ES2300100T3

ES2300100T3 - Metodos para el diseño de peptidos de epitodo recombinado.

Info

Publication number: ES2300100T3
Application number: ES92922494T
Authority: ES
Inventors: Bruce L. Rogers; Jay P. Morgenstern; Julian F. Bond; Richard D. Garman; Mei-Chang Kuo; Malcolm Morville; Julia Greenstein
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1992-10-16
Publication date: 2008-06-01
Anticipated expiration: 2012-10-16
Also published as: PT100978A; IL103456A; AU682658B2; FI941758L; NO941370D0; JP4246794B2; AU2794092A; FI941758A0; HUT70263A; NO316073B1; NZ244782A; FI109809B; JPH07503362A; NO941370L; CA2121498A1; ATE382699T1; WO1993008280A1; HU9401109D0; NZ299122A; EP0610335B1

Abstract

LA INVENCION SUMINISTRA PEPTIDOS QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD ESTIMULANTE DE LAS CELULAS T DENOMINADOS PEPTIDOS RECOMBITOPOS. LOS PEPTIDOS RECOMBITOPOS DE LA INVENCION COMPRENDEN PREFERIBLEMENTE AL MENOS DOS EPITOPOS DE LAS CELULAS T DE LOS MISMOS O DE DIFERENTES ANTIGENOS DE PROTEINAS, Y PREFERIBLEMENTE COMPRENDEN AL MENOS DOS REGIONES, CADA REGION PREFERIBLEMENTE TIENE ACTIVIDAD ESTIMULANTE DE LAS CELULAS T Y CADA REGION COMPRENDE AL MENOS UN EPITOPO DE LAS CELULAS T DERIVADO DE UN ANTIGENO DE LA PROTEINA. LOS PEPTIDOS RECOMBITOPOS DE LA INVENCION PUEDEN DERIVARSE DE AUTOANTIGENOS, ALERGENOS DE LA PROTEINA, U OTROS ANTIGENOS DE LA PROTEINA. TAMBIEN SE SUMINISTRAN METODOS PARA DIAGNOSTICAR LA SENSIBILIDAD A UN ALERGENO DE LA PROTEINA U OTRO ANTIGENO DE LA PROTEINA A UN INDIVIDUO. METODOS PARA TRATAR DICHA SENSIBILIDAD Y COMPOSICIONES TERAPEUTICAS QUE COMPRENDEN UNO O MAS PEPTIDOS RECOMBITOPOS. LA INVENCION SUMINISTRA ADEMAS METODOS PARA DISEÑAR LOS PEPTIDOS RECOMBITOPOS DE LA INVENCION EN LOSQUE EL ANTIGENO DE LA PROTEINA AL CUAL ES SENSIBLE EL INDIVIDUO TIENE EPITOPOS DE LAS CELULAS T DESCONOCIDOS O MAL DEFINIDOS.

Description

Métodos para el diseño de péptidos de epítopo recombinado.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos T pueden mediar y regular tanto los mecanismos efectores específicos como los no específicos de las respuestas inmunes. Los linfocitos T CD4+ ayudan a la producción de anticuerpos y secretan citoquinas que modulan el crecimiento de otras células T y el crecimiento y diferenciación de otras células inmunes, como los monocitos y los granulocitos. Algunos estudios bioquímicos y funcionales han demostrado que la generación de respuestas celulares inmunes depende de los receptores de antígeno en las células T que reconocen fragmentos peptídicos de proteínas foráneas asociadas con productos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) que se expresan en células accesorias presentadoras de antígeno. Algunos avances recientes en tecnología han hecho posible cultivar eficazmente células T antígeno-específicas humanas y de ratón y clones in vitro. Además, es posible producir grandes cantidades de proteínas antígénicas o sus fragmentos usando tecnología de ADN recombinante o síntesis de péptidos en fase sólida. Así, en los últimos años, varios grupos de investigación han empezado a determinar las secuencias lineales de aminoácidos de proteínas antigénicas que son reconocidas por células T en asociación con MHC (epítopos de células T).

La capacidad de estimular las células T específicas de los antígenos se ha examinado en péptidos derivados de una variedad de proteínas antigénicas, incluyendo patógenos bacterianos y víricos, autoantígenos, alérgenos y otros antígenos experimentales, como la lisozima de huevo de gallina (HEL, por sus siglas en inglés), la ovoalbúmina (OVA) y el represor lambda (cl). Se ha indicado un amplio espectro de péptidos que sirven como epítopos de células T. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos 324-339 de OVA (Shimonkevitz, R. et al., J. Immunol., 133:2167 (1984)), los residuos de aminoácidos 74-96 de HEL (Shastri, N. et al., J. Exp. Med. 164:882-896 (1986); y los residuos de aminoácidos 12-26 del represor lambda (cl) (Lai, M.-Z et al., J. Immunol., 139:3973-3980 (1987)) han demostrado que activan de forma eficaz las células T cebadas con toda la proteína. Recientemente se ha demostrado que un péptido derivado del antígeno de superficie de la hepatitis B (residuos de aminoácidos 19-33 de HBsAg) estimula la respuesta de las células T en la mayoría de sujetos humanos que han sido inmunizados con una vacuna de hepatitis B recombinante (Schad, V.C. et al., Seminars in Immunol., 3:217-224 (1991)). También se ha realizado el mapeo de epítopos de una gran proteína antigénica micobacteriana de 65-kD (Lamb, J.R. et al., EMBO J., 6(5):1245-1249 (1987)). Se han identificado epítopos de células T en los péptidos comprendidos por los residuos de aminoácidos 112-132 y 437-459 de la proteína de 65-kD. También se ha realizado un mapeo de epítopos de la proteína básica de mielina (MBP, por sus siglas en inglés), un autoantígeno que induce la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y el presunto autoantígeno en la esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés), tanto en sistemas humanos (Ota, K. et al., Nature, 346:183-187 (1990)) como en roedores (Zamvil et al., Nature, 324:258-260(1986)). Ota et al. han identificado un epítopo principal de las células T, reconocido en pacientes de MS, los residuos 84-102 de MBP. También se han descrito los epítopos menores (residuos de aminoácidos 143-168, 61-82, 124-42 y 31-50 de MBP, reconocidos en células T de pacientes de MS. Zamvil et al. también muestran que el residuo de aminoácidos 1-11 de MBP contiene el principal o principales epítopos de células T causantes de EAE, en cepas susceptibles de roedores.

Muy recientemente se han descrito los epítopos de células T presentes en proteínas alergénicas (O'Hehir, R. et al., Ann. Rev. Immunol., 9:67-95 (1991)). Se ha mostrado que varios péptidos derivados del alérgeno Der p de los ácaros del polvo doméstico son reactivos a las células T (Thomas, W.R., et al. en: Epitopes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlín (Sept. 1989) pp. 77-82; O'Hehir, R.E. Annual Review Immunology 9:67-95 (1991); Stewart, G.A. et al en: Epitopes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlín (Sept. 1989) pp. 41-47; y Yessel, H. et al. en: T Cell Activation in Health and Disease: Discrimination Between Immunity and Tolerance, Conference 22-26 (Sept. 1990) Trinity College, Oxford Reino Unido.). También se ha observado un péptido estimulante de las células T derivado del corto residuo de aminoácidos 54-65 del alérgeno Amb a I de la ambrosía (Rothbard, J.B. et al., Cell, 52: 515-523 (1988). Usando un panel de clones de células T derivados de un individuo alérgico al raigrás, Perez et al. demostraron que los epítopos de células T se encontraban al interior de los residuos de aminoácidos 191-210 de la proteína alergénica Lol p I (Perez, M. et al., J. Biol. Chem., 265(27):16210-16215 (1990)).

En la patente W091/06571 se revela un método para diseñar péptidos aislados con actividad estimulante de las células T, que comprende las etapas: i) revisar la estructura conocida de una proteína alergénica; ii) cortar la proteína alergénica en al menos dos regiones, y iii) determinar si los péptidos correspondientes a dichas dos regiones tienen actividad estimulante de las células T.

Métodos para diseñar péptidos recombitópicos aislados con actividad estimulante de las células T en que la proteína antigénica a la cuál es sensible el individuo tiene epítopos de células T desconocidos o mal definidos (por ejemplo, algunas o todas las regiones peptídicas de la proteína antigénica que tienen actividad estimulante de las células T humanas hacia la proteína antigénica no han sido definidas mediante técnicas estándar de biología de células T, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, editado por Coligan, J.E. et al., volumen 1, (1991), o los epítopos precisos de células T humanas de la proteína antigénica no han sido definidos por técnicas de mapeo fino). Según un método, se revisa la estructura conocida de la proteína de un alérgeno u otra proteína antigénica y el alérgeno u otro antígeno se dividen teóricamente en al menos dos regiones peptídicas de longitudes deseadas. Teóricamente significa que es algo que de hecho no sucede, sino que es un proceso pensado, por ejemplo, sucede sobre el papel o en la mente de alguien. Esta división puede ser arbitraria, se puede realizar según un algoritmo, o se puede basar total o parcialmente en regiones de la proteína antigénica de las que se sabe que tienen actividad estimulante de las células T, preferiblemente actividad estimulante de las células T humanas. Cuando sólo se conocen unas pocas regiones de una proteína antigénica que tienen actividad estimulante de las células T o cuando se desconocen todas las regiones de la proteína antigénica que tienen actividad estimulante de las células T, de preferencia al menos el 50% y mejor aún toda la proteína se divide en regiones peptídicas de longitudes deseadas. Entonces las regiones peptídicas se disponen teóricamente para formar al menos un péptido recombitópico en el que las regiones se reordenan en un orden no contiguo. Posteriormente, se produce al menos un péptido recombitópico con una configuración reordenada y se determina la capacidad del péptido recombitópico para estimular las células T humanas. En otra realización, se analiza la capacidad de tener actividad estimulante de las células T humanas observada en un péptido recombitópico para determinar la capacidad de unir inmunoglobulinas específicas para el alérgeno u otro antígeno, o se analiza para determinar la ausencia de otra propiedad no deseada (por ejemplo, actividad proteasa).

Breve descripción de las figuras

En la figura 1 se representa la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos deducida de la cadena 1 de la Proteína Felina Reactiva de células T humanas (TRFP, por sus siglas en inglés) que incluye las secuencias líder A y B.

En la figura 2 se representa la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos deducida de la cadena 2 de TRFP que incluye una secuencia líder.

La figura 3 es una representación gráfica que describe la respuesta de células T aisladas de pacientes alérgicos a los gatos y cebada con TRFP purificada por afinidad para superponer los péptidos TRFP analizados mediante suma escalonada de respuestas peptídicas.

En la figura 4 se representan las secuencias de aminoácidos del péptido X, el péptido Y, el péptido Z, el péptido A y el péptido B de TRFP, conteniendo cada uno de ellos al menos un epítopo de células T de TRFP.

La figura 5 es una representación esquemática de la construcción de un péptido recombitópico YZX usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La figura 6 es una representación esquemática de la construcción de un péptido recombitópico AYZXB usando técnicas de PCR.

La figura 7 es la secuencia de ácidos nucleicos de los oligonucleótidos C, D, E, F, G, H e I usados en la construcción de un péptido recombitópico YZX y los oligonucleótidos J, K, L, M, N y O usados en la construcción del péptido recombitópico AYZXB.

En la figura 8 se representa la secuencia de ácidos nucleicos (utilizando codones de expresión E. coli) y la secuencia de aminoácidos deducida que comprende el péptido recombitópico YZX. Se muestra el sitio de escisión de una trombina.

La figura 9 es una representación esquemática de la construcción de un péptido recombitópico YZX usando técnicas de PCR con ADNc aislado de TRPF como molde.

En la figura 10 se representa la secuencia de ácidos nucleicos de los cebadores usados en la construcción de los péptidos recombitópicos XZY, YXZ y ZXY.

La figura 11 es una representación gráfica de la secuencia de ácidos nucleicos de los cebadores individuales usados en la construcción de los péptidos recombitópicos XZY, YXZ y ZXY.

La figura 12 es una representación esquemática de la construcción de un péptido recombitópico derivado de la fosfolipasa A_{2}, que tiene epítopos de células T mal definidos.

La figura 13 es una representación de los resultados del análisis de inmunoelectrotransferencia SDS/PAGE, que detecta la unión de la IgE humana obtenida de un individuo alérgico a los gatos con varias muestras de proteínas, incluyendo los péptidos recombitópicos XYZ, XZY, YXZ, YZX, ZXY y ZYX.

La figura 14 es una representación gráfica de los resultados del análisis ELISA que ilustra la unión de la IgE humana obtenida de un individuo alérgico a los gatos con varias muestras de proteínas, incluyendo los péptidos recombitópicos XYZ, XZY, YXZ, YZX, ZXY y ZYX.

Las figuras 15a, 15b y 15c son representaciones gráficas que presentan las respuestas de líneas de células T de tres pacientes cebadas in vitro para TRFP, el péptido recombitópico YXZ, o el péptido recombitópico YZX, y analizándose la respuesta a varios péptidos.

La figura 16 es una representación gráfica que presenta respuestas a murina de células T inmunizadas con el péptido recombitópico YZX y analizándose su respuesta in vitro hacia cultivos con el péptido recombitópico YZX como se midió en la producción de IL-2.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para diseñar péptidos aislados, los denominados péptidos recombitópicos, que poseen simultáneamente actividad estimulante de las células T, como la inducción de la proliferación de células T, la secreción de linfoquinas y/o la tolerización/anergia de células T. Los péptidos recombitópicos tienen preferiblemente actividad estimulante de las células T humanas y son útiles en el diagnóstico y tratamiento de la sensibilidad a una proteína alergénica, un autoantígeno u otra proteína antigénica en seres humanos. En general, los péptidos recombitópicos preferidos comprenden al menos dos regiones derivadas de la misma proteína o de diferentes proteínas alergénicas u otras proteínas antigénicas, teniendo preferiblemente cada región actividad estimulante de células T, como la determinada por técnicas estándar de biología de células T, comprendiendo así al menos un epítopo de células T. Para determinar los epítopos precisos de células T mediante, por ejemplo, técnicas de mapeo fino, las regiones peptídicas que comprenden al menos un epítopo de células T que han sido definidas por técnicas estándar de biología de células T pueden ser modificadas por adición o deleción de residuos de aminoácidos, ya sea en el extremo amino o bien en el carboxi de las regiones peptídicas, y pueden ser analizadas para determinar un cambio en la reactividad de las células T frente al péptido modificado. Además, si se encuentra que dos o más regiones peptídicas que comparten un área de solapamiento tienen actividad estimulante de células T humanas, como se determina por técnicas estándar de biología de células T, se pueden producir péptidos adicionales que comprendan la totalidad o una porción del dichas regiones peptídicas y estos péptidos adicionales se pueden analizar mediante los procedimientos de mapeo fino indicados anteriormente. Como resultado del mapeo fino, se puede producir un conjunto de epítopos de célula T humanos que comprenden residuos de aminoácidos esenciales para el reconocimiento de la
célula T.

Los péptidos recombitópicos se pueden producir por técnicas de ADN recombinante en una célula huésped transformada con una secuencia de ácido nucleico codificante para dicho péptido recombitópico, o por síntesis química, o en ciertas situaciones limitadas, mediante rotura química de una proteína alergénica u otra proteína antigénica. Cuando son producidas por técnicas recombinantes, las células huésped transformadas con ácidos nucleicos codificantes de un péptido recombitópico son cultivadas en un medio apropiado para las células, y los péptidos recombitópicos se pueden purificar a partir del medio de cultivo celular, de células huésped, o de ambos, usando técnicas conocidas en esta especialidad para la purificación de péptidos o proteínas, que incluyen cromatografía de intercambio iónico, enfoque isoeléctrico, cromatografía de gel-filtración, ultrafiltración, electroforesis o inmunopurificación con anticuerpos específicos para el péptido recombitópico, la proteína alergénica u otro antígeno del que se derive el péptido recombitópico, o una porción de ellos. Así, un aspecto de esta invención proporciona un péptido recombitópico producido en una célula huésped transformada mediante una secuencia de ácido nucleico codificante para un péptido recombitópico, o el equivalente funcional de la secuencia de ácido nucleico. Los péptidos recombitópicos de la invención se aíslan de tal forma que el péptido recombitópico está esencialmente exento de material celular o medio de cultivo si se ha producido por técnicas de ADN recombinante, o esencialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente, o se obtiene por rotura química de una proteína alergénica u otra proteína antigénica.

Para obtener los péptidos recombitópicos preferidos de la presente invención que comprenden al menos dos epítopos de células T de una proteína alergénica u otra proteína antigénica o al menos dos regiones, comprendiendo cada una de ellas al menos un epítopo de células T de una proteína alergénica u otro antígeno, disponiéndose los epítopos de células T o las regiones que contienen epítopo(s) de células T en una configuración diferente de la configuración natural de los epítopos o regiones de células T en el alérgeno o antígeno. Por ejemplo, los epítopos de células T o las regiones que contienen epítopo(s) de células T se pueden suponer en una configuración no contigua y pueden derivar preferiblemente de la misma proteína alergénica u otro antígeno. Se define como no contigua la disposición de aminoácidos que comprenden epítopos de células T o regiones que contienen epítopo(s) de células T que es diferente a la de una secuencia de aminoácidos presente en la proteína alergénica u otra proteína antigénica a partir de la cuál se derivan los epítopos o regiones. Además, los epítopos de células T o regiones que contienen epítopo(s) de células T no contiguos se pueden disponer en un orden no secuencial (por ejemplo, en un orden diferente del orden de los aminoácidos de la proteína alergénica nativa u otra proteína antigénica a partir de la cuál se derivan los epítopos de células T o la región que contiene epítopo(s) de células T, en la que los aminoácidos se disponen desde un extremo amino a un extremo carboxi). Un péptido recombitópico preferido comprende al menos un 15%, de preferencia al menos un 30%, incluso más preferiblemente al menos un 50% y en el mejor de los casos hasta un 100% de los epítopos de células T de una proteína alergénica u otra proteína antigénica.

Cuando los epítopos de células T de una proteína alergénica u otra proteína antigénica son desconocidos o están mal definidos (por ejemplo, varias de las regiones peptídicas de la proteína antigénica que tienen actividad estimulante de células T humanas no han sido definidas por técnicas estándar de biología de células T o bien los epítopos precisos de célula T humanas de la proteína antigéncia no han sido definidos por técnicas de mapeo fino) se puede obtener un péptido recombitópico revisando la estructura conocida de la proteína de un alérgeno u otro antígeno y dividiendo teóricamente el alérgeno o antígeno en al menos dos regiones peptídicas de longitudes deseadas. Por ejemplo, la secuencia de la proteína del alérgeno u otro antígeno se puede dividir sistemáticamente en al menos dos regiones peptídicas no solapadas de longitudes deseadas, o al menos dos regiones peptídicas solapadas de longitudes deseadas y dispuestas teóricamente para formar al menos un péptido recombitópico en el que al menos dos regiones se han reordenado en un orden no contiguo y preferiblemente no secuencial. Esta división en regiones peptídicas puede ser arbitraria, se puede realizar según un algoritmo, o se puede basar total o parcialmente en regiones de la proteína antigénica para comprender al menos un epítopo de células T.

Cuando sólo se conocen unas pocas regiones de una proteína alergénica u otra proteína antigénica que comprende al menos un epítopo de células T o cuando se desconocen todas las regiones de la proteína alergénica u otra proteína antigénica que tienen actividad estimulante de las células T, se divide de preferencia al menos el 50% de toda la secuencia proteica de la proteína alergénica u otra proteína antigénica y mejor aún toda la secuencia proteica de la proteína alergénica u otra proteína antigénica y se reordena en uno o varios péptidos recombitópicos. El propósito de usar porcentajes tan grandes de la secuencia proteica de la proteína antigénica en la formación del péptido recombitópico es que el péptido recombitópico resultante comprenda al menos un 15%, de preferencia al menos un 30%, mejor aún al menos un 50% y en el mejor de los casos hasta un 100% de los epítopos de células T de la proteína antigénica. Por supuesto, si cada una de las pocas regiones peptídicas de la proteína antigénica que se sabe que comprenden al menos un epítopo de células T constituyen el porcentaje mencionado arriba de epítopos de células T de la proteína antigénica y dichas regiones peptídicas no constituyen al menos el 50% de toda la secuencia proteica de la proteína antigénica, entonces no es necesario usar un porcentaje tan grande de la secuencia proteica entera para formar el péptido recombitópico. Según este método, los péptidos recombitópicos se pueden producir entonces por medios recombinantes o sintéticos y se puede determinar la capacidad del péptido recombitópico para estimular las células T humanas. Cuando el péptido recombitópico comprende regiones derivadas de una proteína alergénica, se puede producir y analizar cada una de las regiones peptídicas para determinar qué regiones unen inmunoglobulina E específica para el alérgeno y cuáles de dichas regiones causarían la liberación de mediadores (por ejemplo, histaminas) a partir de mastocitos o basófilos. Estas regiones peptídicas que, como se ha observado, se unen a inmunoglobulina E y causan la liberación de mediadores a partir de mastocitos o basófilos en más de aproximadamente un 10-15% de los sueros alérgicos analizados, no se incluyen de preferencia en las regiones peptídicas dispuestas para formar péptidos recombitópicos.

La construcción de un péptido recombitópico derivado de fosfolipasa A_{2}, un alérgeno importante del veneno de la abeja doméstica, se puede usar como ejemplo ilustrativo de la construcción de un péptido recombitópico cuando se conoce la estructura proteica de una proteína antigénica, pero se desconocen o están mal definidos los epítopos de las células T. La fosfolipasa A_{2} se compone de 134 aminoácidos, como se define por clonaje de ADNc (Kuchler, K. et al. Eur. J. Biochem. 184:249-254). Esta secuencia de aminoácidos se puede dividir en regiones que contienen cada una preferiblemente 20 a 35 residuos de aminoácidos, solapándose preferiblemente cada región con otra región de unos 10 aminoácidos (véase figura 12). Aunque la figura 12 muestra la secuencia proteica entera de la proteína dividida en regiones, la secuencia total usada para formar al menos un péptido recombitópico puede ser considerablemente menor que la secuencia proteica entera. Para incrementar el potencial de incluir epítopos de células T en el péptido recombitópico construido se pueden diseñar las áreas de solapamiento y la longitud de cada región para mantener la presencia de los epítopos de células T previstos usando algoritmos (Rothbard, J. y Taylor, W.R. EMBO J. 7:93-100 (1988); Berzofsky, J.A. Philos Trans R. Soc. Lond. 323:535-544 (1989)). Preferiblemente, los epítopos de células T humanas del interior de una proteína alergénica se pueden predecir usando HLA de clase II conocidos que se unen específicamente con residuos de aminoácidos específicos. Además, para minimizar la probabilidad de que el péptido recombitópico construido se una a IgE alérgicas, se puede diferenciar la secuencia de aminoácidos del péptido recombitópico resultante respecto a la secuencia de la estructura nativa de fosfolipasa A_{2} desordenando las regiones y/o transponiendo regiones amino terminales o carboxi terminales al extremo opuesto de la molécula (es decir, los residuos de aminoácidos localizados en el extremo amino de la proteína nativa se pueden situar en el extremo carboxi del péptido recombitópico). Se puede utilizar un procedimiento similar para construir un péptido recombitópico derivado de un autoantígeno con una estructura proteica conocida, pero con epítopos de células T no definidos, como ácido glutámico descarboxilasa (por ejemplo, Samama, J.P., y Mallet, J. Journal of Neurochemistry 54:703-705 (1990)), insulina (Joslin's Diabetes Mellitus, 12th Edition, Eds. A. Marble et al., Lea & Febiger, Philadelphia, p. 67 (1985)), etc. Es esta situación, las regiones peptídicas se disponen en una configuración diferente de la configuración natural de las regiones en el autoantígeno para eliminar una propiedad no deseada del autoantígeno, como la unión a inmunoglobulina o la actividad enzimática.

Los péptidos recombitópicos que comprenden al menos dos regiones derivadas de un alérgeno u otro antígeno se analizan para determinar los péptidos recombitópicos que tienen actividad estimulante de células T (es decir, proliferación, secreción de linfoquinas y/o inducción de anergia/tolerización de células T) y que, de este modo, comprenden al menos un epítopo de células T. Por ejemplo, la actividad estimulante de células T humanas se puede analizar cultivando células T obtenidas de un individuo sensible a una proteína alergénica o una proteína antigénica (es decir, un individuo que tiene respuesta inmune a la proteína alergénica o a la proteína antigénica) con un péptido recombitópico derivado de la proteína alergénica o antígeno y determinante de la presencia de proliferación en las células T en respuesta al péptido recombitópico. Como se describe detalladamente en los ejemplos, los índices de estimulación para las respuestas en células T frente a péptidos recombitópicos se pueden calcular como el máximo CPM en la respuesta al péptido recombitópico dividido por el CPM del medio de control. Como se usa a lo largo de esta aplicación, la actividad estimulante de células T humanas se define como un índice de estimulación de al menos 2,0. Un índice de estimulación de al menos 2,0 se considera positivo para definir péptidos recombitópicos útiles como agentes inmunoterapéuticos. Los péptidos recombitópicos preferidos tienen un índice de estimulación de al menos 2,5, de preferencia al menos 3,5, y mejor aún al menos 5,0.

Además, los péptidos recombitópicos preferidos de la invención derivados de proteínas alergénicas no se unen a la inmunoglobulina E (IgE) o se unen a ella en una medida mucho menor que la(s) proteína(s) alergénica(s) de las que derivan los péptidos. Las complicaciones principales de la inmunoterapia estándar son las respuestas sistemáticas, como la anafilaxis. La inmunoglobulina E es un mediador de las reacciones anafilácticas que resultan de la unión e interconexión de un antígeno con la IgE en mastocitos o basófilos, y la liberación de mediadores (por ejemplo, histamina, serotonina, factores quimiotácticos para eosinófilos). Así, la anafilaxis se puede evitar mediante el uso de un péptido recombitópico que no se une a IgE, o si el péptido recombitópico se une a IgE, haciendo que esta unión no tenga como resultado la liberación de mediadores (por ejemplo, histamina, etc.) desde mastocitos hasta basófilos. Además, los péptidos recombitópicos que tienen una mínima actividad estimulante de la IgE son particularmente útiles por su eficacia terapéutica. La mínima actividad estimulante de IgE se refiere a la producción de IgE que es menor que la cantidad producida de IgE y/o IL-4 estimulada por la proteína alergénica entera.

Cuando se administra un péptido recombitópico de la invención derivado de una proteína alergénica a un individuo sensible a la proteína alergénica, es capaz de modificar la respuesta alérgica del individuo frente al alérgeno. En particular, cuando se administran péptidos recombitópicos que comprenden al menos dos epítopos de células T de una proteína alergénica o al menos dos regiones derivadas de una proteína alergénica, comprendiendo preferiblemente cada región al menos un epítopo de células T, a un individuo sensible a la proteína alergénica, son capaces de modificar la respuesta de las células T del individuo frente al alérgeno. Como se usa aquí, la modificación de la respuesta alérgica de un individuo sensible a una proteína alergénica se puede definir como no reacción o disminución de los síntomas frente al alérgeno, como se determina en procedimientos clínicos estándar (véase, por ejemplo, Varney et al., British Medical Journal 302: 265-269 (1990)).

Como resultado del trabajo descrito aquí se han producido péptidos recombitópicos derivados de proteínas alergénicas u otras proteínas antigénicas que tienen actividad estimulante de células T o preferiblemente comprenden dos regiones con al menos un epítopo de células T cada una. Se cree que los epítopos de células T participan en la iniciación y perpetuación de la respuesta inmune frente a una proteína alergénica u otra proteína antigénica que es responsable de los síntomas clínicos de la alergia u otras enfermedades. Se cree que estos epítopos de células T desencadenan eventos tempranos al nivel de la célula T ayudante, uniéndose a una molécula HLA apropiada en la superficie de una célula presentadora de antígeno y estimulando la subpoblación relevante de células T. Estos eventos conducen a la proliferación de células T, la secreción de linfoquinas, las reacciones inflamatorias locales, el reclutamiento de células adicionales inmunes al sitio, y la activación de la cascada de células B que conduce a la producción de anticuerpos. Un isotipo de estos anticuerpos, IgE, es fundamentalmente importante para el desarrollo de los síntomas alérgicos y su producción es influenciada de forma temprana en la cascada de eventos, al nivel de la célula T ayudante, por la naturaleza de las linfoquinas secretadas. Un epítopo de célula T es el elemento básico o la unidad más pequeña de reconocimiento por un receptor de células T, que comprende el epítopo los aminoácidos esenciales para el reconocimiento del receptor y puede ser contiguo y/o no contiguo en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Un epítopo de células T, como se usa aquí, tiene un índice de estimulación de al menos 2,0, de preferencia al menos 2,5, mejor aún al menos 3,5, y en el mejor de los casos al menos 5,0. Están dentro del alcance de esta invención las secuencias de aminoácidos que mimetizan las de los epítopos de células T y que modifican la respuesta alérgica frente a una proteína alergénica.

La exposición de pacientes a péptidos recombitópicos de la presente invención derivados de proteínas alergénicas u otras proteínas antigénicas puede tolerizar o anergizar subpoblaciones apropiadas de células T, que se vuelven insensibles a la proteína alergénica u otra proteína antigénica o no participan en la estimulación de una respuesta inmune contra dicha exposición. Además, la administración de un péptido recombitópico de la presente invención derivado de una proteína alergénica puede modificar el perfil de secreción de linfoquina en comparación con la exposición a la proteína alergénica o una porción de ella que ocurre de forma natural (por ejemplo, tiene como resultado una disminución de IL-4 y/o un incremento en IL-2). Además, la exposición al péptido recombitópico puede influir en las subpoblaciones de células T, que normalmente participan en la respuesta al alérgeno, de forma que estas células T son arrastradas desde el sitio o sitios de exposición normal al alérgeno (por ejemplo, mucosa nasal, piel y pulmón) hacia el sitio o sitios de administración terapéutica del péptido recombitópico. Esta redistribución de las subpoblaciones de células T puede mejorar o reducir la capacidad del sistema inmune de un individuo para estimular la respuesta inmune usual en el sitio normal de exposición al alérgeno, lo que tiene como resultado una disminución de los síntomas alérgicos.

Los péptidos recombitópicos de la invención comprenden preferiblemente al menos dos epítopos de células T (por ejemplo, el péptido recombitópico comprende al menos aproximadamente ocho residuos de aminoácidos, y preferiblemente al menos quince residuos de aminoácidos). Otros péptidos recombitópicos de la invención comprenden al menos dos regiones derivadas de la misma o de diferentes proteínas alergénicas u otras proteínas antigénicas, teniendo dichos péptidos recombitópicos actividad estimulante de células T y teniendo preferiblemente cada región actividad estimulante de células T humanas y comprendiendo consecuentemente al menos un epítopo de células T de una proteína alergénica u otra proteína antigénica. En general, cada una de dichas regiones de un péptido recombitópico comprende al menos aproximadamente siete residuos de aminoácidos de al menos una proteína alergénica. Cada una de dichas regiones de un péptido recombitópico comprende preferiblemente al menos dos epítopos de células T (por ejemplo, el péptido recombitópico comprende al menos aproximadamente ocho residuos de aminoácidos y preferiblemente al menos quince residuos de aminoácidos). Los péptidos recombitópicos de la invención pueden comprender tantos residuos de aminoácidos como se desee y preferiblemente comprenden al menos 7, de preferencia al menos aproximadamente 15, mejor aún al menos aproximadamente 30 y en el mejor de los casos al menos aproximadamente 40 residuos de aminoácido de una proteína alergénica o una proteína antigénica. Una región de un péptido recombitópico comprende preferiblemente una longitud de hasta 45 residuos de aminoácidos, de preferencia una longitud de hasta 40 residuos de aminoácidos y mejor aún una longitud de hasta 30 residuos de aminoácidos, ya que los incrementos en la longitud de una región de un péptido recombitópico pueden tener como resultado dificultades en la síntesis peptídica, así como la retención de propiedades indeseables (por ejemplo, unión a inmunoglobulinas o actividad enzimática) debido al mantenimiento de la similitud conformacional entre la región y la proteína alergénica u otra proteína antigénica de la que deriva. Si se desea, se pueden producir las secuencias de aminoácidos de las regiones y se pueden unir mediante un conector para incrementar la sensibilidad en el procesado por células presentadoras de antígeno. Dicho conector puede ser cualquier secuencia de aminoácidos no epitópicos u otro conector apropiado o agente de empalme.

Cuando los péptidos recombitópicos derivan de proteínas alergénicas, pueden comprender al menos dos regiones derivadas de diferentes proteínas alergénicas del mismo género, como: el género Dermatophagoides; el género Felis; el género Ambrosia; el género Lolium; el género Cryptomeria; el género Alternaria; el género Alder, el género Betula; el género Quercus; el género Olea; el género Artemisia; el género Plantago; el género Parietaria; el género Canine; el género Blattella, el género Apis; y el género Periplaneta. Además, los péptidos recombitópicos pueden comprender al menos dos regiones derivadas de especies con reactividad cruzada, por ejemplo, una región derivada de Dermatophagoides pteronyssinus y una región derivada de Dermatophagoides farinae. En otra realización, las regiones se pueden derivar de las mismas especies (por ejemplo, una región derivada de Der p I y una región derivada de Der p II; una región derivada de Der f I y una región derivada de Der f II; una región derivada de Amb a I y una región derivada de Amb a II; una región derivada de Lol p I y una región derivada de Lol p IX; y una región derivada de Cry j I y una región derivada de Cry j II). Además, los péptidos recombitópicos pueden contener al menos dos regiones derivadas de diferentes proteínas alergénicas del mismo grupo, como una región derivada de una proteína alergénica del grupo I de Dermatophagoides pteronyssinus (por ejemplo, Der p I) y una región derivada de una proteína alergénica del grupo I de Dermatophagoides farinae (por ejemplo, Der f I). De forma alternativa, las regiones se pueden derivar de diferentes proteínas alergénicas de la misma familia (por ejemplo, Amb a I.1, Amb a I.2, Amb a I.3 y Amb a I.4). Los péptidos recombitópicos particularmente preferidos para el tratamiento contra la sensibilidad para la especie Felis domesticus derivan del género Felis y comprenden regiones seleccionadas de los péptidos X, Y, Z, A y B, de TRFP, las secuencias de aminoácidos de cada péptido se muestran en la figura 4 y las modificaciones de ellas, como el péptico C, que es una adición de un aminoácido al péptido A, se muestra en la figura 4. Los péptidos recombitópicos preferidos comprenden el péptido YZX y el péptido AYZXB. A lo largo de la aplicación, las letras X, Y, Z, A, B y C se refieren respectivamente al péptido X, el péptido Y, el péptido Z, el péptido A, el péptido B y el péptido C y cuando las letras se usan juntas (por ejemplo YZX) nos referimos a un péptido recombitópico que comprende el péptido Y, el péptido Z y el péptido X en el orden secuencial especificado (es decir, YZX se refiere a un péptido recombitópico que comprende la secuencia de aminoácidos del péptido Y seguida inmediatamente, sin que intervenga ningún residuo de aminoácido, por la secuencia de aminoácidos del péptido Z, seguida inmediatamente, sin que intervenga ningún residuo de aminoácido, por la secuencia de aminoácidos del péptido X). Los péptidos recombitópicos de la invención, por ejemplo, YZX, pueden comprender residuos de aminoácidos adicionales tanto del extremo amino como del carboxi del péptido recombitópico.

Los péptidos recombitópicos de la invención se pueden derivar de proteínas antigénicas u otras proteínas alergénicas donde se desea la mejora o la supresión de la respuesta inmune antígeno-específica. Por ejemplo, las regiones que tienen actividad estimulante de células T humanas de una autoantígeno conocido involucradas en la patogénesis de una enfermedad autoinmune o los epítopos de células T de un autoantígeno conocido pueden ser identificadas y combinadas en un péptido recombitópico para reducir la respuesta de anticuerpos al autoantígeno, para interferir con eficacia y/o reducir los efectos secundarios relacionados con el complejo inmune. Para preservar la reactividad de las células T del autoantígeno, las regiones del autoantígeno que tienen actividad estimulante de células T humanas pueden ser definidas por técnicas estándar de biología de células T, o si se desea, se pueden definir los epítopos precisos de células T mediante técnicas de mapeo fino y se puede producir un péptido recombitópico que comprenda al menos dos regiones que tengan cada una actividad estimulante de células T humanas y que comprenda al menos un epítopo de células T. Por ejemplo, si en un autoantígeno se encontraran tres regiones con actividad estimulante de células T humanas o tres epítopos de células T en un orden secuencial y contiguo 1, 2, 3 desde un extremo amino hasta un extremo carboxi, se podrían producir de una vez en varios órdenes (por ejemplo, 213, 312, 132, 321, 123, 231) seis posibles péptidos recombitópicos utilizando cada región o cada epítopo de células T. En estos seis péptidos recombitópicos se podría analizar la capacidad de estimular la actividad de células T y la ausencia de una propiedad no deseada presente en el autoantígeno, por ejemplo, la incapacidad del/de los péptido(s) recombitópico(s) de unirse a anticuerpos. De forma alternativa, como se ha descrito previamente, los péptidos recombitópicos que estimulan las células T y no tienen las propiedades no deseadas del autoantígeno (por ejemplo, no se unen a anticuerpos en un porcentaje sustancial de individuos sensibles al autoantígeno) se seleccionan para su uso como productos inmunoterapéuticos o agentes de diagnóstico. En forma de una composición terapéutica, el péptido recombitópico se liberaría en un excipiente fisiológicamente aceptable en ausencia de adyuvante, para permitir que el péptido recombitópico induzca la tolerancia antígeno-específica al autoantígeno del cuál deriva el recombitopo y regularía cualquier respuesta inmune potencialmente dañina. Entre los autoantígenos útiles en la producción de péptidos recombitópicos está la insulina, la ácido glutámico descarboxilasa (64K), PM-1 y la carboxipeptidasa en la diabetes; la proteína básica de mielina en la esclerosis múltiple; el factor rh en la eritroblastosis fetal; los receptores de acetilcolina en la miastenia grave; los receptores tiroideos en la enfermedad de Graves; las proteínas de la membrana basal en el síndrome de Good Pasture; y las proteína tiroideas en la tiroiditis. Por ejemplo, las regiones que tienen actividad estimulante de células T humanas de la proteína básica de mielina (MBP); por ejemplo, una región que comprende la totalidad o una porción de los residuos de aminoácido 84-106, de preferencia 84-102 y mejor aún 89-101 de MBP humana y una región que comprende la totalidad o una porción de los residuos de aminoácido 140-172 y de preferencia 143-168 de MBP humana, puede comprender un péptido recombitópico de la invención para su uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple.

También es posible modificar la estructura de los péptidos recombitópicos para propósitos tales como aumentar su solubilidad, mejorar su eficacia terapéutica o preventiva, o la estabilidad (por ejemplo, la vida útil ex vivo, y la resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Se puede producir un péptido recombitópico modificado en el cuál se ha alterado la secuencia de aminoácidos, mediante sustitución, deleción o adición de aminoácidos, para modificar la inmunogenicidad y/o reducir la alergenicidad, o en el cuál se ha añadido un componente con el mismo propósito. Por ejemplo, los residuos de aminoácido esenciales para la función epítopo de células T se puede determinar usando técnicas conocidas (por ejemplo, sustitución de cada residuo y determinación de la presencia o ausencia de reactividad de células T). Estos residuos que han mostrado ser esenciales pueden ser modificados (por ejemplo, reemplazados por otro aminoácido cuya presencia muestre que mejora la reactividad de las células T), como también pueden modificarse aquellos aminoácidos que no sean necesarios para la reactividad de las células T (por ejemplo, reemplazándolos por otro aminoácido cuya incorporación mejore la reactividad de las células T, pero no reduzca la unión al MHC relevante). Otro ejemplo de una modificación de péptidos recombitópicos es la sustitución de los residuos de cisteína, preferiblemente con alanita, o ácido glutámico, o de forma alternativa con serina o treonina para minimizar la dimerización vía puentes disulfuro. Para mejorar la estabilidad y/o la reactividad, los péptidos recombitópicos también se pueden modificar para incorporar uno o varios polimorfismos en la secuencia de aminoácidos de una proteína alergénica resultante de la variación alélica natural. Asimismo se pueden sustituir o añadir D-aminoácidos, aminoácidos no naturales o análogos no-aminoácidos para producir un péptido modificado dentro del alcance de esta invención. Además, los péptidos recombitópicos se pueden modificar usando el método de polietilenglicol (PEG) de A. Sehon y colaboradores (Wie et al. supra) para producir un péptido conjugado con PEG. Las modificaciones de péptidos recombitópicos también pueden incluir la reducción/alquilación (Tarr en: Methods of Protein Microcharacterization, J.E. Silver ed. Humana Press, Clifton, NJ, pp. 155-194 (1986)); la acilación (Tarr, supra); la esterificación (Tarr, supra); acoplamiento químico a un soporte apropiado (Mishell y Shiigi, eds, Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, CA (1980); U.S. Patent 4,939,239); o el tratamiento suave con formalina (Marsh International Archives of Allergy and Applied Immunology 41: 199-215 (1971)).

Para facilitar la purificación y aumentar potencialmente la solubilidad de los péptidos recombitópicos, es posible añadir grupo(s) indicador(es) al esqueleto peptídico. Por ejemplo, se puede añadir polihistidina a un péptido recombitópico para purificar el péptido recombitópico en cromatografía de afinidad iónica sobre metal inmovilizado (Hochuli, E. et al., Bio/ Technology, 6: 1321-1235 (1988)). Además, si se desea, se pueden introducir sitios de división específicos para endoproteasa entre un grupo indicador y las secuencias de aminoácidos de un péptido recombitópico para facilitar el aislamiento de los péptidos recombitópicos libres de las secuencias irrelevantes. Para desensibilizar con éxito a un individuo contra una proteína antigénica puede ser necesario incrementar la solubilidad de un péptido recombitópico añadiendo grupos funcionales al péptido o no incluyendo epítopos hidrófobos de células T o regiones que contengan epítopos hidrófobos en los péptidos recombitópicos.

Para ayudar potencialmente al procesado del antígeno apropiado de epítopos de células T en un péptido recombitópico, se pueden diseñar por medios recombinantes o sintéticos, sitios canónicos sensibles a la proteasa entre regiones que comprendan cada una al menos un epítopo de células T. Por ejemplo, se pueden introducir parejas de aminoácidos cargados, como KK o RR, entre regiones de un péptido recombitópico durante la construcción recombinante del péptido recombitópico. El péptido recombitópico resultante puede presentarse sensible a la rotura por catepsina y/u otros enzimas tipo tripsina para generar porciones del péptido recombitópico que contienen uno o varios epítopos de células T. Además, dichos residuos de aminoácidos cargados pueden tener como resultado un aumento en la solubilidad del péptido recombitópico.

La mutagénesis de ADN dirigida al sitio codificante de un péptido recombitópico se puede usar para modificar la estructura del péptido recombitópico. Dichos métodos pueden requerir PCR (Ho et al., Gene 77:51-59 (1989)) o síntesis total de los genes mutados (Hostomsky, Z., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 161:1056-1063 (1989)). Para mejorar la expresión bacteriana, los métodos antes mencionados se pueden usar junto con otros procedimientos para cambiar los codones eucarióticos en construcciones de ADN codificantes de péptidos recombitópicos a las usadas preferentemente en E. coli.

La presente invención también proporciona secuencias de ácidos nucleicos codificantes para los péptidos recombitópicos de la invención. Las secuencias de ácidos nucleicos usadas en cualquier realización de esta invención pueden ser ADNc como se describe aquí, o de forma alternativa, pueden ser cualquier secuencia de oligodesoxinucleótidos, que poseen toda o una parte de una secuencia representada aquí, o sus equivalentes funcionales. Dichas secuencias de oligodesoxinucleótidos se pueden producir por medios químicos o mecánicos, usando técnicas conocidas. Un equivalente funcional de una secuencia de oligonucleótidos es aquél que es 1) una secuencia capaz de hibridizar a un oligonucleótido complementario al cuál se hibrida la secuencia de oligonucleótidos (o las porciones de secuencia correspondientes) o fragmentos de ésta, o 2) la secuencia (o la porción de secuencia correspondiente) complementaria a la secuencia de oligonucleótidos y/o 3) una secuencia que codifica un producto (por ejemplo, una proteína, un polipéptido o un péptido) que tiene las mismas características funcionales del producto codificado por la secuencia de oligonucleótidos (o la porción de secuencia correspondiente). El hecho de que un equivalente funcional deba cumplir uno o más criterios dependerá de su uso (por ejemplo, si se tiene que usar sólo como sonda de hibridación, sólo necesita cumplir el primer y segundo criterios, y si se tiene que usar para producir un péptido de la presente invención, sólo necesita cumplir el tercer criterio).

Como se describe en los ejemplos siguientes, las cadenas 1 y 2 de la Proteína Felina Reactiva de células T humanas (TRFP) (figuras 1 y 2) se han expresado de forma recombinante en E. coli y se han purificado. Se utilizaron estudios de epítopos de células T usando regiones peptídicas superpuestas derivadas de la secuencia de aminoácidos de TRFP para identificar múltiples epítopos de células T en cada cadena de TRFP. Como se describe detalladamente en el ejemplo 2, se ensamblaron construcciones de ADN en las cuales tres regiones (designadas péptido X, péptido Y y péptido Z), cada de las cuales contenía al menos un epítopo principal de células T humanas de TRFP, se unieron en seis posibles combinaciones para producir seis construcciones de ADN codificantes de péptidos recombitópicos que comprenden las tres regiones en seis configuraciones diferentes.

Mientras el péptido X comparte 5 aminoácidos en su extremo carboxi con 5 aminoácidos en el extremo amino del péptido Y, los péptidos recombitópicos XYZ y ZXY se podrían haber construido con o sin duplicación de dichos 5 aminoácidos (véase la figura 11, donde ZXY se construye sin duplicación de la secuencia de 5 aminoácidos). En los ejemplos siguientes, los péptidos recombitópicos se ensamblaron contiguos, sin duplicación de la secuencia de 5 aminoácidos. Además de las tres regiones X, Y y Z, se podrían incluir también otras regiones, que contengan cada una al menos un epítopo de células T humanas, en los péptidos recombitópicos para producir construcciones de ADN con cuatro o más regiones (de N! configuraciones, donde N = el número de regiones). De forma alternativa, se podría sustituir una o más regiones por el péptido X, el péptido Y o el péptido Z, como el péptido A o B, según se muestra en la figura 4, para producir, por ejemplo, el péptido recombitópico AXY.

Se describen protocolos detallados para la separación y eliminación de secuencias extrañas añadidas a péptidos recombitópicos como ayuda para la purificación. Se ha examinado la unión de los péptidos recombitópicos purificados con IgE de pacientes humanos alérgicos a los gatos en membranas de Western y se han comparado a la unión con IgE de las cadenas recombinantes 1 y 2 de TRFP. Se realizó un ELISA para examinar la unión alérgica de IgE a los péptidos recombitópicos relativos a TRFP nativa, la cadena recombinante 1 y la cadena recombinante 2. El trabajo descrito aquí demuestra que los péptidos recombitópicos de la presente invención tienen actividad estimulante de células T, incluso aunque la configuración de sus epítopos difiera generalmente de la observada en la secuencia de proteínas de TRFP nativa. Además, se ha demostrado que el uso de péptidos recombitópicos como gentes profilácticos hace que los ratones sean insensibles al reto de un antígeno, con TRFP nativa, cadena 1 recombinante, o cadena 2 recombinante de TRFP, o el péptido recombitópico que se utilice.

La invención se ilustra más detalladamente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Estudios de epítopos de células T con péptidos TRFP solapados

Células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) fueron purificadas por centrifugación de Ficoll-Hypaque de 60 ml de sangre periférica heparinizada de pacientes alérgicos a los gatos que mostraron síntomas clínicos de alergia a los gatos y dieron positivo en la prueba cutánea con extracto de gato. Se cultivaron diez millones de PBMC de un individuo paciente en 10 ml de RPMI-1640 (Gibco) que contenía 5% de suero AB humano combinado y suplementado con glutamina, penicilina, estreptomicina y tampón HEPES (RPMI-1640 completo) en presencia de 20 \mug de TRFP nativa purificada por afinidad/ml de cultivo a 37ºC durante 7 días. A continuación se purificaron las células viables por centrifugación de Ficoll-Hypaque y se cultivaron durante 2 semanas adicionales en RPMI-1640 completo conteniendo 5 unidades de IL2 humana recombinante/ml y 5 unidades de IL4 humana recombinante/ml. Las células T en reposo resultantes del cultivo se analizaron en un ensayo de proliferación secundario usando una placa de microtitración de 96 pocillos para evaluar las respuestas de las células T a varios péptidos o proteínas de TRFP (antígenos de TRFP) como se muestra en la figura 3. Para el ensayo, 2 X 10^{4} células T en reposo se cultivaron en RPMI-1640 completo durante 3 días a 37ºC en presencia de 5 X 10^{4} PBMC autólogas (3500 Rads) como células presentadoras de antígeno con una concentración variada de uno de los antígenos de TRPF en cada pocillo en una cantidad de 200 \mul por pocillo. Cada pocillo recibió entonces 1 \muCi de timidina tritiada durante 16 horas. Las cuentas incorporadas se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio y se procesaron mediante conteo de escintilación líquida. Entonces los índices de estimulación para las respuestas de cada péptido se calcularon como el CPM máximo en la respuesta a antígeno dividido por el CPM del medio de control. Se consideró que un índice de estimulación del 2,5 sería una respuesta de células T positiva. (En la forma en que se usa a lo largo de esta aplicación, la actividad estimulante de células T humanas se define como un índice de estimulación de al menos 2,0. Sin embargo, el índice de estimulación de los epítopos o regiones de células T que se debe usar en la producción de un recombitopo de la invención es al menos 2,0, de preferencia al menos 2,5, mejor aún al menos 3,5, y en el mejor de los caos al menos 5,0.) En la figura 3 se presenta un resumen de los resultados de 34 experimentos de este tipo. Se clasificaron las cinco mejores respuestas peptídicas al conjunto solapado de péptidos de TRFP que cubren la cadena 1 y la cadena 2 de TRFP en la línea de células T derivada de cada paciente, asignando a la respuesta positiva más elevada un 5, a la siguiente respuesta positiva más elevada un 4, y así sucesivamente. Después se calculó la suma de las clasificaciones obtenidas para cada péptido y se representó en el histograma de la figura 3. Este tipo de análisis destaca la importancia relativa de las diferentes regiones de la molécula de TRFP en la respuesta de células T frente a la proteína intacta. Los resultados indican que las regiones principales de reactividad de las células T en este panel de pacientes están integradas (en orden de importancia) por Fel-14.2 (cadena 1, residuos de aminoácidos 29-42), Fel-3.1 (cadena 1, residuos de aminoácidos 18-32), Fel-2 (cadena 1, residuos de aminoácidos 9-25), Fel-21 (cadena 1, residuos de aminoácidos 56-70), Fel-29 (cadena 1, residuos de aminoácidos 56-70), Fel-1.2 (cadena 1, residuos de aminoácidos 1-17), Fel-4 (cadena 1, residuos de aminoácidos 37-55), Fel-18 (cadena 2, residuos de aminoácidos 23-48), Fel-25 (cadena 2, residuos de aminoácidos 49-68) Fel-16 (cadena 2, residuos de aminoácidos 1-22) y Fel-23 (cadena 1, residuos de aminoácidos 51-66). Después se diseñó un conjunto de péptidos para cubrir estas regiones. Porciones de Fel-1.2, Fel-2, Fel-3.1 y Fel-14.2 comprenden el péptido X (cadena 1, residuos de aminoácidos 7-33). Porciones de Fel-3.1, Fel-14.2, y Fel-4 comprenden el péptido Y (cadena 1, residuos de aminoácidos 29-55). Porciones de Fel-16, Fel-17 y Fel-18 comprenden el péptido Z (cadena 2, residuos de aminoácidos 14-39). Porciones de Fel-4, Fel-21 y Fel-23 comprenden el péptido A. Porciones de Fel-29 comprenden el péptido B. Los péptidos X, Y, Z, A y B se muestran en la figura 4.

Ejemplo 2 Construcción y expresión de péptidos recombitópicos

Se usaron métodos de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que utilizaban oligonucleótidos sintéticos para construir ADN codificantes de la secuencia de péptidos X, Y y Z. Con la finalidad de mejorar la expresión en E. coli, los codones en los oligonucleótidos se seleccionaron a partir de una tabla de aquellos prevalentes en las proteínas expresadas intensamente por E. coli. Sharp, P. M., et al., Nucl. Acids Res. 16:8207 (1988). Abajo se describen detalladamente los oligonucleótidos y los procedimientos de PCR usados para construir péptidos recombitópicos.

Los oligonucleótidos se diseñaron con los codones preferidos de E. coli, como se representa esquemáticamente en las figura 5 y 6. Estos oligonucleótidos (C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N y O ilustrados en la figura 7), fueron amplificados usando un kit Perkin Elmer/Cetus GeneAmp, en dos reacciones de PCR separadas (PCR#1 y PCR#2, en las que PCR #1 tuvo como resultado la síntesis de la porción 5' de la molécula de ADN codificante del péptido recombitópico y PCR #2 tuvo como resultado la síntesis de la porción 3' de la molécula de ADN codificante del péptido recombitópico, respectivamente). Se tomó este enfoque debido a la presencia de una secuencia (KALPV) en los dos péptidos X e Y, que se encontró que interfería en la generación apropiada de PCR del recombitopo YZX cuando se realizaba una única reacción de PCR con los oligonucleótidos (C-I). En la producción del péptido recombitópico AYZXB, como se muestra en la figura 6, los oligonucleótidos usados en PCR#2 fueron C-I y L, M, O. En la producción del péptido recombitópico YZX, que se muestra en la figura 5, los oligonucleótidos usados en PCR#1 fueron C, D, E y F, mientras los oligonucleótidos usados en PCR#2 fueron F, G, H e I. Cada mezcla de reacción (10 \mug) generó la mitad 5' y la mitad 3' respectivamente, de la estructura YZX pretendida (figura 5). Estas mezclas de PCR, tras la adición de Tag polimerasa, se sometieron al siguiente programa con ciclos de desnaturalización, anillamiento y
polimerización:

1

Tras completar las reacciones PCR#1 y PCR#2 en la construcción de la estructura YZX se añadieron alícuotas de cada (100 p moles de los 10 \mug de la mezcla total de reacción; volumen 1/100) a una tercera mezcla de reacción de PCR que contenía un conjunto de cebadores 5' y 3' (100 p moles de los cebadores C e I). Se realizó una tercera reacción de PCR (PCR #3) utilizando esta tercera mezcla de reacción de PCR tal como se describe previamente para las reacciones #1 y #2, excepto en que la temperatura de anillamiento en la etapa 6 se elevó a 65ºC. La finalización de PCR#3 produjo el ADN codificante del péptido recombitópico YZX. El método de reacción de PCR#3 es similar al descrito en Horton, R. M. et al. Gene 77:61 (1989). La mezcla de reacción completa usada en PCR#3 se fraccionó en un gel de agarosa 2% y la banda del tamaño apropiado (230 bp) se electroeluyó en el gel de sílice y se precipitó. El ADN aislado codificante del péptido recombitópico YZX se sometió a otra reacción de PCR usando exceso de cebadores de amplificación 5' y 3' (C e I). Este producto final se digirió con los enzimas de restricción BamH I y después se clonó en el vector pET11d bajo el control transcripcional del promotor de fusión gn 10lac0 del fago T7. Studier, F. W., et al. Methods in Enzymol. 185:60 (1990).

Un sitio de restricción múltiple (polylinker) codificante de seis histidinas secuenciales (CAC)6, se clonó en marco hacia el extremo 5' del ADN codificante del péptido recombitópico YZX. La secuencia líder de seis histidinas (H6 o His6) permitió la purificación del péptido recombitópico usando QIAGEN NTA-Agarose (Diagen Gmbh, Düsseldorf, Alemania), un soporte quelante de Ni2+. Hochuli, E., et al., BioTechnology 6:1321 (1988). Los sitios de rotura enzimática específicos de los sitios codificantes de ADN (por ejemplo, trombina, factor Xa, etc.) se pueden insertar usando métodos de PCR entre la secuencia codificante de la polihistidina (H6) y el ADN codificante del esqueleto del péptido recombitópico. En el caso del péptido recombitópico YZX, se insertó un sitio de reconocimiento de la trombina (LVPRGS). Uhlen, M., y Moks, T. Methods in Enzymol, 185:129 (1990), Chang, J.-Y. Eur. J. Biochem. 151:217 (1985).

Un procedimiento similar al descrito arriba para la construcción de ADN codificante del péptido recombitópico YZX se usó para la construcción de ADN codificante de los péptidos recombitópicos XYZ y ZYX. Además, otros péptidos que contienen epítopos de células T se pueden añadir a una estructura esqueleto del recombitopo existente, como YZX (como la producida arriba), como fue el caso con la construcción del péptido recombitópico AYZXB (véanse las figuras 6 y 7). De forma alternativa, los péptidos que contienen epítopos de células T se pueden producir sin el uso de un esqueleto de recombitopo existente, usando métodos indicados aquí. Para producir el péptido recombitópico AYZXB, se produjeron cebadores oligonucleótidos (J-M) con regiones solapadas a cada extremo del péptido recombitópico YZX y un cebador de amplificación 5' y 3' (N y O). (Como se muestra en la figura 6, la parte oscurecida de las moléculas es la secuencia solapada). Las reacciones de PCR se realizaron como se describe arriba. El fragmento AYZXB resultante se aisló y se subclonó en el vector pET 11DH_{6} TH.

Se usó un procedimiento alternativo para construir el ADN codificante de los péptidos recombitópicos XZY, YXZ y ZXY. Cada una de las construcciones de ADN codificantes de los péptidos recombitópicos XZY, YXZ y ZXY se ligó en el codón codificante de la mayoría de aminoácidos N-terminales del péptido recombitópico con el ADN codificante de la secuencia líder MGHHHHHHEF (donde los aminoácidos EF son codificados por el sitio de restricción Eco RI GAATTC). Los fragmentos de ADN codificantes de los tres péptidos recombitópicos se ensamblaron mediante PCR consecutivo, esencialmente como se describe en Horton et al., (1989) Gene 77: 61-68. Los segmentos de ADN codificantes de los péptidos X, Y y Z (mostrados en la figura 4) se amplificaron a partir de los ADNc Fel d I descritos en Morgenstern et al., (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88: 9690-9694. Como se muestra en la figura 9, que presenta la construcción de la secuencia codificante del péptido recombitópico XZY como ejemplo específico, los cebadores oligonucleótidos se sintetizaron con una secuencia de ADN que no solo amplificaría un segmento específico de ADN codificante del péptido X, Y o Z, sino que uniría covalentemente un pequeño segmento (9-18 pares de bases) del segmento de ADN codificante de los péptidos X, Y o Z. El PCR se realizó usando VentTM polimerasa según las instrucciones de New England Biolabs con un programa de amplificación de 30 X [94ºC 1 min /60ºC 1 min 30 seg /
72ºC 1 min]. Los cebadores usados para la amplificación por PCR se muestran en la figura 10. Los fragmentos de ADN codificante/enlazantes del péptido recombitópico individual de las amplificaciones por PCR se purificaron por electroforesis de gel preparativa en agarosa NuSieve (FMC) al 3% (p/v). Estos fragmentos individuales de PCR se unieron después en una segunda reacción de PCR para formar una construcción de ADN codificante de XZY, como se muestra en las figuras 9 y 11. Para unir estos fragmentos de PCR se fundieron trozos de gel NuSieve al 3% conteniendo los productos de PCR iniciales a 70ºC y 1 \mul de cada uno se añadió a una reacción VentTM PCR polimerasa que empleó los cebadores 5' RI (NH2-terminal) y 3' Bam (COOH-terminal).

A causa de los sitios de restricción presentes en el vector de expresión, pET11d (Studier et al, 1990), todos los cebadores del extremo 5' tenían sitios de codificación EcoR I [GAATTC] en marco con el ADN codificante de los aminoácidos NH2-terminales del recombitopo particular, mientras los extremos de los cebadores del extremo 3' tenían sitios de codificación BamH I [GGATCC]. Las construcciones de ADN codificantes de los péptidos recombitópicos XZY, YXZ y ZXY producidos a partir del PCR secundario se digirieron con EcoR I/BamH I y se realizó su electroforesis mediante gel de agarosa SeaPlaque (FMC) al 0.5 (p/v). Los trozos de gel que contenían las construcciones de ADN se fundieron a 70ºC y se añadieron a una reacción de ligación con plásmido Bluescript KS digerido con EcoR I/BamH I (Stratagene). La ligación se transformó en bacterias XL-1 Blue competentes (Stratagene), y los plásmidos recombinantes con insertos se identificaron por diagnóstico con digestión de restricción tras aislamiento usando el kit Qiatop (Diagen GmbH). La secuencia de insertos se verificó mediante análisis de la secuencia terminal de la cadena didesoxi usando un kit Sequenase Il (United States Biochemicals).

Los plásmidos Bluescript KS que anclan construcciones de ADN codificantes de insertos de los péptidos recombitópicos XZY, YXZ y ZXY con la secuencia de oligonucleótidos correcta se digirieron con EcoRI/BamH I y las construcciones de ADN se aislaron en gel SeaPlaque 0.6% para el subclonaje en el vector de expresión pET11 d en marco con el ADN codificante de la secuencia líder MGHHHHHHEF del extremo NH2, como se menciona arriba. Las construcciones se subclonaron en pET11 d His6 Amb a I.1 HR digerido con EcoR I/BamH I. Esta ligación sirvió para intercambiar la construcción de ADN por un inserto, en este caso el ADNc del alérgeno principal del raigrás, Amb a I.1 (Rafnar et al., (1991) J. Biol. Chem. 226 :1229-1236). pET11d His Amb a I.1 \DeltaHR se derivó de pET 11d en dos etapas. Primero pET11d se digirió con Eco RI/HinD III, se limó con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli, y se ligó de nuevo en sí mismo para crear pET11d \DeltaHR: un pET11d carente de los sitios Hind III y EcoR I. Entonces pETI11d His6 Amb a I.1 \DeltaHR se formó por excisión del casete H6Amb aI.1 a partir del vector de expresión pET11d His6Amb a I.1 como un fragmento Nco I/BamH I y ligando éste en pET11d \DeltaHR digerido con Nco I/BamH I. Los plásmidos recombinantes se identificaron por digestión de restricción diagnóstica tras aislamiento vía kit Qiatip y los plásmidos positivos se transformaron en bacterias BL21 [DE3] competentes para la expresión. BL21 [DE3] contiene un fago l lisogénico recombinante, DE3, con un gen de la ARN polimerasa del fago T7 bajo el control transcripcional del promotor lac UV5. La expresión del gen de la ARN polimerasa T7 es inducida por la adición de IPTG, que a su vez conduce a un nivel elevado de expresión del gen recombinante subclonado 3' del promotor de fusión T7 gn 10 lac 0 del vector pET.

Los fragmentos de ADN derivados de PCR codificantes de la fusiones (H6) de las cadenas 1 y 2 maduras de TRFP subclonados en pSEM (U.S.S.N. 662,276 registrado el 28 de febrero del 1991) se cortaron y ligaron en pET11d. Esto se consiguió anexando conectores Bcl I a los sitios Pst I en los extremos 3' de las dos cadenas, digiriendo con Nco I en el extremo 5' de las cadenas e insertando el fragmento 5' Nco I/3' Bcl I en pET11d digerido con 5'Nco I/3'BamH I

Las cadenas peptídicas recombinantes 1 y 2 de TRFP, así como los péptidos recombitópicos XYZ, XZY, YZX, ZYX, ZXY e YXZ se expresaron en E. coli y se purificaron esencialmente como se describe más abajo. Las bacterias huésped BL21 DE3 que anclan las construcciones de ADN de expresión pET11d se sembraron sobre una placa fresca de agar BHI (3,7% p/v de infusión cerebro corazón Difco; 1.5% p/v de agar Difco) suplementada con 200 \mug/ml de ampicilina y se incubó toda la noche a 37ºC. Se inoculó una sola colonia en 2 ml de 200 \mug/ml de medio ampicilina/BHI (3,7% p/v de infusión cerebro corazón Difco) y se agitó a 300 rpm a 37ºC hasta turbidez, pero no saturación. Después, a los 2 ml de cultivo se le añadieron 100 ml de 200 \mug/ml de medio ampicilina/BHI, se agitó a 300 rpm a 37ºC hasta turbidez, pero no saturación, dividiéndose en este momento el cultivo en 18 X 250 ml (4,5 litros) de 200 \mug/ml de medio ampicilina/BHI y se agitó a 300 rpm a 37ºC. Cuando la OD_{595} del cultivo alcanzó 1,0 se indujo la expresión de los péptidos recombinantes como péptidos de fusión (His)6 mediante la adición de IPTG hasta 400 \muM y se permitió que continuara durante dos horas.

Las bacterias se recogieron por centrifugación a 10.000 X g durante 15 minutos y se resuspendieron en un volumen 1/50 de guanidina HCl 6M, 2-mercaptoetanol 100 mM, NaPO_{4} 100 mM, Tris 10 mM a pH 8,0. La cadena 1 y la cadena 2 recombinantes y los péptidos recombitópicos (péptidos recombinantes) se extrajeron mediante agitación vigorosa de las bacterias resuspendidas durante 1 hora a 25ºC. Esta suspensión se sometió a centrifugación a 15.000 X g, se eliminó el sobrenadante, se ajustó a pH 8,0 con NaOH 10N y se aplicó a una columna de agarosa NTA que se había equilibrado en guanidina HCl 6 M, NaPO_{4} 100 mM, Tris 10 mM a pH 8,0 hasta OD_{280} del fondo alcanzado en el efluente. A continuación se cambió el tampón de la columna a urea 8M, NaPO_{4} 100 mM, Tris 10 mM a pH 8,0. Tras el equilibrado, se realizó un lavado más astringente en urea 8M, NaOAc 100 mM, Tris 10 mM a pH 6,3 hasta OD_{280} del fondo alcanzado en el efluente. Cada péptido recombinante (como fusión His6) se eluyó entonces en urea 8M, NaOAc 100 mM, Tris 10 mM a pH 4,5 y se recogió en alícuotas cuyo perfil OD_{280} fue monitorizado. El pico del péptido se dializó 3 veces en 500 volúmenes de PBS (fosfato salino tamponado) para el análisis. El rendimiento osciló entre 2 y 25 mg de fusión de péptido recombinante (His6) por litro, con pureza (determinada por escaneado densitométrico de gel de poliacrilamida SDS) generalmente superior al 90%.

Todos los péptidos recombinantes (cadena 1 de TRFP, cadena 2 de TRFP, XYZ, YZX y ZYX) descritos arriba poseen una secuencia N terminal añadida como ayuda a la purificación y la expresión (por ejemplo, MGHHHHHHLVPR
GS-). Esta secuencia N terminal irrelevante se puede eliminar por digestión proteolítica ya que la secuencia contiene un sitio de reconocimiento de trombina (LVPRGS) insertado entre la secuencia polihistidina y la secuencia recombitopo. (Véase figura 8, la flecha indica el sitio de rotura de trombina). La trombina se usó para romper la secuencia irrelevante dejando sólo dos residuos de aminoácidos extra, GS, en el extremo N de las cadenas 1 y 2 de TRFP y los péptidos recombitópicos XYZ, YZX y ZYX (Chang, J.-Y. Eur. Biochem. 151:217-224 (1985)). La rotura eficaz de la proteína de fusión se puede conseguir usando una relación proteína a trombina de 1000 a 1 durante 2 horas a 25ºC. El esquema
de rotura y purificación usado para la construcción del péptido recombitópico YZX se describe a continuación:

1): péptido recombitópico MGHHHHHHL VPRGS - YZX

2): Dializar en PBS, pH 8,0

3): Rotura por trombina

\quad: péptido:trombina =1000:1

\quad: 25ºC, 2 horas

4): Reducción con ditiotreitol 100 mM

\quad: en guanidina HCl 5M

\quad: 37ºC, 30 minutos

5): HPLC Fase Reversa C4, pH 2,0

6): Liofilización

1 HPLC analítico en fase reversa se realizó en una columna VYDAC 214 TP54 con un volumen de lecho de 42 ml. La columna se cargó con 340 \mug de péptido recombitópico YZX. Se realizó un HPLC semipreparativo usando una columna VYDAC 214 TP 1022 con un volumen de lecho de 95 ml cargado con 90 mg de proteína. Los gradientes empezaron con 0% a 30% de acetonitrilo que contenía ácido trifluoroacético 0.1% durante los 10 primeros minutos seguido por 30% a 43% de acetonitrilo durante 15 minutos. A continuación se mantuvo la fase móvil a 43% de acetonitrilo durante 10 minutos. El péptido recombitópico YZX purificado eluyó al 43% de acetonitrilo. La rotura y purificación fue monitorizada por SDS-PAGE. La identificación y la pureza del péptido recombitópico YZX se determinó por análisis de la secuencia de proteínas usando Applied Biosystem Inc. Protein Sequenator Model 477A.

Ejemplo 3 Ensayo de enlace directo de IgE a proteínas y recombitopos de TRFP

Se realizó el análisis de inmunotransferencia Western de los péptidos recombitópicos producidos en el ejemplo 2. La concentración de todas las muestras de proteínas (por ejemplo, TRFP, cadena 1 recombinante de TRFP, cadena 2 recombinante de TRFP, péptido recombitópico XYZ, péptido recombitópico XZY, péptido recombitópico YXZ, péptido recombitópico YZX, péptido recombitópico ZXY y péptido recombitópico ZYX) para electroforesis de gel se determinó por el método BCA (Pierce Co.). Todas las muestras de proteínas se cargaron en el gel a 5 \mug/carril, excepto TRFP a 10 \mug/carril. La separación de las proteínas se realizó en gel de poliacrilamina al 15% y la transferencia se realizó por electrotransferencia a 1,5 amperios durante 1,5 horas en papel de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell, 0.1 micras) en un aparato Hoeffer según el protocolo de Towbin, H., T. Stachlin, y J. Gordon, PNAS 76:4350 (1979). Las proteínas se aclararon en solución de transferencia (Tris-HCl 7,5 25 mM, NaCl 0.171 M y Tween 20 0,5 ml/litro). La transferencia se bloqueó durante una hora en solución bloqueante (leche 1% en solución de transferencia). El plasma del paciente #417, que se utilizó como fuente primaria de anticuerpos, se diluyó en solución bloqueante al 10% y se preabsorbió durante 1,5 horas con nitrocelulosa no usada (2 cmx15 cm). Entonces el plasma humano preparado se incubó durante la noche en un agitador orbital con la sección de interés de la transferencia de proteínas. Después de la primera incubación de anticuerpos, la sección de transferencia se lavó tres veces, realizándose en cada lavado una incubación de 15 minutos en solución de transferencia. El segundo anticuerpo, específico para la IgE humana (IgE biotinilada antihumana de cabra, KPL Inc.) se diluyó 1:2500 en solución de transferencia y se realizó la incubación durante dos horas. Posteriormente se eliminó el exceso del segundo anticuerpo mediante tres incubaciones de 15 minutos con solución de transferencia.

Se diluyó estreptavidina yodada ^{125}I (Amersham) a 1:2500 en solución de transferencia y se incubó con las transferencias durante 1 hora, a 2 \muCi en un volumen de incubación de 50 ml. A continuación las secciones de transferencia se lavaron con solución de transferencia hasta que la radioactividad detectable en la solución de desecho se redujo a niveles de fondo. La sección de transferencia se envolvió en un envoltorio de material plástico impermeable y se expuso a película durante toda la noche con una pantalla intensificadora cronex a -80ºC. El patrón de unión de IgE mostrado en la figura 13 demuestra la reactividad a TRFP purificada por afinidad (carril 1), la cadena 1 de 6 KD de peso molecular y la cadena 2 \geq 16 KD. La cadena 1 recombinante muestra unión fuerte de IgE (carril 2) mientras la reactividad de la cadena 2 recombinante es reducida comparada con la cadena 1 (carril 3). Los péptidos recombitópicos que muestran unión de IgE son los péptidos recombitópicos XYZ y ZXY (carriles 4 y 8 respectivamente). Todos los otros péptidos recombitópicos son negativos para la unión de IgE por este método de análisis.

La unión específica de IgE a los péptidos recombitópicos se demostró también en ensayos ELISA. Se recubrieron placas de ensayo Corning (#25882-96) con 10 \mug/ml de cada uno de los antígenos de recubrimiento (es decir, TRFP, cadena 1 (cadena 1 recombinante de TRFP), cadena 2 (cadena 2 recombinante de TRFP), péptido recombitópico XYZ, péptido recombitópico XZY, péptido recombitópico YXZ, péptido recombitópico YZX, péptido recombitópico ZXY y péptido recombitópico ZYX) enumerados en la figura 14 con 50 \mul/pocillo y se incubaron durante la noche a 4ºC. Se eliminaron los antígenos de recubrimiento y los pocillos se bloquearon con gelatina en PBS 0,5%, 200 \mul/pocillo durante 2 horas a temperatura ambiente. El plasma del paciente #669 se diluyó en serie con PBS-Tween 20 (PBS con 0,05% de detergente no iónico Tween-20 Sigma, St. Louis MO) y se añadieron 100 \mul/pocillo y se incubaron durante la noche a 4ºC (las diluciones del plasma se analizaron por duplicado). Se añadieron 100 \mul/pocillo del segundo anticuerpo (IgE biotinilada antihumana de cabra, Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. Gaithersburg, MD), durante una hora a temperatura ambiente. Esta solución se eliminó y después se añadieron 100 \mul/pocillo de estreptavidina-HRPO, 1:10.000 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) durante una hora a temperatura ambiente (todos los pocillos se lavaron tres veces con PBS-Tween entre cada etapa de incubación). Se añadieron 100 \mul/pocillo del sistema TMB Membrane Peroxidase Substrate Kirkegaard & Perry Laboratories) mezclado recientemente. Se permitió el desarrollo del color durante 2 a 5 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 \mul/pocillo de ácido fosfórico 1 M.

Las placas se leyeron en un Microplate EL 310 Autoreader (Biotek Instruments, Winooski, VT) con un filtro de 450 nm. Se promediaron los niveles de absorbancia de los pocillos por duplicado. Los resultados gráficos (log de la dilución vs absorbancia) de los ensayos ELISA se muestran en la figura 14.

Los resultados de ELISA mostrados en la figura 14 demuestran un alto nivel de IgE unida a TRPF con una unión algo inferior a las cadenas recombinantes 1 (cadena 1) y 2 (cadena 2) de TRFP. Las dos cadenas recombinantes demuestran una unión equivalente con la IgE de este paciente. La unión de los otros péptidos recombitópicos está en el nivel de fondo o cercana a éste, con una ligera señal del péptido recombitópico ZXY. Para demostrar que los péptidos recombitópicos estaban presentes en cantidades iguales tanto en el ensayo ELISA como en la transferencia Western, se usó antisuero antipéptido como control positivo y éste dio señales claramente equivalentes para todos los carriles y pocillos con los péptidos recombitópicos.

Ejemplo 4 Respuesta de epítopos de células T humanas frente a péptidos recombitópicos

Se examinó la respuesta de las células T de humanos alérgicos a los gatos frente a los péptidos recombitópicos. Se purificaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) mediante centrifugación de Ficoll-Hypaque de 60 ml de sangre periférica heparinizada de pacientes alérgicos a los gatos, que mostraban síntomas clínicos de alergia a los gatos y dieron positivo en la prueba cutánea con extracto de gato. Se cultivaron diez millones de PBMC de un individuo paciente en 10 ml de RPMI-1640 que contenía 5% de suero AB humano combinado y suplementado con glutamina, penicilina, estreptomicina y tampón HEPES en presencia de 10 \mug de TRFP nativa purificada por afinidad/ml de cultivo o con 25 \mug de péptido recombitópico YXZ no dividido y purificado/ml o con 25 \mug de péptido recombitópico YZX no dividido y purificado/ml a 37ºC durante 7 días. El péptido recombitópico se dividió con trombina como se describe en el ejemplo 2. Las células viables se purificaron entonces por centrifugación de Ficoll-Hypaque y se cultivaron durante 2 semanas adicionales en suero RPMI-1640/AB 5% que contenía 5 unidades de IL2 humana recombinante/ml y 5 unidades de IL4 humana recombinante/ml. Las células T en reposo se analizaron en un ensayo de proliferación secundario usando una placa de microtitración de 96 pocillos para evaluar las respuestas de las células T a varios péptidos o proteínas de TRFP (antígenos de TRFP). Para el ensayo, 2 X 10^{4} células T en reposo se cultivaron durante 3 días a 37ºC en presencia de 2 X 10^{4} células B autólogas transformadas con el virus Epstein-Barr (25.000 Rads) como células presentadoras de antígeno con varias concentraciones de antígeno en 200 \mul por pocillo. Luego, cada pocillo recibió 1 \muCi de timidina tritiada durante 16 horas. Las cuentas incorporadas se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio y se procesaron mediante conteo de escintilación líquida. A continuación se calcularon los índices de estimulación para las respuestas de cada péptido como el CPM máximo en la respuesta a antígeno dividido por el CPM del medio de control. Se consideró que un índice de estimulación del 2,5 sería una respuesta de células T positiva. En las figuras 15a, 15b y 15c se muestra un resumen de los resultados de estos 3 experimentos (pacientes 522, 519 y 386). En comparación con los experimentos mostrados en las figuras 15a y 15b, en el experimento mostrado en la figura 15c, Fel-1.4 (cadena 1, residuos de aminoácidos 6-17) fue sustituida por Fel-1.2 (cadena 1, residuos de aminoácidos 1-17) y Fel-33.3 (cadena 2, residuos de aminoácidos 26-40) fue sustituida por Fel-18 (cadena 2, residuos de aminoácidos 23-48) para ensamblar más cerca los aminoácidos constituyentes de los péptidos X y Z. Además, en este experimento se sintetizaron y analizaron un péptido derivado del empalme Y-Z del péptido recombitópico YZX (residuos de aminoácidos 50-55 de la cadena 1 de TRFP y residuos de aminoácidos 14-19 de la cadena 2 de TRFP) y un péptido derivado del empalme Z-X del péptido recombitópico YZX (residuos de aminoácidos 34-39 de la cadena 2 de TRFP y los residuos de aminoácidos 7-12 de la cadena 1 de TRPF). Estos péptidos de empalme fueron producidos para determinar si estas áreas del péptido recombitópico YZX producían un epítopo no nativo al formarse en el péptido recombitópico.

Los resultados indican que las células T del paciente 522 cebadas con TRFP nativa responden positivamente a TRFP nativa, al péptido recombitópico YXZ, al péptido Y, Fel-14.2 y Fel-17. En contraste, las células T cebadas con recombitopo YXZ responden peor a TRFP nativa, pero responden a un nivel similar o mejor a una variedad de péptidos sintéticos correspondientes a porciones de la molécula de TRFP, incluyendo el péptido X, el péptido Y, el péptido Z, Fel-4, Fel-3.1, Fel-2, Fel-14.2, Fel-17 y Fel-18. En la figura 15b se muestran resultados similares de un experimento con células T del paciente 519. Las células T cebadas con TRFP nativa de este paciente responden a TRFP nativa, al péptido recombitópico YXZ y al péptido Y. Cuando las células del mismo paciente se cebaron con el péptido recombitópico YXZ, mostró respuestas positivas a TRFP nativa, al péptido recombitópico YXZ, al péptido X, al péptido Y, al péptido Z, Fel-3.1, Fel-4 y Fel-17. La figura 15c muestra un experimento similar en el que participa el recombitopo YZX dividido y purificado como antígeno cebador. Los resultados indican que las células T del paciente 386 cebadas con TRFP nativa responden positivamente a TRFP nativa, al péptido recombitópico YXZ, al péptido X, al péptido Y, Fel-3.1 y Fel-14.2. En cambio, las células T cebadas con recombitopo YZX responden de forma similar o mejor a TRFP nativa, el péptido recombitópico YZX, el péptido X, el péptido Y, el péptido Z, Fel-2, Fel-3.1, Fel-14.2 y Fel-17. Estos datos indican que, al menos en estos tres pacientes, las células T pueden reconocer eficazmente los epítopos de células T de TRFP cuando son presentados como un péptido recombitópico. Ningún epítopo presente en la molécula de TRFP nativa examinada en estos experimentos está destruido en el contexto del péptido recombitópico YXZ. La capacidad de los péptidos recombitópicos YXZ o YZX para presentar epítopos de TRFP en estos experimentos parece ser mayor en comparación con la molécula nativa. Los resultados del paciente 386 demuestran que los péptidos derivados de las áreas de empalme del recombitopo YZX (péptido de empalme YZ y péptido de empalme ZX) no son reconocidos por las células T cuando son presentados en un péptido recombitópico; por consiguiente, no se crean epítopos no nativos en las áreas de empalme.

Ejemplo 5 Respuesta de células T de murina a los péptidos recombitópicos

Se inmunizaron ratones con el péptido recombitópico YZX para determinar si los epítopos de células T contenidos en el péptido recombitópico derivado de TRFP son capaces de estimular una respuesta de células T. El ensayo determinó la capacidad de las células de los nódulos linfáticos de responder a los distintos péptidos recombitópicos, así como al antígeno inmunizante.

Se inmunizó subcutáneamente en la base de la cola y en la región del muslo a diez Ratones B6CBAFI con 100 \mug del péptido recombitópico YZX en adyuvante de Freund completo. Después de 10 días, se extrajeron y se mezclaron los nódulos inguinales, paraaórticos y poplíteos de los ratones inmunizados. Las células de los nódulos linfáticos se suspendieron en RPMI 1640 frío con suero fetal bovino 1% (FBS) pasando a través de una malla de acero inoxidable. Después se lavaron las células 2 veces con RPMI-1640 frío con FBS 1% y se mantuvieron a 4ºC.

Las células de los nódulos linfáticos se depositaron en placas a 4 x 10^{6} células/ml en RPMI 1640 con FBS 10%, 250 \mug/ml de penicilina G, 100 \mug/ml de estreptomicina y 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M. Las células se cultivaron con antígeno (es decir, péptido recombitópico YZX, péptido recombitópico ZYX, péptido recombitópico XZY, péptido X, péptido Y, péptido Z, péptidos X, Y y Z y Amb a I) de la forma indicada (figura 16). Tras 24 horas, se eliminaron 50 \mul de sobrenadante de cada cultivo y se congelaron durante la noche para eliminar residuos de células vivas. El sobrenadante se calentó a 37 grados y se lavó. Se añadieron células indicador CTLL-2 (ATCC # T1B 214) (5 x 10^{3} células/pocillo). Esta línea celular indicadora requiere IL-2 para un crecimiento continuado. Tras 24 horas se añadió H^{3}-timidina (1\muCi/pocillo) y las células se siguieron incubando durante 4 horas. Las placas se congelaron y se descongelaron, se recogieron en un recolector de pocillos Tomtec 96 (Tomtec, Orange, Conn.), y se contaron en un contador beta Betaplate (Pharmacia, Gaithersburg, MD.).

Las células de nódulos linfáticos mezcladas respondieron bien in vitro a los cultivos con el péptido recombitópico YZX, medido como producción de IL-2 (figura 16). Los medios tuvieron un fondo medio de sólo 1500 cpm. La respuesta de las células T al péptido recombitópico YZX puede resultar de una respuesta o una combinación de respuestas a los péptidos individuales que contienen epítopos usados para la construcción del péptido recombitópico (es decir, los péptidos X, Y y Z). Se cultivaron otros péptidos recombitópicos, así como los péptidos individuales X, Y y Z con células de nódulos linfáticos y se determinó la respuesta de las células T. Hubo una respuesta significativa a cada uno de los péptidos X, Y y Z, los péptidos constituyentes. Hubo fuertes respuestas de las células T a varios péptidos recombitópicos ZYX y XZY. Hubo una pequeña pero significativa respuesta de las células T a una preparación recombinante Amb a I que tenía las mismas secuencias líder aminoterminales que los péptidos recombitópicos.

Ejemplo 6 Utilización de recombitopos para el diagnóstico de enfermedades alérgicas

Los péptidos recombitópicos pueden ser útiles como una nueva forma de diagnóstico de la sensibilidad a una proteína alergénica o una proteína antigénica. Por ejemplo, aunque los péptidos recombitópicos preferidos de la invención no se unen a IgE, ciertos péptidos recombitópicos derivados de proteínas alergénicas pueden ser capaces de unirse a las IgE de pacientes alérgicos. Estos péptidos recombitópicos se pueden usar en pruebas cutáneas como ensayo preciso de hipersensibilidad de tipo inmediato (ITH, por sus sigla en inglés) de un individuo ante la proteína alergénica de la que deriva el péptido recombitópico. Los alérgenos que provocan la respuesta ITH también pueden ser alérgenos producidos de forma recombinante, alérgenos purificados bioquímicamente a partir de fuentes naturales, además de péptidos recombitópicos, con el único requisito de ser de alto grado de reactividad específica de IgE. Los péptidos recombitópicos que no muestran reactividad, o muestran una reactividad muy baja con IgE humana, pero comprenden epítopos de células T reactivos con una proteína alergénica se pueden usar para provocar hipersensibilidad de tipo retardado (DTH, por sus siglas en inglés) en un individuo sensible al alérgeno del que derivan los epítopos. Las formas alergénicas para la generación de una respuesta DTH pueden ser péptidos recombitópicos aislados, alérgenos recombinantes o alérgenos naturales o recombinantes modificados químicamente (por ejemplo, TRFP tratada con KOH). De nuevo, un requisito principal del antígeno/alérgeno provocador de DTH es la falta de reactividad de unión a IgE, o si ocurre dicha unión, la falta de un mediador de liberación desde los mastocitos o basófilos y la capacidad de estimular células T en un individuo al que se le administre. Un DTH positivo es indicador de células T del individuo específicas para los epítopos del péptido recombitópico. En general, los péptidos recombitópicos son moléculas mayores que los péptidos que comprenden un epítopo de células T individual y de este modo resultan útiles para el ensayo DTH. Al ser los péptidos recombitópicos moléculas mayores, se cree que deberían residir en la piel (lugar de inyección) permitiendo el influjo de linfocitos T y otras células que contribuyen a la respuesta DTH cutánea.

La reacción ITH, que se produce entre 15 y 30 minutos después de la prueba cutánea, se puede usar en combinación con una reacción DTH, apareciendo esta reacción DTH de 48 a 72 horas más tarde. La combinación de estos ensayos, para dos tipos diferentes de reactividades relacionadas con la enfermedad alérgica, es lo que representa una nueva formulación diagnóstica. La aplicación sobre la piel durante la prueba cutánea con un péptido recombitópico puede requerir un formato diferente para provocar una respuesta frente a la otra (ITH vs DTH). Por ejemplo, la reacción ITH puede ser provocada en un individuo por prueba de punción con una cantidad muy pequeña de una composición terapéutica que comprenda un péptido recombitópico (en este caso el péptido recombitópico reactivo a IgE), y un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Para provocar una reacción DTH se aplica una gran cantidad de una composición terapéutica que comprende un péptido recombitópico (en este caso el péptido recombitópico no reactivo a IgE), y un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable por inyección intradérmica o prueba de punción (ambos se usan para el ensayo TB para DTH). Véase Immunology (1985) Roitt, I.M., Brostoff, J., Male, D.K. (eds), C.V. Mosby Co., Gower Medical Publishing, London, NY, pp. 19.2-19.18; pp. 22.1-22.10. Siguiendo el diagnóstico con péptidos recombitópicos de la invención, se pueden seleccionar los individuos para la terapia de desensibilización específica, definiendo en un conjunto de pruebas, la reactividad de IgE y la reactividad de
epítopos T.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: ImmuLogic Pharmaceutical Co., Inc. 7

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDOS RECOMBITÓPICOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 77

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: LAHIVE & COCKFIELD

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 60 State Street, suite 510

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Boston

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Massachusetts

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EEUU

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02109

\vskip0.800000\baselineskip

(v): SOPORTE INFORMÁTICO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: texto ASCII

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US92/08694

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE REGISTRO: 16-Oct-1992

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 777,859

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE REGISTRO: 16-Oct-1991

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 807,529

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE REGISTRO: 13-Dic-1991

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Amy E. Mandragouras

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 36,207

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: 027.0 PCT(IMI-015PC)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO:(617) 227-7400

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FAX:(617) 227-5941

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 418 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 8..283

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 92 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 420 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 26..289

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 88 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 476 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 8..334

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 109 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 10..27

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

: 15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 90 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 10..90

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 63 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..45

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 89 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..63

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:22:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip0.500000\baselineskip

: 26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 9..41

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 65 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..45

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 9..20

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip0.500000\baselineskip

: 36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

\vskip0.500000\baselineskip

: 38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 288 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..288

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

\vskip0.500000\baselineskip

: 43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

\vskip0.500000\baselineskip

: 47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:

\vskip0.500000\baselineskip

: 51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:

\vskip0.500000\baselineskip

: 53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:

\vskip0.500000\baselineskip

: 55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:

\vskip0.500000\baselineskip

: 57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

: 59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:

\vskip0.500000\baselineskip

: 63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:

\vskip0.500000\baselineskip

: 65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64:

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65:

\vskip0.500000\baselineskip

: 67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67:

\vskip0.500000\baselineskip

: 69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68:

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:

\vskip0.500000\baselineskip

: 71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:

\vskip0.500000\baselineskip

: 73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:72:

\vskip0.500000\baselineskip

: 74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:73:

\vskip0.500000\baselineskip

: 75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HIBRIDACIÓN: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGIÁ; lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:77:

79

Claims

1. Método para el diseño de un péptido aislado con un extremo amino y un extremo carboxi que comprende:

al menos dos regiones derivadas de diferentes proteínas alergénicas del mismo género;

al menos dos regiones derivadas de diferentes proteínas alergénicas de especies con reactividad cruzada;

al menos dos regiones derivadas de diferentes proteínas alergénicas de la misma especie;

al menos dos regiones derivadas de diferentes proteínas alergénicas del mismo grupo; o

al menos dos regiones derivadas de diferentes proteínas alergénicas de la misma familia;

teniendo cada región un índice de estimulación de células T humanas de al menos 2,0 y comprendiendo al menos un epítopo de células T de una proteína alergénica seleccionada del grupo consistente en Dermatophagoides pteronyssinus I (Der p I), Dermatophagoides pteronyssinus II (Der p II), Dermatophagoides farinae I (Der f I), Dermatophagoides farinae II (Der f II), Ambrosia artemisiifolia I (Amba I), Ambrosia artemisiifolia II (Amba II), Lolium perenne I (Lol p I) y Lolium perenne II (Lol p IX), y en el que dichas regiones se disponen desde el extremo amino al extremo carboxi en orden diferente que las regiones en la proteína alergénica natural, comprendiendo las etapas de:

a): revisión de la estructura proteica conocida de una proteína alergénica;

b): división de la proteína alergénica en al menos dos regiones;

c): determinación de si las regiones de la etapa (b) tienen actividad estimulante de las células T;

d): disposición de las regiones para formar al menos un péptido en el que las regiones se disponen desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en un orden diferente de las regiones en la proteína alergénica natural; y

e): producción de al menos un péptido con la configuración de las regiones de la etapa (d).

2. Método mencionado en la reivindicación 1, que comprende además la etapa de determinación de si el péptido de la etapa (e) tiene actividad estimulante de células T.

3. Método mencionado en la reivindicación 1, que comprende la etapa de determinación de si el péptido se une específicamente a inmunoglobulina E para la proteína alergénica de la etapa (a).

4. Método mencionado en la reivindicación 1, en el que en la etapa (b) la proteína alergénica se divide en regiones solapadas.

5. Método mencionado en la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende además la determinación de si dichas regiones se unen específicamente a inmunoglobulina E para el alérgeno de la etapa (a) y causan la liberación de mediadores desde los mastocitos o basófilos.

6. Método mencionado en la reivindicación 1, en el que el péptido se produce de forma recombinante.

7. Método mencionado en la reivindicación 1, en el que el péptido se produce sintéticamente.

8. Método mencionado en la reivindicación 1, en el que el péptido comprende además un sitio proteolítico insertado entre al menos dos de dichas regiones.

9. Método mencionado en la reivindicación 1, en el que cada región comprende al menos dos epítopos de células T para la proteína alergénica.

10. Método mencionado en la reivindicación 1, en el que cada región comprende al menos aproximadamente treinta residuos de aminoácidos de la proteína alergénica.

11. Método mencionado en la reivindicación 1, en el que el péptido comprende al menos aproximadamente cuarenta residuos de aminoácidos de la proteína alergénica.

12. Método mencionado en la reivindicación 1, en el que el péptido comprende al menos aproximadamente el quince por ciento de los epítopos de células T de la proteína alergénica.

13. Método mencionado en la reivindicación 1, en el que el péptido comprende al menos aproximadamente el treinta por ciento de los epítopos de células T de la proteína alergénica.

14. Método para el diseño de un péptido aislado con un extremo amino y un extremo carboxi que comprende al menos dos regiones, teniendo cada una actividad estimulante de células T humanas, en el que cada región comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la secuencia X (SEQ ID NO: 7), la secuencia Y (SEQ ID NO: 8), la secuencia Z (SEQ ID NO: 9), la secuencia A (SEQ ID NO: 10) y la secuencia B (SEQ ID NO: 11) y en el que dichas regiones se disponen desde el extremo amino al extremo carboxi en un orden diferente que las regiones en la proteína alergénica natural, comprendiendo las etapas de:

b): división de la proteína alergénica en al menos dos regiones;