ES2300106T3 - Conjugados de agente de union al surco menor y oligonucleotidos unidos covalentemente. - Google Patents

Conjugados de agente de union al surco menor y oligonucleotidos unidos covalentemente. Download PDF

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Abstract

SE UNEN DE FORMA COVALENTE MOLECULAS CONECTORAS DE HENDIDURA MENOR A OLIGONUCLEOTIDOS, CUYA SECUENCIA DE BASES RESULTA COMPLEMENTARIA CON UNA SECUENCIA DIANA DE ARN, ADN MONOCATENARIO O BICATENARIO, O HIBRIDOS DE LOS MISMOS. LOS CONJUGADOS DE CONECTOR DE HENDIDURA MENOR UNIDO DE FORMA COVALENTE A OLIGONUCLEOTIDOS SE UNEN CON FUERZA A LA SECUENCIA DIANA DE LA CADENA COMPLEMENTARIA.

Description

Conjugados de agente de unión al surco menor y oligonucleótidos unidos covalentemente.
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos derivados de oligonucleótidos. Más particularmente, la presente invención se refiere a derivados de oligonucleótidos en los que una o más moléculas de unión al surco menor están unidas covalentemente al oligonucleótido. Los conjugados del resto de unión al surco menor del oligonucleótido muestran una fuerte afinidad para hibridar y unirse fuertemente a secuencias complementarias de ácidos nucleicos mono o bicatenarios y, por lo tanto, tienen utilidad como sondas con especificidad de secuencia y como agentes terapéuticos antisentido y anti-gen.
2. Breve descripción de la técnica anterior
En la técnica se conocen agentes de unión al surco menor que no se unen covalentemente al surco menor del ADN bicatenario. También se conocen bien en la técnica agentes intercalantes que se unen al ARN o ADN bicatenario. Los agentes intercalantes son, en términos generales, moléculas aromáticas planas que no se unen covalentemente al ARN o ADN bicatenario al colocarse (intercalarse) entre las bases de purina y pirimidina que interconectan bases de las dos cadenas del ADN bicatenario o ARN. La Patente de Estados Unidos No. 4.835.263 describe oligonucleótidos que se unen covalentemente a un grupo intercalante. Estos oligonucleótidos que llevan un grupo intercalante pueden ser útiles como sondas de hibridación.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a una combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor que incluye un oligonucleótido que tiene una pluralidad de unidades nucleotídicas, un extremo 3' y un extremo 5', y un resto de unión al surco menor unido covalentemente a al menos uno de dichos nucleótidos. El agente de unión al surco menor típicamente se une al oligonucleótido a través de un grupo de enlace que comprende una cadena de no más de 15 átomos. El resto de unión al surco menor es un radical de una molécula que tiene un peso molecular de aproximadamente 150 a aproximadamente 2000 Dalton, uniéndose dicha molécula de una manera no intercalante en el surco menor de ADN bicatenario, ARN o híbridos de los mismos con una constante de asociación mayor de aproximadamente 10^{3} M^{-1}.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al proceso de síntesis de ciertas combinaciones de oligonucleótido y agente de unión al surco menor unidos covalentemente y a la forma de usar estas combinaciones para una sonda de hibridación y para fines analíticos y de diagnóstico relacionados, así como para fines terapéuticos (antisentido y anti-gen).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de hibridación slot blot.
Descripción detallada de las realizaciones generales de la invención
Una característica prominente de la nueva composición de materia de la presente invención es que una molécula de unión al surco menor se une covalentemente a un oligonucleótido. Como se indica en la sección de introducción de la presente solicitud de patente, un agente de unión al surco menor es una molécula que se une dentro del surco menor de un ácido desoxirribonucleico (ADN) bicatenario. Aunque no puede proporcionarse una fórmula química general para todos los compuestos de unión al surco menor conocidos porque dichos compuestos tienen estructuras químicas que varían ampliamente, los compuestos que pueden unirse al surco menor del ADN, en términos generales, tienen una estructura tridimensional en forma de media luna. La mayoría de los compuestos que se unen al surco menor de la técnica anterior tienen una fuerte preferencia por regiones ricas en A-T (adenina y timina) de la forma B del ADN bicatenario. Los compuestos de unión al surco menor o, más exactamente, los restos indicados de los conjugados de oligonucleótido-agente de unión al surco menor de la presente invención, también tienen la misma preferencia. (Los conjugados de oligonucleótido-agente de unión al surco menor de la presente invención se denominan en lo sucesivo en algunas ocasiones ODN-MGB). Sin embargo, teóricamente también son posibles compuestos de unión al surco menor que muestren preferencia por regiones ricas en C-G (citosina y guanina). Por lo tanto, también están dentro del alcance de la presente invención compuestos ODN-MGB que incorporan un radical o resto derivado de moléculas de unión al surco menor que tiene preferencia por regiones C-G. La preferencia por regiones A-T de los agentes de unión al surco menor conocidos se explica actualmente por la existencia de una interferencia estérica desfavorable entre el grupo 2-amino de la guanina y algunos agentes de unión al surco menor bien conocidos. Sin embargo, como será evidente tras la consiguiente descripción adicional, cuando la guanina se reemplaza por hipoxantina en un ODN-MGB de la presente invención, ya no existe la posibilidad de que se produzca la interferencia estérica desfavorable indicada anteriormente y puede producirse una fuerte unión del ODN-MGB a una cadena complementaria.
En términos generales, los compuestos de unión al surco menor conocidos en la técnica anterior no se unen al ARN bicatenario o a un híbrido bicatenario de ADN y ARN.
Sin embargo, los compuestos ODN-MGB de la presente invención presentan potencial para unirse al ARN monocatenario, y la característica anterior constituye otro aspecto nuevo e interesante de la presente invención.
Son ejemplos de compuestos de unión al surco menor conocidos de la técnica anterior que pueden, de acuerdo con la presente invención, unirse covalentemente a ODN para constituir los nuevos conjugados ODM-MGB, ciertos compuestos naturales tales como netropsina, distamicina y lexitropsina, mitramicina, cromomicina A_{3}, olivomicina, antramicina, sibiromicina, así como otros antibióticos relacionados y derivados sintéticos. Ciertos compuestos heterocíclicos de amonio biscuaternarios, diarilamidinas tales como pentamidina, estilbamidina y berenilo, CC-1065 y polipéptidos de indol y pirroloindol relacionados, Hoechst 33258, 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) así como varios oligopéptidos constituidos por aminoácidos naturales o sintéticos, son compuestos de unión al surco menor. A continuación se ilustran las estructuras químicas de los ejemplos anteriores.
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Para los fines de la presente invención, una molécula es un agente de unión al surco menor si es capaz de unirse dentro del surco menor de un ADN bicatenario con una constante de asociación de 10^{3} M^{-1} o mayor. Este tipo de unión puede detectarse por procedimientos espectrofotométricos bien establecidos tales como espectroscopía ultravioleta (u.v.) y de resonancia magnética nuclear (rmn) y también por electroforesis en gel. Los cambios en el espectro u.v. después de la unión de una molécula de unión al surco menor, y la espectroscopía de rmn utilizando el efecto "Nuclear Overhauser" (NOSEY) son técnicas particularmente bien conocidas y útiles para este fin. La electroforesis en gel detecta la unión de un agente de unión al surco menor al ADN bicatenario o a un fragmento del mismo, porque después de dicha unión cambia la movilidad del ADN bicatenario.
Las moléculas o agentes intercalantes se distinguen fácilmente de los agentes de unión al surco menor basándose en que los agentes intercalantes son moléculas aromáticas planas (preferentemente policíclicas) frente a la "forma de media luna" o geometría análoga de los agentes de unión al surco menor. También puede realizarse una distinción experimental por espectroscopía de rmn utilizando el efecto Overhauser nuclear.
Como se ha indicado anteriormente, para los fines de la presente invención, una molécula es un agente de unión al surco menor si su constante de asociación dentro del surco menor del ADN bicatenario es de 10^{3} M^{-1} o mayor. Sin embargo, algunos agentes de unión al surco menor se unen a los sitios de alta afinidad del ADN bicatenario con una constante de asociación de la magnitud de 10^{7} a 10^{9} M^{-1}.
De acuerdo con la presente invención, la molécula de unión al surco menor se modifica, en esencia, se transforma en un "radical" y se une a una estructura covalente apropiada o cadena de átomos que unen el agente de unión al surco menor al ODN. En un sentido, la cadena de "unión" puede considerarse y algunas veces se considera parte del agente de unión al surco menor, ya que la naturaleza del enlace es tal que no afecta adversamente a las propiedades de unión al surco menor de la molécula ODN-MGB. Sin embargo, es mejor en la presente descripción separar conceptualmente el agente de unión al surco menor del grupo que lo une covalentemente al ODN. El radical "formado" a partir de la molécula de unión al surco menor se denomina en lo sucesivo "resto de unión al surco menor", y el enlace covalente (que puede ser una cadena de hasta aproximadamente 15 átomos) que une el resto de unión al surco menor al oligonucleótido se denomina "grupo de unión". Las realizaciones preferidas de los restos del surco menor de acuerdo con la presente invención se describen con detalle después de la descripción de la parte de oligonucleótido de los compuestos conjugados ODN-MGB de la presente invención.
Hablando en términos generales, la porción de oligonucleótido de los conjugados ODN-MGB de la presente invención comprende de aproximadamente 3 a 100 unidades nucleotídicas. Las unidades nucleotídicas que pueden incorporarse en los ODN de acuerdo con la presente invención incluyen las bases heterocíclicas principales que se encuentran de manera natural en ácidos nucleicos (uracilo, citosina, timina, adenina y guanina), así como modificaciones naturales y sintéticas y análogos de estas bases, tales como hipoxantina, 2-aminoadenina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-N^{4}-etenocitosina, 4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina y 6-amino-4-hidroxi-[3,4-d]pirimidina. A continuación se muestran las estructuras respectivas de los 2-desoxirribósidos de 5-N^{4}-etenocitosina, 4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina y de 6-amino-4-hidroxi-[3,4-d]pirimidina.
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Además, las unidades nucleotídicas que se incorporan en los ODN de los conjugados ODN-MGB de la presente invención pueden tener una función de entrecruzamiento (un agente alquilante) unida covalentemente a una o más de las bases, a través de un brazo de unión. Como los conjugados ODN-MGB que tienen un agente de entrecruzamiento unido forman una clase importante de realizaciones preferidas de la presente invención, estas estructuras se describirán con más detalle a continuación.
El "azúcar" o porción de glicósido de los ODN-MGB de la presente invención puede comprender desoxirribosa, ribosa, 2-fluororribosa, 2-O-alquil o alquenilribosa, donde el grupo alquilo puede tener de 1 a 6 carbonos y el grupo alquenilo de 2 a 6 carbonos. En los nucleótidos naturales y en las modificaciones y análogos descritos en este documento, el resto de desoxirribosa o ribosa forma un anillo de furanosa, el enlace glicosídico es de la configuración \beta y las bases de purina se unen al resto de azúcar a través de la posición 9, las pirimidinas a través de la posición 1 y las pirazolopirimidinas a través de la posición 1. Actualmente, se prefieren oligodesoxirribonucleótidos de acuerdo con la presente invención, y por lo tanto el azúcar preferido es 2-desoxirribosa. Las unidades nucleotídicas de los ODN están interconectadas por un esqueleto de "fosfato", como se conoce bien en la técnica. Los ODN de los conjugados ODN-MGB de la presente invención pueden incluir, además de los enlaces fosfodiéster "naturales", fosforotioatos y metilfosfonatos.
Los ODN de los conjugados ODN-MGB de la presente invención también pueden tener un "resto de cola" con un peso molecular relativamente bajo unido al extremo 3' o 5'. El "resto de cola" en este contexto particular debe distinguirse del resto de unión al surco menor, que con preferencia también se une al extremo 3' o 5', o a los dos. Por lo tanto, en este contexto, el "resto de cola", si está presente, se une al extremo del ODN que no tiene el resto de unión al surco menor. A modo de ejemplo, una molécula de cola puede ser un fosfato, un éster fosfato, un grupo alquilo y un grupo aminoalquio, o un grupo lipófilo.
Con respecto a las posibles variaciones de las unidades nucleotídicas, el "esqueleto de fosfato" y la "cola" de los ODN de los conjugados ODN-MGB de la presente invención, debe tenerse en consideración lo siguiente. La acción útil principal de los conjugados ODN-MGB de la presente invención reside en la capacidad de la parte ODN de la molécula de unirse a una secuencia complementaria en el ADN monocatenario, ARN, ADN bicatenario e híbridos de ADN-ARN, de una manera en la que el resto de unión al surco menor se incorpora en el "dúplex" recién formado y por lo tanto refuerza el enlace, es decir, aumenta la temperatura de fusión (y la constante de asociación) del dúplex recién formado. Además, las realizaciones preferidas de los conjugados ODN-MGB de la presente invención que incluyen un agente de entrecruzamiento, también dan como resultado una unión covalente permanente de la molécula de ODN-MGB a la cadena de ADN o ARN complementaria, dando como resultado una forma unida permanentemente. En vista de lo anterior, los expertos en la materia entenderán fácilmente que la principal limitación estructural de las diversas partes componentes de la parte de ODN del conjugado ODN-MGB de la presente invención reside únicamente en la capacidad de la parte de ODN de formar una cadena complementaria a cualquier secuencia diana específica, y que dentro de estos límites son posibles un gran número de modificaciones estructurales, conocidas en la técnica per se. Además, los procedimientos sintéticos para preparar las diversas bases heterocíclicas, nucleósidos, nucleótidos y oligonucleótidos que pueden formar la parte de ODN de los conjugados ODN-MGB de la presente invención, en términos generales, están bien desarrollados, y son conocidas en la técnica. Pueden prepararse N_{4},N_{4}-etano-5-metildesoxicitidina, sus nucleósidos, nucleótidos y/u oligonucleótidos que incorporan esta base, de acuerdo con las enseñanzas de Webb, T. R.; Matteucci, M.D. Nucleic Acids Res., 1986, 14, 7661-7674, Webb, T. R.; Matteucci, M.D. J. Am. Chem. Soc., 1986, 108, 2764. Pueden prepararse 4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina, 6-amino-4-hidroxipirazolo[3,4-d]pirimidina, sus nucleósidos, nucleótidos y oligonucleótidos que incorporan esta base, de acuerdo con las enseñanzas de Kazimierczuk et al. J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, 6379-6382. Mientras que la síntesis de oligonucleótidos, con el fin de preparar un ODN de secuencia predeterminada específica para que sea complementario a una secuencia diana, puede realizarse de acuerdo con el estado de la materia, a continuación se describe un procedimiento preferido. El procedimiento preferido incorpora las enseñanzas de la Patente de Estados Unidos Nº 5.419.966 (solicitud con número de
serie 08/090.408) presentada el 12 de julio de 1993, que ha sido concedida y cuya tasa de expedición se ha abonado.
El grupo de unión es un resto que une covalentemente la parte de ODN del conjugado con el resto de unión al surco menor. Con preferencia, el grupo de unión es tal que el enlace se produce a través de una cadena de no más de 15 átomos. También con preferencia, de acuerdo con la presente invención, el resto de unión al surco menor se une covalentemente con el extremo 3' o 5' del oligonucleótido. Sin embargo, la unión a un nucleótido en una posición intermedia, y particularmente a la base heterocíclica del nucleótido en la posición intermedia, también está dentro del alcance de la invención. En términos generales, el grupo de unión se obtiene a partir de una molécula bifuncional de manera que una funcionalidad tal como una funcionalidad amina se una, por ejemplo, al fosfato que se encuentra en el extremo 5' del ODN, y la otra funcionalidad, tal como un grupo carbonilo (CO), se una a un grupo amino del resto de unión al surco menor. Como alternativa, el grupo de unión puede obtenerse a partir de un amino alcohol de manera que la función alcohol se una, por ejemplo, al extremo 3'-fosfato del ODN y la función amino se una a un grupo carbonilo del resto de unión al surco menor. Otra alternativa más de un grupo de unión incluye un aminoalcohol (unido al 3'-fosfato con un enlace éster) unido a un ácido aminocarboxílico que a su vez está unido en un enlace peptídico al grupo carbonilo del agente de unión al surco menor. Por lo tanto, las realizaciones preferidas del grupo de unión tienen las fórmulas -HN(CH_{2})_{m}CO, O(CH_{2})_{m}CO y (CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH donde la limitación de m es que el resto de unión al surco menor no debe separarse por más de aproximadamente 15 átomos del ODN. Las realizaciones preferidas de los grupos de unión son -O(CH_{2})_{6}NH, -OCH_{2}CH(OH)CH_{2}NHCOCH_{2}CH_{2}NH y -HN(CH_{2})_{5}CO. Como se ha indicado anteriormente, el grupo de unión también puede estar conceptualizado como parte del resto de unión al surco menor, que en ese caso debería considerarse unido directamente al ODN.
La limitación básica para el resto de unión al surco menor se ha indicado anteriormente, y no puede definirse por la estructura química específica. Además de la estructura molecular que provoca la unión al surco menor, el resto de unión al surco menor también puede tener funciones adicionales, siempre que estas funciones no interfieran con la capacidad de unión al surco menor. Por ejemplo, un grupo reportador, que hace que el agente de unión al surco menor sea fácilmente detectable por color, espectro uv u otra característica física o química fácilmente perceptible, puede unirse covalentemente al resto de unión al surco menor. Un ejemplo de tal grupo reportador es una función diazobenceno que, en el ejemplo de una realización preferida, se une a una función carbonilo del agente de unión al surco menor a través de un enlace -HN(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}-. De nuevo, el grupo reportador u otra función parecida que lleva el agente de unión al surco menor también puede conceptualizarse como parte del propio resto de unión al surco menor.
Las realizaciones preferidas de los conjugados ODN-MGB se definen por la siguiente Fórmula química 1. Esta definición incluye las realizaciones preferidas del resto de unión al surco menor de acuerdo con la presente invención, que también pueden incluir todo o parte del grupo de unión y otros grupos colgantes tales como un grupo reportador, como se ha analizado anteriormente:
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en la que
x es O o S;
q es un número entero de 3 a 100;
R_{8} es H, OH, alcoxi que tiene de 1 a 6 carbonos, O-alquenilo C_{2}-C_{6} o F;
B es un aglicón seleccionado entre un grupo constituido por una base heterocíclica que se encuentra de manera natural en ácidos nucleicos e hipoxantina, 2-aminoadenina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-N^{4}-etenocitosina, 4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina y 6-amino-4-hidroxi-[3,4-d]pirimidina;
W_{1} es H, PO(OH)_{2} o una sal del mismo, o un resto de unión al surco menor unido al extremo 3' o 5' de dicho oligonucleótido, incluyendo el grupo W_{1} el grupo de unión que une covalentemente el resto de unión al surco menor con el oligonucleótido a través de no más de 15 átomos;
W_{2} está ausente o es un resto de unión al surco menor unido a uno de los aglicones B, incluyendo el grupo W_{2} el grupo de unión que une covalentemente el resto de unión al surco menor con dicho aglicón, o W_{2} es una funcionalidad de entrecruzamiento incluyendo un brazo enlazador que une covalentemente la funcionalidad de entrecruzamiento con dicho aglicón,
donde el resto de unión al surco menor es un radical de una molécula que tiene un peso molecular de aproximadamente 150 a aproximadamente 2000 Dalton que se une de manera no intercalante en el surco menor del ADN bicatenario, ARN o híbridos de los mismos con una constante de asociación mayor de aproximadamente 10^{3}, con la condición de que al menos uno de dichos grupos W_{1} y W_{2} sea un resto de unión al surco menor; y
donde además el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión tiene la fórmula seleccionada entre el grupo constituido por los grupos (a), (b), (c), (d) y (e):
(a)R_{1}-(HN-Y_{1}-CO)_{n}-R_{2}
donde Y_{1} representa un anillo de 5 miembros que tiene dos dobles enlaces y de 0 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por N, S y O, los grupos NH y CO están unidos respectivamente a dos carbonos del anillo que están separados entre sí por un átomo del anillo, el átomo del anillo situado entre dichos dos carbonos del anillo sólo está sustituido con H o está sin sustituir, pudiendo estar cada uno de los átomos restantes del anillo opcionalmente sustituidos con 1, 2 ó 3 grupos R_{3};
(b)R_{1}-(R_{6}N-Y_{2}-CO)_{n}-R_{2}
donde Y_{2} es un sistema de anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el sistema de anillos condensado de 0 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por N, S y O, cada uno de los grupos R_{6}N y CO está unido a un carbono del anillo que está en un anillo diferente del sistema de anillos condensados, y que es el segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo del anillo de cabeza de puente común, colocando por lo tanto los grupos CO y NR_{6} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el otro lado del sistema de anillos condensados, estando los dos átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del sistema de anillos condensado opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3};
(c)R_{1}-(CO-Y_{3}-NH)_{n}-R_{2}
donde Y_{3} es un anillo aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono del anillo, estando dichos carbonos del anillo en posición 1,4 entre sí, estando dos átomos del anillo no ocupados por los grupos CO o NH en uno de los dos lados del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos átomos del anillo no ocupados en el otro lado del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7};
(d)R_{1}-(HN-Y_{4}-HN-CO-Y_{4}-CO)_{p}-R_{2}
donde Y_{4} es un anillo aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono del anillo, estando dichos carbonos del anillo en posición 1,4 entre sí en cada anillo, estando dos átomos del anillo no ocupados por los grupos CO o NH en uno de los dos lados del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos átomos del anillo no ocupados en el otro lado del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7};
(e)R_{1}-(Y_{5})_{n}-R_{2}
donde Y_{5} es un sistema de anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el sistema de anillos condensado de 0 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por N, S y O, donde cada uno de los grupos R_{1} y R_{2} está unido a un carbono del anillo que está en un anillo diferente del sistema de anillos condensados, y que es el segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo del anillo cabeza de puente común, colocando los grupos R_{1} y R_{2} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el otro lado del sistema de anillos condensados, estando los dos átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del sistema de anillos condensados opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, -O-, -S-, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4}, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4}, -HN(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH-, o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4}, o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros condensado con el anillo Y_{1};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2}, N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{6} es H, alquilo de 1 a 5 carbonos, o R_{6} y R_{7} juntos forman un anillo de 4, 5 ó 6 miembros, siendo parte de dicho anillo opcionalmente un grupo -O-, -S-, -NH-, -NCH_{3}- o N-alquilo inferior;
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}- o -CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero entre 1 y 10;
n es un número entero entre 1 y 10, y
p es un número entero entre 1 y 5.
Son realizaciones aún más preferidas de los conjugados ODN-MGB de la presente invención aquellas en las que el resto de unión al surco menor es como se define a continuación:
(1) el resto de unión al surco menor se representa por la fórmula (a) anterior y el anillo de cinco miembros tiene la estructura
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(2) el resto de unión al surco menor se representa por la fórmula (a) anterior en la que el anillo de cinco miembros tiene la estructura
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y
(3) el resto de unión al surco menor se representa por la fórmula (b) y el sistema de anillos condensado tiene la estructura
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Realizaciones que contienen una funcionalidad de entrecruzamiento
Una clase de realizaciones preferidas de los conjugados ODN-MGB de la presente invención también incluye una o más funcionalidades de entrecruzamiento, con lo que después de que el conjugado ODN-MGB se una a una secuencia diana complementaria de ADN, ARN o un fragmento de la misma, la funcionalidad de entrecruzamiento reacciona de forma irreversible con la diana y forma un enlace covalente con ella. Las ventajas de dicha unión covalente con una secuencia diana están en el uso analítico y de diagnóstico, así como en sondas de hibridación, y en aplicaciones terapéuticas (anti-sentido y anti-gen). El resto de unión al surco menor que también se une covalentemente al ODN que complementa a la secuencia diana, potencia la unión no covalente inicial del conjugado ODN-MGB con la secuencia diana y, por lo tanto, facilita la unión covalente posterior a través de la función de entrecruzamiento. Las siguientes consideraciones son pertinentes en lo que respecta a las funcionalidades o agentes de entrecruzamiento incorporados en esta clase de conjugados ODN-MGB.
Los agentes de entrecruzamiento incorporados en la presente invención se unen covalentemente a un sitio del ODN-MGB. Su longitud y orientación estérica debe ser tal que puedan alcanzar un sitio de reacción adecuado en la secuencia diana de ADN o ARN después de que el ODN-MGB se hibride con la diana. Por definición, la funcionalidad o agente de entrecruzamiento tiene un grupo reactivo que reaccionará con un grupo reactivo de la secuencia diana de ADN o ARN. El agente (o agentes) de entrecruzamiento pueden unirse covalentemente a una o más de las bases heterocíclicas, a los restos de azúcar o de azúcar modificado, o a las funciones fosfato o fosfato modificado de los conjugados ODN-MGB. El agente de entrecruzamiento también puede unirse al resto de unión al surco menor siempre que no interfiera con su capacidad de unión al surco menor. Con preferencia, el agente o funcionalidad de entrecruzamiento se une a una de las bases heterocíclicas.
En términos sencillos, el propio agente de entrecruzamiento puede dividirse conceptualmente en dos grupos o restos, particularmente el grupo reactivo, que es típicamente y con preferencia un grupo saliente electrófilo (L), y un "brazo" (A) que une el grupo saliente L con el sitio respectivo del ODN-MGB. El grupo saliente L puede elegirse, por ejemplo, entre grupos tales como cloro, bromo, yodo, SO_{2}R''' o S^{+}R'''R'''', donde cada uno de R''' y R'''' es independientemente alquilo C_{1-6} o arilo o R''' y R'''' juntos forman un enlace alquileno C_{1-6}. Se prefieren cloro, bromo y yodo. Dentro de estos grupos, se prefieren grupos haloacetilo tales como -COCH_{2}I, y "mostazas nitrogenadas" bifuncionales, tales como -N-[(CH_{2})_{2}-Cl]_{2}. El grupo saliente se alterará por su capacidad de salida. Dependiendo de la naturaleza y reactividad del grupo saliente particular, el grupo a usar se elige en cada caso para dar la especificidad deseada de las sondas de unión irreversible.
Aunque, como se ha indicado anteriormente, el "brazo" (o brazo enlazador) A puede considerarse conceptualmente una sola entidad que une covalentemente el ODN-MGB con el grupo saliente L, y mantiene al grupo saliente L a una distancia deseada y en posición estérica relativa al ODN-MGB, en la práctica el "brazo" A puede construirse en un esquema sintético en el que una molécula bifuncional se une covalentemente al ODN-MGB, o al ODN antes de que el resto de unión al surco menor se una (por ejemplo, mediante un enlace éster fosfato al extremo 3' o 5', por medio de un enlace carbono a carbono a una base heterocíclica o por medio de un enlace carbono a nitrógeno con una base heterocíclica sustituida con amino) a través de su primera funcionalidad, y también se une covalentemente a través de su segunda funcionalidad (por ejemplo, una amina) a un "puente hidrocarbilo" (puente alquilo, puente alquilarilo o puente arilo, o similar) que, a su vez, lleva el grupo saliente L.
Una fórmula general de la función de entrecruzamiento es -A-L o -A-L_{2} donde L es el grupo saliente definido anteriormente y A es un resto que se une covalentemente al ODN-MGB. El resto de "brazo" A no debe ser reactivo por sí mismo (al contrario que a través del grupo saliente L) en las condiciones de hibridación del ODN-MGB con la secuencia diana, y debe mantener al grupo saliente L en una posición estérica y a una distancia deseadas del sitio deseado de reacciones, tal como en la posición N-7 de un resto guanosina de la secuencia diana. En términos generales, la longitud del grupo A debe ser equivalente a la longitud de una cadena alquilo normal de aproximadamente 2 a 20 carbonos.
Una fórmula más específica ejemplar para una clase de realizaciones preferidas de la función de entrecruzamiento es
-(CH_{2})_{q} - Y - (CH_{2})_{m} - L,
en la que L es el grupo saliente, definido anteriormente, cada uno de m y q es independientemente de 0 a 8, ambos incluidos, y en la que Y se define como un "grupo de unión funcional". Para que la descripción esté más clara, este "grupo de unión funcional" debe distinguirse del "grupo de unión" que une el resto de unión al surco menor con el ODN, aunque los grupos de unión funcionales descritos en este documento para la unión del agente de entrecruzamiento también pueden usarse para unir un resto de unión al surco menor con cualquier extremo del ODN, o con un nucleótido en posición intermedia del ODN. Un "grupo de unión funcional" es un grupo que tiene dos funcionalidades, por ejemplo -NH_{2} y -OH, o -COOH y -OH, o -COOH y -NH_{2}, que son capaces de unir los puentes (CH_{2})_{q} y (CH_{2})_{m}.
Un extremo acetilénico (HC\equivC-) también es una funcionalidad adecuada para Y, debido a que puede acoplarse con ciertos heterociclos, como se describe a continuación.
Otras fórmulas ejemplares y más específicas para una clase de realizaciones preferidas de la función de entrecruzamiento son
-(CH_{2})_{q}-NH-CO-(CH_{2})_{m}-(X)_{n}-N(R_{1})-(CH_{2})_{p}-L
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y
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-(CH_{2})_{q'}-O-(CH_{2})_{q''}-NH-CO-(CH_{2})_{m}-(X)_{n}-N(R_{1})-(CH_{2})_{p}-L
en las que q, m y L son como se han definido anteriormente con respecto a la descripción de las funciones de entrecruzamiento, q' es de 3 a 7, ambos incluidos, q'' es de 1 a 7, ambos incluidos, X es fenilo o fenilo monosustituido (tal como fenilo sustituido con cloro, bromo, alquilo inferior o alcoxi inferior), n es 0 ó 1, p es un número entero de 1 a 6, y R_{1} es H, alquilo inferior o (CH_{2})_{p}-L. Con preferencia, p es 2. Los expertos en la materia apreciarán que la estructura -N(R_{1})-(CH_{2})_{2}-L describe una "mostaza nitrogenada", que es una clase de agentes alquilantes potentes. Dentro de esta clase de conjugados ODN-MGB, se prefieren particularmente aquellos en los que el agente de entrecruzamiento incluye la funcionalidad -N(R_{1})-(CH_{2})_{2}-L, en la que L es halógeno, con preferencia cloro; y se prefieren aún más los conjugados ODN-MGB en los que el agente de entrecruzamiento incluye la agrupación -N-[(CH_{2})_{2}-L]_{2} (una N-mostaza "bifuncional").
Una estructura particularmente preferida del agente de entrecruzamiento incluye la agrupación
-CO-(CH_{2})_{3}-C_{6}H_{4}-N-[(CH_{2})_{2}Cl]_{2}.
En una realización preferida, el grupo de entrecruzamiento que se acaba de mencionar se une a una cola que lleva n-hexilamina en los extremos 5' y 3' del ODN de acuerdo con la siguiente estructura:
R'-O-(CH_{2})_{6}-NH-CO-(CH_{2})_{3}-C_{6}H_{4}-N-[(CH_{2})_{2}Cl]_{2}
en la que R' significa el grupo 5' o 3'-fosfato terminal del ODN. El otro extremo, o un nucleótido en una posición intermedia, lleva el resto de unión al surco menor.
De acuerdo con otras realizaciones preferidas, la funcionalidad de entrecruzamiento se une covalentemente a la base heterocíclica, por ejemplo al resto uracilo de un componente de ácido 2'-desoxiuridílico del conjugado ODN-MGB. El enlace puede producirse a través de un grupo amino, es decir, la "combinación de brazo-grupo saliente" (A-L) puede unirse a una unidad componente de ácido 5-amino-2'-desoxiuridílico del ODN. En otras realizaciones preferidas, la "combinación de brazo-grupo saliente" (A-L) se une a la posición 5 de la unidad componente de ácido 2'-desoxiuridílico del ODN mediante un enlace carbono-carbono. El términos generales, pueden obtenerse -2'-desoxiuridinas 5-sustituidas por una adaptación del procedimiento general de Robins et al. (Can. J. Chem., 60: 554 (1982); J. Org. Chem., 48: 1854 (1983)). De acuerdo con esta adaptación, el acoplamiento mediado con paladio de un 1-alquino sustituido con 5-yodo-2'-desoxiuridina da un producto acoplado con acetileno. El análogo de dUrd acetilénico se reduce, por ejemplo, con níquel Raney, para dar el compuesto saturado, que después se usa para la conversión directa en un reactivo para uso en un sintetizador de ADN automático. Los ejemplos de reactivos que pueden acoplarse a 5-yodo-2'-desoxiuridina de acuerdo con este procedimiento son HC\equivCCH_{2}OCH_{2}CH_{2}N(CO)_{2}C_{6}H_{4} (ftalimidoetoxipropino) y HC\equivCCH_{2}OCH_{2}CH_{2}NHCOCF_{3} (trifluoroacetamidoetoxipropino).
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En estos ejemplos, los nucleósidos que se obtienen en este esquema se incorporan en el ODN deseado, y la porción alquilante del agente de entrecruzamiento se une al grupo amino terminal sólo después de la retirada de los grupos bloqueantes ftálicos o de trifluoroacetilo respectivos. Otros ejemplos de nucleótidos en los que el agente de entrecruzamiento se une a una base heterocíclica son derivados de 2'-desoxi-4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina. Estos compuestos pueden prepararse de acuerdo con las enseñanzas de la publicación de solicitud PCT WO: 90/03370 (publicada el 4/05/90).
Analizando aún en términos generales las estructuras de los ODN modificados de la presente invención, se aprecia que el examen del ADN bicatenario mediante modelos de bolas y varillas y gráficos computarizados de alta resolución indica que la posición 7 de las purinas y la posición 5 de las pirimidinas residen en el surco mayor del dúplex de forma B de los ácidos nucleicos bicatenarios. Estas posiciones pueden estar sustituidas con cadenas laterales de volumen considerable sin interferir con las propiedades de hibridación de las bases. Estos brazos laterales pueden introducirse por derivatización de dThd o dCyd, o por síntesis total sencilla de la base heterocíclica, seguido de glicosilación. Estos nucleósidos modificados pueden convertirse en los nucleótidos activados apropiados para la incorporación en oligonucleótidos con un sintetizador de ADN automático. Con las pirazolo[3,4-d]pirimidinas, que son análogos de adenina, el brazo de entrecruzamiento se une a la posición 3, que es equivalente a la posición 7 de
purina.
La cadena lateral de entrecruzamiento (brazo = A) debe tener una longitud suficiente para alcanzar el otro lado del surco mayor desde la posición 7- u 8- de purina, la posición 5 de pirimidina, la posición 5 de pirrolopirimidina o la posición 3 de pirazolopirimidina y reaccionar con el N-7 de una purina (con preferencia guanina) situada por encima (sobre el lado 3' del oligómero), conteniendo el par de bases el análogo modificado. La cadena lateral de entrecruzamiento (brazo = A) sostiene el grupo funcional lejos de la base cuando la base se empareja con otra dentro del complejo bicatenario. Como se ha indicado anteriormente, el brazo A debe ser equivalente en longitud a una cadena alquilo normal de 2 a 20 carbonos. Con preferencia, los brazos incluyen grupos alquileno de 1 a 12 átomos de carbono, grupos alquenileno de 2 a 12 átomos de carbono y 1 ó 2 enlaces olefínicos, grupos alquinileno de 2 a 12 átomos de carbono y 1 ó 2 enlaces acetilénicos, o dichos grupos están sustituidos en un punto terminal con grupos nucleófilos tales como oxi, tio, amino o derivados químicamente bloqueados de los mismos (por ejemplo, trifluoroacetamido, ftalimido, CONR', NR'CO y SO_{2}NR', donde R' = H o alquilo C_{1-6}). Dichas funcionalidades, incluyendo aminas alifáticas o aromáticas, muestran propiedades nucleófilas y son capaces de servir como punto de unión para grupos tales como
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-(CH_{2})_{m}-L, y
-CO-(CH_{2})_{m}-(X)_{n}-N(R_{1})-(CH_{2})_{p}-L
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que se han descrito anteriormente como componentes de grupos funcionales de entrecruzamiento ejemplares.
Después de que se prepare la unidad nucleosídica o nucleotídica que tiene la funcionalidad de entrecruzamiento A-L, o un precursor adecuado de la misma (tal como el grupo -(CH_{2})_{q}-NH_{2} o -(CH_{2})_{q}-Y, donde Y termina con un grupo nucleófilo tal como NH_{2}), puede realizarse la preparación adicional de los oligonucleótidos modificados de la presente invención de acuerdo con lo establecido en esta materia. Por lo tanto, para preparar oligonucleótidos, se introducen grupos protectores en los nucleósidos o nucleótidos y los compuestos se activan para el uso en la síntesis de oligonucleótidos. La conversión en formas protegidas y activadas puede seguir los procedimientos que se describen con detalle para 2'-desoxinucleósidos en diversas revisiones. Véase Sonveaux, Bioorganic Chemistry, 14: 274-325 (1986); Jones, en "Oligonucleotide Synthesis, a Practical Approach", M. J. Gait, Ed., IRL Press, p. 23-35
(1984).
Los nucleótidos activados se incorporan en oligonucleótidos de una manera análoga a la empleada para nucleótidos de ADN y ARN, ya que los nucleótidos correctos se unirán secuencialmente para formar una cadena de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en el ADN o ARN diana. Los nucleótidos pueden incorporarse enzimáticamente o por síntesis química. Los nucleótidos pueden convertirse en sus derivados de cianoetil éster de 5'-O-dimetoxitritil-3'-(N,N-diisopropil)fosforamidita, e incorporarse en oligonucleótidos sintéticos siguiendo los procedimientos de "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", supra. Después, los grupos N-protectores se retiran, junto con los otros grupos bloqueantes de oligonucleótidos, por aminolisis posterior a la síntesis, mediante procedimientos conocidos generalmente en la técnica.
En una realización preferida, los nucleótidos activados pueden usarse directamente en un sintetizador de ADN automático de acuerdo con los procedimientos e instrucciones del sintetizador particular empleado. Los oligonucleótidos pueden prepararse en el sintetizador usando la química de fosforamidita o de H-fosfonato estándard comercial.
Puede añadirse un resto que contiene el grupo saliente, tal como un grupo haloacilo o un grupo -CO-(CH_{2})_{m}-(X)_{n}-N(R_{1})-(CH_{2})_{p}-L (con más preferencia, un CO-(CH_{2})_{3}-C_{6}H_{4}-N-[CH_{2}CH_{2}Cl]_{2}) al aminoalquilo o colas similares
(-CH_{2})_{q}-Y) después de la incorporación en los oligonucleótidos y de la retirada de cualquier grupo bloqueante.
En las situaciones en las que el agente de entrecruzamiento (resto A-L) se une al extremo 3' o 5' del oligonucleótido, por ejemplo mediante un enlace alquilamina de la fórmula -(CH_{2})_{q}-Y (Y termina en una amina), la síntesis de oligonucleótidos puede realizarse produciendo primero el oligonucleótido con dicha cola de aminoalquilo, en la que después se introduce un resto alquilante, tal como el grupo haloacilo indicado anteriormente o -CO-(CH_{2})_{m}-(X)_{n}-N(R_{1})-(CH_{2})_{p}-L.
Una realización preferida ejemplar de un conjugado ODN-MGB que tiene un agente de entrecruzamiento unido a una de las bases nucleotídicas se representa por la siguiente fórmula:
5'-GGTTATTTTTGAAGATACGAATTTCUCCAGAGACACAGCAGGATTTGTCA-CDPI_{3}
en la que el símbolo subrayado "U" (la 26ª unidad nucleotídica del 50-mero) representa una 5-(3-aminopropil)-2'-desoxiuridina que tiene un resto clorambucilo unido al grupo amino. El símbolo "CDPI_{3}" representa un resto de unión al surco menor como se describe a continuación con respecto al Esquema de Reacción 1. El componente 5-(3-aminopropil)-2'-desoxiuridina se incorpora en el ODN usando 3'-(N,N-diisopropil-cianoetil)-fosforamidita de 5'-O-tritil-5-trifluoroacetamidopropil-2'-desoxiuridina de acuerdo con el procedimiento de Gibson, K.J., & Benkovic, S.J. (1987) Nucleic Acids Res. 15, 6455. El residuo clorambucilo y el resto de unión al surco menor se introducen en el ODN como se describe a continuación en la sección experimental.
Síntesis de restos de unión al surco menor y conjugados ODN-MGB
Las realizaciones más preferidas actualmente de los restos de unión al surco menor de la presente invención son "oligopéptidos" obtenidos a partir de ácido 1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico (CDPI) y de ácido 4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico. Éstos son péptidos sintéticos que tienen unidades de repetición de las estructuras mostradas respectivamente en la Fórmula 2 y en la Fórmula 4, donde el grado de polimerización (m) del péptido es con preferencia de 3 a 5, con más preferencia 5, para el péptido de Fórmula 2 y 3 para el péptido de Fórmula 4. El Esquema de Reacción 1 describe un proceso para preparar un tripéptido específico abreviado como "CDPI_{3}" que después puede acoplarse con o sin modificación minoritaria a los ODN, para formar realizaciones preferidas de los conjugados ODN-MGB de la presente invención.
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Esquema de Reacción 1
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Con respecto al Esquema de Reacción 1, el material de partida en este esquema sintético es ácido 3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico o ácido 3-t-butiloxicarbonil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico que pueden prepararse de acuerdo con la bibliografía química (D.L. Boger, R.S. Coleman y B.J. Invergo, J. Org. Chem., 1987, Vol. 52, 1521-1530). Los compuestos de partida se convierten en un éster activo por tratamiento con el tetrafluorofenil éster del ácido trifluoroacético (TFP-TFA). En el compuesto 1a mostrado en el esquema, el grupo R es CONH_{2}, en 1b R es t-butiloxicarbonilo (^{t}Boc). El grupo t-butiloxicarbonilo (^{t}Boc) es un grupo protector bien conocido para funciones amino que puede retirarse con un ácido. Los ésteres activados resultantes 1a y 1b se hacen reaccionar con 1,2-dihidro-3H-pirroloindolo-7-carboxilato de metilo (también disponible de acuerdo con la bibliografía química, véase D.L. Boger, R.S. Coleman y B,J. Invergo, J. Org. Chem., 1987, Vol. 52, 1521-1530) para producir los compuestos peptídicos "diméricos" 2a y 2c. El grupo metilo de la función carboxilo se retira por tratamiento con una base para producir los péptidos "diméricos" en los que el grupo ácido carboxílico está libre. Este dímero se activa una vez más para formar un éster activo con tetrafluorofenol (2e cuando R = CONH_{2}, TFP-CDPI_{2}; y 2f cuando R = ^{t}Boc, TFP-^{t}Boc-CDPI_{2}). Después de la activación con TFP-TFA, el éster activo del dímero puede usarse para formar el conjugado ODN-MGB como se describe a continuación con respecto al trímero correspondiente. El éster activado del péptido dimérico también puede hacerse reaccionar con otra molécula más de 1,2-dihidro-3H-pirroloindol-7-carboxilato de metilo para formar un "péptido trimérico" que tiene su función ácido carboxílico protegida en forma de un éster metílico, 3a (trímero 3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato de metilo). El grupo metilo se retira por tratamiento con una base y el "péptido trimérico" resultante 3b se convierte de nuevo en un tetrafluorofenil éster activado 3c (trímero 3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo, TFP-CDPI_{3}). El tetrafluorofenil éster activo 3c puede usarse para alargar adicionalmente la cadena peptídica repitiendo las etapas de reacción con 1,2-dihidro-3H-pirroloindolo-7-carboxilato de metilo, saponificando el éster metílico resultante y, si se desea, haciéndolo reaccionar de nuevo con TFP-TFA para preparar el tetrafluorofenil éster activo del péptido que incorpora 4 restos CDPI. Como se apreciará fácilmente, estas etapas pueden repetirse adicionalmente hasta que se incluya el número deseado de restos CDPI en el péptido. En las realizaciones preferidas descritas en este documento, el tetrafluorofenil éster activo del tripéptido 3c (TFP-CDPI_{3}) se utiliza para el acoplamiento con un ODN para preparar un ODN-MGB, o para sintetizar un ODN-MGB en un soporte sólido de vidrio de poro controlado (CPG) modificado adecuado como se describe a continuación con respecto a los Esquemas de Reacción 4 y 5. El Esquema de Reacción 1 indica como su última etapa la preparación de un derivado de hidroxilpropilamida a partir del tetrafluorofenil éster activo del tripéptido 3c (TFP-CDPI_{3}). El derivado de hidroxilpropilamida del tripéptido 3d (trímero 3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxi)-1-amido-3-propanol, CDPI_{3}-3-hidroxipropilamida) puede usarse para el acoplamiento con un ODN para obtener un ODN-MGB de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, el tripéptido 3d también puede usarse como una molécula de unión al surco menor "que permanece libre" como control en ciertos estudios de unión que se describen a continuación.
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Esquema de Reacción 2
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Ahora, con respecto al Esquema de Reacción 2, se describe la síntesis de otra realización preferida de los péptidos de unión al surco menor, donde el "monómero" es el resto de ácido 4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico, y cuya realización también tiene un grupo reportador que contiene un resto diazobenceno. Por lo tanto, de acuerdo con este esquema, el ácido 6-[(terc-butiloxi)carboxamido]hexanoico se condensa en presencia de N,N-diciclohexilcarbodiimida con 2-[4-(fenilazo)-benciltio]-etanol para formar 5-[(terc-butiloxi)carboxamido]pentilcarboxilato de 2-[4-(fenilazo)-benciltio]etil, 11). El grupo protector de ^{t}Boc se retira del compuesto 11 por tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) y el compuesto resultante que tiene una función amino libre se hace reaccionar con un éster activado del ácido 4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico protegido con ^{t}Boc. El último compuesto de éster activado (1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamido-pirrolo-2-carboxilato de 1,2,3-benzotriazol-1-ilo) se prepara a partir de ácido 1-metil-4-[terc-butiloxi]carboxamido]pirrolo-2-carboxílico, que está disponible conforme al procedimiento bibliográfico de L. Grehn, V. Ragnarsson, J. Org. Chem., 1981, 46, 3492-3497. El 5-[1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo, 12) resultante tiene una unidad del residuo monómero "ácido 2-amino-N-metilpirrolocarboxílico" unido al grupo reportador que tiene el resto diazobenceno. Después, puede realizarse la retirada del grupo protector de ^{t}Boc con ácido trifluoroacético y del acoplamiento con una o más moléculas de 1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamido-pirrolo-2-carboxilato de 1,2,3-benzotriazol-1-ilo, hasta que se obtenga un péptido que contiene el número deseado de residuos de monómero. Tal compuesto que tiene un número n de monómeros y un grupo amino libre se indica en el Esquema de Reacción 2 como 16a. El compuesto 16a puede hacerse reaccionar con un éster activado (tal como un éster activado de 1,2,3-benzotriazol-1-ilo) del ácido 6-aminohexanoico protegido con ^{t}Boc para proporcionar el oligopéptido mostrado como compuesto 16b en el Esquema de Reacción 2. El grupo protector de ^{t}Boc puede retirarse del último compuesto en condiciones ácidas, y el derivado resultante que tiene una función amino libre puede unirse por procedimientos sintéticos convencionales a cualquiera de los extremos 3'-fosfato o 5'-fosfato de un ODN. Como alternativa, el derivado que tiene una función amino libre también puede unirse al extremo 3' o 5'-OH de un oligonucleótido usando una diversidad de grupos de unión bifuncionales, como se ha analizado anteriormente.
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Esquema de Reacción 3
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Ahora, con respecto al Esquema de Reacción 3, se ilustra un procedimiento general para el acoplamiento de un ODN de cola 3'-amino o 5'-amino con los oligopéptidos de unión al surco menor ejemplares activados con tetrafluorofenil (TFP) éster. Aunque los esquemas muestran el uso de los compuestos de unión al surco menor ejemplares activados con TFP obtenidos de acuerdo con el Esquema de Reacción 1, debe tenerse en mente que este procedimiento general también es adecuado para el acoplamiento de otros compuestos de unión al surco menor activado con TFP con los ODN. Las referencias numéricas 1a a 3c en el Esquema de Reacción 3 se refieren a los compuestos ejemplares obtenidos de acuerdo con el Esquema de Reacción 1.
Los ODN con cola 3'- o 5'-amino pueden sintetizarse por procedimientos convencionales; por ejemplo, un residuo aminohexilo puede unirse a cualquier extremo del ODN usando fosforamidita de N-monometoxitritilaminohexilo disponible en el mercado. Como alternativa, los ODN de cola amino pueden sintetizarse de acuerdo con los procedimientos descritos en la Patente U.S. No. 5.419.966 (solicitud con número de serie 08/090.408) presentada el 12 de julio de 1993, que ha sido concedida y cuya tasa de ha sido abonada. La memoria descriptiva de la solicitud con número de serie 08/090.408 se incorpora expresamente en este documento como referencia. De acuerdo con el presente esquema, el ODN de cola amino se convierte en una sal de cetiltrimetilamonio para que sea soluble en disolventes orgánicos, y la molécula de unión al surco menor activada con tetrafluorofenil éster se condensa con ella, con preferencia en DMSO como disolvente.
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Esquema de Reacción 4
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El Esquema de Reacción 4 describe otro procedimiento de acoplamiento de un éster activo de una molécula de unión al surco menor con un ODN de cola 5'-amino. El ejemplo mostrado en el esquema es el del éster de TFP del tripéptido obtenido a partir de residuos de ácido 3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico (TFP-CDPI_{3}) pero debe apreciarse que los principios genéricos descritos con respecto a este esquema de reacción pueden usarse también con otras moléculas de unión al surco menor. En este procedimiento, el ODN aún está unido a un soporte de CPG, y tiene un grupo amino libre en su "cola amino". Éste puede obtenerse usando el fosforamidita de N-monometoxitritilaminohexilo mencionado anteriormente. El grupo monometoxitritilo se retira después del acoplamiento del fosforamidita para dar el "ODN de cola amino" que tiene CPG. Como alternativa, dicho CPG- puede obtenerse de acuerdo con la descripción de la Patente de Estados Unidos Nº 5.419.966 (solicitud con número de serie 08/090.408), y referencias citadas en ese documento. A modo de resumen, el ODN se sintetiza por etapas unido al CPG, y tiene una cola que tiene un grupo amino protegido con un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Después de que se haya construido la secuencia deseada de nucleótidos, el grupo Fmoc se retira del grupo amino mientras que el ODN aún está unido al soporte de CPG. De acuerdo con el Esquema de Reacción 4 de la presente invención, este "ODN de cola amino que tiene CPG" que tiene el grupo amino libre se condensa con el éster activo (TFP-CDPI_{3}, 3c) o con una forma activada similar de un agente de unión al surco menor. Después, el conjugado de ODN-MGB se retira del soporte de CPG por procedimientos convencionales, más frecuentemente por tratamiento con
amoniaco.
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Esquema de Reacción 5
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El Esquema de Reacción 5 describe otro procedimiento preferido para preparar los ODN-MGB de la presente invención. Más particularmente, el Esquema de Reacción 5 describe el proceso sintético preferido para preparar los ODN-MGB uniendo primero una molécula de unión a un soporte de CPG, uniendo después una forma activada del agente de unión al surco menor con la molécula de unión y construyendo después el ODN de la secuencia etapa a etapa en un sintetizador de ODN automático usando el soporte de CPG descrito ya modificado. El conjugado ODN-MGB se retira del soporte de CPG sólo después de que se haya completado el resto ODN de la secuencia deseada. En este caso, la molécula de unión es una molécula trifuncional, donde cada función tiene una reactividad diferente, lo que permite la unión al CPG, la reacción con la forma activada del resto de unión al surco menor y la construcción de la porción de ODN, cada una usando una funcionalidad diferente de la molécula de unión. Una descripción más general y detallada de este procedimiento sintético y de las moléculas de unión trifuncionales que pueden utilizarse en el procedimiento, pero sin ninguna referencia a los agentes de unión al surco menor, puede encontrarse en la Patente U.S. No. 5.419.966 (solicitud con número de serie 08/090.408). El Esquema de Reacción 5 ilustra este proceso sintético con el ejemplo de \beta-alanilil-3-amino-1,2-propanodiol como molécula de unión trifuncional y TFP-CDPI_{3} (compuesto 3c) como forma activada del agente de unión al surco menor.
Por lo tanto, de acuerdo con el Esquema de Reacción 5, se hace reaccionar \beta-alanina protegida con Fmoc con trifluoroacetato de tetrafluorofenilo (TFP-TFA) para proporcionar 3-[N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)]-aminopropionato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (4). El éster activado 4 se hace reaccionar con 3-amino-1,2-propanodiol para proporcionar 1-[3-[N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2,3-propanodiol (5). El grupo hidroxilo primario de 5 se protege después con un grupo dimetoxitritilo para dar 1-[3-[N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2-[[bis(metoxifenil)fenilmetoxi]metil]-2-etanol (6). El grupo hidroxilo secundario del compuesto 6 se hace reaccionar con anhídrido succínico y el grupo carboxílico del compuesto resultante se convierte después en un éster activo, 1-[3-[N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2-[[bis(metoxifenil)fenilmetoxi]metil]-2-etil-butanodioato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (7). Después, el compuesto 7 se une a un soporte de vidrio poroso controlado por aminoalquilo de cadena larga (LCAA-CPG, o alquilamina CPG) que está disponible en el mercado y se ha descrito en la Patente U.S. No. 5.419.966 citada anteriormente (solicitud con número de serie 08/090.408). El "CPG modificado" resultante se muestra en el Esquema de Reacción 5 como compuesto 8. El grupo protector de Fmoc se retira de 8 por tratamiento con una base débil (piperidina en dimetilformamida) para producir el "CPG modificado" 9 que tiene una función amina primaria libre como parte de la molécula de unión. En la siguiente etapa, la molécula de unión al surco menor activada, en este caso TFP-CDPI_{3} (compuesto 3c) se hace reaccionar con la función amina primaria de 9, para producir el CPG modificado 10 que incluye el resto de unión al surco menor y aún tiene el grupo hidroxilo primario del grupo de unión protegido con un grupo dimetoxitritilo. Aunque esto no se muestra en el Esquema de Reacción 5, en las siguientes etapas se retira el grupo dimetoxitritilo y se realiza la síntesis del ODN en un sintetizador automático, por etapas que ahora se consideran convencionales en la técnica. Cuando se completa la síntesis, el conjugado ODN-MGB se retira del soporte de CPG por tratamiento con amoniaco. La última etapa escinde el enlace que une al grupo hidroxilo secundario del resto 3-amino-1,2-propanodiol al soporte de CPG.
Ensayos Biológicos y Análisis
Los conjugados ODN-MGB se unen al ADN monocatenario. También se unen al ADN bicatenario en presencia de una enzima recombinasa, y en algunos casos al ARN monocatenario y también a híbridos de ADN y ARN. Sin embargo, la unión se produce únicamente si el resto de ODN es complementario, o sustancialmente complementario en el sentido de Watson-Crick, a una secuencia diana en el ADN o ARN diana. Cuando se cumple esta condición, la unión del ODN-MGB con la secuencia diana es significativamente más fuerte que la unión que se produciría si el mismo ODN no tuviera el agente de unión al surco menor. Lo anterior se demuestra por los ensayos que se describen a continuación, y proporciona utilidad para los conjugados ODN-MGB de la presente invención como sondas de hibridación analíticas y diagnósticas para secuencias diana de ADN o ARN, y en aplicaciones terapéuticas antisentido y anti-gen.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Datos de T_{m} del dúplex (dAp)_{8}+(dTP)_{8} que transporta intercaladores o residuos de oligo-(1-metil-2- carboxil-4-amino)pirrol unidos al extremo 3' del ODN.^{a}
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La Tabla 1 ilustra la temperatura de fusión de diversos complejos formados por oligonucleótidos complementarios que tienen el resto de unión al surco menor obtenido a partir de restos de ácido 4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico. El resto de unión al surco menor se muestra específicamente como el radical X por la fórmula que se encuentra bajo la Tabla 1. Debe apreciarse que el radical X también incluye un resto de unión que se obtiene a partir de ácido 6-aminohexanoico. Los oligonucleótidos utilizados aquí son 8-meros de ácido 2'-desoxiadenílico, y 8-meros de ácido timidílico. El agente de unión al surco menor X se une a los ODN en el extremo 3'-fosfato, y el extremo 5' de estos ODN no tiene fosfato. A este respecto, debe apreciarse que los ODN se abrevian en esta y otras tablas de la manera habitual en la técnica. El grupo Y simboliza un residuo de bromuro de etidio unido al extremo 3'-fosfato a través de un resto de unión "\beta-alanina". El grupo Y representa un grupo de intercalación y actúa como control para la comparación con los grupos de unión al surco menor. El símbolo m representa el número de residuos de ácido 4-amino-N-metil-pirrolo-2-carboxílico presentes en cada ODN-MGB de la tabla.
Como se conoce en la técnica, la temperatura de fusión (T_{m}) de un dúplex de oligonucleótidos o polinucleótidos se define como la temperatura a la que el 50% del oligonucleótido o polinucleótido respectivo se disocia de su dúplex, la forma unida por enlaces de hidrógeno de Watson Crick. Una temperatura de fusión mayor (T_{m}) significa un dúplex más estable. Como se sabe también, la temperatura de fusión de un oligonucleótido o polinucleótido depende de la concentración del nucleótido en la solución en la que se mide la temperatura de fusión, de manera que mayores concentraciones dan como resultado mayores temperaturas de fusión medidas. Las temperaturas de fusión indicadas en estas tablas se midieron en las condiciones indicadas en la tabla y en la sección experimental. \DeltaT_{m} representa el cambio en la temperatura de fusión del dúplex modificado en relación con la temperatura de fusión del complejo (dAp)_{8}\cdot(dTp)_{8} que no tiene resto de unión al surco menor.
Como puede observarse en la Tabla 1, el resto de unión al surco menor unido covalentemente aumenta significativamente la estabilidad (temperatura de fusión T_{m}) del complejo, tanto si el grupo X (resto de unión al surco menor) se une al oligonucleótido (dTp)_{8} como si se une al (dAp)_{8}. En este caso, el mayor grado de estabilización (mayor temperatura de fusión) se alcanza cuando el resto de unión al surco menor es un oligopéptido 5-mero. En el experimento comparativo, cuando el grupo de intercalación Y se une al oligómero (dAp)_{8}, se logra un grado de estabilización comparativamente mucho menor. Incluso uniendo el grupo de intercalación Y a cada una de las dos cadenas de oligómeros en este experimento, la temperatura de fusión aumentaba menos que el resto de unión al surco menor que tenía cinco residuos de ácido 4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico.
TABLA 2 Datos de T_{m} de los dúplex formados por hexadeca-octatimidilato y sus derivados de oligo-(1-metil-2-carboxi-4-amino)pirrol con ácido polidesoxirriboadenílico en NaCl 0,2 M, Na_{2}HPO_{4} 0,01 M, EDTA 0,1 mM (pH 7,0). X es igual que en la Tabla 1
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La Tabla 2 describe la información de una manera similar a la Tabla 1. En los ensayos reportados en esta tabla, los ODN 16-meros de ácido timidílico que tienen el resto de unión al surco menor representado por X (X es igual que en la Tabla 1) se complejaron con ácido polidesoxirriboadenílico. Como control comparativo, también se ensayó un ODN 16-mero de ácido timidílico (dTp)_{16} conectado en su extremo 3'-fosfato con ácido 6-aminohexanoico. Además, también se ensayaron un 8-mero de ácido timidílico (dTp)_{8} y sus conjugados con los agentes de unión al surco menor de longitud peptídica variable. En estos dos ensayos, además, el agente de unión al surco menor unido al ODN provocó una estabilización significativa del complejo entre el ODN-MGB y la cadena complementaria de ADN. La mayor estabilización se produce cuando el número de residuos de ácido 4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico en el resto de unión al surco menor es cinco. Por el contrario, la cola de ácido aminohexanoico del ODN 16-mero virtualmente da como resultado la no estabilización del complejo.
TABLA 3 Temperaturas de fusión (ºC) de los dúplex formados por poli(dA) y poli(rA) con cadenas (Tp)_{8} unidas terminalmente a ligandos CDPI_{3} y BocDPI_{1-2}.^{a}
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La Tabla 3 describe los datos de temperatura de fusión (T_{m}) y cambio en la temperatura de fusión (\DeltaT_{m}) en ensayos en los que el oligonucleótido es un 8-mero de ácido timidílico que tiene un resto de unión al surco menor unido a cualquiera de los extremos 5'-fosfato o 3'-fosfato, como se indica en la tabla. Los restos de unión al surco menor representados aquí por X e Y son "oligopéptidos" basados en el residuo de ácido 1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico (CDPI o BocDPI) y sus estructuras se muestran en la tabla. Estos oligopéptidos de unión al surco menor se une al ODN a través de un resto de unión "L1 o L2", cuyas estructuras también se muestran a continuación en la tabla. Los conjugados ODN-MGB se incubaron con un ribo- o desoxirribo- homopolímero complementario. Por lo tanto, para los conjugados ODN-MGB que comprenden ODN de ácido timidílico, se usó poli A o poli-dA. El cambio en la temperatura de fusión (\DeltaT_{m}) se indica con respecto al complejo con el ODN que tiene el grupo de unión correspondiente L1 o L2 en el extremo correspondiente del ODN, pero no tiene ningún resto de unión al surco menor. Como puede observarse en la Tabla 3, estos complejos de ODN-MGB muestran nuevamente una estabilización significativa del complejo con el desoxirribohomopolímero complementario, produciéndose la mayor estabilización en estos ensayos cuando el resto de unión al surco menor tiene 3 unidades CDPI. Sorprendentemente, la estabilización del complejo se produce incluso cuando el ODN-MGB se incuba con un ribohomopolímero complementario. Esto es sorprendente debido a que se ha observado generalmente en la técnica anterior que las moléculas de unión al surco menor que permanecen libres no se unen a híbridos de ADN-ARN.
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La Tabla 4 describe los resultados de un estudio de formación de dúplex entre derivados de dos octámeros complementarios: CpApTpCpCpGpCpT y ApGpCpGpGpApTpG. Cada octámero se modificó, como se muestra en la tabla, para examinar la hibridación de los oligodesoxirribonucleótidos correspondientes y de los oligodesoxirribonucleótidos que tienen un esqueleto de fosforotioato. El ODN también tenía un tripéptido basado en los residuos de ácido 1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico (CDPI) (resto de unión al surco menor X) unido al extremo 3' o al 5' (como se indica) a través de un grupo de unión de la estructura L1 o L2. (X, L1 y L2 son iguales que en la Tabla 3.) Como control, también se determinó la temperatura de fusión de los dúplex para dúplex en los que los ODN soportaban únicamente los grupos de unión. Como puede observarse en la tabla, los dúplex se estabilizaron significativamente por la presencia de un resto de unión al surco menor, y se producía una mayor estabilización cuando cada cadena del dúplex tenía un agente de unión al surco menor unido covalentemente.
TABLA 5 Datos de T_{m} (ºC) de dúplex heterogéneos que tienen residuos peptídicos 3'-oligo(pirroloindolocarboxamida)
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La Tabla 5 describe los datos de temperatura de fusión obtenidos cuando se incubaron ODN-MGB complementarios o "cuasi-complementarios" y se examinaron para determinar la formación de dúplex. El resto de unión al surco menor X y los grupos de unión L1 y L2 se muestran en la tabla y son iguales que en las Tablas 3 y 4. Como se anticipó, cuando se reemplaza guanina por inosina (I) en las cadenas, la unión de los dúplex es muy débil (T_{m} es de aproximadamente 0ºC) si no está presente ningún resto de unión al surco menor. Sin embargo, cuando se reemplaza guanina por inosina en los oligonucleótidos, la presencia de un agente de unión al surco menor unido covalentemente X estabilizaba el híbrido en casi 50ºC y la presencia de dos de estos agentes de unión al surco menor en orientación antiparalela proporcionaba 63ºC de estabilización. Cuando las mismas cadenas contenían guanina, un agente de unión al surco menor aumentó la T_{m} en 15ºC mientras que dos la aumentaron en casi 45ºC. Para el conocimiento de los inventores de la presente invención, una T_{m} de 81ºC para un 8-mero no tiene precedentes en la técnica anterior.
Experimento de Extensión de Cebador
Se demostró que se requiere esa especificidad de secuencia en el sentido de Watson-Crick de la parte de ODN del conjugado ODN-MGB para complejar el conjugado ODN-MGB con una secuencia diana por un experimento de extensión de cebador. En este experimento, la extensión de cebador se produce con la enzima ADN polimerasa de T7 que trabaja desde el extremo 5' de una cadena de plantilla. Se incubó un 16-mero ODN-MGB que era complementario en el sentido de Watson Crick a una secuencia diana de la cadena plantilla con una plantilla de ADN monocatenario y la enzima T7 ADN polimerasa. El bloqueo de la extensión del cebador se apreció en el sitio de unión con el ODN-MGB cuando el resto de unión al surco menor estaba en el extremo 5' del 16-mero ODN. El agente de unión al surco menor era el tripéptido de pirroloindol mostrado en esta solicitud en la Tabla 5. Cuando existía una sola disparidad en la especificidad de secuencia del 16-mero con la diana, no se bloqueó la extensión del cebador. La extensión del cebador tampoco se bloqueó cuando el resto de unión al surco menor estaba unido al extremo 3' del 16-mero. La extensión del cebador tampoco se bloqueó cuando el 16-mero de secuencia específica y la molécula de unión al surco menor libre (compuesto 3d, no unido covalentemente al ODN) se incubó con la plantilla y la enzima. Estos experimentos demuestran que la especificidad de secuencia del ODN-MGB es importante para la formación de complejos, y que el resto de unión al surco menor no actúa simplemente como un "soporte" para la unión no específica del ODN adjunto a otra cadena. La capacidad de los conjugados ODN-MGB para inhibir la extensión del cebador indica que estos conjugados pueden usarse diagnósticamente como agentes de sujeción para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). (véase Nucleic Acid Research (1993) 21: 5332-5336).
Ensayo de hibridación Slot-blot
Los conjugados ODN-MGB de la presente invención son útiles como sondas de hibridación. Esto se demuestra por la descripción del siguiente experimento utilizando un conjugado ODN-MGB marcado con ^{32}P como sonda de diagnóstico. Cuando se compara con el mismo ODN sin un resto de unión al surco menor (MGB) unido covalentemente, el conjugado hibrida con su complemento con mayor fuerza, eficacia y especificidad. El ensayo de hibridación slot-blot es un ensayo de diagnóstico con sondas de ADN usado ampliamente, y los atributos de estos conjugados MGB-ODN mejoran el rendimiento del ensayo.
Específicamente, en el experimento descrito en este documento se siguió un protocolo convencional, como se describe en Protocols for Nucleic Acid Blotting and Hybridization, 1988, Amersham, United Kingdom. Se cuantificó un ODN de ensayo marcado que hibridaba con el plásmido inmovilizado como cuentas por minuto (cpm), y se representó frente a la temperatura de hibridación. Se evaluaron cuatro sondas 16-méricas complementarias al ADN de M13mpl9 (un ADN de fago). Dos de estas sondas fueron totalmente complementarias a un sitio en el ADN del fago; una de éstas contenía un resto CDPI_{3} conjugado en posición 3' mientras que la otra no se había modificado. El segundo par de sondas se dirigió al mismo sitio en el ADN de M13mpl9 pero cada uno contenía un solo desacoplamiento (subrayado en el dibujo de la Figura 1). Aquí de nuevo, un ODN estaba conjugado en posición 3' con CDPI3 mientras que el otro no se había modificado.
Los resultados del estudio de hibridación slot se muestran en la Figura 1. En comparación con un 16-mero no modificado pero por lo demás idéntico, la sonda que contenía CDPI_{3} formaba un híbrido con una temperatura de fusión (T_{m}) de 50ºC frente a sólo 33ºC. Esta mayor temperatura de fusión produjo un rendimiento más de dos veces mayor que el rendimiento de los híbridos perfectamente emparejados. Cuando se introdujo un desacoplamiento en cualquier sonda, se redujo la estabilidad de los híbridos respectivos. Las sondas modificadas con CDPI_{3} presentaron una buena discriminación de secuencia entre 37º-50ºC. Además, en las condiciones de hibridación usadas aquí no hubo pruebas de unión del resto CDPI_{3} a regiones bicatenarias preexistentes en la diana de ADN de M13mpl9, indicando que no está presente una unión totalmente no específica de estos conjugados.
Alquilación con especificidad de secuencia de un gen en células humanas cultivadas
Los conjugados ODN-MGB de la presente invención que también llevan un agente de alquilación unido covalentemente pueden usarse como agentes "anti-gen", es decir, para la supresión de la expresión de genes indeseados (que producen enfermedades), siempre que el conjugado ODN-MGB sea complementario a una secuencia diana en el gen diana. En este caso, el resto MGB mejora la unión al gen bicatenario (en presencia de una enzima recombinasa) y el resto alquilante produce una unión covalente permanente del conjugado ODN-MGB a la secuencia diana.
Como experimento demostrativo, el ODN 50-mérico descrito anteriormente que estaba modificado en el extremo 3' con un grupo CDPI_{3} y modificado internamente con un grupo de mostaza nitrogenada (clorambucilo) formaba enlaces cruzados con especificidad de secuencia con el sitio esperado en un gen diana (alelo HLA DQ\beta1 0302) presente en células BSM humanas vivas (una línea celular de linfocitos B humana). El conjugado ODN-MGB se añadió a una suspensión de células BSM a una concentración final de 1-50 \muM. Después de 3,5 h, se extrajo el ADN genómico y se trató con pirrolidina caliente para convertir cualquier suceso de alquilación en muescas. A continuación, la región diana del alelo 0302 se amplificó por LM-PCR (reacción en cadena de la polimerasa mediada por ligamiento), una técnica que puede usarse para detectar sucesos de unión en la resolución de una sola base. El análisis de los productos en un gel de secuenciación demostró que el ODN modificado se había unido y alquilado el sitio diana. Un ODN similar que carecía del grupo CDPI_{3} era considerablemente menos eficaz en eficacia de alquilación del sitio diana.
Es probable que en el experimento anterior, el reconocimiento y unión del conjugado ODN-MGB al ADN bicatenario homólogo tenga lugar con la ayuda de recombinasas nucleares. En experimentos y aplicaciones similares, las enzimas recombinasas endógenas pueden catalizar la dirección con especificidad de secuencia del ADN genómico bicatenario por conjugados ODN-CDPI3 en otras células vivas. Cuando estos ODN tienen un agente de entrecruzamiento unido, pueden alquilar al ADN diana. Al estabilizar el bucle D formado en presencia de recombinasa, el CDPI_{3} promueve la reacción de entrecruzamiento. El suceso de entrecruzamiento es un inhibidor poderoso de la expresión del gen diana. De esta manera, el entrecruzamiento de conjugados ODN-CDPI^{3} puede usarse como agentes anti-genes.
Realizaciones específicas, sección experimental Sección Experimental General
Todas las reacciones sensibles al aire y al agua se realizaron con una ligera presión positiva de argón. Los disolventes anhidros se obtuvieron en Aldrich (Milwaukee, WI). La cromatografía de Flash se realizó en gel de sílice de malla 230-400. Los puntos de fusión se determinaron en un aparato de puntos de fusión Mel-Temp en capilares abiertos y se presentan sin corregir. El análisis elemental se realizó por Quantitative Technologies Inc. (Boundbrook, NJ). Los espectros de absorción UV-visible se registraron en el intervalo de 200-400-nm en un espectrofotómetro UV-2100 (Shimadzu) o Lambda 2 (Perkin Elmer). Los espectros de ^{1}H RMN se realizaron a 20ºC en un espectrofotómetro Bruker WP-200 o en un espectrofotómetro Varian XL-200; los desplazamientos químicos se reportan en ppm campo abajo de Me_{4}Si.
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (1a). Se añadió gota a gota trifluoroacetato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2,6 g, 10 mmol, H.B. Gamper, M.W. Reed, T. Cox, J.S. Virosco, A.D. Adams, A.A. Gall, J.K. Scholler y R.B. Meyer, Jr. Nucleic Acids Res., 1993, Vol, 21, No. 1, 145-150) a una solución de ácido 3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico (1,4 g, 6,1 mmol, D.L. Boger, R.S. Coleman y B.J. Invergo. J. Org. Chem., 1987, Vol. 52, 1521-1530) y trietilamina (1,4 ml, 10 mmol) en 15 ml de DMF anhidra. Después de 1 h, la mezcla de reacción se concentró al vacío (0,2 mm). El residuo se trituró con 2 ml de diclorometano seco. Se añadió éter etílico (50 ml) y la mezcla se dejó a 0ºC durante una noche. El precipitado se recogió por filtración en un embudo de vidrio sinterizado, se lavó primero con éter al 50%/CH_{2}Cl_{2} (10 ml) y después con éter (50 ml) y se secó al vacío. El producto se obtuvo en forma de un sólido amarillo (1,8 g, 75%): ^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,32 (s, 1H, NH), 8,13 (d, 1H, J = 9 Hz, C4-H), 8,01 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 7,41 (s, 1H, C8-H), 7,26 (d, 1H, J = 9 Hz, C5-H), 6,17 (s, 2H, CONH_{2}), 3,99 (t, 2H, J = 9 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,30 (t, 2H, J = 9 Hz, NCH_{2}CH_{2}). Anál. calc. para C_{18}H_{11}N_{3}O_{3}F_{4} x 2H_{2}O: C, 50,3; H, 3,52; N, 9,7. Encontrado: C, 50,81; H, 3,60; N, 9,95.
3-(terc-Butiloxicarbonil)-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (1b). Se añadió gota a gota trifluoroacetato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2,6 g, 10 mmol) a una solución de ácido 3-(terc-butiloxicarbonil)-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico (1,0 g, 3,7 mmol, D.L. Boger, R.S. Coleman y B.J. Invergo. J. Org. Chem., 1987, Vol. 52, 1521-1530) y trietilamina (1,5 ml, 10 mmol) en 10 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro. Después de 4 h, el CH_{2}Cl_{2} se retiró por evaporación a presión reducida. La cromatografía por Flash (4 x 20 cm, hexano-acetato de etilo, 1:2) proporcionó 1b en forma de un sólido cristalino amarillo (1,25 g, 75%): ^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,39 (d, 1H, J = 1,4 Hz, NH), 8,02 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 7,9 (br s 1H, C4-H), 7,45 (d, 1H, J = 1,4 Hz, C8-H), 7,33 (d, 1H, J = 9 Hz, C5-H), 4,02 (t, 2H, J = 9 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,26 (t, 2H, J = 9 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 1,51 (s, 9H, C(CH_{3})_{3}). Anál. calcd. para C_{22}H_{18}N_{2}O_{4}F_{4}: C, 58,67; H, 4,03; N, 6,22. Encontrado: C, 58,45; H, 4,09; N, 6,13.
Éster metílico de dímero de 3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato (2a). Una solución de 1,2-dihidro-3H-pirroloindolo-7-carboxilato de metilo (0,6 g, 1,5 mmol), 1a (0,45 g, 2,25 mmol) y trietilamina (0,2 ml, 1,4 mmol) en 10 ml de DMF anhidra se incubó a TA durante 24 h y después a 0ºC durante 12 h. El sólido insoluble resultante se recogió por filtración y se lavó con DHF (10 ml) y éter (20 ml). El secado al vacío proporcionó 2a (0,61 g, 91%) en forma de un sólido amarillo pálido: (^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,00 (d, 1H, J = 1,8 Hz, NH'), 11,54 (s, 1H, NH), 8,28 (d, 1H, J = 9 Hz, C4'-H), 7,97 (d, 1H, J = 9 Hz, C4-H), 7,33 (d, 1H, J = 9 Hz, C5'-H), 7,22 (d, 1H, J = 9 Hz, C5-H), 7,13 (d, 1H, J = 1,4 Hz, C8'-H), 6,94 (d, 1H, J = 1,1 Hz, C8-H), 6,01 (s, 2H, CONH_{2}), 4,62 (t, 2H, J = 8 Hz, (NH_{2}CH_{2})'), 3,98 (t, 2H, J = 8 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,88 (s, 3H, CH_{3}), 3,41 (t, 2H, J = 8 Hz, (NCH_{2}CH_{2})'), 3,29 (t, 2H, NCH_{2}CH_{2}, parcialmente oscurecido con agua). Anál. calc. para C_{24}H_{21}N_{5}O_{5} x 1H_{2}O x 1DMF: C, 58,69; H, 5,84; N, 15,21. Encontrado: C, 58,93; H, 5,76; N, 15,82.
Éster metílico de dímero de 3-(terc-butiloxicarbonil)-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato (2c). Una solución de 1,2-dihidro-3H-pirroloindolo-7-carboxilato de metilo (0,5 g, 2,5 mmol), 1b (1,0 g, 2,2 mmol) y trietilamina (0,1 ml, 0,7 mmol) en 10 ml de DMF anhidra se incubó a TA durante 10 h y a 0ºC durante 12 h. El sólido insoluble resultante se recogió por filtración y se lavó con DMF (5 ml) y éter (40 ml). El secado al vacío proporcionó 2c (0,81 g, 74%) en forma de un sólido blanquecino: ^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,01 (s, 1H, NH'), 11-64 (s, 1H, NH), 8,28 (d, 1H, J = 9 Hz, C4'-H), 7,8 (br s, 1H, C4-H), 7,32 (t aparente, 2H, C5'-H + C5-H), 7,13 (d, 1H, J = 1,1 Hz, C8'-H), 6,98 (d, 1H, J = 1,1 Hz, C8-H), 4,62 (t, 2H, J = 8 Hz, (NH_{2}CH_{2})'), 4,02 (t, 2H, J = 8 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,88 (s, 3H, CH_{3}), 3,41 (t, 2H, J = 8 Hz, (NCH_{2}CH_{2})'), 3,25 (t, 2H, NCH_{2}CH_{2}), 1,52 (s, 9H, C(CH_{3})). Anál. calc. para C_{28}H_{28}N_{4}O_{5}: C, 67,19; H, 5,64; N, 11,19. Encontrado: 66,72, H, 5,69; N, 11,31.
Dímero de 3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2a). Se añadió gota a gota trifluoroacetato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2,6 g, 10 mmol) a una suspensión de 2b (1,2 g, 2,8 mmol, D.L. Boger, R.S. Coleman y B.J. Invergo. J. Org. Chem., 1987, Vol. 52, 1521-1530) en 15 ml de DMF anhidra. Se añadió trietilamina (1,4 ml, 10 mmol) y la mezcla se agitó durante 3 h. La mezcla se concentró al vacío (0,2 mm) usando un evaporador rotatorio. El residuo se trituró con 20 ml de diclorometano seco. El producto obtenido se filtró, se lavó con diclorometano (10 ml) y éter (20 ml) y se secó al vacío para dar 2e en forma de un sólido amarillo (1,5 g, 93%): (^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6},200 MHz, ppm) 12,51 (d, 1H, J = 1,8 Hz, NH'), 11,58 (s, 1H, NH), 8,39 (d, 1H, J = 8,9 Hz, C4'-H), 8,04 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 7,98 (d, 1H, J = 8,8 Hz, C4-H), 7,58 (s, 1H, C8'), 7,42 (d, 1H, J = 9 Hz, C5'-H), 7,22 (d, 1H, J = 9 Hz, C5-H), 6,98 (s, 1H, C8-H), 6,11 (s, 2H, CONH_{2}), 4,66 (t, 2H, J = 7,8 Hz, (NCH_{2}CH_{2})'), 3,94 (t, 2H, J = 9,1 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,47 (t, 2H, J = 8 Hz, (NCH_{2}CH_{2})'), 3,29 (t, 2H, J = 9,1 Hz, NCH_{2}CH_{2}). Anál. calc. para C_{29}H_{19}N_{5}O_{4}F_{4} x 1,5H_{2}O: C, 57,62; H, 3,67; N, 11,59. Encontrado: C, 57,18; H, 3,31; N, 11,54.
Dímero de 3-(terc-butiloxicarbonil)-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2f). Se añadió gota a gota trifluoroacetato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (0,75 g, 2,9 mmol) a una suspensión de 2d (0,25 g, 0,5 mmol, D.L. Boger, R.S. Coleman y B.J. Invergo. J. Org. Chem., 1987, Vol. 52, 1521-1530) y trietilamina (0,5 ml, 3,5 mmol) en una mezcla de CH_{2}Cl_{2} anhidro (8 ml) y DMF (2 ml). La mezcla se agitó durante 20 h. La solución transparente resultante se concentró al vacío y se añadió gota a gota a 40 ml de acetato sódico 1 M (pH 7,5). El precipitado se centrifugó y se lavó con agua (2 x 40 ml), con MeOH al 10% en éter (2 x 40 ml), con éter (40 ml) y con hexano (40 ml). Finalmente, se secó al vacío para dar 2f en forma de un sólido amarillo pálido (0,29 g, 91%); (^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,51 (s, 1H, NH'), 11,66 (s, 1H, NH), 8,37 (d, 1H, J = 8,8 Hz, C4'-H), 8,03 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 7,8 (br s, 1H, C4-H), 7,58 (s, 1H, C8'-H), 7,40 (d, 1H, J = 9,1 Hz, C5'-H), 7,27 (d, 1H, J = 8,6 Hz, C5-H), 7,1 (s, 1H, C8-H), 4,65 (t, 2H, J = 8 Hz, (NCH_{2}CH_{2})'), 4,02 (t, 2H, J = 9 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,46 (t, 2H, J = 8 Hz, (NCH_{2}CH_{2})'), 3,25 (t, 2H, J = 8,9 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 1,51 (s, 9H, C(CH_{3})_{3}). Anál. calc. para C_{33}H_{26}N_{4}O_{5}F_{4} x 0,5H_{2}O: C, 61,59; H, 4,23; N, 8,71. Encontrado: C, 61,73; H, 4,12; N, 8,61.
Éster metílico de trímero de 3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato (3a). Una solución de 1,2-dihidro-3H-pirroloindolo-7-carboxilato de metilo (1,0 g, 5 mmol), 2e (1,2 g, 2,1 mmol) y trietilamina (0,1 ml, mmol) en 15 ml de DMF anhidra se incubó a TA durante 24 h y a 0ºC durante 12 h. El sólido insoluble resultante se recogió por filtración y se lavó con DMF (10 ml), CH_{2}Cl_{2} (20 ml) y éter (20 ml). El secado al vacío proporcionó 3a (1,1 g, 83%) en forma de un sólido amarillo pálido: (^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,02 (s, 1H, NH''), 11,75 (s, 1H, NH''), 11,56 (s, 1H, NH), 8,28 (t aparente, 2H, J = 8,3 Hz, C4-H'' + C4'-H), 7,98 (d, 1H, J = 9,4 Hz, C4-H), 7,98 (d, 1H, J = 9 Hz, C4-H), 7,39-7,33 (2 d, 2H, C5''-H+C5'-H), 7,23 (d, 1H, J = 8,7 Hz, C5-H), 7,14 (d, 1H, J = 1,6 Hz, C8''-H), 7,10 (d, 1H, J = 1 Hz, C8'-H), 6,97 (s, 1H, C8-H), 6,11 (s, 2H, CONH_{2}), 4,65 (t, 4H, (NCH_{2}CH_{2})'' + (NCH_{2}CH_{2})'), 3,98 (t, 2H, J = 8,7 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,88 (s, 3H, CH_{3}), 3,48-3,25 (m, 6H, (NCH_{2}CH_{2})'' + (NCH_{2}CH_{2})' +
NCH_{2}CH_{2} parcialmente oscurecido con H_{2}O). Anál. calc. para C_{35}H_{29}N_{7}O_{5} x 4,5H_{2}0: C, 59,32; H, 5,0; N, 13,03. Encontrado: C, 58,9; N, 5,06; N, 13,77.
Trímero de 3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (3e). Se añadió gota a gota trifluoroacetato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2,6 g, 10 mmol) a una suspensión de 3b (1,1 g, 1,8 mmol) en 15 ml de DMF anhidra y trietilamina (1,4 ml, 10 mmol). La mezcla se agitó durante 3 h. La mezcla se concentró al vacío (0,2 mm). El residuo se trituró con una mezcla de diclorometano seco (20 ml) y metanol (2 ml). El producto resultante se recogió por filtración, se lavó con diclorometano (20 ml) y éter (20 ml) y se secó al vacío para dar 1,3 g (95%) de un sólido amarillo-verde. (^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,54 (d, 1H, J = 1 Hz, NH''), 11,79 (s, 1H, NH'), 11,56 (s, 1H, NH), 8,41 (d, 1H, J = 9,3 Hz, C4-H''), 8,27 (d, 1H, J = 9,4 Hz, C4'-H), 8,03 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 7,98 (d, 1H, J = 9 Hz, C4-H), 7,56 (s, 1H, C8''-H), 7,45-7,35 (m, 2H, C5''-H+C5'-H), 7,23 (d, 1H, J = 9,2 Hz, C5-H), 7,13 (s, 1H, C8'-H), 6,97 (s, 1H, C8-H), 6,11 (s, 2H, CONH_{2}), 4,65 (m, 4H, (NCH_{2}CH_{2})'' + (NCH_{2}CH_{2})'), 3,98 (t, 2H, J = 8,7 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,45 (m, 4H, (NCH_{2}CH_{2})'' + (NCH_{2}CH_{2})''), 3,25 (t, 2H, J = 8,7 Hz, NCH_{2}CH_{2}). Anál. calc. para C_{40}H_{27}N_{7}O_{5}F_{4} x 2H_{2}O: C, 61,59; H, 4,23; N, 8,71. Encontrado: C, 61,73; H, 4,12; N, 8,61.
Trímero de (3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxi)-1-amido-3-propanol (3d). Una solución de 3-amino-1-propanol (70 \mul, 1,4 mmol), 3c (75 mg, 0,1 mmol) y trietilamina (0,1 ml, mm) en 2,5 ml de DMF anhidra se agitó a TA durante 10 h. El sólido insoluble resultante se recogió por filtración y se lavó con DMF (2 ml), CH_{2}Cl_{2} (10 ml) y éter (20 ml). El secado al vacío proporcionó 3d (55 mg, 89%) en forma de un sólido amarillo pálido: (^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 11,76 (s, 1H, NH''), 11,65 (s, 1H, NH'), 11,57 (s, 1H, NH), 8,47 (m, 1H, C4-H), 8,24 (m, 1H, C4-H), 7,99 (d, 1H, J = 8,4 Hz, C4-H), 7,40-7,32 (2d, 2H, C5''-H+C5'-H), 7,23 (d, 1H, J = 8,9 Hz, C5-H), 7,12 (s, 1H, C8''-H), 7,10 (s, 1H, C8'-H), 6,99 (s, 1H, C8-H), 6,12 (s, 3H, CONH_{2} + NHCO), 4,66 (t, 4H, (NCH_{2}CH_{2})'' + (NCH_{2}CH_{2})'), 3,98 (t, 2H, J = 8,7 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,51-3,25 (m, 10H, (NCH_{2}CH_{2})'' + (NCH_{2}CH_{2})' +
NCH_{2}CH_{2} + NHCH_{2} + CH_{2}OH parcialmente oscurecido con H_{2}O), 1,70 (p, 2H, J = 6,6 Hz, CH_{2}CH_{2}CH_{2}).
3-[N-(9-Fluorenilmetoxicarbonil)]aminopropionato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (4). Se añadió gota a gota trifluoroacetato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (1,7 g, 6,5 mmol) a una solución de FMOC-alanina (2,0 g, 6,4 mmol) y trietilamina (1,0 ml, 7 mmol) en 20 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro. Después de 1 h, el CH_{2}Cl_{2} se retiró por evaporación a presión reducida usando un evaporador rotatorio y se disolvió de nuevo en 30 ml de acetato de etilo/hexano (1:1). La cromatografía por Flash (4 x 20 cm, hexano/acetato de etilo, 3:1) proporcionó 4 bruto en forma de un sólido blanco. Se recristalizó en hexano/acetato de etilo para dar 4 en forma de un sólido cristalino blanco (2,3 g, 78%): ^{1}HRMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm) 7,73 (d, 2H, J = 7,1 Hz, protones aromáticos), 7,75 (d, 2H, J = 7,7 Hz, protones aromáticos), 7,24-7,42 (m, 4H, protones aromáticos), 7,01 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 5,21 (br s, 1H, -CONH-), 4,38 (d, 2H, J = 7,1 Hz, -CH_{2}OCO-), 4,20 (m, 1H, protón bencilo), 3,58 (m, 2H, NCH_{2}), 2,93 (t, 2H, J = 5,4 Hz, -CH_{2}CO-). Anál. calc. para C_{24}H_{17}NO_{4}F_{4}: C, 62,75; H, 3,73; N, 3,05. Encontrado: C, 62,52; H, 3,59; N, 3,01.
1-[3-[N-(9-Fluorenilmetoxicarbonil)amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2,3-propanodiol (5). Una solución de 4 (2,0 g, 4,35 mmol) en 20 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro se añadió a una solución agitada de 3-amino-1,2-propanodiol (0,6, mmol) en 10 ml de MeOH. Después de 10 min, se añadió ácido acético (3 ml) y la mezcla se evaporó a sequedad. El residuo se trituró con 100 ml de agua. El sólido obtenido se retiró por filtración, se lavó con agua y se secó por co-evaporación con tolueno (2 x 50 ml) a presión reducida. El lavado con 50 ml de acetato de etilo seguido de secado al vacío durante una noche proporcionó 5 en forma de un sólido cristalino blanco (1,65 g, 99%): ^{1}H RMN (CDCl_{3} + MeOD-d_{4}, 200 MHz, ppm, Me_{4}Si) 7,77 (d, 2H, J = 7,7 Hz, protones aromáticos), 7,61 (d, 2H, J = 7,3 Hz, protones aromáticos), 7,45-7,29 (m, 4H, protones aromáticos), 4,35 (d, 2H, J = 7,1 Hz, -CH_{2}OCO-), 4,22 (m, 1H, protón bencilo), 3,72 (m, 1H, -CH- de NHCH_{2}CHOHCH_{2}OH), 3,52-3,27 (m, 6H, OCONHCH_{2} + CH_{2}CHOHCH_{2}OH), 2,44 (t, 2H, J = 6,6 Hz, -CH_{2}CO-); Anál. calc. para C_{21}H_{24}N_{2}O_{5}: C, 5,61; H, 6,29; N, 7,29%. Encontrado: C, 65,43; H, 6,28; N, 7,21.
1-[3-[N(9-Fluorenilmetoxicarbonil)amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2-[[bis(metoxifenil)fenilmetoxi]metil]-2-etanol (6). A una solución agitada de 5 (1,6 g, 4,2 mmol) en 30 ml de piridina anhidra se le añadió DMTrCl (1,6 g, 4,7 mmol). Después de agitar durante 3 h en una atmósfera de argón, la mezcla se evaporó a sequedad. La piridina residual se retiró por co-evaporación con tolueno. El residuo se disolvió en 100 ml de CH_{2}Cl_{2}, se lavó con 2 x 100 ml de agua, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía por Flash (4 x 20 cm, sílice) usando acetato de etilo como eluyente. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y se evaporaron a sequedad para producir 1,9 g (66%) de 6 en forma de una espuma incolora. ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm, Me_{4}Si) 7,72 (d, 2H, J = 7,2 Hz, protones aromáticos), 7,56 (d, 2H, J = 7 Hz, protones aromáticos), 7,40-7,20 (m, 13H, protones aromáticos), 6,80 (d, 4H, J = 9 Hz, protones DMTr), 5,76 (br s, 1H, NH), 5,42 (br s, 1H, NH), 4,35 (d, 2H, J = 6,6 Hz, -CH_{2}OCO-), 4,17 (m, 1H, protón bencilo), 3,83 (m, 1H, -CH- de NHCH_{2}CHOHCH_{2}OH), 3,75 (s, 6H, OCH_{3}), 3,60-3,30 (m, 4H, OCONHCH_{2} + CH_{2}CHOHCH_{2}OH), 3,13 (d, 2H, J = 5,4 Hz, CH_{2}ODMTr), 2,30 (t, 2H, J = 5,4 Hz, -CH_{2}CO-); Anál. calc. para C_{42}H_{42}K_{2}O_{7}: C, 73,45; H, 6,16; N, 4,08. Encontrado: C, 65,43; H, 6,28; N, 7,21.
1-[3-[N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2-[[bis(metoxifenil)fenilmetoxi]metil]-2-etilbutanodioato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (7). A una solución de 6 (1,2 g, 1,75 mmol), trietilamina (0,2 g, 2 mmol) y 1-metilimidazol (20 \mul) en 10 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro se le añadieron 0,2 g (2 mmol) de anhídrido succínico. Esta solución se agitó durante 20 h. A la solución se le añadió trietilamina (60 \mul) seguido de 0,6 g (2,2 mmol) de trifluoroacetato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo. Después de 1 h, el CH_{2}Cl_{2} se retiró por evaporación a presión reducida usando un evaporador rotatorio y el residuo se disolvió en 15 ml de acetato de etilo/hexano (1:2). La cromatografía por Flash (4 x 20 cm, hexano/acetato de etilo, 2:1) proporcionó 1b en forma de una espuma amarilla pálida (1,2 g, 73%): ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 300 MHz, ppm, Me_{4}Si) 7,71 (d, 2H, J = 7,2 Hz, protones aromáticos), 7,54 (d, 2H, J = 7 Hz, protones aromáticos), 7,40-7,20 (m, 13H, protones aromáticos), 7,00 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 6,78 (d, 4H, J = 7 Hz, protones DMTr), 5,71 (br s, 1H, NH), 5,42 (br s, 1H, NH), 5,15 (m, 1H, -CH- de NHCH_{2}CHOHCH_{2}OH), 4,31 (d, 2H, J = 6,2 Hz, -CH_{2}OCO-), 4,16 (d, 5,5 Hz, 1H, protón bencilo), 3,74 (s, 6H, OCH_{3}), 3,60-3,30 (m, 4H, OCONHCH_{2} + CH_{2}CHOHCH_{2}OH), 3,20 (br s, 2H, CH_{2}ODMTr), 2,98 (br s, 2H, COCH_{2}CH_{2}CO), 2,72 (br s, 2H, COCH_{2}CH_{2}CO), 2,20 (br s, 2H, -CH_{2}CO-); Anál. calc. para C_{42}H_{42}N_{2}O_{7}: C, 66,80; H, 4,96; N, 3,00. Encontrado: C, 66,18; H, 4,98; N, 2,86.
Preparación del derivado de CPG 8. Una mezcla de 5,0 g de vidrio poroso controlado con aminoalquilo de cadena larga (LCAA-CPG), 0,5 ml de 1-metilimidazol y 0,45 g (0,5 mmol) de 7 en 20 ml de piridina anhidra se removió en un matraz de 100 ml (mezclador orbital, 150 rpm). Después de 3 h, el CPG se filtró en un embudo de vidrio sinterizado y se lavó con porciones de 100 ml de DMF, acetona y éter dietílico. El CPG se secó al vacío y se trató con una mezcla de piridina (20 ml), anhídrido acético (2 ml) y 1-metilimidazol (2 ml). Después de remover durante 30 min, el CPG se lavó con piridina, metanol y éter dietílico y después se secó al vacío. El producto (8) se analizó para determinar el contenido de dimetoxitritilo (DMTr) de acuerdo con el procedimiento bibliográfico (T. Atkinson y H. Smith, en M. Gait (ed.), Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach. IRL Press, 1984, Oxford, Reino Unido, págs. 35-81) y se descubrió que tenía una carga de 28 \mumol/g.
Preparación del derivado de CPG 9. El derivado de CPG 8 (3,0 g) se trató dos veces, cada una de ellas con 20 ml de piperidina al 20% en DMF seca durante 5 min. El CPG se lavó con porciones de 100 ml de DMF, metanol y éter dietílico y después se secó al vacío.
Preparación del derivado de CPG 10. Una mezcla de 2,5 g de 9, 7,5 ml de trietilamina y 0,38 g (0-5 mmol) de 3c en 7,5 ml de DMSO anhidro se removió en un matraz de 50 ml (mezclador orbital, embudo a 150 rpm). Después de 2 días, el CFG se filtró en un embudo de vidrio sinterizado y se lavó con porciones de 100 ml de DMSO, acetona y éter dietílico. El CPG se secó al vacío y se trató con una mezcla de piridina (10 ml), anhídrido acético (1 ml) y 1-metilimidazol (1 ml). Después de remover durante 30 min, el CPG se lavó con DMSO, piridina, metanol y éter dietílico y después se secó al vacío.
5-[(terc-Butiloxi)carboxamido]pentilcarboxilato de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (11). Se secó ácido 6-[(terc-butiloxi)carboxamido]hexanoico (4,16 g, 18 mmol) por co-evaporación con DMF seca (70ºC). El residuo se disolvió de nuevo en DMF seca (25 ml) y se añadieron 2-[4-(fenilazo)-benciltio]-etanol (4,08 g, 15 mmol), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (3,71 g, 18 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (1,83 g, 15 mmol) a 0ºC. Después de agitar a 0ºC durante 2 h y a 20ºC durante 12 h, la mezcla de reacción se evaporó a sequedad por co-evaporación con acetato de butilo y se añadió más cantidad de acetato de etilo (150 ml). Esta solución se extrajo con HCl 0,7 M (1 x 30 ml), NaHCO_{3} al 5% y H_{2}O (2 x 50 ml). La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en el evaporador rotatorio. El lavado con 20 ml de éter y la filtración proporcionaron el compuesto 11 (6,91 g, 89%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm): 7,91 (m, 4H), 7,52 (m, 5H), 4,48 (t, 2H), 4,34 (s, 2H), 3,20 (t, 2H), 3,08 (m, 2H), 2,35 (t, 2H), 1,64-1,2 (m, 7H), 1,41 (s, 9H).
1-Metil-4-[terc-Butiloxi]carboxamido-pirrolo-2-carboxilato de 1,2,3-benzotriazol-1-ilo. Se añadió N,N'-diciclohexilcarbodiimida (1,1 g, 5,3 mmol) a una solución de ácido 1-metil-4-[terc-butiloxi)carboxamido]pirrolo-2-carboxí-
lico^{4} (1,2 g, 5,2 mmol) y 1-hidroxibenzotriazol (0,63 g, 4,7 mmol). Después de agitar durante 1 h, la mezcla se filtró a través del filtro de vidrio sinterizado para separar la N,N'-diciclohexilcarbodiimida precipitada. El filtrado se evaporó a sequedad, se disolvió de nuevo en una mezcla de CHCl_{3} y pentano (1:1) y se cargó sobre una columna de gel de sílice. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y se evaporaron a sequedad para dar 1,45 g (80%) del producto deseado en forma de un sólido blanco: p.f. 138-138,5ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 200 MHz) 8,04 (d, 1H), 7,49-7,40 (m, 4H), 7,09 (d, 1H), 3,87 (s, 3H), 1,50 (s, 9H).
5-[1-Metil-4-(terc-butiloxi)carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (12). Se añadió ácido trifluoroacético (5 ml) a 0ºC a 11 (0,73 g, 1,5 mmol). Después de agitar a 0ºC durante 20 min, la mezcla de reacción se evaporó a sequedad por co-evaporación con CHCl_{3}. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} seco (15 ml) y se añadieron 1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamido-pirrolo-2-carboxilato de 1,2,3-benzotriazol-1-ilo (0,59 g, 1,65 mmol) y trietilamina seca (0,23 g, 2,3 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 15 min, se añadió CHCl_{3} (100 ml). La mezcla de reacción se extrajo con NaHCO_{3} al 5% (2 x 20 ml) y H_{2}O (2 x 2 ml). La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en un evaporador rotatorio. La cromatografía sobre gel de sílice (100 g) con CHCl_{3} proporcionó 0,88 g (91,8%) de 12. ^{1}HRMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm): 7,88 (m, 4H), 7,46 (m, 5H), 6,74 (s, 1H), 6,38 (s, 1H), 6,26 (s, 1H), 5,87 (t, 1H), 4,18 (t, 2H, J = 6 Hz), 3,82 (s, 3H), 3,79 (s, 2H), 3,3 (m, 2H), 2,63 (t, 2H, J = 6 Hz), 2,30 (t, 2H, J = 6 Hz), 1,64-1,2 (m, 6H), 1,46 (s, 9H).
5-[1-Metil-4-[1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (13). Una solución de 12 (2,43 g, 4 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (8 ml) se trató con ácido trifluoroacético (4 ml) a 0ºC. La solución resultante se dejó a temperatura ambiente en un matraz tapado durante 1 h y después se repartió entre K_{2}CO_{3} acuoso al 30% (30 ml) y CH_{2}Cl_{2} (30 ml). La capa inferior se recogió. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 20 ml) y los extractos orgánicos combinados, después de lavarse con H_{2}O (1 x 20 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporaron. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (10 ml) y se añadieron 1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxilato de 1,2,3-benzotriazol-1-ilo (1,43 g, 4 mmol) y trietilamina seca (0,8 g, 8 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 min, se añadió CHCl_{3} (100 ml). La mezcla de reacción se extrajo con NaHCO_{3} al 5% (2 x 20 ml) y H_{2}O (2 x 2 ml). La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en un evaporador rotatorio. La cromatografía sobre gel de sílice (100 g) con CHCl_{3} proporcionó 1,95 g (66,8%) de 13. ^{1}HRMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm): 7,87 (m, 4H), 7,46 (m, 5H), 7,04 (d, 1H, J = 1,5 Hz), 6,77 (br s, 1H), 6,52 (br s, 1H), 6,50 (d, 1H, J = 1,5 Hz), 6,31 (br s, 1H), 5,95 (t, 1H), 4,19 (t, 2H, J = 6 Hz), 3,85 (s, 6H), 3,78 (s, 2H), 3,32 (m, 2H), 2,64 (t, 2H, J = 6 Hz), 2,31 (t, 2H, J = 6 Hz), 1,64-1,2 (m, 6H), 1,48 (s, 9H).
5-[1-Metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido] pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (14). Una solución de 13 (1,90 g, 2,6 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (6 ml) se trató con ácido trifluoroacético (3 ml) a 0ºC. La solución resultante se dejó a temperatura ambiente en un matraz tapado durante 1 h y después se repartió entre K_{2}CO_{3} acuoso al 30% (30 ml ) y CH_{2}Cl_{2} (30 ml). La capa inferior se recogió. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 20 ml) y los extractos orgánicos combinados, después de lavarse con H_{2}O (1 x 20 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporaron. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (2,5 ml) y se añadieron 1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxilato de 1,2,3-benzotriazol-1-ilo (1,4 g, 3,9 mmol) y trietilamina seca (0,8 g, 8 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 h, se añadió CHCl_{3} (100 ml). La mezcla de reacción se extrajo con NaHCO_{3} al 5% (2 x 20 ml) y H_{2}O (2 x 20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en un evaporador rotatorio. La cromatografía sobre gel de sílice (100 g) con metanol al 0-1,5% en CHCl_{3} proporcionó 1,56 g (70,5%) de 14. ^{1}HRMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm): 7,87 (m, 4H), 7,68 (br s, 1H), 7,60 (br s, 1H), 7,46 (m, 5H), 7,08 (br s, 2H), 6,78 (br s, 1H), 6,56 (d, 1H, J = 1,5 Hz), 6,60 (br s, 1H), 6,55 (d, 1H, J = 1,5 Hz), 6,03 (t, 1H), 4,18 (t, 2H, J = 6 Hz), 3,86 (m, 9H), 3,78 (s, 2H), 3,32 (m, 2H), 2,63 (t, 2H,
J = 6 Hz), 2,30 (t, 2H, J = 6 Hz), 1,64-1,2 (m, 6H), 1,48 (s, 9H).
5-[1-Metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (15). Una solución de 14 (0,32 g, 0,32 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml) se trató con ácido trifluoroacético (2,5 ml) a 0ºC. La solución resultante se dejó a temperatura ambiente en un matraz tapado durante 1 h y después se repartió entre K_{2}CO_{3} acuoso al 30% (30 ml) y CH_{2}Cl_{2} (30 ml). La capa inferior se recogió. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 20 ml) y los extractos orgánicos combinados, después de lavarse con H_{2}O (1 x 20 ml), se secaron sobre Na_{2}SO y se evaporaron. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (1 ml) y se añadieron 1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxilato de 1,2,3-benzotriazol-1-ilo (0,11 g, 0,32 mmol) y trietilamina seca (0,06 g, 0,03 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1,5 h, se añadió CHCl_{3} (100 ml). La suspensión se filtró y el filtrado se extrajo con NaHCO_{3} al 5% (2 x 20 ml) y H_{2}O (2 x 20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó a sequedad. El rendimiento de 15 fue de 0,25 g (80%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm): 8,17 (br s, 1H), 7,98 (br s), 7,96 (br s), 1H 7,85 (m, 4H), 7,44 (m, 5H), 7,09 (br s, 2H), 7,02 (s, 1H), 6,78 (br s, 1H), 6,74 (br s, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,58 (s, 3H), 6,29 (t, 1H), 4,18 (t, 2H, J = 6 Hz), 3,78 (m, 14H), 3,28 (m, 2H), 2,60 (t, 2H, J = 6 Hz), 2,26 (t, 2H, J = 6 Hz), 1,64-1,2 (m, 6H), 1,48 (s, 9H).
5-[1-Metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (16). Una solución de 15 (0,65 g, 0,67 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (10 ml) se trató con ácido trifluoroacético (5 ml) a 0ºC. La solución amarillenta resultante se dejó a temperatura ambiente en un matraz tapado durante 1 h y después se repartió entre K_{2}CO_{3} acuoso al 30% (30 ml) y CH_{2}Cl_{2} (30 ml). La capa inferior se recogió. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 20 ml) y los extractos orgánicos combinados, después de lavarse con H_{2}O (1 x 20 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporaron. El residuo se disolvió en DMF (1 ml) y se añadieron 1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxilato de 1,2,3-benzotriazol-1-ilo (0,24 g, 0,67 mmol) y trietilamina seca (0,13 g, 0,67 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 h, la mezcla de reacción se evaporó a sequedad por co-evaporación con acetato de butilo. El residuo se disolvió en 3 ml de DMF al 2,5% en CHCl_{3}. La cromatografía sobre gel de sílice (100 g) con metanol al 0-2,5% en CHCl_{3} (DMF al 2,5%) proporcionó 0,67 g (45%) de 16.
4'-[bis(2-Cloroetil)amino]fenilbutirato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2,3,5,6-tetrafluorofenil éster de clorambucilo)
A una solución de 0,25 g (0,82 mmol) de clorambucilo (suministrado por Fluka A. G.) y 0,3 g (1,1 mmol) de trifluoroacetato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo en 5 ml de diclorometano seco se le añadieron 0,2 ml de trietilamina seca. La mezcla se agitó en una atmósfera de argón a temperatura ambiente durante 0,5 h y se evaporó. El aceite residual se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con hexano-cloroformo (2:1) como disolvente de elución para dar el éster en forma de un aceite: 0,28 g (75%); TLC sobre gel de sílice (CHCI_{3}) R_{F} 0,6; IR (en CHCl_{3}) 3010, 1780, 1613, 1521, 1485 cm^{-1}.
Introducción del residuo clorambucilo en los grupos amino primarios de oligonucleótidos
Preparación de la sal de cetiltrimetilamonio de oligonucleótidos: se inyectaron 100 \mul de una solución acuosa de oligonucleótido (50-500 \mug), generalmente sal trietilamonio, en una columna cargada con Dowex 50wx8 en forma del cetiltrimetilamonio y prelavada con alcohol al 50% en agua. La columna se eluyó con etanol acuoso al 50% (0,1 ml/min). La fracción que contenía el oligonucleótido se secó en un Speedvac durante 2 horas y se usó en reacciones posteriores.
Una solución en etanol (50 \mul) de sal cetiltrimetilamonio de un oligonucleótido (50-100 \mug) se mezcló con una solución 0,08 M de 4'-[bis(2-cloroetil)amino]fenilbutirato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (tetrafluorofenil éster de clorambucilo) en acetonitrilo (50 \mul) y 3 \mul de diisopropiletilamina. Después de agitar durante tres horas a temperatura ambiente, el producto se precipitó con LiClO_{4} al 2% en acetona (1,5 ml). El producto se precipitó de nuevo tres veces en agua (60 \mul) con LiClO_{4} al 2% en acetona. Finalmente, el derivado de clorambucilo del oligonucleótido se purificó por Cromatografía de Fase Inversa con un rendimiento de aproximadamente el 50-80%. La fracción que contenía un producto se concentró con aproximadamente butanol. El derivado de clorambucilo del oligonucleótido aislado se precipitó en una solución en acetona de LiClO_{4}, se lavó con acetona y se secó al vacío en una bomba de aceite. Cualquier manipulación del oligonucleótido reactivo se realizó tan rápido como fue posible, con el producto en solución enfriada con hielo, partiendo de la fracción cromatográfica colectada.
Síntesis de oligonucleótidos
Todos los oligonucleótidos se prepararon en 1 \mumol del soporte de CPG apropiado en un AMB 394 usando el protocolo suministrado por el fabricante. Los reactivos convencionales para la química de acoplamiento del cianoetilfosforamidita se adquirieron en Glen Research. Se introdujeron modificaciones de 5'-aminohexilo usando un enlazador de fosforamidita de N-MMT-hexanolamina (Glen Research). Se introdujeron modificaciones de 3'-aminohexilo usando el CPG preparado como se ha descrito previamente, C.R. Petrie, M.W. Reed, A.D. Adams y R.B. Meyer, Jr. Bioconjugate Chemistry, 1992, 3, 85-87.
Preparación de Conjugados (Esquema de Reacción 3)
A una solución de sal cetiltrimetilamonio de un oligonucleótido modificado con aminohexilo (30-50 nmol, Jost, J.-P., Jiricny, J. y Saluz, H. (1989) Quantitative precipitation of short oligonucleotides with low concentrations of cetyltrimethylammonium bromide. Nucleic Acids Res. 17, 2143) y 1,5 \mul de N,N-diisopropiletilamina en 40 \mul de DMSO seco se le añadieron 40 \mul de una solución 4 mM del éster de TFP (1a, 1b, 2e, 2f o 3c). La mezcla de reacción se mantuvo durante 12 h a TA. El material relacionado con el oligonucleótido se precipitó mediante la adición de 1,5 ml de LiClO_{4} al 2% en acetona. El sedimento se lavó con acetona y se secó al vacío. El sedimento se disolvió de nuevo en 60 \mul de DMF al 50% en H_{2}O y se precipitó de nuevo como se ha descrito anteriormente usando una solución al 2% de LiClO_{4} en acetona. Este procedimiento se repitió dos veces. El residuo se purificó por HPLC (4,6 x 250 mm, C-18, Dynamax-300A, Rainin) usando un gradiente de acetonitrilo del 20 al 75% en presencia de LiClO_{4} 50 mM. La fracción que contenía el producto puro se secó al vacío usando Speedvac. El residuo se disolvió en 60-80 ml de H_{2}O y se precipitó con 1,5 ml de LiClO_{4} al 2% en acetona. Después del lavado con acetona (2 x 1,5 ml) y del secado al vacío, el gránulo se disolvió en 100 \mul de H_{2}O. El rendimiento del producto final fue del 20-50%.
Se usó un procedimiento modificado de Godovikova et al. (T. S. Godovikova, V.F. Zarytova, T.V. Maltzeva, L.M. Khalimskaya. Bioorgan. Khim., 1989, 15, 1246-1259) para la preparación de los conjugados oligonucleotídicos que tienen restos de ácido 4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico. Una solución de sal cetiltrimetilamonio del oligonucleótido que contiene 3'-fosfato (50-100 nmol), trifenilfosfina (10 mg), disulfuro de 2,2'-dipiridilo (10 mg), N,N-dimetilaminopiridina (10 mg) y uno de los análogos seleccionados entre los compuestos 11 a 16 en 100 \mul de DMF seca se incubó durante 20 min a TA. El material relacionado con el oligonucleótido se precipitó mediante la adición de 1,5 ml de LiClO_{4} al 2% en acetona. El sedimento se lavó con acetona y se secó al vacío. El residuo se purificó por HPLC usando un gradiente de acetonitrilo del 20 al 75% en presencia de LiClO_{4} 50 mM. La fracción que contenía el producto puro se secó al vacío usando Speedvac. El residuo se disolvió en 60-80 \mul de H_{2}O y se precipitó con 1,5 ml de LiClO_{4} al 2% en acetona. Después del lavado con acetona (2 x 1,5 ml) y del secado al vacío, el sedimento se disolvió en 100 \mul de H_{2}O. El rendimiento del producto final fue del 30-50%.
Preparación de Conjugados (Esquema de Reacción 4)
El oligonucleótido obtenido a partir de 5'-aminohexilo que contenía CPG obtenido en una síntesis a escala 1 \mumol se trató con ácido dicloroacético al 2% en CH_{2}Cl_{2} para retirar el grupo protector de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) del grupo amino, seguido de lavado con acetonitrilo y secado mediante lavado abundante con argón. El CPG se transfirió a un tubo de plástico de 1,5 ml y se añadieron 100 \mul de una solución 50 mM de éster de TFP en DMSO anhidro. El tubo se agitó durante 24 h, después se lavó con 3 x 1,5 ml de DMSO y 2 x 1,5 ml de acetona y se secó al vacío. El CPG se trató con amoniaco concentrado para desproteger el oligonucleótido usando condiciones convencionales. La mezcla de reacción resultante se separó usando HPLC de fase inversa como se ha descrito anteriormente. El rendimiento típico fue de aproximadamente el 50%.
Estudios de Desnaturalización Térmica
Se obtuvieron curvas de fusión óptica de complejos de oligonucleótidos que llevaban residuos de ácido 4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico en NaCl 200 mM, Na_{2}HPO_{4} 10 mM, EDTA 0,1 mM (pH 7,0) en el detector UV de un cromatógrafo líquido Milichrom en una celda termorregulada diseñada especialmente para este fin. Los datos se recogieron y procesaron en un ordenador personal como se describe por S.G. Lokhov et al. (S.G. Lokhov, M.A. Podyminogin, D.S. Sergeev, V.N. Silnikov, I.V. Kutyavin, G.V. Shishkin, V.F. Zarytova. Bioconjugate Chem. 1992, 3, 414).
Los complejos de oligonucleótidos que llevaban ácido 1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico (CDPI) se fundieron en KCl 140 mM, MgCl_{2} 10 mM y HEPES-HCl 20 mM (pH 7,2) en un espectrofotómetro Lambda 2 (Perkin Elmer) con un programador de temperatura multicelda automático PTP-6. Las temperaturas de fusión de los complejos (Tm) se determinaron a partir de la máxima obtenida.
Reacciones de extensión de cebadores
Las reacciones de extensión de cebadores se realizaron como se ha descrito previamente por Lee, et al., [Biochemistry (1994) 33: 6024-6030]. Las concentraciones finales de plantilla, cebador y ADN de bloqueo fueron de 5 x 10^{-10} M, 4 x 10^{-8} M y 10^{-9} M, respectivamente. La extensión de cebadores se realizó durante 15 min a 45ºC, y los productos se analizaron por electroforesis en gel desnaturalizante como se ha descrito en la referencia.
En ausencia de cualquier ODN de bloqueo, la reacción de extensión de cebadores generó un producto de alto peso molecular que se presentó como una banda no resuelta en el gel de secuenciación. En todas las mezclas de reacción se observaron reproduciblemente bandas débiles correspondientes a sitios de pausa o a sucesos de terminación espontánea. Los ODN 16-méricos y 32-méricos no modificados, completamente complementarios a la diana, no pudieron bloquear la extensión de cebadores. También carecían de actividad los ADN 8-mérico y 16-mérico complementarios, cada uno de los cuales estaba unido en posición 3' a un grupo CDPI_{3}. Sólo un ODN 16-mérico completamente complementario con un grupo CDPI_{3} conjugado en posición 5' detuvo la extensión del cebador por la ADN polimerasa de T7. Un ODN 8-mérico complementario con la misma modificación 5' generó únicamente una pequeña cantidad de producto bloqueado. Los ODN de control confirmaron que la inhibición de la extensión de cebadores requiere tanto un ODN complementario como un MGB unido covalentemente. Dos ODN 16-méricos desacoplados individualmente, cada uno con un péptido CDPI_{3} unido en posición 5', eran mucho menos inhibidores que los conjugados ODN-MGB perfectamente acoplados. La adición de un ODN 16-mérico no modificado junto con una cantidad equimolar de CDPI_{3} libre no tuvo ningún efecto sobre la extensión de cebadores, subrayando la importancia de la conjugación del MGB con el ODN. Cuando un resto de acridina 5' se conjugó con el ODN 16-mérico totalmente complementario en lugar del MGB, se observó una pérdida de actividad inhibidora.
Experimento de entrecruzamiento en cultivo celular
El conjugado ODN-MGB era complementario a los nucleótidos 815-864 de la cadena de plantilla del alelo DQ\beta1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 7313-7317]. Las células B de BSM humanas usadas aquí son homocigotas para este alelo y lo expresan constitutivamente. Antes de añadir el ODN, las células BSM se cultivaron en un matraz de 25 ml a una densidad de 4,5 x 10^{6} células por ml de medio.
Para cada tratamiento, las células de una alícuota de 2 ml de cultivo se sedimentaron y se resuspendieron en 200 \mul de medio sin suero que contenía ODN unido a clorambucilo 50-mérico 0, 1, 10 ó 50 \muM (con o sin un grupo CDPI_{3} conjugado en posición 3'). Cada muestra se incubó durante 3,5 horas a 37ºC con 5% de CO_{2} en una placa de microtitulación de 48 pocillos. Las células después se transfirieron a tubos de centrífuga Eppendorf de 0,5 ml, se sedimentaron durante 5 min a 2,000 rpm, se lavaron dos veces con 500 \mul de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se desproteinaron con Proteinasa K/SDS durante una noche a 37ºC. Después de la extracción con fenol/cloroformo y digestión con Rnasa A, el ADN se trató con pirrolidina 1 M a 90ºC durante 30 min. La pirrolidina se retiró por precipitación con etanol y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por ligamiento se realizó como se describe por Lee et al. [Biochemistry (1994) 33: 6024-6630]. El ADN amplificado se analizó en un gel de secuenciación para visualizar cualquier muesca con especificidad de secuencia que pudiera haberse producido como resultado de la alquilación de la diana por ODN que contenían clorambucilo. Los resultados mostraron la escisión en el nucleótido en la diana adyacente al agente de entrecruzamiento en el ODN, y que el 50-mero que contenía CDPI_{3} era 10 veces más eficaz que el mismo ODN sin el MGB en la secuencia alquilando específicamente el alelo 0302.
Se preparó medio completo a partir de los siguientes componentes (el medio sin suero carecía de HI-FCS): 500 ml de RPMI 1640 con L-glutamina (2 mM) (Gibco BRL Nº Cat. 11875-036)
50 ml de HI-FCS (Gibco BRL Nº Cat. 26140, inactivado con calor 30 min a 55ºC),
5 ml de Penicilina/Estreptomicina 100X (Gibco BRL Nº Cat., 15070-022),
5 ml de L-Glutamina 200 mM (Gibco BRL Nº Cat. 25030-024),
5 ml de piruvato sódico 100X (11 mg/ml; obtenido en Gibco BRL Nº Cat. 11840-030)
5 ml de HEPES 1 M, pH 7,3 (Gibco BRL Nº Cat. 15630-023).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Microprobe Corporation, Bothell WA 98021
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MENOR OLIGONUCLEÓTIDO UNIDO COVALENTEMENTE
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIA: 2
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(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
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(A)
DESTINATARIO: KLEIN & SZEKERES
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(B)
CALLE: 4199 Campus Drive, Suite 700
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Irvine
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(D)
ESTADO: CA
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(E)
PAÍS: ESTADOS UNIDOS
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 92715
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
IMPRESO LEGIBLE POR ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
SOFTWARE: PatentIn nº de Distribuión 1.0, Nº de versión 1,25
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(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/415.370
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-ABRIL-1995
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(C)
CLASIFICACIÓN:
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(viii)
INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
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(A)
NOMBRE: Szekeres, Gabor L.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 28.675
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(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: 491-09-PA
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(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
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(A)
TELÉFONO: 714-854-5502
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: 714-854-5502
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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 1:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
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(B)
TIPO: ácido nucleico
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(C)
ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
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(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTTATTTTT GAAGATACGA ATTTCUCCAG AGACACAGCA GGATTTGTCA 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PAR ALA ID. SEC. Nº: 2:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
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(B)
TIPO: ácido nucleico
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(C)
ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 2:
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTTTTTTT TTTTTT 
\hfill
16

Claims (31)

1. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor, que comprende un oligonucleótido que tiene una pluralidad de unidades nucleotídicas, un extremo 3' y un extremo 5', y la capacidad de unirse a una secuencia diana complementaria o sustancialmente complementaria de ácidos nucleicos, y
un resto de unión al surco menor unido al menos a uno de dichos nucleótidos a través de un grupo de unión que une covalentemente el resto de unión al surco menor con el oligonucleótido a través de una cadena de preferentemente no más de 15 átomos, donde el resto de unión al surco menor es un radical de una molécula que tiene un peso molecular de 150 a 2000 Dalton y se une de una manera no intercalante en el surco menor de ADN bicatenario, ARN o híbridos de los mismos, con una constante de asociación de 10^{3} M^{-1} o mayor.
2. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (a):
(a)R_{1}-(HN-Y_{1}-CO)_{n}-R_{2}
donde Y_{1} representa un anillo de 5 miembros que tiene dos dobles enlaces y de 0 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por N, S y O, los grupos NH y CO se unen respectivamente a dos carbonos del anillo que están separados entre sí por un átomo de anillo, estando el átomo de anillo situado entre dichos dos carbonos de anillo sustituido únicamente con H cuando es carbono o nitrógeno y sin sustituir cuando es oxígeno o azufre, pudiendo estar cada uno de los átomos restantes del anillo opcionalmente sustituidos con 1, 2 ó 3 grupos R_{3};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, -O-, -S-, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4}, O(CH_{2})_{m}CO, O(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH, -O-, -S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4}, -HN(CH_{2})_{m}
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH-, o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4}, o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros condensado con el anillo Y_{1} y estar sustituidos con uno, dos o tres R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2}, N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5}; y
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos.
3. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (b):
(b)R_{1}-(R_{6}N-Y_{2}-CO)_{n}R_{2}
donde Y_{2} es un sistema de anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el sistema de anillos condensado de 0 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por N, S y O, cada uno de los grupos R_{6}N y CO está unido a un carbono del anillo que está en un anillo diferente del sistema de anillos condensado, y que es el segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo del anillo de cabeza de puente común, colocando por lo tanto los grupos CO y NR_{6} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el otro lado del sistema de anillos condensado, estando los dos átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del sistema de anillos condensados opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4} y H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4}, O(CH_{2})_{m}CO, O(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH, -O-, -S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4}, -HN (CH_{2})_{m}
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4}, o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros condensado con el anillo Y_{1} y sustituido con uno, dos o tres R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2}, N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{6} es H, alquilo de 1 a 5 carbonos, o R_{6} y R_{7} juntos forman un anillo de 4, 5 ó 6 miembros, siendo parte de dicho anillo opcionalmente un grupo -O-, -S-, -NH-, -NCH_{3}-, o N-alquilo inferior;
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}-, o -CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero de 1 a 10;
n es un número entero de 1 a 10, y
p es un número entero de 1 a 5.
4. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (c):
(c)R_{1}-(CO-Y_{3}-NH)_{n}-R_{2}
donde Y_{3} es un anillo aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono, estando dichos carbonos del anillo en la posición 1,4 entre sí, estando dos átomos del anillo no ocupados por los grupos CO o NH en uno de los dos lados del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos átomos en el anillo no ocupados en el otro lado del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4} y H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4}, O(CH_{2})_{m}CO, O(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH, -O-, -S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4}, -HN (CH_{2})_{m}
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4}, o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros condensado con el anillo Y_{1} y sustituido con uno, dos o tres R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2}, N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}-, o -CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero entre 1 y 10;
n es un número entero entre 1 y 10, y
p es un número entero entre 1 y 5.
5. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (d):
(d)R_{1}-(HN-Y_{4}-HN-CO-Y_{4}-CO)_{p}-R_{2}
donde Y_{4} es un anillo aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono del anillo, estando dichos carbonos del anillo en la posición 1,4 entre sí en cada anillo, estando dos átomos del anillo no ocupados por los grupos CO o NH en uno de los dos lados del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos átomos del anillo no ocupados en el otro lado del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4} y H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4}, O(CH_{2})_{m}CO, O(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH, -O-, -S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4}, -HN (CH_{2})_{m}
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4}, o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros condensado con el anillo Y_{1} y sustituido con uno, dos o tres R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2}, N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}-, o -CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero entre 1 y 10;
n es un número entero entre 1 y 10, y
p es un número entero entre 1 y 5.
6. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (e):
(e)R_{1}-(Y_{5})_{n}-R_{2}
donde Y_{5} es un sistema de anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el sistema de anillos condensados de 0 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por N, S y O, donde cada uno de los grupos R_{1} y R_{2} está unido a un carbono del anillo que está en un anillo diferente del sistema de anillos condensados, y que es el segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo del anillo de cabeza de puente común, colocando los grupos R_{1} y R_{2} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el otro lado del sistema de anillos condensados, estando los dos átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del sistema de anillos condensados opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4} y H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4}, O(CH_{2})_{m}CO, O(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH, -O-, -S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4}, -HN (CH_{2})_{m}
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4}, o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros condensado con el anillo Y_{1} y sustituido con uno, dos o tres R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2}, N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}-, o -CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero entre 1 y 10;
n es un número entero entre 1 y 10, y
p es un número entero entre 1 y 5.
7. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor está unido al extremo 5'- del oligonucleótido.
8. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor está unido al extremo 3'- del oligonucleótido.
9. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor está unido a una unidad nucleotídica que no está en el extremo 3' ni en el extremo 5' del oligonucleótido.
10. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor está unido a la porción de base heterocíclica de una unidad nucleotídica.
11. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 9, en la que el resto de unión al surco menor está unido a la porción de base heterocíclica de una unidad nucleotídica.
12. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la que el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión tiene la fórmula
42
en la que n es de 2 a 5.
13. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 12, en la que el resto de unión al surco menor está unido al extremo 3' del oligonucleótido.
14. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la que el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión tiene la fórmula
43
en la que n = 2-5.
15. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la que el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión tiene la fórmula
44
en la que n = 2-5.
16. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 15, en la que el resto de unión al surco menor está unido al extremo 3' del oligonucleótido.
17. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 2, en la que el resto de unión al surco menor se representa por la fórmula (a) en la que el anillo de cinco miembros tiene la estructura
45
18. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 2, en la que el resto de unión al surco menor se representa por la fórmula (a) en la que el anillo de cinco miembros tiene la estructura
46
19. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 3, en la que el resto de unión al surco menor se representa por la fórmula (b) en la que el anillo de cinco miembros tiene la estructura
47
20. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 1 que comprende adicionalmente una funcionalidad de entrecruzamiento unida covalentemente al menos a una de dichas unidades nucleotídicas.
21. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor que comprende un oligonucleótido que tiene una pluralidad de unidades nucleotídicas, un extremo 3' y un extremo 5', y la capacidad de unirse a una secuencia diana complementaria o sustancialmente complementaria de ácidos nucleicos, y
un resto de unión al surco menor unido al menos a uno de dichos nucleótidos a través de un grupo de unión que une covalentemente el resto de unión al surco menor con el oligonucleótido a través de una cadena de preferentemente no más de 15 átomos, teniendo la combinación la fórmula
48
en la que x es O o S;
q es un número entero comprendido entre 3 y 100;
R_{8} es H, OH, alcoxi que tiene de 1 a 6 carbonos, O-alquenilo C_{2}-C_{8} o F;
B es un aglicón seleccionado entre un grupo constituido por una base heterocíclica natural en ácidos nucleicos e hipoxantina, 2-aminoadenina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-N^{4}-etenocitosina, 4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina, 6-amino-4-hidroxi-[3,4-d]pirimidina;
W_{1} es H, PO(OH)_{2} o una sal del mismo, o un resto de unión al surco menor unido al extremo 3' o 5' de dicho oligonucleótido, incluyendo el grupo de unión que une covalentemente al resto de unión al surco menor con el oligonucleótido a través de no más de 15 átomos;
W_{2} está ausente o es un resto de unión al surco menor unido a uno de los aglicones B, incluyendo el grupo de unión que une covalentemente el resto de unión al surco menor con dicho aglicón, o W_{2} es una funcionalidad de entrecruzamiento incluyendo un brazo enlazador que une covalentemente la funcionalidad de entrecruzamiento con dicho aglicón,
donde el resto de unión al surco menor es un radical de una molécula que tiene un peso molecular de 150 a 2000 Dalton que se une de manera no intercalante en el surco menor del ADN bicatenario, ARN o híbridos de los mismos con una constante de asociación mayor de 10^{3} M^{-1}, con la condición de que al menos uno de dichos grupos W_{1} y W_{2} sea un resto de unión al surco menor.
22. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 21, en la que el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión tiene la fórmula seleccionada entre el grupo constituido por los grupos (a), (b), (c), (d) y (e):
(a)R_{1}-(HN-Y_{1}-CO)_{n}-R_{2}
donde Y_{1} representa un anillo de 5 miembros que tiene dos dobles enlaces y de 0 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por N, S, y O, los grupos NH y CO están unidos respectivamente a dos carbonos del anillo que están separados entre sí por un átomo del anillo, el átomo del anillo situado entre dichos dos carbonos del anillo sólo está sustituido con H cuando es carbono o nitrógeno o está sin sustituir cuando es oxígeno o azufre, pudiendo estar cada uno de los átomos restantes del anillo opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos R_{3};
(b)R_{1}-(R_{6}N-Y_{2}-CO)_{n}-R_{2}
donde Y_{2} es un sistema de anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el sistema de anillos condensados de 0 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por N, S y O, cada uno de los grupos R_{6}N y CO está unido a un carbono del anillo que está en un anillo diferente del sistema de anillos condensados, y que es el segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo del anillo de cabeza de puente común, colocando por lo tanto los grupos CO y NR_{6} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el otro lado del sistema de anillos condensados, estando los dos átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del sistema de anillos condensados opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3};
(c)R_{1}-(CO-Y_{3}-NH)_{n}-R_{2}
donde Y_{3} es un anillo aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono de anillo, estando dichos carbonos del anillo en la posición 1,4 entre sí, estando dos átomos del anillo no ocupados por los grupos CO o NH en uno de los dos lados del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos átomos del anillo no ocupados en el otro lado del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7};
(d)R_{1}-(HN-Y_{4}-HN-CO-Y_{4}-CO)_{p}-R_{2}
donde Y_{4} es un anillo aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono del anillo, estando dichos carbonos del anillo en la posición 1,4 entre sí en cada anillo, estando dos átomos del anillo no ocupados por los grupos CO o NH en uno de los dos lados del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos átomos del anillo no ocupados en el otro lado del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7};
(e)R_{1}-(Y_{5})_{n}-R_{2}
\newpage
donde Y_{5} es un sistema de anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el sistema de anillos condensados de 0 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por N, S y O, donde cada uno de los grupos R_{1} y R_{2} está unido a un carbono del anillo que está en un anillo diferente del sistema de anillos condensados, y que es el segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo del anillo de cabeza de puente común, colocando los grupos R_{1} y R_{2} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el otro lado del sistema de anillos condensados, estando los dos átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del sistema de anillos condensados opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4} y H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4}, -O-,
-S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4}, -HN(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}
NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4}, N(R_{4})_{2}, N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4}, o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros condensado con el anillo Y_{1} y sustituido con uno, dos o tres R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1,2 ó 3 grupos F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2}, N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{6} es H, alquilo de 1 a 5 carbonos, o R_{6} y R_{7} juntos forman un anillo de 4, 5 ó 6 miembros, siendo parte de dicho anillo opcionalmente un grupo -O-, -S-, -NH-, -NCH_{3}- o N-alquilo inferior;
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}- o -CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero de 1 a 10;
n es un número entero de 1 a 10, y
p es un número entero de 1 a 5.
23. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 22, en la que al menos uno de los grupos W_{1} es un resto de unión al surco menor y un grupo de unión, y W_{2} está ausente.
24. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 22, en la que W_{2} es un resto de unión al surco menor y un grupo de unión.
25. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 23, en la que el resto de unión al surco menor que incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (a) en la que el anillo de cinco miembros tiene
\vskip1.000000\baselineskip
49 
\vskip1.000000\baselineskip
26. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 23, en la que el resto de unión al surco menor se representa por la fórmula (a) en la que el anillo de cinco miembros tiene la estructura
50
27. Combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de unión al surco menor según la reivindicación 23, en la que el resto de unión al surco menor se representa por la fórmula (b) en la que el sistema de anillos condensados tiene la estructura
51
28. Uso del conjugado de agente de unión al surco menor unido covalentemente-oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 27 como una sonda de hibridación.
29. Uso según la reivindicación 28, donde el conjugado de MGB-oligonucleótido es una sonda que comprende un grupo reportador, que hace fácilmente detectable al agente de unión al surco menor.
30. Uso de un conjugado de agente de unión al surco menor-oligonucleótido unido covalentemente según una de las reivindicaciones 1 a 27 como una sonda de diagnóstico.
31. Uso de un conjugado de agente de unión al surco menor-oligonucleótido unido covalentemente según una de las reivindicaciones 1 a 27 para la fabricación de agentes terapéuticos antisentido y anti-gen.
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