ES2300852T3 - Tratamiento de enfermedades neurogenerativas mediante el uso de gpr49. - Google Patents
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Abstract
Uso de un inhibidor de GPR49 seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, ARNsi, y ribozimas, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.
Description
Tratamiento de enfermedades neurodegenerativas
mediante el uso de GPR49.
La presente invención se relaciona con los
complejos de proteínas de la ruta que procesa la APP, que comprende
la proteína GPR49 así como con el uso de inhibidores de estos
complejos así como de GPR49 en el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas.
La enfermedad de Alzheimer es una condición
crónica que afecta a millones de individuos en todo el mundo.
Los cerebros de los pacientes de la enfermedad
de Alzheimer muestran una patología característica de lesiones
neuropatológicas prominentes, tales como los ovillos neurofibrilares
intracelulares inicialmente (NFTs), y las placas seniles ricas en
amiloides extracelulares. Estas lesiones se asocian con pérdida
masiva de poblaciones de las neuronas CNS y su progresión acompaña
la demencia clínica asociada, con AD. El componente principal de
las placas amiloides son los péptidos beta amiloide
(A-beta, Abeta o AB) de varias longitudes. Una
variante de estos, la cual es el péptido AB1-42
(Abeta-42), es el principal agente causativo para la
formación de amiloides. Otra variante es el péptido
AB1-40 (Abeta-40). El beta amiloide
es el producto proteolítico de un proteína precursora, la proteína
precursora beta amiloide (beta-APP o APP). La APP es
una proteína tipo-I trans-membrana
que secuencialmente se divide por varias proteasas diferentes
asociadas con la membrana. La primera división de la APP ocurre por
una de dos proteasas, alfa-secretasa o
beta-secretasa. La alfa-secretasa es
una metaloproteasa cuya actividad es más probable que sea
proporcionada por una o una combinación de las proteínas
ADAM-10 y ADAM-17. La división por
alfa-secretasa imposibilita la formación de péptidos
amiloides y es así como se refiere a
no-amiloidogénica. En contraste, la división de la
APP mediante beta-secretasa es un
pre-requisito para la posterior formación de
péptidos amiloides. Esta secretasa, también llamada BACE1 (enzima de
división de APP sitio-beta), es una proteína
transmembrana tipo-I que contiene una actividad
aspartil proteasa (que se describe con detalle abajo).
La actividad de la
beta-secretasa (BACE) divide la APP en el
ectodominio, resultando en el derramamiento de la APPb secretada,
soluble, y en un fragmento transmembrana C-terminal
residuo-99 (APP-C99). Vassar et
al. (Science 286, 735-741) clonaron una
proteasa aspártica transmembrana, que tuvo las características de la
postulada beta-secretasa de APP, la cual llamaron
BACE1. Los cultivos de cerebro y cortical primario a partir de
ratones carentes de BACE1, no mostraron actividad
beta-secretasa detectable, y los cultivos cortical
primario de ratones carentes de BACE produjeron mucho menos beta
amiloide de APP. Esto sugiere que la BACE1, en lugar de su parálogo
BACE2, es la principal beta-secretasa para APP. La
BACE1 es una proteína de 501 aminoácidos (aa) que contiene un
péptido señal de 21-aa seguido por un dominio
pro-secuencia que abarca 22 a 45 aa. Existen de
manera alterna formas empalmadas,
BACE-I-457 y
BACE-I-476. El dominio extracelular
de la proteína madura se sigue por un dominio transmembrana
predicho y una cola C-terminal citosólica pequeña de
24 aa. Se predice que la BACE1 es una proteína transmembrana tipo 1
con el sitio activo sobre el lado extracelular de la membrana,
cuando la beta-secretasa divide la APP y otros
posibles sustratos aún no identificados. Aunque BACE1 es claramente
una enzima clave requerida para el procedimiento de la APP en
A-beta, la evidencia reciente sugiere otros
sustratos potenciales y las funciones de BACE1 (J. Biol. Chem. 279,
10542-10550). Hasta la fecha, ninguna BACE1 que
interactúa las proteínas con las funciones reguladoras o moduladoras
se ha descrito.
El fragmento APP generado por la división de
BACE1, APP-C99, es un sustrato para la actividad de
la gama-secretasa, que divide la
APP-C99 dentro del plano de la membrana en un
péptido A-beta (tal como el péptido
AB1-42 amiloidogénico), y en un fragmento
C-terminal, llamado dominio intracelular de APP
(AICD) (Annu Rev Cell Dev Biol 19, 25-51). La
actividad de la gama-secretasa reside dentro de un
complejo multiproteico con al menos cuatro subunidades distintas.
La primera subunidad que se descubrió fue la presenilina (Proc Natl
Acad Sci USA 94, 8208-13). Otros componentes de la
proteína conocidos del complejo gamasecretasa son
Pen-2, Nicastrin y Aph-1a
(Aph1a).
A pesar de los recientes progresos en los
eventos moleculares subyacentes que delinean la etiología de la
enfermedad de Alzheimer, ninguna terapia que modifique la
enfermedad, ha sido desarrollada hasta el momento. Para ello, la
industria ha luchado para identificar los compuestos líder
apropiados para la inhibición de BACE1. Además, se ha reconocido
que existe un número cada vez mayor de sustratos alternativos de
gama-secretasa, el más notable la proteína Notch.
Por consiguiente, la inhibición de la gama-secretasa
es probablemente la causa de los efectos secundarios basados en el
mecanismo. Los fármacos superiores en la actualidad (por ejemplo
Aricept®/donepezil) intentan lograr una mejora provisional de las
funciones cognitivas, mediante la inhibición de la
acetilcolinesterasa, que resulta en niveles incrementados del
neurotransmisor acetilcolina en el cerebro. Estas terapias no son
apropiadas para las etapas posteriores de la enfermedad, no tratan
la patología de la enfermedad subyacente, y no detienen la
progresión de la enfermedad.
De esta manera, existe una necesidad uninet para
la identificación de objetivos novedosos permitiendo estrategias
moleculares novedosas para el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer. Además, existe una fuerte necesidad de compuestos
terapéuticos novedosos, que modifiquen los procesos moleculares
mencionados anteriormente, mediante el direccionamiento de los
objetivos novedosos citados.
En un primer aspecto, la invención proporciona
el uso de un inhibidor de GPR49 seleccionado del grupo que consiste
de anticuerpos, oligonucleótidos antisentido en ARN y ribozimas para
la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento
de enfermedades neurodegenerativas.
En el contexto de la presente invención, se ha
encontrado sorprendentemente que el GPR49 (también conocido como el
receptor 5 (LGR5) proteína G-acoplado
repetido-que contiene leucinerich; FEX HG38, GPR67)
forma parte de diferentes complejos de proteínas que se involucran
en el aberrante procedimiento de APP en la enfermedad de Alzheimer
por gama-secretasa. Especialmente, se ha encontrado
que GPR49 es parte del complejo-Aphla, del
complejo-Fe65L2, del
complejo-APP-C99, y del
complejo-BACE1. Estos complejos se les pusieron el
nombre de sus respectivos compuestos de proteínas claves, que se
han utilizado como el punto de entrada de la tecnología TAP (ver
más adelante).
La identificación de GPR49 como una molécula
clave en estos complejos permite el uso de moléculas que interactúan
con GPR49 para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Esto especialmente se muestra en los ejemplos dónde se demuestra
que el ARNsi dirigido contra GPR49 resulta en la atenuación de la
generación y/o secreción de Abeta-42.
En el contexto de la presente invención, una
"molécula que interactúa con GPR49" es una molécula, que une
al menos temporalmente un GPR49 y que preferiblemente modula y
particularmente inhibe la actividad de GPR49.
GPR49 es un miembro putativo de la superfamilia
del receptor de la hormona de la glicoproteína - receptores
acoplados a la proteína G (GPCRs) inusuales, que se caracterizan por
un gran ectodominio N-terminal que contiene
repeticiones ricas en leucina que en algunos casos, se ha demostrado
que es importante para interactuar con los ligandos de la
glicoproteína. El análisis filogenético de los miembros de la
superfamilia sugiere que, se divide en tres
sub-familias - la primera destacada por los
receptores para LH, FSH (hormona que estimula el folículo) y TSH
(hormona que estimula la tiroides); la segunda que contiene los
receptores de relaxina LGR7 y LGR8. GPR49/LGR5 junto con LGR4 y
LGR6 (Fig. 4) constituye una sub-familia de
receptores huérfanos que muestran únicamente \sim35% de identidad
de la secuencia con el receptor FSH (Hsu SY, Liang SG, Hsueh AJ
(1998) Characterization of two LGR genes homologous to gonadotropin
and thyrotropin receptors with extracellular
leucine-rich repeats and a G
protein-coupled, seven-transmembrane
region. Mol Endocrinol. 12(12):1830-45;
McDonald T, Wang R, Bailey W, Xie G, Chen F, Caskey CT, Liu Q (1998)
Identification and cloning of an orphan G
protein-coupled receptor of the glycoprotein hormone
receptor subfamily. Biochem Biophys Res Commun.
247(2):
266-70).
266-70).
GPR49 se expresa prominentemente en el músculo
esquelético, placenta y médula espinal y a niveles inferiores en
colon, suprarenal y varias subregiones del cerebro (Hsu SY, et
al. (1998), supra). En las transcripciones de cerebro de
ratón adulto GPR49 principalmente se restringen al bulbo olfativo,
dónde se encuentran en las capas de células nerviosas (Hermey G,
Methner A, Schaller HC, Hermans-Borgmeyer I (1999)
Identification of a novel seven-transmembrane
receptor with homology to glycoprotein receptors and its expression
in the adult and developing mouse. Biochem Biophys Res Commun.
254(1):273-9). La función de GPR49 en el
adulto no es bien caracterizada. Targeted deletion of the GPR49
gene in mice results in neonatal lethality and is associated with
ankyloglossia and gastrointestinal distension (Morita H, Mazerbourg
S, Bouley DM, Luo CW, Kawamura K, Kuwabara Y, Baribault H, Tian H,
Hsueh AJ (2004) Neonatal lethality of LGR5 null mice is associated
with ankyloglossia and gastrointestinal distension. Mol Cell Biol.
24(22):9736-43).
GPR49 ha sido recientemente identificado como un
gen sobre-expresado en carcinomas hepatocelulares
humanos con betacatenina mutaciones (Yamamoto Y, Sakamoto M, Fujii
G, Tsuiji H, Kenetaka K, Asaka M, Hirohashi S (2003) Overexpression
of orphan G-protein-coupled
receptor, Gpr49, in human hepatocellular carcinomas with
beta-catenin mutations. Hepatology.
37(3):528-33).
De acuerdo con la presente invención, la
expresión "GPR49" no significa únicamente la proteína como se
muestra en la Fig. 3, pero también un derivado funcionalmente
activo de éstos, o un fragmento funcionalmente activo de éstos, o
un homólogo de éstos, o una variante codificada por un ácido
nucleico que hibridiza al ácido nucleico que codifica dicha
proteína bajo condiciones de severidad baja. Preferiblemente, estas
condiciones de severidad baja incluyen hibridación en una solución
reguladora que comprende 35% de formamida, 5X SSC,
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, 0,02% PVP,
0,02% de BSA, 100 ug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado,
y 10% de (peso/vol) dextran sulfato por 18-20 horas
a 40ºC, lavando en una solución reguladora que consiste de 2X SSC,
Tris- HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, y 0,1% de SDS por
1-5 horas a 55ºC, y lavando en una solución
reguladora que consiste de 2X SSC, Tris-HCl 25 mM
(pH 7,4) EDTA 5 mM, y 0,1% de SDS por 1,5 horas a
60ºC.
60ºC.
Lo mismo aplica también a todas las otras
citadas en la presente invención. Por consiguiente, un nombre de
cada proteína o ácido nucleico, no se refiere únicamente a la
proteína o ácido nucleico como se describe en la lista de la
secuencia, pero también con su derivado funcionalmente activo, o con
un fragmento funcionalmente activo de éstos, o un homólogo de
éstos, o una variante codificada por un ácido nucleico que hibridiza
al ácido nucleico que codifica dicha proteína bajo condiciones de
severidad baja, preferiblemente bajo las condiciones como se
mencionan anteriormente.
El término "funcionalmente activo" como se
utiliza aquí se refiere a un polipéptido, a saber un fragmento o
derivado, que tiene funciones estructurales, reguladoras, o
bioquímicas de la proteína, de acuerdo con la modalidad de la cual
este polipéptido, a saber fragmento o derivado, está
relacionado.
De acuerdo con la presente invención, el término
"actividad" como se utiliza aquí, se refiere a la función de
una molécula en su más amplio sentido. Ésta generalmente incluye,
pero no se limita a, funciones biológicas, bioquímicas, físicas o
químicas de la molécula. Ésta incluye por ejemplo, la actividad
enzimática, la capacidad para interactuar con otras moléculas y la
capacidad para activar, facilitar, estabilizar, inhibir, suprimir o
desestabilizar la función de otras moléculas, estabilidad, capacidad
para localizar a ciertos emplazamientos subcelulares. Cuando es
aplicable, dicho término también se relaciona con la función de un
complejo de proteínas en su más amplio sentido.
De acuerdo con la presente invención, los
términos "derivados" o "análogos de componentes de
proteínas" o "variantes" como se utiliza aquí
preferiblemente incluyen, pero no se limitan, a las moléculas que
comprenden las regiones, que son sustancialmente homólogos a los
componentes de proteínas, en varias modalidades, por al menos 30%,
40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de identidad sobre una
secuencia de aminoácido de idéntico tamaño o cuando se compara con
una secuencia alineada en la cual la alineación se hace mediante un
programa de homología con ordenador conocido en el oficio, o cuyo
ácido nucleico que codifica es capaz de hibridizar a una secuencia
que codifica el componente de proteína bajo condiciones rigurosas,
moderadamente rigurosas, o no rigurosas. Esto significa una
proteína que es el resultado de una modificación de la proteína que
ocurre naturalmente, por sustituciones, deleciones y adiciones de
aminoácido, respectivamente, los derivados que aún exhiben la
función biológica de la proteína que ocurre naturalmente aunque no
necesariamente al mismo grado. La función biológica de dichas
proteínas puede por ejemplo ser examinada por apropiados ensayos
in vitro disponibles, según lo suministrado en la
invención.
El término "fragmento" como se utiliza aquí
se refiere a un polipéptido de al menos 10, 20, 30, 40 o 50
aminoácidos de la componente de la proteína de acuerdo con la
modalidad. En modalidades específicas, tales fragmentos no son más
grandes de 35, 100 o 200 aminoácidos.
El término "gen" como se utiliza aquí se
refiere a un ácido nucleico que comprende un marco de lectura
abierta que codifica un polipéptido de, si no se indica de otra
manera, la presente invención, incluyendo ambas secuencias de exón
y opcionalmente intrón.
Los términos " homólogo" o "productos
génicos homólogos" como se utiliza aquí significan una proteína
en otra especie, preferiblemente mamíferos, que realiza la misma
función biológica como un componente de la proteína del complejo
descrito adicionalmente aquí. Dichos homólogos también se llaman
"productos génicos ortólogos". El algoritmo para la detección
de los pares del gen ortólogo a partir de humanos y mamíferos u
otras especies, utiliza el genoma completo de estos organismos.
Primero, los mejores aciertos por comparaciones en pares se
recuperan, utilizando una alineación Smith-Waterman
completa de las proteínas predichas. Para mejorar además la
confiabilidad, estos pares se aglomeran con mejores aciertos por
comparaciones en pares, involucrando proteínas Drosophila
melanogaster y C. elegans. Tales análisis se dan, por
ejemplo, en Nature, 2001, 409:860-921. Los
homólogos de las proteínas de acuerdo con la invención se pueden
aislar basándose en la homología de la secuencia de los genes que
codifican la proteínas proporcionadas en este punto con los genes de
otras especies, clonando el gen respectivo aplicando tecnología
convencional y expresando la proteína de dicho gen, o mediante el
aislamiento de las proteínas de la otra especie, mediante el
aislamiento del complejo análogo de acuerdo con los métodos
proporcionados en este punto o con otros métodos apropiados,
normalmente conocidos en el oficio.
De acuerdo con la presente invención el término
"inhibidor de GPR49" se refiere a una molécula que interactúa
con GPR 49, que es un compuesto bioquímico o químico que inhibe o
reduce la actividad de GPR49. Esto puede por ejemplo ocurrir vía
supresión de la expresión del gen correspondiente. La expresión del
gen se puede medir por análisis RT-PCR o Western
blot. Adicionalmente, esto puede ocurrir vía la inhibición de la
actividad, por ejemplo, mediante el enlace a GPR49.
Ejemplos de tales inhibidores de GPR49 se unen a
las proteínas o a los péptidos dirigidos contra GPR49, en
particular contra el sitio activo de GPR49, y los ácidos nucleicos
dirigidos contra el gen GPR49.
El término "ácidos nucleicos contra GPR49"
se refiere a un ADN o ARN bicatenario o monocatenario, o una
modificación o derivado de éstos que, por ejemplo, inhibe la
expresión del gen GPR49 o la actividad de GPR49 e incluye, sin
limitación, los ácidos nucleicos antisentido, aptámeros, siARNs
(ARNs interferentes pequeños) y ribozimas.
El inhibidor puede ser seleccionado del grupo
que consiste de anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, ARNsi,
moléculas de peso molecular bajo (LMWs), péptidos de enlace,
aptámeros, ribozimas y peptidomiméticos.
Estos ácidos nucleicos se pueden administrar
directamente a una célula, o los cuales se pueden producir
intracelularmente, mediante la transcripción de secuencias
introducidas, exógenas.
Un ácido nucleico "antisentido" como se
utiliza aquí, se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridizar a
una porción específica de la secuencia de un ARN del componente de
la proteína (preferiblemente mARN) en virtud de alguna
complementariedad de la secuencia. El ácido nucleico antisentido
puede ser complementario a una región codificante y/o
no-codificante de un mARN del componente de la
proteína. Tales ácidos nucleicos antisentido que inhiben la
formación o actividad del complejo, tienen utilidad como
terapéuticos, y se pueden utilizar en el tratamiento o prevención
de desórdenes, como se describe en este punto.
Los ácidos nucleicos antisentido son de al menos
seis nucleótidos y son preferiblemente oligonucleótidos, oscilando
entre 6 a aproximadamente 200 nucleótidos. En aspectos específicos,
el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos, al menos 15
nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, o al menos 200
nucleótidos.
Los ácidos nucleicos, por ejemplo los ácidos
nucleicos antisentido o siARNs, se pueden sintetizar químicamente,
por ejemplo de acuerdo con el método fosfotriéster (ver, por
ejemplo, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90,
543-584). Los aptámeros son ácidos nucleicos que se
unen con alta afinidad a un polipéptido, aquí GPR49. Los aptámeros
se pueden aislar, mediante métodos de selección tales como SELEX
(ver por ejemplo Jayasena (1999) Clin. Chem., 45,
1628-50; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep.,
20, 97-107; US 5,582,981) a partir de una gran
mezcla de diferentes moléculas de ARN monocatenarias. Los aptámeros
también se pueden sintetizar y seleccionar en su forma
contra-imagen, por ejemplo como el
L-ribonucleótido (Nolte et al. (1996) Nat.
Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al.
(1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Las formas que
han sido aisladas de esta manera cuentan con la ventaja de que no
se degradan por ribonucleasas de origen natural y, por
consiguiente, poseen una mayor estabilidad.
Los ácidos nucleicos se pueden degradar por
endonucleasas o exonucleasas, en particular por DNases y RNases que
se pueden encontrar en la célula. Esto es, por consiguiente,
ventajoso para modificar los ácidos nucleicos con el fin de
estabilizarlos contra la degradación, por consiguiente garantizando
que una alta concentración del ácido nucleico se mantiene en la
célula durante un largo periodo de tiempo (Beigelman et al.
(1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; WO 95/11910;
WO 98/37240; WO 97/29116). Usualmente, tal estabilización se puede
obtener introduciendo uno o más grupos de fósforo internucleótido o
introduciendo uno o más internucleótidos
no-fosforosos.
Internucleótidos modificados apropiados se
recopilan en Uhlmann y Peyman (1990), supra (ver también
Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res.
23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116).
Los radicales fosfato internucleótido modificados y/o puentes
no-fosforosos en un ácido nucleico, que se puede
emplear en uno de los usos de acuerdo con la invención contienen,
por ejemplo, metil fosfonato, fosforotioato, fosforamidato,
fosforoditioato y/o ésteres fosfato, mientras que los análogos
internucleótido no-fosforosos contienen, por
ejemplo, puentes siloxano, puentes carbonato, ésteres carboximetilo,
puentes acetamidato y/o puentes tioéter. También es la intención,
que esta modificación debería mejorar la durabilidad de una
composición farmacéutica que se puede emplear en uno de los usos de
acuerdo con la invención. En general, el oligonucleótido se puede
modificar en la fracción base, fracción azúcar, o esqueleto
fosfato.
El oligonucleótido puede incluir otros grupos
anexos tales como péptidos, agentes que facilitan el transporte a
través de la membrana celular (ver, por ejemplo, Letsinger et
al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; International
Patent Publication No. WO 88/09810) o barrera hematoencefálica
(ver, por ejemplo, International Patent Publication No. WO
89/10134), agentes de división desencadenantes de la hibridización
(ver, por ejemplo, Krol et al., 1988, BioTechniques
6:958-976), o agentes que intercalan (ver, por
ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549).
En detalle, los oligonucleótidos antisentido
pueden comprender al menos una fracción base modificada, que se
selecciona del grupo incluyendo pero no limitando a
5-fluorouracil, 5-bromouracil,
5-clorouracil, 5-yodouracil,
hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina,
5-(carboxihidroxilmetil)uracil,
5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina,
5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracil,
D-galactosilqueosina, inosina,
N6-isopenteniladenina,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina, N6-adenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracil,
5-metoxiaminometil-2-tiouracil,
D-manosilqueosina,
5N-metoxicarboximetiluracil,
5-metoxiuracil,
2-metil-tio-N6-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
wybutoxosina, pseudouracil, queosina,
2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracil,
2-tiouracil, 4-tiouracil,
5-metiluracil, ácido
uracil-5-oxiacético metiléster,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
5-metil-2-tiouracil,
3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)
uracil, (acp3)w, y 2,6-diamino-
purina.
purina.
En otra modalidad, el oligonucleótido comprende
al menos una fracción azúcar modificada seleccionada del grupo
incluyendo, pero no limitando a, arabinosa,
2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa.
El uso de ácidos nucleicos antisentido
apropiados se describe además por ejemplo en Zheng and Kemeny (1995)
Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2; Nellen and
Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci., 18,
419-23, Stein (1992) Leukemia, 6,
697-74 o Yacyshyn, B. R. et al. (1998)
Gastroenterology, 114, 1142).
En aun otra modalidad, el oligonucleótido es un
oligonucleótido 2-a-anomérico. Un
oligonucleótido a-anomérico
(2-a-anomérico o
a-anomérico) forma híbridos bicatenarios específicos
con ARN complementario en el cual, contrario a las
unidades-B usuales, las cadenas corren paralelas a
cada una (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res.
15:6625-6641).
El oligonucleótido se puede conjugar con otra
molécula, por ejemplo, un péptido, agente de entrecruzamiento
desencadenante de la hibridización, agente de transporte, agente de
división desencadenante de la hibridización, etc.
Durante toda la invención, los oligonucleótidos
de la invención se pueden sintetizar por métodos estándar conocidos
en el oficio, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN
automatizado (como los disponibles comercialmente de Biosearch,
Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, se pueden sintetizar
oligo-nucleótidos fosforotioato, mediante el método
de Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209),
oligonucleotidos metilfosfonato se puede preparar, mediante el uso
de soportes de polímero de vidrio de poro controlado (Sarin et
al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:7448-7451), etc.
En una modalidad específica, los
oligonucleótidos antisentido comprenden ARNs catalíticos, o
ribozimas (ver, por ejemplo, International Patent Publication No.
WO 90/11364; Sarver et al., 1990, Science
247:1222-1225). En otra modalidad, el
oligonucleótido es un
2'-0-metilribonucleotido (Inoue
et al., 1987, Nucl. Acids Res.
15:6131-6148), o un ARN
quimérico-análogo de ADN (Inoue et al., 1987,
FEBS Lett. 215:327-330).
En una modalidad alternativa, los ácidos
nucleicos antisentido de la invención se produjeron
intracelularmente, por transcripción de una secuencia exógena. Por
ejemplo, un vector se puede introducir in vivo, tal que éste
se ocupe por una célula, en la célula que el vector o una porción de
ésta se transcribe, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN)
de la invención. Tal vector debería contener una secuencia que
codifica el componente de la proteína. Tal vector puede quedarse
episomal o convertirse en un integrado por medio de cromosomas,
siempre y cuando, éste se pueda transcribir para producir el ARN
antisentido deseado. Tales vectores se pueden construir por métodos
estándar en el oficio de tecnología de ADN recombinante. Los
vectores pueden ser plásmidos, virales, u otros conocidos en el
oficio, que sean capaces de replicar y expresar en células de
mamífero. La expresión de las secuencias que codifican los ARNs
antisentido puede ser por cualquier promotor conocido en el oficio,
para actuar en células de mamífero, preferiblemente humanas. Tales
promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores
incluyen, pero no se limitan a, la región promotor primaria SV40
(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310),
el promotor contenido en la repetición del terminal largo de 3' del
virus Rous sarcoma (Yamamoto et al., 1980, Cell
22:787-797), el promotor herpes timidina quinasa
(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen
metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature
296:39-42), etc.
Los ácidos nucleicos antisentido de la invención
comprenden una secuencia complementaria a al menos una porción de
una transcripción de ARN de un gen del componente de la proteína,
preferiblemente un gen humano. Sin embargo, la complementariedad
absoluta, aunque se prefiere, no se necesita. Una secuencia
"complementaria a al menos una porción de un ARN", como se
refiere en este punto, significa una secuencia que tiene suficiente
complementariedad, para ser capaz de hibridizar con el ARN,
formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos
antisentido bicatenarios, un monocatenario del ADN dúplex se puede
probar de esta manera, o se puede analizar la formación triple. La
capacidad para hibridizar dependerá de tanto el grado de
complementariedad como la longitud del ácido nucleico antisentido.
Generalmente, el largo del ácido nucleico hibridizado, el
apareamiento erróneo más base con un ARN del componente de la
proteína, puede contener y aún formar un dúplex estable (o triple,
según sea el caso). Alguien de habilidad en el oficio puede
determinar un grado de apareamiento erróneo tolerable, mediante el
uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión
del complejo hibridizado.
La producción y uso de siARNs como herramientas
para la interferencia de ARN en el proceso para inhibir la
expresión o para intercambiar la expresión génica, aquí expresión
génica GPR49, por ejemplo se describe en Elbashir, S. M. et
al. (2001) Genes Dev., 15, 188 o Elbashir, S. M. et al.
(2001) Nature, 411, 494. Preferiblemente, siARNs exhibe una
longitud de menos de 30 nucleótidos, en donde la flexibilidad de la
identidad de la cadena cordada sentido del ARNsi tiene
preferiblemente al menos 19 nucleótidos.
Las ribozimas también son herramientas
apropiadas para inhibir la traducción de ácidos nucleicos, aquí el
gen GPR49, puesto que son capaces de unir específicamente y cortar
el mARNs. Se describen por ejemplo en Amarzguioui et al.
(1998) Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175-202; Vaish
et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26,
5237-42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15,
921-2 o Couture and Stinchcomb (1996) Trends Genet.,
12, 510-5.
Las composiciones farmacéuticas de la invención,
que comprenden una cantidad efectiva de un ácido nucleico en un
portador farmacéuticamente aceptable, se pueden administrar a un
paciente que tiene una enfermedad o desorden, que es de un tipo que
expresa o sobreexpresa un complejo de proteínas de la presente
invención.
La cantidad de ácido nucleico, que será efectiva
en el tratamiento de un desorden o condición particular dependerá
de la naturaleza del desorden o condición, y se puede determinar por
técnicas clínicas estándar. Cuando sea posible, es deseable
determinar la citotoxicidad del ácido nucleico in vitro, y
luego en sistemas de modelo de animal útiles, previo a la prueba y
uso en humanos.
En una modalidad específica, las composiciones
farmacéuticas que comprenden los ácidos nucleicos se administran
vía liposomas, micropartículas, o microcápsulas. En varias
modalidades de la invención, puede ser útil utilizar tales
composiciones, para lograr la liberación controlada de los ácidos
nucleicos. En una modalidad específica, puede ser deseable utilizar
liposomas dirigidos vía anticuerpos a tipos de células del sistema
nervioso central identificables específicos (Leonetti et
al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
87:2448-2451; Renneisen et al., 1990, J.
Biol. Chem. 265:16337-16342).
Las así llamadas "moléculas de bajo peso
molecular" (en lo sucesivo llamadas "LMWs") son moléculas
que no son proteínas, péptidos, anticuerpos o ácidos nucleicos, y
que muestran un peso molecular inferior a 5000 Da, preferiblemente
menor de 2000 Da, más preferiblemente menor de 1000 Da, más
preferiblemente menor de 500 Da. Tales LMWs se pueden identificar
en procedimientos de rendimiento alto, iniciando de bibliotecas.
Tales métodos se conocen en el oficio y se discuten en detalle a
continuación.
El término "proteína de enlace" o
"péptido de enlace" se refiere a una clase de proteínas o
péptidos que se unen e inhiben el GPR49, e incluye, sin limitación,
anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos de anticuerpos
y adaptadores de proteínas dirigidos contra GPR49.
De acuerdo con la presente invención, el término
anticuerpo o fragmento de anticuerpo también se entiende que
significa los anticuerpos o partes de enlace antígeno de éstos, que
han sido preparados recombinantemente y, cuando sea apropiado,
modificado, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos
humanizados, anticuerpos multifuncionales, anticuerpos
biespecíficos u oligoespecíficos, anticuerpos monocatenarios y
fragmentos F(ab) o F(ab)2 (ver, por ejemplo,
EP-B1-0 368 684, US 4.816.567, US
4.816.397, WO 88/01649, WO 93/06213 o WO 98/24884), preferiblemente
produjeron con la ayuda de una biblioteca de expresión FAB.
Como una alternativa a los anticuerpos clásicos,
también es posible, por ejemplo, utilizando adaptadores de
proteínas contra GPR49, por ejemplo anticalinas que se basan en
lipocalina (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
96, 1898-1903). Los sitios de
enlace-ligandos naturales de las lipocalinas, por
ejemplo el retinol-proteína de enlace o el
bilin-proteína de enlace, se pueden alterar, por
ejemplo por medio de una metodología "diseño de proteína
combinatorias", de tal manera, que se unen a los haptenos
seleccionados, aquí para GPR49 (Skerra, 2000, Biochim. Biophys.
Acta, 1482, 337-50). Otros conocidos adaptadores de
proteínas se conocen como alternativas a los anticuerpos para el
reconocimiento molecular (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13,
167-187).
El procedimiento para preparar un anticuerpo o
fragmento de anticuerpo se lleva a cabo de acuerdo con métodos que
son bien conocidos por aquellos de habilidad, por ejemplo por
inmunización de un mamífero, por ejemplo un conejo, con GPR49,
cuando sea apropiado en la presencia de, por ejemplo, geles de
adyuvante de Freund y/o hidróxido de aluminio (ver, por ejemplo,
Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal de
Medicine: 1344-1349). Los anticuerpos policlonales
que se forman en el animal como resultado de una reacción
inmunológica, posteriormente pueden ser aislados a partir de la
sangre utilizando métodos bien conocidos y, por ejemplo,
purificarse por medio de cromatografía de columna. Los anticuerpos
monoclonales pueden, por ejemplo, ser preparados de acuerdo con el
método conocido de Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein,
C. (1991) Nature, 349, 293-299).
En detalle, los anticuerpos policlonales se
pueden preparar como se describe arriba por inmunización de un tipo
apropiado con un polipéptido como un inmunógeno. Las composiciones
de anticuerpos policlonales preferidos, son aquellas que han sido
seleccionadas para anticuerpos dirigidos contra un polipéptido o
polipéptidos de la invención. Las preparaciones de anticuerpos
policlonales, preferidas particularmente, son aquellas que
contienen únicamente anticuerpos dirigidos contra un polipéptido o
polipéptidos dados. Las composiciones de inmunógenos preferidas
particularmente son aquellas que no contienen otras proteínas
humanas tales como, por ejemplo, composiciones de inmunógenos,
fabricadas utilizando una célula huésped no-humana
para la expresión recombinante de un polipéptido de la invención.
De tal manera, los únicos epitope o epitopes humanos reconocidos
por las composiciones de anticuerpos resultantes, construidos contra
este inmunógeno estarán presentes como parte de un polipéptido o
polipéptidos de la invención.
El título del anticuerpo en el sujeto inmunizado
se puede monitorear a través del tiempo por técnicas estándar,
tales como con un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas
(ELISA) utilizando un polipéptido inmovilizado. Si se desea, las
moléculas anticuerpo se pueden aislar a partir del mamífero (por
ejemplo, a partir de la sangre) y además purificarse por técnicas
bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A para obtener
la fracción IgG. Como alternativa, los anticuerpos específicos para
una proteína o polipéptido de la invención se pueden seleccionar
por (por ejemplo, purificarse parcialmente) o purificarse por, por
ejemplo, cromatografía de afinidad. Por ejemplo, un proteína de la
invención expresada recombinantemente y purificada (o purificada
parcialmente) se produjo como se describe en este punto, y acoplada
covalente o no-covalentemente con un soporte sólido
tal como, por ejemplo, una columna de cromatografía. La columna
luego se puede utilizar para purificar por afinidad de los
anticuerpos específicos a las proteínas de la invención a partir de
una muestra que contiene anticuerpos dirigidos contra un gran
número de diferentes epitopes, generando por consiguiente una
composición de anticuerpo purificado sustancialmente, i.e., aquella
que es sustancialmente libre de anticuerpos contaminantes. Por una
composición de anticuerpos purificada sustancialmente se entiende,
en este contexto, que la muestra de anticuerpos contiene a lo sumo
solo 30% (en peso seco) de anticuerpos contaminantes dirigidos
contra los epitopes diferentes de aquellos en la proteína o
polipéptido de la invención deseados, y preferiblemente a lo sumo
20%, aún más preferiblemente a lo sumo 10%, y más preferiblemente a
lo sumo 5% (en peso seco) de la muestra es anticuerpos
contaminantes. Una composición de anticuerpo purificado significa
que al menos el 99% de los anticuerpos en la composición se dirigen
contra la proteína o polipéptido de la invención deseados.
En el momento apropiado después de la
inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpos
específicos son más altos, las células que producen anticuerpos se
pueden obtener a partir del sujeto y se utiliza para preparar
anticuerpos monoclonales por técnicas estándar, tales como la
técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler and
Milstein, 1975, Nature 256:495-497, the human B cell
hybridoma technique (Kozbor et al., 1983, Immunol. Today
4:72), the EBV-hybridoma technique (Cole et
al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.
Liss, Inc., pp. 77-96) o técnicas trioma. La
tecnología para producir los hibridomas es bien conocida (ver
generalmente Current Protocols in Immunology 1994, Coligan et
al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Las
células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la
invención se detectaron por selección del cultivo de hibridoma de
sobrenadantes para los anticuerpos que se unen al polipéptido de
interés, por ejemplo, utilizando un ensayo ELISA estándar.
Una alternativa para preparar hibridomas que
secretan anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoclonal dirigido
contra un polipéptido de la invención se puede identificar y aislar
por selección de un biblioteca de inmunoglubulina combinatoria
recombinante (por ejemplo, una biblioteca de expresión en fago de
anticuerpo) con el polipéptido de interés. Los kits para generar y
seleccionar bibliotecas de expresión en fagos son disponibles
comercialmente (por ejemplo, the Pharmacia Recombinant Phage
Antibody System, Catalog No.
27-9400-01; and the Stratagene
SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612). Adicionalmente, los
ejemplos de métodos y reactivos particularmente sensibles para
utilizar en la generación y selección de la biblioteca de expresión
de anticuerpos se puede encontrar, por ejemplo, Patente U.S. No.
5.223.409; Publicación PCT No. WO 92/18619; Publicación PCT No. WO
91/17271; Publicación PCT No. WO 92/20791; Publicación PCT No. WO
92/15679; Publicación PCT No. WO 93/01288; Publicación PCT No. WO
92/01047; Publicación PCT No. WO 92/09690; Publicación PCT No. WO
90/02809; Fuchs et al., 1991, Bio/Technology
9:1370-1372; Hay et al., 1992, Hum. Antibod.
Hybridomas 3:81-85; Huse et al., 1989,
Science 246: 1275-1281; Griffiths et al.,
1993, EMBO J. 12:725-734.
Adicionalmente, los anticuerpos recombinantes,
tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que
comprenden ambas porciones humana y no-humana, que
se pueden hacer utilizando técnicas de ADN recombinante estándar,
están dentro del alcance de la invención. Un anticuerpo quimérico es
una molécula en la cual diferentes porciones se derivan de
diferentes especies de animales, tales como aquellos que tienen una
región variable derivada de una murina mAb y una región constante
de inmunoglobulina humana. (Ver, por ejemplo, Cabilly et
al., Patente U.S. No. 4.816.567; y Boss et al., Patente
U.S. No. 4.816.397, que se incorporan en su totalidad, como
referencia en este punto). Los anticuerpos humanizados son moléculas
anticuerpo a partir de especies no-humanas que
tienen una o más regiones de determinación complementarias (CDRs) de
las especies no-humanas y una región de armadura a
partir de una molécula de inmunoglobulina humana. (Ver, por ejemplo,
Queen, Patente U.S. No. 5.585.089, que se incorpora en su
totalidad, como referencia en este punto). Tales anticuerpos
monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir por
técnicas de ADN recombinante conocidas en el oficio, por ejemplo
utilizando los métodos descritos en la Publicación PCT No. WO
87/02671; Aplicación de la Patente Europea 184.187; Aplicación de
la Patente Europea 171.496; Aplicación de la Patente Europea
173.494; Publicación PCT No. WO 86/01533; Patente U.S. No.
4.816.567; Aplicación de la Patente Europea 125.023; Better et
al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et
al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol.
139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al.,
1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al.,
1985, Nature 314: 446-449; y Shaw et al.,
1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison,
1985, Science 229:1202-1207; Oi et al.,
1986, Bio/Techniques 4:214; Patente U.S. 5.225.539; Jones et
al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et
al., 1988, Science 239:1534; y Beidler et al., 1988, J.
Immunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos, son
particularmente deseables, para el tratamiento terapéutico de
pacientes humanos. Tales anticuerpos se pueden producir, por
ejemplo, utilizando ratones transgénicos, los cuales son incapaces
de expresar genes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina
endógena, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y ligera
humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de la manera normal
con un antígeno seleccionado, por ejemplo, toda o una porción de un
polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos
contra el antígeno se puede obtener utilizando tecnología
convencional de hibridoma. Los transgenes de inmunoglobulina
humanos albergados por los ratones transgénicos se ordenan de otro
modo, durante la diferenciación de célula B, y posteriormente
experimentan una clase de mutación somática y de intercambio. De
esta manera, utilizando dicha técnica, es posible producir
anticuerpos IgG, IgA y IgE terapéuticamente útiles. Para una visión
general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver
Lonberg y Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol.
13:65-93). Para una discusión detallada de esta
tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos humanos
monoclonales y los protocolos para producir dichos anticuerpos, ver,
por ejemplo, Patente U.S. 5.625.126; Patente U.S. 5.633.425;
Patente U.S. 5.569.825; Patente U.S. 5.661.016; y Patente U.S.
5.545.806. Además, las compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont,
CA), se pueden involucrar para proporcionar los anticuerpos humanos
dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando tecnología
similar a aquella descrita anteriormente.
Los anticuerpos completamente humanos, que
reconocen un epitope seleccionado se pueden generar utilizando una
técnica referida como a una "selección guiada". En esta
metodología un anticuerpo monoclonal no-humano
seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo murina, se utiliza para
encaminar la selección de un anticuerpo completamente humano que
reconoce el mismo epitope. (Jespers et al., 1994,
Bio/tecnología 12:899-903).
Los fragmentos de anticuerpos que contienen los
idiotipos del complejo se pueden generar por técnicas conocidas en
el oficio. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, pero no se
limitan a, el fragmento F(ab')2 que se puede producir por
digestión con pepsina de la molécula del anticuerpo; el fragmento
Fab', que se puede generar por reducción de los puentes bisulfuro
del fragmento F(ab')2; el fragmento Fab, que se puede generar
mediante el tratamiento del anticuerpo molecular con papaina y un
agente reductor; y los fragmentos Fv.
En la producción de anticuerpos, la selección
para el deseado anticuerpo se puede lograr, mediante técnicas
conocidas en el oficio, por ejemplo, ELISA (ensayo de
inmunoabsorción con enzima ligada). Para seleccionar anticuerpos
específicos a un dominio particular del complejo, o un derivado de
éste, se pueden ensayar hibridomas generados por un producto que
une al fragmento del complejo, o a un derivado de éste, que contiene
dicho dominio. Para la selección de un anticuerpo, que
específicamente se une a un complejo de la presente, o a un
derivado, u homólogo de éstos, pero que no se une específicamente a
las proteínas individuales del complejo, o a un derivado, u
homólogo de estos, se puede seleccionar, en base al enlace positivo
con el complejo y una carencia de enlace con los componentes
individuales de la proteína.
Los anticuerpos precedentes se pueden utilizar
en métodos conocidos en el oficio relacionados con la localización
y/o cuantificación de la proteína o proteínas dadas, por ejemplo,
por representación de estas proteínas, midiendo los niveles de
éstos en muestras fisiológicas apropiadas (por inmunoensayo), en
métodos de diagnóstico, etc. esto también es válido para un
derivado, u homólogo del mismo complejo.
En una modalidad preferida, el inhibidor de
GPR49 es un ARNsi con la secuencia:
AACAGCAGTATGGACGACCTT
GPR49 muestra similaridad a los receptores de LH
(hormona luteinizante), relaxina, IGF, FSH (hormona estimulante del
folículo), y TSH. Por consiguiente, LH, relaxina, IGF, FSH, y TSH
podrían ser ligandos fisiológicos de GPR49. Adicionalmente, las
tieno[2,3-d]pirimidinas identificadas
como agonistas de LH y del receptor FSH en WO-03
020 726
y WO-00 187
287
pueden ser agonistas del
GPR49.
Según lo planteado arriba, GPR49 es parte de los
complejos de proteínas que se involucran en la regulación de la
actividad de la gama secretasa y/o la
beta-secretasa. Por consiguiente, en una modalidad
preferida, la molécula que interactúa con GPR49 o el inhibidor
actúa en una molécula de GPR49, la cual es parte de un complejo de
proteínas, preferiblemente del complejo-Aphla, del
complejo Fe65L2-, del
complejo-APP-C99, o del
complejo-BACE1.
Dichos complejos de proteínas han sido
identificados como ensambles de proteínas que interactúan con la
subunidad gama-secretasa Aph1 al sustrato
gama-secretasa APP-C99 (más su
adaptador Fe65L2) y con la proteína
beta-secretasa.
Las presenilinas 1 y 2 (Psen1 y Psen2, conocidas
también como PS1 y PS2 respectivamente) son proteínas de membrana
integral, que se localizan en el retículo endoplásmico, el Golgi y
también en la superficie celular (Kovacs, Nat Med 2. 224).
Predominantemente se encuentran como heterodímeros de los NTF y CTF
fragmentos endoproteolíticos. La proteasa que divide las
presenilinas (la "presenilinasa") no se conoce, es probable que
el proceso sea autocatalítico, también la significancia funcional
de PS (auto)proteolisis es ambigua. Las presenilinas se
involucran en el procedimiento proteolítico de la proteína
precursora Amiloide (APP) (De Strooper et al, Nature 391,
387) y el receptor Notch (De Strooper et al. Nature 398,
518). Además, Las presenilinas se asocian con las proteínas de
adhesión celular alfa y beta-catenina,
N-caderina, y E-caderina
(Georgakopoulos et al, Mol Cell 4, 893) y otros miembros de
la familia armadillo (Yu et al, J Biol Chem 273, 16470). El
procedimiento APP para las presenilinas es a través de sus efectos
en la gama-secretasa que divide la APP, generando el
C-terminal del péptido A-beta. PS1
asociado con los fragmentos C-terminal C83 y C99
procesados de APP (Xia et al, Proc Natl Acad Sci USA, 94,
8208), Nicastrin (Yu et al, Nature 407, 48) y
Pen-2 (Francis et al, Dev Cell 3, 85).
Las proteínas Aph-1 tal como
Aph-1a se necesitan en el procedimiento de la
Presenilina (Francis et al, Dev Cell 3, 85). Esto es claro
si las Presenilinas regulan la actividad de la
gama-secretasa directamente o si son las propias
enzimas proteasas (Kopan y Gouate, Genes Dev 14, 2799). La actividad
de la gama secretasa podría comprender un complejo multimérico de
estas proteínas (Yu et al, Nature 407, 48) pero no se conoce,
como la relación entre estas proteínas afecta la actividad de la
secretasa.
Aph-1 y Pen-2 se
clonaron recientemente en un tamiz para los potenciadores de la
presenilina ("pen") en C. elegans y se muestra para
interactuar genéticamente con Aph-2 (Nicastrin). Los
defectos en Aph-1 afectan la señalización de Notch
y la localización de Nicastrin. Aph-1 y
Pen-2 se necesitan para la división de Notch, la
actividad de la gama-secretasa y la acumulación de
las Presenilinas procesadas. Francis et al. Clonaron los
ortólogos humanos putativos de estos genes, Aph-1a,
Aph-1b y Pen-2, y recientemente Lee
et al. también clonaron los cADNs de Aph-1
humanos. Los componentes exactos del complejo
gama-secretasa no se conocen pero estas dos
proteínas novedosas podrían ser componentes de o factores de
accesorios para el complejo y pueden interactuar junto directamente
con la Presenilina o con un complejo Presenilina/Nicastrina. La
Nicastrina es por consiguiente un miembro del complejo
gama-secretasa activo y existe la evidencia reciente
de que es la forma de la proteína completamente glicosilada, la
cual es importante en este complejo.
Fe65-como 2 (Fe65L2) es un
homólogo de la proteína adaptador Fe65 APP-que
interactúa intracelular bien caracterizada (Duilio A, Faraonio R,
Minopoli G, Zambrano N, Russo T (1998) Fe65L2: un nuevo miembro de
la familia de la proteína Fe65 que interactúa con el dominio
intracelular de la proteína precursora beta-amiloide
del Alzheimer. Biochem J. 330 (Pt 1):513-9.). Ésta
se expresa altamente en el cerebro e interactúa con la APP a través
de su dominio PTB C-terminal (Tanahashi H, Tabira T
(1999) Molecular cloning of human Fe65L2 and its interaction with
the Alzheimer's beta-amyloid precursor protein.
Neurosci Lett. 261 (3):143-6.). Fe65L2 se ha
mostrado para traslocar al núcleo y regular la transcripción (Bruni
P, Minopoli G, Brancaccio T, Napolitano M, Faraonio R, Zambrano N,
Hansen U, Russo T (2002) Fe65, a ligand of the Alzheimer's
beta-amyloid precursor protein, blocks cell cycle
progression by down-regulating thymidylate synthase
expression. J. Biol. Chem. 277(38):
35481-8). Sugiriendo que éste se involucra en las
funciones de señalización secuencia abajo de APP. Overexpression of
Fe65L2 promotes secretion/generation of Abeta in vitro
(Tanahashi H, Tabira T (2002) Characterization of an amyloid
precursor protein-binding protein Fe65L2 and its
novel isoforms lacking phosphotyrosine-interaction
domains. Biochem J. 367(Pt 3):687-95.).
La actividad de la
beta-secretasa (BACE) divide la APP en el
ectodominio, resultando en la presencia de la APPb soluble,
secretada, y en un fragmento transmembrana
C-terminal residuo-99
(APP-C99). Vassar et al. (Science 286,
735-741) clonaron una proteasa aspártica
transmembrana que tuvo las características de la
beta-secretasa de APP postulada, que llamaron
BACE1. El cerebro y cultivos primarios corticales de los ratones
carentes de BACE1 no mostraron actividad
beta-secretasa detectable, y cultivos primarios
corticales a partir de ratones carentes de BACE produjeron mucho
menos beta amiloide de APP. Esto sugiere que el BACE1, en lugar de
su parálogo BACE2, es la principal beta-secretasa
por APP. BACE1 es una proteína de 501 aminoácidos que contiene un
péptido señal de 21-aa seguido por un dominio
proproteína que abarca de 22 a 45 aa. Existen de una manera alterna
formas empalmadas, BACE-I-457 y
BACE-I-476. El lumenal del dominio
de la proteína madura se sigue por un dominio transmembrana
predicho y una cola citosólica pequeña C-terminal de
24 aa. BACE1 se predice que es una proteína transmembrana tipo 1
con el sitio activo en el lado lumenal de la membrana, dónde
beta-secretasa divide la APP y otros posibles
sustratos aún no identificados. Aunque el BACE1 es claramente una
enzima clave requerida para el procedimiento de APP en
A-beta, la evidencia reciente sugiere sustratos
potenciales y funciones de BACE1 adicionales (J. Biol. Chem. 279,
10542-10550). Hasta la fecha, no se han descrito
proteínas que interactúen con BACE1 con funciones reguladoras o
moduladoras.
Como se explica anteriormente, se ha encontrado
sorprendentemente en el contexto de la presente invención que GPR49
es parte del procedimiento proteolítico regulador de los complejos
de proteínas de APP, en particular por la actividad de la
beta-secretasa y/o gama secretasa. Por consiguiente,
en una modalidad preferida, el inhibidor o la molécula de
interacción modula la actividad de la beta-secretasa
y/o la gama secretasa.
Durante toda la invención, el término
"modulación de la actividad de la gama secretasa y/o la beta
secretasa" incluye que la actividad de la enzima se modula
directa o indirectamente. Lo que significa que el modulador GPR49,
puede ya sea unirse también directamente a cualquiera de estas
enzimas o, más preferido, puede ejercer una influencia en GPR49 que
a su vez, por ejemplo mediante interacciones
proteína-proteína o por transducción de señal o vía
metabolitos pequeños, modula la actividad de cualquiera de estas
enzimas.
Durante toda la invención, se prefiere que el
modulador beta secretasa inhiba la actividad de la beta secretasa
tanto completa como parcialmente. Durante toda la invención, la
consecuencia funcional más preferida de un modulador GPR49 es una
reducción en la generación Abeta-42.
En el contexto de la presente invención,
"modulación de la actividad de la gama secretasa y/o la beta
secretasa" significa que la actividad se reduce en que al menos
o ningún producto se forma, más preferiblemente que menos o ninguna
Abeta-42 se forma, (inhibición parcial o completa) o
que la enzima respectiva produce un producto diferente (en el caso
de la gama-secretasa por ejemplo
Abeta-38 u otra especie de péptido Abeta de
secuencia de aminoácido más corta - en lugar de
Abeta-42) o que las cantidades relativas de los
productos son diferentes (en el caso de
gama-secretasa por ejemplo la relación de
Abeta-40 con Abeta-42 se modifica
preferiblemente incrementa). Adicionalmente, se incluye que el
modulador modula tanto la gama secretasa como la
beta-secretasa o la actividad de ambas enzimas.
En consideración con el modulador de la
actividad de la gama secretasa, se prefiere que este modulador
inhiba la actividad de la gama secretasa. Sin embargo, también se
prefiere que la actividad de gama secretasa se cambie, de manera
que la cantidad total de la especie de péptido Abeta no se modifica,
sino que se produce más Abeta-38 en lugar de
Abeta-42.
La actividad de la gama secretasa puede por
ejemplo medirse por el procedimiento para determinar la APP, por
ejemplo mediante la determinación de los niveles de especie de
péptido Abeta producidos, los niveles más importantes de
Abeta-42 (ver Ejemplo-sección,
infra).
Para medir la actividad de BACE1, cambio de la
relación entre los fragmentos alfa- y
beta-C-terminal APP se pueden
analizar por Western Blotting (Blasko et al., J Neural Transm
111, 523); ejemplos adicionales para los ensayos de actividad del
BACE1 incluyen pero no se limitan a: use of a cyclized enzyme donor
peptide containing a BACE1 cleavage site to reconstitute and
measure beta-galactosidase reporter activity (Naqvi
et al., J Biomol Screen. 9, 398); use of quenched
fluorimetric peptide substrates and fluorescence measurements
(Andrau et al., J.Biol Chem 278, 25859); use of
cell-based assays utilizing recombinant chimeric
proteins, in which an enzyme (such as alkaline phosphatase) is
linked via a stretch of amino acids, that contain the BACE1
recognition sequence, to a Golgi-resident protein
(Oh et al., Anal Biochem, 323, 7); fluorescence resonance
energy transfer (FRET)-based assays (Kennedy et
al., Anal Biochen 319, 49); a cellular growth selection system
in yeast (Luthi et al., Biochim Biophys Acta 1620,
167).
167).
Preferiblemente, la enfermedad neurodegenerativa
es la enfermedad de Alzheimer.
De acuerdo con la invención, el inhibidor de
GPR49 se utiliza para preparar una composición farmacéutica.
Por consiguiente, la invención proporciona las
composiciones farmacéuticas, que se pueden administrar a un sujeto
en una cantidad efectiva. En un aspecto preferido, el terapéutico
sustancialmente se purifica. El sujeto preferiblemente es un animal
incluyendo, pero no limitando a, animales tales como vacas, cerdos,
caballos, pollos, gatos, perros, etc., y preferiblemente es un
mamífero, y más preferiblemente humano. En una modalidad
específica, un mamífero no-humano es el sujeto.
Varios sistemas de entrega se conocen y se
pueden utilizar para administrar un terapéutico de la invención,
por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, y
microcápsulas: uso de células recombinantes capaces de expresar el
terapéutico, uso de endocitosis receptor-mediada
(por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem.
262:4429-4432); construcción de un ácido nucleico
terapéutico como parte de un retroviral u otro vector, etc. Los
métodos de introducción incluyen pero no se limitan a rutas
intradérmicas, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa,
subcutánea, intranasal, epidural, y oral. Los compuestos se pueden
administrar por cualquier ruta conveniente, por ejemplo por
infusión, por inyección de bolos, por absorción a través de
revestimientos epiteliales o mucocutaneos (por ejemplo, mucosa
oral, rectal e intestinal, etc.), y se pueden administrar junto con
otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser
sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las
composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso
central por cualquier ruta apropiada, incluyendo inyección
intraventricular e intratecal; inyección intraventricular se puede
facilitar por un catéter intraventricular, por ejemplo, conectado a
un recipiente, tal como un recipiente Ommaya. La administración
pulmonar también se puede emplear, por ejemplo, mediante el uso de
un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de
aerosol.
En una modalidad específica, puede ser deseable
administrar las composiciones farmacéuticas de la invención
localmente en el área, con necesidad del tratamiento. Esto se puede
lograr por, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local
durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción
con una venda para heridas después de cirugía, por inyección, por
medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un
implante, dicho implante que es de un material poroso,
no-poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas,
tales como membranas sialásticas, o fibras. En una modalidad, la
administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio
creador) de un tumor maligno o tejido neoplástico o
pre-neoplástico.
En otra modalidad, el terapéutico se puede
entregar en una vejiga, en particular un liposoma (Langer, 1990,
Science 249:1527-1533; Treat et al., 1989,
In: Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,
Lopez- Berestein and Fidler, eds., Liss, New York, pp.
353-365; Lopez-Berestein,
ibid., pp. 317-327; ver en general
Ibídem).
En aun otra modalidad, el terapéutico se puede
entregar vía un sistema de liberación controlada. En una modalidad,
se puede utilizar una bomba (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC
Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et
al., 1980, Surgery 88:507-516; Saudek et
al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574-579). En
otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos (Medical
Applications de Controlled Release, Langer y Wise, eds., CRC Press,
Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug
Product Design and Performance, Smolen and Ball, eds., Wiley, New
York, 1984; Ranger y Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol.
Chem. 23:61; Levy et al., 1985, Science
228:190-192; During et al., 1989, Ann.
Neurol. 25:351-356; Howard et al., 1989, J.
Neurosurg. 71:85 8-863). En aun otra modalidad, un
sistema de liberación controlada se pueden colocar en proximidad del
objetivo terapéutico, i.e., el cerebro, de esta manera requiere
únicamente una fracción de la dosis sistémica (por ejemplo,
Goodson, 1984, In: Medical Applications de Controlled Release,
supra, Vol. 2, pp. 115-138). Otros sistemas
de liberación controlada se discuten en la revisión por Langer
(1990, Science 249:1527-1533).
En una modalidad específica dónde el terapéutico
es un ácido nucleico, preferiblemente que codifica un terapéutico
de proteína, el ácido nucleico se puede administrar in vivo
para promover la expresión de su proteína codificada, por
construcción de ésta como parte de un vector de expresión de ácido
nucleico apropiado y administrándolo, de tal manera que llega a ser
intracelular, por ejemplo, por el uso de un vector retroviral
(Patente U.S. No. 4.980.286), o por inyección directa, o por el uso
de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica;
Biolistic, Dupont), o por el recubrimiento con lípidos, receptores
de superficie celular o agentes de transfección, o por
administración en unión con un péptido semejante a box homeo, que se
conoce por entrar en el núcleo (por ejemplo, Joliot et al.,
1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc.
Como alternativa, un ácido nucleico terapéutico se puede introducir
intracelularmente e incorporar por recombinación de homólogos
dentro del ADN de la célula huésped para la expresión.
En general, las composiciones farmacéuticas de
la presente invención comprenden una cantidad efectiva
terapéuticamente de un terapéutico, y un portador farmacéuticamente
aceptable. En una modalidad específica, el término
"farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una
agencia reguladora del gobierno Federal o un Estado o enumerado en
la Farmacopea Americana u otra Farmacopea reconocida usualmente
para utilizar en animales, y más particularmente, en humanos. El
término "portador" se refiere a un diluente, adyuvante,
excipiente, o vehículo con el cual, el terapéutico se administra.
Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales
como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo,
animal, vegetal o sintético, incluyendo pero no limitando a aceite
de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de ajonjolí y
similares. El agua es un portador preferido cuando la composición
farmacéutica se administra vía oral. La dextrosa salina y acuosa son
portadores preferidos cuando la composición farmacéutica se
administra vía intravenosa. Las soluciones salinas y dextrosa acuosa
y soluciones de glicerol preferiblemente se emplean como portadores
líquidos para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos
apropiados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina,
malta, arroz, harina, yeso, silica gel, estearato de sodio,
glicerol monoestearato, talco, cloruro de sodio, leche descremada
en polvo, glicerol, propilen, glicol, agua, etanol y similares. La
composición, si se desea, también puede contener cantidades menores
de agentes de humectación o emulsificantes, o agentes reguladores de
pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones,
suspensiones, emulsiones, tabletas, píldoras, cápsulas, polvos,
formulaciones de liberación controlada y similares. La composición
se puede formular como un supositorio, con aglutinantes
tradicionales y portadores tales como trigliceridos. La formulación
oral puede incluir portadores estándar tales como productos grado
farmacéutico de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio,
sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de
portadores farmacéuticos apropiados se describen en "Remington's
Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. Tales composiciones
tendrán una cantidad efectiva terapéuticamente del terapéutico,
preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad
apropiada de portador, para proporcionar la forma para una
administración adecuada al paciente. La formulación debe adaptarse
al modo de administración.
En una modalidad preferida, la composición se
formula, de acuerdo con procedimientos rutinarios, como una
composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa
a los seres humanos. Usualmente, las composiciones para
administración intravenosa son soluciones en solución reguladora
acuosa isotónica estéril. En caso necesario, la composición también
puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal
como lidocaina para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.
Generalmente, los ingredientes se suplen ya sea por separado o
mezclado junto en una forma de dosificación por unidad, por ejemplo,
como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un
contenedor herméticamente sellado tal como una ampolla o bolsita
indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición se ha
de administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de
infusión que contiene agua o solución salina grado farmacéutico
estéril. Cuando la composición se administra por inyección, una
ampolla de agua o solución salina estéril para inyección se puede
proporcionar de modo que los ingredientes se puedan mezclar antes
de la administración.
Los terapéuticos de la invención se pueden
formular como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente
aceptables incluyen aquellas formadas con grupos carboxilo libres
tales como aquellos derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico,
acético, oxálico, tartárico, etc., aquellos formados con grupos
amino libres tales como aquellas derivadas de isopropilamina,
trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina,
procaina, etc., y aquellas derivadas de sodio, potasio, amonio,
calcio, e hidróxidos férricos, etc.
La cantidad del terapéutico de la invención, que
será efectiva en el tratamiento de un desorden o condición
particular dependerá de la naturaleza del desorden o condición, y se
puede determinar por técnicas clínicas estándar. Además, los
ensayos in vitro pueden opcionalmente ser empleados para
ayudar a identificar rangos de dosificación óptimos. La dosis
precisa para ser empleada en la formulación, también dependerá de la
ruta de administración, y la seriedad de la enfermedad o desorden,
y se debería decidir de acuerdo con el juicio del practicante y
cada circunstancia del paciente. Sin embargo, los rangos de
dosificación apropiada para la administración intravenosa son
generalmente aproximadamente 20-500 microgramos de
compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los rangos de
dosificación apropiados para administración intranasal son
generalmente cerca de 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso
corporal. Las dosis efectivas se pueden extrapolar de las curvas
dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba
in vitro o modelo de animal.
Los supositorios generalmente contienen el
ingrediente activo en el rango de 0,5% a 10% en peso; las
formulaciones orales preferiblemente contienen 10% a 95% de
ingrediente activo.
La invención también proporciona a paquete o kit
farmacéutico que comprende uno o más envases llenos con uno o más
de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la
invención. Opcionalmente asociada con tal contenedor(s)
puede estar una información en la forma prescrita por una agencia
gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos
biológicos o farmacéuticos, información que refleja la autorización
por la agencia para la fabricación, uso o venta para administración
humana.
Los kits de la presente invención también pueden
contener vectores de expresión que codifican los componentes
esenciales de la maquinaria compleja, componentes que después de ser
expresados pueden ser reconstituidos con el fin de formar un
complejo biológicamente activo. Tal kit preferiblemente también
contiene las soluciones reguladoras y reactivos requeridos.
Opcionalmente asociados con tales contenedor(s) pueden estar
las instrucciones de uso del kit y/o una información en la forma
prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación,
uso o venta de productos biológicos o farmacéuticos, información que
refleja la autorización por la agencia de fabricación, uso o venta
para administración humana.
La invención además se relaciona con un método
de tratamiento, en donde una cantidad efectiva de una molécula que
interactúa con GPR49 o el inhibidor o de una composición
farmacéutica de la invención administrada a un sujeto que sufre de
una enfermedad neurodegenerativa, preferiblemente la enfermedad de
Alzheimer.
En consideración con este método de la
invención, todas las modalidades dadas anteriormente aplican para el
uso de la invención.
La invención además se relaciona con un método
para identificar un modulador gama secretasa y/o modulador
beta-secretasa, que comprende las siguientes
etapas:
a. identificación de una molécula que interactúa
con GPR49, mediante la determinación si un compuesto de prueba dado
es una molécula que interactúa con GPR49,
b. determinación si la molécula que interactúa
con GPR49 de la etapa a) es capaz de modular la actividad de la
gama secretasa o la actividad beta-secretasa.
En una modalidad preferida de la invención, en
la etapa a) el compuesto de prueba es puesto en contacto con GPR49
y se determina la interacción de GPR49 con el compuesto de prueba.
Preferiblemente, ésta se mide si la molécula candidato se unió al
GPR49.
En una modalidad preferida de la invención, la
molécula que interactúa con GPR49 identificada en la etapa a)
primero se somete a una prueba de actividad de GPR49 como se
describe arriba (también ver el ejemplo 3) con el fin de encontrar
si ésta modula, preferiblemente inhibe la actividad de GPR49 y luego
se somete al proceso de la etapa b) (prueba para un efecto de baja
de Abeta).
El método de la invención preferiblemente se
representa en el contexto de un ensayo de alto rendimiento. Tales
ensayos se conocen por alguien de habilidad en el oficio.
Moléculas de prueba o candidato para ser
seleccionadas se pueden proporcionar como mezclas de un número
limitado de compuestos específicos, o como bibliotecas de
compuestos, bibliotecas de péptidos y similares. Los
agentes/moléculas para ser seleccionados también puede incluir
todas las formas de antisuero, ácidos nucleicos antisentido, etc.,
que pueden modular la actividad o formación del complejo.
Ejemplarmente las moléculas candidatos y bibliotecas para
seleccionar se publican abajo.
La selección de las bibliotecas se puede lograr
por cualquiera de una variedad de métodos conocidos normalmente.
Ver, por ejemplo, las siguientes referencias, que revelan la
selección de bibliotecas de péptidos: Parmley and Smith, 1989, Adv.
Exp. Med. Biol. 251: 215-218; Scott and Smith, 1990,
Science 249:386-390; Fowlkes et al., 1992,
BioTechniques 13:422-427; Oldenburg et al.,
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yu
et al., 1994, Cell 76:933-945; Staudt et
al., 1988, Science 241: 577-580; Bock et
al., 1992, Nature 355:564-566; Tuerk et
al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:6988-6992; Ellington et al., 1992, Nature
355:850-852; Patente U.S. No. 5,096,815, Patente
U.S. No. 5,223,409, y Patente U.S. No. 5,198,346, all to Ladner
et al.; Rebar and Pabo, 1993, Science
263:671-673; and International Patent Publication
No. WO 94/18318.
En una modalidad específica, la selección se
puede realizar por el contacto de los miembros de la biblioteca con
un GPR49 inmovilizado en una fase sólida, y cosechando aquellos
miembros de la biblioteca que se unen a la proteína (o ácido
nucleico que codifica o derivado). Ejemplos de tales métodos de
selección, llamados técnicas "detección por barrido", se
describen por medio de ejemplos en Parmley and Smith, 1988, Gene
73:305-318; Fowlkes et al., 1992,
BioTechniques 13:422-427; International Patent
Publication No. WO 94/18318; y en las referencias citadas
anteriormente.
En una modalidad específica, los fragmentos
GPR49 y/o análogos, especialmente peptidomiméticos, se seleccionan
por actividad como inhibidores competitivos o
no-competitivos de la formación de un complejo de
GPR49 con otras proteínas, por ejemplo las proteínas dadas en la
Tabla 1 (cantidad de complejo o composición de complejo) o
actividad de GPR49 en la célula, que por consiguiente inhibe la
actividad o formación del complejo en la célula.
En una modalidad, los agentes que modulan (i.e.,
antagonista o agonista) la actividad de GPR49 o formación del
complejo de proteínas GPR49, se pueden seleccionar por el uso de un
ensayo de inhibición del enlace, en donde los agentes se
seleccionan por su capacidad para modular la formación de un
complejo bajo condiciones de enlace acuosas, o fisiológicas en las
cuales la formación del complejo ocurre en la ausencia del agente a
ser probado. Los agentes que interfieren con la formación de
complejos de la invención se identifican como antagonistas de
formación del complejo. Los agentes que promueven la formación de
complejos se identifican como agonistas de formación del complejo.
Los agentes que bloquean completamente la formación de complejos se
identifican como inhibidores de formación del complejo.
Los métodos para la selección pueden involucrar
la marcación de los componentes de proteínas del complejo con
radioligandos (por ejemplo, ^{125}I o ^{3}H), ligandos
magnéticos (por ejemplo, cuentas paramagnéticas covalentemente
conectadas al acetato de fotobiotina), ligandos flurescentes (por
ejemplo, fluoresceina o rodamina), o ligandos de enzima (por
ejemplo, luciferasa o \beta-galactosidasa). Los
reactivos que se unen en solución luego pueden ser aislados por una
de muchas técnicas conocidas en el oficio, incluyendo pero no
limitadas a, co-inmunoprecipitación de la fracción
del complejo marcado utilizando antisuero contra el enlace patrón
sin marcar (o enlace patrón marcado con un marcador distinguible de
aquel utilizado en la segunda fracción del complejo marcado),
inmunocromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión, y
centrifugación en gradiente de densidad. En una modalidad
preferida, el enlace patrón marcado es un fragmento pequeño o
peptidomimético que no se retiene por un filtro disponible
comercialmente. Bajo el enlace, la especie marcada luego no es
capaz de pasar a través del filtro, proporcionando un simple ensayo
de la formación del complejo.
Los métodos normalmente conocidos en el oficio
se utilizan para marcar al menos uno de los miembros del componente
del complejo. Los métodos de marcación apropiados incluyen, pero no
se limitan a, radiomarcación por incorporación de aminoácidos
radiomarcados, por ejemplo, 3H-leucina o
35S-metionina, la radiomarcación por
pos-yodación traslacional con ^{125}I o ^{131}I
utilizando el método de cloramina T, reactivos
Bolton-Hunter, etc., o marcación con ^{32}P
utilizando fosforilasa y fósforo radiomarcado inorgánico, marcación
de biotina con fotobiotina-acetato y exposición a
una lámpara de rayos ultravioleta, etc. En casos dónde uno de los
miembros del complejo se inmoviliza, por ejemplo, como se describe
debajo, la especie libre se marca. En caso de que ninguna de las
que interactúan se inmovilice, cada una se puede marcar con un
marcador distinguible tal que el aislamiento de ambas fracciones se
puede seguir para proporcionar la cuantificación más precisa, y
distinguir la formación de complejos homoméricos a partir de los
heteroméricos. Se proporcionan los métodos que utilizan proteínas
accesorios que se unen a uno de los que interactúan modificados para
mejorar la sensibilidad de detección, aumentan la estabilidad del
complejo,
etc.
etc.
Las condiciones de enlace típicas son, por
ejemplo, pero no a modo de limitación, en una solución salina acuosa
de NaCl 10-250 mM, Tris-HCl
5-50 mM, pH 5-8, y 0,5% de Triton
X-100 u otro detergente que mejora la especificidad
de interacción. Los quelantes metálicos y/o cationes divalentes se
pueden adicionar para mejorar el enlace y/o reducir la proteólisis.
Las temperaturas de reacción pueden incluir 4, 10, 15, 22, 25, 35, o
42 grados Centígrados, y el tiempo de incubación es usualmente al
menos 15 segundos, pero tiempos más largos se prefieren para
permitir que el equilibrio del enlace ocurra. Los complejos
particulares se pueden ensayar utilizando ensayos de enlace de
proteínas rutinarios para determinar la condiciones de enlace
óptimos para un enlace reproducible.
Los parámetros físicos de formación del complejo
se pueden analizar mediante la cuantificación de formación del
complejo utilizando métodos de ensayo específicos para el marcador
utilizado, por ejemplo, conteo de centelleo líquido por detección
de radioactividad, actividad enzimática para fracciones marcadas de
enzima, etc. Los resultados de reacción luego se analizan
utilizando análisis de Scatchard, análisis de Hill, y otros métodos
normalmente conocidos en el oficio (ver, por ejemplo, Proteins,
Structures, y Molecular Principles, 2nd Edition (1993) Creighton,
Ed., W.H. Freeman y Company, New York).
En una segunda metodología común a los ensayos
de enlace, una de la especie de enlace se inmoviliza en un filtro,
en un pozo de placa de microtitulación, en un tubo de ensayo, para
una matriz de cromatografía, etc., ya sea covalente o
no-covalentemente. Las proteínas pueden ser
inmovilizadas covalentemente, utilizando cualquier método bien
conocido en el oficio, por ejemplo, pero no limitando al método de
Kadonaga y Tjian, 1986, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA
83:5889-5893, i.e., enlace a un sustrato
derivatizado cianógeno-bromuro tal como
CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). Donde se necesite,
el uso de espaciadores puede reducir la barrera estérica por el
sustrato. La adherencia no-covalente de las
proteínas con un sustrato incluyen, pero no se limitan a, unión de
una proteína a una superficie cargada, enlace con anticuerpos
específicos, enlace a un tercer inconexo que interactúa con la
proteína, etc.
Ensayos de agentes (incluyendo extractos
celulares o una biblioteca mezcla) para la competición por el enlace
de un miembro de un complejo (o derivados de estos) con otro
miembro del complejo marcado por cualquier medio (por ejemplo,
aquellos medios descritos anteriormente) se proporcionan para
seleccionar los competidores o potenciadores de formación del
complejo.
En modalidades específicas, los agentes
bloqueadores para inhibir el enlace no-específico de
reactivos con otros componentes de la proteína, o pérdida de la
absorción de reactivos a plásticos, matrices de inmovilización,
etc., se incluyen en la mezcla de ensayo. Los agentes de bloqueo
incluyen, pero no se limitan a albúmina de suero de bovino,
caseina, leche deshidratada sin grasa, reactivo de Denhardt, Ficoll,
polivinilpirolidina, detergentes no iónicos (NP40, Triton
X-100, Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes
iónicos (por ejemplo, SDS, LDS, etc.), polietilenglicol, etc. Las
concentraciones apropiadas del agente de bloqueo permiten la
formación del complejo.
Después de que el enlace se realiza, la proteína
marcada, desligada, se retira en el sobrenadante, y la proteína
inmovilizada que retiene cualquier unión, la proteína marcada se
lava extensamente. La cantidad de enlace marcado, luego se
cuantifica utilizando métodos estándar en el oficio para detectar la
marca como se describe, supra.
En otras modalidades específicas la selección
para moduladores de los complejos de proteínas/proteína como se
proporciona en este punto, se puede realizar por unión de aquellos
y/o los anticuerpos como se proporciona en este punto con un
portador sólido.
La preparación de tal colección que contiene
diferentes tipos de proteínas, incluyendo anticuerpos) es bien
conocida en el oficio y es apreciable para alguien de habilidad en
el oficio (ver por ejemplo Ekins et al., 1989, J. Pharm.
Biomed. Anal. 7:155-168; Mitchell et al.
2002, Nature Biotechnol. 20:225-229; Petricoin et
al., 2002, Lancet 359:572-577; Templin et
al., 2001, Trends Biotechnol. 20:160-166; Wilson
and Nock, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 6:81-85;
Lee et al., 2002 Science 295: 1702-1705;
MacBeath and Schreiber, 2000, Science 289:1760; Blawas and
Reichert, 1998, Biomaterials 19:595; Kane et al., 1999,
Biomaterials 20:2363; Chen et al., 1997, Science 276:1425;
Vaugham et al., 1996, Nature Biotechnol. 14:
309-314; Mahler et al., 1997,
Immunotechnology 3:31-43; Roberts et al.,
1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:268-273; Nord et
al., 1997, Nature Biotechnol. 15:772-777; Nord
et al., 2001, Eur. J. Biochem. 268:4269-4277;
Brody and Gold, 2000, Rev. Mol. Biotechnol. 74:5-13;
Karlstroem and Nygren, 2001, Anal. Biochem.
295:22-30; Nelson et al., 2000,
Electrophoresis 21:1155-1163; Honore et al.,
2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 3:265-274; Albala,
2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 2:145-152, Figeys and
Pinto, 2001, Electrophoresis 2:208-216 y las
referencias en las publicaciones enumeradas aquí).
La proteína o complejos de proteínas se pueden
conectar a una colección por diferentes medios como será apreciable
por alguien de habilidad en el oficio. Los complejos pueden por
ejemplo se adicionados a la colección vía un
TAP-tag (como se describe en WO/0009716 y en Rigaut
et al., 1999, Nature Biotechnol.
10:1030-1032) después de la etapa de purificación o
por otro apropiado esquema de purificación como será apreciable por
alguien de habilidad en el oficio.
Opcionalmente, las proteínas del complejo se
pueden ligar en cruz para mejorar la estabilidad del complejo.
Diferentes métodos para ligar en cruz las proteínas son bien
conocidos en el oficio. Los grupos terminales reactivos de los
agentes de entrecruzamiento incluyen pero no se limitan a -COOH,
-SH, -NH2 o N-oxi-succinamato.
El espaciador del agente de entrecruzamiento
debería ser seleccionado con respecto al tamaño del complejo para
ser ligado en cruz. Para complejos de proteínas pequeños, que
comprenden únicamente unos espaciadores de pocas proteínas,
relativamente pequeñas se prefieren con el fin de reducir la
probabilidad de complejos separados de entrecruzamiento en la
mezcla de reacción. Para complejos de proteínas grandes, el uso
adicional de espaciadores grandes es preferible con el fin de
facilitar el entrecruzamiento entre las proteínas dentro del
complejo.
Esto es preferible para comprobar la velocidad
de éxito de entrecruzamiento antes de ligar el complejo con el
portador.
Tal como será apreciable por alguien de
habilidad en el oficio, la velocidad óptima de entrecruzamiento debe
determinarse en una base de caso por caso. Esto se puede lograr por
métodos bien conocidos en el oficio, algunos de los cuales se
describen ejemplarmente a continuación.
Una velocidad de entrecruzamiento suficiente se
puede comprobar i.e. f.e. mediante el análisis del complejo ligado
en cruz vs. un complejo no-ligado en cruz sobre un
gel de proteína desnaturalizado.
Sí el entrecruzamiento se ha desarrollado
exitosamente, las proteínas del complejo se esperan que se
encuentren en la misma senda, mientras que las proteínas del
complejo no-ligado en cruz se espera que se separen
de acuerdo con sus características individuales. Opcionalmente la
presencia de todas las proteínas del complejo se pueden además
comprobar por la secuenciación de péptidos de las proteínas en las
bandas respectivas utilizando métodos bien conocidos en el oficio
tales como espectrometría de masas y/o degradación de Edman.
Además, una velocidad de entrecruzamiento que es
muy alta también se debería evitar. Si el entrecruzamiento se ha
realizado en gran medida, habrá un incremento de la cantidad de
entrecruzamiento del complejo individual de proteínas, que
potencialmente interfiere con la selección de patrones de enlace
potenciales y/o moduladores etc. utilizando las colecciones.
La presencia de tales estructuras se puede
determinar por métodos bien conocidos en el oficio e incluyen por
ejemplo experimentos de filtración en gel que comparan las
soluciones de perfil de filtración en gel que contienen los
complejos ligados en cruz vs. complejos no-ligados
en cruz.
Opcionalmente, los ensayos funcionales, como
será apreciable para alguien de habilidad en el oficio, algunos de
los cuales se proporcionan ejemplarmente en este punto, se pueden
realizar para comprobar la integridad del complejo.
Como alternativa, las proteínas o la proteína se
pueden expresar como una proteína de fusión sola y acoplada a la
matriz como será apreciable por alguien de habilidad en el
oficio.
Opcionalmente, la adherencia del complejo o las
proteínas o el anticuerpo, que se ha hecho mención, se puede además
monitorear por varios métodos apreciables por alguien de habilidad
en el oficio. Aquellos incluyen, pero no se limitan a resonancia en
un plasmón de superficie (ver, por ejemplo McDonnel, 2001, Curr.
Opin. Chem. Biol. 5:572-577; Lee, 2001, Trends
Biotechnol. 19:217-222; Weinberger et al.,
2000, 1:395-416; Pearson et al., 2000, Ann.
Clin. Biochem. 37:119-145; Vely et al., 2000,
Methods Mol. Biol. 121: 313-321; Slepak, 2000, J.
Mol Recognit. 13:20-26.
Ensayos ejemplares útiles para medir la
producción de los péptidos Abeta-40 y
Abeta-42 por ELISA incluyen pero no se limitan a
aquellos descritos en Vassar R et al., 1999, Science,
286:735-41.
Ensayos ejemplares útiles para medir la
producción de fragmentos APP C-terminal en líneas
celulares o animales transgénicos por western blot incluyen pero no
se limitan a aquellos descritos en Yan R et al., 1999,
Nature, 402:533-7.
Ensayos ejemplares útiles para medir la
actividad proteolítica de beta- o gama secretasas hacia los
fragmentos APP expresados bacterialmente in vitro (por
ejemplo, modificando la expresión de una o varias proteínas que
interactúan en las células por medio del ARNi (ARNsi) y/o los
plásmidos que codifican la(s) proteína(s) que
interactúan) del complejo-BACE1 incluyen pero no se
limitan a aquellos descritos en Tian G et al., 2002, J Biol
Chem, 277:31499-505.
Ensayos ejemplares útiles para medir la
transactivación de un gen indicador conducido Gal4 (por ejemplo
modificando la expresión de una o varias proteínas que interactúan
en las células por medio del ARNi (ARNsi) y/o los plásmidos que
codifican la(s) proteína(s) que interactúan) del
complejo-BACE1 incluyen pero no se limitan a
aquellos descritos en Cao X et al., 2001, Science,
293:115-20.
Cualquier molécula conocida en el oficio se
puede probar por su capacidad para ser una molécula de interacción
o de inhibición de acuerdo con la presente invención. Las moléculas
candidatas se pueden proporcionar directamente a una célula
expresando la maquinaria del complejo GPR49, o, en el caso de
proteínas candidatas, se pueden proporcionar, mediante el
suministro de sus ácidos nucleicos codificantes bajo las condiciones
en las cuales los ácidos nucleicos se expresan recombinantemente
para producir la proteína candidata.
El método de la invención se adapta bien para
seleccionar las bibliotecas químicas para las moléculas que
modulan, por ejemplo, inhiben, antagonizan, o agonizan, la cantidad
de, actividad de, o la composición del componente de la proteína
del complejo. Las bibliotecas químicas pueden ser bibliotecas de
péptidos, bibliotecas de péptidomiméticos, bibliotecas sintetizadas
químicamente, recombinantes, por ejemplo, bibliotecas de expresión
en fagos, y bibliotecas basadas de traducción in vitro, otras
bibliotecas de no-péptidos sintéticos orgánicos,
etc.
Bibliotecas ejemplares son disponibles
comercialmente de varias fuentes (ArQule, Tripos/PanLabs,
ChemDesign, Pharmacopoeia). En algunos casos, estas bibliotecas
químicas se generan utilizando estrategias combinatorias, que
codifican la identidad de cada miembro de la biblioteca en un
sustrato al cual el compuesto del miembro se adhiere, permitiendo
de esta manera la identificación directa e inmediata de una molécula
que es un modulador efectivo. De esta manera, en muchas
metodologías combinatorias, la posición en una placa de un compuesto
especifico a la composición del compuesto. También, en un ejemplo,
una sola posición de la placa puede tener de 1-20
productos químicos, que se pueden seleccionar, por la administración
a un pozo que contiene las interacciones de interés. De esta
manera, si la modulación se detecta, mezclas más y más pequeñas
mezclas de pares que interactúan se pueden ensayar en cuanto a la
modulación de la actividad. Mediante tales métodos, muchas moléculas
candidatas se pueden seleccionar.
Muchas bibliotecas de diversidad apropiada para
utilizar se conocen en el oficio y se pueden utilizar para
proporcionar compuestos para ser analizados de acuerdo con la
presente invención. Como alternativa, las bibliotecas se pueden
construir utilizando métodos estándar. Bibliotecas de productos
químicos (sintético), bibliotecas de expresión recombinante, o
bibliotecas basadas en polisomas son tipos de bibliotecas ejemplares
que se pueden utilizar.
Las bibliotecas pueden ser limitadas o
semirígidas (que tienen algún grado de rigidez estructural), o
lineal o no-limitada. La biblioteca puede ser una
biblioteca de expresión genómica o cADN, biblioteca de expresión de
péptidos al azar o una biblioteca de péptidos al azar sintetizados
químicamente, o biblioteca de no-péptidos. Las
bibliotecas de expresión se introducen en las células en las cuales
el ensayo ocurre, dónde los ácidos nucleicos de la biblioteca se
expresan para producir sus proteínas codificadas.
En una modalidad, las bibliotecas de péptidos
que se pueden utilizar en la presente invención pueden ser
bibliotecas que se sintetizan químicamente in vitro.
Ejemplos de tales bibliotecas se dan en Houghten et al.,
1991, Nature 354:84-86, que describe las mezclas de
hexapéptidos libres en las cuales, el primer y segundo residuos en
cada péptido fueron individual y específicamente definidos; Lam
et al., 1991, Nature 354:82-84, que describe
una metodología "una cuenta, un péptido", en la cual una fase
del esquema de síntesis de división sólida produjo una biblioteca
de péptidos en la cual cada cuenta en la colección ha inmovilizado
por consiguiente un sólo residuo de secuencia de aminoácido al
azar; Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710, que
describe los métodos de síntesis de división y síntesis
T-bag; y Gallop et al., 1994, J. Med. Chem.
37:1233-1251. Simplemente por medio de otros
ejemplos, una biblioteca combinatoria se puede preparar para
utilizar, de acuerdo con los métodos de Ohlmeyer et al.,
1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb
et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:11422-11426; Houghten et al., 1992,
Biotechniques 13:412; Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91:1614-1618; o Salmon et
al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:11708-11712. Publicación PCT No. WO 93/20242 and
Brenner and Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:5381-5383 describe las "bibliotecas de química
combinatoria codificada", que contienen identificadores de
oligonucleótidos por cada miembro de la biblioteca del polímero
químico.
En una modalidad preferida, la biblioteca
seleccionada es una biblioteca de expresión biológica que es una
biblioteca de expresión en fagos de péptidos al azar, dónde los
péptidos al azar son limitados (por ejemplo, en virtud de que
tienen un enlace bisulfuro).
Por otra parte, las bibliotecas de carácter más
general, limitadas estructuralmente, de diversidad orgánica (por
ejemplo, no-péptido), también se pueden utilizar. A
modo de ejemplo, una biblioteca de benzodiazepina (ver por ejemplo,
Bunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:4708-4712) se puede utilizar.
Las bibliotecas limitadas en forma adaptativa
que se pueden utilizar incluyen pero no se limitan a aquellas que
contienen residuos de cisteina fijos los cuales, en un ambiente de
oxidación, se ligan en cruz por enlaces bisulfuro para formar
cisteinas, péptidos modificados (por ejemplo, incorporando flúor,
metales, marcadores isotópicos, son fosforilados, etc.), péptidos
que contienen uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente,
estructuras no-péptidos, y péptidos que contienen
una significante fracción de -ácido carboxiglutámico.
Las bibliotecas de no-péptidos,
por ejemplo, derivados de péptidos (por ejemplo, que contienen uno o
más aminoácidos que no ocurren naturalmente) también se pueden
utilizar. Un ejemplo de éstas son las bibliotecas de peptoides
(Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:9367-9371). Los peptoides son polímeros de
aminoácidos no naturales que no tienen cadenas laterales de origen
natural adheridas al carbón-alfa pero sí al
esqueleto amino nitrógeno. Dado que los peptoides no se degradan
fácilmente por enzimas digestivas humanas, ellas son ventajosamente
más fácilmente adaptables para utilizar como fármacos. Otro ejemplo
de una biblioteca que se pueden utilizar, en la cual la
funcionabilidad de la amida en los péptidos han sido permetilados
para generar una biblioteca combinatoria químicamente transformada,
se describe por Ostresh et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91:11138-
11142).
11142).
Los miembros de las bibliotecas de péptidos que
se pueden seleccionar de acuerdo con la invención no se limitan a
los que contienen 20 aminoácidos de origen natural. En particular,
las bibliotecas sintetizadas químicamente y bibliotecas basadas en
polisomas permiten el uso de aminoácidos, además de los 20
aminoácidos de origen natural (por su inclusión en la mezcla
precursora de aminoácidos utilizada en la biblioteca producción de
la biblioteca). En modalidades específicas, los miembros de la
biblioteca contienen uno o más aminoácidos
no-naturales o no-clásicos o
péptidos cíclicos. Los aminoácidos no-clásicos
incluyen pero no se limitan a los D-isómeros de los
aminoácidos comunes, - ácido amino isobutírico, ácido
4-aminobutírico, Abu, ácido
2-aminobutírico; -Abu, -Ahx, ácido
6-amino hexanoico; Aib, ácido amino
2-isobutírico; ácido 3-amino
propionico; omitina; norleucina; norvalina, hidroxiprolina,
sarcosina, citrullina, ácido cisteico,
t-butilglicina, t-butilalanina,
fenilglicina, ciclohexilalanina, B-alanina,
aminoácidos de diseño tal como B-metil aminoácidos,
C- metil aminoácidos, N-metil aminoácidos,
fluoro-aminoácidos y análogos de aminoácido en
general. Adicionalmente, el aminoácido puede ser D
(dextrorotatorio) o L (levógiro).
En una modalidad específica, los fragmentos y/o
análogos de complejos de la invención, o componentes de la proteína
de éstos, especialmente peptidomiméticos, se seleccionan por su
actividad como inhibidores competitivos o
no-competitivos de actividad o formación del
complejo.
En otra modalidad de la presente invención, se
pueden utilizar la química combinatoria para identificar moduladores
de los complejos. La química combinatoria es capaz de crear las
bibliotecas que contienen cientos de miles de compuestos, muchos de
los cuales pueden ser estructuralmente similares. A pesar de que los
programas de selección de alto rendimiento con capaces de
seleccionar estas inmensas bibliotecas por afinidad de objetivos
conocidos, nuevas metodologías han sido desarrolladas, que logran
bibliotecas de dimensión más pequeña pero que proporcionan máxima
diversidad química. (Ver por ejemplo, Matter, 1997, J. Med. Chem.
40:1219-1229).
Un método de química combinatoria, huella
genética de afinidad, se ha utilizado previamente, para probar una
biblioteca discreta de pequeñas moléculas por afinidad de enlace
para un panel definido de proteínas. Las huellas genéticas
obtenidas por la selección, se utilizan para predecir la afinidad de
los miembros individuales de la biblioteca para otras proteínas o
receptores de interés (en el momento de la invención, los complejos
de proteínas de la presente invención y los componentes de la
proteína de éstos.) Las huellas genéticas se comparan con huellas
genéticas obtenidas a partir de otros compuestos conocidos, para
reaccionar con la proteína de interés, para predecir si el
compuesto de la biblioteca puede reaccionar de manera similar. Por
ejemplo, en lugar de probar cada ligando en una biblioteca amplia
para interactuar con un complejo o componente de la proteína,
únicamente aquellos ligandos que tienen una huella genética similar
a los otros compuestos conocidos que tienen aquella actividad
deberían ser probados. (Ver, por ejemplo, Kauvar et al.,
1995, Chem. Biol. 2:107-118; Kauvar, 1995, Affinity
fingerprinting, Pharmaceutical Manufacturing International.
8:25-28; and Kauvar, Toxic-Chemical
Detection by Pattern Recognition in New Frontiers in Agrochemical
Immunoassay, Kurtz, Stanker and Skerritt (eds), 1995, AOAC:
Washington, D.C., 305-
312).
312).
Kay et al. (1993, Gene
128:59-65) revelaron un método de construcción de
bibliotecas de péptidos que codifican los péptidos de la secuencia
al azar completamente que son más largos que aquellos de
cualesquiera bibliotecas convencionales previas. Las bibliotecas
reveladas en Kay et al. Codifican los péptidos al azar
sintéticos completamente de una longitud mayor de aproximadamente
20 aminoácidos en longitud. Tales bibliotecas se pueden seleccionar
ventajosamente para identificar los moduladores del complejo. (Ver
también la Patente U.S. No. 5,498,538 fechada en Marzo 12, 1996; y
Publicación PCT No. WO 94/18318 fechada el Agosto 18, 1994).
Un revisión integral de varios tipos de
bibliotecas de péptidos se puede encontrar en Gallop et al.,
1994, J. Med. Chem. 37:1233-1251.
En una modalidad preferida, la interacción del
compuesto de prueba con GPR49 resulta en una inhibición de la
actividad de GPR49.
De acuerdo con una modalidad preferida, en la
etapa b) se mide, la capacidad de la gama-secretasa
para dividir APP. Ésta se puede medir como se indica arriba.
Adicionalmente, la invención también describe un
método para preparar una composición farmacéutica para el
tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, posiblemente la
enfermedad de Alzheimer, que comprende las siguientes etapas:
a) identificación de un modulador
gama-secretasa y/o un modulador
beta-secretasa, preferiblemente inhibidor, de
acuerdo con el método de la invención, y
b) formulación del modulador
gama-secretasa y/o beta-secretasa,
preferiblemente un inhibidor, en una composición farmacéutica.
En consideración con la composición
farmacéutica, todas las modalidades como se indica arriba también
aplican aquí.
Este método además puede comprender la etapa de
mezclado de la molécula identificada con un portador
farmacéuticamente aceptable como se explica anteriormente.
La invención también describe una composición
farmacéutica que comprende un inhibidor de GPR49 como se define
anteriormente.
Adicionalmente, la invención también describe
una composición farmacéutica obtenible, mediante el anterior
método, para la preparación de una composición farmacéutica.
La invención también describe la composición
farmacéutica como se describe anteriormente, para el tratamiento de
una enfermedad neurodegenerativa tal como la enfermedad de Alzheimer
y desórdenes neurodegenerativos relacionados.
La invención también describe un método para
tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa, preferiblemente
la enfermedad de Alzheimer, que comprende la administración a un
sujeto con necesidad de dicho tratamiento o prevención, de una
cantidad efectiva terapéuticamente de una composición farmacéutica
como se describe anteriormente.
En consideración con aquel método todas las
modalidades como se describe anteriormente para el uso de la
invención también aplican.
La invención también se relaciona con el uso de
un inhibidor de GPR49 como se utiliza arriba para la modulación,
preferiblemente la inhibición de la actividad de la
beta-secretasa y/o la gama-secretasa
in vitro. Por ejemplo, se abarca dentro de la presente
invención para modular, preferiblemente inhiben la actividad de la
beta-secretasa y/o la
gama-secretasa en cultivos celulares por la molécula
que interactúa con GPR49. Todas las modalidades con respecto al
inhibidor de GPR49 como se describe anteriormente también aplican a
este uso de la invención.
Los siguientes ejemplos describirán el contenido
de la invención con más detalle.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La tecnología-TAP, la cual se
describe más completamente en EP 1 105 508 B1 y en Rigaut, et
al., 1999, Nature Biotechnol. 17:1030-1032
respectivamente, se utilizó y además se adaptó como se describe
abajo para la purificación de la proteína. Las proteínas se
identificaron utilizando espectrometría de masas como se describe
más adelante.
GPR49 fue identificado como un miembro de
complejos de proteínas con la tecnología de puntos de entrada TAP
Aph1a, APPC99, BACE1 y Fe65L2 (Fig. 1).
\newpage
Parte
1
Los cADNs que codifican el ORF completo se
obtuvieron por RT-PCR. El ARN total se preparó a
partir de líneas celulares apropiadas utilizando el Kit RNeasy Mini
(Qiagen). Ambos la síntesis de cADN y PCR se llevaron a cabo con el
SUPERSCRIPT One-Step RT-PCR para un
Kit de plantillas Long (Life Technologies) utilizando cebadores de
gen específicos. Después de que los 35-40 ciclos de
productos-PCR de amplificación con el tamaño
esperado se purificaron en gel con el kit de purificación PCR
MinElute (Qiagen) y, si es necesario, utilizado otra amplificación.
Los ARNs abundantes pequeños se amplificaron por PCR anidada antes
de la purificación de gel. Los sitios de restricción para NotI se
conectaron a cebadores PCR para permitir la subclonación de cADNs
amplificados en los vectores retrovirales
pIE94-N/C-TAP generando por
consiguiente las fusiones N- o C-terminal con el
TAP-tag (Rigaut et al., 1999, Nature
Biotechnol. 17:1030-1032). El
N-terminal marcado se seleccionó por los siguientes
anzuelos/puntos de entrada: Presenilina 1, Presenilina 2,
Aph-1a, Aph-1b,
Pen-2, APP, Tau, Fe65, Calsenilina. El
C-terminal marcado se seleccionó por los siguientes
anzuelos/puntos de entrada: Nicastrin, Aph-1a,
Aph-1b, BACE1 D215N, APP, APP695SW,
APP-C99, Fe65, Fe65L2, X11beta.
Los clones se analizaron mediante digestión de
restricción, secuenciación de ADN y por traducción in vitro
utilizando el Sistema de Traducción/Transcripción Acoplado TNT T7
Quick (Promega inc.). La presencia de las proteínas se probó por
Western blotting utilizando la proteína A parte de la
TAP-tag para la detección. Brevemente, la
separación de las proteínas por SDS-PAGE estándar se
siguió por transferencia semi-seca sobre una
membrana de nitrocelulosa (PROTRAN, Schleicher&Schuell)
utilizando el equipo de transferencia MultiphorII de Pharmacia
Biotech.
La solución reguladora de transferencia
consistió de Tris 48 mM, glicina 39 mM, 10% de metanol y 0,0375% de
sodio dodecilsulfato. Después de que el bloqueo en solución
reguladora salina de fosfato (PBS) suplementada con 10% de leche en
polvo seco y 0,1% de Tween 20, las proteínas transferidas se
probaron con el Complejo Soluble de
Peroxidasa-Anti-Peroxidasa (Sigma)
diluidas en solución de bloqueo. Después de un lavado intensivo las
proteínas inmunoreactivas se visualizaron por luminiscencia mejorada
(ECL; Amersham Pharmacia Biotech).
Parte
2
Como vector, se utilizó un virus recombinante
basado en MoMLV.
La preparación se ha realizado como sigue:
293 gp células se cultivaron a una confluencia
del 100%. Se dividieron 1:5 en placas
poli-L-Lisina (diluidas 1:5 en
poli-L-Lisina [0,01% de solución
stock, Sigma P-4832] en PBS, dejándolas en las
placas por al menos 10 min.). En el Día 2, 63 microgramos del ADN
del Vector retroviral junto con 13 microgramos de ADN de plásmidos
que codifican una apropiada proteína de la envoltura, se
transfectaron en 293 gp células (Somia, et al., 1999, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 96:12667-12672; Somia, et
al. 2000, J. Virol. 74:4420-4424). En el Día 3,
el medio se reemplazó con 15 ml de DMEM + 10% de FBS por
15-cm del plato. En el Día 4, el medio que contiene
los virus (sobrenadante) se cosechó (a las 24 h después de cambiar
el medio de transfección). Cuando una segunda colección se
programó, se adicionó DMEM 10% de FBS a las placas y las placas se
incubaron por otras 24 h. Todas las colecciones se realizaron como
sigue: El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45
micrómetros (Corning GmbH, acetato de celulosa, 431155). El filtro
se colocó en tubos de centrífuga de polialomero cónicos (Beckman,
358126) que se colocan en las cubetas de un rotor SW 28 (Beckman).
El sobrenadante filtrado se ultracentrifugó a 19.400 rpm en el
rotor SW 28, por 2 horas a 21 grados centígrados. El sobrenadante se
descartó. El pellet que contiene los virus se resuspendió en un
volumen pequeño (por ejemplo 300 microlitros) de Solución Salina
Balanceada de Hank [Gibco BRL, 14025-092],
pipeteando arriba y abajo 100-veces, utilizando una
punta segura con aerosol. Los virus se utilizaron para la
transfección como se describe abajo.
Las células que se infectaron se sembraron en
placas un día antes dentro de un pozo de una placa de 6 pozos. 4
horas antes de la infección, el medio viejo sobre las células se
reemplazó con medio fresco. Solamente se adicionó un volumen
mínimo, de tal manera que las células se cubrieron completamente
(por ejemplo 700 microlitros). Durante la infección, las células se
dividieron activamente.
Una descripción de las células y sus condiciones
de crecimiento se da más adelante ("3. Líneas celulares")
A los virus concentrados, se les adicionó
polibreno (Bromuro de Hexadimetrina; Sigma, H 9268) para lograr una
concentración final de 8 microgramos/ml (esto es equivalente a 2,4
microlitros del polibreno stock de 1 miligramo/ml por 300
microlitros de retrovirus concentrado). El virus se incubó en
polibreno a temperatura ambiente por 1 hora. Para la infección, La
mezcla virus/polibreno se adicionó a las células y se incubaron a
37 grados centígrados a la apropiada concentración de CO2 por varias
horas (por ejemplo durante el día o durante la noche). Después de
la infección, el medio en las células infectadas se reemplazó con
medio fresco. Las células se pasaron como de costumbre después se
hicieron confluentes. Las células contienen el retrovirus integrado
en sus cromosomas y expresan establemente el gen de interés.
Para la expresión, se utilizaron las células
SKN-BE2. Las células SKN-BE2
(American Type Culture Collection-No.
CRL-2271) se cultivaron en 95% de OptiMEM + 5% de
suero de ternera suplementado con hierro.
Parte
3
La expresión patrón de la proteína marcada TAP
se comprobó, mediante un análisis inmunotransferencia y/o por
inmunofluorescencia. El análisis de inmunofluorescencia se realizó
tanto de acuerdo con No. 1 como con el No. 2 dependiendo del tipo
de la proteína marcada TAP. El análisis inmunotransferencia se
realizó de acuerdo con el No. 3.
Las células se cultivaron en medios de FCS en
superficies de la cámara de 8 pozos cubiertos con polilisina a una
confluencia del 50%. Entonces la fijación de las células se realizó
en 4% de Paraformaldehido diluido en solución salina Reguladora de
Fosfato (PBS) (0,14M de Fosfato, 0,1M de NaCl pH 7.4). Las células
se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente en 300
microlitros por pozo. El apagado se realizó en 0,1M de Glicina en
PBS por 2x 20 minutos a temperatura ambiente. El bloqueo se realizó
con 1% de Albúmina de Suero Bovino (BSA) en 0,3% de Saponina + PBS
por al menos 1 hora a temperatura ambiente. La incubación de los
anticuerpos primarios se realizó en la solución de bloqueo durante
la noche a +4ºC. La dilución correcta de los anticuerpos se
determinó en términos de caso a caso. Las células se lavaron en PBS
que contiene 0,3% de Saponina por 2x 20 minutos a temperatura
ambiente. La incubación de los anticuerpos secundarios se realiza en
la solución de bloqueo. El anti-conejo de cabra
acoplado Alexa 594 diluido 1:1000 (Molecular Probes).
anti-ratón de cabra acoplado Alexa 488 diluido
1:1000 (Molecular Probes). Se utilizó DAPI para marcar ADN. Si
Phalloidin se utiliza para marcar F-actina, el
fármaco diluido 1:500 se incuba con los anticuerpos secundarios. Las
células luego se lavaron nuevamente 2x 20 minutos a temperatura
ambiente en PBS. El exceso de solución reguladora se retiró y las
células se montaron en un medio que contiene un agente
anti-blanqueante (Vectashield, Vector
Laboratories).
Las células se cultivaron en medios de FCS en
superficies de la cámara de 8 pozos cubierta con Polilisina a una
confluencia del 50%. La fijación de las células se realizó en 4% de
Para-formaldehído diluido en solución salina
Reguladora de Fosfato (PBS) (Fosfato 0,14M, NaCl 0,1M pH 7,4) por 30
minutos a Temperatura Ambiente (RT), 300 microlitros por pozo. El
apagado se realizó en Glicina 0,1M en PBS por 2x 20 minutos a
temperatura ambiente. La permeabilización de las células se hizo
con 0,5% de Triton X-100 en PBS por 10 minutos a
temperatura ambiente. El bloqueo luego se hizo en 1% de Albúmina de
Suero Bovino (BSA) en 0,3% Saponina + PBS por al menos 1 hora a RT
(solución de bloqueo). La incubación de los anticuerpos primarios se
realizó en la solución de bloqueo, durante la noche a +4ºC. La
dilución correcta de los anticuerpos tiene que ser determinada en
una base caso a caso. Las células se lavaron en PBS que contiene
0,3% de Saponina, por 2x 20 minutos a RT. La incubación de los
anticuerpos secundarios se realizó en la solución de bloqueo
anti-conejo de cabra acoplado Alexa 594 diluido
1:1000 (Molecular Probes), anti-ratón de cabra
acoplado Alexa 488 diluido 1:1000 (Molecular Probes). Se utilizó
DAPI para marcar el ADN. Si se utiliza Phalloidina para marcar la
F-actina, el fármaco se diluye 1:500 y se incuba
con los anticuerpos secundarios. Las células se lavaron 2x 20
minutos a RT en PBS.
El exceso de solución reguladora se retiró y la
células se montaron en un medio que contiene an agente
anti-blanqueante (Vectashield, Vector
Laboratories).
Para analizar los niveles de expresión de
proteínas marcadas TAP, un pellet celular (a partir de un plato de
6 pozos) se lisó en 60 \mul de ADNse I solución reguladora (5%
Glicerol, NaCl 100 mM, 0,8% de NP-40 (IGEPAL),
sulfato de magnesio 5 mM, 100 \mug/ml ADNse I (Roche Diagnostics),
Tris 50 mM, pH 7,5, cóctel inhibidor de proteasa) por 15 min en
hielo. Cada muestra se dividió en dos alícuotas. La primera mitad se
centrifugó a 13.000 rpm por 5 min. Para producir el material
extractable NP-40 en el sobrenadante; la segunda
mitad (materia total) cuidadosamente se trituró 50 \mug de cada
uno del material extractable NP-40 y la materia
total se mezclaron con muestra que contiene DTT en solución
reguladora por 30 min a 50ºC en un agitador y se separaron mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida SDS sobre un gel
prefabricado 4-12% de Bis-Tris
(Invitrogen). Las proteínas luego se transfirieron a nitrocelulosa
utilizando un procedimiento semi-seco con un
sistema de solución reguladora discontinuo. Brevemente, el gel y la
membrana de nitrocelulosa se recopilaron en papeles de filtro
empapados es cualquier solución reguladora ánodo (tres capas de
solución reguladora Al (Tris-HCl 0,3 M) y tres
capas de solución reguladora A2 (Tris-HCl 0,03 M)) o
solución reguladora cátodo (tres capas de Tris-HCl
0,03 M, pH 9,4, 0,1% de SDS, 40 mM K-ácido aminocaprónico). La
electrotransferencia de dos geles a la vez se realizó a 600 mA por
25 min. Las proteínas transferidas se visualizaron con solución
Ponceau S por un minuto para controlar eficiencia de la
transferencia y entonces se destiñe en agua. La membrana se bloqueó
en 5% de leche desnatada en polvo en TBST (TBS que contiene 0,05% de
Tween-20) por 30 min a temperatura ambiente.
Posteriormente se incubó con anticuerpo PAP
HRP-acoplado (1:5000 diluido en 5% de leche/TBST)
por 1 h a temperatura ambiente, se lavó tres veces por 10 min en
TBST. La membrana de transferencia finalmente se empapó en sustrato
quimioluminescente (ECL, Roche Diagnostics) por 2 min. y se expuso a
una película de rayos-X o se analizó en una
estación de imágenes.
Parte
4
La purificación del complejo de proteína se
adaptó a la localización sub-celular de la proteína
marcada TAP y se realizó como se describe abajo.
Aproximadamente 1 x 10^{9} células adherentes
(media) se cosecharon con un removedor de células y se lavaron 3
veces en PBS helado (3 min, 550 g). Las células recolectadas se
congelaron en nitrógeno líquido o inmediatamente después de
procesar. Para la lisis celular, el pellet celular se resuspendió en
10 ml de CZ solución reguladora de lisis (Tris-Cl
50 mM, pH 7,4; 5% de Glicerol; 0,2% de IGEPAL; MgCl_{2}1,5 mM;
NaCl 100 mM; NaF 25 mM; Na_{3}VO_{4}1 mM; DTT 1 mM; que
contiene 1 tableta de cóctel del inhibidor de la proteasa libre de
EDTA (Complete^{TM}, Roche) por 25 ml de solución reguladora) y
homogenizado por 10 golpes de una mano de mortero
adecuada-ajustada en un homogenizador dounce. El
lisado se incubó por 30 min en hielo y se gira por 10 min a 20.000
g. El sobrenadante se sometió con una etapa de ultracentrifugación
adicional por 1 h a 100.000 g. El sobrenadante se recuperó y
rápidamente se congeló en nitrógeno líquido o inmediatamente después
de procesar.
Aproximadamente 1 x 10^{9} células adherentes
(media) se cosecharon con un removedor de células y se lavaron 3
veces en PBS helado (3 min, 550 g). Las células recolectadas se
congelaron en nitrógeno líquido o inmediatamente después de
procesar. Para la lisis celular, el pellet celular se resuspendió en
10 ml de solución reguladora de Lisis de Membrana (Tris 50 mM, pH
7,4; 7,5% de Glicerol; EDTA 1 mM; NaCl 150 mM; NaF 25 mM;
Na_{3}VO_{4} 1 mM; DTT 1 mM; que contiene 1 tableta del cóctel
del inhibidor de la proteasa libre de EDTA (Complete^{TM}, Roche)
por 25 ml de solución reguladora) y se homogenizó por 10 golpes de
una mano de mortero adecuada-ajustada en un
homogenizador dounce. El lisado se giró por 10 min a 750 g, el
sobrenadante se recuperó y se sometió a una etapa de
ultracentrifugación por 1 h a 100.000 g. El pellet de la membrana se
resuspendió en 7,5 ml de solución reguladora de Lisis de Membrana
que contiene 0,8% de
n-Dodecil-D-maltosida
y se incuba por 1 h a 4ºC con agitación constante. La muestra se
sometió a otra etapa de ultracentifugación por 1 h a 100.000 g y el
material solubilizado se congeló rápidamente en nitrógeno líquido o
inmediatamente después de procesar.
Aproximadamente 1 x 10^{9} células adherentes
(media) se cosecharon con un removedor de células y se lavaron 3
veces en PBS helado (3 min, 550 g). Las células recolectadas se
congelaron en nitrógeno líquido o inmediatamente después de
procesar. Para la lisis celular, el pellet celular se resuspendió en
10 ml de solución reguladora de Lisis-Hipotónica
(Tris 10 mM, pH 7,4; MgCl_{2} 1,5 mM; KCl 10 mM; NaF 25 mM;
Na_{3}VO_{4} 1 mM; DTT 1 mM; que contiene 1 tableta del cóctel
del inhibidor de la proteasa libre de EDTA (Complete^{TM}, Roche)
por 25 ml de solución reguladora) y se homogenizó por 10 golpes de
una mano de mortero adecuada-ajustada en un
homogenizador dounce. El lisado se giró por 10 min a 2.000 g y el
sobrenadante resultante (S1) guardado en hielo. El pellet nuclear
(P1) se resuspendió en 5 ml de solución reguladora de
Lisis-Nuclear (Tris 50 mM, pH 7,4; MgCl_{2} 1,5
mM; 20% de Glicerol; NaCl 420 mM; NaF 25 mM; Na_{3}VO_{4} 1 mM;
DTT 1 mM; que contiene 1 tableta del cóctel del inhibidor de la
proteasa libre de EDTA (Complete^{TM}, Roche) por 25 ml de
solución reguladora) y se incuba por 30 min en hielo. La muestra se
combinó con S1, se diluye otra vez con 7 ml de solución reguladora
de Dilución (Tris110 mM, pH 7,4; 0,7% de NP_{4}O; MgCl_{2} 1,5
mM; NaF 25 mM; Na_{3}VO_{4} 1 mM; DTT 1 mM), se incubó en hielo
por 10 min y se centrifugó a 100.000 g por 1 h. El sobrenadante
final (S2) se congeló rápidamente en nitrógeno líquido.
El lisado congelado rápidamente se descongeló en
un baño de agua a 37ºC, y se gira por 20 min a 100.000 g. El
sobrenadante se recuperó y se incubó con 0,2 ml de cuentas de
IgG-Agarosa de conejo establecido (Sigma) por 2 h
con agitación constante a 4ºC. Los complejos de proteína
inmovilizados se lavaron con 10 ml de solución reguladora de lisis
CZ (que contiene 1 tableta Complete^{TM} (Roche) por 50 ml de
solución reguladora) y se lavó otra vez con 5 ml de solución
reguladora de división TEV (Tris 10 mM, pH 7,4; NaCl 100 mM; 0,1% de
IGEPAL; EDTA 0,5 mM; DTT 1 mM). Los complejos de proteína se
eluyeron mediante incubación con 5\mul de proteasa TEV (GibcoBRL,
Cat.No. 10127-017) por 1 h a 16ºC en 150 \mul de
solución reguladora de división TEV. El eluido se recuperó y
combinó con 0,2 ml de cuentas de afinidad de Calmodulin establecidas
(Stratagene) en 0,2 ml de solución reguladora de enlace CBP (Tris
10 mM, pH 7,4; NaCl 100 mM; 0,1% de IGEPAL; MgAc 2 mM; Imidazol 2
mM; DTT 1 mM; CaCl2 4 mM) seguido por 1 h de incubación a 4ºC con
agitación constante. Los complejos de proteína inmovilizados se
lavaron con 10 ml de solución reguladora de lavado CBP (Tris 10 mM,
pH 7.4; NaCl 100 mM; 0,1% de IGEPAL; 1 mM MgAc; Imidazol 1 mM; DTT
1 mM; CaCl_{2} 2 mM) y se eluye por adición de 600 \mul de CBP
solución reguladora de elución (Tris 10 mM, pH 8,0; EGTA 5 mM) por 5
min a 37ºC. El eluido se recuperó en un tubo siliconizado y se
liofilizó. La resina de Calmodulina remanente se sometió a
ebullición por 5 min en 50 \mul 4x solución reguladora de la
muestra Laemmli. La solución reguladora de la muestra se aisló, se
combinó con la fracción liofilizada y se cargó en un gel de
gradiente NuPAGE (Invitrogen, 4-12%, 1,5 mm, 10
pozos).
Parte
5
Las proteínas separadas en gel se redujeron,
alquilaron y digirieron en gel esencialmente continuando el
procedimiento descrito por Shevchenko et al., 1996, Anal.
Chem. 68:850-858. Brevemente, las proteínas
separadas en gel se retiraron por incisión del utilizando un
bisturí limpio, reducido utilizando DTT 10 mM (en bicarbonato de
amonio 5 mM, 54ºC, 45 min) y posteriormente se alquilaron con
yodoacetamida 55 mM (en bicarbonato de amonio 5 mM) a temperatura
ambiente en la oscuridad (30 min). Las proteínas reducidas y
alquiladas se digirieron en gel con tripsina de porcino (Promega) a
una concentración de proteasa de 12,5 ng/\mul en bicarbonato de
amonio de 5 mM. La digestión se dejó proceder por 4 horas a 37ºC y
la reacción posteriormente de detuvo utilizando 5 \mul de ácido
fórmico al 5%.
Los tapones de gel se extrajeron dos veces con
20 \mul de TFA al 1% y se mezclaron con sobrenadantes digeridos
acidificados. Las muestras se secaron en una centrífuga a vacío y se
resuspendieron en 13 \mul de TFA al 1%.
Las muestras de péptidos se inyectaron en un
sistema espectrómetro de masas LC nano (CapLC, Waters o Ultimate,
Dionex) que se acopló directamente tanto a un quadrupole TOF (QTOF2,
QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass o un QSTAR Pulsar, Sciex) como a
una trampa de iones (LCQ Deca XP). Los péptidos se separaron en el
sistema LC utilizando un gradiente de solventes acuoso y orgánico
(ver más adelante). El solvente A fue 5% de acetonitrilo en ácido
fórmico al 0,5% y solvente B fue 70% de acetonitrilo en ácido
fórmico al 0,5%.
Los péptidos que eluyen completamente en el
sistema LC se secuenciaron parcialmente dentro del espectrómetro de
masas.
Los datos de masa y fragmentación del péptido,
generados en los experimentos LC-MS/MS se utilizaron
para consultar las bases de datos de la proteína formateada fasta y
la secuencia de nucleótidos, mantenidas y actualizadas regularmente
en la NCBI (para el NCBInr, dbEST y los genomas humanos y de ratón)
y European Bioinformatics Institute (EBI, para las bases de datos
de proteomas humanos, ratón, D. melanogaster y C.
elegans). Las proteínas se identificaron correlacionando los
datos de masa y la fragmentación del péptido medidos con los mismos
datos calculados a partir de las entradas en la base de datos
utilizando el software tool Mascot (Matrix Science; Perkins et
al., 1999, Electrophoresis 20:3551-3567). Los
criterios de búsqueda varían dependiendo de cual espectrómetro de
masas se utiliza para el análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Observamos que, los siARNs semejantes dirigidos
contra los conocidos ejecutores del procedimiento de APP, BACE1 y
nicastrina, el GPR49 blanco del ARNsi causó atenuación significante
de la secreción de A\beta1-42, mientras que el
Luc3 ARNsi no tuvo ningún efecto (Figura 2A) - demostrando que GPR49
juega un papel funcional en la regulación del
procedimiento/secreción de APP.
Confirmamos luego que el GPR49 ARNsi ciertamente
interfiere con la expresión del GPR49 (Figura 2B).
Una estrategia de perturbación de la expresión
génica del ARNi, se empleó para una validación funcional de GPR49
como un ejecutador del procedimiento de APP: Un ARNsi dirigido
contra GPR49 o siARNs dirigido contra conocidos ejecutores del
procedimiento de APP, BACE1 o nicastrina, o contra Luc3 no
relacionado fue transfectado en las células de neuroblastona
SK-N-BE2 expresando el APP695
humano. El ARNsi para el GPR49 humano se sintetizó por Dharmacon
Research Inc.
La secuencia de ARNsi utilizada para GPR49 fue:
AACAGCAGTATGGACGACCTT.
La transfección de células
SK-N-BE2 se realizó utilizando
LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Brevemente, las células se sembraron a una densidad de
1,0 x 10^{4} células en un volumen final de 85 \mul por
96-pozos 12-16 horas previo a la
transfección. 25 nM de siARNs se mezclaron con 8 \mul de solución
reguladora Opti-MEM (Gibco) y 60 ng de ADN portador,
y la mezcla se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente antes
de adicionar a las células. A las 16 y 48 horas de
pos-transfeción el medio se reemplazó con 100
\mul o 200 \mul de medio de crecimiento con o sin suero,
respectivamente. A las 72 horas de pos-transfección
100 \mul de sobrenadante se cosecharon por ELISA
A\beta1-42 (Innogenetics). El ensayo se realizó
siguiendo las instrucciones del fabricante.
La eficiencia de silenciación de los siARNs
seleccionados se evalúo por RT-PCR cuantitativo.
Brevemente, 5x 10º5 SKNBE2 células se sembraron en placas por
6-pozos y se transfectaron con 25 nM de ARNsi al
siguiente día. 36 h después de la transfección, las células se
cosecharon y se preparó el ARN total y
transcrito-reverso utilizando procedimientos
estándar. Cantidades iguales de cebadores específicos de cADNs y
GPR49 se utilizaron para la determinación de los niveles de
expresión relativos de GPR49 siguiendo las instrucciones del
fabricante. Todos los valores se normalizaron a un ARN de
referencia humana (Stratagene).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las casacadas de transducción de señal
accionadas por GPR49 se desconocen actualmente. Otros miembros de la
familia, sin embargo, receptores de glicohormona humana así como el
ortólogo LGR putativo distante filogenéticamente en nematodos (Kudo
M, Chen T, Nakabayashi K, Hsu SY, Hsueh AJ. (2000) El homólogo de la
proteína del receptor acoplado a la proteína G (LGR), que contiene
la repetición del nematodo rico en leucina, para los receptores
gonadotropina y tirotropina del vertebrado es activo
constitutivamente en las células de mamífero. Mol Endocrinol.
14(2):272-84), ha demostrado que la señal a
través de mecanismos dependientes de la adenilato ciclasa. El más
reciente, cuando heterologamente expresada en las células de
mamífero causa incrementos constitutivos en niveles celulares de
monofosfato adenosina cíclico (cAMP).
Para confirmar que GPR49 hace pareja con la ruta
cAMP, varios ensayos disponibles en el dominio público se pueden
utilizar. Por ejemplo, Bresnick et al. (Bresnick JN, Skynner
HA, Chapman KL, Jack AD, Zamiara E, Negulescu P, Beaumont K, Patel
S, McAllister G (2003) Identification of signal transduction
pathways used by orphan g protein-coupled
receptors. El ensayo Drug Dev Technol.
1(2):239-49.) ha utilizado
beta-lactamasa construcciones indicadoras para
identificar la transducción de sistemas de señal utilizados por
GPRCs huérfanos.
Los moduladores GPR49 luego se identifican
basándose en su capacidad para desencadenar elevaciones celulares
en cAMP que se observan en las células que expresan GPR49 pero no en
GPR49-deficiente. Las mediciones directas de cAMP
pueden, por ejemplo, hacerse en un formato de alto rendimiento
utilizando líneas celulares indicadoras
(CRE)-luciferasa elemento
respuesta-cAMP (Gabriel D, Vernier M, Pfeifer MJ,
Dasen B, Tenaillon L, Bouhelal R (2003) High throughput screening
technologies for direct cyclic AMP measurement. Assay Drug Dev
Technol. 1(2):291-303). Otros métodos para
la determinación de las elevaciones cAMP o señalización
cAMPdependiente son apreciables por alguien de habilidad en el
oficio. Para una revisión de los precedentes para la identificación
de pequeños moduladores de la molécula de previamente GPCRs
huérfano, ver (Howard AD, McAllister G, Feighner SD, Liu Q, Nargund
RP, Van der Ploeg LH, Patchett AA (2001) Orphan
G-protein-coupled receptors and
natural ligand discovery. Trends Pharmacol Sci.
22(3):132-40).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Las células SKNBE2 (u otra apropiada línea
celular) establemente sobre-expresada humana APP695
(ShNBE2/
APP695) o un mutante apropiado con división cinética de la beta-/gama-secretasa mejorada se colocan en placas en medio de crecimiento y suero cosechado por 4 h la siguiente mañana. Un modulador GPR49, preferiblemente inhibidor, diluido en medio libre de suero, luego se adiciona y se incuba por periodos de tiempo apropiados. Los sobrenadantes celulares se recolectaron y se determinaron los niveles de A\beta1-42 por ELISA (Innotest \beta-amiloide (1-42) de INNOGENETICS N.V., Belgium).
APP695) o un mutante apropiado con división cinética de la beta-/gama-secretasa mejorada se colocan en placas en medio de crecimiento y suero cosechado por 4 h la siguiente mañana. Un modulador GPR49, preferiblemente inhibidor, diluido en medio libre de suero, luego se adiciona y se incuba por periodos de tiempo apropiados. Los sobrenadantes celulares se recolectaron y se determinaron los niveles de A\beta1-42 por ELISA (Innotest \beta-amiloide (1-42) de INNOGENETICS N.V., Belgium).
La invención se describe con más detalle en las
siguientes figuras:
Figura 1: Representación esquemática de los
puntos de entrada TAP (blanco) que fueron encontrados para
interactuar con GPR49.
Figura 2: silenciación mediada por ARNsi de
expresión de GPR49 atenúa la generación/secreción de
A\beta1-42.
Fig. 2A: siARNs dirigido contra BACE1,
nicastrina, GPR49 o Luc3 se transfectaron en las células de
neuroblastona SK-N-BE2
sobre-expresado APP695. 48 h después de la
transfección, el medio de crecimiento se retiró y las células se
incubaron durante la noche en medio libre de suero. Los
sobrenadantes se recolectaron y los niveles de
A\beta1-42 se determinaron por ELISA (Innotest
\beta-amiloide (1-42) de
INNOGENETICS N.V., Belgium). Al menos tres experimentos
independientes se llevaron a cabo por duplicado. Un ejemplo
representativo se muestra.
Fig. 2B: Un ARNsi dirigido contra GPR49, pero no
dirigido contra Luc3 no relacionado, específicamente reduce el mARN
de GPR49 como se evaluaron mediante, el análisis cuantitativo
RT-PCR. Dos barras mostraron para cada ARNsi
representa dos experimentos independientes.
Figura 3: Secuencia de aminoácido de GPR humana
(LGR5; receptor 5 acoplado a la proteína G rico en leucina que
contiene una repetición), representado en el código de una
letra.
Figura 4: Secuencia de alineación múltiple de
LGR4, LGR5/GPR49 y LGR6 humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (9)
1. Uso de un inhibidor de GPR49 seleccionado del
grupo que consiste de anticuerpos, oligonucleótidos antisentido,
ARNsi, y ribozimas, para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad
neurodegenerativa.
2. El uso de la reivindicación 1, en donde GPR49
es parte de un complejo de proteínas intracelular.
3. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 o 2, en donde el inhibidor modula la actividad de la
gama-secretasa y/o
beta-secretasa.
4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3, en donde la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de
Alzheimer.
5. Un método para identificar un modulador
gama-secretasa y/o a beta-secretasa,
que comprende las siguientes etapas:
a. identificación de una molécula que interactúa
con GPR49 mediante la determinación, si un compuesto de prueba dado
es una molécula que interactúa con GPR49,
b. determinación si la molécula que interactúa
con GPR49 de la etapa a) es capaz de modular la actividad de la
gama-secretasa y/o la
beta-secretasa.
6. El método de la reivindicación 5, en donde en
la etapa a) el compuesto de prueba se pone en contacto con GPR49 y
se determina la interacción de GPR49 con el compuesto de prueba.
7. El método de la reivindicación 6, en donde la
interacción del compuesto de prueba con GPR49 resulta en una
inhibición de la actividad de GPR49.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, en donde en la etapa b) se mide, la
capacidad de la gama-secretasa y/o la
beta-secretasa para dividir APP, preferiblemente, en
donde se mide la capacidad de producir Abeta 42.
9. Uso de un inhibidor de GPR49 para la
inhibición de la actividad in vitro de la
beta-secretasa y/o la
gama-secretasa, en donde el inhibidor es una
molécula seleccionada del grupo que consiste de anticuerpos,
oligonucleótidos antisentido, ARNsi, y ribozimas.
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