ES2909509T3 - Variante de alfa-amilasas con mayor actividad en polímeros de almidón - Google Patents

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Abstract

Método para producir una variante de polipéptido de α-amilasa que presenta alteración en la unión a haces de almidón, en el que se alinean polímeros individuales de almidón, en comparación con un polipéptido parental de α-amilasa, que comprende: introducir en la secuencia amino de un polipéptido de α-amilasa parental de familia 13 una mutación en un residuo de aminoácido en el surco de unión de almidón que se une a unos haces de almidón, donde la mutación altera la unión de haces de almidón a la variante de polipéptido de α-amilasa en comparación con el polipéptido de α-amilasa parental; donde el surco de unión de almidón se forma mediante residuos de aminoácidos en la hélice α que precede a la primera cadena β en el dominio A, el bucle entre la sexta hélice α y la séptima cadena β en el dominio A, el bucle entre la séptima hélice α y la octava cadena β en el dominio A, y el bucle que conecta el dominio A y el dominio C; el surco de unión de almidón corresponde a los residuos de aminoácidos 1-6, 36, 38, 91-97, 224-226, 249-257, 278-282, 309-320, 354-359, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 2 para la numeración, a los residuos de aminoácidos 1-6, 37, 39, 92-98, 227-229, 252-260, 281-285, 312-323, 357-362, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 3 para la numeración, o a los residuos de aminoácidos 1-4, 36, 38, 91-97, 226-228, 251-259, 280-284, 311-322, 356-361, 363, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración; y donde el compuesto parental presenta al menos un 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto al SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5.

Description

DESCRIPCIÓN
Variante de a-amilasas con mayor actividad en polímeros de almidón
CAMPO TÉCNICO
[0001] Se describen composiciones y métodos relacionados con la variante de enzimas a-amilasa para uso en procesos industriales como licuefacción de almidón. Las variantes de a-amilasa presentan actividad específica aumentada, lo que permite la reducción más rápida de la viscosidad pico durante los procesos de licuefacción.
ANTECEDENTES
[0002] Las a-amilasas se emplean en una variedad de procesos industriales y comerciales, incluyendo licuefacción de almidón, desencolado textil, preparación de alimentos, lavado de ropa y lavado de platos. En estas aplicaciones, las aamilasas pueden descomponer almidón para liberar carbohidratos más pequeños. Sin embargo, los haces de almidón pueden presentar resistencia a la hidrólisis de a-amilasa debido a que los polímeros organizados de almidón excluyen las enzimas. Por consiguiente, al emplear una a-amilasa con actividad específica aumentada tan solo mejora la hidrólisis de almidón de forma marginal debido a que no aborda el problema de la accesibilidad. Se necesitan a-amilasas que sean más eficaces a la hora de acceder a los polímeros de almidón en haces de almidón.
[0003] En Matsui & Svensson, J. Biol. Chem., 272 (36), 22456 - 22463 (1997) se describen a-amilasas de cebada que han mutado por mutagénesis aleatoria local para presentar actividad mejorada respecto a la amilosa. En Gottschalk et al., Biochem., 40 (43), 12844 -12854 (2001) se describen a-amilasas de cebada que han mutado mediante una estrategia de mutagénesis aleatoria sesgada para presentar especificidad del sustrato y perfiles de producto modificados. En Mori et al., Eur. J. Biochem., 269 (22), 5377 - 5390 (2002) se describe una serie de a-amilasas mutantes que contienen mutaciones en el residuo Met53, que se encuentra en el subsitio -2 de alta afinidad en a-amilasa de cebada 1.
[0004] El documento US 7,166,453 B2 describe métodos para producir variantes de polipéptidos que presenten actividad exoamilasa no maltogénica, comprendiendo el método introducir una sustitución del aminoácido en un polipéptido parental que presente actividad exoamilasa no maltogénica, seleccionándose la sustitución del aminoácido de entre el grupo que consiste en: G69P, A141P, G223A, A268P y G313P, S399P y G400P, con respecto a la numeración de las posiciones de una exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia.
SUMARIO
[0005] La invención proporciona métodos para producir variantes de polipéptidos de a-amilasa, como se definen en las reivindicaciones. En los siguientes párrafos numerados por separado 1-14 se resumen aspectos y modos de realización de la invención.
1. En un aspecto, se proporciona un método para producir una variante de polipéptido de a-amilasa que presenta alteración en la unión a haces de almidón, en el que se alinean polímeros individuales de almidón, en comparación con un polipéptido de a-amilasa parental. El método comprende:
introducir en la secuencia amino de un polipéptido de a-amilasa parental de familia 13 una mutación en un residuo de aminoácido en el surco de unión de almidón que se une a unos haces de almidón, donde la mutación altera la unión de haces de almidón a la variante de polipéptido de a-amilasa en comparación con el polipéptido de a-amilasa parental;
donde el surco de unión de almidón se forma mediante residuos de aminoácidos en la hélice a que precede a la primera cadena p en el dominio A, el bucle entre la sexta hélice a y la séptima cadena p en el dominio A, el bucle entre la séptima hélice a y la octava cadena p en el dominio A, y el bucle que conecta el dominio A y el dominio C;
el surco de unión de almidón corresponde a los residuos de aminoácidos 1-6, 36, 38, 91-97, 224-226, 249-257, 278-282, 309-320, 354-359, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 2 para la numeración, a los residuos de aminoácidos 1-6, 37, 39, 92-98, 227-229, 252-260, 281-285, 312-323, 357-362, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 3 para la numeración, o a los residuos de aminoácidos 1-4, 36, 38, 91-97, 226-228, 251-259, 280-284, 311-322, 356-361, 363, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración; y
donde el compuesto parental presenta al menos un 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto al SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5.
2. En algunos modos de realización del método del párrafo 1, la mutación se da en un residuo de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácidos 92, 251, 254, 256, 317, 318, 320 o 321, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
3. En algunos modos de realización del método de cualquiera de los párrafos precedentes, la mutación consiste en la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a R251 o K256 con un residuo de aminoácido diferente, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
4. En algunos modos de realización del método de cualquiera de los párrafos 1-3 precedentes, la mutación consiste en la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 92 en el SEQ ID NO: 4 con L, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 251 en el SEQ ID NO: 4 con A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, Q, S, T o W, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 254 en el SEQ ID NO: 4 con H, K, W o Y, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 256 en el SEQ ID NO: 4 con A, E, T o V, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 317 en el SEQ ID NO: 4 con C o R, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 318 en el SEQ ID NO: 4 con A, F, H, K, Q o R, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 320 en el SEQ ID NO: 4 con A, H, M, N o P, o la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 321 en el SEQ ID NO: 4 con D, G, I o T.
5. En algunos modos de realización del método de cualquiera de los párrafos 1-3 precedentes, la mutación corresponde a S92L, R251A, R251C, R251D, R251E, R251F, R251G, R251H, R251L, R251M, R251N, R251Q, R251S, R251T o R251W, T254H, T254K, T254W o T254Y, K256A, K256E, K256T o K256V, S317C o S317R, N318A N318F, N318H, N318K, N318Q o N318R, T320A, T320H, T320M, T320N o T320P, y/o K321D, K321G, K321I o K321T, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
6. En algunos modos de realización del método de cualquiera de los párrafos precedentes, la variante además comprende residuos de aminoácidos naturales en una o más posiciones correspondientes a N88, A252, A253, N308, A316, S357, T400, R402 y D403, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
7. En algunos modos de realización del método de cualquiera de los párrafos precedentes, la variante además comprende residuos de aminoácidos naturales en una o más posiciones correspondientes a N4, G5, T38, N93, G94, I95, Q96, V97, Y230, G255, V315, P319, A322, L354, T355, R356, G359, Y396, A397, Y398, G399 y Q401 en el SEQ ID NO: 4, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
8. En algunos modos de realización del método de cualquiera de los párrafos precedentes, la variante además comprende N en la posición 88, A en la posición 252, A en la posición 253, N en la posición 308, A en la posición 316, S en la posición 357, T en la posición 400, R en la posición 402 o D en la posición 403, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración. 4.
9. En algunos modos de realización del método de cualquiera de los párrafos precedentes, la variante además comprende N en la posición 4, G en la posición 5, T en la posición 38, N en la posición 93, G en la posición 94, I en la posición 95, Q en la posición 96, V en la posición 97, Y en la posición 230, G en la posición 255, V en la posición 315, P en la posición 319, A en la posición 322, L en la posición 354, T en la posición 355, R en la posición 356, G en la posición 359, Y en la posición 396, A en la posición 397, Y en la posición 398, G en la posición 399 y Q en la posición 401, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
10. En algunos modos de realización del método de cualquiera de los párrafos precedentes, la unión relativa al almidón se determina por medio de ciclodextrina.
11. En algunos modos de realización del método de cualquiera de los párrafos precedentes, la variante presenta al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5.
12. En algunos modos de realización del método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el compuesto parental presenta al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5.
13. En algunos modos de realización del método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la variante presenta licuefacción de almidón, sacarificación de almidón o rendimiento de lavado mejorados en comparación con el compuesto parental.
14. En algunos modos de realización del método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la variante presenta actividad de hidrólisis aumentada en un sustrato de amilosa en comparación con el compuesto parental.
15. La presente divulgación también expone varias variantes de polipéptidos y composiciones como se trata en la presente memoria a continuación. No obstante, la invención se define mediante las reivindicaciones que acompañan.
16. En la presente memoria se describe una variante de polipéptido de a-amilasa producido mediante el método de los párrafos precedentes.
17. En la presente memoria también se describe una variante de un polipéptido de a-amilasa parental de familia 13, que comprende una mutación en el surco de unión de almidón; donde el surco de unión de almidón se forma mediante residuos de aminoácidos en la hélice a que precede a la primera cadena p en el dominio A, el bucle entre la sexta hélice a y la séptima cadena p en el dominio A, el bucle entre la séptima hélice a y la octava cadena p en el dominio A, y el bucle que conecta el dominio A y el dominio C; donde la mutación altera la unión de almidón a la variante de polipéptido de a-amilasa en comparación con el polipéptido de a-amilasa parental.
18. En la presente memoria se describe la variante de polipéptido de a-amilasa del párrafo 17, donde el surco de unión de almidón corresponde a los residuos de aminoácidos 1-6, 36, 38, 91-97, 224-226, 249-257, 278-282, 309-320, 354-359, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 2 para la numeración, a los residuos de aminoácidos 1-6, 37, 39, 92-98, 227-229, 252-260, 281-285, 312-323, 357-362, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 3 para la numeración, o a los residuos de aminoácidos 1-4, 36, 38, 91-97, 226-228, 251-259, 280­ 284, 311-322, 356-361, 363, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
19. En la presente memoria se describe la variante de polipéptido de a-amilasa de las reivindicaciones 17 o 18 precedentes, donde la mutación es un residuo de aminoácido que corresponde a los residuos de aminoácidos 92, 251, 254, 256, 317, 318, 320 o 321, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
20. En la presente memoria se describe la variante de polipéptido de a-amilasa de cualquiera de las reivindicaciones 17-19 precedentes, donde la mutación consiste en la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a R251 o K256 por un residuo de aminoácido diferente, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
21. En la presente memoria se describe la variante de polipéptido de a-amilasa de cualquiera de los párrafos 17­ 19 precedentes, donde la mutación consiste en la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 92 en el SEQ ID NO: 4 con L, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 251 en el SEQ ID NO: 4 con A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, Q, S, T o W, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 254 en el SEQ ID NO: 4 con H, K, W o Y, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 256 en el SEQ ID NO: 4 con A, E, T o V, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 317 en el SEQ ID NO: 4 con C o R, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 318 en el SEQ ID NO: 4 con A, F, H, K, Q o R, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 320 en el SEQ ID NO: 4 con A, H, M, N o P, o la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 321 en el SEQ ID NO: 4 con D, G, I o T.
22. En la presente memoria se describe la variante de polipéptido de a-amilasa de cualquiera de los párrafos 17­ 19 precedentes, donde la mutación corresponde a S92L, R251A, R251C, R251D, R251E, R251F, R251G, R251H, R251L, R251M, R251N, R251Q, R251S, R251T o R251W, T254H, T254K, T254W, o T254Y, K256A, K256E, K256T o K256V, S317C, o S317R, N318A N318F N318H, N318K, N318Q, o N318R, T320A, T320H, T320M, T320N o T320P, o K321D, K321G, K321I o K321T, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
23. En la presente memoria se describe la variante de polipéptido de a-amilasa de cualquiera de los párrafos 17­ 22 precedentes, donde la variante además comprende residuos de aminoácidos naturales en una o más posiciones que corresponden a N88, A252, A253, N308, A316, S357, T400, R402 y/o D403, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
24. En la presente memoria se describe la variante de polipéptido de a-amilasa de cualquiera de los párrafos 17­ 23 precedentes, donde la variante además comprende residuos de aminoácidos naturales en una o más posiciones que corresponden a N4, G5, T38, N93, G94, I95, Q96, V97, Y230, G255, V315, P319, A322, L354, T355, R356, G359, Y396, A397, Y398, G399, y/o Q401 en el SEQ ID NO: 4, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
25. En la presente memoria se describe la variante de polipéptido de a-amilasa de cualquiera de los párrafos 17­ 24 precedentes, donde la variante además comprende N en la posición 88, A en la posición 252, A en la posición 253, N en la posición 308, A en la posición 316, S en la posición 357, T en la posición 400, R en la posición 402 y/o D en la posición 403, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
26. En la presente memoria se describe la variante de polipéptido de a-amilasa de cualquiera de los párrafos 17­ 25 precedentes, donde la variante además comprende N en la posición 4, G en la posición 5, T en la posición 38, N en la posición 93, G en la posición 94, I en la posición 95, Q en la posición 96, V en la posición 97, Y en la posición 230, G en la posición 255, V en la posición 315, P en la posición 319, A en la posición 322, L en la posición 354, T en la posición 355, R en la posición 356, G en la posición 359, Y en la posición 396, A en la posición 397, Y en la posición 398, G en la posición 399, y/o Q en la posición 401, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
27. En la presente memoria se describe la variante de cualquiera de los párrafos 17-26 precedentes, donde la variante presenta al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5.
28. En la presente memoria se describe la variante de cualquiera de los párrafos 17-27 precedentes, donde el compuesto parental presenta al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5.
29. En la presente memoria se describe la variante de cualquiera de los párrafos 17-28 precedentes, donde la variante presenta licuefacción de almidón, sacarificación de almidón o rendimiento de lavado mejorados en comparación con el compuesto parental.
30. En la presente memoria se describe la variante de cualquiera de los párrafos 17-29 precedentes, donde la variante presenta actividad de hidrólisis aumentada en un sustrato de amilosa en comparación con el compuesto parental.
31. En la presente memoria se describe una composición que comprende la variante de polipéptido de a-amilasa de cualquiera de los párrafos 17-30 precedentes, y al menos un agente de formulación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0006]
La figura 1 es un modelo de cinta de amilasa modificada derivada de Pyrococcus woesei, que muestra la ubicación de una ciclodextrina unida.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos y la ubicación de los rasgos de la estructura secundaria en la amilasa modificada de P. woesei.
La figura 3 es un alineamiento de varias a-amilasas de familia 13 [a-amilasa de Geobacillus (anteriormente Bacillus) stearothermophilus, a-amilasa de Bacillus licheniformis (LAT) a-amilasa, y a-amilasa de Cytophaga sp. (AAF00561.1, GI# 6006681)] realizado por medio de Clustal W con parámetros por defecto.
La figura 4 es una estructura de varillas de amilasa de B. stearothermophilis (AmyS) que muestra los residuos del surco en el lateral izquierdo de la molécula resaltados como varillas en negrita. La región de unión de sustrato (esto es, la hendidura del centro activo) se encuentra en el lateral derecho de la molécula.
La figura 5 es una estructura de varillas de amilasa de B. stearothermophilis (AmyS) orientada al surco, con los residuos que forman el surco resaltados como varillas en negrita.
La figura 6 es un histograma que muestra la distribución del PI para valores de actividad de todas las variantes de la SEL que presentan un PI para la expresión >0.3.
La figura 7 es un histograma que muestra la distribución del PI para los valores de actividad de las variantes de SEL que tan solo presentan sustituciones en las posiciones del surco y que tienen un PI para la expresión >0.3. Las figuras 8A y 8B consisten en una tabla que muestra los resultados del cribado de las variantes individuales obtenidas de la biblioteca SEL por medio de un sustrato de amilosa.
Las figuras 9A y 9B consisten en una tabla que muestra los resultados del cribado de las variantes individuales obtenidas de la biblioteca SEL por medio de un sustrato de amilopectina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
[0007]
SEQ ID NO: 1 establece la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la amilasa de Pyrococcus woesei. SEQ ID NO: 2 establece la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la a-amilasa de Bacillus licheniformis (LAT) a-amilasa.
SEQ ID NO: 3 establece la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la a-amilasa de Geobacillus (anteriormente Bacillus) stearothermophilus.
SEQ ID NO: 4 establece la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la a-amilasa de Cytophaga sp. (AAF00561.1, GI# 6006681).
SEQ ID NO: 5 establece la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la variante de amilasa de P. woesei, uPWA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
1. Introducción
[0008] Los presentes métodos se refieren a la variante de polipéptidos de a-amilasa que comprende mutaciones en un surco de unión de almidón descubierto recientemente que se sitúa en el lateral opuesto de la molécula con respecto al sitio de unión del sustrato. Las mutaciones en el surco de unión de almidón alteran la unión de la variante de polipéptidos de a-amilasa a los haces de almidón, de manera que alteran el rendimiento de las moléculas en términos de, p. ej., actividad, estabilidad térmica, estabilidad del pH, estabilidad del detergente, dependencia del calcio y similares.
[0009] A continuación, se describen detalladamente estos y otros aspectos de los métodos.
2. Definiciones y abreviaturas
[0010] De conformidad con esta descripción detallada, se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Nótese que las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. En consecuencia, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de dichas enzimas, y la referencia a "la dosis" incluye la referencia a una o más dosis y a equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, etc.
[0011] El presente documento se organiza en varias secciones para facilitar su lectura; sin embargo, el lector apreciará que las afirmaciones realizadas en una sección pueden ser aplicables a otras secciones. De esta forma, los encabezamientos utilizados para las distintas secciones de la exposición no deberían interpretarse como limitativos.
[0012] A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia. Por motivos de claridad, se definen los siguientes términos y/o abreviaturas a continuación:
2.1 Acrónimos/abreviaturas
[0013] Los siguientes acrónimos/abreviaturas tienen los siguientes significados a no ser que se especifique lo contrario:
ADNc ADN complementario
ADN ácido desoxirribonucleico
EC Comisión de Enzimas
EDTA ácido etilendiaminotetraacético
GA glucoamilasa
IPTG isopropil p-D-1-tiogalactósido
kDa kilodalton
LAT amilasa de B. licheniformis
PM peso molecular
MWU unidad Wohlgemuth modificada; 1.6 x 10-5 mg/MWU = unidad de actividad
NOBS nonanoiloxibencenosulfonato
NTA ácido nitriloacético
PEG polietilenglicol
pI punto isoeléctrico
PVA poli(alcohol vinílico)
PVP poli(vinilpirrolidona)
ARN ácido ribonucleico
SAS alcano sulfonato
SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio
sp. especie
p/v peso/volumen
p/p peso/peso
v/v volumen/volumen
% en peso porcentaje en peso
°C grados centígrados
H2O agua
dH2O o DI agua desionizada
dIH2O agua desionizada, filtración Milli-Q
g o gm gramos
pg microgramos
mg miligramos
kg kilogramos
pL y pi microlitros
mL y mi mililitros
mm milímetros
A ángstrom
pm micrómetro
M molar
mM milimolar
pM micromolar
U unidades
s segundos
min minuto/minutos
h hora/horas
Ncm Newton centímetro
ETOH etanol
eq. equivalentes
N normal
ds o DS contenido de materia seca
uPWA variante de a-amilasa derivada de Pyrococcus woesei
PWA a-amilasa de Pyrococcus woesei
MWCO límite de peso molecular
SSRL Fuente de luz de radiación sincrotrón de Stanford
PDB Base de datos de proteínas
CAZy Base de datos de enzimas activas en carbohidratos
Tris-HCl tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato
HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico
2.2 Definiciones
[0014] Los términos «amilasa» o «enzima amilolítica» se refieren a una enzima que, entre otras cosas, es capaz de catalizar la degradación de almidón. Las a-amilasas son hidrolasas que escinden los enlaces a-D -(1^4) O-glucosídicos en almidón. Por lo general, las a-amilasas (EC 3.2.1.1; glucanohidrolasa a-D-(1^4)-glucano) se definen como enzimas endoactivas que escinden enlaces a-D-(1^4) O-glucosídicos en la molécula de almidón de manera aleatoria produciendo polisacáridos que contienen tres o más unidades de D-glucosa con enlaces (1-4)-a. En cambio, las enzimas amilolíticas exoactivas, como p-amilasas (EC 3.2.1.2; maltohidrolasa a-D-(1^4)-glucano) y algunas amilasas específicas del producto, como a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133), escinden la molécula de polisacárido desde el extremo no reductor del sustrato. Las p-amilasas, a-glucosidasas (EC 3.2.1.20; glucohidrolasa a-D-glucósido), glucoamilasa (EC 3.2.1.3; gluchohidrolasa a-D-(1^4)-glucano) y amilasas específicas del producto, como las maltotetraosidasas (EC 3.2.1.60) y las maltohexaosidasas (EC 3.2.1.98) pueden producir maltooligosacáridos de una longitud concreta. Algunas a-amilasas bacterianas producen principalmente maltotetrosa (G4), maltopentosa (G5) o maltohexosa (G6) a partir de almidón y a-1,4-glucanos relacionados, mientras que la mayoría de las a-amilasas también las transforman a glucosa y maltosa como productos finales. A efectos de los presentes métodos y composiciones, no se hace distinción entre las a-amilasas verdaderas, que actúan en el interior, y las G4, G5, G6, y amilasas similares.
[0015] La expresión «amilasa tipo familia 13» se refiere a cualquier amilasa clasificada como una amilasa de CAZy de familia 13, que presenta al menos un 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los SEQ ID NO: 1-5, y/o hasta aquí descrita como «tipo Termamyl». La expresión «amilasa de familia 13» se refiere a cualquier amilasa clasificada como una amilasa de CAZy de familia 13.
[0016] La expresión «amilasa que tiene el pliegue de amilasa de Bacillus sp.» se refiere a cualquier amilasa que tiene una estructura esencialmente superponible con los SEQ ID NO: 2 o 3.
[0017] La expresión «tipo Termamyl» es tal como se usa en varias solicitudes de patentes y patentes publicadas.
[0018] Tal como se utiliza en la presente memoria, «almidón» se refiere a cualquier material formado por los carbohidratos de polisacáridos complejos de plantas, formado por amilosa y amilopectina con la fórmula (C6H1oO5)x, donde X puede ser cualquier número. El término incluye materiales vegetales tales como granos, pastos, tubérculos y raíces, y, más concretamente, materiales obtenidos a partir de trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, salvado, mandioca, mijo, patata, boniato y tapioca.
[0019] El término «haz de almidón» se refiere a una forma de almidón en que se disponen polímeros de almidón individuales, p. ej., mediante gelatinización seguida de retrogradación, de manera que son resistentes a la hidrólisis enzimática de las enzimas de a-amilasa. En algunos casos, los polímeros en haces de almidón son paralelos (esto es, están alineados), lo que impide el acceso de las enzimas.
[0020] El término «amilosa» se refiere a un sustrato de almidón no ramificado que consiste en residuos de glucosa en enlaces a-1,4.
[0021] El término «amilopectina» se refiere a un sustrato de almidón ramificado que consiste en enlaces a-1,6 y enlaces a-1,4.
[0022] Los términos «natural», «parental» o «de referencia», con respecto a un polipéptido, se refieren a un polipéptido de origen natural que no incluye una sustitución, inserción o deleción sintética en una o más posiciones de aminoácidos. De forma similar, los términos «natural», «parental» o «de referencia», con respecto a un polinucleótido, se refieren a un polinucleótido de origen natural que no incluye un cambio de nucleósidos sintético. No obstante, nótese que un polinucleótido que codifica un polipéptido natural, parental o de referencia no está limitado a un polinucleótido de origen natural, y abarca cualquier polinucleótido que codifique el polipéptido natural, parental o de referencia. Se pueden llevar a cabo sustituciones, inserciones o deleciones mediante «transposición».
[0023] La expresión «uno/a o varios/as» significa menos de 10.
[0024] El término «variante», con respecto a un polipéptido, se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido natural, parental o de referencia especificado en cuanto a que este incluye una sustitución, inserción o deleción sintética en una o más posiciones de aminoácidos. Del mismo modo, el término «variante», con respecto a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que difiere en cuanto a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido natural, parental o de referencia especificado. La identidad del polipéptido o polinucleótido natural, parental o de referencia resultará evidente a partir del contexto. Se pueden producir variantes mediante «transposición».
[0025] El término «recombinante», cuando se utiliza con referencia a una célula, ácido nucleico, proteína, o vector objeto, indica que el sujeto se ha modificado por la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogos o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativos, o que la célula se deriva de una célula modificada de dicha forma. En consecuencia, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos a distintos niveles o en condiciones distintas de las que se hallan en la naturaleza.
[0026] Los términos «recuperado/a(s)», «aislado/a(s)» y «separado/a(s)» se refieren a un compuesto, proteína (polipéptidos), célula, ácido nucleico, aminoácido u otro material o componente especificado que se elimina de al menos otro material o componente al que se asocia de forma natural como se puede encontrar en la naturaleza.
[0027] Tal como se utiliza en la presente memoria, el término «purificado/a(s)» se refiere al material (p. ej., un polipéptido o polinucleótido aislado) que se encuentra en un estado relativamente puro, p. ej., al menos aprox. un 90 % puro, al menos aprox. un 95 % puro, al menos aprox. un 98 % puro o incluso al menos aprox. un 99 % puro.
[0028] El término «estabilidad mejorada» o «estabilidad aumentada» en el contexto de un ambiente oxidante, la presencia de quelantes, la presencia de detergentes, la exposición a temperaturas elevadas y/o la exposición a pH extremos, significa que una amilasa sujeto retiene más actividad amilolítica en el tiempo en comparación con otra amilasa (esto es, de referencia).
[0029] Los términos «termoestable(s)» y «termoestabilidad», en lo relativo a una enzima, se refieren a la capacidad de la enzima para retener actividad tras la exposición a una temperatura elevada. La termoestabilidad de una enzima, tal como una enzima amilasa, se mide por medio de su semivida (ti/2) dada en minutos, horas o días, durante la cual la mitad de la actividad enzimática se pierde en condiciones definidas. La semivida se puede calcular midiendo la actividad de la a-amilasa residual tras la exposición (es decir, tras hacer frente) a una temperatura elevada.
[0030] Un «intervalo de pH», en lo relativo a una enzima, se refiere al intervalo de valores de pH en los que la enzima muestra actividad catalítica.
[0031] Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos «pH estable» y «estabilidad de pH», en lo relativo a una enzima, están relacionados con la capacidad de la enzima para retener actividad en un intervalo amplio de valores de pH para un período de tiempo predeterminado (p. ej., 15 min, 3o min, 1 h).
[0032] Tal como se utiliza en la presente memoria, el término «secuencia de aminoácidos» es sinónimo de los términos «polipéptido», «proteína» y «péptido», y se utilizan indistintamente. En los casos en los que dichas secuencias de aminoácidos muestran actividad, se puede hacer referencia a estas como una «enzima». Se emplean los códigos convencionales de una letra o de tres letras para los residuos de aminoácidos, estando presentes las secuencias de aminoácidos en la orientación habitual amino-carboxi terminal (esto es, N^-C).
[0033] El término «ácido nucleico» abarca ADN, ARN, heteroduplexos y moléculas sintéticas capaces de codificar un polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, y pueden ser modificaciones químicas. Los términos «ácido nucleico» y «polinucleótido» se utilizan indistintamente. Dado que el código genético está degenerado, se puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido concreto, y los presentes métodos y composiciones abarcan secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos concreta. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de ácido nucleico se presentan en orientación 5' a 3'.
[0034] El término «homólogo» se refiere a una entidad que tenga un grado especificado de identidad con las secuencias de aminoácidos sujeto y las secuencias de nucleótidos sujeto. Se toma una secuencia homóloga para incluir una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % idéntica a la secuencia sujeto, por medio de Clustal W (Thompson J.D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) con parámetros por defecto, esto es;
Penalización por apertura de hueco: 10.0
Penalización por extensión de hueco: 0.05
Matriz de peso de proteína: BLOSUM series
Matriz de peso de ADN: IUB
% de retraso de secuencias divergentes: 40
Distancia de separación de hueco: 8
Peso de transiciones de ADN: 0.50
Listar residuos hidrofílicos: GPSNDQEKR
Usar matriz negativa: OFF
Alternar penalizaciones específicas por residuos: ON
Alternar penalizaciones hidrofílicas: ON
Alternar penalización por separación de extremo de hueco OFF
[0035] El término «hibridación» se refiere al proceso mediante el que una cadena de la base del ácido nucleico se empareja con una cadena complementaria, como sucede durante las técnicas de hibridación por transferencia (blot) y las técnicas de PCR. Como ejemplo de condiciones rigurosas de hibridación, se pueden mencionar las siguientes: 65 °C y 0.1X SSC (donde IX SSC = 0.15 M de NaCl, 0.015 M de citrato de Naa, pH 7.0).
[0036] El término «sacarificación» se refiere a la conversión enzimática del almidón en glucosa.
[0037] El término «licuefacción» se refiere a la fase de conversión del almidón en que el almidón gelatinizado se hidroliza para dar dextrinas solubles de bajo peso molecular. El término «grado de polimerización» (DP) se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido determinado. Ejemplos de DP1 son los monosacáridos glucosa y fructosa. Ejemplos de DP2 son los disacáridos maltosa y sacarosa. A efectos de la presente memoria, los «procesos de licuefacción comparables» son los llevados a cabo en condiciones comparables, preferiblemente condiciones normalizadas para temperatura, pH, concentración del sustrato, concentración de iones de calcio y similares. Preferiblemente, los procesos de licuefacción se comparan en base a las proteínas iguales o unidades de actividad iguales, sin embargo, en algunos modos de realización, o bien proteínas o unidades de actividad, o ambas pueden variar en procesos de licuefacción comparables. El experto en la materia comprenderá las bases en que los procesos de licuefacción pueden ser «comparables».
[0038] Durante los procesos de licuefacción, la viscosidad de una suspensión de almidón se suele utilizar como una medida de la transformación del almidón en unidades DP más pequeñas. En algunos casos se utiliza la expresión «viscosidad inicial» en la presente memoria. El experto en la materia tendrá en cuenta que este término pertenece a la materia, y que lo que se pretende no es la viscosidad inicial textualmente, sino la viscosidad pico cuando se da, por ejemplo, en torno al punto de gelatinización del sustrato. La viscosidad inicial se utiliza para distinguirla de la «viscosidad final» que es la viscosidad de un sustrato, p. ej., suspensión de almidón al final de un proceso de licuefacción. En consecuencia, como es evidente gracias a un vistazo a un gráfico de la viscosidad a lo largo del transcurso del tiempo, la viscosidad pico o inicial no ocurre inmediatamente, sino después de un cierto tiempo, p. ej., menos del 50 % del tiempo total, y más preferiblemente dentro de aprox. el primer 1/3 o incluso 1/4 o 1/5 del tiempo total de licuefacción. Por ejemplo, en una licuefacción de ejemplo de la presente memoria, la viscosidad pico suele tener lugar durante los primeros diez minutos, después de este tiempo, se añade la enzima y la viscosidad empieza a caer. A medida que los gránulos de almidón se hinchan durante el proceso de gelatinización, el interior de los gránulos se vuelve más accesible a la actividad amilásica y se produce más escisión, lo que resulta en una caída en la viscosidad.
[0039] El término «contenido de materia seca» (ds) se refiere a la cantidad total de sólidos de una suspensión expresados en base al peso seco. El contenido de materia seca y la base de peso seco se suelen expresar como el peso del material sujeto como un porcentaje del peso total de la materia seca. El término «suspensión» se refiere a una mezcla que contiene sólidos insolubles en un líquido, normalmente agua o un disolvente similar. Se suelen suspender almidón u harina en una solución con base acuosa para formar una suspensión para pruebas con amilasas o procesos de licuefacción.
[0040] El término «DE» o «dextrosa equivalente» se define como el porcentaje de azúcar reductor como una fracción del carbohidrato total. El término «DP» o «grado de polimerización» se refiere al tamaño de los productos de degradación de amilasa del almidón. A mayor DP, más complejo es el carbohidrato.
[0041] El término «mezcla» o «mezcla de enzimas» se refiere a una composición que comprende una mezcla de dos o más enzimas que por lo tanto proporcionan una actividad catalítica combinada que implica la actividad de cada una de las enzimas presentes en la mezcla. Las mezclas de enzimas no necesitan cantidades iguales de cada una de las dos o más enzimas, pero las mezclas de enzimas se pueden formular sobre una proteína igual o una base de actividad igual, si se desea. La actividad catalítica combinada puede ser meramente aditiva o promediada, o puede ser antagónica o sinérgica. Las mezclas preferidas para uso en la presente memoria proporcionan al menos actividad catalítica aditiva, y más preferiblemente, efectos catalíticos sinérgicos.
[0042] A efectos de la presente memoria, un «proceso de licuefacción comparable» significa un proceso similar llevado a cabo en unas condiciones específicas y controladas, (p. ej., con respecto a la temperatura, el pH, la concentración de iones de calcio y la concentración del sustrato) por medio de una amilasa diferente o de «control», y que se puede comparar con un proceso de licuefacción sujeto.
[0043] Tal como se usa en la presente memoria, una «unidad de alfa amilasa (AAU)» es la cantidad de actividad bacteriana de alfa amilasa necesaria para hidrolizar 10 mg de almidón por minuto en las condiciones especificadas.
[0044] Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos «transformada(s)», «transformada(s) de forma estable» y «transgénica(s)», utilizados en referencia a una célula significan que la célula contiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (p. ej., heteróloga) integrada en su genoma o portada como un episoma que se mantiene a través de múltiples generaciones.
[0045] El término «introducido/a(s)» en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula significa «transfección», «transformación» o «transducción», como se conoce en la materia.
[0046] Una «cepa huésped» o «célula huésped» es un organismo en el que se ha introducido un vector de expresión, fago, virus, u otro constructo de ADN, incluyendo un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés (p. ej., una amilasa). Un ejemplo de cepas huésped son las células bacterianas. El término «cepa huésped» incluye protoplastos creados a partir de células, como las de una Bacillus sp.
[0047] El término «heterólogo/a(s)», en referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que no está presente de forma natural en una célula huésped.
[0048] El término «endógeno/a(s)», en referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que está presente de forma natural en la célula huésped.
[0049] Tal como se utiliza en la presente memoria, el término «expresión» se refiere al proceso por el cual se produce un polipéptido en función de una secuencia de ácido nucleico. El proceso incluye tanto transcripción como traducción.
[0050] Un «marcador selectivo» o «marcador de selección» se refiere a un gen capaz de expresarse en un huésped para facilitar la selección de células huésped portadoras del gen. Entre los ejemplos de marcadores de selección se incluyen, sin carácter limitativo, sustancias antimicrobianas (p. ej., higromicina, bleomicina o cloranfenicol) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, como una ventaja nutricional, en la célula huésped.
[0051] Un «vector» se refiere a una secuencia de polinucleótidos diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, partículas de fago, casetes y similares.
[0052] Un «vector de expresión» se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés, cuya secuencia de codificación está ligada de forma operativa a una secuencia control adecuada capaz de efectuar la expresión del ADN en un huésped adecuado. Dichas secuencias control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifique sitios de unión del ribosoma adecuados en el ARNm, potenciadores y secuencias que controlen la terminación de la transcripción y la traducción.
[0053] El término «ligado/a(s) de forma operativa» significa que los componentes especificados se encuentran relacionados (incluyendo, sin carácter limitativo, la yuxtaposición), permitiéndoles funcionar de una forma prevista. Por ejemplo, una secuencia reguladora está ligada de forma operativa a una secuencia de codificación si la expresión de la secuencia de codificación está controlada por las secuencias reguladoras.
[0054] Una «secuencia señal» es una secuencia de aminoácidos adjunta a la porción del extremo N-terminal de una proteína, que facilita la secreción de la proteína fuera de la célula. La forma madura de la proteína extracelular carece de la secuencia de señal, que se escinde durante el proceso de secreción.
[0055] Tal como se utiliza en la presente memoria, «biológicamente activo/a(s)» se refiere a una secuencia que presenta una actividad biológica específica, como una actividad enzimática.
[0056] Tal como se utiliza en la presente memoria, «un material celular cultivado que comprende un polipéptido de aamilasa» u otras expresiones similares, se refieren a un lisado o sobrenadante celular (incluyendo medios) que incluye un polipéptido de a-amilasa como componente. El material celular puede ser de un huésped heterólogo que prolifera en cultivo con el fin de producir la amilasa.
3. Identificación de un nuevo sitio de unión del almidón en una a-amilasa
[0057] Con respecto a los ejemplos adjuntos, la estructura tridimensional de una variante de a-amilasa modificada del arquea hipertermófila, Pyrococcus woesei, se determinó a una resolución de 2 A (figuras 1 y 2). Se encontró una molécula de ciclodextrina asociada con la enzima en los cristales (figura 1) de forma inesperada. La ciclodextrina no formaba parte del medio de cristalización, lo que sugiere que la ciclodextrina estaba unida a la molécula durante la expresión o purificación y que permaneció junto con la molécula durante la cristalización. La molécula de ciclodextrina no se asoció con el sitio de unión del sustrato. En cambio, se unió en un surco situado en el lateral opuesto de la molécula según el sitio de unión del sustrato.
[0058] Especialmente, varias mutaciones en la variante de a-amilasa de P. woesei (esto es, D358Y, S359G, R360D, R361K y P372S) se sitúan cerca de la unión de ciclodextrina, lo que sugiere que las mutaciones en estas posiciones modulan la unión. Los residuos adyacentes dentro de 5 A de uno o más átomos de la unión de ciclodextrina que se esperaría para modular esta unión incluyen Gln7, Lys8, Gly9, Lys241, Pro278, Phe279, Glu307, Gly308, Gln309, Gly338, Gly339, Ser340, Arg355 y Tyr358. Los residuos adicionales que forman el surco de unión de almidón incluyen residuos Ser4, Glu5, Tyr236, Gln268, Ser275, Arg276, Asp277, Lys280, Tyr306, Glu334, Thr341, Asp342, Ile343, Asn 356, Asp360 y Lys361.
4. Variante de a-amilasas con mutaciones en el surco de unión de almidón
[0059] Sin verse limitadas por una teoría en concreto, las presentes composiciones y métodos se basan en hipótesis de que, en la estructura tridimensional descrita anteriormente, la ciclodextrina imita un haz helicoidal de almidón, al que conviene que la a-amilasa se una. La presencia de la región de unión de almidón permite que la amilasa se asocie con un haz de almidón, y quizá incluso deslizarse a lo largo del haz de almidón, en ubicaciones alteradas, donde la enzima pueda hidrolizar cadenas de almidón, que se unen en el sitio de unión del sustrato canónico. La capacidad de deslizarse a regiones que favorecen la hidrólisis reduciría la libertad difusional de difusión tridimensional en la solución de una difusión unidimensional a lo largo de las moléculas de almidón. Esto mejoraría la procesividad de la molécula para hidrolizar almidón como demostraría la hidrólisis de almidón mejorada. La unión del almidón por medio del surco puede incluso fomentar la ruptura de un haz de almidón, lo que por consiguiente aumenta la hidrólisis. Además, la unión del almidón por medio del surco puede conferir estabilidad a la a-amilasa, como se puede demostrar, p. ej., mediante la estabilidad térmica aumentada, estabilidad del pH aumentada, estabilidad del detergente aumentada, dependencia del calcio reducida y similares.
[0060] Las estructuras tridimensionales de las amilasas de familia 13 de la base de datos de enzimas activas de carbohidratos (CAZy) están altamente conservadas, constando de tres dominios (véase, p. ej., Henrissat, B. (1991) Biochem. J. 280:309-316; Henrissat, B. and Bairoch, A. (1996) Biochem. J. 316:695-696; Henrissat, B. and Davies, G.
(1997) Curr. Opin. Biotech. 7:637-644; Nagano, N. et al. (2001) Protein Eng. 14:845-855; Pujadas, G. and Palau, J. (2001) Mol. Biol. Evol. 18:38-54; documento WO 94/02597). Con respecto a la figura 2, el dominio A es una estructura de barril TIM en el extremo N-terminal del polipéptido. El dominio B es una región de bucle grande entre la tercera cadena p (Pa3) y la tercera hélice a (aAs) en el dominio A. El dominio C incluye el extremo C-terminal del polipéptido. Las amilasas de Bacillus licheniformis (AmyL), Bacillus stearothermophilus (AmyS) y Cytophaga sp. son parte de esta familia. Se muestra un alineamiento de estas amilasas en la figura 3. Se ejemplifican las estructuras de estas amilasas mediante entradas 1hxv y 1bli, respectivamente, en la base de datos de proteínas, que muestran rasgos de surcos incluso más pronunciados situados en las regiones correspondientes de estas moléculas.
[0061] En cada una de estas enzimas, hay aprox. 44 residuos homólogos que forman el surco de unión de almidón. Estos residuos se encuentran en la hélice a corta que precede a la primera cadena p en el dominio A, el bucle entre la sexta hélice a y la séptima cadena p en el dominio A, el bucle entre la séptima hélice a y la octava cadena p en el dominio A, y el bucle conecta el dominio A y el dominio C. En una variante de amilasa de P. woesei, estos residuos se corresponden con residuos Gln7, Lys8, Gly9, Lys241, Pro278, Phe279, Glu307, Gly308, Gln309, Gly338, Gly339, Ser340, Arg355 y Tyr358. Los residuos adicionales que forman el surco de unión de almidón incluyen residuos Ser4, Glu5, Tyr236, Gln268, Ser275, Arg276, Asp277, Lys280, Tyr306, Glu334, Thr341, Asp342, Ile343, Asn 356, Asp360 y Lys361 (con respecto al SEQ ID NO: 5 para la numeración). En la amilasa de B. licheniformis, estos residuos corresponden a residuos 1-6, 36, 38, 91-97, 224-226, 249-257, 278-282, 309-320, 354-359, 391, y 395-402 (con respecto al SEQ ID NO: 2 para la numeración). En la amilasa de B. stearothermophilus, estos residuos corresponden a residuos 1-6, 37, 39, 92-98, 227-229, 252-260, 281-285, 312-323, 357-362, 391, y 395-402 (con respecto al SEQ ID NO: 3 para la numeración). En la amilasa de Cytophaga sp., estos residuos corresponden a residuos 1-4, 36, 38, 91-97, 226-228, 251-259, 280-284, 311-322, 356­ 361, 363, 391, y 395-402 (con respecto al SEQ ID NO: 4).
[0062] En algunos modos de realización, las presentes variantes presentan una o más sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 92, 251, 254, 256, 317, 318, 320 y 321 en el SEQ ID NO: 4. En algunos modos de realización, las variantes incluyen la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a R251 y/o K256 en el SEQ ID NO: 4 con residuos aminoácidos menos positivos. En algunos modos de realización, las presentes variantes incluyen sustituciones del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 92 en el SEQ ID NO: 4 con L, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 251 en el SEQ ID NO: 4 con A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, Q, S, T o W, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 254 en el SEQ ID NO: 4 con H, K, W o Y, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 256 en el SEQ ID NO: 4 con A, E, T o V, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 317 en el SEQ ID NO: 4 con C o R, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 318 en el SEQ ID NO: 4 con A, F, H, K, Q o R, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 320 en el SEQ ID NO: 4 con A, H, M, N o P, y/o la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 321 en el SEQ ID NO: 4 con D, G, I o T.
[0063] En algunos modos de realización, las presentes variantes incluyen las sustituciones concretas correspondientes a S92L, R251A, R251C, R251D, R251E, R251F, R251G, R251H, R251L, R251M, R251N, R251Q, R251S, R251T o R251W, T254H, T254K, T254W o T254Y, K256A, K256E, K256T o K256V, S317C o S317R, N318A, N318F, N318H, N318K, N318Q o N318R, T320A, T320H, T320M, T320N o T320P, y/o K321D, K321G, K321I o K321T, todas con respecto al SEQ ID NO: 4.
[0064] En algunos modos de realización, las presentes variantes no incluyen sustituciones de los residuos de aminoácidos naturales en una o más posiciones correspondientes a N88, A252, A253, N308, A316, S357, T400, R402 y D403 en el SEQ ID NO: 4. En algunos modos de realización, las presentes variantes no incluyen sustituciones de los residuos de aminoácidos naturales en una o más posiciones correspondientes a N4, G5, T38, N93, G94, I95, Q96, V97, Y230, G255, V315, P319, A322, L354, T355, R356, G359, Y396, A397, Y398, G399 y Q401 en el SEQ ID NO: 4.
[0065] En algunos modos de realización, las presentes variantes incluyen uno o más de los siguientes residuos en las siguientes posiciones correspondientes a SEQ ID NO: 4: N en la posición 88, A en la posición 252, A en la posición 253, N en la posición 308, A en la posición 316, S en la posición 357, T en la posición 400, R en la posición 402 y D en la posición 403 en el SEQ ID NO: 4. En algunos modos de realización, las presentes variantes incluyen todos los residuos anteriormente mencionados en las posiciones indicadas. En algunos modos de realización, las presentes variantes incluyen uno o más de los siguientes residuos en las siguientes posiciones correspondientes al SEQ ID NO: 4: N en la posición 4, G en la posición 5, T en la posición 38, N en la posición 93, G en la posición 94, I en la posición 95, Q en la posición 96, V en la posición 97, Y en la posición 230, G en la posición 255, V en la posición 315, P en la posición 319, A en la posición 322, L en la posición 354, T en la posición 355, R en la posición 356, G en la posición 359, Y en la posición 396, A en la posición 397, Y en la posición 398, G en la posición 399, y Q en la posición 401 en el SEQ ID n O: 4. En algunos modos de realización, las presentes variantes incluyen todos los residuos anteriormente mencionados en las posiciones indicadas.
[0066] Se pueden determinar posiciones correspondientes en otras amilasas mediante el alineamiento de la secuencia de aminoácidos. Las figuras 4 y 5 ilustran la ubicación del surco en la amilasa de B. stearothermophilus. Se pueden determinar residuos homólogos en otras amilasas mediante el alineamiento estructural o mediante el alineamiento de la estructura primaria, tal como se ilustra en la figura 6.
Variante de amilasa de P. woesei, uPWA (SEQ ID NO: 5)
AKYSELEKGG VIMQAFYWDV PSGGIWWDTI RQKIPEWYDA G IS A IW IP P A
SKGMGGAYSM GYDPYDFFDL GEYDQKGTVE TRFGSKQELV NMINTAHAYG
MKVIADIVIN HRAGGDLEWN PFVNDYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE
LHAGDSGTFG GYPDICHDKS WDQYWLWASQ ESYAAYLRSI GIDAWRFDYV
KGYAPWVVKD WLNWWGGWAV GEYWDTNVDA VLNWAYSSGA KVFDFALYYK
MDEAFDNKNI PALVSALQNG QTVVSRDPFK AVTFVANHDT DIIWNKYPAY
AFILTYEGQP TIFYRDYEEW LNKDKLKNLI W1HENLAGGS TDIVYYDNDE
LIFVRNGYGD K PG LITY IN L GSSKAGRWVY VPKFAGAC1H EYTGNLGGWV
DKYVYSSGWV YLEAPAYDPA NGQYGYSVWS YCGVG
A-amilasa de Bacillus licheniformis (LAT; SEQ ID NO: 2):
ANLNGTLMQY FEWYMPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS
QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD
VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEHLIKAWTH FHFPGRGSTY
SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSNEN GNYDYLMYAD
IDYDHPDVAA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE
KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG
GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF
ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL K H KIEPILK A RKQYAYGAQH
DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH
DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR
Amilasa de Geobacillus (anteriormente Bacillus) stearothermophilus (SEQ ID NO: 3):
AAPFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSSLGITA LWLPPAYKGT
SRSDVGYGVY DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA
DVVFDHKGGA DGTEWVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAWT KFDFPGRGNT
YSSFKWRWYH FDGVDWDESR KLSRIYKFRG IGKAWDWEVD TENGNYDYLM
YADLDMDHPE VVTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK FSFFPDWLSY
VRSQTGKPLF TVGEYWSYDI NKLHNYITKT DGTMSLFDAP LHNKFYTASK
SGGAFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPWFKPLA
YAFILTRQEG YPCVFYGDYY G IP Q Y N IP S L K S K ID P L L IA RRDYAYGTQH
DYLDHSDIIG WTREGGTEKP GSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFY
DLTGNRSDTV TINSDGWGEF KVNGGSVSVW VPR
A-amilasa de Cytophaga sp. (AAF00567.1, GI# 6006681; SEQ ID NO: 4):
AATNGTMMQY FEWYVPNDGQ QWNRLRTDAP YLSSVGITAV WTPPAYKGTS
QADVGYGPYD LYDLGEFNQK GTVRTKYGTK GELKSAVNTL HSNGIQVYGD
VVMNHKAGAD YTENVTAVEV NPSNRNQETS GEYNIQAWTG FNFPGRGTTY
SNFKWQWFHF DGTDWDQSRS LSR IFK FR GT GKAWDWEVSS ENGNYDYLMY
ADIDYDHPDV VNEMKKWGVW YANEVGLDGY RLDAVKHIKF SFLKDWVDNA
RAATGKEMFT VGEYWQNDLG ALNNYLAKVN YNQSLFDAPL HYNFYAASTG
GGYYDMRNIL NNTLVASNPT KAVTLVENHD TQPGQSLEST VQPWFKPLAY
AFILTRSGGY PSVFYGDMYG TKGTTTREIP A LKSK IEPLL KARKDYAYGT
QRDYIDNPDV IGWTREGDST KAKSGLATVI TDGPGGSKRM YVGTSNAGEI
WYDLTGNRTD KITIGSDGYA TFPVNGGSVS VWVQQ
[0067] De acuerdo con la presente invención, uno o más de los residuos de los diseños de estructura secundaria anteriormente mencionados, o uno o más de los residuos de aminoácidos anteriormente mencionados, o los residuos correspondientes en otra a-amilasa de tipo familia 13, mutan debido al efecto derivado de alterar la interacción entre el surco de unión de almidón y los haces de almidón. En algunos modos de realización, muta un único residuo. En otros modos de realización, mutan 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 o incluso 44 residuos. En algunos modos de realización, uno o más residuos en los diseños de estructura secundaria anteriormente mencionados, o uno o más de los residuos de aminoácidos anteriormente mencionados, o los residuos correspondientes de otra a-amilasa de tipo familia 13 no han mutado expresamente, mientras que uno o más residuos han mutado. En algunos modos de realización, uno o varios de los residuos en los diseños de estructura secundaria anteriormente mencionados, o uno o varios de los residuos de aminoácidos anteriormente mencionados, o los residuos correspondientes de otra a-amilasa de tipo familia 13 no han mutado expresamente, mientras que uno o varios residuos han mutado.
[0068] En algunos modos de realización, las mutaciones son sustituciones del/de los residuo(s) de aminoácido presente(s) en la amilasa parental por residuo(s) de aminoácido diferente(s). En algunos modos de realización, las mutaciones son deleciones del/de los residuo(s) de aminoácidos presente(s) en la amilasa parental, lo que por consiguiente transforma el/los residuo(s) de aminoácido en el surco que interaccionan con haces de almidón. En algunos modos de realización, las mutaciones consisten en inserciones del/de los residuo(s) de aminoácidos presente(s) en la amilasa parental, lo que por consiguiente transforma los residuos de aminoácidos en el surco que interaccionan con haces de almidón.
[0069] En algunos modos de realización, las mutaciones aumentan la unión de una a-amilasa de tipo familia 13 con haces de almidón, p. ej., al aumentar las interacciones moleculares entre residuos en el surco de unión de almidón con haces de almidón. Se espera que estas mutaciones limiten la difusión de amilasa y mejoren la procesividad, aunque también pueden aumentar la estabilidad térmica, la estabilidad del pH, la estabilidad del detergente, así como reducir la dependencia del calcio.
[0070] En algunos modos de realización, la presente amilasa es una amilasa de CAZy de familia 13. En algunos modos de realización, presente la amilasa tiene el pliegue de la amilasa de Bacillus sp. En algunos modos de realización, la presente amilasa es una variante de una amilasa de Bacillus sp. que presenta un grado definido de homología/identidad de secuencia de aminoácidos con el SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, por ejemplo, de al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de homología/identidad de secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, la presente amilasa es una variante de una amilasa de Cytophaga sp. que presenta un grado definido de homología/identidad de secuencia de aminoácidos con el SEQ ID NO: 4, por ejemplo, de al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de homología/identidad de secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, la presente amilasa es una variante de una amilasa de Pyrococcus sp. que presenta un grado definido de homología/identidad de secuencia de aminoácido con el SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 5, por ejemplo, de al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de homología/identidad de secuencia de aminoácidos.
[0071] Además de las mutaciones descritas en la presente memoria, la presente amilasa puede además incluir una o más de las mutaciones descritas previamente. Las mutaciones descritas previamente son las que se conocen por conferir propiedades beneficiosas en al menos una amilasa que tiene un pliegue similar y/o presenta un 60 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos con las amilasas de Bacillus, o en cualquier amilasa a la hasta ahora se haya denominado como «tipo Termamyl».
[0072] Asimismo, las presentes amilasas pueden incluir cualquier número de sustituciones de aminoácidos conservadoras, en posiciones no mutadas específicamente. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras se listan en la Tabla 1.
Tabla 1. Sustituciones conservadoras de aminoácidos
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[0073] Las presentes amilasas pueden ser «precursoras», «inmaduras», o «de longitud completa», en cuyo caso incluyen una secuencia de señal, o «maduras», en cuyo caso carecen de una secuencia de señal. Por lo general, las formas maduras de los polipéptidos son las más útiles. A menos que se indique lo contrario, la numeración de residuos de aminoácidos empleada en la presente memoria se refiere a las formas maduras de los respectivos polipéptidos de amilasa. Los presentes polipéptidos de amilasa también se pueden truncar para eliminar los extremos N o C-terminales, siempre que los polipéptidos resultantes retengan actividad amilasa.
[0074] Las presentes amilasas pueden ser polipéptidos «quiméricos» o «híbridos», en cuanto a que incluyen al menos una porción de un primer polipéptido de amilasa y al menos una porción de un segundo polipéptido de amilasa (tales amilasas quiméricas se han «redescubierto» recientemente como amilasas de dominio swap). Las presentes amilasas pueden incluir además secuencias de señal heterólogas, un epítopo para permitir el seguimiento o la purificación, o similares. Los ejemplos de secuencias de señal heterólogas son de amilasa de B. licheniformis (LAT), B. subtilis (AmyE o AprE), y CelA de Streptomyces.
[0075] En la presente memoria también se describen ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos de amilasa descritos. El ácido nucleico puede codificar un polipéptido de amilasa concreto, o una amilasa que presenta un grado específico de identidad de secuencia de aminoácidos con la amilasa concreta. En un ejemplo, el ácido nucleico codifica una amilasa que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87%, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de identidad/homología con una amilasa de referencia. Se podrá apreciar que, debido a la degeneración del código genético, una pluralidad de ácidos nucleicos puede codificar el mismo polipéptido.
[0076] El ácido nucleico también puede presentar un grado específico de homología con un polinucleótido de ejemplo que codifica un polipéptido de a-amilasa. Por ejemplo, el ácido nucleico puede presentar al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87%, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de identidad de secuencia nucleotídica con la secuencia de ejemplo. En otro ejemplo, el ácido nucleico se hibrida en condiciones rigurosas o muy rigurosas a la secuencia de ejemplo. Dichas condiciones se describen en la presente memoria, pero también son conocidas en la materia.
[0077] Los ácidos nucleicos pueden codificar una amilasa «de longitud completa» («fl» o «FL»), que incluye una secuencia de señal, únicamente la forma madura de una amilasa, que carece de la secuencia de señal, o una forma truncada de una amilasa, que carece del extremo N o C-terminal de la forma madura.
[0078] Un ácido nucleico que codifica una a-amilasa puede estar ligado de forma operativa a varios promotores y reguladores en un vector adecuado para la expresión de la a-amilasa en células huésped. Entre los ejemplos de promotores se incluyen la amilasa de B. licheniformis (LAT), B. subtilis (AmyE o AprE), y CelA de Streptomyces. Dicho ácido nucleico también puede encontrarse ligado a otras secuencias de codificación, p. ej., para codificar un polipéptido quimérico.
5. Métodos para producir variantes de amilasas
[0079] Un aspecto de la presente invención es un método para producir una variante de amilasa al mutar específicamente uno o más residuos en el surco de unión del haz de almidón, que se han definido anteriormente. De esta manera, se introducen mutaciones en un rasgo estructural común en la molécula de amilasa para producir un efecto deseado en cuanto a la unión de almidón. Se pueden llevar a cabo las mutaciones por medio de técnicas de biología molecular conocidas y la variante de amilasas resultante se puede expresar en forma de polipéptidos segregados por medio de métodos normalizados. Por ejemplo, los métodos para producir y purificar las proteínas que se segregan en el medio de cultivo de Bacillus se conocen en la materia, ya que son células huésped adecuadas para producir amilasas. A continuación, se divulgan los métodos de ejemplo para producir amilasas.
5.1. Materias y métodos para producir amilasas
[0080] Un polipéptido se puede expresar por medio de un vector de expresión que normalmente incluirá secuencias de control que incluyen un promotor, operador, sitio de unión del ribosoma, una señal de iniciación de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores adecuados. Se puede adquirir un elevado número de vectores de forma comercial para uso en procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector a menudo dependerá de la célula huésped en la que se ha de introducir. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, esto es, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. De forma alternativa, el vector puede ser uno de los que, al introducirse en una célula huésped aislada, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el/los cromosoma(s) en el/los que se ha integrado. También se puede amplificar el gen integrado para crear múltiples copias del gen en el cromosoma mediante el uso de un constructo amplificable impulsado por la selección del antibiótico u otra presión selectiva, como un gen regulador o mediante complementación debido a la dosis efectiva de un gen de vía metabólica esencial.
[0081] En el vector, la secuencia de ADN debería estar ligada de forma operativa a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que presente actividad transcripcional en la célula huésped elegida y puede derivarse de genes que codifiquen proteínas homólogas o heterólogas a la célula huésped. Entre los ejemplos de promotores para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una amilasa, especialmente en un huésped bacteriano, se encuentran el promotor del operón lac de E. coli, los promotores del gen de agarasa dagA o celA de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen a-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, los promotores de la a-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, los ejemplos de promotores útiles son los que derivan del gen que codifica la TAKA amilasa en Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica en Rhizomucor miehei, la a-amilasa neutra en Aspergillus niger, la a-amilasa estable en ácido de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae, o la acetamidasa de A. nidulans. Cuando se expresa un gen que codifica una amilasa en una especie bacteriana como E. coli, se puede seleccionar un promotor adecuado, por ejemplo, de entre un promotor bacteriófago, incluyendo un promotor T7 y un promotor fago lambda. Entre los ejemplos de promotores adecuados para la expresión en una especie de levadura se incluyen, sin carácter limitativo, los promotores Gal 1 y Gal l0 de Saccharomyces cerevisiae y los promotores AOX1 o AOX2 de Pichia pastoris. Se puede utilizar un promotor CBHII (celobiohidrolasa II) para la expresión en Trichoderma reesei.
[0082] Un vector de expresión también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación ligadas de forma operativa a la secuencia de ADN que codifica una variante de amilasa. Las secuencias de terminación y de poliadenilación pueden derivar de forma adecuada de las mismas fuentes que el promotor.
[0083] El vector además puede comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped. Entre los ejemplos de tales secuencias se encuentran los orígenes de la replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMBI y pIJ702.
[0084] El vector también puede comprender un marcador de selección, p. ej., un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped aislada, como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o un gen que confiere resistencia antibiótica, como, p. ej., resistencia a la ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Asimismo, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus, como amdS, argB, niaD y xxsC, un marcador que dé lugar a resistencia a la higromicina, o la selección puede llevarse a cabo mediante cotransformación, como se conoce en la materia. Véase, por ejemplo, la solicitud internacional PCT WO 91/17243.
[0085] Tal como se ha señalado anteriormente, mientras que la expresión intracelular o la fermentación en estado sólido puede presentar beneficios en algunos aspectos, p. ej., al utilizar ciertas bacterias u hongos como células huésped, un aspecto de los métodos y las composiciones contempla la expresión de una a-amilasa en el medio de cultivo.
[0086] En general, las amilasas «de longitud completa», «maduras» o «precursoras» incluyen una secuencia de señal en el extremo amino terminal que permite la secreción en el medio de cultivo. Si se desea, este péptido señal se puede reemplazar por una secuencia diferente, lo que se lleva a cabo de forma conveniente mediante la sustitución de las secuencias de ADN que codifican el respectivo péptido señal.
[0087] Normalmente, el vector de expresión incluye los componentes de un vector de clonación, como, por ejemplo, un elemento que permita la replicación autónoma del vector en el organismo huésped seleccionado y uno o más marcadores fenotípicamente detectables para fines de selección. Normalmente, el vector de expresión comprende secuencias de nucleótidos de control, como un promotor, operador, sitio de unión del ribosoma, una señal de inicio de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o uno o más genes activadores. Asimismo, el vector de expresión puede comprender una secuencia que codifique una secuencia de aminoácidos capaz de dirigir la amilasa a un orgánulo de la célula huésped, como un peroxisoma, o a un compartimento concreto de la célula huésped. Dicha secuencia diana incluye sin carácter limitativo la secuencia SKL. Para la expresión en la dirección de secuencias de control, la secuencia de ácido nucleico de la amilasa se encuentra ligada de forma operativa a las secuencias de control de una forma adecuada en relación con la expresión.
[0088] Los procedimientos empleados para ligar el constructo de ADN que codifica una amilasa, el promotor, el terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación son conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a Ed., Cold Spring Harbor, 1989, and 3a Ed., 2001).
[0089] Una célula aislada que comprende, bien un constructo de ADN, bien un vector de expresión se utiliza ventajosamente como célula huésped en la producción recombinante de una amilasa. La célula puede transformarse con el constructo de ADN que codifica la enzima, integrando de manera conveniente el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Por lo general, se considera que esta integración supone una ventaja, ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede llevarse a cabo conforme a métodos habituales, p. ej., mediante recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa, la célula se puede transformar con un vector de expresión según se ha descrito anteriormente en relación con los distintos tipos de células huésped.
[0090] Entre los ejemplos de organismos huésped bacterianos adecuados se encuentran especies de bacterias Grampositivas, como Bacillaceae, incluyendo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus (anteriormente Bacillus) stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, y Bacillus thuringiensis; especies de Streptomyces, como Streptomyces murinus; especies de bacterias ácido-lácticas, incluyendo Lactococcus sp. como Lactococcus lactis; Lactobacillus sp, incluyendo Lactobacillus reuteri; Leuconostoc sp.; Pediococcus sp.; y Streptococcus sp. De forma alternativa, se pueden seleccionar como organismo huésped cepas de especies de bacterias gramnegativas que pertenecen a Enterobacteriaceae, incluyendo E. coli, o a Pseudomonadaceae.
[0091] Se puede seleccionar un organismo huésped de levadura adecuado de entre especies de levaduras relevantes desde el punto de vista biotecnológico, entre las que se incluyen, sin carácter limitativo, especies de levaduras como Pichia sp., Hansenula sp. o Kluyveromyces, Yarrowinia, especies de Schizosaccharomyces o una especie de Saccharomyces, incluyendo Saccharomyces cerevisiae o una especie que pertenezca a Schizosaccharomyces, como, por ejemplo, la especie S. pombe. Se puede utilizar como organismo huésped una cepa de la especie de levaduras metilotróficas Pichia pastoris. De forma alternativa, el organismo huésped puede ser una especie de Hansenula. Entre los organismos huésped de hongos filamentosos adecuados se incluyen especies de Aspergillus, p. ej., Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori o Aspergillus nidulans. De forma alternativa, pueden utilizarse como organismo huésped cepas de una especie de Fusarium, p. ej., Fusarium oxysporum, o de una especie de Rhizomucor, como Rhizomucor miehei. Otras cepas adecuadas incluyen las especies Thermomyces y Mucor. Además, se puede utilizar Trichoderma reesei como huésped. Un procedimiento adecuado para la transformación de células huésped de Aspergillus incluye, por ejemplo, el descrito en el documento EP 238023.
[0092] En otro aspecto adicional, se proporciona un método para producir una a-amilasa que comprende el cultivo de una célula huésped según se ha descrito anteriormente en condiciones propicias para la producción de la enzima, y la recuperación de la enzima de las células y/o del medio de cultivo.
[0093] El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio habitual adecuado para el cultivo de la célula huésped en cuestión y la obtención de la expresión de una amilasa. Los medios adecuados y los componentes de los medios pueden adquirirse a través de proveedores comerciales, o se pueden preparar conforme a recetas publicadas (p. ej., según se describe en los catálogos de la American Type Culture Collection).
[0094] En un aspecto, una enzima secretada de las células huésped se emplea en una preparación de caldo completo. En los presentes métodos, se puede conseguir la preparación de un caldo de fermentación completo gastado de un microorganismo recombinante utilizando cualquier método de cultivo conocido en la materia que dé como resultado la expresión de una alfa-amilasa. Puede entenderse, por lo tanto, que la fermentación comprende el cultivo en matraz de agitación, la fermentación a pequeña o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, por lote alimentado, o en estado sólido) en laboratorios o fermentadores industriales, realizada en un medio adecuado y en condiciones que permitan que la amilasa se exprese o se aísle. El término «caldo de fermentación completo gastado» se define en la presente memoria como contenidos no fraccionados de material de fermentación que incluye medio de cultivo, proteínas extracelulares (p. ej., enzimas), y biomasa celular. Se entiende que el término «caldo de fermentación completo gastado» abarca también la biomasa celular que se ha lisado o permeabilizado empleando métodos conocidos en la materia.
[0095] Una enzima secretada de las células huésped puede recuperarse convenientemente del medio de cultivo mediante procedimientos conocidos, incluyendo la separación de las células del medio mediante centrifugación o filtración, y la precipitación de componentes proteicos del medio con una sal como sulfato de amonio, y a continuación, empleando procesos cromatográficos, como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.
[0096] Un aspecto contempla el polinucleótido en un vector que está ligado de forma operativa a una secuencia de control capaz de posibilitar la expresión de la secuencia de codificación mediante la célula huésped, esto es, el vector es un vector de expresión. Las secuencias de control pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adición de otros elementos reguladores transcripcionales para provocar que el nivel de transcripción dirigida por las secuencias de control sea más sensible a moduladores transcripcionales. Las secuencias de control pueden comprender, en concreto, promotores.
[0097] Las células huésped pueden cultivarse en condiciones adecuadas que permitan la expresión de una amilasa. La expresión de las enzimas puede ser constitutiva, de tal forma que se produzcan continuamente, o inducible, lo cual requiere de un estímulo para iniciar la expresión. En el caso de la expresión inducible, la producción de proteínas se puede iniciar cuando sea conveniente mediante, por ejemplo, la adición de una sustancia inductora al medio de cultivo, como dexametasona o IPTG o soforosa. Los polipéptidos también se pueden producir de forma recombinante en un sistema libre de células in vitro, como el sistema de reticulocitos de conejo TNT™ (Promega).
[0098] Un huésped de expresión de amilasa también puede cultivarse en el medio apropiado para el huésped, en condiciones aerobias. Se puede proporcionar agitación o una combinación de agitación y aireación, teniendo lugar la producción a la temperatura adecuada para ese huésped, p. ej., desde aprox. 25 °C a aprox. 75 °C (p. ej., de 30 °C a 45 °C), dependiendo de las necesidades del huésped y de la producción de la variante de amilasa deseada. El cultivo puede llevarse a cabo desde aprox. 12 horas hasta aprox. 100 horas o más (y cualquier valor de horas comprendido en ese período, p. ej., de 24 a 72 horas). Normalmente, el caldo de cultivo presenta un pH de aprox. 5.5 a aprox. 8.0, dependiendo una vez más de las condiciones de cultivo necesarias para el huésped en relación con la producción de una amilasa.
5.2. Materias y métodos para purificación de la proteína
[0099] En la materia, se conocen técnicas de fermentación, separación y concentración, y se pueden utilizar métodos habituales para preparar una solución concentrada que contenga polipéptidos de amilasa.
[0100] Tras la fermentación, se obtiene un caldo de fermentación, se eliminan las células microbianas y varios sólidos suspendidos, incluyendo las materias primas de fermentación, mediante técnicas de separación habituales con el fin de obtener una solución de amilasa. Por lo general, se emplea la filtración, centrifugación, microfiltración, filtración rotativa al vacío, ultrafiltración, centrifugación seguida de ultrafiltración, extracción o cromatografía, o similares.
[0101] Es conveniente concentrar una solución que contenga polipéptidos de una a-amilasa con el fin de optimizar la recuperación. El uso de soluciones no concentradas requiere de un mayor tiempo de incubación con el fin de recoger el precipitado enzimático purificado.
[0102] La solución que contiene enzimas se concentra utilizando técnicas de concentración convencionales hasta que se obtiene el nivel de enzimas deseado. Se puede lograr la concentración de la solución que contiene enzimas mediante cualquiera de las técnicas expuestas en la presente memoria. Entre los ejemplos de métodos de purificación se incluyen, sin carácter limitativo, la filtración rotativa al vacío y/o la ultrafiltración.
[0103] La solución de enzimas se concentra en una solución de enzimas concentrada hasta que la actividad enzimática de la solución concentrada que contiene polipéptidos de una variante de a-amilasa alcanza un nivel deseado.
[0104] La concentración se puede llevar a cabo empleando, p. ej., un agente de precipitación, como un agente de precipitación de haluro de metal. Los agentes de precipitación de haluro de metal incluyen, sin carácter limitativo, cloruros de metal alcalino, bromuros de metal alcalino y mezclas de dos o más de estos haluros de metal. Entre los ejemplos de haluros de metal se incluyen el cloruro de sodio, cloruro de potasio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y mezclas de dos o más de estos haluros de metal. El agente de precipitación de haluro de metal, cloruro de sodio, también puede utilizarse como conservante.
[0105] El agente de precipitación de haluro de metal se utiliza en una cantidad efectiva para precipitar un polipéptido de a-amilasa. La selección de al menos una cantidad efectiva y una cantidad óptima de haluro de metal eficaz para provocar la precipitación de la enzima, así como las condiciones de la precipitación para la recuperación máxima, incluyendo tiempo de incubación, pH, temperatura y concentración de enzima, resultará evidente a primera vista para un experto en la materia, tras análisis rutinarios.
[0106] En general, se añade al menos aprox. de un 5 % p/v (peso/volumen) a aprox. un 25 % p/v de haluro de metal a la solución concentrada de enzimas, y normalmente al menos un 8 % p/v. Por lo general, no se añade más de aprox. un 25 % p/v a la solución concentrada de enzimas, y generalmente no más de aprox. un 20 % p/v. La concentración óptima del agente de precipitación de haluro de metal dependerá, entre otras cosas, de la naturaleza del polipéptido de amilasa concreto y de su concentración en la solución concentrada de enzimas.
[0107] Otra forma alternativa de precipitar la enzima consiste en utilizar compuestos orgánicos. Entre los ejemplos de agentes de precipitación de compuesto orgánico se incluyen: ácido 4-hidroxibenzoico, sales de metal alcalino de ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres de alquilo de ácido 4-hidroxibenzoico, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. La adición de dichos agentes de precipitación de compuesto orgánico puede tener lugar anterior, simultánea o posteriormente a la adición del agente de precipitación de haluro de metal, y la adición de ambos agentes de precipitación, el compuesto orgánico y el haluro de metal, se puede llevar a cabo de forma secuencial o simultánea.
[0108] Por lo general, los agentes de precipitación orgánicos se seleccionan de entre el grupo que consiste en sales de metal alcalino de ácido 4-hidroxibenzoico, como sales de sodio o de potasio, y ésteres de alquilo de ácido 4-hidroxibenzoico lineales o ramificados, donde el grupo alquilo contiene de 1 a 12 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los agentes de precipitación de compuesto orgánico pueden ser, por ejemplo, ésteres de alquilo de ácido 4-hidroxibenzoico lineales o ramificados, donde el grupo alquilo contiene de 1 a 10 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los ejemplos de compuestos orgánicos son ésteres de alquilo de ácido 4-hidroxibenzoico lineales, donde el grupo alquilo contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Asimismo, se pueden emplear ésteres de metilo de ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres de propilo de ácido 4-hidroxibenzoico, éster de butilo de ácido 4-hidroxibenzoico, éster de etilo de ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Entre otros compuestos orgánicos también se incluyen, sin carácter limitativo, éster de metilo de ácido 4-hidroxibenzoico (llamado metilparabeno), éster de propilo de ácido 4-hidroxibenzoico (llamado propilparabeno), que son también ambos agentes conservantes de amilasa. Para descripciones adicionales, véase, p. ej., el documento de patente estadounidense n.° 5,281,526.
[0109] La adición del agente de precipitación de compuesto orgánico ofrece la ventaja de presentar una alta flexibilidad en las condiciones de precipitación con respecto al pH, la temperatura, la concentración de polipéptido de amilasa, la concentración de agente de precipitación y el tiempo de incubación.
[0110] El agente de precipitación de compuesto orgánico se utiliza en una cantidad efectiva para mejorar la precipitación de la enzima por medio del agente de precipitación de haluro de metal. La selección de al menos una cantidad efectiva y una cantidad óptima de agente de precipitación de compuesto orgánico, así como las condiciones de la precipitación para la recuperación máxima, incluyendo tiempo de incubación, pH, temperatura y concentración de enzima, resultará evidente a primera vista para un experto en la materia, en virtud de la presente descripción, tras los análisis rutinarios.
[0111] Por lo general, se añade al menos aprox. un 0.01 % p/v de agente de precipitación de compuesto orgánico a la solución concentrada de enzimas, y normalmente al menos un 0.02 % p/v. Por lo general, no se añade más de aprox. un 0.3 % p/v de agente de precipitación de compuesto orgánico a la solución concentrada de enzimas, y normalmente no más de aprox. un 0.2 % p/v.
[0112] La solución concentrada de polipéptidos, que contiene el agente de precipitación de haluro de metal, y el agente de precipitación de compuesto orgánico, puede ajustarse a un pH que, necesariamente, dependerá de la enzima que se va a purificar. En general, el pH se ajusta a un nivel cercano al punto isoeléctrico de la amilasa. El pH puede ajustarse a un pH comprendido en un rango que va desde aproximadamente 2.5 unidades de pH por debajo del punto isoeléctrico (pl) hasta aproximadamente 2.5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico.
[0113] El tiempo de incubación necesario para obtener un precipitado enzimático purificado depende de la naturaleza de la enzima específica, la concentración de enzimas, y el/los agente(s) de precipitación específico(s) y su concentración. Por lo general, el tiempo efectivo para precipitar la enzima está comprendido entre aprox. 1 hora y aprox. 30 horas; normalmente, no sobrepasa de aprox. 25 horas. En presencia del agente de precipitación de compuesto orgánico, el tiempo de incubación puede reducirse aún más hasta menos de aprox. 10 horas, y en la mayoría de los casos, incluso hasta aprox. 6 horas.
[0114] En general, la temperatura durante la incubación oscila entre aprox. 4 °C y aprox. 50 °C. Normalmente, el método se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aprox. 10 °C y aprox. 45 °C (p. ej., entre aprox. 20 °C y aprox. 40 °C). La temperatura óptima para inducir la precipitación varía conforme a las condiciones de la solución y a la enzima o el/los agente(s) de precipitación utilizado/a(s).
[0115] La recuperación global del precipitado enzimático purificado, y la eficacia con la que se realiza el proceso, mejora al agitar la solución que comprende la enzima, el haluro de metal añadido y el compuesto orgánico añadido. La etapa de agitación se lleva a cabo tanto durante la adición del haluro de metal y del compuesto orgánico, como durante el período de incubación posterior. Entre los métodos de agitación adecuados se incluyen la mezcla o agitación mecánica, la aireación intensa, o cualquier técnica parecida.
[0116] Tras el período de incubación, la enzima purificada se separa entonces del pigmento disociado y de otras impurezas, y se recoge mediante técnicas de separación convencionales, como filtración, centrifugación, la microfiltración, filtración rotativa al vacío, ultrafiltración, filtración de prensa, microfiltración por membranas cruzadas, microfiltración con membranas de flujo cruzado, o similares. Se puede obtener una purificación adicional del precipitado enzimático purificado lavando el precipitado con agua. Por ejemplo, se lava el precipitado enzimático enriquecido o purificado con agua que contiene el agente de precipitación de haluro de metal, o con agua que contiene los agentes de precipitación de haluro de metal y de compuesto orgánico.
[0117] Durante la fermentación, se acumula un polipéptido de a-amilasa en el caldo de cultivo. Para el aislamiento y purificación de la amilasa deseada, se centrifuga o se filtra el caldo de cultivo para eliminar células, y el líquido resultante libre de células se emplea para la purificación de enzima. En un modo de realización, el caldo libre de células se somete a precipitación salina empleando sulfato de amonio a una saturación de aprox. un 70 %; la fracción de precipitación saturada al 70 % se disuelve entonces en un tampón y se aplica a una columna, como una columna Sephadex G-100, y se eluye para recuperar la fracción activa de enzimas. Para una purificación adicional, se puede utilizar un procedimiento convencional, como cromatografía de intercambio iónico.
[0118] Las enzimas purificadas resultan útiles para aplicaciones de lavado de ropa y de limpieza. Por ejemplo, se pueden utilizar en detergentes para ropa y en quitamanchas. Pueden transformarse en un producto final que puede ser líquido (solución, suspensión) o sólido (granulado, polvo).
[0119] En Sumitani, J. et al. (2000) "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. 195 a-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading," Biochem. J. 350: 477-484 se describe un ejemplo más específico de purificación, y se resume brevemente en la presente memoria. La enzima obtenida a partir de 4 litros de un sobrenadante de cultivo de Streptomyces lividans TK24 se trató con (N H ^S O 4 a un 80 % de saturación. El precipitado se recuperó mediante centrifugación a 10000 * g (20 min a 4 °C) y se volvió a disolver en 20 Mm de tampón Tris/HCl (pH 7.0) conteniendo 5 mM de CaCh. El precipitado solubilizado se dializó a continuación con el mismo tampón. La muestra dializada se aplicó entonces a una columna de Sephacryl S-200, que previamente se había equilibrado con 20 mM de tampón Tris/HCl, (pH 7.0), 5 mM de CaC12, y se había eluido a una velocidad de flujo lineal de 7 mL/h con el mismo tampón. Se recogieron fracciones de la columna y se evaluaron para determinar si existía actividad, con arreglo al ensayo enzimático y la SDS-PAGE. Posteriormente, se purificó la proteína según se expone a continuación. Se equilibró una columna de Toyopearl HW55 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA; Cat. n.° 19812) con 20 mM de tampón Tris/HCl (pH 7.0) que contenía 5 mM de CaCh y 1.5 M de (NH4)2SO4. La enzima se eluyó con un gradiente lineal de 1.5 a 0 M de (NH4)2SO4 en 20 mM de tampón Tris/HCL, pH 7.0 que contenía 5 mM de CaCh. Se recogieron las fracciones activas, y la enzima precipitó con (NH4)2SO4 a una saturación del 80 %. El precipitado se recuperó, se volvió a disolver y se dializó según se ha descrito anteriormente. A continuación, la muestra dializada se aplicó a una columna Mono Q HR5/5 (Amersham Pharmacia, Cat. n.° 17-5167-01) previamente equilibrada con 20 mM de tampón Tris/HCl (pH 7.0) que contenía 5 mM de CaCh, a una velocidad de flujo de 60 mL/h. Las fracciones activas se recogieron y se añadieron a una solución de 1.5 M de (NH4)2SO4. Las fracciones de enzimas activas se recromatografiaron en una columna de Toyopearl HW55, al igual que antes, para conseguir una enzima homogénea, según lo determinado mediante la SDS-PAGE. Véase Sumitani, J. et al. (2000) Biochem. J. 350: 477-484, para un análisis general sobre el método y las variaciones al respecto.
[0120] Para la recuperación de la escala de producción, se pueden purificar parcialmente polipéptidos de amilasa, tal como se ha descrito en general anteriormente, mediante la eliminación de células por medio de floculación con polímeros. De forma alternativa, la enzima puede purificarse mediante microfiltración, seguida de concentración mediante ultrafiltración utilizando membranas y equipamiento disponibles. No obstante, para algunas aplicaciones, la enzima no necesita purificarse, y el caldo de cultivo completo puede lisarse y utilizarse sin tratamiento adicional. A continuación, la enzima puede transformarse, por ejemplo, en gránulos.
6. Composiciones que comprenden variantes de a-amilasas
[0121] También se describen composiciones que comprenden una o más de las variantes de a-amilasa descritas. Entre tales composiciones se incluyen, por ejemplo, concentrados de enzimas, mezclas de enzimas, preparados enzimáticos purificados, productos enzimáticos parcialmente purificados, productos de caldo clarificados, productos de caldo enteros, aditivos alimentarios y productos de limpieza. Las composiciones se pueden proporcionar en una variedad de presentaciones materiales, incluyendo líquidos, suspensiones, geles, aglutinados, polvos, granulados y similares. Las composiciones se pueden liofilizar, concentrar, congelar, secar por atomización o procesar de otra forma según una variedad de maneras conocidas o útiles. Las composiciones se pueden proporcionar en tamaños estándar para ciertas aplicaciones comerciales, o empaquetadas a medida, o se pueden proporcionar en recipientes para graneles de cualquier tipo.
[0122] Además, las composiciones pueden comprender o utilizarse junto con una cantidad de ingredientes de formulación, como tampones, sales, quelantes, conservantes, antimicrobianos, polímeros, agentes de carga y similares. Especialmente cuando las composiciones consisten en composiciones de limpieza, también pueden comprender adicionalmente, p. ej., tensioactivos, oxidantes, quelantes u otros agentes de limpieza. Entre los ejemplos de composiciones se encuentran detergentes para ropa y detergente para lavavajillas, incluyendo detergentes para lavavajillas automáticos. Las composiciones pueden además comprender o se pueden usar junto con uno o más polipéptidos adicionales. Este o más polipéptidos adicionales pueden incluir al menos una enzima. Entre las enzimas adicionales se incluyen, sin carácter limitativo, otras a-amilasas, p-amilasas, glucoamilasas, isoamilasas, isomerasas, fitasas, proteasas, celulasas, ligasas, hemicelulasas, lipasas, fosfolipasas y cutinasas.
[0123] En la presente memoria también se describen composiciones que comprenden una o más de las presentes variantes de amilasas o mezclas de enzimas que además comprenden una o más enzimas adicionales, útiles para la licuefacción de almidón. En algunas composiciones descritas en la presente memoria, las composiciones son útiles para facilitar la eliminación del almidón de textiles, papel, vidrio, plástico, metal, telas, porcelana y otras superficies. En algunas composiciones descritas en la presente memoria, las composiciones se preparan o formulan para uso como aditivos alimentarios o coadyuvantes tecnológicos adecuados para uso en transformaciones alimentarias. Las composiciones son especialmente eficaces cuando al menos una porción del almidón está en forma de haces de almidón.
8. Métodos de uso
[0124] También se describen en la presente memoria métodos de uso de las variantes de a-amilasas o las composiciones que comprenden dichas variantes descritas. En algunos métodos descritos en la presente memoria, las variantes de a-amilasas se usan en un método para licuefacción de un carbohidrato complejo, como una suspensión de almidón, especialmente cuando la suspensión de almidón contiene haces de almidón. En general, el método comprende elaborar una suspensión que comprende el carbohidrato complejo, calentar la suspensión hasta alcanzar una temperatura aceptable para la licuefacción, añadir a la suspensión una composición que comprenda al menos una variante de aamilasa tal como se describe en la presente memoria e incubar la suspensión con la composición durante un tiempo y a una temperatura suficiente para licuar el carbohidrato complejo. Tal como se utiliza en la presente memoria, «licuar» no significa que se escindan todos los enlaces del sustrato disponibles, sino que significa que el carbohidrato complejo se hidroliza al menos parcialmente, tal como demuestra una reducción medible en la viscosidad final, un aumento en la DE de la suspensión, la liberación de fragmentos/productos de bajo DP, u otra medición de un aumento en los grupos reductores, dextrinas o unidades de a-maltosa.
[0125] La temperatura de licuefacción puede oscilar entre temperatura ambiente y más de 100 °C, pero más preferiblemente de aprox. 50 °C a aprox. 95 °C. La licuefacción puede conllevar el uso de una curva de temperatura compleja en el tiempo, por ejemplo, la reacción puede iniciarse a una temperatura baja y aumentarse mediante métodos conocidos en la materia hasta alcanzar la temperatura final deseada. La temperatura también se puede reducir después de un periodo específico de tiempo, o después de alcanzar un punto final deseado en términos de viscosidad, valor de DE u otra medida de licuefacción. El experto en la materia además comprenderá que no es necesario que el método implique una temperatura específica para una duración concreta, siempre que la actividad amilasa pueda ocurrir a la temperatura y en las condiciones previstas. Entre otras condiciones que afectan a la actividad se incluyen el pH y la concentración de iones de calcio, además de la presencia o ausencia de inhibidores o similares.
[0126] La suspensión puede incluir aprox. un 20-40% de almidón con relación al peso seco, por ejemplo, de aprox. un 30 a aprox. un 36 o 37.5 % de almidón. Se pueden utilizar cantidades inferiores de almidón, pero, por lo general, no resultan económicas. La viscosidad máxima y los factores relacionados, tal como los aportes de energía necesarios para la mezcla pueden limitar la cantidad máxima de almidón que se ha de emplear en la suspensión. El experto en la materia tendrá en cuenta las consideraciones prácticas a la hora de elaborar una suspensión de almidón. El experto en la materia tendrá en cuenta que, a mayor reducción de la viscosidad, mayor licuefacción del almidón, mayor será la producción de dextrinas (o más elevada será la DE del almidón licuado resultante). Así, la viscosidad pico se reduce en al menos un 10, 20, 25, 30, 40 o incluso un 50 % o más con respecto a la viscosidad pico de una suspensión licuada mediante una enzima natural a partir de la que deriva la variante, o se trata con un preparado enzimático que actualmente se puede adquirir de forma comercial.
[0127] En algunos métodos descritos en la presente, la licuefacción es parte de una fermentación para producir, p. ej., un producto alimenticio, un aditivo alimentario, un carburante, un aditivo para combustible y similares. Tal como se describe en la presente memoria, la fermentación produce un carburante o un aditivo para combustible como un alcohol, por ejemplo, etanol, butanol u otro alcohol inferior. En la presente memoria se describen métodos para producir etanol por medio de variantes de a-amilasas, composiciones o mezclas de encimas descritas en la presente memoria. De acuerdo con dichos métodos, tras la adición de la variante de enzima, la suspensión de almidón licuada resultante se fermenta con uno o más microorganismos capaces de producir etanol, en un periodo de tiempo y en unas condiciones adecuadas para la producción de etanol durante la fermentación. De forma alternativa, la variante de amilasa y los organismos se encuentran presentes al mismo tiempo, como en el caso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF).
[0128] En la presente memoria también se describen métodos de limpieza de una superficie para eliminar un residuo de almidón no deseado, especialmente cuando al menos una porción del almidón está en forma de haces de almidón. Los métodos comprenden los pasos para proporcionar una superficie que presenta un residuo de almidón que debe eliminarse, al entrar en contacto la superficie con una composición que comprende una o más variantes de a-amilasas, durante un tiempo y a una temperatura suficientes, y en condiciones que permiten que resulte en la eliminación del residuo de almidón. La superficie puede estar en cualquier material; por ejemplo, puede estar en un plato, placa, vidrio, etc., o puede estar en ropa o tela. También puede ser, por ejemplo, una encimera o una superficie de trabajo, o un recipiente comercial que deba limpiarse de forma periódica o regular.
[0129] En la presente memoria también se describen métodos para tratar un material tejido utilizando las variantes de a-amilasa descritas en la presente memoria. Los métodos para tratar materiales tejidos, como telas, con amilasas son conocidos en la materia y abarcan lo que se denomina como «desencolado». Los métodos comprenden que el material trenzado entre en contacto con un líquido que comprende una variante de a-amilasa o una composición que comprende una variante de acuerdo con la presente memoria. En algunos métodos descritos en la presente memoria, el material tejido es una tela o textil. En otro método descrito en la presente memoria, el material tejido se trata con el líquido a presión. Por lo general, el líquido es una solución acuosa. Las variantes de a-amilasa descritas en la presente memoria se pueden utilizar por sí solas o junto con otros reactivos químicos de desencolado, como detergentes y/o enzimas de desencolado para desencolar materiales tejidos como telas, incluyendo algodón y telas que contienen algodón.
[0130] A continuación se proporcionan ejemplos prácticos para profundizar en la descripción e ilustración de ciertos aspectos de las variantes de las a-amilasas y por consiguiente no deben entenderse como limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Purificación de uPWA
[0131] Variante de a-amilasa derivada de Pyrococcus woesei, uPWA (SEQ ID NO: 2 en la patente estadounidense n.° 7,273,740), se adquirió a través de Verenium (San Diego, CA, EE. UU.). La uPWA contiene 58 sustituciones de aminoácidos con respecto a la amilasa natural de P. woesei, PWA. Las secuencias de aminoácidos de uPWA y PWA se muestran a continuación como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 1, respectivamente:
Variante de amilasa de P. woesei, uPWA (SEQ ID NO: 5)
AKYSELEKGG VIMQAFYWDV PSGGIWWDTI RQKIPEWYDA G IS A IW IP P A
SKGMGGAYSM GYDPYDFFDL GEYDQKGTVE TRFGSKQELV NMINTAHAYG
MKVIADIVIN HRAGGDLEWN PFVNDYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE
LHAGDSGTFG GYPDICHDKS WDQYWLWASQ ESYAAYLRSI GIDAWRFDYV
KGYAPWVVKD WLNWWGGWAV GEYWDTNVDA VLNWAYSSGA KVFDFALYYK
MDEAFDNKNI PALVSALQNG QTVVSRDPFK AVTFVANHDT DIIWNKYPAY
AFILTYEGQP TIFYRDYEEW LNKDKLKNLI W1HENLAGGS TDIVYYDNDE
LIFVRNGYGD K PG LITY IN L GSSKAGRWVY VPKFAGAC1H EYTGNLGGWV
DKYVYSSGWV YLEAPAYDPA NGQYGYSVWS YCGVG
Amilasa natural de P. woesei (SEQ ID NO: 1)
AKYLELEEGG VIMQAFYWDV PGGGIWWDHI RSKIPEWYEA G IS A IW L PP P
SKGMSGGYSM GYDPYDYFDL GEYYQKGTVE TRFGSKEELV RLIQTAHAYG
IKVIADVVIN HRAGGDLEWN PFVGDYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE
LHCCDEGTFG GFPDICHHKE WDQYWLWKSN ESYAAYLRSI GFDGWRFDYV
KGYGAWVVRD WLNWWGGWAV GEYWDTNVDA LLSWAYESGA KVFDFPLYYK
MDEAFDNNNI PALVYALQNG QTVVSRDPFK AVTFVANHDT DIIWNKYPAY
AFILTYEGQP VIFYRDFEEW LNKDKLINLI W1HDHLAGGS TTIVYYDNDE
LIFVRNGDSR R P G L IT Y IN L SPNWVGRWVY VPKFAGAC1H EYTGNLGGWV
DKRVDSSGWV YLEAPPHDPA NGYYGYSVWS YCGVG
[0132] Se purificó uPWA mediante cromatografía hidrofóbica y se transfirió a un tampón de pH elevado que consistía en 50 mM de glicina, pH 10 y 2 mM de CaCh, y luego se mezcló durante veinte minutos. El sulfato de amonio se añadió a una concentración final de 1 M y se dejó que la solución se mezclara durante otros 30 minutos y luego se aplicó a una columna de Phenyl Sepharose de 30 mL equilibrada con el mismo tampón. Se lavó la columna con el mismo tampón hasta que se alcanzó una línea de base estable. Se aplicó un gradiente de 300 mL para alcanzar 50 mM de glicina, pH 10, 2 mM de CaCh, seguido de 300 mL de lavado en el mismo tampón. Por último, se eluyó la proteína en 50 mM de glicina, pH 10, 2 mM de cloruro de calcio y propilenglicol al 40 %.
[0133] Las fracciones combinadas se concentraron en un concentrador Vivaspin (MWCO 10000) hasta alcanzar una concentración final de proteína de 20 mg/mL. La proteína purificada se conservó en un tampón de elución (50 mM de glicina, pH 10, 2 mM de CaCh, propilenglicol al 40 %) a 4 °C. La concentración se determinó mediante densidad óptica a 280 nm y se utilizó SDS-PAGE para evaluar la pureza. Antes de la cristalización, se intercambió el tampón de almacenamiento de proteína mediante un concentrador Vivaspin (MWCO 10000) y la concentración final de proteína se ajustó a 10 mg/ml.
Ejemplo 2. Cristalización de uPWA
[0134] Los ensayos de cristalización se llevaron a cabo a temperatura ambiente mediante gotas de sedimentación en placas Cryschem de 24 pocillos (Hampton Research). El cribado inicial se llevó a cabo mediante cribas disponibles de forma comercial (Hampton y Qiagen). Las gotas se mezclaron en forma de 2 pl de muestra de proteína con una cantidad igual de solución de depósito y se dejaron equilibrarse con soluciones de depósito de 250 pl. Aparecieron cristales después de 5-7 días en condiciones de depósito que consistían en 0.1M de Tris-HCl con pH 8.5 y etanol al 20 % (v/v) o 0.2 M de NaCl, 0.1 M de HEPES con pH 7.5 e isopropanol al 10 % (v/v). Antes del análisis por difracción de rayos X, se crioprotegieron los cristales mediante la adición de granos de sacarosa a la gota, que se dejaron disolverse. Los cristales se acumularon en bucles de nailon y se refrigeraron de forma ultrarrápida en nitrógeno líquido.
[0135] Los datos se recogieron mediante radiación sincrotrón en el Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (línea de luz BL12-2 de SSRL). Se recogió, integró y escaló a una resolución de 50 - 2.1 A con XDS un conjunto de datos completo (Kabsch, W. (1993) J. Appl. Crystallogr. 26:795-800).
Ejemplo 3. Determinación y refinado de estructura de uPWA
[0136] Se determinó la estructura de uPWA mediante reemplazo molecular por medio de Phaser (McCoy, A. J. et al. (2007) J. Appl. Crystallogr. 40:658-674) con la amilasa natural de P. woesei (código de acceso PDB: 1MWO; Linden, A. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:9875-9884) como un modelo de búsqueda. El refinado del modelo, la interpretación del mapa y la construcción del modelo se llevaron a cabo por medio de p He NIX (Adams, P. D. et al. (2002) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 58:1948-1954) y COOT (Emsley, P. and Cowtan, K. (2004) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.
60:2126-2132). Las estadísticas de refinado del modelo se listan en la Tabla 1.
Tabla 1. Estadísticas de refinado del modelo
Rango de resolución (A) 50 A -2.1 A
Modelado 435 aminoácidos, 191 aguas, 2 sacarosa, 4 Ca2+, 1 Tris+ , 1 Zn2+, 1 SO42' y 1 pciclodextrina
Rtra b a jo(%)1 16.5 %
Rlibre (%)2 20.8 %
Factor B promedio (A) 30.8
RMSDenlaces (A)3 0.008
RMSDángulos (A)3 1.25
1 Rtrabajo (%) = 100*£hkl| Fobs- Fcalc| / Xhkl Fobs donde Fobs y Fcalc son los factores de estructura que se observan y se calculan respectivamente. 2Rlibre (%) se calcula utilizando una muestra del 5 % elegida de forma aleatoria de los datos de reflexión omitidos del refinado. 3Desviación cuadrática media (RMSD) de los ángulos y las longitudes de enlace ideales
[0137] Se determinó la estructura con una resolución de 2.1 Á. El modelo final incluye los residuos de 1 a 435 del polipéptido, 2 moléculas de sacarosa, iones unidos (4 Ca2+, 1 Zn2+, 1 Tris+, 1 SO42-), 191 moléculas de agua, y 1 molécula de p-ciclodextrina y arroja unos valores Rtrabajo y Rlibre del 16.5 % y 20.8 %, respectivamente, a una resolución de 50 - 2.1 Á y con un 94.2 % de residuos en las regiones más favorecidas del gráfico de Ramachandran (Chen, V. B. et al. (2010) Acta Crystallogr. Sect. Biol. Crystallogr. 66:12-21).
[0138] La estructura de uPWA expone el pliegue canónico de la glucosidasa de CAZy de familia 13 con dominios A, B y C característicos (figura 1). Los resultados se muestran en la figura 2. A pesar de la presencia de 58 mutaciones respecto a la amilasa natural de P. woesei, la estructura general era similar a la estructura previamente descrita (PWA en peso, código de acceso PDB: 1MWO; Linden, A. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:9875-9884), con una desviación cuadrática media de 0.6 Á en las posiciones de la cadena principal Ca . El dominio A principal (residuos 1-109 y residuos 170-340) conserva la estructura de barril TIM característica y, alberga los residuos de sitio activo Asp289, Glu222 y Asp198 (Banner, D. W. et al. (1975) Nature 255:609-614). El dominio B relativamente pequeño forma parte de la grieta de unión del sustrato y posee un centro metálico de Ca,Zn (Linden, A. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:9875-9884). El dominio C de extremo C-terminal (residuos 341-435) consiste en una lámina p antiparalela de ocho hebras incluyendo el típico motivo de clave griega. Además de los iones Ca2+ y Zn2+ en el centro metálico único, se encontraron otros tres sitios de Ca2+ : dos dentro del dominio A y uno en el dominio C, todos ellos correspondientes a sitios previamente señalados para PWA en peso con y sin a-acarbosa (códigos de acceso PDB 1MXD y 1MWO, respectivamente), o sitios de Mg2+ para a-acarbosa de PWA en peso (código de acceso PDB: 1MXO).
[0139] Se observó un pico marcadamente anómalo en el sitio de unión del Zn, mientras que no se observaron picos en ninguno de los otros sitios de unión. Inesperadamente se encontró una ciclodextrina estrechamente unida en los extremos N-terminales del dominio A (figura 1). El sitio de unión se formó mediante una hélice pequeña que precedía la primera cadena p, los dos bucles de la hélice 6/cadena 7 y la hélice 7/cadena 8, y el bucle conectó los dominios A y C. Parte del sitio de unión de la ciclodextrina se superpuso con un sitio de unión de la a-acarbosa (Ac-II) que se observó en el polipéptido natural. Un ión sulfato se situaba en el centro del anillo de ciclodextrina.
[0140] Asimismo, una molécula de sacarosa se unió entre dos bucles de la hélice 4/cadena 5 y la hélice 5/cadena 6, en las inmediaciones cercanas de la ciclodextrina. Se encontró una segunda molécula de sacarosa cerca de la hélice 3b y el extremo C-terminal parte del dominio B, superponiéndose con el sitio de unión del metiltetraglicol del polipéptido natural con a-acarbosa (código de acceso PDB: 1Mx D).
[0141] Ninguna de las 58 sustituciones de aminoácidos en uPWA implicaron residuos en contacto directo con iones metálicos u otros ligandos; sin embargo, C153A, C154G, E156S y H168D estaban cerca del centro metálico de Ca,Zn y D358Y, S359G, R360D, R361K y P372S estaban cerca de la ciclodextrina unida. La mayoría de las sustituciones se situaban en la superficie de la enzima.
Ejemplo 4. Correlación entre las variantes de SEL vencedoras y las posiciones del surco
[0142] Se preparó una biblioteca de evaluación de sitios (SEL) completa, de 488 posiciones para el cribado de variantes de una amilasa de Cytophaga sp. (AAF00567.1, GI# 6006681; SEQ ID NO: 4) que presentaba una deleción en el bucle de unión de almidón (a R178+a G 179; subrayado en el SEQ ID NO: 4).
[0143] A-amilasa de Cytophaga sp. (AAF00567.1, GI# 6006681; SEQ ID NO: 4):
AATNGTMMQY FEWYVPNDGQ QWNRLRTDAP YLSSVGITAV WTPPAYKGTS
QADVGYGPYD LYDLGEFNQK GTVRTKYGTK GELKSAVNTL HSNGIQVYGD
VVMNHKAGAD YTENVTAVEV NPSNRNQETS GEYNIQAWTG FNFPGRGTTY
SNFKWQWFHF DGTDWDQSRS LSR IFK FR GT GKAWDWEVSS ENGNYDYLMY
ADIDYDHPDV VNEMKKWGVW YANEVGLDGY RLDAVKHIKF SFLKDWVDNA
RAATGKEMFT VGEYWQNDLG ALNNYLAKVN YNQSLFDAPL HYNFYAASTG
GGYYDMRNIL NNTLVASNPT KAVTLVENHD TQPGQSLEST VQPWFKPLAY
AFILTRSGGY PSVFYGDMYG TKGTTTREIP ALKSKIEPLL KARKDYAYGT
QRDYIDNPDV IGWTREGDST KAKSGLATVI TDGPGGSKRM YVGTSNAGEI
WYDLTGNRTD KITIGSDGYA TFPVNGGSVS VWVQQ
[0144] Estas SEL son conocidas en la materia y se emplean rutinariamente para evaluar el efecto de las sustituciones individuales, o las combinaciones de mutaciones en polipéptidos. La variante de polipéptidos de amilasa de Cytophaga se calificó para rendimiento en función de su habilidad para hidrolizar almidón de maíz. Se hizo referencia a la relación de actividad de una variante/actividad de una amilasa natural de Cytophaga sp., normalizada para la expresión, como el índice de rendimiento (PI) para actividad. Las SEL claramente vencedoras fueron variantes que tenían un PI para actividad >1, que indicaban actividad aumentada en almidón de maíz. No obstante, las mutaciones que resultan en un PI para actividad <1 pueden presentar beneficios de rendimiento en combinación con otras mutaciones. Se hizo referencia a la relación del nivel de expresión de una variante/nivel de expresión de una amilasa natural de Cytophaga sp. como PI para expresión. Al analizar los datos de la SEL, a menudo conviene excluir los datos de las variantes que tienen un PI de expresión por debajo del umbral preseleccionado (p. ej., <0.3) para evitar errores que surgen al medir niveles bajos de actividad enzimática.
[0145] La figura 6 es un histograma que muestra la distribución del PI para valores de actividad de todas las variantes de SEL que presentaban un PI para la expresión >0.3. El eje X indica el PI para actividad y el eje Y indica el número de variantes que tenían el PI correspondiente para actividad. La figura 7 es un histograma que muestra la distribución de los valores de PI para actividad de las variantes de la SEL que tan solo presentaban sustituciones en posiciones del surco (esto es, las posiciones 1, 2, 3, 4, 38, 88, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 230, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 308, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 396, 397, 398, 399, 400, 401,402 y 403, con respecto al SEQ ID NO: 4) y que tenían un PI para expresión >0.3. La distribución de las variantes de la posición del surco es más gaussiana, con menos variantes que presentan un PI para actividad <1. Estos datos indican que las mutaciones en posiciones del surco tienen más posibilidades de producir una variante de amilasa con un PI para actividad >0.8, >0.9, y >1, y menos posibilidades para producir una variante de amilasa con un PI para actividad <1, <0.9, y <0.8, en comparación con una mutación provocada de forma indiscriminada, esto es, en cualquier lugar en un polipéptido de amilasa de la posición 1 a 488.
Ejemplo 5. Correlación entre las posiciones del surco y la actividad en los sustratos de almidón
[0146] Las variantes individuales obtenidas de la biblioteca SEL del ejemplo 4 se analizaron para expresión, actividad en un sustrato de amilosa y actividad en un sustrato de amilopectina. La amilosa es un componente lineal de almidón que consiste en residuos de glucosa en enlaces a-1,4. Las moléculas de almidón en amilosa son prolongadas y se parecen a las moléculas de almidón encontradas en haces de almidón. La amilopectina es un componente ramificado de almidón, que consiste en enlaces a-1,6 y enlaces a-1,4.
[0147] Los resultados se muestran en las figuras 8 y 9. Números de posición del aminoácido (Pos) y los residuos naturales presentes en estas posiciones (NAT.) se muestran en las columnas 1 y 2, respectivamente. Las sustituciones del aminoácido presentes en las posiciones indicadas en las variantes analizadas se muestran en las 20 columnas adyacentes. El resaltado gris en las células indica que no se hizo una variante. Las células blancas indican que una variante no se expresa en niveles suficientes para permitir análisis adicionales. Variantes con sustituciones en las posiciones 2, 3, 88, 92, 251, 252, 253, 254, 256, 308, 316, 317, 318, 320, 321, 357, 400, 402 y 404 (con respecto al SEQ ID NO: 4) se analizaron para actividad en un sustrato de amilosa (figura 8) y sustrato de amilopectina (figura 9).
[0148] Los valores de los datos señalados como log (2) del índice de rendimiento (PI), en cuyo caso un número negativo indica actividad reducida en comparación con una amilasa del residuo de aminoácido natural en la posición indicada y un número positivo indica actividad aumentada en comparación con una amilasa con el residuo de aminoácido natural en la posición indicada, y donde cada cambio de unidad representa un factor de 2. Los datos de las mutaciones que aumentan la actividad en el sustrato se muestran en negrita. El número de variantes analizadas (N.°), los valores máximos de log (2) del PI (Máx.), el número de variantes con log (2) del PI mayor que -2 (# <-2), el porcentaje de variantes con log (2) del PI mayor que 2 (% >-2), el número de variantes con log (2) del PI mayor que -1 (# <-1), el porcentaje de variantes con log (2) del PI mayor que -1 (% >-1), el número de variantes con log (2) del PI mayor que 0 (# <0), el porcentaje de variantes con log (2) del PI mayor que 0 (% >0), y los valores promedio de log (2) del PI (Prom.) se indican en las columnas siguientes.
[0149] Las sustituciones en las posiciones 92, 251, 254, 256, 317, 318, 320 y 321 (con respecto al SEQ ID NO: 4), mejoraron la actividad en el sustrato de amilosa. Las sustituciones en las posiciones 253 y 256 mejoraron la actividad en el sustrato de amilosa. Las sustituciones concretas que mejoraron la actividad en el sustrato de amilosa fueron S92L, R251A, R251C, R251D, R251E, R251F, R251G, R251H, R251L, R251M, R251N, R251Q, R251S, R251T y R251W, T254H, T254K, T254W y T254Y, K256A, K256E, K256T y K256V, S317C y S317R, N318A N318F, N318H, N318K, N318Q y N318R, T320A, T320H, T320M, T320N y T320P, y K321D, K321G, K321I y K321T. La sustitución de R251 y K256 por otros residuos de aminoácidos por lo general resulta en actividad aumentada en el sustrato de amilosa.
[0150] Las sustituciones en las posiciones N88, A252, A253, N308, A316, S357, T400, R402 y D403 no resultaron en una mejora de la actividad del sustrato de amilosa ni en una disminución en la actividad, mientras que las sustituciones en las posiciones N4, G5, T38, N93, G94, I95, Q96, V97, Y230, G255, V315, P319, A322, L354, T355, R356, G359, Y396, A397, Y398, G399 y Q401 resultaron en una reducción de la expresión (con respecto al SEQ ID NO: 4).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Método para producir una variante de polipéptido de a-amilasa que presenta alteración en la unión a haces de almidón, en el que se alinean polímeros individuales de almidón, en comparación con un polipéptido parental de a-amilasa, que comprende:
introducir en la secuencia amino de un polipéptido de a-amilasa parental de familia 13 una mutación en un residuo de aminoácido en el surco de unión de almidón que se une a unos haces de almidón, donde la mutación altera la unión de haces de almidón a la variante de polipéptido de a-amilasa en comparación con el polipéptido de a-amilasa parental;
donde el surco de unión de almidón se forma mediante residuos de aminoácidos en la hélice a que precede a la primera cadena p en el dominio A, el bucle entre la sexta hélice a y la séptima cadena p en el dominio A, el bucle entre la séptima hélice a y la octava cadena p en el dominio A, y el bucle que conecta el dominio A y el dominio C;
el surco de unión de almidón corresponde a los residuos de aminoácidos 1-6, 36, 38, 91-97, 224-226, 249-257, 278-282, 309-320, 354-359, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 2 para la numeración, a los residuos de aminoácidos 1-6, 37, 39, 92-98, 227-229, 252-260, 281-285, 312-323, 357-362, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 3 para la numeración, o a los residuos de aminoácidos 1-4, 36, 38, 91-97, 226-228, 251-259, 280-284, 311-322, 356-361, 363, 391, y 395-402, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración; y
donde el compuesto parental presenta al menos un 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto al SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5.
2. Método de la reivindicación 1, donde la mutación se da en un residuo de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácidos 92, 251, 254, 256, 317, 318, 320 o 321, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
3. Método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde la mutación consiste en la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a R251 o K256 con un residuo de aminoácido diferente, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
4. Método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la mutación consiste en la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 92 en el SEQ ID NO: 4 con L, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 251 en el SEQ ID NO: 4 con A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, Q, S, T o W, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 254 en el SEQ ID NO: 4 con H, K, W o Y, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 256 en el SEQ ID NO: 4 con A, E, T o V, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 317 en el SEQ ID NO: 4 con C o R, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 318 en el SEQ ID NO: 4 con A, F, H, K, Q o R, la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 320 en el SEQ ID NO: 4 con A, H, M, N o P, o la sustitución del residuo natural en una posición correspondiente a la posición 321 en el SEQ ID NO: 4 con D, G, I o T.
5. Método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la mutación corresponde a S92L, R251A, R251C, R251D, R251E, R251F, R251G, R251H, R251L, R251M, R251N, R251Q, R251S, R251T o R251W, T254H, T254K, T254W o T254Y, K256A, K256E, K256T o K256V, S317C o S317R, N318A N318F, N318H, N318K, N318Q o N318R, T320A, T320H, T320M, T320N o T320P, y/o K321D, K321G, K321I o K321T, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
6. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la variante además comprende residuos de aminoácidos naturales en una o más posiciones correspondientes a N88, A252, A253, N308, A316, S357, T400, R402 y D403, con respecto al SEQ iD NO: 4 para la numeración.
7. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la variante además comprende residuos de aminoácidos naturales en una o más posiciones correspondientes a N4, G5, T38, N93, G94, I95, Q96, V97, Y230, G255, V315, P319, A322, L354, T355, R356, G359, Y396, A397, Y398, G399 y Q401 en el SEQ ID NO: 4, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
8. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la variante además comprende N en la posición 88, A en la posición 252, A en la posición 253, N en la posición 308, A en la posición 316, S en la posición 357, T en la posición 400, R en la posición 402 o D en la posición 403, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración. 4.
9. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la variante además comprende N en la posición 4, G en la posición 5, T en la posición 38, N en la posición 93, G en la posición 94, I en la posición 95, Q en la posición 96, V en la posición 97, Y en la posición 230, G en la posición 255, V en la posición 315, P en la posición 319, A en la posición 322, L en la posición 354, T en la posición 355, R en la posición 356, G en la posición 359, Y en la posición 396, A en la posición 397, Y en la posición 398, G en la posición 399 y Q en la posición 401, con respecto al SEQ ID NO: 4 para la numeración.
10. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la unión relativa a almidón se determina por medio de ciclodextrina.
11. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la variante presenta al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto al SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5.
12. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el compuesto parental presenta al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto al SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5.
13. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la variante presenta licuefacción de almidón, sacarificación de almidón o rendimiento de lavado mejorados en comparación con el compuesto parental.
14. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la variante presenta actividad de hidrólisis aumentada en un sustrato de amilosa en comparación con el compuesto parental.
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