ES2295949T3 - Tratamiento de enfermedades neurodegenerativas mediante el uso de inhibidores de degs. - Google Patents

Abstract

El uso de un inhibidor de DEGS seleccionado del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, el siARN y los ribozimas para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Description

Tratamiento de enfermedades neurodegenerativas mediante el uso de inhibidores de DEGS.

La presente invención se relaciona con el papel de DEGS en la elaboración de la APP y el uso de inhibidores de DEGS en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

La enfermedad de Alzheimer es una condición crónica que afecta millones de individuos en todo el mundo.

El cerebro de los pacientes de la enfermedad de Alzheimer muestra una patología característica de lesiones neuropatológicas prominentes, tales como los inicialmente intracelulares enredos neurofibrilares (NFTs), y las placas seniles extracelulares ricas en amiloides. Estas lesiones se asocian con la pérdida masiva de poblaciones de neuronas CNS y su progresión acompaña la demencia clínica asociada con AD. El principal componente de las placas amiloides son los péptidos beta amiloides (A-beta, Abeta o A\beta) de varias longitudes. Una variante de estos, que es el A\beta1-42-péptido (Abeta-42) es el principal agente causativo para la formación amiloide. Otra variante es el A\beta1-40-péptido (Abeta-40). El beta amiloide es el producto proteolítico de un precursor de proteína, precursor de la proteína beta amiloide (beta-APP o APP). La APP es una proteína tipo-I trans-membrana que se divide secuencialmente mediante varias proteasas membrana-asociada diferentes. La primera división de la APP ocurre por una de dos proteasas, alfa-secretasa o beta-secretasa. La alfa secretasa es una metaloproteasa cuya actividad lo más probable es que se proporcionada por una o una combinación de las proteínas ADAM10 y ADAM17. La división mediante alfa-secretasa previene la formación de péptidos amiloides y es así como se hace referencia al no-amiloidogénico. En contraste, la división de APP por beta-secretasa es un prerrequisito para la posterior formación de péptidos amiloides. Esta secretasa, también llamada BACE1 (enzima que divide la APP en el sitio beta), es una proteína tipo-I transmembrana que contiene una actividad aspartil proteasa (se describe en detalle más adelante).

La actividad beta-secretasa (BACE) divide la APP en el ectodominio, resultando en la presencia de APPb soluble, segregada, y en un fragmento del residuo-99 C-terminal transmembrana (APP-C99). Vassar et al. (Science 286, 735-741) clonaron una proteasa aspártica transmembrana que tenía las características de la postulada beta-secretasa de la APP, la cual llamaron BACE1. El cerebro y los cultivos corticales primarios de ratones carentes de BACE1 no mostraron actividad beta-secretasa detectable, y los cultivos corticales primarios de ratones carentes de BACE produjeron mucho menos amiloide-beta a partir de la APP. Esto sugiere que BACE1, más bien que su parálogo BACE2, es la principal beta-secretasa para la APP. BACE1 es una proteína de 501 aminoácidos que contiene un péptido señal 21-aa seguido por un dominio pro-proteína a lo largo de aa 22 a 45. Existen alternativamente formas de empalme, BACE-I-457 y BACE-I-476. El dominio extracelular de la proteína madura se sigue por un dominio transmembrana predicho y una cola C-terminal citosólica corta de 24 aa. Se pronostica que BACE1 es una proteína transmembrana tipo 1 con el sitio activo en el lado extracelular de la membrana, donde la beta-secretasa divide la APP y posiblemente otros sustratos aún no identificados. Aunque BACE1 es claramente una enzima clave requerida para la elaboración de APP en A-beta, una evidencia reciente sugiere sustratos potenciales y funciones adicionales de BACE1 (J. Biol. Chem. 279, 10542-10550). Hasta hoy, ningún BACE1 que interactúe con las proteínas con funciones reguladoras o moduladoras ha sido descrito.

El fragmento de APP generado por la división de BACE1, APP-C99, es un sustrato para la actividad de gamma-secretasa, que se divide APP-C99 dentro del plano de la membrana en un péptido A-beta (tal como el péptido A\beta1-42amiloidogénico), y en un fragmento C-terminal llamado dominio intracelular de APP (AICD) (Annu Rev Cell Dev Biol 19, 25-51). La actividad de la gamma-secretasa reside entre un complejo de multiproteínas con al menos cuatro subunidades distintas. La primera subunidad que se descubrió fue la presenilina (Proc Natl Acad Sci USA 94, 8208-13). Otros conocidos componentes de la proteína del complejo gamma secretasa son Pen-2, Nicastrin y Aph-la.

A pesar de los recientes adelantos en delinear los eventos moleculares fundamentales de la etiología de la enfermedad de Alzheimer, ninguna terapia que modifique la enfermedad ha sido desarrollada hasta ahora. Para este fin, la industria ha luchado para identificar compuestos líderes apropiados para la inhibición de BACE1. Además, se ha reconocido que un número creciente de sustratos alternativos de gamma-secretasa existe, más notablemente la proteína Notch. Por consiguiente, la inhibición de gamma-secretasa es probable que cause el mecanismo-basado en los efectos secundarios. Los fármacos punta actuales (por ejemplo Aricept®/donepezil) intentan lograr una mejora provicional de las funciones cognitivas inhibiendo la acetilcolinesterasa, que resulta en aumento de los niveles del neurotransmisor acetilcolina en el cerebro. Estas terapias no son apropiadas para las últimas etapas de la enfermedad, no tratan la patología fundamental de la enfermedad, y no detienen la progresión de la enfermedad.

De esta manera, hay una necesidad no adecuada para la identificación de objetivos novedosos que permitan estrategias moleculares novedosas para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Adicionalmente, hay una necesidad fuerte para compuestos terapéuticos novedosos que modifican los procesos moleculares antes mencionados dirigiéndose a dichos objetivos novedosos.

En un primer aspecto, la invención proporciona el uso de una molécula que interactúa con DEGS para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.

En el contexto de la presente invención, utilizando ensayos funcionales, se ha encontrado sorprendentemente que DEGS es un objetivo novedoso que permite terapias novedosas para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

La identificación de DEGS como una molécula diana clave permite el uso de moléculas que interactúan con DEGS para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Esto se muestra especialmente en la sección de Ejemplos (abajo) donde se demuestra que siARN se dirige contra DEGS resulta en una secreción/generación reducida o atenuada de Abeta-42 y, menos prominente, de Abeta-40.

En el contexto de la presente invención, una "molécula que interactúa con DEGS" es una molécula que se une al menos temporalmente a DEGS y que preferiblemente modula la actividad de DEGS.

DEGS (dihidroceramida desaturasa; IPI de DEGS humana: IPI00021147.1) también se conoce como sphingolipido \Delta4 desaturasa o DES1. La secuencia de aminoácido de DEGS humana se representa en la Fig. 3. La DEGS humana se localiza en el cromosoma 1q42.12.

DEGS convierte la dihidroceramida en ceramida en la ruta sphingosine-ceramida (ver Fig. 5). El gen correspondiente codifica un miembro de la familia desaturasa de ácido graso de la membrana que es responsable de insertar enlaces dobles en posiciones específicas en ácidos grasos. La proteína se pronostica que sea una membrana múltiple-a lo largo de la proteína localizada en el retículo endoplasmático. Se expresa ampliamente en tejidos humanos. La transfección múltiple de DEGS con el receptor EGF resulto en la disminución de la expresión del receptor pero no afectó la expresión de PDGFR, sugiriendo un papel de un ácido graso desaturasa en la regulación biosintética de la elaboración del receptor EGF.

La expresión patrón de DEGS en tejido humano se ha reportado (Cadena DL, Kurten RC, Gill GN (1997). El producto del gen MLD es un miembro de la familia desaturasa de ácido graso de la membrana: la sobre expresión de MLD inhibe la biosíntesis del receptor EGF. Biochemistry 23, 6960-7). En el contexto de la presente invención, se confirmó que DEGS se expresa más fuertemente en corazón que en riñón, hígado o músculo esquelético. Sin embargo, en el contexto de la presente invención, también se encontró expresión fuerte en el cerebro (aparentemente en contraste con los reportes publicados, Cadena, supra) en particular en áreas afectadas por la enfermedad de Alzheimer (ver Fig. 1).

Una enzima relacionada, DES2 (Sphingolipido \Delta4 desaturasa/C-4 hidroxilasa DES2; IPI00040687.2), muestra actividad enzimática similar. Esta muestra ambas actividades \Delta4 desaturasa y C4-hidroxilasa (Ternes P, Franke S, Zahringer U, Sperling P, Heinz E. (2002) Identification and characterization of a sphingolipid delta 4-desaturase family. J. Biol. Chem. 277, 25512-84). Los patrones de expresión de los dos miembros de la familia DES traslapados (Mizutani Y, Kihara A, Igarashi Y (2004) Identification of the human sphingolipid C4-hydroxylase, hDES2, and its up-regulation during keratinocyte differentiation. FEBS Lett. 563(1-3):93-7). Varias transcripciones de DES2 parecen existir, algunos de ellos se expresan destacadamente en el cerebro.

Una alineación de secuencia de DEGS y DES2 se muestra en la Fig. 4B.

Un ortólogo de DEGS parece existir en ratón (IPI0011373.1). Una alineación de secuencia con DEGS humana se muestra en la Fig. 4A.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "DEGS" no solo significa que la proteína como se muestra en la Fig. 3, pero también un derivado activo funcionalmente de estos, o un fragmento de estos activo funcionalmente, o un homólogo de estos, o una variante codificada por una ácido nucleico que hibridiza al ácido nucleico codificante de dicha proteína bajo condiciones de severidad bajas. Preferiblemente, estas condiciones de severidad bajas incluyen hibridación en una solución reguladora que comprende 35% de formamida, 5X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), EDTA 5 mM, 0.02% de PVP, 0.02% de BSA, 100 ug/ml de ADN esperma de salmón desnaturalizado, y 10% (peso/vol) de dextran sulfato por 18-20 horas a 40ºC, lavando en una solución reguladora que consiste de 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7.4), EDTA 5 mM, y 0.1% de SDS por 1-5 horas a 55ºC, y lavando en una solución reguladora que consiste de 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7.4) EDTA 5 mM, y 0.1% de SDS por 1.5 horas a 60ºC.

Generalmente, el término "activo funcionalmente" según se utiliza aquí se refiere a polipéptido, a saber un fragmento o derivado, que tiene funciones estructurales, reguladoras o bioquímicas de la proteína de acuerdo con la modalidad de la cual este polipéptido, a saber fragmento o derivado se relaciona.

En el caso de DEGS, un derivado activo funcionalmente preferiblemente significa un derivado que ejerce esencialmente la misma actividad como DEGS, por ejemplo se convierte a estearato (y palmitato) en ácidos graso monoinsaturados (en su mayor parte oleato; C18:1) y/o es capaz de jugar un papel similar como DEGS en la secreción de Abeta-42. La actividad de DEGS así como de un derivado activo funcionalmente de estos se puede medir como se describe en Triola G, Fabrias G, Llebaria A (2001) Synthesis of a Cyclopropene Analogue of Ceramide, a Potent Inhibitor of Dihydroceramide Desaturase. Angew Chem Int Ed Engl. 2001 May 18; 40(10):1960-1962.

De acuerdo con la presente invención, el término "actividad" según se utiliza aquí, se refiere a la función de una molécula en su más amplio sentido. Generalmente incluye, pero no se limita a, funciones biológicas, bioquímicas, físicas o químicas de la molécula. Esto incluye por ejemplo la actividad enzimática, la capacidad para interactuar con otras moléculas y la capacidad para activar, facilitar, estabilizar, inhibir, suprimir o desestabilizar la función de otras moléculas, estabilidad, la capacidad de localizar a ciertos emplazamientos subcelulares. Donde sea aplicable, dicho término también se relaciona con la disminución o atenuación de la secreción de Abeta-42 si la molécula se inhibe.

De acuerdo con la presente invención, los términos "derivados" o "análogos" de DEGS o "variantes" según se utiliza aquí preferiblemente incluyen, pero no se limitan a, las moléculas que comprenden regiones que son sustancialmente homólogos al DEGS, en varias modalidades, por al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de identidad sobre una secuencia de aminoácido de tamaño idéntico o cuando comparado con una secuencia alineada en la cual la alineación se hace por un programa de homología de ordenador conocido en el oficio, o cuyo ácido nucleico codificante es capaz de hibridizar a una secuencia codificante de la proteína bajo condiciones rigurosas, moderadamente rigurosas, o no rigurosas. Esto significa que una proteína es el resultado de una modificación de la proteína que ocurre naturalmente, por sustituciones, deleciones y adiciones, aminoácido respectivamente, derivados que aún exhiben la función biológica de la proteína que ocurre naturalmente aunque no necesariamente al mismo grado. La función biológica de tales proteínas puede por ejemplo ser examinada por apropiados ensayos disponibles in vitro como se proporciona en la invención.

El término "fragmento" según se utiliza aquí se refiere a un polipéptido de al menos 10, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos de la proteína, particularmente DEGS, de acuerdo con la modalidad. En modalidades específicas, tales fragmentos no son más grandes de 35, 100 o 200 aminoácidos.

El término "gen" según se utiliza aquí se refiere a un ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de, si no se indica de otra manera, la presente invención, incluyendo ambas secuencias exón y opcionalmente intrón.

Los términos "homólogo" o "productos de gen homólogos" según se utiliza aquí significan una proteína en otras especies, preferiblemente mamíferos, que realizan la misma función biológica como la proteína descrita aquí, en particular DEGS. Tales homólogos también se llaman "productos de gen ortólogos". El algoritmo para la detección de pares gen ortólogo de humanos y mamíferos u otras especies usa el genoma completo de estos organismos.

En primer lugar, los pares de mejores resultados se recuperan, utilizando una alineación Smith-Waterman completa de las proteínas predichas. Para mejorar aún más la fiabilidad, estos pares se agrupan con pares de mejores resultados que involucran las proteínas Drosophila melanogaster y C. elegans. Dicho análisis se da, por ejemplo, en Nature, 2001, 409:860-921. Los homólogos de las proteínas de acuerdo con la invención pueden ser aislados sobre la base de la homología de la secuencia de los genes codificantes de la proteína proporcionada aquí para los genes de otras especies clonando el gen respectivo aplicando tecnología convencional y expresando la proteína de dicho gen, o por otros métodos apropiados comúnmente conocidos en el oficio.

En una modalidad preferida de la presente invención, la molécula que interactúa con DEGS es un inhibidor de DEGS.

De acuerdo con la presente invención el término "inhibidor" se refiere a un compuesto bioquímico o químico, que preferiblemente inhibe o reduce la actividad de DEGS. Esto puede por ejemplo ocurrir vía supresión de la expresión del gen correspondiente. La expresión del gen se puede medir por análisis RT-PCR o Western blot. Adicionalmente, esto puede ocurrir vía inhibición de la actividad, por ejemplo uniendo al DEGS.

Ejemplos de tales inhibidores de DEGS se proteínas de enlace o péptidos de enlace dirigidos contra DEGS, en particular contra el sitio activo de DEGS, y ácidos nucleicos dirigidos contra el gen DEGS.

Ejemplos de inhibidores de DEGS comprenden análogos de ciclopropeno de ceramida. Su efecto en dihidroceramida desaturasa se ha descrito recientemente (Triola G, Fabrias G, Casas J, Llebaria A. (2003) Synthesis of cyclopropene analogues of ceramide and their effect on dihydroceramide desaturase. J. Org. Chem. 68(26):9924-32). N-[(1R,2S)-2-hidroxi-l-hidroximetil-2-(2-tridecil-l-ciclopropenil)etil]octanamida (GT11) es un inhibidor competitivo con un Ki de 6 \muM.

El término "ácidos nucleicos contra DEGS" se refiere a un ADN bicatenario o monocatenario o ARN, o una modificación o derivado de estos que, por ejemplo, inhibe la expresión del gen DEGS o la actividad de DEGS e incluye, sin limitación, ácidos nucleicos antisentido, aptameros, siARNs (ARNs que interfiere pequeño) y ribozimas.

Preferiblemente, el inhibidor se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, siARN, moléculas de peso molecular bajo (LMWs), péptidos de enlace, aptameros, ribozimas y peptidomiméticos.

LMWs son moléculas que no son proteínas, péptidos, anticuerpos o ácidos nucleicos, y que exhiben un molecular peso de menos de 5000 Da, preferiblemente menor de 2000 Da, más preferiblemente menor de 2000 Da, más preferiblemente menor de 500 Da. Dicho LMWs puede ser identificado en procedimientos de alto rendimiento a partir de bibliotecas. Tales métodos son conocidos en el oficio y se discuten con detalle abajo.

Estos ácidos nucleicos se pueden administrar directamente a una célula, o que se puede producir vía intracelular por transcripción de secuencias introducidas, exógenos.

Un ácido nucleico "antisentido" según se utiliza aquí se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridizar a una porción específica de la secuencia de ARN que codifica una proteína (preferiblemente mARN) en virtud de alguna complementariedad de la secuencia. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una región codificada y/o no codificada de un mARN. Tales ácidos nucleicos antisentido que inhiben la expresión o la actividad de la proteína tienen utilidad como terapéuticos, y se pueden utilizar en el tratamiento o prevención de los desórdenes como se describen aquí.

Los ácidos nucleicos antisentido son de por lo menos seis nucleótidos y son preferiblemente oligonucleótidos, que fluctúan de 6 a aproximadamente 200 nucleótidos. En aspectos específicos, el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, o al menos 200 nucleótidos.

Los ácidos nucleicos, por ejemplo los ácidos nucleicos antisentido o siARNs, se pueden sintetizar químicamente, por ejemplo de acuerdo con el método fosfotriéster (ver, por ejemplo, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584). Los aptameros son ácidos nucleicos que se unen con alta afinidad a un polipéptido, aquí DEGS. Los aptameros se pueden aislar por métodos de selección tal como SELEX (ver por ejemplo Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US 5,582,981) de una mezcla grande de diferentes moléculas de ARN monocatenario. Los aptameros también pueden ser sintetizados y seleccionados en su forma contra-imagen, por ejemplo como el L-ribonucleótido (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Las formas que han sido aisladas de esta manera cuentan con la ventaja que no se degradan por las ribonucleasas que ocurren naturalmente y, por consiguiente, poseen una mayor estabilidad.

Los ácidos nucleicos se pueden degradar por endonucleasas o exonucleasas, en particular por DNases y RNases que se pueden encontrar en la célula. Esto es, por consiguiente, ventajoso para modificar los ácidos nucleicos con el fin de estabilizarlos contra la degradación, por esta razón se garantiza que una alta concentración del ácido nucleico se mantiene en la célula durante un largo periodo de tiempo (Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116). Usualmente, dicha estabilización se puede obtener introduciendo uno o más grupos de fósforo internucleótido o introduciendo uno o más internucleótidos no-fósforo.

Los internucleótidos modificados apropiados recopilados en Uhlmann y Peyman (1990), supra (ver también Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116). Los radicales fosfato internucleótido modificados y/o puentes no-fósforo en un ácido nucleico que puede ser empleado en uno de los usos de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, metil fosfonato, fosforotioato, fosforamidato, fosforoditioato y/o ésteres fosfato, mientras que análogos internucleótido sin-fósforo contienen, por ejemplo, puentes siloxano, puentes carbonato, carboximetil ésteres, puentes acetamida y/o puentes tioéter. También la intención es que esta modificación debería mejorar la durabilidad de una composición farmacéutica que puede ser empleada en uno de los usos de acuerdo con la invención. En general, el oligonucleótido se puede modificar en la fracción base, fracción azúcar, o esqueleto de fosfato.

El oligonucleótido puede incluir otros grupos anexos tal como péptidos, agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; International Patent Publication No. WO 88/09810) o barrera hemato encefálica (ver, por ejemplo, Publicación de la Patente Internacional No. WO 89/10134), agentes de división que provocan la hibridación (ver, por ejemplo, Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958-976), o agentes intercalantes (ver, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549).

En detalle, los oligonucleótidos antisentido pueden comprender al menos una fracción base modificada que se selecciona del grupo incluyendo pero no limitando a 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-yodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracil, 5-carboxihidroxilmetilaminometil-2-tio-uridina, 5-carboximetilaminometiluracil, dihidrouracil, D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5-metoxiaminometil-2-tiouracil, D-mannosilqueosina, 5N-methoxicarboximetiluracil, 5-methoxiuracil, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracil, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, ácido uracil-5-oxiacético metiléster, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracil, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina.

En otra modalidad, el oligonucleótido comprende al menos una fracción de azúcar modificado seleccionado del grupo incluyendo, pero no limitando a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa.

El uso de ácidos nucleicos antisentido apropiados adicionalmente se describe por ejemplo en Zheng and Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2; Nellen and Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci., 18, 419-23, Stein (1992) Leukemia, 6, 697-74 o Yacyshyn, B. R. et al. (1998) Gastroenterology, 114, 1142).

En aún otra modalidad, el oligonucleótido es un 2-a-anomérico oligonucleótido. Un a-anomérico oligonucleótido forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en que, contrario a las \beta-unidades usuales, las hebras corren en paralelo a cada otra (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641).

El oligonucleótido se puede conjugar a otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente reticulante que provoca la hibridación, agente de transporte, agente de división que provoca hibridación, etc.

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Hasta el final de la invención, los oligonucleótidos de la invención se pueden sintetizar por métodos estándar conocidos en el oficio, por ejemplo, por uso de un sintetizador de ADN automatizado (tal como son comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, fosforotioato oligo-nucleótidos se pueden sintetizar por el método de Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209), oligonucleótidos metilfosfonato se pueden preparar por uso de soportes de polímero de vidrio de poro controlado (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448-7451), etc.

En una modalidad específica, los oligonucleótidos antisentido comprenden ARNs catalíticos, o ribozimas (ver, por ejemplo, Publicación de Patente Internacional No. WO 90/11364; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). En otra modalidad, el oligonucleótido es un 2'-0-metilribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148), o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).

En una modalidad alternativa, los ácidos nucleicos antisentido de la invención se producen vía intracelular por transcripción de una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector se puede introducir in vivo tal que se ocupa por una célula, dentro la célula que el vector o una porción de estos se transcribe, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN) de la invención. Tal vector debería contener una secuencia codificante de la proteína. Tal vector puede permanecer episomal o llegar a ser cromosomáticamente integrados, tan largo como se puede transcribir para producir el ARN antisentido deseado. Tales vectores se pueden construir por métodos estándar de tecnología de ADN recombinante en el oficio. Los vectores pueden ser plásmido, viral, u otros conocidos en el oficio que es capaz de replicar y expresar en células de mamífero. La expresión de las secuencias que codifican el ARNs antisentido puede ser por cualquier promotor conocido en el oficio para actuar en células de mamífero, preferiblemente humano. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores incluyen, pero no se limitan a, la región del promotor primero SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en el 3' de largo terminal repite del virus de sarcoma Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor del herpes timidinaquinasa (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen metalotioneina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), etc.

Los ácidos nucleicos antisentido de la invención comprenden una secuencia complementaria a al menos una porción de un transcripción de ARN de un gen de la proteína, preferiblemente un gen humano, más preferiblemente el gen humano de DEGS. Sin embargo, la absoluta complementariedad, aunque se prefiere, no se requiere. Una secuencia "complementaria a al menos una porción de un ARN", como se refiere aquí, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad que sea capaz de hibridizar con el ARN, que forma un duplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido bicatenarios, un monocatenario del ADN duplex puede de esta manera ser probado, o formación triple se puede ensayar. La capacidad de hibridizar dependerá tanto del grado de complementariedad y de la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, cuanto más largo la hibridización del ácido nucleico, más incompatibilidades base con un ARN puede contener y aún formar un doble estable (o triple, según el caso). Una habilidad en el oficio puede averiguar un grado tolerable de incompatibilidad por el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo de hibridización.

La producción y uso de siARNs como herramientas para la interferencia de ARN en el proceso para reducir o apagar completamente la expresión génica, aquí la expresión del gen DEGS, por ejemplo se describe en Elbashir, S. M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188 o Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature, 411, 494. Preferiblemente, siARNs muestra una longitud menor de 30 nucleótidos, en donde el tramo de identidad del tramo de sentido del siARN es preferiblemente de al menos 19 nucleótidos.

Los ribozimas también son apropiadas herramientas para inhibir la traducción de los ácidos nucleicos, aquí el gen de DEGS, porque ellos son capaces de unir específicamente y cortar los mARNs. Ellos se describen por ejemplo en Amarzguioui et al. (1998) Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175-202; Vaish et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5237-42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15, 921-2 o Couture and Stinchcomb (1996) Trends Genet., 12, 510-5.

Las composiciones farmacéuticas de la invención, que contienen una cantidad efectiva de un ácido nucleico en un vehículo farmacéuticamente aceptable, se pueden administrar a un paciente que tiene una enfermedad o desorden que es de un tipo que expresa o sobre expresa DEGS.

La cantidad del ácido nucleico que será efectiva en el tratamiento de un desorden particular o condición dependerá de la naturaleza del desorden o condición, y puede ser determinada por técnicas clínicas estándar. Cuando sea posible, es deseable determinar la citotoxicidad del ácido nucleico in vitro, y luego en sistemas de modelo de animales útiles, previo a la prueba y uso en humanos.

En una modalidad específica, las composiciones farmacéuticas que comprenden ácidos nucleicos se administran vía liposomas, micropartículas, o microcápsulas. En varias modalidades de la invención, puede ser útil para utilizar tales composiciones lograr la liberación sostenida de los ácidos nucleicos. En una modalidad específica, puede ser deseable utilizar liposomas dirigidas vía anticuerpos para tipos de células del sistema nervioso central identificable específico. (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2448-2451; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:16337-16342).

El término "proteína de enlace" o "péptido de enlace" se refiere a una clase de proteínas o péptidos que unen e inhiben DEGS, e incluye, sin limitación, anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos de anticuerpo y armazones proteínicos dirigidos contra DEGS.

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De acuerdo con la presente invención el término anticuerpo o fragmento de anticuerpo también se entiende como que significa anticuerpos o partes de estos que unen el antígeno, que han sido preparados recombinantemente y, cuando es apropiado, modifica, tal como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos multifuncionales, anticuerpos biespecíficos u oligoespecíficos, anticuerpos monocatenarios y fragmentos F(ab) o F(ab)2 (ver, por ejemplo, EP-B1-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213 o WO 98/24884), preferiblemente se producen con la ayuda de una biblioteca de la expresión FAB.

Como una alternativa a los anticuerpos clásicos también es posible, por ejemplo, utilizar armazones proteínicos contra DEGS, por ejemplo anticalinas que se basan en la lipocalina (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903). Los sitios de enlace-ligandos naturales de las lipocalinas, por ejemplo el retinol-proteína de enlace o la bilina-proteína de enlace, se puede alterar, por ejemplo por medio de una metodología "diseño de proteína combinatoria", de tal manera que se unen a los haptenos seleccionados, aquí a los DEGS (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50). Otros armazones proteínicos conocidos se conocen por ser alternativas a los anticuerpos para reconocimiento molecular (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167-187).

El procedimiento para preparar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo se lleva a cabo de acuerdo con métodos que son bien conocidos por alguien de habilidad, por ejemplo inmunizando un mamífero, por ejemplo un conejo, con DEGS, cuando es apropiado en la presencia de, por ejemplo, adyuvante de Freund y/o geles de hidróxido de aluminio (ver, por ejemplo, Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349). Los anticuerpos policlonales que se forman en el animal como un resultado de una reacción inmunológica pueden posteriormente ser aislados de la sangre utilizando métodos bien conocidos y, por ejemplo, purificados por medio de cromatografía de columna. Los anticuerpos monoclonales pueden, por ejemplo, ser preparados de acuerdo con el método conocido de Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299).

En detalle, los anticuerpos policlonales se pueden preparar según lo descrito arriba inmunizando un sujeto apropiado con un polipéptido como un inmunógeno. Las composiciones de anticuerpo policlonal preferidos son las mismas que han sido seleccionadas para anticuerpos dirigidos contra un polipéptido o polipéptidos de la invención. Particularmente las preparaciones preferidas de anticuerpo policlonal son aquellas que contienen solamente anticuerpos dirigidos contra un polipéptido o polipéptido dado. Particularmente las composiciones de inmunógenos preferidas son aquellas que no contienen otras proteínas humanas tales como, por ejemplo, composiciones de inmunógenos hechas utilizando una célula huésped no-humana para la expresión recombinante de un polipéptido de la invención. De tal manera, solamente el epitope o epitopes humanos reconocidos por composiciones de anticuerpos resultantes construidos contra este inmunógeno estará presente como parte de un polipéptido o polipéptidos de la invención.

El título de anticuerpo en el sujeto inmunizado se puede monitorear durante el tiempo por técnicas estándar, tal como con un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) utilizando un polipéptido inmovilizado. Si se desea, las moléculas del anticuerpo se pueden aislar del mamífero (por ejemplo, a partir de la sangre) y adicionalmente purificar por técnicas bien conocidas, tal como cromatografía de proteína A para obtener la fracción IgG. Alternativamente, los anticuerpos específicos para una proteína o polipéptido de la invención se pueden seleccionar por (por ejemplo, parcialmente purificado) o purificar por, por ejemplo, cromatografía de afinidad. Por ejemplo, una proteína de la invención expresada y purificada (o parcialmente purificada) recombinantemente se produce según lo descrito aquí, y acoplada covalente o no-covalentemente a un soporte sólido tal como, por ejemplo, una columna de cromatografía. La columna luego se puede utilizar para purificación por afinidad de los anticuerpos específicos para las proteínas de la invención a partir de una muestra que contiene los anticuerpos dirigidos contra un gran número de epitopes diferentes, por esta razón desarrolla una composición de anticuerpos purificados sustancialmente, i.e., una que es sustancialmente libre de anticuerpos contaminados. Por una composición de anticuerpos purificada sustancialmente se entiende, en este contexto, que la muestra del anticuerpo contiene como máximo solo 30% (en peso seco) de anticuerpos contaminados dirigidos contra los epitopes, otros diferentes de aquellos en la proteína o polipéptido deseados de la invención, y preferiblemente como máximo 20%, aún más preferiblemente como máximo 10%, y más preferiblemente como máximo 5% (en peso seco) de la muestra es anticuerpos contaminados. Una composición de anticuerpos purificada significa que al menos 99% de los anticuerpos en la composición se dirigen contra la proteína o polipéptido deseados de la invención.

En un tiempo apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos del anticuerpo específico son más altos, las células que producen anticuerpos se pueden obtener a partir del sujeto y utilizar para preparar anticuerpos monoclonales por técnicas estándar, tal como la técnica de hibridoma originalmente descrito por Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497, the human B cell hybridoma technique (Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72), la técnica EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas es bien conocida (por lo general ver Current Protocols in Immunology 1994, Coligan et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Las células hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan por selección de sobrenadantes de cultivo de hibridoma para los anticuerpos que se unen al polipéptido de interés, por ejemplo, utilizando un ensayo de ELISA estándar.

Una alternativa para preparar hibridomas que secretan el anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal dirigido contra un polipéptido de la invención se puede identificar y aislar por selección de una biblioteca de inmunoglobulina combinatorial recombinante (por ejemplo, un biblioteca de expresión en fago de anticuerpo) con el polipéptido de interés. Los Kits para desarrollar y seleccionar las bibliotecas de expresión en fago son comercialmente disponibles (por ejemplo, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; and the Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612). Adicionalmente, ejemplos de métodos y reactivos particularmente sensibles para utilizar en el desarrollo y selección de la biblioteca de expresión de anticuerpos se pueden encontrar en, por ejemplo, Patente U.S. No. 5,223,409; Publicación PCT No. WO 92/18619; Publicación PCT No. WO 91/17271; Publicación PCT No. WO 92/20791; Publicación PCT No. WO 92/15679; Publicación PCT No. WO 93/01288; Publicación PCT No. WO 92/01047; Publicación PCT No. WO 92/09690; Publicación PCT No. WO 90/02809; Fuchs et al., 1991, Bio/ Technology 9:1370-1372; Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281; Griffiths et al., 1993, EMBO J. 12:725-734.

Adicionalmente, los anticuerpos recombinantes, tal como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden ambas porciones humanas y no-humanas, que se pueden hacer utilizando técnicas estándar de ADN recombinante, están dentro del alcance de la invención. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual las diferentes porciones se derivan a partir de diferentes especies de animales, tal como aquellas que tienen una región variable derivada a partir de una región constante de inmunoglobulina humana y murine mAb. (Ver, por ejemplo, Cabilly et al., Patente U.S. No. 4,816,567; and Boss et al., Patente U.S. No. 4,816,397, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad). Los anticuerpos humanizados son moléculas del anticuerpo a partir de especies no-humanas que tienen una o más regiones que determinan la complementariedad (CDRs) a partir de las especies no-humanas y una región de armadura a partir de una molécula de inmunoglobulina humana. (Ver, por ejemplo, Queen, Patente U.S. No. 5,585,089, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad). Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se puede producir por técnicas de ADN recombinante conocidas en el oficio, por ejemplo utilizando métodos descritos en la Publicación PCT No. WO 87/02671; Aplicación de la Patente Europea 184,187; Aplicación de la Patente Europea 171,496; Aplicación de la Patente Europea 173,494; Publicación PCT No. WO 86/01533; Patente U.S. No. 4,816,567; Aplicación de la Patente Europea 125,023; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446-449; and Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4:214; Patente U.S. 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; y Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.

Los anticuerpos humanos completamente son particularmente deseables para un tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Tales anticuerpos se puede producir, por ejemplo, utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y liviana de humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener utilizando tecnología de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana hospedados por los ratones transgénicos dispuestos de otro modo durante la diferenciación de la célula B, y experimentando posteriormente intercambio de clase y mutación somática. De esta manera, utilizando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una detallada discusión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos humanos monoclonales y los protocolos para producir dichos anticuerpos, ver, por ejemplo, Patente U.S. 5,625,126; Patente U.S. 5,633,425; Patente U.S. 5,569,825; Patente U.S. 5,661,016; y Patente U.S. 5,545,806. Adicionalmente, las compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA), pueden ser contratadas para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando tecnología similar a la descrita anteriormente.

En su totalidad los anticuerpos humanos que reconocen un epitope seleccionado se pueden generar utilizando una técnica referida como "selección dirigida". En esta metodología un anticuerpo monoclonal no-humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo murine, se utiliza para guiar la selección de un anticuerpo humano completamente reconociendo el mismo epitope. (Jespers et al., 1994, Bio/technology 12:899-903).

Los fragmentos de anticuerpo que contienen los idiotipos de una proteína, en particular DEGS, se pueden generar por técnicas conocidas en el oficio. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, el fragmento F(ab')2 que se puede producir por digestión con pepsina de la molécula del anticuerpo; el fragmento Fab' que se puede generar reduciendo los puentes bisulfuro del fragmento F(ab')2; el fragmento Fab que se puede generar tratando el anticuerpo molecular con papaina y un agente reductor; y fragmentos Fv.

En la producción de anticuerpos, la selección para el anticuerpo deseado se puede acompañar por técnicas conocidas en el oficio, por ejemplo, ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas). Para seleccionar los anticuerpos específicos a un dominio de la proteína particular, o un derivado de estos, alguien puede ensayar generar hibridomas para un producto que se une al fragmento de la proteína, o un derivado de estos, que contiene dicho dominio.

Los anticuerpos precedentes se pueden utilizar en métodos conocidos en el oficio relacionados con la localización y/o cuantificación de la proteína o las proteínas dadas, por ejemplo, para ser parecidos a estas proteínas, los niveles de medición de estas en muestras fisiológicas apropiadas (por inmunoensayo), en métodos de diagnóstico, etc. Esto ocurre también para un derivado, u homólogo de estos de DEGS.

En una modalidad preferida, el inhibidor de DEGS es un siARN con la secuencia: UGUGGAAUCGCUGGUUUG
G. En otra modalidad preferida, el inhibidor de DEGS es un siARN con la secuencia: GUUAUCAAUACCGUGGCAC.

Como se explica arriba, se ha encontrado sorprendentemente en el contexto de la presente invención que DEGS disminuye o atenúa la secreción de Abeta-42. De esta manera, esto directa o indirectamente regula la actividad de beta-secretasa y/o gamma secretasa. Por consiguiente, en una modalidad preferida, el inhibidor o molécula que interactúa disminuye o atenúa la secreción de Abeta-42 o modula la actividad de beta-secretasa y/o gamma secretasa.

En el contexto de la presente invención, "modulación de la actividad de gamma secretasa y/o beta secretasa" significa que la actividad se reduce en eso menos o ningún producto se forma (inhibición parcial o completa) o que la enzima respectiva produce un producto diferente (en el caso de gamma secretasa por ejemplo Abeta-40 en lugar de Abeta-42) o que las cantidades relativas de los productos son diferentes (en el caso de gamma secretasa por ejemplo más Abeta-40 que Abeta-42).

A lo largo de la invención, el término "modulación de la actividad de gamma secretasa y/o beta secretasa" incluye que la actividad de la enzima se modula directa o indirectamente. Eso significa que el modulador de DEGS puede unir también directamente a la enzima o, más preferido, puede ejercer una influencia en DEGS que a su vez, por ejemplo por interacciones proteína-proteína o por transducción de señal o vía metabolitos pequeños, modula la actividad de la enzima.

Adicionalmente, se abarca que el modulador modula tanto gamma secretasa o beta secretasa como la actividad de ambas enzimas.

Hasta el final la invención, se prefiere que el modulador beta secretasa inhiba la actividad de beta secretasa ya sea completa o parcialmente.

Con respecto al modulador de la actividad de gamma secretasa, se prefiere que este modulador inhiba la actividad gamma secretasa. Sin embargo, también se prefiere que la actividad de gamma secretasa se alterne de una manera que se produzca más Abeta-40 en lugar de Abeta-42.

La actividad de Gamma secretasa se puede medir por ejemplo para determinar la elaboración de APP, por ejemplo para determinar si se produce Abeta-40 o Abeta-42 (ver sección de Ejemplos, abajo).

Para medir la actividad de BACE1, los cambios de la relación entre fragmentos de APP alfa- y beta-C-terminal se pueden analizar por Western Blotting (Blasko et al., J Neural Transm 111, 523); ejemplos adicionales para ensayos de la actividad de BACE1 incluyen pero no se limitan a: uso de un péptido donador de enzima ciclada que contiene un sitio de división de BACE1 para reconstituir y medir la actividad indicadora de la beta-galactosidasa (Naqvi et al., J Biomol Screen. 9, 398); uso de sustratos de péptido fluorimétrico de apagado y mediciones de fluorescencia (Andrau et al., J.Biol Chem 278, 25859); uso de ensayos basados en la célula utilizando proteínas quiméricas recombinantes, en las cuales una enzima (tal como fosfatasa alcalina) se une vía un tramo de aminoácidos, que contiene la secuencia de reconocimiento BACE1, para una proteína residente de Golgi (Oh et al., Anal Biochem, 323, 7); ensayos basados en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) (Kennedy et al., Anal Biochen 319, 49); un sistema de selección de crecimiento celular en levadura (Luthi et al., Biochim Biophys Acta 1620, 167).

Preferiblemente, la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer.

De acuerdo con la invención, la molécula que interactúa con DEGS se utiliza para preparar una composición farmacéutica.

Por consiguiente, la invención proporciona las composiciones farmacéuticas, que pueden ser administradas a un sujeto en una cantidad efectiva. En un aspecto preferido, el terapéutico se purifica sustancialmente. El sujeto es preferiblemente un animal incluyendo, pero no limitando a animales tal como vacas, cerdos, caballos, gallinas, gatos, perros, etc., y preferiblemente es un mamífero, y más preferiblemente un humano. En una modalidad específica, un mamífero no-humano es el sujeto.

Varios sistemas de entrega se conocen y se pueden utilizar para administrar un terapéutico de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, y microcápsulas: uso de células recombinantes capaces de expresar el terapéutico, uso de endocitosis mediada por el receptor (por ejemplo, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432); construcción de un ácido nucleico terapéutico como parte de un retroviral u otro vector, etc. Los métodos de introducción incluyen pero no se limitan a las rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, y oral. Los compuestos se pueden administrar por cualquier ruta conveniente, por ejemplo por infusión, por inyección de bolo, por absorción a través de epitelial o recubrimiento mococutáneo (por ejemplo, oral, rectal y mucosa intestinal, etc.), y se pueden administrar junto con otros agentes activos biológicamente. La administración puede ser sistémica o local. Adicionalmente, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier ruta apropiada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular se puede facilitar mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. La administración pulmonar también se puede emplear, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de pulverización.

En una modalidad específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área con necesidad del tratamiento. Esto se puede lograr mediante, por ejemplo, y no amanera de limitación, infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción con la puesta de vendas después de cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no-poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tal como membranas sialásticas, o fibras. En una modalidad, la administración pueden ser mediante inyección directa en el sitio (o sitio matriz) de un tumor maligno o en el tejido neoplástico o pre-neoplástico.

En otra modalidad, el terapéutico se puede entregar en una ampolla, en particular un liposoma (Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., 1989, In: Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler, eds., Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; see generally ibid).

En aún otra modalidad, el terapéutico se puede entregar vía un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507-516; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574-579). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball, eds., Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy et al., 1985, Science 228:190-192; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:858-863). En aún otra modalidad, un sistema de liberación controlada se puede colocar en cercanía del objetivo terapéutico, i.e., el cerebro, de esta manera solamente requiere una fracción de la dosis sistémica (por ejemplo, Goodson, 1984, In: Medical Applications of Controlled Release, supra, Vol. 2, pp. 115-138). Otros sistemas de liberación controlada se plantean en las revisiones por Langer (1990, Science 249:1527-1533).

En una modalidad específica donde el terapéutico es un ácido nucleico, preferiblemente que codifica una proteína terapéutica, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, por construcción de esta como parte de un apropiado vector de expresión de ácido nucleico y administrándolo así que llega a ser intracelular, por ejemplo, por el uso de un vector retroviral (Patente U.S. No. 4,980,286), o por inyección directa, o por uso de un bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un pistola génica; Biolistic, Dupont), o por recubrimiento de este con lípidos, receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo en enlace a un péptido similar a una secuencia homeótica que se conoce para ingresar el núcleo (por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, un ácido nucleico terapéutico se puede introducir vía intracelular e incorporar por recombinación de homólogos dentro del ADN de la célula huésped para expresión.

En general, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad efectiva terapéuticamente de un terapéutico, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia regulatoria del gobierno Federal o un estado o enumerado en la Farmacopea U.S. u otras farmacopeas reconocidos generalmente para utilizar en animales, y más particularmente, en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluente, adyuvante, excipiente, o transportador con el cual el terapéutico se administra. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tal como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, incluyendo pero no limitando a aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra vía oral. Solución salina y dextrosa acuosa son vehículos preferidos cuando la composición farmacéutica se administra vía intravenosa. Las soluciones salinas y la dextrosa acuosa y las soluciones de glicerol se emplean preferiblemente como vehículos líquidos para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos apropiados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, silica gel, estearato de sodio, glicerol monoestearato, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades inferiores de agentes de humectación y emulsificantes, o agentes reguladores de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación controlada y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tal como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándar tal como calidad farmacéutica de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de apropiados vehículos farmacéuticos se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad efectiva terapéuticamente del terapéutico, preferiblemente en forma pura, junto con una apropiada cantidad del vehículo para así proporcionar la forma para una correcta administración al paciente. La formulación debe traer el modo de administración.

En una modalidad preferida, la composición se formula, de acuerdo con procedimientos rutinarios, como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a un ser humano. Usualmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en solución reguladora acuosa isotónica estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lidocaina para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se proporcionan tanto individualmente o mezclados junto en forma de dosificación por unidad, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de agente activo. Donde la composición debe ser administrada por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o salina estéril calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua o salina estéril para inyección así que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.

Los terapéuticos de la invención se pueden formular como formas neutras o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos carboxilo libres tal como aquellos derivados a partir de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., aquellos formados con grupos amino libres tales como aquellos derivados a partir de isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina, etc., y aquellos derivados a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, e hidróxidos férricos, etc.

La cantidad del terapéutico de la invención que será efectiva en el tratamiento de un desorden particular o condición dependerá de la naturaleza del desorden o condición, y puede ser determinada por técnicas clínicas estándar. Adicionalmente, se pueden emplear ensayos in vitro opcionalmente para ayudar a identificar los rangos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se emplea en la formulación también dependerá de la ruta de administración, y la gravedad de la enfermedad o desorden, y debería ser decidida de acuerdo con el juicio del practicante y circunstancias de cada paciente. Sin embargo, los rangos de dosificación apropiados para la administración intravenosa son generalmente aproximadamente 20-500 microgramos del compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los rangos de dosificación apropiados para administración intranasal son generalmente aproximadamente 0.01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas dosis-respuesta derivadas a partir de sistemas de pruebas de modelos de animales o in vitro.

Los supositorios generalmente contienen ingrediente activo en el rango de 0.5% a 10% por peso; las formulaciones orales preferiblemente contienen 10% a 95% de ingrediente activo.

La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más envases llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociada con su enva-
se(s) puede estar la información en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, información que refleja la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana.

Los kits de la presente invención también pueden contener vectores expresión que codifican DEGS o uno que interacúa o péptido de enlace o polipéptido, que se puede utilizar para expresar DEGS o la interacción respectiva o péptido de enlace o polipéptido. Tal kit preferiblemente también contiene las soluciones reguladoras y reactivos requeridos. Opcionalmente asociados con tales envases(s) pueden estar las instrucciones para utilizar el kit y/o una información en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, información que refleja la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana.

La invención además se relaciona con un método de tratamiento, en donde una cantidad efectiva de una molécula que interactúa con DEGS o inhibidor o de una composición farmacéutica de la invención se administra a un sujeto que padece de una enfermedad neurodegenerativa, preferiblemente enfermedad de Alzheimer. En relación a este método de la invención, todas las modalidades dadas arriba aplican para el uso de la invención.

La invención además se relaciona con un método de identificación un modulador gamma secretasa y/o modulador beta-secretasa, que comprende las siguientes etapas:

a. identificación de una molécula que interactúa con la molécula DEGS para determinar si un compuesto de ensayo dado es una molécula que interactúa con la molécula DEGS,

b. determinar si la molécula que interactúa con la molécula DEGS de la etapa a) es capaz de modular la actividad gamma secretasa o la actividad beta-secretasa.

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En una modalidad preferida de la invención, en la etapa a) el compuesto de prueba se pone en contacto con DEGS y se determina la interacción de DEGS con el compuesto de prueba. Preferiblemente, se mide si la molécula candidato se une a DEGS.

El método de la invención preferiblemente se realiza en el contexto de un ensayo de alto rendimiento. Tales ensayos se conocen por alguien de habilidad en el oficio.

Las moléculas candidato o prueba para ser seleccionadas pueden ser proporcionada como mezclas de un número limtado de compuestos específicos, o como bibliotecas de compuestos, bibliotecas de péptidos y similares. Las moléculas/agentes para ser seleccionadas también pueden incluir todas las formas de antisuero, ácidos nucleicos antisentido, etc., que pueden modular la actividad o expresión de DEGS. Ejemplares moléculas candidato y bibliotecas para la selección se publican abajo.

La selección de las bibliotecas se puede acompañar por cualquiera de una variedad de métodos conocidos comúnmente. Ver, por ejemplo, las siguientes referencias, que revelan la selección de bibliotecas de péptidos: Parmley and Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218; Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13:422-427; Oldenburg et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yu et al., 1994, Cell 76:933-945; Staudt et al., 1988, Science 241: 577-580; Bock et al., 1992, Nature 355:564-566; Tuerk et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellington et al., 1992, Nature 355:850-852; Patente U.S. No. 5,096,815, Patente U.S. No. 5,223,409, y Patente U.S. No. 5,198,346, all to Ladner et al.; Rebar y Pabo, 1993, Science 263:671-673; y Publicación de la Patente Internacional No. WO 94/18318.

En una modalidad específica, la selección se puede realizar por contacto de los miembros de la biblioteca con un DEGS inmobilizado sobre una fase sólida, y cultivando aquellos miembros de la biblioteca que unen a la proteína (o ácido nucleico codificante o derivado). Ejemplos de tales métodos selección, llamadas técnicas "panning", se describen por medio del ejemplo en Parmley and Smith, 1988, Gene 73:305-318; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13:422-427; Publicación de la Patente Internacional No. WO 94/18318; y en las referencias citadas anteriormente.

En una modalidad específica, fragmentos y/o análogos DEGS, especialmente peptidomiméticos, se seleccionan por actividad como inhibidores competitivos o no competitivos de la presencia de DEGS (por ejemplo expresión o estabilidad de DEGS) o, particularmente, actividad de DEGS en la célula.

En una modalidad, agentes que modulan (i.e., inhibir o activar) la actividad de DEGS pueden ser seleccionados para utilizar una secreción del ensayo Abeta-42, en donde los agentes se seleccionan por su capacidad para modular la actividad de DEGS bajo condiciones acuosas, o fisiológicas, en el cual DEGS es activo en ausencia del agente para ser probado. Preferiblemente, los agentes candidatos son agentes que interactúan con o unen a DEGS. Los agentes que interfieren con la secreción de Abeta-42 se identifican como inhibidores de la actividad de DEGS. Los agentes que promueven la secreción de Abeta-42 se identifican como activadores de DEGS.

Preferiblemente, un procedimiento de dos-etapas se pueden utilizar, que involucran (a) identificación de moduladores en una actividad del ensayo DEGS (tal como se describe en Triola G, Fabrias G, Llebaria A (2001), Angew Chem Int Ed Engl., cited above), y (b) prueba de los moduladores para disminución o atenuación de la actividad Abeta-42.

Métodos para la selección, particularmente métodos para la selección para agentes que une a DEGS, puede involucrar DEGS marcado con radioligandos (por ejemplo, ^{125}I o ^{3}H), ligandos magnéticos (por ejemplo, cuentas paramagnéticas covalentes unido a acetato de fotobiotina), ligandos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceina o rhodamina), o ligandos enzima (por ejemplo, luciferasa o \beta-galactosidasa). Los reactivos que se unen en solución luego pueden ser aislados por una de muchas técnicas conocidas en el oficio, incluyendo pero no restringido a, co-inmunoprecipitación de la proteína marcada utilizando antisuero contra el enlace asociado sin marcar (o enlace asociado marcado con un marcador distinguible a partir de que se usa en la segunda proteína marcada), cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de permeación sobre gel, y centrifugación en gradiente de densidad. En una modalidad, el enlace asociado marcado es un pequeño fragmento o peptidomimetico que no se retiene por un filtro comercialmente disponible. Una vez unida, la especie marcada no puede luego pasar a través del filtro, proporcionando un simple ensayo de enlace.

Los métodos comúnmente conocidos en el oficio se utilizan para marcar al menos una de las proteínas o polipéptidos. Métodos de marcación apropiados incluyen, pero no se limitan a, radiomarcación por incorporación de aminoácidos radiomarcados, por ejemplo, ^{3}H leucina o ^{35}S-metionina, radiomarcación por yodación pos-translacional con ^{125}I o ^{131}I utilizando el método T cloramina, reactivos Bolton-Hunter, etc., o marcando con ^{32}P utilizando fosforilasa y fósforo radiomarcado inorgánico, biotina marcada con acetato de fotobiotina y exposición lámpara de rayos ultravioleta, etc. En casos donde uno de los enlaces asociados se inmobiliza, por ejemplo, según lo descrito abajo, la especie libre se marca. Donde ninguna de la especies que interactúan se inmobiliza, cada una pueden ser marcada con un marcador distinguible tal que el aislamiento de ambos asociados pueden ser seguidos para proporcionar una cuantificación más exacta, y para distinguir la formación por ejemplo de enlace homomérico a partir del heteromérico. Los métodos que utilizan proteínas accesorios que se unen a uno de los asociados modificados para mejorar la sensibilidad de detección, incrementar la estabilidad del enlace, etc., se proporcionan.

Los mismos métodos de marcación según lo descrito arriba también se pueden utilizar para marcar por ejemplo APP, Abeta-40, o Abeta-42, por ejemplo para determinar la cantidad de Abeta-40 o Abeta-42 secretada en un ensayo de secreción de Abeta.

Las condiciones de enlace típicas son, por ejemplo, pero no a manera de limitación, en una solución salina acuosa de NaCl 10-250 mM, Tris-HCl 5-50 mM, pH 5-8, y 0.5% de Triton X-100 u otro detergente que mejora la especificidad de interacción. Los metales quelantes y/o cationes divalentes se pueden adicionar para mejorar el enlace y/o reducir la proteólisis. Las temperaturas de reacción pueden incluir 4, 10, 15, 22, 25, 35, o 42 grados Centígrados, y tiempo de incubación es típicamente al menos 15 segundos, pero se prefieren tiempos más largos para permitir que el equilibrio del enlace ocurra. El enlace particular puede ser ensayado utilizando ensayos de enlace de proteínas rutinarios para determinar las condiciones de enlace óptimas para enlace reproducible.

Los parámetros de enlace físicos se pueden analizar por cuantificación de métodos específicos utilizando ensayo de enlace para la marca utilizada, por ejemplo, conteo de centelleo líquido para detección de la radioactividad, actividad de la enzima para fracciones de enzima-marcada, etc. La resultados de la reacción luego se analizaron utilizando análisis Scatchard, análisis Hill, y otros métodos comúnmente conocidos en el oficio (ver, por ejemplo, Proteins, Structures, y Molecular Principles, 2nd Edition (1993) Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York).

En una segunda metodología común para ensayos de enlace, una de las especies de enlace se inmobiliza en un filtro, en un pozo de la placa de microtitulación, en un tubo de prueba, a una matriz de cromatografía, etc., tanto covalente como no-covalentemente. Las proteínas pueden ser inmobilizadas covalentemente utilizando cualquier método bien conocido en el oficio, por ejemplo, pero no limitando al método de Kadonaga and Tjian, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5889-5893, i.e., un enlace para un sustrato derivatizado cianógeno-bromuro tal como CNBr-Sefarosa 4B (Pharmacia). Cuando sea necesario, el uso de espaciadores puede reducir la barrea estérica por el sustrato. La adherencia no-covalente de las proteínas a un sustrato incluyen, pero no se limitan a, adherencia de una proteína a una superficie cargada, enlace con anticuerpos específicos, enlace a una tercera proteína no-relacionada que interactúa,
etc.

Ensayos de agentes (incluyendo extractos celulares o una mezcla de biblioteca) que competen para el enlace de una molécula dada para DEGS se proporcionan para seleccionar los competidores, mejoradores, o agentes con características de enlace deseadas específicamente (por ejemplo afinidad inferior o superior) comparadas con un enlace asociado dado. Una vez más, tanto la molécula como DEGS pueden ser marcadas por cualquier medio (por ejemplo, aquellos medios descritos arriba).

En modalidades específicas, agentes de bloqueo para inhibir el enlace no-específico de reactivos con otras proteínas, o pérdida de absorción de reactivos a plásticos, inmobilización de matrices, etc., se incluyen en la mezcla de ensayo. Los agentes de bloqueo incluyen, pero no se restringen a albúmina de suero bovino, caseina, leche deshidratada sin grasa, reactivo de Denhardt, Ficoll, polivinilpirolidina, detergentes no iónicos (NP40, Triton X-100, Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes iónicos (por ejemplo, SDS, LDS, etc.), polietilenglicol, etc. Las concentraciones de agente de bloqueo apropiadas permiten el enlace específico.

Después el enlace se realiza, sin unir, el agente marcado se extrae en el sobrenadante, y la proteína inmobilizada (o, si es aplicable, el agente inmobilizado) que retiene cualquier enlace, el agente marcado se lava extensamente. La cantidad de enlace marcado luego se cuantifica utilizando métodos estándar en el oficio para detectar la marcación según lo descrito, supra.

En otras modalidades específicas la selección para moduladores de la proteína como se proporciona aquí se puede realizar para unir aquellos y/o los anticuerpos como se proporcionan aquí a un vehículo sólido.

La preparación de tal arreglo que contiene diferentes tipos de proteínas (incluyendo anticuerpos) es bien conocida en el oficio y es apreciable para alguien de habilidad en el oficio (ver por ejemplo Ekins et al., 1989, J. Pharm. Biomed. Anal. 7:155-168; Mitchell et al. 2002, Nature Biotechnol. 20:225-229; Petricoin et al., 2002, Lancet 359:572-577; Templin et al., 2001, Trends Biotechnol. 20:160-166; Wilson and Nock, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 6:81-85; Lee et al., 2002 Science 295: 1702-1705; MacBeath and Schreiber, 2000, Science 289:1760; Blawas and Reichert, 1998, Biomaterials 19:595; Kane et al., 1999, Biomaterials 20:2363; Chen et al., 1997, Science 276:1425; Vaugham et al., 1996, Nature Biotechnol. 14: 309-314; Mahler et al., 1997, Immunotechnology 3:31-43; Roberts et al., 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:268-273; Nord et al., 1997, Nature Biotechnol. 15:772-777; Nord et al., 2001, Eur. J. Biochem. 268:4269-4277; Brody and Gold, 2000, Rev. Mol. Biotechnol. 74:5-13; Karlstroem and Nygren, 2001, Anal. Biochem. 295:22-30; Nelson et al., 2000, Electrophoresis 21:1155-1163; Honore et al., 2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 3:265-274; Albala, 2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 2:145-152, Figeys and Pinto, 2001, Electrophoresis 2:208-216 y las referencias en las publicaciones enumeradas aquí).

Las proteínas u otros agentes se pueden unir a una estructura por diferentes medios como será apreciable para alguien de habilidad en el oficio. Las proteínas por ejemplo pueden ser adicionados a la estructura vía un TAP-tag (como se describe en WO/0009716 y en Rigaut et al., 1999, Nature Biotechnol. 10:1030-1032) después de la etapa de purificación o por otro apropiado esquema de purificación como será apreciable para alguien de habilidad en el oficio.

Opcionalmente, ensayos funcionales como será apreciable para alguien de habilidad en el oficio, algunos de los cuales se proporciona ejemplarmente aquí, pueden ser realizados para controlar la integridad del enlace de la proteína a la matriz.

Opcionalmente, la adherencia de las proteínas o el anticuerpo como se indica arriba puede ser además monitoreada por varios métodos apreciables para alguien de habilidad en el oficio. Aquellos incluyen, pero no se limitan a la resonancia del plasmón de superficie (ver por ejemplo McDonnel, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:572-577; Lee, 2001, Trends Biotechnol. 19:217-222; Weinberger et al., 2000, 1:395-416; Pearson et al., 2000, Ann. Clin. Biochem. 37:119-145; Vely et al., 2000, Métodos Mol. Biol. 121: 313-321; Slepak, 2000, J. Mol Recognit. 13:20-26).

Ejemplares ensayos útiles para medir la producción de los péptidos Abeta-40 y Abeta-42 por ELISA incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en Vassar R et al., 1999, Science, 286:735-41.

Ejemplares ensayos útiles para medir la producción de los fragmentos de APP C-terminal en líneas celulares o animales transgénicos por Western Blot incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en Yan R et al., 1999, Nature, 402:533-7.

Ejemplares ensayos útiles para medir la actividad proteolítica de secretasas beta- o gamma hacia fragmentos de APP expresados bacterianamente in vitro (por ejemplo por que modifican la expresión de las proteínas DEGS en células por medio de ARNi (siARN) y/o plásmidos codificantes de la proteína de DEGS incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en Tian G et al., 2002, J Biol Chem, 277:31499-505.

Ejemplares ensayos útiles para medir la transactivación de un gen indicador Gal4-conducido (por ejemplo modificando la expresión de DEGS por medio de ARNi (siARN) y/o plásmidos codificantes de la proteína de DEGS, incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en Cao X et al., 2001, Science, 293:115-20.

Cualquier molécula conocida en el oficio se puede probar para su capacidad para ser una molécula que interactúa o inhibe de acuerdo con la presente invención. Las moléculas candidato pueden ser proporcionadas directamente a una célula que expresa la DEGS, o, en el caso de proteínas candidato, pueden ser proporcionadas suministrando sus ácidos nucleicos codificantes bajo condiciones en las cuales los ácidos nucleicos se expresa recombinantemente para producir la proteína candidato.

El método de la invención es bien apropiado para seleccionar bibliotecas químicas para moléculas que modulan, por ejemplo, inhiben, antagonizan, o agonizan, la cantidad o actividad de la proteína, en particular de DEGS. Las bibliotecas químicas pueden ser bibliotecas de péptidos, bibliotecas de peptidomimeticos, bibliotecas sintetizadas químicamente, recombinantes, por ejemplo, bibliotecas de expresión en fago, y bibliotecas basadas en traducción in vitro, otras bibliotecas orgánicas sintético no-péptidos, etc.

Ejemplares bibliotecas son comercialmente disponibles a partir de varias fuentes (ArQule, Tripos/PanLabs, ChemDesign, Pharmacopoeia). En algunos casos, estas bibliotecas químicas se generan utilizando estrategias combinatorias que codifican la identidad de cada miembro de la biblioteca en un sustrato al cual el compuesto miembro se une, de esta manera permitiendo la identificación directa e inmediata de una molécula que es un modulador efectivo. De esta manera, en muchas metodologías combinatorias, la posición en una placa de un compuesto especifica que composición del compuesto. También, en un ejemplo, Una posición de placa única puede tener de 1-20 químicos que pueden ser seleccionados por administración en un pozo que contiene las interacciones de interés. De esta manera, si se detecta la modulación, pequeños y mezclas de pequeños de pares que interactúan, se pueden ensayar para la modulación de la actividad. Mediante dichos métodos, muchas moléculas candidato pueden ser seleccionados.

Gran número de bibliotecas apropiadas para utilizar se conoce en el oficio y se pueden utilizar para proporcionar los compuestos para ser probados de acuerdo con la presente invención. Alternativamente, las bibliotecas se pueden construir utilizando métodos estándar. Las bibliotecas químicas (sintéticas), bibliotecas de expresión recombinante, o bibliotecas basadas en polisomas son tipos ejemplares de bibliotecas que se pueden utilizar.

Las bibliotecas pueden ser comprimidas o semirígidas (que tienen un cierto grado de rigidez estructural), o lineal o no-comprimida. La biblioteca puede ser una biblioteca de cDNA o de expresión genómica, biblioteca de expresión de péptidos aleatorios o una biblioteca de péptido aleatorios sintetizados químicamente, o biblioteca de no-péptido. Las bibliotecas de expresión se introducen en las células en las cuales el ensayo ocurre, cuando los ácidos nucleicos de la biblioteca se expresan para producir sus proteínas codificadas.

En una modalidad, las bibliotecas de péptidos que se pueden utilizar en la presente invención pueden ser bibliotecas que son sintetizadas químicamente in vitro. Ejemplos de dichas bibliotecas se dan en Houghten et al., 1991, Nature 354:84-86, que describe las mezclas de hexapéptidos libres en las que los primeros y segundos residuos en cada péptido se definieron individual y específicamente; Lam et al., 1991, Nature 354:82-84, que describe una metodología "una perla, un péptido" en la cual un esquema de la síntesis por división de fase sólida produce una biblioteca de péptidos en los cuales cada perla en la colección ha inmobilizado por consiguiente una secuencia sola, aleatoria de residuos de aminoácidos; Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710, que describe la síntesis por división y métodos de síntesis T-bag; y Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233-1251. Simplemente por medio de otros ejemplos, una biblioteca combinatoria se puede preparar para utilizar, de acuerdo con los métodos de Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13:412; Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; o Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712. Publicación PCT No. WO 93/20242 and Brenner and Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383 describe "bibliotecas químicas combinatorias codificada," que contienen identificadores de oligonucleótido para cada miembro de la biblioteca de polímero químico.

En una modalidad preferida, la biblioteca seleccionada es una biblioteca de expresión biológica que es una biblioteca de demostración del fago de péptidos aleatorios, donde los péptidos aleatorios se comprimen (por ejemplo, en virtud de que tiene enlaces bisulfuro).

Además, las bibliotecas, más generales, comprimidas estructuralmente, de diversidad orgánica (por ejemplo, no-péptido), también se pueden utilizar. A modo de ejemplo, se puede utilizar, una biblioteca de benzodiazepina (ver por ejemplo, Bunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712).

Las bibliotecas comprimidas conformacionalmente que se pueden utilizar incluyen pero no se limitan a aquellas que contienen residuos de cisteina invariante que, en un ambiente oxidación, entrecruzamiento por enlaces bisulfuro para formar cisteinas, péptidos modificados (por ejemplo, incorporando flúor, metales, marcas isotópicas, se fosforizan, etc.), péptidos que contienen uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente, estructuras no-péptidicas, y péptidos que contienen una fracción significante de ácido carboxiglutámico.

Las bibliotecas de no-péptidos, por ejemplo, derivados de péptidos (por ejemplo, que contienen uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente) también se puede utilizar. Un ejemplo de estas son las bibliotecas de peptoides (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371). Los peptoides son polímeros de aminoácidos no-naturales que tienen cadenas laterales que ocurren naturalmente que no se adhieren al carbono de K sino al esqueleto amino nitrógeno. Tales peptoides no se degradan fácilmente por enzimas digestivas humanas, son ventajosamente más adaptables fácilmente al uso como fármaco. Otro ejemplo de una biblioteca que se pueden utilizar, en la que la funcionalidades de la amida en los péptidos han sido permetilados para generar una biblioteca combinatoria transformada químicamente, se describe por Ostresh et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142).

Los miembros de las bibliotecas de péptidos que pueden ser seleccionados de acuerdo con la invención no se limitan a contener los 20 aminoácidos que ocurren naturalmente. En particular, las bibliotecas sintetizadas químicamente y bibliotecas basadas en polisomas permiten el uso de aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos que ocurren naturalmente (por su inclusión en la mezcla precursor de aminoácidos utilizados en la producción de la biblioteca). En modalidades específicas, los miembros de la biblioteca contienen uno o más aminoácidos no-naturales o no-clásicos o péptidos cíclicos. Los aminoácidos no-clásicos incluyen pero no se limitan a los D-isómeros de los aminoácidos comunes, -aminoácido isobutírico, 4-aminoácido butírico, Abu, 2-aminoácido butírico; -Abu, -Ahx, 6-aminoácido hexanoico; Aib, 2-aminoácido isobutírico; 3-amino ácido propionico; ornithina; norleucina; norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrullina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, \beta-alanina, aminoácidos diseñados tal como \beta-metil aminoácidos, C-metil aminoácidos, N-metil aminoácidos, fluoro-aminoácidos y aminoácidos análogos en general. Adicionalmente, el aminoácido puede ser D (dextrorotatorio) o L (levógiro).

En una modalidad específica, los fragmentos y/o análogos de las proteínas de la invención, especialmente los peptidomiméticos, se seleccionan por la actividad como inhibidores competitivos o no competitivos de la expresión o actividad de DEGS (por ejemplo estabilidad).

En otra modalidad de la presente invención, química combinatoria se puede utilizar para identificar moduladores de DEGS. La química combinatoria es capaz de crear bibliotecas que contienen cientos de miles de compuestos, muchos de los cuales pueden ser estructuralmente similares. Mientras que programas de selección de alto rendimiento son capaces de seleccionar estas inmensas bibliotecas por afinidad para objetivos conocidos, nuevas metodologías han sido desarrolladas para lograr bibliotecas de dimensión más pequeña pero que proporcionen una máxima diversidad química. (Ver por ejemplo, Matter, 1997, J. Med. Chem. 40:1219-1229).

Un método de química combinatoria, huella dactilar de afinidad; se ha utilizado previamente para probar una biblioteca discreta de moléculas pequeñas para afinidad del enlace para un panel definido de proteínas. Las huellas dactilares obtenidas por la selección se utilizan para predecir la afinidad de los miembros individuales de la biblioteca para otras proteínas o receptores de interés, en particular de DEGS. Las huellas dactilares se comparan con huellas dactilares obtenidas a partir de otros compuestos conocidos para reaccionar con la proteína de interés para predecir si el compuesto de la biblioteca podría reaccionar de manera semejante. Por ejemplo, en lugar de pruebas de cada ligando en una biblioteca grande para la interacción con una proteína, solamente aquellos ligandos que tienen una huella dactilar similar a otros compuestos conocidos que tienen dicha actividad podrían ser evaluados. (See, e.g., Kauvar et al., 1995, Chem. Biol. 2:107-118; Kauvar, 1995, Affinity fingerprinting, Pharmaceutical Manufacturing International. 8:25-28; and Kauvar, Toxic-Chemical Detection by Pattern Recognition in New Frontiers in Agrochemical Immunoassay, Kurtz, Stanker and Skerritt (eds), 1995, AOAC: Washington, D.C., 305-312).

Kay et al. (1993, Gene 128:59-65) revelan un método de construcción de bibliotecas de péptidos que codifican los péptidos de la secuencia aleatoria completamente que son más grandes que aquellos de cualquier de las bibliotecas convencionales previas. Las bibliotecas reveladas en Kay et al. codifican los péptidos aleatorios sintéticos completamente de mayor de aproximadamente 20 aminoácidos de longitud. Tales bibliotecas pueden ser ventajosamente seleccionadas para identificar los moduladores de la proteína. (Ver también Patente U.S. No. 5,498,538 dated March 12, 1996; and Publicación PCT No. WO 94/18318 dated August 18, 1994).

Una revisión integral de varios tipos de bibliotecas de péptidos se puede encontrar en Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233-1251.

En una modalidad preferida, la interacción del compuesto de prueba con DEGS resulta en una inhibición de la actividad de DEGS.

De acuerdo con una modalidad preferida, en la etapa b) se mide la capacidad de la gamma secretasa para dividir APP. Esta se puede medir según lo indicado arriba.

De acuerdo con otra modalidad preferida, en la etapa b) se mide, la capacidad de la molécula que interactúa con la molécula DEGS para disminuir o atenuar la secreción de Abeta-42.

Adicionalmente, la invención también se relaciona con un método para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, preferiblemente la enfermedad de Alzheimer, que comprende las siguientes etapas:

a) identificación de un modulador de gamma secretasa y/o modulador de beta-secretasa, preferiblemente inhibidor, de acuerdo con el método de la invención, y

b) formulación del modulador de gamma secretasa y/o beta-secretasa, preferiblemente inhibidor, para una composición farmacéutica.

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En relación con la composición farmacéutica, todas las modalidades según lo indicado arriba aplican también aquí.

En una modalidad preferida, este método de la invención además comprende la etapa de mezclado de la molécula identificada con un vehículo farmacéuticamente aceptable como se explicó anteriormente.

La invención también se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de DEGS según lo definido arriba.

Adicionalmente, la invención también se dirige a una composición farmacéutica obtenible mediante el método anterior para la preparación de una composición farmacéutica.

La invención también se dirige a la composición farmacéutica de la invención para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa tal como la enfermedad de Alzheimer y desórdenes neurodegenerativos relacionados.

La invención también se dirige a un método para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa, preferiblemente la enfermedad de Alzheimer, que comprende la administración a un sujeto con necesidad de dicho tratamiento o prevención de una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición farmacéutica de la invención.

En relación con este método de la invención, todas las modalidades según lo descrito arriba para el uso de la invención también aplican.

La invención también se relaciona con el uso de una molécula que interactúa con DEGS para la modulación, preferiblemente inhibición de la actividad de beta secretasa y/o gamma secretasa in vitro. Por ejemplo, se abarca dentro de la presente invención para modular, preferiblemente inhibir la actividad de beta secretasa y/o gamma secretasa en cultivos celulares por la molécula que interactúa con DEGS. Todas las modalidades en relación con la molécula que interactúa con DEGS según lo descrito arriba también aplican a este uso de la invención.

La invención además se ilustra pero no se limita de ninguna manera por las siguientes figuras y ejemplos:

Fig. 1

DEGS se expresa altamente en cerebro humano.

5 \mug de ARN total a partir de varias fuentes de tejido humano (Clontech) se sometieron a transcripción inversa. Cantidades iguales de cDNA a partir de cada tejido y cebadores DEGS-específicos se utilizaron para la determinación de niveles de expresión relativos de DEGS por PCR cuantitativo. Tres experimentos independientes se realizaron y todos los valores se normalizaron para un ARN referencia humano (Stratagene).

Fig. 2

El siARN-mediado abatido de la expresión de DEGS atenúa la secreción de AB1-42. (panel izquierdo, Fig. 2A) siARNs dirigidos contra BACE1, DEGS o Luc3 se transfectaron en mutante sobre-expresado APPsw de las células neuroglioma H4. 48 horas después de la transfección el medio de crecimiento se eliminó y las células se incubaron durante la noche en medio libre de suero. Los sobrenadantes se recolectaron y los niveles de A\beta1-42 se determinaron por ELISA (Innogenetics). Al menos tres experimentos independientes se realizaron por duplicado. (panel derecho, Fig. 2B) El siARN dirigido contra DEGS específicamente reduce los niveles de mARN. El ARN total se preparó a partir de las células transfectadas H4/APPsw con siARN dirigido contra ya sea Luc3 o DEGS. Después de la transcripción inversa, cantidades relativas de transcripciones de DEGS se determinaron por PCR cuantitativo. Al menos dos experimentos independientes se realizaron.

Fig. 3

Secuencia de aminoácido de DEGS humana, representada en el código-único de letra

Fig. 4

Secuencia alineación de (A) DEGS humana y ratón, y (B) de DEGS humana y DES2.

Fig. 5

El papel de la dihidroceramida desaturasa en la ruta sphingosine-ceramida.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se refieren a todas las modalidades de la invención y especialmente a las modalidades como se reivindica en las reivindicaciones.

Ejemplo 1 Determinación de niveles de expresión de tejido DEGS

Para evaluar si DEGS califica como un objetivo potencial para AD, investigamos si este se expresó en cerebro humano. Para ese fin, determinamos sus niveles de expresión en varios tejidos por reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). En resumen, 5 \mug de ARN total a partir de varias fuentes de tejido humano (Clontech) se sometieron a transcripción inversa utilizando procedimientos estándar. Cantidades iguales de cDNAs a partir de cada tejido y cebadores DEGS-específico se utilizaron para la determinación de los niveles de expresión relativos de DEGS por PCR cuantitativo siguiendo las instrucciones del fabricante. Todos los valores se normalizaron a un ARN referencia humano (Stratagene).

Ejemplo 2 siARN-Inhibición de DEGS

Se empleó una estrategia de perturbación de expresión génica del ARNi para una validación funcional de DEGS como un realizador de la elaboración de APP: Dos siARNs dirigidos diferentes contra DEGS así como siARNs dirigidos contra BACE1 o Luc3 se transfectaron en el siARNs de células neuroblastoma SKNBE2 o neuroglioma H4 para DEGS humana se sintetizaron por Dharmacon Research Inc. Dos siARNs correspondientes a las siguientes secuencias se utilizaron:

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Una primera secuencia fue UGUGGAAUCGCUGGUUUGG

Una segunda secuencia fue GUUAUCAAUACCGUGGCAC

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La transfección de las células SK-N-BE2 se realizó utilizando LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se sembraron a una densidad de 1.0 x 10^{4} células en un volumen final de 85 \mul por 96-pozos 12-16 horas antes de la transfección. 25 nM de siARNs se mezclaron con 8 \mul de solución reguladora Opti-MEM (Gibco) y 60 ng de ADN vehículo, y la mezcla se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente antes de la adición a las células. 16 y 48 horas pos-tranfección el medio se reemplazó con 100 \mul o 200 \mul de medio de crecimiento con o sin suero, respectivamente. 72 horas de pos-transfección 100 \mul de sobrenadante se cultivaron para A\beta42 ELISA. El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante (Innogenetics).

La transfección de las células H4 se realizó utilizando RNAiFect (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se sembraron a una densidad de 1.0 x 10^{4} células en un volumen final de 100 \mul por 96-pozos 12-16 horas antes de la transfección. 270 nM (0,375 Pg) de siARNs se mezclaron con 25 \mul de EC-R solución reguladora y 2,3 \mul de RNAiFect y se incubó por 15 minutos a temperatura ambiente antes de la adición a las células. El medio en las células se reemplazó con 75 \mul de medio de crecimiento recién preparado. 5 horas pos-transfección las células se lavaron una vez con medio de crecimiento y se adicionaron 100 \mul para un cultivo posterior. A las 48 horas de pos-transfección el medio se reemplazó con 200 \mul de medio de crecimiento suero-libre, 72 horas depos-transfección 100 \mul de sobrenadante se cultivaron para A\beta42 ELISA. El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante (Innogenetics).

La eficiencia de abatimiento de siARNs seleccionados se evalúo en el nivel de proteína por co-transfección del siARNs y de vectores de expresión del cDNA TAP-tagged correspondientes o utilizando líneas celulares expresadas establemente de la proteína de interés respectiva tagged. Se prepararon extractos de 48 horas pos-transfección, las proteínas se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Western blots se analizaron con anticuerpos dirigidos contra el tag y tubulina.

Hemos observado que, los siARNs similares dirigidos contra el conocido realizador de la elaboración de APP, BACE1, aquellas DEGS dirigidas causaron atenuación significante de la secreción de A\beta1-42, mientras que el siARN Luc3 no tuvo efecto.

De esta manera, podríamos demostrar que la DEGS desempeña un papel funcional en la elaboración de APP. Se demostró que inhibiendo DEGS, la producción del péptido A\beta1-42 podría ser reducido.

Hemos confirmado que ambos siARNs de DEGS interfieren efectivamente con la expresión de la desaturasa en el nivel de mARN por el análisis RT-PCR según lo descrito arriba.

Ejemplo 3 Determinación de la actividad de DEGS a) Ensayo microsomal en hígado de Rata

Triola G, Fabrias G, Llebaria A (2001) Synthesis of a Cyclopropene Analogue of Ceramide, a Potent Inhibitor of Dihydroceramide Desaturase. Angew Chem Int Ed Engl. 2001 May 18;40(10):1960-1962. En esencia, las membranas microsomales de rata se obtuvieron por procedimientos de fraccionamiento bioquímicos estándar. La actividad de DEGS se determina en solución reguladora de fosfato (0.1 M, pH 7.4), con D-erythro-N-octanoylsphingosine como sustrato. Los interactuadores de DEGS tales como inhibidores de molécula pequeños y sustrato (15 nM) se disolvieron in (15 nmol de BSA en solución reguladora de fosfato /etanol 9:1 v/v, 100 \mul), combinados con las membranas microsomales (1 mg de proteína) y NADH (30 \mul, 1 \muM en solución reguladora de fosfato), y se llevaron a un volumen final de 300 \mul con solución reguladora de fosfato. La suspensión se incuba por 30 min a 37ºC, y las reacciones se detienen mediante la adición de CHCl_{3} (0.5 ml) que contiene D-erythro-N-hexanoylsphingosine (1 nmol) como un estándar interno para la cuantificación. Los lípidos se extrajeron con CHCl_{3} (2x250 \mul), las capas orgánicas combinadas se evaporaron bajo una corriente de nitrógeno, y el residuo se derivatiza con bistrimetilsililtrifluoroacetamida (50 \mul, 25ºC, 60 min). Después de la derivatización, se adicionó CHCl_{3} (50 \mul) y las muestras se almacenaron a
-80ºC. Los análisis instrumentales se pueden realizar por cromatografía de gases acoplada a spectrometría de masas
(GC-MS).

b) Ensayos de selección de rendimiento ultraelevado utilizando enzimas sintéticas de ácido graso (s. WO-03/ 019146, p.27 ff.)

El ensayo utiliza ésteres sustrato de lípidos tritiados específicamente en una posición, en un formato de ensayo microsomal (ver arriba). El método detecta la liberación de agua tritiada y evade los requisitos de las técnicas analíticas GS-MS para el análisis de productos lípidos.

En esencia, los siguientes componentes se mezclan (volumen total: 100 \mul): 2 \mul de D-erythro-N-octanoylsphingosine 1.5 mM sin marcar, 1 \mul de D-eriythro-N-octanoylsphingosine tritiado, 10 \mul de NADH 20 mM, compuestos de stock DMSO, 67 \mul de solución reguladora de fosfato 100 mM, pH 7.2. se adicionaron 80 \mul de esta mezcla a 20 \mul de microsomas (\sim20 \mug de proteína total) y la reacción se dejo procesar por 5-30 min a RT. 10 \mul de ácido perclórico al 6% se adicionaron para detener la reacción. Para sedimentar el sustrato tritiado no utilizado, las muestras se colocaron en el vortex con 100 \mul de suspensión de carbón activado y se centrifugaron a 13,000 rpm por 10 min a 4ºC. 400 \mul del sobrenadante se analizaron en un contador de centelleo líquido.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.

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<110> Cellzome AG

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<120> Tratamiento de Enfermedades Neurodegenerativas por el uso de los Inhibidores de DEGS

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<130> CEL63176PC

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<140> PCT/EP2004/013341

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<141> 2004-11-24

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<160> 5

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<170> Patente en version 3.1

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<210> 1

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<211> 19

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> siARN diseñado

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

uguggaaucg cugguuugg

\hfill

19

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<210> 2

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<211> 19

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> siARN diseñado

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

guuaucaaua ccguggcac

\hfill

19

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<210> 3

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<211> 323

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

1

2

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<210> 4

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<211> 323

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

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3

4

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<210> 5

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<211> 323

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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5

6

7

Claims (7)

1. El uso de un inhibidor de DEGS seleccionado del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, el siARN y los ribozimas para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde el inhibidor modula la actividad de la gamma secretasa y/o beta secretasa.

3. Un método de identificación de un modulador gamma secretasa y/o un modulador beta secretasa, que comprende las siguientes etapas:

a. identificación de una molécula que interactúa con DEGS para determinar si un compuesto de ensayo dado es una molécula que interactúa con DEGS,

b. determinar si la molécula que interactúa con DEGS de la etapa a) es capaz de modular la actividad de la gamma secretasa y/o de la beta secretasa.

4. El método de la reivindicación 3, en donde en la etapa a) el compuesto de prueba se pone en contacto con DEGS y se determina, la interacción de DEGS con el compuesto de prueba.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la interacción del compuesto de prueba con DEGS resulta en una inhibición de la actividad de DEGS.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde en la etapa b) se mide la capacidad de la gamma secretasa y/o la beta secretasa para dividir la APP.

7. El uso de un inhibidor de DEGS seleccionado del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, siARN y ribozimas para la modulación de la actividad de la beta secretasa y/o la gamma secretasa in vitro.