoácidos haya sido modificada por vía química. Tales derivatizaciones pueden llevarse a cabo, por ejemplo, por vía biológica en cooperación con la biosíntesis de proteínas por medio del organismo huésped. Con esta finalidad pueden emplearse métodos de la biología molecular. Sin embargo pueden llevarse a cabo también por vía química, por ejemplo por medio de la transformación química de una cadena lateral de un aminoácido o por medio del enlace covalente de otro compuesto sobre la proteína. Un compuesto de este tipo puede estar constituido, por ejemplo, por otras proteínas que se enlacen sobre la proteína según la invención, por ejemplo, a través de compuestos químicos bifuncionales. Del mismo modo se entenderá por derivatización el enlace covalente sobre un soporte
macromolecular.

El concepto de proteína puede agruparse, también, con el grupo de las proteínas emparentadas desde el punto de vista inmunológico a través de la reacción con un antisuero o con un anticuerpo determinado. Los miembros de un grupo se caracterizan porque presentan el mismo determinante antígeno, reconocido por un anticuerpo.

En el sentido de la presente invención se agruparán todos los enzimas, las proteínas, los fragmentos y los derivados, en tanto en cuanto no deban ser citados explícitamente como tales, bajo el concepto de proteínas.

Mediante comparación con los enzimas conocidos, que han sido depositados por ejemplo en bancos de datos accesibles en general, pueden deducirse partes de moléculas características a partir de la secuencia de los aminoácidos o de la secuencia de los nucleótidos, tales como, por ejemplo, elementos estructurales o la actividad enzimática de un enzima considerado.

Una comparación de este tipo se lleva a cabo relacionando entre sí las series similares en las secuencias de los nucleótidos o de los aminoácidos de las proteínas consideradas. Esto se denomina homologación. Una asociación en forma de tabla de las posiciones correspondientes se denomina alineamiento. En el caso del análisis de las secuencias de los nucleótidos deben tenerse en consideración a su vez ambas cadenas complementarias y respectivamente, las tres pautas de lectura posibles; del mismo modo debe tenerse en consideración la degeneración del código genético y el uso del codón específico del organismo. Entre tanto se preparan alineamientos por medio de programas de ordenador, como por ejemplo por medio de los algoritmos FASTA o BLAST; esta forma de proceder ha sido descrita, por ejemplo, por los autores D. J. Lipman y W. R. Pearson (1985) en Science, tomo 227, página 1435-1441. Una agrupación de todas las posiciones coincidentes en las secuencias comparadas se denomina secuencia de consenso.

Una comparación de este tipo permite también una predicción sobre la similitud o sobre la homología de las secuencias comparadas entre sí. Esto se indica como porcentaje de identidad, es decir la proporción de los nucleótidos idénticos o de los restos de aminoácidos idénticos sobre las mismas posiciones. Otro concepto de homología utilizado incluye también las variaciones conservadas de los aminoácidos. En este caso se habla de porcentaje de similitud. Tales predicciones pueden realizarse a través de toda la proteína o de todo el gen o únicamente a través de regiones individuales.

Regiones homólogas de diversas proteínas son, en la mayoría de los casos, aquellas con elementos estructurales y/o con funciones iguales, que pueden reconocerse por las coincidencias en la secuencia primaria de los aminoácidos. Ésta se extiende hasta la total identidad en regiones pequeñas, denominadas casetes, que abarcan únicamente un reducido número de aminoácidos y que ejercen en la mayoría de los casos funciones esenciales para la actividad total. Se entenderán por las funciones de las regiones homólogas, las funciones parciales mínimas de la función ejercida por el conjunto de la proteína, tal como por ejemplo la formación de enlaces simples por puentes de hidrógeno hasta la transformación en complejo de un substrato o de un complejo de transición.

La identificación de las regiones homólogas entre, al menos, dos proteínas constituye la base para conjuntarlas para dar proteínas de fusión o híbridas con una función comparable. En este caso se substituirá, al menos, una región de una proteína por la región homóloga de la otra proteína. Así pues, deben ser compatibles las regiones fusionadas con mantenimiento de la función principal de la proteína en su conjunto. Si, por ejemplo, se trata de la fusión de secuencias parciales de dos amilasas, entonces se obtendrá, de conformidad con la invención, una amilasa híbrida, cuando el propio producto de fusión presente, en conjunto, una actividad amilolítica.

La actividad enzimática puede modificarse de manera cualitativa o cuantitativa por medio de otras regiones de la proteína, que no participen en la reacción propiamente dicha. Esto se refiere, por ejemplo, a la estabilidad enzimática, a la actividad, a las condiciones de la reacción o a la especificidad con respecto al substrato.

Así pues, debe entenderse por el concepto de una proteína amilolítica, de conformidad con la invención, no solamente aquella que presente una función puramente destinada a llevar a cabo la hidrólisis de los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos, que se deben al reducido número de restos de aminoácidos de un centro con probable actividad catalítica. De igual modo, éste concepto abarca todas aquellas funciones que favorezcan la hidrólisis de un enlace \alpha-1,4-glicosídico.

Se entenderá por rendimiento de un enzima su actividad en el sector industrial considerado en cada caso. Esto se basa en la actividad enzimática propiamente dicha, sin embargo depende también de otros factores que son relevantes para el proceso correspondiente. A éstos pertenecen, por ejemplo, la estabilidad, el enlace con el substrato, la interacción con el material que porta al substrato o con las interacciones con otros componentes, especialmente las sinergias. De este modo se considerará por ejemplo en los ensayos dirigidos a determinar si un enzima es adecuado para el empleo en los agentes para el lavado o en los agentes para la limpieza, su contribución para el rendimiento del lavado o de la limpieza de un agente formulado con otros componentes.

Las proteínas, esenciales de conformidad con la invención, se emplearán, de conformidad con la invención, en agentes de lavado o de limpieza. En éstos se emplearán especialmente aquellas cuya actividad enzimática contribuya a mejorar el rendimiento de al menos una receta de agente de lavado o de agente de limpieza sobre al menos una suciedad que contenga almidón o similar al almidón sobre al menos una superficie. Son especialmente preferentes aquellas que aporten una contribución para el rendimiento de lavado y respectivamente de limpieza del o de los agentes correspondientes en más de un problema de limpieza.

Estas superficies están constituidas preferentemente por artículos textiles o por superficies duras. Las condiciones que deben ser elegidas para esta finalidad, tales como por ejemplo la temperatura, el valor del pH, la fuerza iónica, las condiciones Redox o los influjos mecánicos deben optimizarse para el correspondiente problema de limpieza, es decir en relación la suciedad y al material de soporte. De este modo las temperaturas usuales para los agentes de lavado y de limpieza se encuentran en el intervalo comprendido entre 10ºC, en el caso de los agentes manuales hasta 40ºC y 60ºC llegándose hasta los 95ºC en agentes para máquinas o en el caso de aplicaciones industriales. De manera preferente se ajustarán también entre sí los componentes de los agentes correspondientes.

Las amilasas híbridas, que caracterizan a los agentes de conformidad con la invención, están compuestas en el complemente homólogo por las secuencias parciales de las \alpha-amilasas de Bacillus amyloliquefaciens y de Bacillus licheniformis. Esto significa que cada aminoácido de las correspondientes amilasas híbridas se encuentra en una región parcial que abarca, al menos, dos aminoácidos, que puede encontrarse en la posición homóloga bien en una u otra de las secuencias de partida. Esto puede comprenderse, por ejemplo, por medio del alineamiento de la figura 2.

Las secuencias de estos dos enzimas de partida pueden obtenerse en los bancos de datos accesibles al público bajo las denominaciones amyA (para la \alpha-amilasa procedente de B. amyloliquefaciens), y respectivamente amyL (para la \alpha-amilasa procedente de B. licheniformis). A título de ejemplo han sido depositadas en el banco de datos Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Ginebra, Suiza; http://www.genebio.com/sprot.html) bajo los números de registro P00692 (para las \alpha-amilasas amyA procedentes de B. amyloliquefaciens) y P06278 (para las \alpha-amilasas amyL procedentes de B. licheniformis). Además han sido indicadas en el protocolo de secuencias de la presente solicitud en SEQ ID NO. 4, y respectivamente SEQ ID NO. 2; junto con las secuencias de nucleótidos correspondientes en la SEQ ID NO. 3, y respectivamente SEQ ID NO. 1.

Ambas especies de Bacillus han sido ampliamente descritas en la literatura y son accesibles en general mediante colecciones de cultivos. De este modo puede adquirirse el B. amyloliquefaciens por ejemplo bajo la denominación DSM 7 en la colección alemana de microorganismos y de cultivos celulares (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de)) o bajo la denominación ATCC 23350 en la colección americana de tipos de cultivo (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org)). El B. licheniformis puede adquirirse en las mismas dependencias por ejemplo bajo las denominaciones DSM 13, y respectivamente ATCC 14580.

A partir de estas cepas pueden obtenerse los correspondientes genes de \alpha-amilasa por ejemplo mediante la RCP con tales cebadores, que han sido sintetizados por medio del protocolo de secuencias de la presente solicitud (SEQ ID NO. 3, y respectivamente SEQ ID NO. 1). Los productos de la RCP obtenidos pueden clonarse según métodos en sí conocidos y someterse a un procesamiento ulterior de cualquier forma conveniente (véase más adelante).

De conformidad con la invención pueden definirse las clases híbridas correspondientes y pueden denominarse por medio de las secuencias de partida. Si se elige para la amilasa procedentes de B. licheniformis la letra L y para la que procede de B amyloliquefaciens se elige la letra A, un enzima, que presente la secuencia N-terminal de la \alpha-amilasa procedente de B. licheniformis y la secuencia C-terminal de la \alpha-amilasa procedente de B amyloliquefaciens, pertenecerá a la clase híbrida LA. En el caso de una composición inversa pertenece a la clase híbrida AL, y en el caso de fusión de tres partes de manera correspondiente corresponde a las clases híbridas LAL o ALA, según que secuencias parciales de los enzimas de partida hayan sido combinadas.

Los números adicionales caracterizan la molécula claramente en lo que se refiere a aquél punto en el que se ha llevado a cabo la fusión, es decir de qué aminoácido C-terminal. En este caso es decisiva, en caso de duda, la enumeración de la \alpha-amilasa procedentes de B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4). De este modo la molécula AL76 tiene, por ejemplo, los 76 aminoácidos N-terminales de la \alpha-amilasa procedente de B. amyloliquefaciens y a continuación, hasta el extremo C, los aminoácidos homólogos de la \alpha-amilasa procedente de B licheniformis, es decir a partir de la tirosina, que se encuentra en la posición 79 según la numeración de la \alpha-amilasa procedente de B. licheniformis. A modo de ejemplo la amilasa híbrida LAL19-433 está constituida por los 21 aminoácidos N-terminales de la \alpha-amilasa del B. licheniformis, seguido por la región homóloga de la \alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens, es decir comenzando con el triptofano que sigue a la histidina en el complemento homólogo hasta la glicina, que corresponde según ambas enumeraciones a la posición 433 y, finalmente, los aminoácidos restantes de la \alpha-amilasa de B. licheniformis, es decir la región de los aminoácidos 434 hasta 483. Los puntos de fusión han sido realzados en la figura 2.

Si se produjesen faltas de claridad con respecto a la numeración por la observación de las secuencias de los aminoácidos, será decisiva la correspondiente secuencia de nucleótidos, como se ha divulgado en el protocolo de secuencias, puesto que la formación de las proteínas híbridas se lleva a cabo de una manera más favorable en el plano del ADN correspondiente. El número del punto de fusión está dado, por lo tanto, a partir del número del codón, detrás de cuya primera, segunda o tercera nucleobase se haya verificado el intercambio para dar otro ADN, referido nuevamente a su vez a la numeración del codón del B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 3).

Las amilasas híbridas, que caracterizan formas de realización preferentes de la presente solicitud, han sido representadas esquemáticamente en la figura 1. Éstas están constituidas por, al menos, una región secuencial de la \alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens, que comprenda al menos dos aminoácidos, y por al menos una región secuencial de la \alpha-amilasa de B. licheniformis, que comprenda igualmente, al menos, dos aminoácidos.

Son preferentes las secuencias parciales de las amilasas híbridas basadas en las moléculas de partida, con una longitud mayor que 7, de manera preferente mayor que 14, de forma especialmente preferente comprendida entre 21 y 462 aminoácidos. Como puede verse por ejemplo por la figura 1, las secuencias parciales de los representantes especialmente preferentes (véase más adelante) tienen una longitud comprendida entre 21 y 462 aminoácidos. A partir de combinaciones arbitrarias de los puntos de fusión allí indicados se producen proteínas de conformidad con la invención con una longitud de, al menos, 8 (puntos de fusión 76 y 84) a continuación con una longitud de 15 (puntos de fusión 19 y 34) y, finalmente, con una longitud comprendida entre 21 y 462 aminoácidos.

De manera preferente la proteína híbrida está compuesta por tres o por dos secuencias parciales que se complementan entre sí de acuerdo con las secuencias de partida. Esto significa que presenta uno o dos puntos de fusión y que puede asociarse con una de las clases híbridas AL, LA, LAL o ALA.

La obtención de tales amilasas híbridas según un procedimiento in vivo se ha descrito ampliamente en la publicación "Hybrid Bacillus amyloliquefaciens X Bacillus licheniformis \alpha-Amylases. Construction, properties and sequence determinats" (1995) de B. Conrad, V. Hoang, A. Polley y en la publicación de J. Hofemeister, Eur. J. Biochem., 230, páginas 481-490. En estas publicaciones se obtienen por medio de la recombinación in-vivo. Esto es posible, por ejemplo, dado que ambos genes clonan en el mismo vector sucesivamente y transforman una célula huésped (véase la publicación de H. Weber, C. Weissmann (1983): "Formation of genes coding for hybrid proteins by recombination between related, cloned genes in E. coli", Nucleic Acid Res., 11, páginas 5661-5669, y EP 208491). De este modo puede producirse una multitud de amilasas híbridas, que están basadas en los resultados de la recombinación entre estos dos genes independientemente de determinados puntos de corte por restricción. Las proteínas obtenidas han sido indicadas esquemáticamente en la figura 2 del trabajo de Conrad et al.

Para la realización de más de una fusión son prometedores sin embargo los métodos in vitro establecidos en el estado de la técnica. La formación de amilasas híbridas es posible por lo tanto mediante la fusión sobre puntos de corte por restricción ya existentes así como también sobre puntos de corte por restricción incorporados ulteriormente. De este modo pueden insertarse puntos de corte adicionales en ambos genes correspondientes (SEQ ID NO. 1 y 3), intercambiándose según los procedimientos de mutagénesis puntual, en sí conocidos, los nucleótidos deseados por ejemplo mediante el cebador de Mismatch. En este caso puede aprovecharse la tendencia a la degeneración del código genético para genera únicamente codones sinónimos, es decir para implantar aquellas mutaciones que no tengan influencia sobre la secuencia de aminoácidos derivada. La elección de los puntos de corte por restricción generados puede realizarse libremente puesto que puede compatibilizarse para la fusión in vitro respectivamente también con un enzima de restricción adecuado; esto es válido especialmente para la generación de puntos de corte singulares. De manera alternativa pueden llevarse a cabo también reacciones de RCP a través de secuencias parciales, preferentemente con cebadores, que contengan puntos de corte, y enlazándose entre sí los productos obtenidos.

Otras posibilidades para obtener tales proteínas de fusión son, por ejemplo: (a) la recombinación estadística de los fragmentos correspondientes mediante procedimientos que son comparables a la recombinación secuencial recursiva, como los que se han descrito por ejemplo en las solicitudes de patente WO 98/05764, WO 97/35966, EP 590689 o EP 229046; y (b) la recombinación estadística de los fragmentos correspondientes mediante procedimientos basados en la RCP; uno de tales procedimientos representa, por ejemplo, el método StEP, como el que se ha descrito en la solicitud WO 98/42832.

Las moléculas de ADN fusionadas pueden clonarse a continuación según métodos en sí conocidos, amplificarse y hacer que sean expresadas en células huésped. De igual modo se conocen por el estado de la técnica sistemas adecuados con esta finalidad, tales como por ejemplo vectores y/o células huésped y se ofrecen comercialmente en un gran número. Las células huésped fácilmente cultivables con elevadas tasas de formación de producto son especialmente adecuadas para la obtención a gran escala de las amilasas híbridas correspondientes.

Se sabe para ambos enzimas de partida pueden ofrecer una contribución al rendimiento de lavado y respectivamente de limpieza de los agentes correspondientes, especialmente en lo que se refiere a las suciedades de almidón y similares al almidón. De este modo, ambas moléculas de tipo silvestre representan los puntos de partida para las \alpha-amilasas que pueden ser adquiridas en el comercio constituidas por el producto BAN® y respectivamente por el producto Termamyl® (fabricante: firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca). Desde luego éstas presentan propiedades enzimáticas diferentes, especialmente en lo que se refiere a la estabilidad térmica. De este modo la estabilidad térmica de la \alpha-amilasa procedente de B. amyloliquefaciens es claramente menor que en el caso de la que procede de B. licheni-formis (Tomazic, S.J., y Klibanov, A.M., (1988), J. Biol. Chem., 263, páginas 3086-3091 y páginas 3092-3096).

Las amilasas híbridas, que pueden ser obtenidas de la forma descrita a partir de ambos enzimas de partida, podrían disponer de actividad amilolítica como es de esperar, debido a las actividades enzimáticas de los enzimas de partida y en base al trabajo de Conrad et al. Sin embargo, esto no significa, obligatoriamente, un aumento del rendimiento de lavado y respectivamente del rendimiento de limpieza de los agentes correspondientes frente a las suciedades que contengan almidón y similares al almidón. A título de ejemplo, pueden estar contenidos también enzimas, que sean esencialmente más inestables que los enzimas de partida y, como consecuencia, que no sean adecuados como componentes para los agentes de lavado y respectivamente de los agentes de limpieza. Sin embargo, éstos serán empleados de manera preferente cuando sean capaces de mejorar el rendimiento de lavado y/o de limpieza al menos de un agente de lavado y respectivamente de limpieza enriquecidos correspondientemente con los mismos, bajo condiciones definidas.

Esto puede verificarse experimentalmente si se prepara una receta de agente de lavado o de limpieza con una amilasa híbrida correspondiente o bien respectivamente sin una amilasa híbrida correspondiente con fines comparativos y verificándose su rendimiento de lavado y, concretamente, de manera especial con respecto a las impurezas que contengan
almidón. Tales ensayos han sido indicados en los ejemplos de realización relativos a la presente solicitud de patente.

Las proteínas de fusión mostradas en la figura 1 de la presente solicitud, y respectivamente en la figura 2 de la publicación citada de los autores Conrad et al., han sido producidas por medio de la fusión por rotura y de la refusión en los puntos situados dentro de los geles de partida, que correspondan en el plano de las proteínas a las posiciones siguientes: 17, 34, 76, 108, 112, 142, 147, 149, 151, 163, 174, 179, 185, 191, 198, 207, 231, 234, 244, 256, 263, 276, 431, 84, 99, 429, 201, 19, 433 y 153 según la numeración de la secuencia de la \alpha-amilasa procedente de B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 2). Esto significa que se encuentra, a continuación del correspondiente extremo C del aminoácido, que adquiere esta posición, un aminoácido procedente, respectivamente, de la otra secuencia. Las formas preferentes de realización de la presente invención contienen tales proteínas híbridas, cuyos puntos de fusión se encuentran dentro de una región de 10 aminoácidos por delante hasta 10 aminoácidos por detrás de estas posiciones. Frente a estas formas de realización son más preferentes aquellas cuyos puntos de fusión se encuentren dentro de un intervalo comprendido entre 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido por delante hasta 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido por detrás de estas posiciones. Y son muy especialmente preferentes aquellas cuyos puntos de fusión se encuentran exactamente en estas posiciones, es decir en el extremo C.

Tal como se ha indicado precedentemente, la identidad de las diversas secuencias parciales, contenidas en las proteínas híbridas y las formas de fusión determinan también su número. Puede imaginarse la secuencia de aminoácidos que se producirá en el caso individual por medio de las secuencias de aminoácidos del tipo silvestre de ambos enzimas de partida, indicadas en el protocolo de secuencias bajo los números SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 4 así como por medio de la figura 2.

Se ha demostrado ya una cierta actividad amilolítica para las amilasas híbridas especiales siguientes en la publicación de los autores Conrad et al.: AL17, AL108, AL142, AL147, AL149, AL151, AL163, AL174, AL179, AL185, AL191, AL198, AL207, AL231, AL234, AL244, AL263, AL276, AL431, ALA17-151, ALA76-151, ALA99-429, ALA12-151, ALA112-201, LA19 y LA431. Por lo tanto éstas caracterizan formas preferentes de realización de la presente invención.

Las amilasas híbridas, que caracterizan formas de realización especialmente preferentes de este objeto de la invención, presentan puntos de fusión cerca de las posiciones 34, 256, 84, 19 y/o 153 según la numeración de la SEQ ID NO. 4. Éstas se encuentran, de una manera más preferente, dentro de un intervalo comprendido entre 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 y 1 aminoácido por delante hasta, de manera más preferente, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 y 1 aminoácido por detrás de estas posiciones.

Entre éstos son especialmente preferentes los agentes con las amilasas híbridas AL34 (SEQ ID NO. 6), AL256 (SEQ ID NO. 12), ALA34-84 (SEQ ID NO. 14) y/o LAL19-153 (SEQ ID NO. 18). Esto se debe a que son capaces de mejorar el rendimiento de lavado y respectivamente el rendimiento de limpieza de las recetas correspondientes frente a las suciedades que contengan almidón o que son similares al almidón. En parte muestran rendimientos de lavado y respectivamente rendimientos de limpieza que son equivalentes a los de los enzimas establecidos en el estado de la técnica, tal como puede verse por medio de los ejemplos de aplicación de la presente solicitud.

Las amilasas híbridas, que caracterizan formas de realización especialmente preferentes de este objeto de la invención, presentan puntos de fusión cerca de las posiciones 19, 76, 112 y/o 433 según la numeración de la SEQ ID NO. 4. De una manera más preferente éstas se encuentran dentro de un intervalo comprendido entre 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 y 1 aminoácido por delante hasta, de manera más preferente, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 y 1 aminoácido por detrás de estas posiciones.

Entre éstos son especialmente preferentes aquellos agentes con tales amilasas híbridas, que presenten como secuencia parcial la secuencia parcial de las posiciones de los aminoácidos 19 hasta 76 de la \alpha-amilasa procedente de Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) y como otra secuencia parcial presentan la secuencia parcial de las posiciones de los aminoácidos 433 hasta 483 de la \alpha-amilasa procedente de Bacillus licheniformis (SEQ ID NO. 2).

A título de ejemplo, se sabe, por el trabajo de los autores Conrad et al., que la región comprendida entre las posiciones 34 y 76 de la \alpha-amilasa procedente de B. amyloliquefaciens, ejerce una función termoestabilizante para el conjunto de la molécula. Sin embargo, es probable que no todas estas regiones sean responsables de esta propiedad, sino que la termoestabilidad esté basada en la interacción con otras regiones de las amilasas. De este modo, los enzimas, que presentan al mismo tiempo la secuencia parcial 19 hasta 76 de la \alpha-amilasa procedentes de B. amyloliquefaciens y las 433 hasta 483 de las posiciones de aminoácidos de la \alpha-amilasa procedentes de B. licheniformis, muestran una buena contribución a los rendimientos de lavado y respectivamente de limpieza de las recetas correspondientes. Esto puede ser el resultado de que ciertas características estructurales, posiblemente aún desconocidas proporcionen a los enzimas bajo condiciones correspondientes (temperatura, valor del pH, fuerza iónica, solicitación mecánica) la capacidad para disolver el almidón o las suciedades similares al almidón sobre las fibras o sobre las superficies duras. Los ejemplos de la presente solicitud demuestran esto.

Por este motivo son muy especialmente preferentes aquellos agentes, que contengan amilasas híbridas, que presenten una identidad con respecto a la AL76 (SEQ ID NO. 8) o con respecto a la AL112 (SEQ ID NO. 10) o con respecto a la LAL19-433 (SEQ ID NO. 16) al menos de un 98%, y de una manera más preferente, de un 98,25%, de un 98,5%, de un 98,75%, de un 99%, de un 99,25%, de un 99,5%, de un 99,75% y de un 100%.

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Estos enzimas han mejorado en los ejemplos indicados el rendimiento de lavado y respectivamente el rendimiento de limpieza de los agentes ahí ensayados frente a las suciedades que contienen almidón o que son similares al almidón. En parte su contribución era tan elevada como la de las amilasas para los agentes de lavado o de limpieza establecidas o incluso la sobrepasaba.

Los buenos rendimientos de lavado y de limpieza de los enzimas AL76, AL112 y LAL19-433 permiten suponer que la combinación de los intervalos de la posición 19 hasta 76 de la \alpha-amilasa procedente de B amyloliquefaciens con el dominio C-terminal de la \alpha-amilasa procedente de B licheniformis, es decir que actúa, a partir de la posición 433, de forma especialmente favorable, no solamente sobre la estabilidad de las variantes correspondientes, sino que también lo hace sobre los rendimientos de lavado y respectivamente sobre los rendimientos de limpieza.

De igual modo quedan abarcados en la protección de la región de homología de estos enzimas especialmente preferentes AL76 (SEQ ID NO. 8), AL112 (SEQ ID NO. 10) y LAL19-433 (SEQ ID NO. 16), aquellos que puedan derivarse de los mismos mediante mutaciones puntuales individuales. A éstos pertenecen de una manera más preferente aquellos con 1, con 2 o con 3 mutaciones puntuales, de manera preferente substituciones en las posiciones de los aminoácidos, que correspondan a las posiciones 134, 320 y 412 en la enumeración de la \alpha-amilasa procedente de B. licheniformis, y respectivamente a las posiciones 132, 320 y 412 en la enumeración de la \alpha-amilasa procedente de B. amyloliquefaciens.

Entre éstas son especialmente preferentes las variantes R132L, A318S y/o T410A de AL76 (según la enumeración de la SEQ ID NO. 8), las variantes R132L, A318S y/o T410A de AL112 (según la enumeración de la SEQ ID NO. 10), y respectivamente las variantes Q134L, A322S y/o T414A de LAL19-433 (según la enumeración de la SEQ ID NO. 16). A título de ejemplo, la variante AL76 R132L/A318S/T410A ha proporcionado resultados sorprendentemente positivos en los ensayos de lavado, que corresponden a los resultados de los ejemplos 2 hasta 7 de la presente solicitud, que son comparables con los resultados de la AL76.

También pueden llevarse a cabo de manera más preferente mutaciones puntuales adicionales y/o diferentes en otras posiciones de las diversas amilasas híbridas, de acuerdo con lo que se ha descrito precedentemente. Entre éstas son preferentes las substituciones de aminoácidos individuales y en este caso, de una manera muy especialmente preferente, las que mejoren una propiedad de las amilasas en lo que se refiere a su empleo en los agentes de lavado o de limpieza. A éstas pertenecen, por ejemplo: la estabilidad frente a las condiciones oxidantes, frente a las temperaturas elevadas, especialmente entre 40 y 95ºC, frente a los agentes desnaturalizantes tales como los tensioactivos o los formadores de complejos, la mejora del enlace del calcio, la adaptación del óptimo de pH, la interacción con el substrato hidrolizante o la modificación del enlace específico o no específico sobre la superficie del producto de limpieza.

La obtención de tales variaciones puede llevarse a cabo mediante mutagénesis específica (site directed mutagenesis) por ejemplo mediante el cebador denominado de Mismatch, como es familiar para el técnico en la materia en el estado de la técnica. De manera alternativa pueden emplearse también procedimientos estadísticos (random mutagenesis) combinados con una selección subsiguiente con respecto a una contribución al rendimiento de lavado de una receta correspondiente de agente de lavado o de agente de limpieza. Tales procedimientos de mutagénesis han sido publicados para las amilasas híbridas, por ejemplo, en las solicitudes de patente WO 96/23874, WO 97/41213 y WO 00/60059. La selección previa de las variantes obtenidas puede llevarse a cabo como se ha descrito en el ejemplo 1 en la presente solicitud y pueden llevarse a cabo otros ensayos de conformidad con los ejemplos siguientes.

Otras formas de realización de este objeto de la invención corresponden a agentes de lavado o a agentes de limpieza, caracterizados porque contienen una amilasa híbrida relevante para la invención, obtenida mediante deleción de, respectivamente, un número no mayor que 5 aminoácidos contiguos y, de una manera más preferente de, respectivamente, un número no mayor que 4, 3, 2 y, de manera especialmente preferente de, respectivamente, sólo un aminoácido.

Tales amilasas híbridas pueden obtenerse, por ejemplo, eliminándose específicamente regiones secuenciales cortas preferentemente durante la fusión, precedentemente descrita, de las secuencias de partida o incluso independientemente de las mismas. En este caso puede tratarse, por ejemplo, de elementos desestabilizantes pequeños o puede tratarse de pérdidas de aminoácidos individuales durante la fusión que no perjudiquen al rendimiento de lavado o bien al rendimiento de limpieza.

Otras formas de realización de este objeto de la invención consiste en agentes de lavado o de limpieza, caracterizados porque contienen como amilasa híbrida una proteína amilolítica obtenida mediante mutación por inserción o una proteína amilolítica quimera, que sea idéntica al menos en una parte proporcionadora de la actividad amilolítica procedente de una de las amilasas híbridas precedentemente descritas.

De este modo es posible, cuando se utilizan las enseñanzas de la publicación WO 99/57250, copular un enzima de este tipo con un dominio de enlace de celulosa para aumentar la interacción con el substrato. De manera análoga pueden fusionarse, por ejemplo, también otros enzimas con actividad de lavado o con actividad de limpieza con una amilasa híbrida relevante de conformidad con la invención. En este caso carece de importancia, en principio, el que la fusión se lleve a cabo de una manera N-terminal o C-terminal o mediante inserción; lo decisivo consiste únicamente en que se consiga el objetivo de poner a disposición un agente que mejore el rendimiento.

Otras formas de realización de este objeto de la invención consisten en agentes de lavado o de limpieza, caracterizados porque contienen un derivado amilolítico de una de las amilasas híbridas precedentemente descritas.

En este caso se trata, de manera especial, de moléculas, que pueden ser obtenidas mediante copulación química de compuestos de bajo peso molecular o de polímeros. El objeto de una modificación de este tipo, por ejemplo de acuerdo con las enseñanzas de la publicación WO 00/22103, puede residir en la reducción del efecto alergénico, de conformidad con la publicación WO 99/58651 en una optimización de los parámetros enzimáticos o de conformidad con la publicación EP 1088887 en el aumento de la estabilidad. A título de ejemplo, de acuerdo con las enseñanzas de la publicación WO 00/26354 pueden modificarse las proteínas también a través de la glicosilación.

Otras formas de realización de este objeto de la invención consisten en agentes de lavado o en agentes de limpieza, caracterizados porque contienen, al menos, una proteína amilolítica o derivado, que tenga en común un determinante antígeno, generado mediante la formación del híbrido, con una de las proteínas o derivados, que han sido citados precedentemente.

Las transiciones relevantes para la invención de una secuencia parcial a otra caracterizan los agentes mejorados, de conformidad con la invención, y las correspondientes formas preferentes de realización. Por otro lado puede proporcionarse fácilmente la prueba de que una amilasa híbrida, esencial para la invención, es realmente activa en un agente correspondiente mediante la reacción de cruce inmunológica.

Los agentes, de conformidad con la invención, contienen a las amilasas híbridas, esenciales para la invención o a sus derivados, preferentemente en cantidades comprendidas entre un 0,000001 por ciento en peso hasta un 5% en peso y, de manera más preferente, comprendidas entre un 0,00005 hasta un 4% en peso, desde un 0,00001 hasta un 3% en peso, desde un 0,0001 hasta un 2% en peso y, de forma especialmente preferente, comprendidas entre un 0,001 hasta un 1% en peso.

Mediante el concepto de agentes de lavado o agentes de limpieza, de conformidad con la invención, quieren indicarse todos aquellos tipos de agentes de limpieza imaginables, tanto concentrados, así como también agentes que deban ser empleados de forma no diluida; para el empleo a escala comercial, en las máquinas lavadoras o en la colada a mano y respectivamente para la limpieza a mano. A éstos pertenecen, por ejemplo, los agentes de lavado para artículos textiles, alfombras, o fibras naturales, para los que se empleará, de conformidad con la presente invención, la denominación de agentes de lavado. A éstos pertenecen, por ejemplo, también los agentes para el fregado de la vajilla para máquinas lavavajillas o para agentes para el fregado a mano de la vajilla o agentes limpiadores para superficies duras tales como metales, vidrio, porcelana, cerámica, baldosines, loza, superficies barnizadas, materiales sintéticos, madera o cuero; para tales se empleará, de conformidad con la presente invención, la denominación de agentes de lavado. Cualquier tipo de agente de limpieza representa una forma de realización de la presente invención en tanto en cuanto esté enriquecida con una proteína de conformidad con la invención.

Las formas de realización de la presente invención abarcan todas las formas de administración establecidas según el estado de la técnica y/o todas las formas de administración convenientes de los agentes de conformidad con la invención. A éstas pertenecen, por ejemplo, los agentes sólidos, en forma de polvo, líquidos, en forma de gel o pastosos, en caso dado incluso constituidos por varias fases, comprimidos o no comprimidos; a éstos pertenecen, además, por ejemplo: los cuerpos extruidos, los granulados, las tabletas o las bolsitas, tanto en recipientes de gran tamaño así como también envasados en forma de porciones.

Además de un enzima esencial para la invención, el agente según la invención contiene, en caso dado, otros componentes tales como los tensioactivos, por ejemplo los tensioactivos no iónicos, aniónicos y/o anfóteros, y/o los agentes de blanqueo y/o los adyuvantes así como, en caso dado, otros componentes usuales.

Como tensioactivos no iónicos se emplearán, preferentemente, alcoholes alcoxilados, ventajosamente etoxilados, especialmente primarios con, preferentemente, 8 hasta 18 átomos de carbono y en promedio 1 hasta 12 moles de óxido de etileno (EO) por mol de alcohol, en los que el resto alcohólico puede ser lineal o, de manera preferente, puede estar ramificado por metilo en la posición 2, o bien puede contener en mezcla restos lineales y ramificados con metilo de tal manera, que esté presente usualmente un resto de oxoalcohol. Sin embargo son especialmente preferentes los alcoholetoxilatos con restos lineales procedentes de alcoholes de origen natural con 12 hasta 18 átomos de carbono, por ejemplo de alcohol de coco, de palma, de grasa de sebo o alcohol oleílico y, en promedio, 2 hasta 8 EO por mol de alcohol. A los alcoholes etoxilados preferentes pertenecen, por ejemplo, los alcoholes con 12 hasta 14 átomos de carbono con 3 EO o con 4 EO, los alcoholes con 9 hasta 11 átomos de carbono con 7 EO, los alcoholes con 13 hasta 16 átomos de carbono con 3 EO, con 5 EO, con 7 EO o con 8 EO, los alcoholes con 12 hasta 18 átomos de carbono con 3 EO, con 5 EO o con 7 EO y mezclas de los mismos, tales como mezclas formadas por alcoholes con 12 hasta 14 átomos de carbono con 3 EO y alcoholes con 12 hasta 18 átomos de carbono con 5 EO. Los grados de etoxilación indicados representan valores estadísticos medios, que pueden ser un número entero o un número fraccionario para un producto especial. Los alcoholetoxilatos preferentes presentan una distribución estrecha de los homólogos (narrow range ethoxylates, NRE). Además de estos tensioactivos no iónicos pueden emplearse también alcoholes grasos con más de 12 EO. Ejemplos a este respecto son alcoholes grasos de sebo con 14 EO, con 25 EO, con 30 EO o con 40 EO.

Otra clase preferente de tensioactivos no iónicos, empleables, que se emplean bien como únicos tensioactivos no iónicos o en combinación con otros tensioactivos no iónicos, son los ésteres de alquilo de los ácidos grasos alcoxilados, preferentemente etoxilados o etoxilados y propoxilados, preferentemente con 1 hasta 4 átomos de carbono en la cadena alquilo, especialmente los ésteres de metilo de los ácidos grasos.

Otra clase de tensioactivos no iónicos que pueden ser empleados de manera ventajosa son los alquilpoliglicósidos (APG). Los alquilpoliglicósidos empleables cumplen la fórmula general RO(G)_{z}, en la que R significa un resto alifático lineal o ramificado, especialmente ramificado con metilo en la posición 2, saturado o insaturado, con 8 hasta 22, preferentemente con 12 hasta 18 átomos de carbono y G es el símbolo que significa una unidad de glicosa con 5 o con 6 átomos de carbono, preferentemente significa glucosa. El grado de glicosilación z está comprendido, en este caso, entre 1,0 y 4,0, preferentemente entre 1,0 y 2,0 y, especialmente, entre 1,1 y 1,4. Preferentemente se emplearán alquilpoliglucósidos, es decir alquilpoliglicósidos en los cuales el resto de poliglicosilo es un resto de glucosa y el resto alquilo es un resto n-alquilo.

También pueden ser adecuados los tensioactivos no iónicos del tipo de los óxidos de amina, especialmente los óxidos de N-cocoalquil-N,N-dimetilamino y los óxidos de N-seboalquil-N,N-dihidroxietilamina, y del tipo de las alcanolamidas de los ácidos grasos. La proporción de estos tensioactivos no iónicos no se encuentra, preferentemente, por encima de la de los alcoholes grasos etoxilados, especialmente no es mayor que la mitad de los mismos.

Otros tensioactivos adecuados son las amidas de los ácidos polihidroxigrasos de la fórmula (II),

1

en la que RCO significa un resto acilo alifático con 6 hasta 22 átomos de carbono, R^{1} significa hidrógeno, un resto alquilo o hidroxialquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono y [Z] significa un resto polihidroxialquilo lineal o ramificado con 3 hasta 10 átomos de carbono y con 3 hasta 10 grupos hidroxilo. Las amidas de los ácidos polihidroxigrasos están constituidas por productos conocidos que, usualmente, pueden obtenerse por medio de aminación por reducción de un azúcar reductor con amoníaco, con una alquilamina o con una alcanolamina y subsiguiente acilación con un ácido graso, con un éster de alquilo de ácido graso o con un cloruro de ácido graso.

Al grupo de las amidas de los ácidos polihidroxigrasos pertenecen, también, los compuestos de la fórmula (III),

2

en la que R significa un resto alquilo o alquenilo lineal o ramificado con 7 hasta 12 átomos de carbono, R^{1} significa un resto alquilo lineal, ramificado o cíclico o un resto arilo con 2 hasta 8 átomos de carbono y R^{2} significa un resto alquilo, lineal, ramificado o cíclico o significa un resto arilo o un resto oxi-alquilo con 1 hasta 8 átomos de carbono, siendo preferentes los restos alquilo con 1 a 4 átomos de carbono o los restos fenilo y [Z] significa un resto polihidroxialquilo lineal, cuya cadena alquilo está substituida con, al menos, dos grupos hidroxilo, o derivados alcoxilados, preferentemente etoxilados o propoxilados de estos restos.

Preferentemente, [Z] se obtiene por medio de la aminación por reducción de un azúcar reductor, por ejemplo la glucosa, la fructosa, la maltosa, la lactosa, la galactosa, la manosa o la xilosa. Los compuestos substituidos por N-alcoxi o por N-ariloxi pueden transformarse, por ejemplo, por medio de la reacción con ésteres de metilo de los ácidos grasos en presencia de un alcóxido a modo de catalizador para dar las amidas de los ácidos polihidroxigrasos
deseadas.

Como tensioactivos aniónicos se emplearán, por ejemplo, aquellos del tipo de los sulfonatos y de los sulfatos. Como tensioactivos del tipo sulfonato entran en consideración en este caso, preferentemente, los bencenosulfonatos de alquilo con 9 hasta 13 átomos de carbono, los olefinasulfonatos, es decir mezclas formadas por alquenosulfonatos e hidroxialcanosulfonatos así como disulfonatos, tales como por ejemplo los que están constituidos por monoolefinas con 12 hasta 18 átomos de carbono con el doble enlace situado en el extremo o en el interior de la cadena por sulfonación con trióxido de azufre gaseoso y subsiguiente hidrólisis alcalina o ácida de los productos de la sulfonación. También son adecuados los alcanosulfonatos, que se obtienen a partir de alcanos con 12 hasta 18 átomos de carbono, por ejemplo, por medio de la sulfocloración o por medio de la sulfoxidación con hidrólisis o bien neutralización subsiguiente. Del mismo modo son adecuados los ácidos \alpha-sulfograsos (éstersulfonatos), por ejemplo los ésteres de metilo \alpha-sulfonados de los ácidos grasos de coco, de semillas de palma o de sebo, hidrogenados.

Otros tensioactivos aniónicos adecuados son los ésteres de glicerina de los ácidos grasos, sulfonados. Se entenderá por ésteres de glicerina de los ácidos grasos los monoésteres, los diésteres y los triésteres así como sus mezclas, como las que se obtienen en la fabricación por esterificación de una monoglicerina con 1 hasta 3 moles de ácido graso o en la transesterificación de los triglicéridos con 0,3 hasta 2 moles de glicerina. Los ésteres de glicerina de los ácidos grasos, sulfonados, preferentes son en este caso los productos de sulfonación de los ácidos grasos saturados, con 6 hasta 22 átomos de carbono, por ejemplo del ácido caprónico, del ácido caprílico, del ácido caprínico, del ácido mirístico, del ácido láurico, del ácido palmítico, del ácido esteárico o del ácido behénico.

Como sulfatos de alqu(en)ilo serán preferentes las sales alcalinas y, especialmente, las sales de sodio de los semiésteres del ácido sulfúrico de los alcoholes grasos con 12 hasta 18 átomos de carbono, por ejemplo constituidos por los alcoholes grasos de coco, los alcoholes grasos de sebo, el alcohol laurílico, el alcohol miristílico, el alcohol cetílico o el alcohol estearílico o de los oxoalcoholes con 10 hasta 20 átomos de carbono y aquellos semiésteres de alcoholes secundarios con estas longitudes de la cadena. Además son preferentes los sulfatos de alqu(en)ilo con las longitudes de las cadenas citadas, que contengan un resto alquilo de cadena lineal sintético, fabricado sobre la base petroquímica, que tengan un comportamiento a la degradación similar al de los compuestos adecuados a base de materias primas de la química de grasas. Desde el punto de vista industrial para el lavado son preferentes los sulfatos de alquilo con 12 hasta 16 átomos de carbono y los sulfatos de alquilo con 12 hasta 15 átomos de carbono así como los sulfatos de alquilo con 14 hasta 15 átomos de carbono. También los sulfatos de 2,3-alquilo son tensioactivos aniónicos adecuados.

Del mismo modo son adecuados los monoésteres del ácido sulfúrico de los alcoholes con 7 hasta 21 átomos de carbono de cadena lineal o de cadena ramificada, etoxilados con 1 hasta 6 moles de óxido de etileno, tales como los alcoholes con 9 hasta 11 átomos de carbono ramificados con 2-metilo con un promedio de 3,5 moles de óxido de etileno (EO) o los alcoholes grasos con 12 hasta 18 átomos de carbono con 1 hasta 4 EO. Éstos se emplearán en los agentes de limpieza únicamente en cantidades relativamente pequeñas, debido a su elevado comportamiento a la formación de espuma, por ejemplo en cantidades de hasta un 5% en peso, usualmente desde un 1 hasta 5% en peso.

Otros tensioactivos aniónicos adecuados son también las sales de los ácidos alquilsulfosuccínicos, que se denominan también como sulfosuccinatos o como ésteres del ácido sulfosuccínico y que representan monoésteres y/o diésteres del ácido sulfosuccínico con alcoholes, preferentemente con alcoholes grasos y, especialmente, con alcoholes grasos etoxilados. Los sulfosuccinatos preferentes contienen restos de alcoholes grasos con 8 hasta 18 átomos de carbono o mezclas formadas por los mismos. Son especialmente preferentes los sulfosuccinatos que contengan un resto de alcohol graso, que se derive de alcoholes grasos etoxilados, que considerados en sí mismos sean tensioactivos no iónicos (para la descripción véase más arriba). En este caso son especialmente preferentes, a su vez, los sulfosuccinatos, cuyos restos de alcohol graso se derivan de alcoholes grasos etoxilados con una distribución estrecha de los homólogos. Del mismo modo, es posible, también, emplear ácidos alqu(en)ilsuccínicos preferentemente con 8 hasta 18 átomos de carbono en la cadena de alqu(en)ilo o sus sales.

Como otros tensioactivos aniónicos entran en consideración especialmente los jabones. Son adecuados los jabones de ácidos grasos saturados, tales como las sales del ácido láurico, del ácido mirístico, del ácido palmítico, del ácido esteárico, del ácido erúcico hidrogenado y del ácido behénico así como, especialmente, las mezclas de jabones derivadas de los ácidos grasos naturales, por ejemplo los ácidos grasos de coco, de semillas de palma o de sebo. Los tensioactivos aniónicos con inclusión de los jabones pueden presentarse en forma de sus sales de sodio, de potasio o de amonio así como en forma de sales solubles de bases orgánicas, tales como la monoetanolamina, la dietanolamina o la trietanolamina. Preferentemente los tensioactivos aniónicos se presentan en forma de sus sales de sodio, de potasio, especialmente en forma de sus sales de sodio.

Los tensioactivos pueden estar contenidos en los agentes de lavado o de limpieza, según la invención, en total en una cantidad desde aproximadamente un 5% en peso hasta un 50% en peso, especialmente desde un 8% en peso hasta un 30% en peso, referido al agente acabado.

Los agentes según la invención pueden contener agentes de blanqueo. Entre los compuestos suministradores de H_{2}O_{2} en agua, que sirven como agentes de blanqueo, tienen un significado especial el percarbonato de sodio, el tetrahidrato de perborato de sodio y el monohidrato de perborato de sodio. Otros agentes de blanqueo empleables son, por ejemplo, los peroxopirofosfatos, los citratoperhidratos así como las sales perácidas o los perácidos suministradores de H_{2}O_{2}, tales como los persulfatos o bien el ácido persulfúrico. También puede emplearse el peroxohidrato de urea percarbamida, que puede describirse por medio de la fórmula H_{2}N-CO-NH_{2}\cdotH_{2}O_{2}. Especialmente podrán estar contenidos también, en caso deseado, agentes de blanqueo del grupo de los agentes de blanqueo orgánicos, cuando se utilicen los agentes para la limpieza de superficies duras, por ejemplo en el fregado a máquina de la vajilla, aún cuando su empleo sea posible en principio, también, en los agentes para el lavado de los artículos textiles. Los agentes de blanqueo orgánicos típicos son los peróxidos de diacilo, tal como por ejemplo el peróxido de dibenzoilo. Otros agentes de blanqueo orgánicos típicos son los peroxiácidos, citándose como ejemplos especialmente los alquilperoxiácidos y los arilperoxiácidos. Los representantes preferentes son el ácido peroxibenzoico y sus derivados de substitución en el anillo, tales como los ácidos alquilperoxibenzoicos, así como también el ácido peroxi-\alpha-naftoico y el monoperftalato de magnesio, los peroxiácidos alifáticos o alifáticos substituidos, tales como el ácido peroxiláurico, el ácido peroxiesteárico, el ácido \varepsilon-ftalimidoperoxicaprónico (ácido ftalimidoperoxihexanoico, PAP), el ácido o-carboxibenzamidoperoxicaprónico, el ácido N-nonenilamidoperadípico y el N-nonenilamidopersuccinato, y los ácidos peroxidicarboxílicos alifáticos y aralifáticos, tales como el ácido 1,12-diperoxicarboxílico, el ácido 1,9-diperoxiazelaico, el ácido diperoxisebácico, el ácido diperoxibrasílico, los ácidos diperoxiftálicos, el ácido 2-decildiperoxibutano-1,4-dioico, el ácido N,N-tereftaloil-di(6-aminopercaprónico).

El contenido de los agentes en agentes de blanqueo puede estar comprendido entre un 1 y un 40% en peso y, especialmente, entre un 10 y un 20% en peso, empleándose ventajosamente el monohidrato de perborato o el percarbonato. Se ha descrito un empleo sinérgico de las amilasas con percarbonato o de las amilasas con el ácido percarboxílico en las solicitudes de patente WO 99/63036 y respectivamente WO 99/63037.

Con el fin de conseguir un efecto de blanqueo mejorado cuando se lleve a cabo la colada a temperaturas de 60ºC y por debajo de este valor y, especialmente, en el tratamiento previo de la colada, los agentes podrán contener también activadores de blanqueo. Como activadores de blanqueo pueden emplearse compuestos que generen, bajo condiciones de perhidrólisis, ácidos peroxocarboxílicos alifáticos con, preferentemente, 1 hasta 10 átomos de carbono, especialmente con 2 hasta 4 átomos de carbono, y/o ácidos perbenzoicos substituidos en caso dado. Son adecuadas las substancias que porten grupos de O-acilo y/o grupos de N-acilo con el número de átomos de carbono citado y/o que porten grupos benzoilo substituidos en caso dado. Son preferentes las alquilendiaminas poliaciladas, especialmente la tetraacetiletilendiamina (TAED), los derivados de triazina acilados, especialmente la 1,5-diacetil-2,4-dioxohexahidro-1,3,5-triazina (DADHT), los glicolurilos acilados, especialmente el 1,3,4,6-tetraacetilglicolurilo (TAGU), las N-acilimidas, especialmente la N-nonanoilsuccinimida (NOSI), los fenolsulfonatos acilados, especialmente los oxibencenosulfonatos de n-nonanoilo o de isononanoilo (n- y respectivamente iso-NOBS), los ácidos hidroxicarboxílicos acilados, tales como el citrato de trietil-O-acetilo (TEOC), los anhídridos de los ácidos carboxílicos, especialmente el anhídrido del ácido ftálico, el anhídrido del ácido isatoico y/o el anhídrido del ácido succínico, las amidas de los ácidos carboxílicos, tal como la N-metildiacetamida, los glicoluros, los alcoholes polivalentes acilados, especialmente la triacetina, el diacetato de etilenglicol, el acetato de isopropenilo, el 2,5-diacetoxi-2,5-dihidrofurano y los ésteres de enol, conocidos por las solicitudes de patente alemanas DE 196 16 693 y DE 196 16 767 así como el sorbitol y el manitol acetilados o bien sus mezclas (SORMAN) descritas en la solicitud de patente europea EP 0 525 239, los derivados sacáricos acilados, especialmente la pentaacetilglucosa (PAG), la pentaacetilfructosa, la tetraacetilxilosa y la octaacetillactosa así como la glucamina acetilada, en caso dado N-alquilada o bien la gluconolactona, el triazol o bien los derivados de triazol y/o las caprolactamas y/o los derivados de caprolactama, en forma de partículas, preferentemente las lactamas N-aciladas, por ejemplo la N-benzoilcaprolactama y la N-acetilcaprolactama, que se conocen por las solicitudes de patente internacionales WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 y WO 95/17498. Del mismo modo se emplearán, preferentemente, los acilacetales substituidos de manera hidrófila, conocidos por la solicitud de patente alemana DE 196 16 769 y las acillactamas descritas en la solicitud de patente alemana DE 196 16 770 así como en la solicitud de patente internacional WO 95/14075. También pueden emplearse las combinaciones de los activadores de blanqueo convencionales conocidas por la solicitud de patente alemana DE 4443 177. Del mismo modo pueden emplearse derivados del nitrilo tales como las cianopiridinas, los nitrilquats, por ejemplo los N-alquilamonioacetonitrilos, y/o los derivados de cianamida. Los activadores de blanqueo preferentes son el 4-(octanoiloxi)-bencenosulfonato de sodio, el oxibencenosulfonato de n-nonanoilo o de isononanoilo (n- y respectivamente iso-NOBS), el oxibencenosulfonato de undecenoilo (UDOBS), el dodecanoiloxibencenosulfonato de sodio (DOBS), el ácido decanoiloxibenzoico (DOBA, OBC 10) y/o el oxibencenosulfonato de dodecanoilo (OBS 12), así como el acetonitrilo de N-metilmorfolino (MMA). Dichos activadores de blanqueo pueden estar contenidos en las cantidades usuales desde un 0,01 hasta un 20% en peso, preferentemente en cantidades desde un 0,1 hasta un 15% en peso, especialmente desde un 1% en peso hasta un 10% en peso, referido al conjunto de la composición.

Además de los activadores de blanqueo convencionales o en su lugar pueden estar contenidos también los denominados catalizadores de blanqueo. Estos productos están constituidos por sales de los metales de transición o bien complejos de los metales de transición, que refuerzan el blanqueo, tales como por ejemplo los complejos de sales o los complejos de carbonilo de Mn, de Fe, de Co, de Ru o de Mo. También son adecuados como catalizadores de blanqueo los complejos de Mn, de Fe, de Co, de Ru, de Mo, de Ti, de V y de Cu con ligandos tripodo que contengan N así como los complejos de amina con Co, con Fe, con Cu y con Ru, empleándose preferentemente aquellos compuestos que han sido descritos en la publicación DE 197 09 284 A1. Los derivados del acetonitrilo según la publicación WO 99/63038 y los compuestos de los complejos de los metales de transición, activadores de blanqueo, según la publicación WO 99/63041, pueden desplegar un efecto activador del blanqueo en combinación con amilasas.

Los agentes según la invención contienen, por regla general, uno o varios adyuvantes, especialmente zeolitas, silicatos, carbonatos, coadyuvantes orgánicos y -cuando no se opongan a su empleo motivos ecológicos- también los fosfatos. Estos últimos son productos estructurantes a ser empleados preferentemente en particular en los agentes de limpieza para el fregado a máquina de la vajilla.

En este caso deben citarse los silicatos de sodio cristalinos, estratificados de la fórmula general NaMSi_{x}O_{2x+1}\cdotyH_{2}O, en la que M significa sodio o hidrógeno, x significa un número desde 1,6 hasta 4, preferentemente desde 1,9 hasta 4,0 e y significa un número desde 0 hasta 20 y siendo preferentes para x los valores 2, 3 o 4. Tales silicatos estratificados cristalinos han sido descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 0164 514. Los silicatos estratificados cristalinos preferentes de la fórmula indicada son aquellos en los cuales M significa sodio y x toma los valores 2 o 3. Son especialmente preferentes tanto los disilicatos de sodio \beta así como también los disilicatos de sodio \delta Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O. En el comercio se encuentran tales compuestos por ejemplo bajo la denominación SKS® (firma Clariant). De este modo el SKS-6® está constituido preponderantemente por un disilicato de sodio \delta con la fórmula Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O, en el caso del SKS-7® se trata preponderantemente del disilicato de sodio \beta. Mediante la reacción con ácidos (por ejemplo con el ácido cítrico o con el ácido carbónico) se obtienen a partir de los disilicatos de sodio \delta la canemita NaHSi_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O, que se encuentra en el comercio bajo las denominaciones SKS-9® o bien SKS-10® (firma Clariant). También puede ser ventajoso emplear modificaciones químicas de estos silicatos estratificados. De este modo puede influenciarse, por ejemplo, adecuadamente la alcalinidad de los silicatos estratificados. Los silicatos estratificados dopados con fosfato o bien con carbonato presentan, en comparación con el disilicato de sodio \delta, morfologías cristalinas modificadas, se disuelven más rápidamente y presentan, en comparación con el disilicato de sodio \delta, una mayor capacidad de enlace con el calcio. De este modo se han descrito silicatos estratificados con la fórmula empírica general x Na_{2}O \cdot y SiO_{2} \cdot z P_{2}O_{5}, en la que la relación entre x e y corresponde a un número desde 0,35 hasta 0,6, la relación entre x y z corresponde a un número desde 1,75 hasta 1.200 y la relación entre y con respecto a z corresponde a un número desde 4 hasta 2.800, en la solicitud de patente DE 196 01 063. La solubilidad de los silicatos estratificados puede aumentarse también si se emplean silicatos estratificados especialmente finos. También pueden emplearse mixturas constituidas por silicatos estratificados cristalinos con otros componentes. En este caso deben citarse, especialmente, las mixturas con los derivados de la celulosa, que presentan ventajas en cuanto a su acción desintegrante y, especialmente, que se emplean en las tabletas de agentes de lavado, así como mixturas con policarboxilatos,
por ejemplo el ácido cítrico, o bien con policarboxilatos polímeros, por ejemplo copolímeros del ácido acrílico.

También pueden emplearse silicatos de sodio amorfos con un módulo Na_{2}O : SiO_{2} desde 1:2 hasta 1:3,3, preferentemente desde 1:2 hasta 1:2,8 y, especialmente, desde 1:2 hasta 1:2,6, que se disuelven de manera retardada y que presentan propiedades de lavado secundario. El retardo de la disolución frente a los silicatos de sodio amorfos tradicionales puede provocarse en este caso de diversas maneras, por ejemplo por medio del tratamiento superficial, por medio de la formación de mixturas, por compactación/recalcado o por medio del sobresecado. En el ámbito de esta invención se entenderá por el concepto "amorfo" también "amorfo a los rayos X". Es decir que los silicatos no proporcionan reflejos nítidos a los rayos X en los experimentos de difracción de los rayos X, como los que son típicos para las substancias cristalinas, sino que, en todo caso, presentan uno o varios máximos en la irradiación dispersada de los rayos X, que presentan una anchura de varias unidades de grado en el ángulo de difracción. Sin embargo puede conducir incluso a propiedades adyuvantes especialmente buenas el que las partículas de silicato proporcionen en los experimentos de difracción electrónica máximos de difracción acrecentados e incluso nítidos. Esto debe interpretarse de tal manera, que los productos presentan zonas microcristalinas con un tamaño de 10 hasta algunos cientos de nm, siendo preferentes valores de hasta 50 nm como máximo y, especialmente preferentes, de hasta 20 nm como máximo. Son especialmente preferentes los silicatos amorfos recalcados/compactados, los silicatos amorfos en forma de mixturas y los silicatos amorfos a los rayos X sobresecados.

Una zeolita, que puede ser empleada en caso dado, finamente cristalina, sintética y que contenga agua enlazada es, por ejemplo, la zeolita A y/o P. Como zeolita P será especialmente preferente la zeolita MAP® (producto comercial de la firma Crosfield). Sin embargo son adecuadas también la zeolita X así como las mezclas formadas por A, X y/o P. También puede obtenerse en el comercio y puede emplearse en el ámbito de la presente invención, preferentemente, por ejemplo un cocristalizado formado por zeolita X y por zeolita A (aproximadamente 80% en peso de zeolita X), que se comercializa por la firma CONDEA Augusta S.p.A. bajo la marca registrada VEGOBOND AX® y que puede describirse por medio de la fórmula

nNa_{2}O \cdot (1-n)K_{2}O \cdot Al_{2}O_{3} \cdot (2 - 2,5)SiO_{2} \cdot (3,5 - 5,5) H_{2}O.

Las zeolitas adecuadas presentan un tamaño medio de las partículas menor que 10 \mum (distribución en volumen; método de medición: Coulter Counter) y preferentemente contienen desde un 18 hasta un 22% en peso, especialmente desde un 20 hasta un 22% en peso de agua enlazada.

Evidentemente, es posible también el empleo de los fosfatos conocidos en general como substancias adyuvantes, en tanto en cuanto un empleo de este tipo no deba ser evitado por motivos ecológicos. Entre la pluralidad de fosfatos, que pueden ser adquiridos en el comercio, han adquirido un gran significado los fosfatos de los metales alcalinos, de una manera especialmente preferente los trifosfatos de pentasodio y respectivamente de pentapotasio (tripolifosfato de sodio y respectivamente tripolifosfato de potasio) en la industria para los agentes de lavado y de limpieza.

La expresión fosfatos de metales alcalinos abarca en este caso las sales de los metales alcalinos (especialmente de sodio y de potasio) de los diversos ácidos fosfóricos, entre los cuales se puede distinguir entre el ácido metafosfórico (HPO_{3})_{n} y el ácido ortofosfórico H_{3}PO_{4} además de representantes de mayor peso molecular. Los fosfatos reúnen en este caso varias ventajas en sí mismos: actúan como portadores de álcali, impiden los depósitos de cal sobre las partes de las máquinas o bien las incrustaciones de cal en los tejidos y contribuyen, además, al rendimiento de limpieza.

El dihidrógenofosfato de sodio, NaH_{2}PO_{4}, existe en forma de dihidrato (densidad 1,91 gcm^{-3}, punto de fusión 60ºC) y a modo de monohidrato (densidad 2,04 gcm^{-3}). Ambas sales son blancas, polvos muy fácilmente solubles en agua, que pierden el agua de cristalización por calentamiento y que se transforman a 200ºC en el difosfato débilmente ácido (hidrógenodifosfato disódico, Na_{2}H_{2}P_{2}O_{7}), a temperaturas más elevadas en el trimetafosfato de sodio (Na_{3}P_{3}O_{9}) y en la sal de Maddrell (véase más adelante). El NaH_{2}PO_{4} tiene reacción ácida; se forma cuando se ajusta ácido fosfórico con lejía de hidróxido de sodio a un valor del pH de 4,5 y se pulveriza el caldo. El dihidrógenofosfato de potasio (fosfato de potasio primario o monobásico, bifosfato de potasio, KDP), KH_{2}PO_{4}, es una sal blanca con una densidad de 2,33 gcm^{-3}, tiene un punto de fusión de 253ºC [descomposición con formación de polifosfato de potasio (KPO_{3})_{x}] y es fácilmente soluble en agua.

El hidrógenofosfato disódico (fosfato sódico secundario), Na_{2}HPO_{4}, es una sal incolora, cristalina, muy fácilmente soluble en agua. Existe en estado anhidro y con 2 moléculas de agua (densidad 2,066 gmc^{-3}, pérdida de agua a 95ºC), con 7 moléculas de agua (densidad 1,68 gcm^{-3}, punto de fusión 48ºC con pérdida de 5 H_{2}O) y con 12 moléculas de agua (densidad 1,52 gcm^{-3}, punto de fusión 35ºC con pérdida de 5 H_{2}O), a 100ºC se vuelve anhidro y se transforma, por calentamiento más pronunciado, en el difosfato Na_{4}P_{2}O_{7}. El hidrógenofosfato disódico se prepara por neutralización de ácido fosfórico con solución de carbonato de sodio con empleo de fenolftaleína como indicador. El hidrógenofosfato dipotásico (fosfato de potasio secundario o dibásico), K_{2}HPO_{4}, es una sal blanca, amorfa, que es fácilmente soluble en agua.

El fosfato trisódico, fosfato de sodio terciario, Na_{3}PO_{4}, está constituido por cristales incoloros, que presentan, en forma de dodecahidrato, una densidad de 1,62 gcm^{-3} y un punto de fusión de 73-76ºC (descomposición), a modo de decahidrato (lo que corresponde a un 19-20% de P_{2}O_{5}) un punto de fusión de 100ºC y en forma anhidra (lo que corresponde a un 39-40% de P_{2}O_{5}), presenta una densidad de 2,536 gcm^{-3}. El fosfato trisódico es fácilmente soluble en agua con reacción alcalina y se prepara por medio de la concentración por evaporación de una solución formada exactamente por 1 mol de fosfato disódico y 1 mol de NaOH. El fosfato tripotásico (fosfato de potasio terciario o tribásico) K_{3}PO_{4}, es un polvo blanco, granular, esparcible, con una densidad de 2,56 gcm^{-3}, tiene un punto de fusión de 1.340ºC y es fácilmente soluble en agua con reacción alcalina. De manera ejemplificativa se forma por calentamiento de escoria de Thomas con carbón y sulfato de potasio. A pesar del precio mayor son preferentes muchas veces en la industria de los agentes de limpieza los fosfatos de potasio más fácilmente solubles, por lo tanto más activos, frente a los compuestos de sodio correspondientes.

El difosfato tetrasódico (pirofosfato de sodio), Na_{4}P_{2}O_{7}, existe en forma anhidra (densidad 2,534 gcm^{-3}, punto de fusión 988ºC, también se ha dado con 880ºC) y a modo de decahidrato (densidad 1,815-1,836 gcm^{-3}, punto de fusión 94ºC con pérdida de agua). Ambas substancias son cristales incoloros, solubles en agua con reacción alcalina. El Na_{4}P_{2}O_{7} se forma por calentamiento de fosfato disódico a temperaturas > 200ºC o por reacción de ácido fosfórico con carbonato de sodio en proporción estequiométrica y eliminación del agua de la solución por medio de la pulverización. El decahidrato forma sales complejas con los metales pesados y con los formadores de la dureza y reduce, por lo tanto, la dureza del agua. El difosfato de potasio (pirofosfato de potasio), K_{4}P_{2}O_{7}, existe en forma de trihidrato y representa un polvo incoloro, higroscópico, con una densidad de 2,33 gcm^{-3}, que es soluble en agua, siendo el pH de la solución al 1%, a 25ºC, de 10,4.

Mediante condensación del NaH_{2}PO o bien del KH_{2}PO_{4} se forman fosfatos de sodio y de potasio de elevado peso molecular, entre los cuales pueden distinguirse representantes cíclicos, los metafosfatos de sodio o bien de potasio y tipos en forma de cadenas, los polifosfatos de sodio o bien de potasio. Especialmente se utiliza una gran cantidad de denominaciones para estos últimos: fosfato por fusión o por calcinación, sal de Graham, sal de Kurrol y de Maddrell. Todos los fosfatos de sodio y de potasio superiores se denominan, en conjunto, fosfatos condensados.

El trifosfato pentasódico, industrialmente importante, Na_{5}P_{3}O_{10} (tripolifosfato de sodio), es una sal anhidra o que cristaliza con 6 H_{2}O, no higroscópica, blanca, soluble en agua de la fórmula general NaO-[P(O)(ONa)-O]_{n}-Na con n=3. A temperatura ambiente se disuelven, en 100 g de agua, aproximadamente 17 g, a 60ºC, aproximadamente 20 g, a 100ºC aproximadamente 32 g de la sal exenta de agua de cristalización; al cabo de un calentamiento de dos horas de la solución a 100ºC se forma, por hidrólisis, aproximadamente un 8% de ortofosfato y un 15% de difosfato. En la fabricación del trifosfato pentasódico se hace reaccionar ácido fosfórico con solución de carbonato de sodio o con lejía de hidróxido de sodio en proporción estequiométrica y se libera la solución del agua, por medio de la pulverización. De manera similar a lo que ocurre en el caso de la sal de Graham y del difosfato de sodio, el trifosfato pentasódico disuelve muchos compuestos metálicos insolubles (también jabones de cal, etc.). El trifosfato pentapotásico, K_{5}P_{3}O_{10} (tripolifosfato de potasio), se comercializa por ejemplo en forma de una solución al 50% en peso (> 23% de P_{2}O_{5}, 25% de K_{2}O). Los polifosfatos de potasio encuentran una amplia aplicación en la industria de los agentes de lavado y de limpieza. Además existen también tripolifosfatos de sodio y de potasio que igualmente pueden emplearse en el ámbito de la presente invención. Éstos se forman, por ejemplo, cuando se hidroliza con KOH el trimetafosfato de sodio:

(NaPO_{3})_{3} + 2 KOH \rightarrow Na_{3}K_{2}P_{3}O_{10} + H_{2}O

Estos fosfatos pueden emplearse, según la invención, exactamente igual que el tripolifosfato de sodio, el tripolifosfato de potasio o las mezclas de ambos, también pueden emplearse, según la invención, mezclas constituidas por tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de sodio y de potasio o mezclas constituidas por tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio y de potasio o mezclas constituidas por tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio y de potasio.

Como coadyuvantes orgánicos pueden utilizarse en los agentes de lavado y de limpieza según la invención, especialmente policarboxilatos o ácidos policarboxílicos, policarboxilatos polímeros, ácido asparagínico, poliacetales, dextrinas en caso dado oxidadas, otros coadyuvantes orgánicos (véase lo expuesto posteriormente), así como fosfonatos. Estas clases de productos se describen a continuación.

Las substancias estructurantes orgánicas, empleables son, por ejemplo, los ácidos policarboxílicos que pueden utilizarse en forma de sus sales de sodio, entendiéndose por ácidos policarboxílicos aquellos ácidos carboxílicos que llevan más de una función ácida. Éstos son, por ejemplo, el ácido cítrico, el ácido adípico, el ácido succínico, el ácido glutárico, el ácido málico, el ácido tartárico, el ácido maleico, el ácido fumárico, los ácidos sacáricos, los ácidos aminocarboxílicos, el ácido nitrilotriacético (NTA), siempre que este tipo de uso no pueda rechazarse por motivos ecológicos, así como mezclas de los mismos. Las sales preferidas son las sales de los ácidos policarboxílicos, tales como el ácido cítrico, el ácido adípico, el ácido succínico, el ácido glutárico, el ácido tartárico, los ácidos sacáricos y mezclas de las mismas.

También pueden utilizarse los ácidos en sí mismos. Además de su efecto de adyuvante, los ácidos tienen también típicamente la propiedad de un componente de acidificación y, con ello, sirven también para el ajuste de un valor de pH bajo y suave de los agentes de lavado y de los agentes de limpieza, en tanto en cuanto el valor del pH obtenido por medio de la mezcla de los componentes restantes no sea el deseado. De manera especial se trata en este caso de ácidos compatibles con el sistema y con el medio ambiente, tales como el ácido cítrico, el ácido acético, el ácido tartárico, el ácido málico, el ácido láctico, el ácido glicólico, el ácido succínico, el ácido glutárico, el ácido adípico, el ácido glucónico y cualquier mezcla de éstos. Además pueden servir como reguladores del pH, también, los ácidos minerales, especialmente el ácido sulfúrico o las bases, especialmente los hidróxidos de amonio o los hidróxidos alcalinos. Tales reguladores están contenidos en los agentes, según la invención, en cantidades preferentemente no mayores que el 20% en peso, especialmente desde un 1,2% en peso hasta un 17% en peso.

Además, como adyuvantes son adecuados los policarboxilatos polímeros, éstos son, por ejemplo, las sales de metales alcalinos del ácido poliacrílico o del ácido polimetacrílico, por ejemplo aquellas con un peso molecular relativo de 500 a 70.000 g/mol.

En cuanto a los pesos moleculares indicados para los policarboxilatos polímeros se trata, en el sentido de este documento, de pesos moleculares M_{w} promedio en peso de la forma respectiva del ácido, que se determinaron básicamente por medio de la cromatografía de permeación en gel (GPC), para lo cual se utilizó un detector de rayos UV. A este respecto, la medición se realizó frente a un patrón externo de ácido poliacrílico, que proporciona valores de peso molecular similares a los reales debido a su afinidad estructural con los polímeros analizados. Estos datos difieren marcadamente de los datos de pesos moleculares para los cuales se utiliza un patrón de ácidos poliestirenosulfónicos. Los pesos moleculares medidos frente a los ácidos poliestirenosulfónicos son en general marcadamente más altos que los pesos moleculares indicados en este documento.

Los polímeros adecuados son especialmente poliacrilatos, que presentan preferentemente un peso molecular de 2.000 a 20.000 g/mol. Debido a su solubilidad superior, de este grupo pueden preferirse a su vez los poliacrilatos de cadena corta, que presentan pesos moleculares de 2.000 a 10.000 g/mol y, de forma especialmente preferente, de 3.000 a 5.000 g/mol.

Además, son adecuados los policarboxilatos copolímeros, especialmente aquellos del ácido acrílico con ácido metacrílico y del ácido acrílico o del ácido metacrílico con ácido maleico. Han demostrado ser especialmente adecuados los copolímeros del ácido acrílico con ácido maleico, que contienen del 50 al 90% en peso de ácido acrílico y del 50 al 10% en peso de ácido maleico. Su peso molecular relativo, referido al ácido libre, es generalmente de 2.000 a 70.000 g/mol, preferentemente de 20.000 a 50.000 g/mol y especialmente de 30.000 a 40.000 g/mol. Los policarboxilatos (co)polímeros pueden utilizarse o bien como polvo o bien como solución acuosa. El contenido de policarboxilatos (co)polímeros de los agentes es preferentemente del 0,5 al 20% en peso, especialmente del 1 al 10% en peso.

Para mejorar la solubilidad en agua, los polímeros pueden contener también ácidos alilsulfónicos como monómeros, como por ejemplo el ácido aliloxibencenosulfónico y el ácido metalilsulfónico.

También se prefieren especialmente los polímeros biodegradables de más de dos unidades de monómeros diferentes, por ejemplo aquellos que contienen como monómeros, sales del ácido acrílico y del ácido maleico, así como alcohol vinílico o bien derivados del alcohol vinílico, o contienen como monómeros, sales del ácido acrílico y del ácido 2-alquilalilsulfónico, así como derivados sacáricos.

Otros copolímeros preferentes son aquellos que presentan como monómeros preferentemente acroleína y ácido acrílico/sales del ácido acrílico o bien acroleína y acetato de vinilo.

También deben mencionarse como substancias adyuvantes preferidas los ácidos aminodicarboxílicos polímeros, sus sales o sus substancias precursoras. Se prefieren especialmente los ácidos poliasparagínicos o bien sus sales y derivados.

Otras substancias adyuvantes adecuadas son los poliacetales, que pueden obtenerse por reacción de dialdehídos con ácidos poliolcarboxílicos, que presentan de 5 a 7 átomos de carbono y al menos 3 grupos hidroxilo. Los poliacetales preferentes se obtienen a partir de dialdehídos, tales como glioxal, glutaraldehído, tereftalaldehído, así como sus mezclas, y a partir de ácidos poliolcarboxílicos, tales como ácido glucónico y/o ácido glucoheptónico.

Otras substancias adyuvantes orgánicas adecuadas son dextrinas, por ejemplo oligómeros o bien polímeros de hidratos de carbono, que pueden obtenerse por hidrólisis parcial de almidones. La hidrólisis puede realizarse según procedimientos usuales, por ejemplo catalizados por ácidos o por enzimas. Preferentemente se trata de productos de hidrólisis con pesos moleculares promedio en el intervalo de 400 a 500.000 g/mol. En este caso, es preferente un polisacárido con un equivalente de dextrosa (ED) en el intervalo de 0,5 a 40, especialmente de 2 a 30, con lo que ED es una medida usual para el efecto reductor de un polisacárido en comparación con la dextrosa, que tiene un ED de 100. Son empleables tanto las maltodextrinas con un ED de entre 3 y 20 y los jarabes de glucosa secos con un ED de entre 20 y 37, como también las denominadas dextrinas amarillas y dextrinas blancas con mayores pesos moleculares en el intervalo de 2.000 a 30.000 g/mol.

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En cuanto a los derivados oxidados de este tipo de dextrinas se trata de sus productos de reacción con agentes oxidantes, que sean capaces de oxidar al menos una función de alcohol del anillo del sacárido para dar una función de ácido carboxílico. Los adyuvantes orgánicos, especialmente preferentes para los agentes, según la invención, son los almidones oxidados, o bien sus derivados conocidos por las solicitudes EP 472 042, WO 97/25399 y EP 755 944.

Otros coadyuvantes adecuados son también los oxidisuccinatos y otros derivados de los disuccinatos, preferentemente el etilendiaminodisuccinato. En este caso, el etilendiamino-N,N'-disuccinato (EDDS) se utiliza preferentemente en forma de sus sales de sodio o magnesio. En este contexto son preferentes además los disuccinatos de glicerina y los trisuccinatos de glicerina. Las cantidades de uso adecuadas son del 3 al 15% en peso, en formulaciones que contienen zeolita y/o que contienen silicato.

Otros adyuvantes orgánicos empleables son, por ejemplo, los ácidos hidroxicarboxílicos acetilados o bien sus sales, que, en caso dado, también pueden estar presentes en forma de lactona y que contienen al menos 4 átomos de carbono y al menos un grupo hidroxilo, así como un máximo de dos grupos ácidos.

Otra clase de substancias con propiedades de coadyuvante son los fosfonatos. En este caso se trata especialmente de fosfonatos de hidroxialcanos o bien de fosfonatos de aminoalcano. Bajo los fosfonatos de hidroxialcanos, el 1,1-difosfonato de 1-hidroxietano (HEDP) tiene una especial importancia como coadyuvante. Se utiliza preferentemente como sal de sodio, reaccionando la sal disódica neutra y la sal tetrasódica alcalina (pH 9). Como fosfonatos de aminoalcano se consideran preferentemente el fosfonato de etilendiaminotetrametileno (EDTMP), el fosfonato de dietilentriaminopentametileno (DTPMP), así como sus homólogos superiores. Se utilizan preferentemente en forma de las sales de sodio de reacción neutra, por ejemplo como la sal hexasódica de EDTMP o como sal heptasódica y octasódica de DTPMP. En este caso, de la clase de los fosfonatos se utiliza preferentemente como adyuvante el HEDP. Además, los fosfonatos de aminoalcano tienen un marcado poder de unión de metales pesados. De manera correspondiente puede ser preferente el uso de fosfonatos de aminoalcano, especialmente de DTPMP, especialmente cuando los agentes también contienen agentes de blanqueo, o el uso de mezclas de los fosfonatos mencionados.

Además, todos los compuestos capaces de formar complejos con iones alcalinotérreos pueden utilizarse como coadyuvante.

Las substancias adyuvantes pueden estar contenidas en los agentes, según la invención, en caso dado en cantidades de hasta un 90% en peso. Preferentemente éstas están contenidas en cantidades de hasta un 75% en peso. Los agentes de lavado, según la invención, presentan contenidos en adyuvantes especialmente desde un 5% en peso hasta un 50% en peso. En los agentes según la invención para la limpieza de superficies duras, especialmente para la limpieza a máquina de la vajilla, el contenido en las substancias adyuvantes se encuentra preferentemente entre un 5% en peso y un 88% en peso, no empleándose materiales adyuvantes solubles en agua preferentemente en tales agentes. En una forma preferente de realización de los agentes según la invención especialmente para la limpieza a máquina de la vajilla está contenido desde un 20% en peso hasta un 40% en peso de adyuvantes orgánicos solubles en agua, especialmente de citratos alcalinos, desde un 5% en peso hasta un 15% en peso de carbonatos alcalinos y desde un 20% en peso hasta un 40% en peso de disilicatos alcalinos.

Los disolventes, que pueden ser empleados en las composiciones líquidas hasta en forma de gel de los agentes de lavado y de limpieza proceden, de manera ejemplificativa, del grupo de alcoholes monovalentes o polivalentes, de las alcanolaminas o de los glicoléteres, en tanto en cuanto éstos sean miscibles con agua en el intervalo de concentración indicado. Preferentemente se seleccionan los disolventes entre el etanol, el n- o i-propanol, los butanoles, el etilenglicolmetiléter, el etilenglicoletiléter, el etilenglicolpropiléter, el etilenglicolmono-n-butiléter, el dietilenglicol-metiléter, el dietilenglicoletiléter, el propilenglicol-metil-éter, el propilenglicol-etil-éter o el propilenglicol-propil-éter, el dipropilenglicolmonometil-éter o dipropilenglicolmono-etiléter, el di-isopropilenglicolmono-metiléter- o el di-isopropilenglicolmono-etiléter, el metoxi-triglicol, el etoxi-triglicol o el butoxitriglicol, el 1-butoxietoxi-2-propanol, el 3-metil-3-metoxibutanol, el propilen-glicol-t-butiléter, así como mezclas de estos disolventes.

Los disolventes pueden emplearse en los agentes de lavado y de limpieza líquidos hasta en forma de gel, según la invención, en cantidades comprendidas entre un 0,1 y un 20% en peso, preferentemente sin embargo por debajo del 15% en peso, y, especialmente, por debajo del 10% en peso.

Para el ajuste de la viscosidad pueden añadirse a las composiciones, según la invención, uno o varios espesantes, o bien sistemas espesantes. Estos productos de elevado peso molecular, que se denominan también agentes hinchantes (de hinchamiento), absorben la mayoría de las veces los líquidos y se hinchan para, finalmente, transformarse en soluciones viscosas reales o en soluciones coloidales.

Los espesantes adecuados son compuestos inorgánicos u orgánicos polímeros. A los espesantes inorgánicos pertenecen, por ejemplo, los ácidos polisilícicos, los minerales de arcilla tales como montmorillonita, zeolitas, ácidos silícicos y bentonitas. Los espesantes orgánicos proceden de los grupos de los polímeros naturales, de los polímeros naturales modificados y de los polímeros completamente sintéticos. Los polímeros que proceden de la naturaleza son por ejemplo, el agar-agar, el carrageen (musgo de Irlanda), el tragacanto, la goma arábiga, los alginatos, las pectinas, las poliosas, el harina de guar, el harina de algarroba, los almidones, las dextrinas, las gelatinas y las caseínas. Los productos naturales modificados, que se emplean como espesantes, proceden ante todo del grupo de los almidones y de las celulosas modificadas. De manera ejemplificativa pueden citarse en este caso la carboximetilcelulosa y otros éteres de celulosa, la hidroxietilcelulosa y la hidroxipropilcelulosa así como éteres de flor de harina. Los espesantes completamente sintéticos son polímeros tales como compuestos de poliacrilo y de polimetacrilo, polímeros vinílicos, ácidos policarboxílicos, poliéteres, poliiminas, poliamidas y poliuretanos.

Los espesantes pueden estar contenidos en una cantidad de hasta un 5% en peso, preferentemente desde un 0,05 hasta un 2% en peso y, de forma especialmente preferente, desde un 0,1 hasta un 1,5% en peso, referido a la composición acabada.

Los agentes de lavado y de limpieza según la invención pueden contener en caso dado a modo de otros componentes usuales, agentes secuestrantes, electrolitos y otros productos auxiliares tales como abrillantadores ópticos, inhibidores del agrisado, inhibidores de la corrosión de la plata, inhibidores del corrido de los colores, inhibidores de la espuma, productos abrasivos, colorantes y/o productos odorizantes, así como productos activos microbianos y/o absorbedores de los UV.

Los agentes para el lavado de los artículos textiles, según la invención, pueden contener abrillantadores ópticos del tipo de los derivados del ácido diaminoestilbendisulfónico o bien de sus sales de metales alcalinos. Son adecuadas por ejemplo, sales del ácido 4,4'-bis(2-anilino-4-morfolino-1,3,5-triazinil-6-amino)estilben-2,2'-disulfónico o compuestos de constitución similar, que porten, en lugar del grupo morfolino, un grupo dietanolamino, un grupo metilamino, un grupo anilino o un grupo 2-metoxietilamino. Además pueden estar presentes abrillantadores del tipo de los difenilestirilos substituidos, por ejemplo las sales alcalinas del 4,4'-bis(2-sulfoestiril)-difenilo, del 4,4'-bis(4-cloro-3-sulfoestiril)-difenilo, o del 4-(4-cloroestiril)-4'-(2-sulfoestiril)-difenilo. También pueden emplearse mezclas de los abrillantadores ópticos anteriormente citados.

Los inhibidores del agrisado tienen como cometido mantener en suspensión en el baño la suciedad desprendida de las fibras textiles. Para ello son adecuados los coloides solubles en agua, la mayoría de las veces de naturaleza orgánica, por ejemplo los almidones, las colas, las gelatinas, las sales de los ácidos etercarboxílicos o de los ácidos etersulfónicos de los almidones o de la celulosa o sales de ésteres ácidos del ácido sulfúrico de la celulosa o de los almidones. También son adecuadas para esta finalidad poliamidas que contienen grupos ácidos, solubles en agua. Además pueden emplearse otros derivados del almidón diferentes de los que se han citado precedentemente por ejemplo aldehídoalmidones. Preferentemente se emplearán éteres de celulosa tales como la carboximetilcelulosa (sal de Na), la metilcelulosa, la hidroxialquilcelulosa y éteres mixtos, tales como la metilhidroxietilcelulosa, la metilhidroxipropilcelulosa, la metilcarboximetilcelulosa y sus mezclas, por ejemplo en cantidades desde 0,1 hasta 5% en peso, referido a los agentes.

Con objeto de provocar una protección contra la corrosión de la plata, pueden emplearse en los agentes de limpieza según la invención para la vajilla inhibidores de la corrosión de la plata. Éstos son conocidos por el estado de la técnica, por ejemplo benzotriazoles, cloruro férrico(III) o CoSO_{4}. Tal como se conoce, por ejemplo, por la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 736084 B1, son especialmente adecuados para el empleo conjunto con enzimas los inhibidores de la corrosión de la plata constituidos por sales y/o complejos de manganeso, de titanio, de circonio, de hafnio, de vanadio, de cobalto o de cerio, en los cuales están presentes los metales citados en uno de los niveles de oxidación II, III, IV, V o VI. Ejemplos de tales compuestos son MnSO_{4}, V_{2}O_{5}, V_{2}O_{4}, VO_{2}, TiOSO_{4}, K_{2}TiF_{6}, K_{2}ZrF_{6}, Co(NO_{3})_{2}, Ce(NO_{3})_{3}, así como sus mezclas.

Los productos activos "desprendedores de la suciedad" "Soil-Release" o "Soil-Repellents" son, en la mayoría de los casos, polímeros, que proporcionan a las fibras de la colada propiedades que la hacen repeler la suciedad cuando se emplean en un agente de lavado y/o favorecen la capacidad desprendedora de la suciedad de los restantes componentes de los agentes de lavado. Un efecto comparable puede observarse también cuando se emplean en agentes de limpieza para superficies duras.

Los productos activos, desprendedores de la suciedad (Soil-Release) especialmente activos y conocidos desde hace mucho tiempo son copoliésteres con unidades de ácidos dicarboxílicos, de alquilenglicol y de polialquilenglicol. Ejemplos a este respecto son copolímeros o polímeros mixtos constituidos por tereftalato de polietileno y polioxietilenglicol (DT 16 17 141, o bien DT 22 00 911). Se han citado en la solicitud de patente alemana publicada, no examinada DT 22 53 063 agentes ácidos que contienen, entre otras cosas, un copolímero constituido por un ácido carboxílico dibásico y por un alquilenpoliglicol o por un cicloalquilenpoliglicol. Los polímeros constituidos por tereftalato de etileno y por tereftalato de óxido de polietileno y su empleo en los agentes de lavado están descritos en las memorias descriptivas de las patentes alemanas DE 28 57 292 y DE 33 24 258 y en la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 253 567. La patente europea EP 066944 se refiere a agentes, que contienen un copoliéster constituido por etilenglicol, polietilenglicol, ácidos dicarboxílicos aromáticos y ácidos dicarboxílicos aromáticos sulfonados en determinadas proporciones molares. Se conocen por la patente europea EP 0 185 427 poliésteres cerrados en los extremos con grupos metilo o con grupos etilo con unidades de tereftalato de etileno y/o de propileno y con unidades de tereftalato de óxido de polietileno y agentes de lavado que contienen tales polímeros desprendedores de la suciedad. La patente europea EP 0 241984 se refiere a poliéster que contiene, además de grupos de oxietileno y de unidades de ácido tereftálico, también unidades de etileno substituidas así como unidades de glicerina. Se conocen por la patente europea EP 0 241 985 poliésteres que contienen, además de grupos de oxietileno y de unidades de ácido tereftálico, grupos de 1,2-propileno, de 1,2-butileno y/o de 3-metoxi-1,2-propileno así como unidades de glicerina y que están cerrados en los grupos extremos con grupos alquilo con 1 a 4 átomos de carbono. Se conocen por la solicitud de patente europea EP 0 272 033 poliésteres cerrados en los grupos extremos al menos en parte por restos alquilo o por restos acilo con 1 a 4 átomos de carbono con unidades de tereftalato de poli-propileno y tereftalato de polioxietileno. La patente europea EP 0 274 907 describe poliésteres desprendedores de la suciedad que contienen tereftalato cerrados en los grupos extremos con sulfoetilo. Según la solicitud de patente europea EP 0 357 280 se preparan por medio de la sulfonación de los grupos extremos insaturados, poliésteres desprendedores de la suciedad con unidades de tereftalato, de alquilenglicol y de poli-glicol con 2 a 4 átomos de carbono. La solicitud de patente internacional WO 95/32232 se refiere a poliésteres ácidos, aromáticos, con capacidad para el desprendimiento de la suciedad. Se conocen por la solicitud de patente internacional WO 97/31085 productos activos no polímeros repelentes de la suciedad para materiales constituidos por algodón con varias unidades funcionales: una primera unidad, que puede ser catiónica, por ejemplo, es capaz de adsorberse sobre la superficie del algodón por medio de la interacción electrostática, y una segunda unidad, que está formada de manera hidrófoba, que es responsable de la permanencia del producto activo sobre la superficie límite entre el agua/algodón.

A los inhibidores del corrido de los colores que entran en consideración para el empleo en los agentes de lavado de artículos textiles, según la invención, pertenecen, especialmente, las polivinilpirrolidonas, los polivinilimidazoles, los N-óxidos polímeros tal como el poli-(N-óxido de vinilpiridina) y los copolímeros de vinilpirrolidona con vinilimidazol.

Cuando se emplean en procedimientos de limpieza a máquina puede ser ventajoso añadir los agentes inhibidores de la espuma. Como inhibidores de la espuma son adecuados, por ejemplo, jabones de origen natural o sintético, que presenten una elevada proporción en ácidos grasos con 18 a 24 átomos de carbono. Los inhibidores de la espuma de tipo no tensioactivo, adecuados, son, por ejemplo, órganopolisiloxanos y sus mezclas con ácido silícico microfino, en caso dado silanizado así como parafinas, ceras, ceras microcristalinas y sus mezclas con ácido silícico silanizado o biesteariletilendiamida. Ventajosamente se emplearán también mezclas constituidas por diversos inhibidores de la espuma, por ejemplo aquellas constituidas por siliconas, parafinas o ceras. Son preferentes los inhibidores de la espuma, especialmente los inhibidores de la espuma que contienen silicona y/o parafina, enlazados sobre una substancia de soporte granular, soluble en agua o bien dispersable en agua. Son especialmente preferentes en este caso mezclas constituidas por parafinas y por biesteariletilendiamidas.

Un agente de limpieza según la invención para superficies duras puede contener, además, componentes con actividad abrasiva, especialmente del grupo que comprende harina de cuarzo, harina de madera, harina de material sintético, cretas y microesferas así como sus mezclas. Los productos abrasivos están contenidos en los agentes de limpieza según la invención preferentemente en una proporción no mayor que el 20% en peso, especialmente desde el 5% en peso hasta el 15% en peso.

A los agentes de lavado y de limpieza se les añaden colorantes y productos odorizantes para mejorar la impresión estética de los productos y para poner a disposición del usuario, además del rendimiento del lavado y de la limpieza, un producto "típico e inconfundible" desde el punto de vista estético y sensorial. Como esencias perfumantes o bien productos odorizantes pueden utilizarse compuestos odorizantes individuales, por ejemplo los productos sintéticos del tipo de los ésteres, de los éteres, de los aldehídos, de las cetonas, de los alcoholes y de los hidrocarburos. Los compuestos odorizantes del tipo de los ésteres son, por ejemplo, el acetato de bencilo, el isobutirato de fenoxietilo, el acetato de p-terc.-butilciclohexilo, el acetato de linalilo, el acetato de dimetilbencilcarbinilo, el acetato de feniletilo, el benzoato de linalilo, el formiato de bencilo, el glicinato de etilmetilfenilo, el propionato de alilciclohexilo, el propionato de estiralilo y el salicilato de bencilo. A los éteres pertenecen, por ejemplo, el benciletiléter, a los aldehídos pertenecen, por ejemplo los alcanales lineales con 8 a 18 átomos de carbono, el citral, el citronelal, el citroneliloxiacetaldehído, el ciclamenaldehído, el hidroxicitronelal, el lilial y el bourgeonal, a las cetonas pertenecen, por ejemplo la ionona, la \alpha-isometilionona y la metilcedrilcetona, a los alcoholes pertenecen el anetol, el citronelol, el eugenol, el geraniol, el linalool, el alcohol feniletílico y el terpineol, a los hidrocarburos pertenecen, principalmente, los terpenos, tales como limoneno y el pineno. Sin embargo se emplean preferentemente mezclas de diferentes productos odorizantes, que produzcan, en conjunto, una nota de olor agradable. Tales esencias perfumantes también pueden contener mezclas de productos odorizantes naturales, como a las que pueden obtenerse a partir de fuentes vegetales, por ejemplo la esencia de pino, de cítricos, de jazmín, de pachulí, de rosas o Ylang-Ylang. También son adecuadas la esencia de salvia moscatel, la esencia de salvia romana, la esencia de manzanilla, la esencia de clavel, la esencia de melisa, la esencia de menta, la esencia de hojas de canela, la esencia de pétalos de tilo, la esencia de bayas de enebro, la esencia de vetiver, la esencia de olibano, la esencia de galbano y la esencia de labdano, así como esencia de azahar, la esencia de neroli, la esencia de cáscara de naranja y de madera de sándalo. Usualmente el contenido de los colorantes en los agentes de lavado y de limpieza se encuentra por debajo del 0,01% en peso, mientras que los productos odorizantes pueden constituir hasta un 2% en peso del conjunto de la formulación.

Los productos odorizantes pueden incorporarse directamente en los agentes de lavado y de limpieza, no obstante también puede ser ventajoso disponer los productos odorizantes sobre soportes, que refuercen la adherencia del perfume sobre la ropa y que se encarguen de que el olor de los materiales textiles se mantenga por mucho tiempo por medio de una liberación lenta del olor, especialmente de los artículos textiles tratados. Se han acreditado, por ejemplo, como materiales de soporte las ciclodextrinas, pudiéndose revestir los complejos de ciclodextrina-perfume adicionalmente con otros agentes auxiliares. Otro soporte preferente para los productos odorizantes es la zeolita X, descrita, que puede absorber también productos odorizantes en lugar de o en mezcla con los tensioactivos. Son preferentes los agentes de lavado y de limpieza, que contengan la zeolita X, descrita, y los productos odorizantes, que estén, de manera preferente, al menos parcialmente absorbidos en la zeolita.

Los colorantes preferentes, cuya elección no constituye ninguna dificultad para el técnico en la materia, tienen una elevada estabilidad al almacenamiento y son insensibles frente a los restantes componentes del agente y contra la luz así como están exentos de cualquier substantividad marcada frente a las fibras textiles para no colorearlas.

Para la lucha contra los microorganismos, los agentes de lavado o de limpieza pueden contener productos activos antimicrobianos. En este caso se distingue según el espectro antimicrobiano y el mecanismo de actuación entre bacteriostáticos y bactericidas, fungistáticos y fungicidas, etc. Los productos importantes de estos grupos son, por ejemplo, el cloruro de benzalconio, los alquilarilsulfonatos, los halógenofenoles y el mercuriacetato de fenol. Las expresiones de efecto antimicrobiano y producto activo antimicrobiano tienen en el ámbito de las enseñanzas según la invención el significado usual en el ramo, que se han dado por ejemplo en la publicación de K. H. Wallhäußer en "Praxis der Sterilisation, Desinfektion - Konservierung: Keimidentifizierung - Betriebshygiene" (5ª edición - Stuttgart; New York : Thieme, 1995), pudiéndose emplear todas las substancias allí descritas con efecto antimicrobiano. Los productos activos antimicrobianos adecuados se eligen, preferentemente, entre el grupo de los alcoholes, las aminas, los aldehídos, los ácidos antimicrobianos o bien sus sales, los ésteres de los ácidos carboxílicos, las amidas de ácido, los fenoles, los derivados de fenol, los difenilos, los difenilalcanos, los derivados de urea, los acetales así como los formales oxigenados y nitrogenados, las benzamidinas, las isotiazolinas, los derivados de ftalimida, los derivados de piridina, los compuestos tensioactivos antimicrobianos, las guanidinas, los compuestos anfóteros antimicrobianos, las quinolinas, el 1,2-dibromo-2,4-dicianobutano, el yodo-2-propil-butil-carbamato, el yodo, los yodóforos, los compuestos peroxo, los compuestos halogenados así como mezclas arbitrarias de los precedentes.

El producto activo antimicrobiano puede elegirse en este caso entre etanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butanodiol, fenoxietanol, 1,2-propilenglicol, glicerina, ácido undecilénico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido dihidracético, o-fenilfenol, N-metilmorfolinacetonitrilo (MMA), 2-bencil-4-clorofenol, 2,2'-metilen-bis-(6-bromo-4-clorofenol), 4,4'-dicloro-2'-hidroxidifeniléter (Dichlosan), 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifeniléter (Trichlosan), clorohexidina, N-(4-clorofenil)-N-(3,4-diclorofenil)-urea, dihidrocloruro de N,N'-(1,10-decan-diildi-1-piridinil-4-iliden)-bis-(1-octanoamina), N,N'-bis-(4-clorofenil)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecanodiimidoamida, glucoprotaminas, compuestos cuaternarios tensioactivos antimicrobianos, guanidinas con inclusión de las biguanidinas y de las poliguanidinas, tales como por ejemplo el dihidrocloruro de 1,6-bis-(2-etilhexil-biguanido-hexano), el tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-fenil-N_{1},N_{1}-metildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-O-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,6-diclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-[N_{1},N_{1}'-beta-(p-metoxifenil)diguanido-N_{5},N_{5}']-hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-alfa-metil-.beta.-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-p-nitrofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, el dihidrocloruro de omega:omega-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-di-n-propiléter, el tetrahidrocloruro de omega:omega'-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-di-n-propiléter, el tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,4-diclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-p-metilfenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, el tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,4,5-triclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-[N_{1},N_{1}'-alfa-(p-clorofenil)etildiguanido-N_{5},N_{5}']hexano, el dihidrocloruro de omega:ome-
ga-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')m-xileno, el dihidrocloruro de 1,12-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},
N_{5}')-dodecano, el tetrahidrocloruro de 1,10-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-decano, el tetrahidrocloruro de 1,12-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-dodecano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexa-
no, el tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, la etilen-bis-(1-tolilbiguanida), la etilen-bis-(p-tolilbiguanida), la etilen-bis-(3,5-dimetilfenilbiguanida), la etilen-bis-(p-terc.-amilfenilbiguanida), la etilen-bis-(nonilfenilbiguanida), la etilen-bis-(fenilbiguanida), la etilenbis-(N-butilfenilbiguanida), la etilen-bis(2,5-dietoxifenilbiguanida), la etilen-bis(2,4-dimetilfenilbiguanida), la etilen-bis(o-difenilbiguanida), la etilen-bis(amilnaftilbiguanida mixta), la N-butil-etilen-bis-(fenilbiguanida), la trimetilenobis(o-tolilbiguanida), la N-butil-trimetilo-bis-(fenilbiguanida) y las sales correspondientes tales como los acetatos, los gluconatos, los hidrocloruros, los hidrobromuros, los citratos, los bisulfitos, los fluoruros, los polimaleatos, los N-cocoalquilsarcosinatos, los fosfitos, los hipofosfitos, los perflúoroctanoatos, los silicatos, los sorbatos, los salicilatos, los maleatos, los tartratos, los fumaratos, los etilendiaminotetraacetatos, los iminodiacetatos, los cinamatos, los tiocianatos, los arginatos, los piromelitatos, los tetracarboxibutiratos, los benzoatos, los glutaratos, los monoflúorfosfatos, los perflúorpropionatos así como mezclas arbitrarias de los mismos. Además son adecuados los derivados halogenados del xileno y del cresol, tales como el p-clorometacresol o el p-clorometa-xileno, así como productos activos antimicrobianos naturales de origen vegetal (por ejemplo procedentes de especias o de hierbas aromáticas), de origen animal así como microbiano. Preferentemente pueden emplearse compuestos cuaternarios antimicrobianos, de acción tensioactiva, un producto activo antimicrobiano natural de origen vegetal y/o un producto activo antimicrobiano natural de origen animal, de manera extraordinariamente preferente al menos un producto activo antimicrobiano natural de origen vegetal del grupo que comprende la cofeína, la teobromina y la teofilina así como esencias etéricas tales como eugenol, timol y geraniol, y/o al menos un producto activo antimicrobiano natural de origen animal del grupo que comprende los enzimas tales como la proteína de leche, la lisozima y la lactoperoxidasa, y/o al menos un compuesto cuaternario antimicrobiano, de acción tensioactiva, con un grupo amonio, sulfonio, fosfonio, yodonio o arsonio, compuestos peroxo y compuestos clorados. También pueden emplearse productos de origen microbiano, las denominadas
bacteriocinas.

Los compuestos de amonio cuaternario (QAV), adecuados como productos activos antimicrobianos, presentan la fórmula general (R^{1})(R^{2})(R^{3})(R^{4}) N^{+} X^{-}, en la que R^{1} hasta R^{4} son restos alquilo con 1 hasta 22 átomos de carbono, restos aralquilo con 7 hasta 28 átomos de carbono o restos heterocíclicos, iguales o diferentes, formando dos restos o, en el caso de un enlace aromático tal como en la piridina, incluso tres restos, junto con el átomo de nitrógeno del heterociclo, por ejemplo un compuesto de piridinio o un compuesto de imidazolinio y X^{-} significa iones halogenuro, iones sulfato, iones hidroxi o iones similares. Para un efecto antimicrobiano óptimo uno de los restos presenta al menos preferentemente una longitud de la cadena de 8 hasta 18, especialmente de 12 hasta 16 átomos de carbono.

Los QAV pueden obtenerse por medio de la reacción de las aminas terciarias con agentes de alquilación, tales como por ejemplo el cloruro de metilo, el cloruro de bencilo, el sulfato de dimetilo, el bromuro de dodecilo así como también con el óxido de etileno. La alquilación de las aminas terciarias con un resto alquilo largo y dos grupos metilo se consigue de forma especialmente sencilla, también la cuaternización de las aminas terciarias con dos restos largos y un grupo metilo puede llevarse a cabo con ayuda de cloruro de metilo bajo condiciones suaves. Las aminas, que disponen de tres restos alquilo largo o de restos alquilo substituidos por hidroxi, son menos reactivas y se cuaternizarán preferentemente con sulfato de dimetilo.

Los QAV adecuados son, por ejemplo, el cloruro de benzalconio (cloruro de N-alquil-N,N-dimetil-bencilamonio, CAS No. 8001-54-5), benzalcona B (cloruro de m,p-diclorobencil-dimetil-alquilamonio con 12 átomos de carbono, CAS No. 58390-78-6), cloruro de benzoxonio (cloruro de bencil-dodecil-bis-(2-hidroxietil)-amonio), bromuro de cetrimonio (bromuro de N-hexadecil-N,N-trimetil-amonio, CAS No. 57-09-0), cloruro de bencetonio (cloruro de N,N-dimetil-N-[2-[2-[p-1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenoxi]etoxi]etil]-bencilamonio, CAS No. 121-54-0), cloruro de dialquildimetilamonio tales como el cloruro de di-n-decil-dimetil-amonio (CAS No. 7173-51-5-5), bromuro de didecildi-metilamonio (CAS No. 2390-68-3), cloruro de dioctil-dimetil-amonio, cloruro de 1-cetilpiridinio (CAS No. 123-03-5) y yoduro de tiazolinio (CAS No. 15764-48-1) así como sus mezclas. Los QAV especialmente preferentes son los cloruros de benzalconio con restos alquilo con 8 hasta 18 átomos de carbono, especialmente el cloruro de alquil-bencil-dimetil-amonio con 12 hasta 14 átomos de carbono.

Los halogenuros de benzalconio y/o los halogenuros de benzalconio substituidos son obtenibles comercialmente por ejemplo como Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/ Sherex y Hyamine® ex Lonza, así como Bardac® ex Lonza. Otros productos activos antimicrobianos, que pueden ser adquiridos en el comercio son el cloruro de N-(3-cloroalil)-hexaminio tales como Dowicide® y Dowicil® ex Dow, cloruro de benzoetonio tal como Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, cloruro de metilbenzoetonio tal como Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, cloruro de cetilpiridinio tal como Cepacolchlorid ex Merrell Labs.

Los productos activos antimicrobianos se emplean en cantidades desde 0,0001% en peso hasta 1% en peso, preferentemente desde 0,001% en peso hasta 0,8% en peso, de forma especialmente preferente desde 0,005% en peso hasta 0,3% en peso y, especialmente, desde 0,01 hasta 0,2% en peso.

Los agentes pueden contener absorbedores de los UV (absorbedores UV), que se absorban en los artículos textiles tratados y que mejoren la estabilidad frente a la luz de las fibras y/o la estabilidad frente a la luz de otros componentes de la receta. Se entenderán por absorbedores de los UV substancias orgánicas (filtros protectores contra la luz), que sean capaces de absorber la irradiación ultravioleta y de desprender de nuevo la energía absorbida en forma de irradiación de longitud de onda más larga, por ejemplo en forma de calor.

Los compuestos que presentan estas propiedades deseadas son, por ejemplo, los compuestos activos por medio de la desactivación en ausencia de irradiación y los derivados de la benzofenona con substituyentes en la posición 2 y/o en la posición 4. Además son adecuados también los benzotriazoles substituidos, los acrilatos substituidos por fenilo en la posición 3 (derivados del ácido cinámico, en caso dado con grupos ciano en la posición 2), salicilatos, complejos orgánicos de Ni así como productos naturales tales como la umbeliferona y los ácidos urocanoicos corporales. Tienen un significado especial los derivados de bifenilo y, ante todo, los derivados los estilbeno como los que se han descrito por ejemplo en la publicación EP 0728749 A y que pueden adquirirse en el comercio como Tinosorb® FD o Tinosorb® FR ex Ciba. Como absorbedores de las UV-B pueden citarse: el 3-bencilidenalcanfor o bien el 3-bencilidennoralcanfor y sus derivados, por ejemplo el 3-(4-metilbenciliden)alcanfor, como se describe en la publicación EP 10693471 B1; los derivados del ácido 4-aminobenzoico, preferentemente el 4-(dimetilamino)benzoato de 2-etilhexilo, el 4-(dimetilamino)benzoato de 2-octilo y el 4-(dimetilamino)benzoato de amilo; los ésteres del ácido cinámico, preferentemente el 4-metoxicinamato de 2-etilhexilo, el 4-metoxicinamato de propilo, el 4-metoxicinamato de isoamilo, el 2-ciano-3,3-fenilcinamato de 2-etilhexilo (octocrileno); los ésteres del ácido salicílico, preferentemente el salicilato de 2-etilhexilo, el salicilato de 4-isopropilbencilo, el salicilato de homometilo; los derivados de la benzofenona, preferentemente la 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona, la 2-hidroxi-4-metoxi-4'-metilbenzofenona, la 2,2'-dihidroxi-4-metoxibenzofenona; los ésteres del ácido benzalmalónico, preferentemente el 4-metoxibenzalmalonato de di-2-etilhexilo; los derivados de triazina, tales como, por ejemplo, la 2,4,6-trianilino-(p-carbo-2'-etil-1'-hexiloxi)-1,3,5-triazina y la octil triazona, como se han descrito en la publicación EP 0818450 A1 o la dioctil butamido triazona (Uvasorb® HEB); las propano-1,3-dionas tal como, por ejemplo, la 1-(4-terc.-butilfenil)-3-(4'-metoxifenil)propano-1,3-diona; los derivados de cetotriciclo(5.2.1.0)decano, tales como los que se han descrito en la publicación EP 0694521 B1. Además, son adecuados el ácido 2-fenilbencimidazol-5-sulfónico y sus sales alcalinas, alcalinotérreas, de amonio, de alquilamonio, de alcanolamonio y de glucamonio; los derivados de ácidos sulfónicos de benzofenonas, preferentemente el ácido 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona-5-sulfónico y sus sales; los derivados de ácidos sulfónicos del 3-bencilidenalcanfor tales como, por ejemplo, el ácido 4-(2-oxo-3-bornilidenmetil)bencenosulfónico y el ácido 2-metil-5-(2-oxo-3-borniliden)sulfónico y sus sales.

Como filtros contra los UV-A típicos entran en consideración, de manera especial, derivados del benzoilmetano, tales como, por ejemplo, la 1-(4'-terc.-butilfenil)-3-(4'-metoxifenil)propano-1,3-diona, el 4-terc.-butil-4'-metoxidebenzoilmetano (Parsol 1789), la 1-fenil-3-(4'-isopropilfenil)-propano-1,3-diona así como compuestos de enamina, como los que se han descrito en la publicación DE 19712033 A1 (BASF). Los filtros contra los UV-A y UV-B pueden emplearse también, evidentemente, en mezclas. Además de los productos solubles, citados, entran en consideración para esta finalidad también los pigmentos insolubles, los protectores contra la luz, en concreto los óxidos metálicos finamente dispersados, preferentemente a nanoescala o bien las sales. Ejemplos de los óxidos metálicos adecuados son, especialmente, el óxido de cinc y el dióxido de titanio y, además, los óxidos de hierro, de circonio, de silicio, de manganeso, de aluminio y de cerio así como sus mezclas. Como sales pueden emplearse silicatos (talco), sulfato de bario o estearato de cinc. Los óxidos y las sales se emplearán en forma de pigmentos listos para emulsiones destinadas al cuidado de la piel y para la protección de la piel y para productos cosméticos decorativos. Las partículas deben presentar en este caso un diámetro medio menor que 100 nm, preferentemente comprendido entre 5 y 50 nm y, especialmente, comprendido entre 15 y 30 nm. Éstas pueden presentar una forma esférica, sin embargo, pueden emplearse también aquellas partículas que tengan una forma elipsoide o que se diferencie de la configuración esférica de otro modo. Los pigmentos pueden presentarse también tratados superficialmente, es decir hidrofilados o hidrofobados. Ejemplos típicos son dióxidos de titanio revestidos, tales como, por ejemplo dióxido de titanio T 805 (Degussa) o Eusolex® T2000 (Merck); como agentes de revestimiento hidrófobos entran en consideración de manera preferente las siliconas y, especialmente, los trialcoxioctilsilanos o simeticonas. Preferentemente se empleará el óxido de cinc micronizado. Otros filtros adecuados, protectores contra la luz UV pueden verse en la recopilación de P. Finkel en SÖFW-Journal 122, (1966), página 543.

Los absorbedores de los UV se emplearán usualmente en cantidades desde 0,01% en peso hasta 5% en peso, preferentemente desde 0,03% en peso hasta 1% en peso.

Una proteína, esencial para la invención, puede protegerse, especialmente durante el almacenamiento, por medio de estabilizantes, por ejemplo contra la desnaturalización, contra la descomposición o contra la inactivación, por ejemplo debido a influjos físicos, a la oxidación o a la disociación proteolítica. En el caso de las proteínas, que se obtengan a partir de microorganismos, es especialmente crítica una inhibición de la proteolisis, puesto que la mayoría de los microorganismos secretan al medio ambiente proteasas diferentes como enzimas de digestión. Estas pueden dañar considerablemente a las proteínas interesantes durante las etapas de elaboración subsiguientes. Del mismo modo, en los agentes de lavado y de limpieza pueden estar asociadas las proteínas esenciales para la invención con proteasas y, por este motivo, requieren una protección especial.

De igual modo, los agentes según la invención pueden contener, para esta finalidad, estabilizantes. Un grupo de estabilizantes está constituido por los inhibidores reversibles de la proteasa, que se disocien en el momento de la dilución del agente en el baño de lavado. Para esta finalidad se han establecido el hidrocloruro de benzamidina y la leupeptina. Frecuentemente se emplean borax, ácidos bóricos, ácidos borónicos o sus sales o ésteres, entre ellos ante todo los derivados con grupos aromáticos, por ejemplo los ácidos fenilborónicos ortosubstituidos según la publicación WO 95/12655, metasubstituidos según la publicación WO 92/19707 y para-substituidos según la publicación US 5 972 873, o bien sus sales o ésteres. En las solicitudes WO 98/13460 y EP 583 534 se han divulgado aldehídos de péptido, es decir oligopéptidos con un extremo C reducido y, concretamente, aquellos con 2 hasta 50 monómeros, para la inhibición reversible de las proteasas en los agentes de lavado y de limpieza. A los inhibidores reversibles peptídicos de las proteasas pertenecen, entre otros, el Ovomucoid (WO 93/00418). De manera ejemplificativa se han divulgado en la solicitud WO 00/01826 inhibidores reversibles de los péptidos, específicos, para la subtilisina de proteasa para el empleo en agentes que contienen proteasa y en la publicación WO 00/01831 se han divulgado proteínas de fusión, correspondientes, a partir de proteasas e inhibidores.

Otros estabilizantes enzimáticos son los aminoalcoholes tales como la mono-, la di-, la trietanolamina y tripropanolamina y sus mezclas, los ácidos carboxílicos alifáticos con hasta 12 átomos de carbono inclusive, como los que se conocen por ejemplo por las solicitudes de patente EP 0 378 261 y WO 97/05227, tales como el ácido succínico, otros ácidos dicarboxílicos o sales de los ácidos citados. En la solicitud de patente DE 196 50 537 se han divulgado para esta finalidad alcoxilatos de amidas de ácidos grasos cerrados en los grupos extremos. Algunos ácidos orgánicos, empleados como adyuvantes son capaces de estabilizar además un enzima contenido como se ha divulgado en la publicación WO 97/18287.

Los alcoholes alifáticos inferiores, ante todo sin embargo los polioles, tales como por ejemplo la glicerina, el etilenglicol, el propilenglicol o la sorbita son otros estabilizantes de los enzimas empleados frecuentemente. Según una nueva solicitud de patente (EP 0 965 268) el fosfato de di-glicerina protege, también, contra la desnaturalización debida a efectos físicos. Del mismo modo se utilizan sales de calcio, tal como por ejemplo el acetato de calcio o el formiato de calcio divulgado en la memoria descriptiva de la patente EP 0 028 865 con esta finalidad, y las sales de magnesio, por ejemplo según la solicitud de patente europea EP 0 378 262.

Los oligómeros de poliamida (WO 99/43780) o los compuestos polímeros tales como la lignina (WO 97/00932), los copolímeros de vinilo solubles en agua (EP 828 762) o, como se ha divulgado en la publicación EP 702 712, los éteres de la celulosa, los polímeros acrílicos y/o las poliamidas estabilizan las preparaciones enzimáticas entre otras cosas frente a los efectos físicos o frente a las oscilaciones del valor del pH. Los polímeros que contienen N-óxidos de poliamina (EP 587 550 y EP 581 751) actúan simultáneamente como estabilizantes de los enzimas y como inhibidores del corrido de los colores. Otros estabilizantes polímeros son los polioxialquilenos con 8 hasta 18 átomos de carbono lineales divulgados en la publicación WO 97/05227 junto a otros componentes. Los alquilpoliglicósidos pueden estabilizar los componentes enzimáticos del agente según la invención como en las solicitudes de patente WO 97/43377 y WO 98/45396 e incluso pueden acrecentar su rendimiento. Los compuestos que contienen N, reticulados, como los que se han divulgado en la publicación WO 98/17764, cumplen una doble función como agentes desprendedores de la suciedad (Soil-release) y como estabilizantes de los enzimas. Los polímeros hidrófobos, no iónicos, actúan en una mezcla con otros estabilizantes según la solicitud de patente WO 97/32958 de manera estabilizante sobre una celulasa de tal manera, que también pueden ser adecuados tales componentes u otros componentes similares para el enzima esencial para la invención.

Los agentes reductores y los antioxidantes aumentan la estabilidad de los enzimas frente a la descomposición por oxidación como se ha divulgado entre otras, en la publicación EP 780 466. Los agentes reductores que contienen azufre son conocidos, por ejemplo, por las memorias descriptivas de las patentes EP 0 080 748 y EP 0 080 223. Otros ejemplos son el sulfito de sodio (EP 533 239) y los azúcares reductores (EP 656 058).

Muchas veces se utilizan también combinaciones de estabilizantes, por ejemplo constituidas por polioles, ácido bórico y/o borax como se divulga en la solicitud de patente WO 96/31589, la combinación de ácido bórico o de borato, de sales reductoras y de ácido succínico o sus derivados como se divulga en la solicitud de patente EP 126 505 o la combinación de ácido bórico o de borato con polioles o con compuestos poliamínicos y con sales reductoras como se divulga en la solicitud de patente EP 080 223. El efecto de los estabilizantes aldehídicos de los péptidos se aumenta, según la publicación WO 98/13462 por medio de la combinación con ácido bórico y/o con derivados del ácido bórico con polioles y, según la publicación WO 98/13459 se refuerza todavía más por medio del empleo adicional de los iones calcio.

Los agentes con actividades enzimáticas estabilizadas representan formas de realización preferentes de la presente invención. Son especialmente preferentes aquellos agentes con enzimas que estén estabilizados según varias de las formas indicadas.

Desde hace décadas se emplean los enzimas, tales como las proteasas, las amilasas, las lipasas o ls celulasas, como componentes activos de los agentes de lavado y de limpieza. Su respectiva contribución al rendimiento de lavado, o bien de limpieza del agente correspondiente consiste, en el caso de las proteasas, en la capacidad para degradar impurezas que contienen proteína, en el caso de las amilasas, en la degradación de impurezas que contienen almidón y, en el caso de las lipasas, en la actividad disociadora de las grasas. Las celulasas son empleadas preferentemente en los agentes de lavado, en particular, debido a su contribución al rendimiento secundario de lavado de un agente de lavado y debido a su efecto sobre las fibras de los artículos textiles. Los respectivos productos de hidrólisis son atacados, disueltos, emulsionados o suspendidos por los restantes componentes de los agentes de lavado o de limpieza o son eliminados por flotación con el baño de lavado debido a su elevada solubilidad de tal manera, que se producen, en caso favorable, efectos sinérgicos entre los enzimas y los restantes componentes.

Los agentes según la invención pueden contener además de las proteínas esenciales según la invención, otros enzimas amilolíticos, especialmente \alpha-amilasas. Entre éstas pueden encontrarse también los enzimas que se han establecido para el empleo en los agentes de lavado y de limpieza. Ejemplos de amilasas comercialmente obtenibles son BAN®, Termamyl®, Purastar®, Amylase-LT®, Maxamyl®, Duramyl® y/o Purafect® OxAm. Esto es adecuado cuando los diferentes enzimas sean capaces de complementarse. Un complemento de este tipo puede verificarse, por ejemplo, desde el punto de vista de la regulación, por ejemplo por medio de la activación mutua o por medio de la inactivación. Puede producirse por ejemplo si al menos una parte del enzima según la invención, no homóloga con las \alpha-amilasas conocidas, ejerce un efecto sobre las actividades amilolíticas que no son esenciales según la invención. Sin embargo puede ser interesante el empleo conjunto debido a especificidades del substrato variables. Ambas son formas de realización de la presente invención.

Especialmente puede ser ventajoso sobre suciedades químicamente diferentes, emplear los enzimas amilolíticos en los agentes de lavado y de limpieza junto con otros enzimas con actividad de lavado y/o de limpieza. Por lo tanto los agentes de lavado y de limpieza, que están caracterizados además de por una proteína según la invención, por otros enzimas adicionales, representan formas de realización preferentes de la presente invención.

A éstas pertenecen, además de otras amilasas, por ejemplo proteasas, así como también lipasas, cutinasas, esterasas, pululanasas, celulasas, hemicelulasas y/o xilanasas, así como sus mezclas. Son especialmente preferentes las proteasas, las lipasas, las \beta-glucanasas y/o las celulasas. Otros enzimas amplían las prestaciones de limpieza del agente correspondiente en su rendimiento enzimático específico respectivo. A éstos pertenecen por ejemplo las óxidorreductasas o las peroxidasas como componentes de los sistemas de blanqueo enzimáticos, por ejemplo las lacasas (WO 00/39306), las \beta-glucanasas (WO 99/06515 y WO 99/06516) o enzimas desprendedores de pectina (WO 00/42145), que se emplean especialmente en agentes de lavado especiales.

Ejemplos de enzimas que pueden ser adquiridos en el comercio para su utilización en los agentes según la invención son proteasas tales como subtilisina BPN', Properase®, BLAP®, Optimase®, Opticlean®, Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Alcalase®, Esperase®, Savinase®, Durazym®, Everlase® y/o Purafect®G o Purafect®OxP y lipasas tales como Lipolase®, Lipomax®, Lumafast® y/o Lipozym®.

La actividad de la proteasa en tales agentes puede determinarse según los métodos descritos en la publicación Tenside, tomo 7 (1970), páginas 125-132. Por lo tanto se indicará en PE (unidades de proteasa). La actividad en proteasa de los agentes preferentes puede llegar hasta 1.500.000 unidades de proteasa por gramo de preparación (PE, determinado según los métodos descritos en la publicación Tenside, tomo 7 (1970), páginas 125-132).

En lo que se refiere a su obtención entran en consideración entre los enzimas empleables, en primer lugar, los que se obtienen a partir de microorganismos, tales como bacterias u hongos, por ejemplo a partir de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Streptomyces griseus, Humicola lanuginosa, Humicola insolens, Pseudomonas pseudoalcaligenes o Pseudomonas cepacia, especialmente las mezclas de enzimas formadas de manera natural por estas cepas, o bien mezclas con las otras cepas. De manera conocida se obtienen por medio de procesos de fermentación a partir de los microorganismos adecuados, que han sido descritos por ejemplo en las solicitudes de patente alemanas publicadas, no examinadas DE 19 40 488 y DE 21 21 397, en las memorias descriptivas de las patentes norteamericanas US 3 623957 y US 4 264 738, en la solicitud de patente europea EP 006 638, así como en la solicitud de patente internacional WO 91/02792.

También estos enzimas, empleados adicionalmente en caso dado, pueden estar adsorbidos sobre soportes y/o pueden estar incrustados en substancias de recubrimiento para su protección contra una inactivación prematura como se describe por ejemplo en la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 564 476 o en la solicitud de patente internacional WO 94/23005. Éstos están contenidos en los agentes de lavado preferentemente en cantidades de hasta un 10% en peso inclusive, especialmente desde un 0,2% en peso hasta un 2% en peso, empleándose de forma especialmente preferente enzimas estabilizados contra la degradación por oxidación, como los que se conocen por ejemplo, por la solicitud de patente internacional WO 94/18314.

Los agentes según la invención pueden estar constituidos por varias fases para liberar separadamente entre sí en el tiempo o en el espacio por ejemplo los productos activos contenidos. En este caso puede tratarse de fases en diversos estados de agregación, especialmente puede tratarse de dos fases en el mismo estado de agregación.

Los agentes según la invención, que están constituidos por varios componentes sólidos, pueden fabricarse de manera sencilla mezclándose entre sí diversos componentes sólidos, especialmente polvos, granulados o cuerpos extrudidos con diversos componentes y/o comportamientos diferentes a la liberación en estado a granel en conjunto. La fabricación de los agentes sólidos según la invención a partir de una o varias fases puede llevarse a cabo de manera conocida, por ejemplo por medio del secado por pulverización o granulación, añadiéndose en caso dado ulteriormente, por separado, los enzimas y, eventualmente, otros componentes sensibles a la temperatura tales como por ejemplo los agentes de blanqueo. Para la fabricación de los agentes según la invención con un elevado peso a granel, especialmente en el intervalo desde 650 g/l hasta 950 g/l, es preferente un procedimiento conocido por la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 486 592, que presenta una etapa de extrusión. Otra fabricación preferente con ayuda de un procedimiento de granulación está descrita en la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 642 576.

Las proteínas pueden emplearse para los agentes sólidos, por ejemplo, en forma secada, granulada, encapsulada o encapsulada y adicionalmente secada. Pueden añadirse separadamente, es decir como fase propia, o junto con otros componentes en la misma fase, con o sin compactación. Cuando deban elaborarse enzimas microencapsulados en forma sólida, podrá eliminarse el agua con procedimientos conocidos por el estado de la técnica a partir de las soluciones acuosas que se forman durante la preparación, tal como secado por pulverización, eliminación por centrifugación o por medio de la transolubilización. Las partículas, obtenidas de este modo, tienen usualmente un tamaño de partícula comprendido entre 50 y 200 \mum.

La forma encapsulada es adecuada para proteger los enzimas frente a otros componentes, tales como por ejemplo los agentes de blanqueo o para posibilitar una liberación controlada (controlled release). De acuerdo con el tamaño de estas cápsulas se distinguirá entre milicápsulas, microcápsulas y nanocápsulas, siendo las microcápsulas especialmente preferentes para los enzimas. Tales cápsulas se han divulgado por ejemplo, con las solicitudes de patente WO 97/24177 y DE 199 18 267. Otro posible método de encapsulación consiste en que los enzimas, adecuados para el empleo en los agentes de lavado y de limpieza, se encapsulan a partir de una mezcla de la solución enzimática con una solución o suspensión de almidones o de un derivado del almidón, en almidones, o bien en el derivado del almidón. Un procedimiento de encapsulación de este tipo se ha descrito en la solicitud de patente alemana DE 199 56 382.

Otra posibilidad de poner a disposición un agente sólido según la invención consiste en el prensado o en la compactación para dar tabletas. Tales tabletas pueden ser monofásicas o polifásicas. De este modo esta forma de administración ofrece también la posibilidad de presentar un agente sólido según la invención con dos fases sólidas. Para la fabricación de los agentes según la invención en forma de tabletas, que pueden ser monofásicas o polifásicas, monocrómicas o policrómicas y/o que pueden estar constituidas por una o por varias capas, se mezclan entre sí en un mezclador preferentemente todos los componentes -en caso dado para cada capa- y la mezcla se prensa con prensas entabletadoras tradicionales, por ejemplo prensas excéntricas o prensas circulares, con fuerzas para el prensado en el intervalo desde aproximadamente 50 hasta 100 kN/cm^{2}, preferentemente a 60 hasta 70 kN/cm^{2}. Especialmente en el caso de tabletas con varias capas puede ser ventajoso que se prense previamente al menos una capa. Esto se llevará a cabo preferentemente con fuerzas para el prensado comprendidas entre 5 y 20 kN/cm^{2}, especialmente a 10 hasta 15 kN/cm^{2}. Preferentemente una tableta fabricada de este modo presenta un peso desde 10 g hasta 50 g, especialmente desde 15 g hasta 40 g. La forma geométrica de las tabletas es arbitraria y puede ser circular, oval o poligonal, aún cuando también sean posibles formas intermedias.

Es especialmente ventajoso que, en los agentes polifásicos, al menos una de las fases contenga un material sensible a las amilasas, especialmente almidones o que esté rodeada o recubierta, al menos en parte, por el mismo. De este modo se estabiliza mecánicamente la fase y/o queda protegida frente a las influencias externas y, al mismo tiempo, es atacada por una amilasa, activa en el baño de lavado de tal manera, que se facilite la liberación de los componentes.

Pueden añadirse a los agentes líquidos, en forma de gel o pastosos, según la invención, los enzimas, así como también una proteína esencial para la invención a partir de una obtención de proteínas realizada según el estado de la técnica y preparación en solución concentrada acuosa o no acuosa, por ejemplo en forma líquida, por ejemplo como solución, suspensión o emulsión, así como también forma de gel o encapsulada o como polvo secado. Tales agentes de lavado o de limpieza según la invención en forma de soluciones en disolventes usuales se fabrican, por regla general, por simple mezcla de los componentes, que pueden añadirse en substancia o como solución a un mezclador automático.

Una forma de realización de la presente invención consiste en tales agentes líquidos, en forma de gel o pastosos a los que se les haya añadido una proteína esencial para la invención y/u otra de las proteínas obtenidas y/u otro de los componentes contenidos en forma de microcápsulas. Entre éstos son especialmente preferentes aquellos con cápsulas de material sensible a la amilasa. Un empleo conjunto de este tipo de los materiales sensibles a las amilasas y del enzima amilolítico, esencial para la invención, en un agente de lavado o de limpieza puede presentar efectos sinérgicos, por ejemplo de tal manera, que el enzima con mayor potencia disociadora favorezca la disociación de las microcápsulas y, de este modo, controle el proceso de liberación de los componentes encapsulados de tal manera, que su liberación no se produzca durante el almacenamiento y/o tampoco al inicio del programa de limpieza, sino que se produzca solamente en un momento determinado. Los sistemas complejos de lavado y de limpieza con los componentes más diversos y con los tipos de cápsulas más diversos pueden estar basados en este mecanismo, que representan formas de realización especialmente preferentes de la presente invención.

Un efecto similar se obtiene cuando los componentes del agente de lavado y de limpieza estén distribuidos al menos entre dos fases diferentes, por ejemplo entre dos o varias fases unidas entre sí, fijas, de un agente de lavado o de limpieza en forma de tabletas, o granulados diferentes dentro del mismo agente pulverulento. Los limpiadores con dos o varias fases pertenecen al estado de la técnica para la aplicación tanto en el fregado a máquina de la vajilla como también en los agentes de lavado. La actividad de un enzima amilolítico en una fase activada previamente es una condición previa para la activación de una fase ulterior cuando ésta esté recubierta por una vaina o recubrimientos sensibles a las amilasas o el material sensible a las amilasas represente un componente integral de la fase sólida, desintegrándose la fase correspondiente durante su hidrólisis parcial o completa. El empleo del enzima esencial para la invención para esta finalidad representa, por lo tanto, una forma de realización preferente de la presente invención.

Los componentes de los agentes de lavado y de limpieza son capaces de favorecerse adecuadamente entre sí en cuanto a sus prestaciones. El empleo sinérgico de amilasas y de inhibidores del corrido de los colores para aumentar las prestaciones de limpieza se divulga por ejemplo en la solicitud WO 99/63035. También se sabe que los polímeros, que pueden emplearse simultáneamente como coadyuvantes, tales como por ejemplo los alquil-poli-glicósidos, pueden estabilizar y aumentar la actividad y la estabilidad de los enzimas contenidos, tal como se conoce por la solicitud de patente WO 98/45396. Del mismo modo es posible modificar, especialmente estabilizar y/o aumentar una actividad amilolítica esencial para la invención por medio de uno de los restantes componentes, anteriormente indicados. Las recetas ajustadas correspondientemente para los agentes según la invención representan, por lo tanto, formas de realización especialmente preferentes de la presente invención.

De conformidad con las realizaciones descritas hasta este punto, pueden mejorarse también los procedimientos para la limpieza de los artículos textiles o de las superficies duras porque se activa en una de las etapas del procedimiento una amilasa híbrida, esencial para la invención, o un derivado de la misma. En este caso se trata de procedimientos de conformidad con la invención.

De manera preferente, tales procedimientos se caracterizan porque se emplea, al menos en una de las etapas del procedimiento, un agente de conformidad con la invención según la descripción dada hasta este punto.

Se han determinado como cantidades especialmente adecuadas de la proteína o del fragmento según la invención, para los procedimientos de limpieza.

Los procedimientos de este tipo se caracterizan, de manera especialmente preferente, porque, se emplea la proteína amilolítica o el derivado amilolítico, por ejemplo en las máquinas domésticas para el fregado de la vajilla o en las máquinas domésticas para la colada, corrientes, en cantidades comprendidas entre 0,01 mg y 400 mg, de manera preferente comprendidas entre 0,02 mg y 200 mg, de forma especialmente preferente comprendidas entre 0,02 mg y 100 mg.

En el caso más favorable se producen, en este caso, valores de concentración comprendidos entre 0,0005 y 20 mg por litro, de manera preferente comprendidos entre 0,005 y 10 mg por litro, de manera especialmente preferente comprendidos entre 0,005 y 8 mg de la proteína amilolítica por litro de baño de lavado. La concentración en proteína puede determinarse con ayuda de métodos conocidos, por ejemplo según el procedimiento BCA (ácido bicincónico; ácido 2,2'-biquinolil-4,4'-dicarboxílico) o el procedimiento al biuret (A.G. Gornall, C.C. Bardawill y M.M. David, J. Biol. Chem. 177 (1948), páginas 751-766).

De acuerdo con las realizaciones dadas hasta ahora, también el empleo de una amilasa híbrida, esencial para la invención o de un derivado de la misma solos o junto con al menos otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca el efecto de limpieza, destinado a la limpieza de los artículos textiles o de las superficies duras, representa una forma de realización de la presente invención.

De manera preferente esto se verifica mediante el empleo de un agente de conformidad con la invención.

El agente de conformidad con la invención o una proteína amilolítica, esencial para la invención, se empleará, de manera preferente, en los intervalos cuantitativos precedentemente indicados de tal manera, que se produzcan de manera conveniente en el baño de lavado los valores de concentración precedentemente indicados para la proteína amilolítica. Esta dosificación puede llevarse a cabo, según el problema de limpieza, por parte del fabricante del agente o por el usuario final.

Otra posibilidad de empleo de una amilasa híbrida esencial para la invención o de un derivado de la misma está representada por la activación de las propias fases o de otras fases, cuando se prepare sola o junto con, al menos, otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca el efecto de limpieza, en un agente de lavado o en un agente de limpieza constituido por más de una fase.

Otra posibilidad de empleo de una amilasa híbrida esencial para la invención o de un derivado de la misma está representada por la liberación de los componentes a partir de cápsulas, cuando se prepare sola o junto con, al menos, otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca el efecto de limpieza, en un agente de lavado o en un agente de limpieza con componentes encapsulados.

En otro aspecto de la presente invención se muestran procedimientos, según los cuales puede mejorarse el rendimiento de lavado y respectivamente el rendimiento de limpieza de un agente de lavado o de un agente de limpieza mediante el desarrollo de nuevas amilasas. Éstos consisten en que se fusiona respectivamente al menos una secuencia parcial, que comprenda más de un aminoácido, de las \alpha-amilasas procedentes de Bacillus amyloliquefaciens y de Bacillus licheniformis en posición respectivamente homóloga con respecto a una amilasa híbrida con actividad amilolítica y ésta se añade al agente.

Tales procedimientos son conocidos en sí mismos por el estado de la técnica y están basados en la ingeniería de la biología molecular, como los que se conocen, por ejemplo, por el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989 o en los manuales de consulta tal como en el "Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlín, 1999. De manera preferente éstos están basados en las secuencias de nucleótidos de las moléculas de partida, que han sido dadas en el protocolo de secuencias según las SEQ ID NO. 1 y 3. A título de ejemplo se ha presentado en el trabajo de los autores Conrad et al. (véase más arriba) la obtención de una multitud de moléculas a través de la recombinación in vivo de los genes correspondientes. Otras posibilidades para la generación de híbridos relevantes para la invención han sido ya presentados también más arriba.

De conformidad con las indicaciones precedentemente dadas, son preferentes aquellos procedimientos en los cuales las secuencias parciales de las amilasas híbridas, basadas en la molécula de partida, tengan una longitud mayor que 7, preferentemente mayor que 14, de manera especialmente preferente comprendida entre 21 y 462 aminoácidos.

De conformidad con las indicaciones precedentemente dadas, son preferentes aquellos procedimientos en los cuales la proteína híbrida esté formada a partir de 3 o a partir de 2 secuencias parciales que se complementen entre sí de acuerdo con las secuencias de partida.

De conformidad con las indicaciones precedentemente dadas, son más preferentes aquellos procedimientos en los cuales los puntos de fusión de la amilasa híbrida se encuentren dentro de una región comprendida entre 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 y 1 aminoácido por delante hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 y 1 aminoácido por detrás y, de una manera muy especialmente preferente, exactamente en una o varias de las posiciones 17, 34, 76, 108, 112, 142, 147, 149, 151, 163, 174, 179, 185, 191, 198, 207, 231, 234, 244, 256, 263, 276, 431, 84, 99, 429, 201, 19, 433 y 153 de conformidad con la numeración de la SEQ ID NO. 4.

De conformidad con las indicaciones precedentemente dadas, son más preferentes aquellos procedimientos en los cuales las amilasas híbridas, que han sido obtenidas, contengan, además, una o varias deleciones que no correspondan a más de 5, de 4, de 3 y de 2 aminoácidos contiguos, de manera especialmente preferente que contengan respectivamente sólo un aminoácido.

Tales mutaciones pueden generarse con etapas parciales en sí conocidas, por ejemplo en relación con la fusión. Éstas pueden introducirse también en otras posiciones diferentes a los puntos de fusión.

De conformidad con las indicaciones precedentemente dadas, son preferentes aquellos procedimientos en los cuales las amilasas híbridas, que han sido obtenidas, experimenten, de manera adicional, un intercambio de aminoácidos al menos en una posición. Entre éstas son más preferentes las substituciones en 1, en 2 o en 3 de las posiciones 132, 320 y 412 según la enumeración de la SEQ ID NO. 4.

De conformidad con las indicaciones precedentemente dadas, son preferentes aquellos procedimientos en los cuales las amilasas híbridas, que han sido obtenidas, contengan inserciones adicionales o representen una proteína amilolítica quimérica.

De conformidad con las indicaciones precedentemente dadas, son preferentes aquellos procedimientos en los cuales las amilasas híbridas, que han sido obtenidas, estén derivatizadas adicionalmente, por ejemplo mediante copulación sobre otra proteína, sobre un polímero o por medio de una modificación química de otro tipo.

Son especialmente preferentes, respectivamente, aquellos procedimientos caracterizados porque se emplean ácidos nucleicos para la formación de las amilasas híbridas, que presenten las secuencias de nucleótidos o las secuencias de nucleótidos sinónimas con las anteriores, en las regiones parciales correspondientes, que han sido indicadas en la SEQ ID NO. 1 y en la SEQ ID NO. 3 o secuencias de nucleótidos sinónimas con las anteriores. Tal como se ha descrito precedentemente puede ser especialmente significativo el intercambio de codones sinónimos, cuando deba modificarse la secuencia de nucleótidos manteniéndose la secuencia de aminoácidos para introducir determinados puntos de corte por restricción. Los genes mutados obtenidos pueden amplificarse, clonarse y emplearse para la producción de las variantes correspondientes, de manera en sí conocida.

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Ejemplos Ejemplo 1 Obtención de las amilasas híbridas AL 34, AL76, AL112, AL 256, ALA 34-84, LAL 19-153 y LAL 19-433 así como la determinación de sus actividad enzimáticas

Todas las etapas de biología molecular y de microbiología siguen los métodos patrón, como los que han sido descritos, por ejemplo, en el manual de los autores Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989.

Las cepas bacterianas, que forman los enzimas correspondientes, pueden ser obtenidas como se ha descrito en la publicación "Hybrid Bacillus amyloliquefaciens X Bacillus licheniformis \alpha-Amylases. Construction, properties and sequence determinats" (1995) de B. Conrad, V. Hoang, A. Polley y J. Hofemeister, Eur. J. Biochem., 230, páginas 481-490.

El cultivo de partida de las cepas bacterianas, que expresan las amilasas híbridas AL 34, AL76, AL112, AL 256, ALA 34-84, LAL 19-153 y LAL 19-433, se llevó a cabo en cultivos de 250 ml en matraces sometidos a trepidaciones de 1 litro a 37ºC y a 200 revoluciones por minuto. Como medio sirvió: MLBSP (10 g/l de Casiton; 20 g/l de Trypton, 10 g/l de extracto de levadura, respectivamente de la firma Becton Dickinson, Cockeysville; 5 g/l de NaCl; 27 g/l de succinato de sodio; 100 mg/l de MgSO_{4}*7 H_{2}O; 75 mg/l de CaCl_{2}*2 H_{2}O; 0,5 \muM de MnCl_{2}; 0,5 \muM de FeSO_{4}; 2% (p/v) de glucosa; 50 mM de tampón PIPES (a partir de una solución madre 1 M con pH 7,2); 75 mM de KPO_{4} (a partir de una solución madre 1,5 M con pH 7,0); pH = 7,0, ajustado con KOH) y 5 \mug/ml de cloroanfenicol. Como inoculum sirvió respectivamente un 1% del volumen objetivo de un cultivo previo durante 24 horas en el mismo medio.

El sobrenadante se obtuvo mediante centrifugación a 4ºC al cabo de 64 horas. El sobrenadante se estabilizó con un 50% de propilenglicol y se determinó su actividad en amilasa en TAU. Para ello se utiliza el substrato constituido por el p-nitrofenil-\alpha-D-maltoheptaglucósido, estando bloqueada su unidad de glucosa situada en el extremo de la cadena por medio de un grupo de bencilideno. Éste se disocia por medio de amilasa para dar el p-nitrofenil-oligosacárido libre, que, por su parte, se convierte en glucosa y en p-nitrofenol por medio de los enzimas auxiliares constituidos por la glucoamilasa y por la alfa-glucosidasa. De este modo la cantidad de p-nitrofenol liberada es proporcional a la actividad de la amilasa. La medida se lleva a cabo, por ejemplo, con el estuche de ensayo Quick-Start® de la firma Abbott, Abott Park, Illinois, USA. El aumento de la absorción (405 nm) en carga de ensayo se detecta a 37ºC durante 3 minutos frente a un valor en blanco por medio de un fotómetro. La calibración se lleva a cabo por medio de un patrón enzimático con una actividad conocida (por ejemplo Maxamyl®/Purastar® 2900 de la firma Genencor con 2900 TAU/g). La evaluación se lleva a cabo por medio de la representación de la diferencia de absorción dE (405 nm) por minuto frente a la concentración enzimática del patrón. La cantidad de 1 TAU es la cantidad de enzima que es capaz, bajo las condiciones dadas, de disociar en un minuto 1 \mumol del substrato.

Se obtuvieron los valores de actividad dados en la tabla 1 siguiente:

TABLA 1 Valores de actividad de amilasas híbridas seleccionadas

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Ejemplo 2

Se dotaron artículos textiles de algodón de manera normalizada con las siguientes suciedades: A: mousse de chocolate; B: copos de avena con cacao, C: almidón de patata, y se ensayaron diversas recetas de agentes de lavado por launderometría con respecto a su rendimiento de lavado por medio del material preparado de este modo. Para ello se ajusta respectivamente una relación de baño de 1:12 y se lava durante 30 minutos a una temperatura de 30ºC. La dosificación era de 5,88 g del correspondiente agente de lavado por litro de baño de lavado. La dureza del agua fue de 16º de dureza alemana.

Como agentes de lavado de control sirvieron, para A y para B, una receta de base para agentes de lavado con la siguiente composición (todas las indicaciones en porcentaje en peso): un 4% de alquilbencenosulfonato de sodio lineal (sal de sodio), un 4% de sulfato de alcoholes grasos con 12 hasta 18 átomos de carbono (sal de sodio), un 5,5% de alcoholes grasos con 12 hasta 18 átomos de carbono con 7 EO, un 1% de jabones de sodio, un 11% de carbonato de sodio, un 2,5% de disilicato de sodio amorfo, un 20% de tetrahidrato de perborato de sodio, un 5,5% de TAED, un 25% de zeolita A, un 4,5% de policarboxilato, un 0,5% de fosfonato, un 2,5% de granulado inhibidor de la espuma, un 5% de sulfato de sodio, un 1% de granulado de proteasa, resto: agua, abrillantador óptico, perfume, sales. Éstos se combinaron con diversas amilasas para las diversas series de ensayos de tal manera que se produjese respectivamente una concentración final de 44 TAU de enzima amilolítico por litro de baño de lavado.

Se compararon con los enzimas amilolíticos, esenciales para la invención, constituidos por AL76, AL112 y LAL19-433, los productos Termamyl®, Duramyl® y BAN® (fabricante respectivamente: Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca). Para la impureza C se empleó la misma receta de base, desde luego sin proteasa, y se empleó como controles como en A y en B, o bien se combinó con las amilasas.

El grado de blancura de los artículos textiles se midió en el sistema CIELAB con el dispositivo de medida Minolta CR 310 antes y después del lavado en comparación con un patrón, que se normalizó al 100%. Las diferencias entre los valores obtenidos se reúnen en la tabla 2 siguiente para los ensayos correspondientes. Se han dado los valores medios respectivamente de 5 mediciones. Éstos permiten una deducción inmediata sobre la contribución del enzima contenido sobre el rendimiento de lavado del agente empleado.

TABLA 2

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Puede verse que, en el caso de la suciedad A, la amilasa híbrida AL76 es al menos equivalente al mejor de los tres enzimas de comparación; en el caso de la suciedad B, las AL76 y LAL19-433 sobrepasan claramente a aquellas. En el caso de la suciedad C la amilasa híbrida AL112 es equivalente al mejor de los tres enzimas de comparación. Los restantes enzimas esenciales para la invención, respectivamente ensayados, mostraron rendimientos de lavado que al menos eran equivalentes a los de los enzimas establecidos. Estos resultados son tanto más llamativos cuanto que en todos los agentes está contenido un agente de blanqueo y en A y B está contenida, además, una proteasa, a las cuales reaccionan de una manera muy sensible, en general, los enzimas contenidos.

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Ejemplo 3

Se ensuciaron artículos textiles de algodón, de manera normalizada, con las suciedades B (copos de avena con cacao) y D (copos de avena con cacao y con un poco de leche). Los ensayos realizados por launderometría se llevaron a cabo como en el ejemplo 2, desde luego con el empleo de una receta de base para agente de lavado exenta de agente blanqueante; ésta contenía, respectivamente, en porcentaje en peso: un 14% de alquilbencenosulfonato de Na, un 6% de sulfonato de alcoholes grasos en forma de sal de Na, un 6% de alcoholes grasos con 12 hasta 18 átomos de carbono 7 veces etoxilados, un 1% de jabones, un 25% de zeolita Na-A, un 10% de carbonato de Na, un 5% de policarboxilato polímero (Sokalan CP5), un 11% de citrato trisódico-dihidrato, un 4% de ácido cítrico, un 1% de inhibidor de la espuma confeccionado en forma de partículas, un 1% de granulado de proteasa, un 5% de sulfato de sodio, resto: agua y sales. Esta receta de base se combinó con las diversas amilasas para las diversas series de ensayos de tal manera que se produjese respectivamente una concentración final de 33,5 TAU de enzima amilolítico por litro de baño de lavado. Se compararon con las amilasas híbridas, esenciales para la invención, constituidas por la AL76, AL112 y LAL19-433, los productos Termamyl®, Duramyl® y BAN® (fabricante respectivamente: Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dinamarca). La dosificación fue de 4,45 g del correspondiente agente de lavado por litro de baño de lavado.

Tras el lavado se determinó el grado de blancura de los artículos textiles lavados como en el ejemplo precedente. Los valores de la diferencia, obtenidos de manera respectiva, se han reunido en la tabla 3 siguiente. En este caso se trata respectivamente de los valores medios de 5 mediciones, que permiten a su vez una deducción inmediata de la contribución del enzima correspondiente al rendimiento de lavado del agente.

TABLA 3

8

En ambos casos ensayados, los tres enzimas esenciales para la invención, especialmente el LAL19-433, mostraron incluso en esta receta para agentes de lavado exenta de agentes de blanqueo, contribuciones a los rendimientos de lavado de los agentes correspondientes tales que son mejores que las de los tres enzimas de comparación o al menos son equivalentes con los mismos dentro de los límites de error.

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Ejemplo 4

Se ensuciaron artículos textiles de algodón de manera normalizada con dos tipos diferentes de variedades de cacao malteado (E y F) que pueden ser adquiridos en el comercio. De este modo se llevó a cabo el ensayo por launderometría como se ha descrito en el ejemplo 2. Como agente de lavado para el control sirvió la receta de base para el agente de lavado del agente 3, sin embargo sin proteasa. Ésta se combinó para las diversas series de ensayos como en el ejemplo 3 con las diversas amilasas y se empleó en la misma dosificación.

Tras el lavado se midió el grado de blancura de los artículos textiles lavados, en comparación con el sulfato de bario, que se normalizó al 100%. La medición se llevó a cabo con un espectrómetro Datacolor SF500-2 a 460 nm (filtro 3 para el bloqueo de los UV), diafragma de 30 mm, sin brillo, tipo de luz D65, 10º, d/8º. Los resultados obtenidos se han reunido como porcentajes de remisión, es decir como indicaciones en porcentaje en comparación con el sulfato de bario, en la tabla 4 siguiente; en esta tabla se han indicado igualmente los correspondientes valores iniciales. Se han dado los valores medios respectivamente de 5 mediciones. Éstos permiten una deducción inmediata de la contribución del enzima amilolítico respectivo contenido sobre el rendimiento de lavado del agente empleado.

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TABLA 4

9

10

En el caso de la suciedad E las tres amilasas híbridas, esenciales para la invención, ensayadas superan claramente a los tres enzimas establecidos; en el caso de la suciedad F son aproximadamente equivalentes a los enzimas establecidos dentro de los límites de error.

Ejemplo 5

Se dotaron a artículos textiles de algodón normalizados con las suciedades G (puré de patata con pulpa de tomate como indicador del color), H (cacao malteado), D (copos de avena con cacao y un poco de leche), E y F (dos tipos comerciales de variedades de cacao malteado que pueden ser adquiridos en el comercio) y se ensayaron por launderometría bajo las condiciones de ensayo indicadas en el ejemplo 2. La concentración del agente de lavado empleado en cada caso fue a su vez de 5,88 g por cada litro de baño de lavado.

Para ello se empleó a su vez la receta de base del agente de lavado, dada en el ejemplo 2, con blanqueo, pero sin otros enzimas. Sin embargo, las \alpha-amilasas se emplearon en una concentración de 125 TAU por cada litro de baño de lavado. En comparación con los tres enzimas de referencia conocidos constituidos por Termamyl®, por Duramyl® y por BAN® (fabricante respectivamente: Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dinamarca) se ensayaron en este caso las dos amilasas híbridas AL76 y LAL.

Tal como se ha descrito en el ejemplo 2 se determinó para las suciedades G, H y D el grado de blancura alcanzado de los artículos textiles en porcentaje por medio del sistema CIELAB; para las suciedades E y F se establecieron, como se ha descrito en el ejemplo 4, medidas comparativas con respecto al sulfato de bario. En la tabla 5 siguiente se han reunido los valores medios obtenidos respectivamente a partir de 5 mediciones.

TABLA 5

11

En el caso de las suciedad G, el valor para la amilasa híbrida AL76 se encuentra dentro del margen de error, por encima del valor máximo de los tres enzimas de comparación, por lo tanto debe considerarse al menos como equivalente. En el caso de las suciedades H y D, la AL76 presenta, con gran diferencia, los mejores resultados, en el caso de H seguida por la amilasa híbrida LAL y solamente después el valor de las amilasas para los agentes de lavado establecidas, empleadas con fines comparativos.

De igual modo, en el caso de las suciedades E y F, la AL76 no presenta valores por debajo de los correspondientes a los enzimas de comparación, y la LAL19-433 presenta valores que únicamente son ligeramente peores que los correspondientes a los tres enzimas de comparación. Así mismo, este ejemplo demuestra que las amilasas híbridas, especialmente la AL76 y la LAL19-433 son perfectamente comparables con los enzimas establecidos de los agentes de lavado correspondientes, en lo que se refiere a su contribución a los rendimientos de lavado.

Ejemplo 6

Se ensuciaron recipientes con superficies lisas, duras, de manera normalizada con copos de avena hinchados en agua y a continuación se fregaron a 45ºC con el programa normal de una máquina lavavajillas doméstica de tipo Miele® G 575. Se emplearon 20 g de agente de fregado por cada proceso de fregado; la dureza del agua fue de 16º de dureza alemana.

Como agente de fregado sirvió la receta de base siguiente (todas las indicaciones respectivamente en porcentaje en peso): un 55% de tripolifosfato de sodio (calculado en estado anhidro), un 4% de disilicato de sodio amorfo (calculado en estado anhidro), un 22% de carbonato de sodio, un 9% de perborato de sodio, 2% TAED, un 2% de tensioactivo no iónico, un 1,4% de granulado de proteasa, resto: agua, colorantes, perfume. Esta receta de base se empleó para los diversos ensayos con diversas amilasas, concretamente con los productos Termamyl®, Duramyl®, BAN® (fabricante respectivamente: Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dinamarca), o bien respectivamente con un enzima amilolítico esencial para la invención. El enzima se empleó en cantidades activas respectivamente de 150 TAU de actividad amilolítica por proceso de limpieza, calculadas según el método indicado en el ejemplo 2. Los representantes empleados de las amilasas híbridas esenciales para la invención están constituidos por: ALA34-84, AL34, AL76, AL112, AL256, LAL19-153, LAL19-433.

Tras el fregado se evaluó a simple vista el desprendimiento de la suciedad tras coloreado con yodo por medio de una reacción de yodo-almidón, en una escala comprendida entre 0 (= sin modificaciones, es decir ensuciado muy fuerte) hasta 10 (= no puede reconocerse ningún tipo de suciedad). Los resultados obtenidos se reúnen en la tabla 6 siguiente. En esta tabla se han indicado los valores medios procedentes de, respectivamente, 9 mediciones. Éstos permiten una deducción inmediata sobre la contribución del enzima obtenido sobre el rendimiento de limpieza del agente empleado.

TABLA 6

12

Las tres amilasas híbridas AL34, AL76 y AL112 muestran sobre las tres suciedades que contienen almidón, contribuciones para el rendimiento de lavado de los agentes que se encuentran por encima del valor correspondiente al mejor de los tres enzimas de referencia. Únicamente la \alpha-amilasa LAL19-153 muestra un valor que se encuentra por debajo del peor de los enzimas de referencia pero por encima de los controles. De este modo, las amilasas híbridas, esenciales para la invención, presentan, a 45ºC, contribuciones a los rendimientos de limpieza del agente según la invención, que son comparables o bien que sobrepasan a las de los enzimas establecidos con esta finalidad.

Ejemplo 7

Se dotaron recipientes con superficies lisas, duras, de manera normalizada con las suciedades siguientes: J (DIN copos de avena), I (copos de avena hinchados en agua) y K (almidones mixtos).

El ensayo relativo a la contribución del enzima amilolítico correspondiente al rendimiento de limpieza de una receta de agente para el fregado de la vajilla, se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo precedente. La única diferencia consistía en que en este caso se llevó a cabo el fregado a 55ºC.

Se ensayaron de manera correspondiente las amilasas híbridas AL112, LAL 19-433 y AL76, a su vez en comparación con las \alpha-amilasas constituidas por los productos Termamyl®, Duramyl® y BAN® (fabricante respectivamente: Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca). La evaluación para las suciedades J e I se llevó a cabo a simple vista, como se ha descrito en el ejemplo precedente, sobre una escala comprendida entre 0 y 10. El desprendimiento de la suciedad K se determinó en porcentaje, por gravimetría. Para ello se relacionó la diferencia entre el peso del recipiente ensuciado y a continuación fregado y el peso inicial del recipiente con la diferencia entre el peso del recipiente no fregado y el peso inicial. Esta relación puede considerarse como porcentaje de desprendimiento. El resultado se ha reunido en la tabla 7 siguiente.

TABLA 7

14

En este ensayo, la AL76 proporcionó, en el caso de la suciedad J, claramente la contribución máxima al rendimiento de lavado del agente correspondiente, seguida de la AL112 y solamente a continuación de los enzimas comparativos. De manera especial, cuando se lleva a cabo la limpieza a 55ºC, las contribuciones de las amilasas híbridas AL76 sobre la suciedad I se encuentran claramente por encima de las correspondientes a los tres enzimas de referencia; las contribuciones de las otras dos amilasas híbridas ensayadas presentan valores comparables. Lo mismo es válido para la suciedad K.

Descripción de las figuras

Figura 1: Esquema para la construcción de las amilasas híbridas especialmente esenciales para la invención AL34, AL76, AL112, AL256, ALA34-84, LAL19-153 y LAL19-433.

Las zonas respectivamente caracterizadas en negro se derivan de las \alpha-amilasas procedentes de B. amyloliquefaciens (B.A.; barra superior), y las que están caracterizadas en blanco se derivan de la \alpha-amilasa procedente de B. licheniformis (B.L.; segunda barra). Por encima de la primera barra se han indicado los puntos de fusión en la numeración de las secuencias de aminoácidos de la \alpha-amilasa madura de B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4).

Figura 2: Alineación de las secuencias de aminoácidos de las preproteínas (precursor) de las \alpha-amilasas procedentes de B. licheniformis (B.L.) y de B. amyloliquefaciens. (B.A.).

El péptido líder de la \alpha-amilasa procedente de B. licheniformis comprende 29 aminoácidos, el de la \alpha-amilasa procedente de B. amyloliquefaciens comprende 31 aminoácidos. Las proteínas maduras tienen respectivamente una longitud de 483 aminoácidos.

Se han realzado en trazo grueso, respectivamente, los primeros aminoácidos de la proteína madura así como los aminoácidos que corresponden, según la enumeración de la proteína madura procedente de B. amyloliquefaciens, a las posiciones 19, 34, 76, 84, 112, 153, 256 y 433. Los cambios de una secuencia hasta otra secuencia por detrás de una o bien por detrás de dos de estas posiciones, caracterizan cada una de las formas de realización especialmente preferentes de la presente invención.

<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien

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<120> Agentes de lavado y de limpieza con alfa-amilasas híbridas

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<130> H 4714 PCT

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<140>

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<141>

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<150> DE 10138753.9-41

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<151> 2001-08-07

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<160> 18

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1452

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<212> DNA

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<213> Bacillus licheniformis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1452)

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<400> 1

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15

16

17

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<210> 2

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<211> 483

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<212> PRT

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<213> Bacillus licheniformis

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<400> 2

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18

19

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<210> 3

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<211> 1452

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<212> DNA

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<213> Bacillus amyloliquefaciens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1452)

\newpage

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<400> 3

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20

22

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<210> 4

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<211> 483

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<212> PRT

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<213> Bacillus amyloliquefaciens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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23

24

\newpage

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<210> 5

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<211> 1446

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fusión de los genes de alfa-amilasa de B. licheniformis y B. amyloliquefaciens (AL34).

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1446)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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25

26

27

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<210> 6

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<211> 481

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 6

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28

30

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<210> 7

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<211> 1446

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fusión de los genes de alfa-amilasa de B. licheniformis y B. amyloliquefaciens (AL76).

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1).. (1446)

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<400> 7

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31

32

33

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<210> 8

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<211> 481

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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34

\newpage

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<210> 9

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<211> 1446

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fusión de los genes de alfa-amilasa de B. licheniformis y B. amyloliquefaciens (AL112).

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1446)

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<400> 9

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36

37

38

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<210> 10

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<211> 481

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 10

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39

40

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<210> 11

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<211> 1452

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: fusión de los genes de alfa-amilasa de B. licheniformis y B. amyloliquefaciens (AL256).

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1452)

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<400> 11

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41

42

43

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<210> 12

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<211> 483

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 12

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44

45

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<210> 13

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<211> 1452

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fusión de los genes de alfa-amilasa de B. licheniformis y B. amyloliquefaciens (ALA34-84).

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1952)

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<400> 13

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46

47

48

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<210> 14

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<211> 483

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 14

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49

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<210> 15

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<211> 1458

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: fusión de los genes de alfa-amilasa de B. licheniformis y B. amyloliquefaciens (LAL19-433).

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1458)

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<400> 15

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51

52

53

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<210> 16

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<211> 485

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 16

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54

55

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<210> 17

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<211> 1452

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: fusión de los genes de alfa-amilasa de B. licheniformis y B. amyloliquefaciens (LAL19-153).

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1452)

\newpage

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<400> 17

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56

57

58

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<210> 18

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<211> 483

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 18

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59

Claims

1. Agente de lavado o de limpieza, caracterizado porque contiene una proteína híbrida amilolítica, estando constituida la proteína híbrida por aquella es idéntica a la AL76 (SEQ ID NO. 8) al menos en un 98%, de manera preferente en un 99%, de manera especialmente preferente en un 100%.

2. Agente de lavado o de limpieza según la reivindicación 1, caracterizado porque como proteína amilolítica contiene una amilasa híbrida obtenida por deleción, respectivamente, de un número no mayor que 5 aminoácidos contiguos, de manera preferente por deleción de, respectivamente, un número no mayor que 3 aminoácidos contiguos, de manera especialmente preferente por deleción de, respectivamente, únicamente un aminoácido u obtenida por substitución de un aminoácido, según la reivindicación 1.

3. Agente de lavado o de limpieza según la reivindicación 1, caracterizado porque como proteína amilolítica contiene una proteína amilolítica, obtenida por mutación por inserción o contiene una proteína amilolítica quimérica, que ha sido obtenida mediante la inserción de un fragmento de proteína en la secuencia de partida, según la reivindicación 1.

4. Agente según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque contiene desde un 0,000001 por ciento en peso hasta un 5% en peso, de manera especial desde un 0,00001 hasta un 3% en peso de la proteína amilolítica.

5. Agente según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque contiene, de manera adicional, una o varias proteínas amilolíticas de otro tipo, de manera especial contienen \alpha-amilasas.

6. Agente según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque contiene, de manera adicional, otros enzimas, de manera especial contiene una o varias proteasas, lipasas, \beta-glucanasas y/o celulasas.

7. Agente según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque está constituida por más de una fase.

8. Agente según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque es sólido y se presentan mezclados entre sí al menos dos componentes sólidos diferentes, de manera especial polvo, granulado o cuerpos extruidos, en conjunto en forma suelta.

9. Agente según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se presentan al menos dos fases sólidas unidas entre sí, de manera especial tras una fase conjunta de compactación.

10. Agente según una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque al menos una de las fases contiene un material sensible a las amilasas, de manera especial almidones o está rodeada o recubierta, al menos en parte, por el mismo.

11. Agente según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque en conjunto es líquido, en forma de gel o pastoso y la proteína contenida y/o al menos uno de los enzimas contenidos y/o al menos uno de los otros componentes contenidos se presentan encapsulados de maneras individual o junto con otros componentes, de manera preferente en microcápsulas, de manera especialmente preferente en aquellas que estén constituidas por un material sensible a las amilasas.

12. Agente según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se modifica la actividad amilolítica por medio de uno de los otros componentes del agente, de manera especial se estabiliza y/o se aumenta su contribución con respecto al rendimiento de lavado, o bien de limpieza del agente.

13. Procedimiento para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras, caracterizado porque se activa una proteína amilolítica según una de las reivindicaciones 1 a 3 en, al menos, una de las etapas del procedimiento.

14. Procedimiento para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras, caracterizado porque se emplea un agente según una de las reivindicaciones 1 a 12 en, al menos, una de las etapas del procedimiento.

15. Procedimiento según la reivindicación 13 o 14, caracterizado porque la proteína amilolítica se emplea en la etapa correspondiente del procedimiento en una cantidad comprendida entre 0,01 mg y 400 mg, de manera preferente comprendida entre 0,02 mg y 200 mg, de manera especialmente preferente comprendida entre 0,02 y 100 mg por aplicación.

16. Empleo de una proteína amilolítica según una de las reivindicaciones 1 a 3 sola o junto con, al menos, otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca el efecto de limpieza, para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras.

17. Empleo de un agente según una de las reivindicaciones 1 a 12 para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras.

18. Empleo según la reivindicación 16 o 17, caracterizado porque se aplican entre 0,01 mg y 400 mg, de manera preferente entre 0,02 mg y 200 mg, de manera especialmente preferente entre 0,02 y 100 mg de la proteína amilolítica, por aplicación, de manera preferente por cada aplicación en una máquina lavavajillas o en una máquina lavadora.

19. Empleo de una proteína amilolítica según una de las reivindicaciones 1 a 3 sola o junto con, al menos, otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca el efecto de limpieza en un agente de lavado o de limpieza, constituido por más de una fase, para la activación de la propia fase o de otras fases.

20. Empleo de una proteína amilolítica según una de las reivindicaciones 1 a 3 sola o junto con, al menos, otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca el efecto de limpieza en un agente de lavado o de limpieza con componentes encapsulados para la liberación de los componentes a partir de las cápsulas.

21. Procedimiento para mejorar el rendimiento de lavado o el rendimiento de limpieza de un agente de lavado o de limpieza, caracterizado porque se añade al agente una amilasa híbrida, con actividad amilolítica, estando constituida la proteína híbrida por una que es idéntica a la AL76 (SEQ ID NO. 8) al menos en un 98%, de manera preferente en un 99%, de manera especialmente preferente en un 100%.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque se emplean ácidos nucleicos para la formación de la amilasa híbrida, que presentan, en las regiones parciales correspondientes, las secuencias de nucleótidos indicadas en las SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 3 o presentan secuencias de nucleótidos sinónimas con las anteriores.