ES2301170T3 - Extraccion,amplificacion e hibridacion secuencial de adn micotico y metodos para detectar celulas micoticas en material clinico. - Google Patents

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Abstract

PARA LA DETECCION DE CELULAS FUNGICAS EN EL MATERIAL CLINICO SE EXTRAE EL ADN FUNGICO DE LA SANGRE TOTAL Y EL ADN FUNGICO EXTRAIDO SE ENSAYA A CONTINUACION. GRACIAS A ESTE ENSAYO SE PUEDE DETERMINAR LA EXISTENCIA DE UNA INFECCION FUNGICA. PARA OTROS DIAGNOSTICOS SE DETERMINAN LAS ESPECIES FUNGICAS A PARTIR DEL ADN FUNGICO EXTRAIDO. EL PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCION DEL ADN FUNGICO A PARTIR DE LA SANGRE TOTAL INCLUYE EL AISLAMIENTO DE CELULAS FUNGICAS ESENCIALMENTE INTACTAS DE LA SANGRE TOTAL Y LA EXTRACCION DEL ADN A PARTIR DE CELULAS AISLADAS. PARA LA DETECCION DEL ADN FUNGICO, SE AMPLIFICA AL MENOS UN SEGMENTO DEL ADN FUNGICO A DETERMINAR, DETECTANDOSE OPCIONALMENTE LOS PRODUCTOS DE AMPLIFICACION. PARA PODER SEGUIR IDENTIFICANDO LAS ESPECIES FUNGICAS, SE DETERMINAN LAS SECCIONES DE LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS CARACTERISTICAS DE LAS ESPECIES FUNGICAS.

Description

Extracción, amplificación e hibridación secuencial de ADN micótico y métodos para detectar células micóticas en material clínico.
La presente invención se refiere de manera general a secuencias nucleótidas y a un método para detectar células micóticas en material clínico, en el cual pueden emplearse las secuencias nucleótidas.
Esta clase de secuencias nucleótidas y métodos se conocen a través de la patente EP 0 422 869 A2.
Tales métodos también son conocidos en la práctica; de manera estándar están basados en un cultivo de especies micóticas procedentes de material clínico sobre medios nutrientes adecuados.
Este cultivo, p.ej. en cápsulas Petri, y la detección basada en las colonias con o sin crecimiento afectan mucho a la velocidad y sensibilidad de identificación, debido sobre todo al lento crecimiento de las especies micóticas. Por lo tanto es frecuente que la infección fúngica invasiva solo se diagnostique mediante una biopsia extraordinariamente complicada de un órgano o incluso tras la muerte del paciente.
El interés en métodos de detección de células micóticas se debe a que, sobre todo en los últimos años, las especies micóticas han cobrado considerable importancia como agentes patógenos nosocomiales para los pacientes inmunosuprimidos. Las infecciones fúngicas invasivas han aumentado mucho, sobre todo tras los trasplantes de médula ósea (TMO), pero también tras los trasplantes de hígado, riñones, páncreas, corazón y corazón-pulmones. Así p.ej., en el año 1994 -sobre todo en centros franceses de TMO- aumentaron tanto las infecciones por Aspergillus, especialmente, que hubo que cerrar estos centros durante varios meses.
Además de los pacientes con órganos trasplantados cada vez hay más pacientes con cáncer -sobre todo tras la quimioterapia o después de intervenciones quirúrgicas- con quemaduras, así como pacientes internados en unidades de cuidados intensivos quirúrgicos o neonatales, que resultan afectados por infecciones fúngicas invasivas. Cuando en estos grupos de pacientes resulta afectado un sistema orgánico o incluso varios aparatos, la mortalidad por esta complicación infecciosa alcanza unos porcentajes comprendidos entre 80 y 100%.
En este caso el resultado del tratamiento solo se puede mejorar mediante un diagnóstico precoz. A causa de los inconvenientes del método estándar citados al principio se están realizando intensos esfuerzos para facilitar el diagnóstico precoz de una infección fúngica sistémica.
En la patente EP 0 422 869 A2 se describen secuencias nucleótidas y métodos para detectar levaduras patógenas del género Candida. Ahí se describen sondas de hibridación que se hibridan con zonas del gen 18S ARNr de especies de Candida. La hibridación se experimenta con el método "Dot Blot" o en los llamados ensayos de hibridación "Sandwich". Asimismo se describen dos cebadores, con los cuales se puede amplificar casi todo el gen 18S ARNr de las especies de Candida en una reacción PCR.
A través de la publicación "Detection of various fungal pathogenes in blood samples" (Detección de diversos agentes patógenos fúngicos en muestras de sangre) en: EBMT 1995, Vol. 15, Suppl. 2, marzo de 1995, Libro resumen, compendio nº 432, p. 103, se conoce el procedimiento de amplificar un segmento de ADN de un gen micótico mediante el método PCR, con el fin de identificar en la sangre un sinnúmero de agentes patógenos micóticos. La hibridación suplementaria con oligonucleótidos específicos de cada especie permite además distinguir varias especies de hongos entre sí.
Los problemas esenciales de la detección de infecciones fúngicas mediante técnicas biomoleculares cabe atribuirlos a la composición tan compleja de las paredes celulares de los hongos, que requiere hasta la fecha el uso de unos métodos de extracción largos y caros.
Otro problema es que hay un número creciente de especies de hongos capaces de causar infecciones malignas en los pacientes inmunosuprimidos, de lo cual se desprende la necesidad de registrar y determinar en estos pacientes toda una serie de géneros y cepas de diversos hongos. Por tanto, como la terapia de las infecciones es diferente según las diversas especies de hongos, no basta con registrar todas las especies, sino que además hay que poder distinguirlas e identificarlas.
Con estos antecedentes el objeto de la presente invención es proporcionar secuencias nucleótidas y un método que permita el diagnóstico precoz de una infección fúngica.
Dicho método debe ser de ejecución lo más rápida y sencilla posible, abarcar el mayor número de especies y, según un desarrollo de la presente invención, tener la capacidad de identificarlas.
Este objetivo se logra mediante las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 1 y SEQ ID-Nº: 2 del registro de secuencias adjunto.
\newpage
Estas secuencias nucleótidas deben emplearse preferentemente como cebadores, a fin de amplificar un fragmento procedente del gen micótico para el 18ssu ARNr de una serie de especies de hongos en una reacción de polimerasa en cadena.
El inventor de la presente patente ha descubierto sorprendentemente que ambas secuencias nucleótidas pueden usarse como cebadores para las más diversas especies de hongos relevantes en la clínica cotidiana. Con el uso de ambos cebadores en la reacción PCR se generan unos productos amplificados que poseen una longitud aproximada de 500 pares de bases y por lo tanto facilitan las posteriores elaboraciones, ya que p.ej. se pueden detectar fácilmente mediante electroforesis de gel. Por tanto de esta manera se dispone de un método de detección idéntico para todas las especies patógenas de hongos, pues se ha descubierto que ambas secuencias de cebadores se fijan al ADN de diversos hongos.
El objetivo de la presente invención también se resuelve mediante un método de detección de ADN micótico en material clínico, extrayendo ADN micótico de sangre entera, que comprende los siguientes pasos:
a)
separación de las células micóticas preponderantemente intactas en la sangre entera, por
a1)
disgregación de las células sanguíneas presentes en la sangre entera;
a2)
separación de las células micóticas preponderantemente intactas del ADN celular;
b)
extracción de ADN de las células micóticas aisladas, por
b1)
disgregación de las células micóticas aisladas, y
b2)
separación del ADN micótico;
c)
amplificación de al menos un segmento del ADN micótico a detectar, mediante reacción de polimerasa en cadena con las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 1 y SEQ ID-Nº: 2 del registro de secuencias adjunto como cebadores, y
d)
dado el caso, detección de los productos amplificados.
Así se obtiene un método muy sensible para detectar ADN específico de hongos, que permite la detección precoz de las infecciones fúngicas.
El procedimiento de extracción es adecuado, sobre todo en diagnosis, para poder extraer el ADN micótico con seguridad, aunque las cantidades de hongos existentes en la sangre entera sean muy pequeñas. Además este método puede realizarse tan rápida y fácilmente, que también se puede utilizar en la clínica cotidiana y, si es necesario, por parte de personal instruido.
Mediante el método de la presente invención se consigue separar de manera muy rápida y segura el ADN micótico del ADN celular. Al disgregar las células sanguíneas existentes en la sangre entera se libera el ADN celular en esta disolución de partida, tras lo cual las células micóticas no disueltas o al menos no totalmente disueltas por el proceso de disgregación anterior pueden separarse del ADN celular libre usando procedimientos rápidos y sencillos, como p.ej. una centrifugación. Durante la subsiguiente disgregación de las células micóticas separadas de este modo puede suponerse con gran seguridad que en la solución no hay ADN celular o solo en cantidades despreciables. Por consiguiente, la disgregación de las células sanguíneas en a1) debe efectuarse de modo que no tenga lugar la lisis de las células micóticas. Como la pared celular de los hongos es mucho más compleja que la de las células sanguíneas, esto se puede garantizar empleando procedimientos de disgregación cuidadosos.
La etapa a1) tiene además otra ventaja; mediante esta operación se liberan células micóticas eventualmente fagocitadas, lo cual también permite extraer cantidades muy pequeñas de hongos presentes en la sangre entera, sobre todo para el diagnóstico. Con el nuevo método ya no es necesario que en la sangre entera haya por lo menos algunas células micóticas libres en disolución, basta simplemente que queden unas pocas células micóticas tras la fagocitosis, p.ej. en granulocitos o en macrófagos.
En este caso se prefiere especialmente realizar las siguientes operaciones en la etapa a):
a1.1)
lisis de los glóbulos rojos por hemolisis osmótica,
a1.2)
disgregación enzimática de los glóbulos blancos y
a2.1)
centrifugación de la sangre entera así tratada y empleo del precipitado en los siguientes pasos del proceso.
La ventaja es que en las operaciones a1.1) y a1.2) las células sanguíneas se disgregan con certeza, pero las células micóticas no son dañadas. La posterior centrifugación permite luego una separación muy segura entre el ADN celular liberado entretanto de las células sanguíneas y los fragmentos de las células lisadas, por una parte, y las células micóticas predominantemente intactas por otra parte. De este modo también se asegura que no se pierda ninguna cantidad de ADN micótico, pues éste se halla en las células micóticas que todavía puede haber en el precipitado. Por lo tanto, resumiendo, las operaciones anteriores tienen por una parte la ventaja de recoger hasta las mínimas concentraciones de células micóticas y por otra parte la ventaja de que el ADN micótico aislado está en cualquier caso poco impurificado con ADN celular, de modo que las siguientes etapas del diagnóstico pueden poseer una gran sensibilidad y especificidad, puesto que la proporción entre ADN micótico y celular se ha mejorado claramente en beneficio del ADN micótico.
En un desarrollo posterior se prefiere llevar a cabo en la etapa b) las siguientes operaciones:
b1.1)
lisis alcalina y tratamiento enzimático de las células micóticas.
Se ha demostrado que estos pasos sencillos del proceso permiten disgregar con seguridad las células micóticas retomadas del precipitado de la etapa a2.1).
Asimismo es preferible que en la etapa a1.1) la lisis de los glóbulos rojos tenga lugar mediante una solución hipotónica, preferentemente con una concentración final de aprox. 10 mM de Tris a pH 7,6, 5 mM de MgCl_{2} y 10 mM de NaCl, y que en la etapa a1.2) la disgregación enzimática de los glóbulos blancos tenga lugar en una disolución con una concentración final de 200 \mug/ml de proteinasa K, 10 mM de Tris a pH 7,6, 10 mM de EDTA a pH 8,0, 50 mM de NaCl y 0,2% de SDS.
En otro desarrollo, la disolución de la etapa a1.2) se incuba durante 100-140 min., preferentemente durante 120 min. a 60-70ºC, sobre todo a 65ºC.
Se encontró que de esta forma las células sanguíneas se pueden disgregar de manera fiable y completa, evitando que se dañen las células micóticas, con lo cual, tras estas etapas del proceso, tanto las células micóticas libremente disueltas en la sangre de partida como las fagocitadas se encuentran bastante intactas y pueden separarse por centrifugación, sin que pierdan su ADN.
Asimismo se prefiere que la etapa b1.1) comprenda los siguientes pasos:
-
incubación de las células micóticas presentes en el precipitado de la etapa a2.1) a 90-98ºC, preferentemente a 95ºC, durante 5-15 min., preferentemente durante 10 min., en una solución con 50 mM de NaOH,
-
neutralización con Tris-HCl 1M a pH 7,0,
-
tratamiento enzimático con zymoliasa durante 50-70 min., preferentemente durante 60 min., a 30-40ºC, preferentemente a 37ºC,
-
desnaturalización proteica por incubación con Tris/EDTA a 60-70ºC, preferentemente a 65ºC, durante 10-30 min., preferentemente durante 20 min.
Se encontró que con estas etapas de proceso puede conseguirse una disgregación segura de las células micóticas y después una liberación completa del ADN micótico, con lo cual el ADN micótico queda luego libremente en solución y separado de los fragmentos de las células micóticas lisadas.
En este contexto se prefiere entonces que la etapa b2) comprenda los siguientes pasos:
-
precipitación proteica con acetato potásico 5 M, y
-
precipitación de ADN del sobrenadante en isopropanol helado.
Estas etapas del proceso son muy fáciles de llevar a cabo; primero se precipita la proteína mediante la adición de acetato potásico, luego se retira el sobrenadante y se mezcla con isopropanol helado, con lo cual precipita el ADN. Luego este ADN precipitado se puede usar en las posteriores etapas del método, es decir, para detectar e identificar una infección fúngica.
La primera ventaja del método descrito hasta ahora es, resumiendo, que, por así decirlo, la especie micótica puede detectarse en general por su ADN y luego se puede identificar en concreto. El ADN micótico no se extrae directamente de la sangre entera; primero se separan las células micóticas del ADN celular, para aumentar la sensibilidad y la especificidad de la detección. En otras palabras, si hay muy pocas células micóticas en la sangre entera, la cantidad tan pequeña de ADN micótico extraído de ella tal vez no pueda detectarse, probablemente por la presencia de ADN celular en concentraciones muy elevadas; por tanto la mencionada separación aporta aquí grandes ventajas respecto a la sensibilidad.
Otra ventaja del nuevo método es que las células micóticas fagocitadas también son utilizables para la detección, porque antes se disgregan las células sanguíneas de la sangre entera, sin dañar las células micóticas, tanto si se hallan libremente en solución como si están fagocitadas. Las células micóticas solo se disgregan una vez separadas del ADN celular y de los restos de las células sanguíneas. El procedimiento empleado para ello tiene la capacidad de disgregarlas totalmente, sin destruir el ADN micótico, a pesar de la gran complejidad de las paredes celulares de los hongos.
También es objeto de la presente invención un kit para la realización del método arriba descrito. Este tipo de kit puede reunir todas las soluciones patrón necesarias para cada una de las citadas etapas del proceso. Pero también puede ser que este kit solo lleve aquellas soluciones patrón que no son habituales en un laboratorio, prescindiendo p.ej. del tampón Tris, etc., aunque como mínimo la proteinasa K y la zymoliasa están contenidas en el kit.
En las etapas c) y d) tiene lugar la detección del ADN micótico extraído. Para ello es conveniente extraer o separar el ADN micótico del modo arriba descrito. No obstante también puede extraerse p.ej. mediante una centrifugación adecuada en gradiente de densidad, mediante una precipitación específica por etapas con sondas de ADN, etc.
El ADN micótico se usa ventajosamente para diagnosticar infecciones fúngicas, pero también se puede transformar para otras aplicaciones. Para ello el ADN micótico puede obtenerse sobre placas de agar o de sangre de animales infectados especialmente con las especies fúngicas de interés. Del ADN micótico así obtenido se pueden recortar p.ej. sondas de ADN, que luego pueden usarse para reacciones de detección o integrarse en plásmidos. Cabe pensar en aplicaciones dentro de todo el ámbito de la investigación básica, en diagnosis, terapéutica, tecnología genética industrial, etc.
Mediante la nueva etapa de detección se captan en un solo proceso muchas especies distintas de hongos, aunque su concentración en la solución de partida sea muy baja, permitiendo, p.ej. en diagnosis, afirmar con gran rapidez y prontitud si realmente hay una infección fúngica. Además el nuevo método es de ejecución tan rápida y sencilla, que también se puede usar en clínica cotidiana y, si es necesario, por parte de personal instruido.
La amplificación tiene lugar por PCR (reacción de polimerasa en cadena) y la detección se puede realizar mediante electroforesis sobre gel, densidad óptica, tinción con marcadores de fijación específica al ácido nucleico, etc. Dichos métodos son altamente específicos y muy sensibles, de manera que conllevan las propiedades deseadas en diagnosis, terapéutica, tecnología genética industrial, etc.
La PCR se efectúa mediante los dos cebadores que tienen las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 1 y SEQ ID-Nº: 2 del registro de secuencias adjunto, los cuales se fijan al ADN de un gran número de diversas especies de hongos e igualmente al gen micótico para el 18 ssu-ARNr.
En este caso es conveniente que pueda producirse ADN en cantidad suficiente, de manera sencilla y entretanto implantada, que luego sea fácilmente detectable y también reutilizable para identificar las respectivas especies de hongos.
Para ello es preferible efectuar la reacción de polimerasa en cadena con el siguiente ciclo:
c1)
desnaturalización durante 0,3-1 min., preferentemente durante 0,5 min., a 90-96ºC, preferentemente a 94ºC;
c2)
hibridación durante 0,5-1,5 min., preferentemente durante 1,0 min., a 58-64ºC, preferentemente a 62ºC; y
c3)
extensión durante 1,5-2,5 min., preferentemente durante 2,0 min., a 68-75ºC, preferentemente a 72ºC.
En este caso, antes de iniciar los pasos del ciclo, se prefiere realizar una etapa de desnaturalización de 5-9 min., preferentemente de 3 min., a 90-96ºC, preferentemente a 94ºC.
Se ha visto que en dichas condiciones la reacción PCR transcurre de manera muy reproducible y sobre todo muy específica, garantizando así que los productos amplificados sean realmente segmentos del ADN micótico original.
Además es preferible que en la etapa d) la detección de los productos amplificados se efectúe mediante electroforesis sobre gel -en concreto sobre un gel de agarosa- tiñéndolos preferentemente con bromuro de etidio.
La ventaja de este método es el uso de un procedimiento de detección conocido y bien establecido, con el cual puede demostrarse que los productos amplificados resultantes de la reacción PCR revelan efectivamente una infección por hongos.
También es preferible que una secuencia de ADN del gen micótico se amplifique para el 18ssu-ARNr.
El inventor de la presente patente ha descubierto, por una parte, que en las diversas cepas y géneros de hongos este gen micótico presenta un fragmento secuencial flanqueado por dos regiones para la fijación de cebadores, que son idénticas para todas las cepas y géneros de hongos, y, por otra parte, que la secuencia de este fragmento es tan diferente para las diversas cepas y géneros de hongos, que puede emplearse para detectar cada una de las especies y géneros de hongos.
\newpage
La presente invención también se refiere a un kit para detectar ADN micótico en una solución investigada. Este kit lleva los cebadores que se fijan al ADN de un gran número de especies de hongos para una reacción de polimerasa en cadena. Este kit contiene preferentemente como cebadores las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 1 y SEQ ID-Nº: 2 del registro de secuencias.
La presente invención también se refiere a un kit para la realización del método arriba mencionado.
En un kit de este tipo es ventajoso que estén reunidas todas las soluciones necesarias y en especial todos los cebadores necesarios, para que puedan ser empleados en el proceso rutinario. Así por ejemplo, en el trabajo diario de laboratorio se puede recurrir a estos nuevos kits para poder detectar especies de hongos en cualquier solución sometida a examen. Además estos kits pueden usarse para amplificar ciertos segmentos de las especies micóticas detectadas, que luego pueden servir p.ej. para posteriores procesos de identificación.
También forma parte de la presente invención la tercera etapa del proceso, ya sea separada o combinada con las etapas 1 y 2, es decir, la determinación de la especie de hongo con la ayuda del ADN micótico extraído y detectado.
La determinación de la especie de hongo debe ser rápida y sencilla de cara al diagnóstico, de modo que también pueda realizarse en la clínica cotidiana y, si es necesario, por parte de personal instruido.
La presente invención resuelve tal problema mediante la siguiente etapa adicional:
e)
Determinación de los fragmentos de secuencia nucleótida del ADN contenido en la solución analizada, característicos para la especie micótica.
\vskip1.000000\baselineskip
Como el método de detección se realiza al nivel de ADN resulta del todo suficiente determinar ciertos segmentos del ADN micótico, siempre que tales segmentos sean específicos de la respectiva especie de hongo. Para ello puede recurrirse a métodos estándar, secuenciando, al menos en parte, los productos amplificados, o añadiéndoles una secuencia auxiliar, analizando la fusión de la doble hélice, etc.
Estos procedimientos son por regla general de ejecución tan rápida y sencilla, que también pueden ser realizados por personal instruido.
Para ello es preferible que en la etapa e) el ADN micótico o segmentos del ADN micótico se hibriden con sondas de ADN específicas para ciertas cepas y/o especies de hongos, de manera que el ensayo de hibridación efectuado con las mismas conduzca a la identificación de la especie micótica.
La ventaja en este caso es el empleo de un proceso de hibridación de muy rápida y fácil ejecución para la detección. Para ello se usan sondas específicas para las correspondientes especies de hongos, que se fijan exclusivamente al segmento amplificado de estas especies. Estos procesos pueden realizarse p.ej. sobre geles, de manera que los híbridos se reconocen luego por tinción. Otro método consiste en aprovechar el distinto comportamiento óptico de hebras sencillas y de regiones de hebras dobles, p.ej. de densidad óptica, en el dicroísmo o similar.
Para comprobar la hibridación efectuada también es preferible marcar las sondas con digoxigenina y detectar los híbridos por el método Southern Blot, p.ej.
Con este paso se simplifica de nuevo el proceso, pues las propias sondas ya van provistas del respectivo marcador, que, empleando tras la hibridación un método conocido, indica la formación del híbrido mediante una reacción cromática ventajosa y visualmente reconocible.
En este caso se prefiere usar como sondas de ADN una o varias secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 3 hasta SEQ ID-Nº: 8 del registro de secuencias adjunto, empleándolas de modo preferentemente secuencial y sucesivo en el orden SEQ ID-Nº: 3, SEQ ID-Nº: 8, SEQ ID-Nº: 6, SEQ ID-Nº: 7, SEQ ID-Nº: 4 y SEQ ID-Nº: 5 y comprobando respectivamente la hibridación.
Con esta hibridación secuencial se pueden ensayar las distintas especies de hongos según el orden de su frecuencia, lo cual permite acelerar claramente el proceso de detección.
La presente invención también se refiere a una de las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 3 - SEQ ID-Nº: 8 del registro de secuencias adjunto.
La presente invención también se refiere al uso de una o varias de esas secuencias nucleótidas como sondas de ADN para identificar especies de hongos.
La ventaja en este caso es que mediante las 6 secuencias nucleótidas citadas pueden distinguirse específicamente entre sí todas las especies fúngicas de interés clínico.
\newpage
La secuencia nucleótida SEQ ID-Nº: 3 sirve aquí para detectar la especie fúngica Candida albicans, la SEQ ID-Nº: 4 para detectar Candida glabrata, la SEQ ID-Nº: 5 para detectar Candida krusei, la SEQ ID-Nº: 6 para detectar Candida tropicalis, la SEQ ID-Nº: 7 para detectar Candida parapsilosis y la SEQ ID-Nº: 8 para detectar especies fúngicas del género Aspergillus, especialmente A. fumigatus, A. flavus, A. versiculor, A. niger, A. nidulans y A. terreus.
La presente invención también se refiere a un kit para identificar especies de hongos, el cual contiene sondas de ADN que se hibridan con fragmentos específicos de secuencias nucleótidas del ADN de la respectiva especie de hongo. El kit contiene preferentemente como sondas de ADN una o varias de las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 3 - SEQ ID-Nº: 8 del registro de secuencias adjunto.
La presente invención se refiere además a un kit para la realización completa del proceso arriba mencionado.
En tal caso es conveniente que un kit de este tipo vaya equipado solo con las sondas de ADN o además con otras soluciones necesarias, con el fin de que en la práctica cotidiana de laboratorio puedan tomarse directamente del kit todas las soluciones patrón requeridas, etc. Así se simplifica notablemente la detección e identificación de la respectiva especie de hongo, ya que no hace falta preparar especialmente en el laboratorio cada solución patrón. Pero también puede ser que en este kit solo se incluyan las sondas y eventualmente los cebadores y las soluciones patrón de enzimas para la reacción de polimerasa en cadena, recurriendo por lo demás a soluciones patrón estándar ya existentes.
Un método que integra ventajosamente todos los pasos del proceso anteriormente descritos para la detección de especies fúngicas en sangre entera comprende las siguientes etapas:
-
separación de las células micóticas predominantemente intactas en la sangre entera,
-
extracción del ADN de las células micóticas aisladas,
-
amplificación de al menos un segmento del ADN micótico extraído, preferentemente de al menos un segmento del gen micótico para el 18ssu-ARNr,
-
detección de los productos amplificados en forma de un dictamen sí/no, y
-
atribución de los productos amplificados a cada especie de hongo mediante hibridación con sondas de ADN específicas para determinadas cepas y/o especies de hongos.
Este método integrado tiene la gran ventaja de que solo requiere una etapa de amplificación, en la cual se amplifica un segmento del ADN micótico, preferentemente un segmento del gen micótico para el 18ssu-ARNr, de tal manera que este producto amplificado puede servir tanto para el dictamen sí/no como para la determinación de la especie fúngica. El inventor de la presente patente ha encontrado por una parte que el gen micótico para el 18ssu-ARNr puede estar flanqueado, al menos de forma segmentada, por dos cebadores iguales para todas las especies micóticas de interés, mientras que por otra parte el amplicón es diferente para la distintas especies, de modo que se puede hibridar con distintas sondas características para las especies de hongos.
En otras palabras, basta un solo paso de amplificación para poder responder a las preguntas de si hay verdaderamente una infección fúngica y de qué especie de hongo se trata. Por lo tanto este método es considerablemente sencillo y fácil de realizar y no requiere conocimientos especiales, por lo cual también puede ser empleado por personal instruido.
De la siguiente descripción se infieren otras ventajas.
Se entiende que las características antes mencionadas y las que todavía deben exponerse no solo son aplicables en las respectivas combinaciones indicadas, sino también en otras combinaciones o aisladamente, sin apartarse del marco de la presente invención.
En la siguiente descripción se indican ejemplos de cada una de las etapas del método, así como su empleo en el marco de un programa de análisis clínicos.
Una ventaja especial del nuevo método es que se lleva a cabo con sangre entera, es decir que p.ej. no hace falta ninguna biopsia ni un suero por preparar. En la sangre entera primero se separan las células micóticas del ADN celular, lo cual es preciso para que el ADN micótico, que puede hallarse en muy poca cantidad, no tenga que ser detectado en presencia de una concentración mucho más elevada de ADN celular. Así se incrementa por lo tanto la especificidad del método de detección. Para ello, en primer lugar se lisan los glóbulos rojos por hemolisis osmótica y luego se disgregan enzimáticamente los glóbulos blancos. Estas dos etapas del método están especialmente seleccionadas para evitar que las células micóticas libres se deterioren y para que las células micóticas eventualmente fagocitadas se liberen sin resultar dañadas, de tal manera que también estén disponibles para la detección.
\newpage
Ejemplo 1
Lisis de los glóbulos rojos por hemolisis osmótica
La lisis de los glóbulos rojos tiene lugar con la ayuda de una solución hipotónica. Para ello se emplea el siguiente tampón con las siguientes concentraciones finales:
Tris pH 7,6
10 mM
MgCl_{2}
5 mM
NaCl
10 mM
La solución se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se centrifuga.
Para esta primera etapa bastan 3 ml de sangre entera.
Ejemplo 2
Disgregación enzimática de los glóbulos blancos
Los glóbulos blancos, que pueden contener células micóticas, se disgregan cuidadosamente digiriendo enzimáticamente las células con Proteinasa K (200 \mug/ml) de la firma Boehringer, Mannheim, en el siguiente tampón con las concentraciones finales indicadas, al cual se incorpora el precipitado del ejemplo 1:
Tris pH 7,6
10 mM
EDTA pH 8,0
10 mM
NaCl
50 mM
SDS
0,2%
Proteinasa K
200 \mug/ml
Este tampón se incubó durante dos horas a 65ºC.
Ejemplo 3
Separación de las células micóticas predominantemente intactas, sobre todo del ADN celular
Una vez disgregadas las células sanguíneas como en los ejemplos 1 y 2, dejando libre el ADN celular, se lleva a cabo una etapa de centrifugación a 5000 revoluciones/min., la cual produce una pérdida considerable de ADN celular que no sedimenta en esta etapa de centrifugación.
El sedimento contiene ahora todas las células micóticas libres o liberadas, que luego se introducen en un tampón (de agua bidestilada) para la posterior elaboración.
Ejemplo 4
Disgregación de las células micóticas
A continuación, las células micóticas se someten a un lisado alcalino y se tratan enzimáticamente, para liberar el ADN micótico.
Además, primero se lleva a cabo una lisis alcalina con 200 ml de NaOH 50 mM durante 10 min. a 95ºC.
Después tiene lugar una etapa de neutralización con 1 M Tris-HCl de pH 7,0.
A continuación se añaden 500 \mul de zimoliasa de Sigma (300 \mug/ml) y la solución se incuba durante 60 min. a 37ºC, a fin de disgregar las células enzimáticamente.
Luego se añaden 500 \mul de Tris/EDTA y 50 \mul de solución de SDS al 10% y la mezcla se incuba a 65ºC durante 20 min., a fin de desnaturalizar la proteína.
\newpage
Ejemplo 5
Separación del ADN micótico
La solución contiene ahora detritus de las células micóticas y ADN micótico libre, que debe aislarse.
Para ello se efectúa primero una precipitación proteica con acetato potásico 5 M, después se retira el sobrenadante y luego se precipita el ADN con isopropanol helado. Este producto precipitado se utiliza para las posteriores etapas del proceso.
Por tanto con las etapas de proceso 1 - 5 indicadas se puede extraer de modo muy selectivo ADN micótico de la sangre entera, que en este punto se halla en forma de un precipitado contaminado con ADN celular, lo cual permite ahora detectarlo con gran sensibilidad y especificidad.
Ejemplo 6
Amplificación de un segmento de ADN específico de la especie de hongo
En esta etapa del proceso hay que detectar primero si realmente hay ADN micótico en el precipitado procedente de la etapa del ejemplo 5. Para ello se aprovecha que las secuencias de ADN registradas como SEQ ID-Nº: 1 y SEQ ID-Nº: 2 se unen específicamente a sitios de fijación del gen micótico para el 18ssu-ARNr de muchas cepas y especies de hongos.
El inventor de esta patente ha encontrado que este gen micótico presenta en las diversas cepas y géneros de hongos un segmento secuencial de tal tipo, que, por una parte, está flanqueado por dos regiones de fijación para cebadores, idénticas para todas las cepas y géneros de hongos, aunque, por otra parte, la secuencia de este segmento es tan diferente en las diversas cepas y géneros de hongos, que puede emplearse al mismo tiempo para detectar cada especie y género de hongo.
En este caso la secuencia de ADN SEQ ID-Nº: 1 se fija a la cadena codificante, mientras que la secuencia de ADN SEQ ID-Nº: 2 se fija a la cadena antisentido, de modo que la distancia entre ambos sitios de fijación es de unos 500 pares de bases. Por tanto ambas secuencias SEQ ID-Nº: 1 y SEQ ID-Nº: 2 son adecuadas como cebadores para una reacción de polimerasa en cadena (PCR), en la cual se generan luego productos amplificados (amplicones) con una longitud de aprox. 500 pares de bases.
En la siguiente tabla 1 se indica la situación de los cebadores y la longitud del correspondiente amplicón.
TABLA 1 Amplicones obtenidos de agentes patógenos de hongos
1
Por tanto mediante el método PCR y estos dos cebadores SEQ ID-Nº: 1 y SEQ ID-Nº: 2 se pueden preparar amplicones de unos 500 pares de bases en cantidad suficiente para todas las especies de hongos importantes, pertenecientes a los géneros Candida y Aspergillus.
En este caso las condiciones de PCR son las siguientes:
Tampón (50 \mul):
10 mM Tris pH 9,6
50 mM NaCl
10 mM MgCl_{2}
0,2 mg/ml BSA
Polimerasa
0,5 mM de nucleótidos respectivamente
100 pM de cebadores respectivamente
Desnaturalización inicial: 3 min. a 94ºC
Desnaturalización cíclica: 0,5 min. a 94ºC
Hibridación: 1 min. a 62ºC
Extensión: 2 min. a 72ºC
Extensión terminal: 5 min. a 72ºC
Número de ciclos: 34.
La elevada concentración de magnesio en el tampón proporciona una elevada especificidad de la polimerasa, la cual con 72ºC en la etapa de extensión puede trabajar a su temperatura óptima.
Con estos cebadores pudieron amplificarse con éxito en total 40 cepas de Candida albicans, 10 cepas de Candida tropicalis, 6 cepas de Candida parapsilosis, 11 cepas de Candida glabrata, 8 cepas de Candida krusei, 8 cepas de Aspergillus fumigatus, 6 cepas de Aspergillus flavus, 5 cepas de Aspergillus terreus, 7 cepas de Aspergillus niger, 5 cepas de Aspergillus nidulans y 3 cepas de Aspergillus versiculor.
Ejemplo 7
Detección de los productos amplificados del ejemplo 6
Ahora en la siguiente etapa hay que detectar si en la reacción PCR del ejemplo 6 también se han amplificado efectivamente segmentos de ADN hasta una longitud aproximada de 500 pares de bases. Esta detección de los segmentos de ADN específicos de hongos tiene lugar tiñendo las bandas específicas con bromuro de etidio en un gel de agarosa al 2%.
Si se identifica la banda específica puede deducirse la existencia de una infección fúngica, puesto que los cebadores SEQ ID-Nº: 1 y SEQ ID-Nº: 2 se fijan a todas las cepas de hongos arriba citadas. Por lo tanto, si mediante las etapas de proceso de los ejemplos 1 - 5 se ha extraído ADN micótico, éste se amplifica de tal modo en la etapa PCR del ejemplo 6, que entonces puede detectarse con bromuro de etidio.
Ejemplo 8
Atribución de los productos amplificados del ejemplo 6 a cada especie de hongo
Para proceder a una terapia concreta aún es necesario especificar más exactamente la infección fúngica detectada en la etapa 7. Aquí se pone de manifiesto otra ventaja de la PCR del ejemplo 6. Allí se han generado tantos segmentos de ADN específicos de hongos, que ahora son posibles más métodos de detección para determinar la especie de hongo.
Para ello se emplean las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 3 hasta SEQ ID-Nº: 8 indicadas en el registro, las cuales sirven de sondas específicas para las especies y se hibridan específicamente con un fragmento secuencial del segmento de ADN generado en el ejemplo 6.
Se ha visto que la sonda SEQ ID-Nº: 3 se hibrida con Candida albicans, la SEQ ID-Nº: 4 con Candida glabrata, la SEQ ID-Nº: 5 con Candida krusei, la SEQ ID-Nº: 6 con Candida tropicalis, la SEQ ID-Nº: 7 con Candida parapsilosis y la SEQ ID-Nº: 8 con Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. versiculor, A. niger, A. nidulans y A. terreus. Por lo tanto la secuencia nucleótida SEQ ID-Nº: 8 es una sonda general de Aspergillus, mientras que las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 3 hasta SEQ ID-Nº: 5 pueden distinguir una de otra las especies de hongos del género Candida.
Para poder comprobar la hibridación acabada, las sondas se marcan con digoxigenina mediante el kit de transferasa de la firma Boehringer, Mannheim, y la detección se efectúa por el método Southern Blot con la reacción cromática habitual.
Mediante estas sondas tiene lugar una hibridación secuencial, escalonada según la frecuencia de cada especie de hongo, de modo que primero se hibrida con SEQ ID-Nº: 3 (C. albicans), luego con SEQ ID-Nº: 8 (Aspergillus), SEQ ID-Nº: 6 (C. tropicalis), SEQ ID-Nº: 7 (C. parapsilosis), SEQ ID-Nº: 4 (C. glabrata) y finalmente con SEQ ID-Nº: 5 (C. krusei).
Por lo tanto la hibridación secuencial de los productos de amplificación generados en la etapa del ejemplo 6 permite de esta manera identificar las especies de hongos e iniciar una terapia adecuada.
Ejemplo 9
Detección de células micóticas sembradas en sangre
Mediante la amplificación específica y la hibridación secuencial se consiguieron detectar células micóticas de modo reproducible, con una sensibilidad de 1 - 3 células. Sembrando especies de hongos en muestras de sangre pudo comprobarse que el método anterior alcanza la sensibilidad de una denominada CFU (unidad formadora de colonia)/ml de sangre. Este límite de detección queda muy por debajo de los que cabe esperar en una siembra clínicamente relevante de hongos en sangre.
Ejemplo 10
Programa de análisis clínico
En un programa de análisis clínico de gran alcance pudo demostrarse que el nuevo método tenía una gran especificidad para el análisis de 165 muestras de sangre de 65 probandos. Todas las 165 muestras de sangre resultaron negativas.
Después se examinaron 94 pacientes inmunosuprimidos con fiebre confusa, para investigar la presencia de una infección fúngica. De los 69 pacientes que no tenían ninguna infección fúngica invasiva también fueron negativas más de 200 muestras de sangre (salvo una excepción).
En cambio todos los 25 pacientes con infección fúngica invasiva ya pudieron ser identificados como positivos dentro de la primera semana. Asimismo se logró determinar para todos los pacientes el agente micótico causante de la infección.
INDICACIONES GENERALES:
\vskip1.000000\baselineskip
SOLICITANTE:
NOMBRE: Universidad Eberhard-Karls de Tübbingen
VÍA PÚBLICA: Geissweg 3
LOCALIDAD: Tübingen
PAÍS: Alemania
CÓDIGO POSTAL: 72076
TELÉFONO: 07071-29-1
TELEFAX: 07071-293966
DENOMINACIÓN DE LA PATENTE: Extracción de ADN micótico
NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
VERSIÓN INFORMÁTICA LEGIBLE:
\hskip0.5cm SOPORTE DE DATOS: (sigue)
\hskip0.5cm ORDENADOR:
\hskip0.5cm SISTEMA OPERATIVO:
\hskip0.5cm PROGRAMA: 
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
EXPEDIENTE LEGAL: 5402P102 
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA SECUENCIA SEQ ID-Nº:1:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\hskip0.5cm LONGITUD: 20 pares de bases
\hskip0.5cm TIPO: ácido nucleico
\hskip0.5cm FORMA DE CADENA: simple
\hskip0.5cm TOPOLOGÍA: lineal
HIPOTÉTICA: SÍ
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID-Nº:1: 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTGGAGGGC AAGTCTGGTG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA SECUENCIA SEQ ID-Nº:2:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\hskip0.5cm LONGITUD: 20 pares de bases
\hskip0.5cm TIPO: ácido nucleico
\hskip0.5cm FORMA DE CADENA: simple
\hskip0.5cm TOPOLOGÍA: lineal
HIPOTÉTICA: SÍ
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID-Nº:2: 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGATCCCTA GTCGGCATAG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA SECUENCIA SEQ ID-Nº:3:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\hskip0.5cm LONGITUD: 30 pares de bases
\hskip0.5cm TIPO: ácido nucleico
\hskip0.5cm FORMA DE CADENA: simple
\hskip0.5cm TOPOLOGÍA: lineal
HIPOTÉTICA: SÍ
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID-Nº:3: 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTGGGTAGC CATTTATGGC GAACCAGGAC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA SECUENCIA SEQ ID-Nº:4:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\hskip0.5cm LONGITUD: 30 pares de bases
\hskip0.5cm TIPO: ácido nucleico
\hskip0.5cm FORMA DE CADENA: simple
\hskip0.5cm TOPOLOGÍA: lineal
HIPOTÉTICA: SÍ
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID-Nº:4: 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTCTGGCTAA CCCCAAGTCC TTGTGGCTTG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA SECUENCIA SEQ ID-Nº:5:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\hskip0.5cm LONGITUD: 30 pares de bases
\hskip0.5cm TIPO: ácido nucleico
\hskip0.5cm FORMA DE CADENA: simple
\hskip0.5cm TOPOLOGÍA: lineal
HIPOTÉTICA: SÍ
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID-Nº:5: 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCTTTCCTT CTGGCTAGCC TCGGGCGAAC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA SECUENCIA SEQ ID-Nº:6:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\hskip0.5cm LONGITUD: 30 pares de bases
\hskip0.5cm TIPO: ácido nucleico
\hskip0.5cm FORMA DE CADENA: simple
\hskip0.5cm TOPOLOGÍA: lineal
HIPOTÉTICA: SÍ
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID-Nº:6: 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTGGCCGGT CCATCTTTCT GATGCGTACT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA SECUENCIA SEQ ID-Nº:7:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\hskip0.5cm LONGITUD: 30 pares de bases
\hskip0.5cm TIPO: ácido nucleico
\hskip0.5cm FORMA DE CADENA: simple
\hskip0.5cm TOPOLOGÍA: lineal
HIPOTÉTICA: SÍ
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID-Nº:7: 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTCCTTCTG GCTAGCCTTT TTGGCGAACC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA SECUENCIA SEQ ID-Nº:8:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\hskip0.5cm LONGITUD: 30 pares de bases
\hskip0.5cm TIPO: ácido nucleico
\hskip0.5cm FORMA DE CADENA: simple
\hskip0.5cm TOPOLOGÍA: lineal
HIPOTÉTICA: SÍ
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID-Nº:8: 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATGGCCTTC ACTGGCTGTG GGGGGAACCA 
\hfill
30

Claims (33)

1. Secuencia nucleótida SEQ ID-Nº: 1 del registro adjunto de secuencias.
2. Secuencia nucleótida SEQ ID-Nº: 2 del registro adjunto de secuencias.
3. Uso de las secuencias nucleótidas de las reivindicaciones 1 y 2 como cebadores para amplificar un segmento del gen micótico para el 18su-ARNr de un gran número de especies de hongos en una reacción de polimerasa en cadena.
4. Método para detectar ADN micótico en material clínico, extrayendo ADN micótico de sangre entera, que comprende las siguientes etapas:
a)
separación de las células micóticas mayormente intactas en la sangre entera por
a1)
disgregación de las células sanguíneas presentes en la sangre entera;
a2)
separación de las células micóticas mayormente intactas del ADN celular;
b)
extracción de ADN de las células micóticas separadas por
b1)
disgregación de las células micóticas separadas, y
b2)
separación del ADN micótico;
c)
amplificación mediante reacción de polimerasa en cadena de al menos un segmento del ADN micótico a detectar, empleando las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 1 y SEQ ID-Nº: 2 del registro adjunto de secuencias, y
d)
dado el caso, detección de los productos amplificados.
5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque la etapa a) incluye los siguientes pasos adicionales:
a1.1)
lisis de los glóbulos rojos por hemolisis osmótica;
a1.2)
disgregación enzimática de los glóbulos blancos; y
a2.1)
centrifugación de la sangre entera así tratada y empleo del precipitado en las siguientes etapas del proceso.
6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque en el paso a1.1) la lisis de los glóbulos rojos tiene lugar con la ayuda de una solución hipotónica y un detergente, preferentemente con una concentración final de 10 mM de Tris a pH 7,6, 5 mM de MgCl_{2} y 10 mM de NaCl.
7. Método según la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque en el paso a1.2) la disgregación enzimática de los glóbulos blancos tiene lugar en una solución con una concentración final de 200 \mug/ml de proteinasa K, 10 mM de Tris a pH 7,6, 10 mM de EDTA a pH 8, 0,50 mM de NaCl y 0,2% de SDS.
8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque la solución se incuba durante 100 - 140 min., preferentemente durante 120 min. a 60-70ºC, sobre todo a 65ºC.
9. Método según una de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porque la etapa b1) incluye el siguiente paso adicional:
b1.1)
lisado alcalino y tratamiento enzimático de las células micóticas.
10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque el paso b1.1) incluye las siguientes operaciones:
-
incubación de las células micóticas existentes en el precipitado del paso a2.1) a 90-95ºC, preferentemente a 95ºC durante 5-15 min., sobre todo durante 10 min., en una solución con 50 mM de NaHO, y
-
neutralización con Tris-HCl 1 M a pH 7,0,
-
tratamiento enzimático con zimoliasa durante 50-70 min. preferentemente durante 60 min. a 30-40ºC, sobre todo a 37ºC,
-
desnaturalización proteica por incubación con Tris/EDTA a 60-70ºC, preferentemente a 65ºC durante 10-30 min., sobre todo durante 20 min.
11. Método según la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque la etapa b2) incluye los siguientes pasos adicionales:
-
precipitación proteica con acetato potásico 5 M y
-
precipitación del ADN del sobrenadante en isopropanol helado.
12. Método según una de las reivindicaciones 4 a 11, caracterizado porque en la etapa c) la reacción de polimerasa en cadena se realiza mediante el siguiente ciclo:
c1)
desnaturalización durante 0,3-1 min., preferentemente durante 0,5 min., a 90-95ºC, sobre todo a 94ºC,
c2)
hibridación durante 0,5-1,5 min., preferentemente durante 1,0 min., a 58-64ºC, sobre todo a 62ºC, y
c3)
extensión durante 1,5-2,5 min., preferentemente durante 2,0 min., a 68-75ºC, sobre todo a 72ºC.
13. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque antes de iniciar los pasos del ciclo se efectúa una desnaturalización de 5-9 min., preferentemente de 3 min., a 90-96ºC, sobre todo a 94ºC.
14. Método según una de las reivindicaciones 4 hasta 11 o 12 o 13, caracterizado porque en la etapa d) los productos amplificados se detectan por electroforesis de gel, preferiblemente sobre un gel de agarosa, y para tal fin se tiñen con bromuro de etidio.
15. Kit para detectar ADN micótico en una solución sometida a análisis, caracterizado porque como cebadores se usan las secuencias nucleótidas de las reivindicaciones 1 y 2.
16. Secuencia nucleótida SEQ ID-Nº: 3 del registro adjunto de secuencias.
17. Secuencia nucleótida SEQ ID-Nº: 4 del registro adjunto de secuencias.
18. Secuencia nucleótida SEQ ID-Nº: 5 del registro adjunto de secuencias.
19. Secuencia nucleótida SEQ ID-Nº: 6 del registro adjunto de secuencias.
20. Secuencia nucleótida SEQ ID-Nº: 7 del registro adjunto de secuencias.
21. Secuencia nucleótida SEQ ID-Nº: 8 del registro adjunto de secuencias.
22. Empleo de una o varias secuencias nucleótidas de las reivindicaciones 16 a 21 como sonda de ADN para identificar especies de hongos.
23. Uso de la secuencia nucleótida de la reivindicación 16 para detectar la especie micótica Candida albicans.
24. Uso de la secuencia nucleótida de la reivindicación 17 para detectar la especie micótica Candida glabrata.
25. Uso de la secuencia nucleótida de la reivindicación 18 para detectar la especie micótica Candida krusei.
26. Uso de la secuencia nucleótida de la reivindicación 19 para detectar la especie micótica Candida tropicalis.
27. Uso de la secuencia nucleótida de la reivindicación 20 para detectar la especie micótica Candida parapsilosis.
28. Uso de la secuencia nucleótida de la reivindicación 21 para detectar especies de hongos del género Aspergillus.
29. Método para identificar especies de hongos, a realizar preferentemente de manera combinada con el método según una de las reivindicaciones 4 a 11 o 12 a 14, con la siguiente etapa adicional:
e)
determinación de los fragmentos de secuencia nucleótida del ADN contenido en la solución analizada que son característicos de las especies de hongos,
hibridizando en la etapa e) el ADN micótico o segmentos de ADN micótico eventualmente amplificados según la etapa c) con sondas de ADN específicas de determinadas cepas y/o especies de hongos, de manera que el ensayo de la hibridación acabada conduce luego a la identificación de las especies de hongos, caracterizado porque como sondas de ADN se usan una o varias de las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 3 hasta SEQ ID-Nº: 8 del registro adjunto de secuencias.
30. Método según la reivindicación 29, caracterizado porque para comprobar la hibridación efectuada las sondas se marcan con digoxigenina y los híbridos se detectan p.ej. mediante el método Southern Blot.
31. Método según la reivindicación 29 o 30, caracterizado porque las sondas de ADN se utilizan secuencialmente una tras otra, preferentemente en el orden SEQ ID-Nº: 3, SEQ ID-Nº: 8, SEQ ID-Nº: 6, SEQ ID-Nº: 7, SEQ ID-Nº: 4 y SEQ ID-Nº: 5 y si es preciso se comprueba la hibridación.
32. Kit para identificar especies de hongos, caracterizado porque como sondas de ADN lleva una o varias de las secuencias nucleótidas de las reivindicaciones 16 hasta 21.
33. Método para detectar especies de hongos en sangre entera, que comprende las siguientes etapas:
-
separación de las células micóticas mayormente intactas en la sangre entera,
-
extracción de ADN de las células micóticas separadas,
-
amplificación de al menos un segmento del ADN micótico extraído, en concreto de un segmento del gen micótico para el 18ssu-ARNr empleando las secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 1 y SEQ ID-Nº: 2 del registro de secuencias adjunto,
-
detección de los productos amplificados en forma de un dictamen sí/no, y
-
atribución de los productos amplificados a cada especie de hongo mediante la hibridación con una o varias secuencias nucleótidas SEQ ID-Nº: 3 hasta SEQ ID-Nº: 8, como sondas de ADN.
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