ES2301754T3 - Analisis de pruebas multiples de amplificaciones de acidos nucleicos en tiempo real. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para determinar la presencia de un ácido nucleico en una muestra que comprende las etapas proporcionar una entidad fluorescente que pueda indicar la presencia del ácido nucleico y que pueda proporcionar una señal relacionada con la cantidad del ácido nucleico, amplificar el ácido nucleico mediante una pluralidad de ciclos de amplificación en presencia de la entidad fluorescente, medir la intensidad de fluorescencia de la entidad fluorescente en cada uno de la pluralidad de ciclos de amplificación para producir un valor fluorescente para cada ciclo relacionado con la cantidad de ácido nucleico presente en cada ciclo, obtener una puntuación individual de cada una de una pluralidad de pruebas, usando cada una de la pluralidad de pruebas los valores de fluorescencia para generar la puntuación individual, introducir las puntuaciones en una función para generar una puntuación compuesta y comparar la puntuación compuesta con intervalos predeterminados para hacer una llamada positiva, negativa o indeterminada de la presencia del ácido nucleico.
Description
Análisis de pruebas múltiples de amplificaciones
de ácidos nucleicos en tiempo real.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para analizar la presencia de un analito en una
muestra. Más particularmente, la presente invención se refiere a un
procedimiento automatizado para detectar e informar de la presencia
de un analito en una muestra poniendo en contacto la muestra con un
sustrato para alterar la cantidad del analito o sustrato y analizar
los datos obtenidos mientras se altera la cantidad del analito o
sustrato.
La amplificación de ADN mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental para la
biología molecular. El análisis de ácidos nucleicos por PCR requiere
la preparación de muestras, amplificación y análisis de productos.
Aunque estas etapas se realizan normalmente secuencialmente, la
amplificación y el análisis pueden producirse simultáneamente. Los
colorantes de ADN o sondas fluorescentes pueden añadirse a la
mezcla de PCR antes de la amplificación y usarse para analizar
productos de PCR durante la amplificación. El análisis de muestras
se produce simultáneamente con la amplificación en el mismo tubo
dentro del mismo instrumento. Esta solución combinada disminuye la
manipulación de muestras, ahorra tiempo y reduce extraordinariamente
el riesgo de contaminación de productos para reacciones
posteriores, ya que no existe la necesidad de sacar las muestras de
sus recipientes cerrados para análisis posteriores. El concepto de
combinar la amplificación con el análisis de productos se conoce
como PCR en "tiempo real". Véase, por ejemplo, la patente de
EE.UU. No. 6.174.670.
El control de la fluorescencia de cada ciclo de
PCR implicó inicialmente el uso de bromuro de etidio. Higuchi R, G
Dollinger, PS Walsh y R. Griffith, Simultaneous amplification and
detection of specific DNA sequences, Bio/Technology
10:413-417, 1992; Higuchi R, C Fockler G Dollinger y
R Watson, Kinetic PCR analysis: real time monitoring of DNA
amplification reactions, Bio/Technology
11:1026-1030, 1993. En ese sistema, la fluorescencia
se mide una vez por ciclo como una medida relativa de la
concentración de producto. El bromuro de etidio detecta ADN
bicatenario; si el molde está presente, la intensidad de
fluorescencia aumenta con el ciclado de temperatura. Además, el
número de ciclos en el que primero se detecta un aumento en la
fluorescencia aumenta de manera inversamente proporcional al
logaritmo de la concentración de molde inicial. Se han desarrollado
otros sistemas fluorescentes que pueden proporcionar datos
adicionales referentes a la concentración y secuencia de ácidos
nucleicos.
Aunque la PCR es una herramienta inestimable de
la biología molecular, la implementación práctica de las técnicas
de PCR en tiempo real se ha quedado atrás de la promesa conceptual.
Realmente, la instrumentación actualmente disponible generalmente
no analiza datos durante la PCR; simplemente adquiere los datos para
análisis posterior. Después de que la PCR se ha completado, se
necesitan múltiples etapas manuales para analizar los datos
adquiridos, y normalmente se requiere la opinión humana para
obtener el resultado del análisis. Lo que se necesita es un sistema
para automatizar la adquisición y el análisis de datos de manera que
no se requiera intervención del usuario para informar de los
resultados analíticos. Por tanto, cuando se completa el ciclado de
temperatura en una amplificación por reacción en cadena de la
polimerasa, el software del sistema se activa automáticamente y los
resultados, por ejemplo, la presencia o ausencia de un patógeno
dado, se muestran inmediatamente en la pantalla. Se necesitan
algoritmos para la detección, cuantificación y genotipado. Además,
el inicio del algoritmo de análisis puede implementarse antes de
completarse el ciclado de temperatura. El procesamiento de datos
puede producirse durante la amplificación y los resultados de
análisis concomitantes pueden usarse para modificar el ciclado de
temperatura y para adquirir datos adicionales durante las últimas
fases del procedimiento de amplificación para optimizar el
protocolo de amplificación y la calidad de los datos.
Un problema importante en la automatización del
análisis de datos de PCR es la identificación de la fluorescencia
del nivel inicial. La fluorescencia de fondo varía de reacción a
reacción. Además, es frecuente el desplazamiento del nivel inicial,
en el que la fluorescencia aumenta o disminuye sin relación con la
amplificación de ácidos nucleicos en la muestra. Intentos
anteriores por automatizar el análisis de datos de amplificación
implicaron fijar la fluorescencia del nivel inicial como la
fluorescencia medida en uno o más números de ciclos previos
predeterminados. Esta técnica explica la variación en la
fluorescencia de fondo, pero no compensa el desplazamiento del
nivel inicial. Sin la compensación del desplazamiento del nivel
inicial, el análisis automatizado de datos de amplificación puede
proporcionar fácilmente tanto resultados negativos falsos como
positivos falsos.
Por tanto, en un aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para determinar la
presencia de un ácido nucleico en una muestra, comprendiendo el
procedimiento las etapas de proporcionar una entidad fluorescente
que pueda indicar la presencia del ácido nucleico y que pueda
proporcionar una señal relacionada con la cantidad del ácido
nucleico, amplificar el ácido nucleico mediante una pluralidad de
ciclos de amplificación en presencia de la entidad fluorescente,
medir la intensidad de fluorescencia de la entidad fluorescente en
cada uno de la pluralidad de ciclos de amplificación para producir
un valor fluorescente para cada ciclo relacionado con la cantidad
de ácido nucleico presente en cada ciclo, obtener una puntuación de
cada una de una pluralidad de pruebas, usando cada una de la
pluralidad de pruebas los valores de fluorescencia para generar la
puntuación, introducir las puntuaciones en una función para generar
una puntuación compuesta y comparar la puntuación compuesta con
intervalos predeterminados para hacer una llamada positiva, negativa
o indeterminada de la presencia del ácido nucleico en la muestra.
En una realización ilustrada, las pruebas comprenden una prueba del
intervalo de confianza y una prueba de la relación señal/ruido.
En otro aspecto de la invención se proporciona
un procedimiento para determinar la presencia de un analito en la
muestra, que comprende las etapas de poner en contacto el analito
con un sustrato para alterar la cantidad del analito o el sustrato,
en el que el analito se pone en contacto con el sustrato durante un
periodo de tiempo predeterminado, generar una señal relacionada con
la cantidad o calidad del analito o el sustrato, medir la
intensidad de señal durante dicho periodo de tiempo predeterminado,
de forma que los valores de intensidad se obtienen para una
pluralidad de momentos, obtener una puntuación individual de cada
una de una pluralidad de pruebas, comprendiendo la pluralidad de
pruebas una prueba del intervalo de confianza y una prueba de la
relación señal/ruido, introducir las puntuaciones en una función
para generar una puntuación compuesta y comparar la puntuación
compuesta con intervalos predeterminados para hacer una llamada
positiva, negativa o indeterminada de la presencia del analito en
la muestra. Ejemplos ilustrados del analito incluyen, pero no se
limitan a, ácidos nucleicos, bacterias, antígenos y enzimas, y
ejemplos ilustrados de la señal incluyen, pero no se limitan a,
fluorescencia, absorbancia óptica, densidad óptica, indicadores
colorimétricos, indicadores enzimáticos, quimioluminiscencia e
indicadores radiactivos.
Rasgos adicionales de la presente invención
serán evidentes para aquellos expertos en la materia tras considerar
la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas
que ilustran el mejor modo de llevar a cabo la invención como se
percibe actualmente.
Las figs. 1a-l muestran una
comparación de tres esquemas de control de fluorescencia, (figs. 1a,
d, g, j) colorante de ADNb, (figs. 1b, e, h, k) sonda de
exonucleasa y (figs. 1c, f, i, l) sonda de hibridación, para
amplificación por PCR, en las que cada esquema se ilustra (figs.
1a-c) antes de la amplificación y (figs.
1d-f) después de la amplificación, y los valores de
fluorescencia se muestran (figs. 1 g-i) una vez
durante cada ciclo de PCR y (figs. 1j-l)
continuamente durante la PCR;
la fig. 2 es una gráfica que ilustra el
crecimiento logístico;
las figs. 3a-f muestran una
comparación de diversos tipos de curvas de ciclos frente a
fluorescencia;
la fig. 4 ilustra un análisis de ventana
deslizante para determinar la pendiente de la gráfica de
fluorescencia frente al número de ciclos en cada ciclo;
la fig. 5 muestra gráficas típicas de
fluorescencia frente a ciclos de amplificación para (A) una muestra
negativa y (B) una muestra positiva;
la fig. 6 también muestra gráficas típicas de
amplificación en las que (A) muestra fluorescencia frente al ciclo
de amplificación, (B) es la primera derivada de la fluorescencia
frente al ciclo de amplificación y (C) es la segunda derivada de la
fluorescencia frente al ciclo de amplificación;
las fig. 7-11 muestra los
resultados de diversas muestras en las que los círculos blancos
abiertos representan la medición de fluorescencia en cada ciclo,
los círculos negros abiertos representan las primeras derivadas,
los círculos negros cerrados representan las segundas derivadas, los
círculos negros grandes conectados por líneas representan los
puntos que contribuyen al cálculo del nivel inicial y las líneas
horizontales ilustran la región de nivel inicial; las fig. 7 y 8
ilustran resultados positivos, mientras que las figs.
9-11 ilustran resultados negativos;
la fig. 12 muestra los resultados del análisis
de siete pruebas, en los que el Valor de llamada, o
log(Puntuación) se representa frente al número de muestras.
El intervalo (-1, 1) para llamadas indeterminadas está marcado por
líneas de puntos.
En la descripción y las reivindicaciones de la
invención se usará la siguiente terminología según las definiciones
expuestas a continuación.
Como se usa en este documento, "ácido
nucleico", "ADN" y términos similares también incluyen
análogos de ácidos nucleicos, es decir, análogos que tienen un
esqueleto distinto de uno fosfodiéster. Por ejemplo, los denominados
"ácidos nucleicos peptídicos", que se conocen en la técnica y
tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en el
esqueleto, se consideran dentro del alcance de la presente
invención.
Como se usa en este documento, "par de
transferencia de energía de
fluorescencia-resonancia" o "par FRET" se
refiere a un par de fluoróforos que comprenden un fluoróforo donante
y un fluoróforo aceptor, en el que el fluoróforo donante puede
transferir energía de resonancia al fluoróforo aceptor. En otras
palabras, el espectro de emisión del fluoróforo donante se solapa
con el espectro de absorción del fluoróforo aceptor. En pares de
transferencia de energía de fluorescencia-resonancia
preferidos, el espectro de absorción del fluoróforo donante no se
solapa sustancialmente con el espectro de absorción del fluoróforo
aceptor.
Como se usa en este documento, "par de
oligonucleótidos FRET" se refiere a un par de oligonucleótidos,
cada uno marcado con un miembro de un par de transferencia de
energía de fluorescencia-resonancia, en el que la
hibridación con secuencias complementarias de ácidos nucleicos diana
lleva a las entidades fluorescentes a una relación de transferencia
de energía de fluorescencia-resonancia.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un procedimiento para analizar la presencia de un ácido nucleico en
una muestra, en el que la muestra se amplifica, preferentemente
usando PCR, en presencia de una sonda fluorescente que puede
detectar la presencia de la muestra de ácido nucleico. En una
realización se determina una región de nivel inicial mediante
comparación de la fluorescencia a diversos ciclos de amplificación,
y la fluorescencia en cada uno de los diversos ciclos de
amplificación se compara con la región de nivel inicial para
determinar si las mediciones de fluorescencia quedan fuera de esa
región de nivel inicial. En otra realización se realizan diversas
pruebas en los datos fluorescentes adquiridos durante la
amplificación, produciendo cada una de las pruebas una puntuación
numérica. Entonces, las puntuaciones se usan para determinar un
valor compuesto, y se hace una llamada basada en ese valor.
Recientemente se han puesto a disposición muchas
sondas diferentes para controlar PCR. Aunque no son específicas
para secuencias, en cualquier amplificación pueden usarse colorantes
específicos de ADN bicatenario (ADNb) sin la necesidad de síntesis
de sondas. Tales colorantes incluyen bromuro de etidio y SYBR^{TM}
Green I. Con colorantes de ADNb, la especificidad del producto
puede aumentarse mediante el análisis de curvas de fusión o
adquiriendo fluorescencia a una alta temperatura a la que se han
fundido los productos no específicos. Ririe KM, Rasmussen RP y CT
Wittwer, Product differentiation by analysis of DNA melting curves
during the polymerase chain reaction, Anal. Biochem.
245-154-160, 1997; Morrison TB,
J&J Weis y CT Wittwer, Quantification of low copy transcripts
by continuous SYBR Green I monitoring during amplification,
BioTechniques 24:954-962, 1998.
Las sondas de oligonucleótidos también pueden
estar covalentemente marcadas con moléculas fluorescentes. Los
cebadores de horquilla (cebadores Sunrise^{TM}), sondas de
horquilla (Molecular Beacons^{TM}) y sondas de exonucleasa
(TaqMan^{TM}) son oligonucleótidos de doble marca que pueden
controlarse durante la PCR. Estas sondas dependen de la extinción
de la fluorescencia de un fluoróforo por un extintor de
fluorescencia en el mismo oligonucleótido. La fluorescencia aumenta
cuando se produce la hibridación o hidrólisis de exonucleasa.
Un diseño de sonda ilustrado emplea dos
oligonucleótidos, cada uno marcado con una sonda fluorescente. La
hibridación de estos oligonucleótidos con un ácido nucleico diana
aproxima las dos sondas fluorescentes para permitir que se produzca
la transferencia de energía de resonancia. Wittwer CT, MG Herrmann,
AA Moss y RP Rasmussen, Continuous fluorescence monitoring of rapid
cycle DNA amplification, BioTechniques 22:130-138,
1997. Estas sondas de hibridación sólo requieren marca única
fluorescente por sonda y son más fáciles de diseñar y sintetizar
que las sondas de doble marca. Los pares de fluoróforos aceptables
para uso como pares de transferencia de energía de
fluorescencia-resonancia son muy conocidos para
aquellos expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a,
fluoresceína/rodamina, ficoeritrina/Cy7, fluoresceína/Cy5,
fluoresceína/Cy5.5, fluoresceína/LC Red 640 y fluoresceína/LC Red
705. También pueden emplearse pares de oligonucleótidos FRET
donante-extintor de fluorescencia, en los que la
fluorescencia del fluoróforo donante se extingue por el fluoróforo
extintor de fluorescencia cuando las dos sondas fluorescentes se
aproximan. Se entiende que, cuando se usan los pares de
oligonucleótidos FRET donante-extintor de
fluorescencia, los valores de fluorescencia, y de ahí todos los
valores máximos y mínimos, serán la inversa como se describe más
adelante.
Otro tipo de sonda de hibridación, una "sonda
de oligonucleótidos de marca única", emplea una sonda de
oligonucleótidos en la que cada sonda está construida por un único
oligonucleótido y un único colorante fluorescente. Las sondas de
oligonucleótidos se construyen de forma que la hibridación de la
sonda con una secuencia diana afecte la emisión fluorescente del
colorante fluorescente. Las sondas de oligonucleótidos de marca
única pueden emplear diversos diseños de sonda. En un diseño, la
hibridación de la sonda con la secuencia diana aproxima el colorante
fluorescente a un residuo de guanina, con consiguiente extinción de
la emisión fluorescente. En otra realización, la entidad
fluorescente sustituye una base en la estructura de la sonda de
oligonucleótidos y, con la hibridación, este "nucleótido
virtual" se coloca en una posición complementaria a un residuo G,
con consiguiente extinción de la fluorescencia. En otras
realizaciones, las sondas se construyen de forma que la hibridación
da como resultado un aumento en la emisión fluorescente. En una
realización tal, la entidad fluorescente está unida a un residuo G,
aumentando la fluorescencia con la hibridación. En el documento
WO02/14555 se encuentra más información sobre el diseño de sondas
de oligonucleótidos de marca única. Al igual que con los pares de
oligonucleótidos FRET donante-extintor de
fluorescencia, si la extinción fluorescente indica hibridación, los
valores de fluorescencia, y de ahí todos los valores máximos y
mínimos, serán la inversa como se describe más adelante.
En las figs. 1a-l se muestran
diseños de SYBR^{TM} Green I, sondas de exonucleasa y sondas de
hibridación. Para cada diseño se muestran esquemas de tanto antes
(figs. 1a-c) como después (figs.
1d-f) de la amplificación, además de
representaciones de amplificación de ciclos frente a fluorescencia
de controles positivos y negativos (figs. 1 g-i), y
representaciones de temperatura frente a fluorescencia de controles
continuos (figs. 1j-l). La fluorescencia de SYBR
Green I aumenta cuanto más ADNb se hace (figs. 1a, d, g, j). Debido
a que el colorante no es específico para secuencias, un control
negativo también aumenta en fluorescencia durante los ciclos
posteriores a medida que se forman dímeros de cebadores. En las
figs. 1b, e, h, k, las sondas de fluoresceína/rodamina de doble
marca se escinden durante la extensión de la polimerasa por la
actividad de 5'-exonucleasa, separándose los
fluoróforos y aumentando la emisión de fluoresceína. La señal
generada es acumulativa y la fluorescencia continúa aumentando,
incluso después de que la cantidad de producto ha alcanzado una
meseta. Las figs. 1c, f, i, l muestran el uso de un par de
oligonucleótidos FRET en el que las dos sondas se hibridan próximas
entre sí, una marcó 3' con fluoresceína y la otra marcó 5' con Cy5.
A medida que el producto se acumula durante PCR, aumenta la
transferencia de energía de fluorescencia a Cy5. La fluorescencia de
las sondas de hibridación disminuye a alto número de ciclos debido
a la competencia sonda/producto.
Los instrumentos estándar para PCR completan 30
ciclos en aproximadamente de dos a cuatro horas. Un sistema
preferido es un dispositivo de ciclado térmico rápido que usa tubos
capilares y control de temperatura por aire caliente. Véase, por
ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 5.455.175, incorporada en
este documento como referencia. Debido a la baja capacidad térmica
del aire y las finas paredes y alta área superficial de los tubos
capilares, pueden ciclarse rápidamente muestras de pequeño volumen.
El tiempo total de amplificación durante 30 ciclos se reduce a 15
minutos con excelentes resultados.
El uso de capilares con calentamiento por aire
forzado permite el control exacto de la temperatura de la muestra a
una velocidad que no es posible con otros diseños. Por ejemplo,
representaciones de la temperatura de la muestra frente al tiempo
en capilares muestran picos afilados a las temperaturas de
desnaturalización e hibridación, mientras que para que toda la
muestra alcance el equilibrio en tubos de plástico cónicos se
requieren varios segundos. Wittwer, CT, GB Reed y KM Ririe, Rapid
cycle DNA amplification, en K Mullis, F Ferre y R Gibbs (Eds.), The
polymerase chain reaction, Springer-Verlag,
Deerfield Beach, FL. pág. 174-181, 1994; Wittwer,
CT, BC Marshall, GB Reed, y JL Cherry, Rapid cycle
allele-specific amplification: studies with the
cystic fibrosis delta F508 locus, Clin. Chem.,
39:804-809, 1993. El ciclado rápido de temperatura
con mínimos tiempos de hibridación y desnaturalización mejora la
PCR cuantitativa y aumenta la discriminación de amplificación
específica para alelos. Weis, JH, SS Tan, BK Martin y CT Wittwer,
Detection of rare mRNA species via quantitative
RT-PCR, Trends in Genetics,
8:263-4, 1992; Tan ST y JH Weis, Development of a
sensitive reverse transcriptase PCR assay, RT-RPCR,
utilizing rapid cycle times, PCR Meth. y Appl.
2:137-143, 1992. El ciclado rápido para
secuenciación de ciclos reduce los artefactos de secuenciación y
minimiza la "formación de bandas de sombra" en amplificaciones
repetidas de dinucleótidos. Swerdlow H, K Dew-Jager
y RF Gesteland, Rapid cycle sequencing in an air thermal cycler,
BioTechniques 15:512-519, 1993; Odelberg SJ y R
White, A method for accurate amplification of polymorphic
CA-repeat sequences, PCR Meth. Appl.
3:7-12, 1993. Para PCR larga, el rendimiento mejora
cuando la muestra se expone tan poco como sea posible a altas
temperaturas de desnaturalización. Gustafson CE, RA Alm y TJ Trust,
Effect of heat denaturation of target DNA on the PRC amplification.
Gene 23:241-244, 1993. RapidCycler®, desarrollado
por Idaho Technology, es un ejemplo de un dispositivo de ciclado
térmico rápido. LightCycler® (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)
es un ciclador rápido de temperatura con un fluorímetro, en el que
los diodos emisores de luz se usan para la excitación y los
fotodiodos se usan para la detección.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
procedimientos para automatizar la detección de ácidos nucleicos
con PCR en tiempo real. Mientras que estos algoritmos pueden
aplicarse a cualquier sistema de amplificación, en una realización,
estos algoritmos están integrados en la plataforma LightCycler®.
Estas rutinas de análisis son activadas por la finalización del
ciclado térmico rápido para la amplificación "sin
intervención", análisis y presentación de resultados finales en
un total de menos de 15 min. Las rutinas de análisis tardan de <
1 segundo para la detección y cuantificación a <10 segundos para
el genotipado. Para el control del instrumento LightCycler® se
prefiere LabView (National Instruments, Austin, TX), un lenguaje de
programación gráfico. LightCycler® es un instrumento basado en PC.
LightCycler® puede embalarse en una forma compacta para uso en
campo.
El análisis más básico de datos de PCR en tiempo
real es quizás una opinión de si un ácido nucleico elegido como
diana está presente. Si el ácido nucleico está presente, puede tener
lugar cuantificación y genotipado adicionales. En muchos casos, una
opinión sí/no es todo lo que se necesita. Por ejemplo, se puede
querer determinar si E. coli 0157:H7 está en una muestra de
hamburguesa, si ántrax está presente en un polvo blanco sospechoso;
o si la hepatitis C está en una unidad de sangre. La PCR en tiempo
real puede mejorar la detección sí/no respecto a ensayos de PCR en
punto final debido a que la fluorescencia se adquiere en cada
ciclo.
La inspección de los datos de ciclos frente a
fluorescencia procedente de ejecuciones de PCR en tiempo real
positivas y negativas (véanse las figs. 1h y 1i) sugiere que la
discriminación es simple. Las muestras positivas aumentan con el
número de ciclos, mientras que las muestras negativas permanecen en
el nivel inicial. Un observador cualificado espera que las muestras
positivas sigan una curva con forma de S, empezando con un nivel
inicial, seguido por un segmento exponencial y terminando con una
meseta. La curva esperada es similar al modelo logístico para el
crecimiento de población, en la que la tasa de crecimiento es
proporcional tanto al tamaño de población como a la diferencia
L-y, en la que L es la población máxima que puede
tolerarse. Para y pequeño, el crecimiento es exponencial, pero
cuando y se aproxima a L, la tasa de crecimiento se aproxima a cero.
En la fig. 2 se muestra un ejemplo de crecimiento logístico.
Aunque intuitivamente es simple, en la práctica
no es fácil discriminar con precisión entre muestras positivas y
negativas. La solución más simple es fijar un umbral de
fluorescencia horizontal como discriminador entre muestras
positivas y negativas. Éste funciona mejor con un nivel inicial
estable (entre y dentro de las muestras) y una intensidad de
fluorescencia conocida que guarda relación con "positiva".
Aunque este procedimiento funcionará en muestras obvias (por
ejemplo, figs. 1h y 1i), se desea un algoritmo más robusto que
funcione bajo una variedad más amplia de condiciones. Por ejemplo,
el nivel inicial puede desplazarse y la intensidad de fluorescencia
puede variar enormemente entre diferentes muestras y técnicas de
sondas. Por tanto, la presente invención se refiere a un
procedimiento que: (1) identificará automáticamente el nivel
inicial, (2) usará la varianza del nivel inicial para establecer
una región de confianza y (3) llamará a cada muestra positiva o
negativa basándose en la relación de la región de confianza con los
datos de fluorescencia.
Las figs. 3a-f muestran diversos
tipos de curvas de amplificación, habiéndose observado todas en
ejecuciones de LightCycler®. Las figs. 3a y b muestran curvas de
muestras que son negativas sin molde presente. Las escalas de
fluorescencia en las figs. 3a y b están ampliadas (en comparación
con las figs. 3c-f) para demostrar el
desplazamiento del nivel inicial y para proporcionar algoritmos que
pueden ser independientes de la intensidad de fluorescencia.
Siempre hay algún desplazamiento del nivel inicial durante el
ciclado. Este desplazamiento es normalmente mayor al principio del
ciclado, pero más tarde se estabiliza, y puede ser o hacia abajo
(fig. 3a) o hacia arriba (fig. 3b). Este desplazamiento del nivel
inicial de reacciones negativas debe distinguirse de las reacciones
positivas de o bajos números de copias (fig. 3c) o altos números de
copias (fig. 3d) del molde de partida. El procedimiento necesita
funcionar con diversos diseños de sondas, que incluyen sondas de
exonucleasa (fig. 3e) y de hibridación (fig.
3f).
3f).
La identificación automática del ruido de fondo
es sorprendentemente difícil. En los procedimientos de la técnica
anterior, el nivel inicial se determina como una función de la
fluorescencia medida a un intervalo fijo de ciclos casi al
principio de la amplificación. Sin embargo, la selección de un
intervalo fijo de ciclos no es adecuado debido a que pueden
llamarse incorrectamente tanto el desplazamiento hacia abajo (fig.
3a) como altas amplificaciones de copias (fig. 3d).
En una realización de la presente invención, el
ruido de fondo se identifica analizando las mediciones fluorescentes
respecto a un amplio intervalo de ciclos de amplificación.
Preferentemente, el ruido de fondo se identifica seleccionando la
ventana deslizante (fig. 4) con la pendiente más baja. Es decir,
calcular la pendiente en cada ciclo mediante regresión lineal de la
vecindad local (por ejemplo, una ventana deslizante de 7 puntos).
La ventana con la pendiente de menor valor absoluto (menor
diferencia de cero) define la región de ruido de fondo. Una vez se
ha identificado la región de ruido de fondo, la variación de estos
puntos de ruido de fondo alrededor de su recta de regresión (la
raíz cuadrada del error cuadrático medio) se multiplica por una
constante para determinar una banda de confianza. Esta banda de
confianza tendrá una pendiente próxima a cero y se extrapola a
todos los ciclos. Si la fluorescencia del último ciclo está dentro
de la banda de confianza, es negativa, si está fuera de la banda,
es positiva. La fig. 5 demuestra ambos casos.
Este algoritmo debería funcionar bien en la
mayoría de los casos. Sin embargo, con el tipo de curva de alta
fluorescencia de altas copias (fig. 3d), la pendiente más baja
podría encontrarse en ciclos tempranos (dando como resultado una
llamada positiva correcta) o en ciclos tardíos (dando como resultado
una llamada negativa incorrecta). Esta excepción puede manipularse
analizando la forma de la curva. En una amplificación de buen
comportamiento, la forma esperada de la curva de amplificación está
ordenada por número de ciclos del siguiente modo:
- 1.
- Fluorescencia mínima
- 2.
- Segunda derivada máxima (F'')
- 3.
- Primera derivada máxima (F')
- 4.
- Segunda derivada mínima (F'')
- 5.
- Fluorescencia máxima
Esto da la forma de curva S característica
esperada durante la PCR (fig. 6A). La pendiente máxima (primera
derivada) se obtiene del análisis de ventana deslizante ya realizado
para la identificación del ruido de fondo. Preferentemente, las
segundas derivadas se calculan mediante una regresión lineal de
ventana deslizante de 3 puntos de las primeras derivadas. Si la
forma de la curva se comporta bien (es decir, si mirando una gráfica
de la fig. 6 y leyendo desde el número de ciclo más bajo hasta el
más alto, los rasgos se producen en el orden enumerado
anteriormente), entonces el ruido de fondo sólo se selecciona de
ventanas deslizantes centradas en números de ciclos inferiores al
máximo de la segunda derivada. Esto resuelve el potencial problema
de análisis con la fig. 3d. En otras realizaciones preferidas
pueden usarse números de ciclos inferiores al máximo de la primera
derivada o números de ciclos inferiores al mínimo de la segunda
derivada. También se entenderá que cualquier número de ciclos entre
el máximo de la segunda derivada y el mínimo de la segunda derivada
es un ciclo de corte adecuado para uso con esta técnica y está
dentro del alcance de esta invención.
Otro procedimiento es comparar el ciclo con la
mayor fluorescencia (que no es necesariamente el último ciclo) con
la banda de confianza. Esto es especialmente apto para sondas de
hibridación que pueden disminuir en fluorescencia con ciclado
extensivo, tales como se ven en la fig. 3f. El ciclo con la mayor
fluorescencia sólo debería usarse cuando la forma de la curva se
comporta bien, con el fin de evitar llamadas positivas falsas con
desplazamientos hacia abajo, tales como se muestran en la fig.
3a.
Las variables a optimizar para la detección
automática son: 1) el tamaño de ventana para el cálculo aproximado
de la primera derivada, 2) el tamaño de ventana para el cálculo
aproximado de la segunda derivada y 3) el factor de la banda de
confianza. Un valor razonable para el tamaño de ventana de la
primera derivada es 7, aunque 3, 5, 9, y 11 también son bastante
útiles. Para la segunda derivada, el tamaño de ventana preferido es
3, pero también se ha probado que 5 y 7 son valores útiles. Un
factor de la banda de confianza preferido es 20. A medida que
aumenta el tamaño de ventana de la primera derivada, el cálculo
aproximado de la varianza es más preciso, pero se pierden los
ciclos de los extremos (principio y fin).
Este algoritmo se entiende mejor con referencia
a la representación de los resultados de la prueba de fluorescencia
frente a ciclos mostrados en las figs. 7-11. Los
datos de entrada están constituidos por un valor de fluorescencia
para cada ciclo de amplificación, mostrados como los círculos
blancos cerrados. Sea esto igual a la matriz Yi, en la que i es el
número de ciclos y N es el número total de ciclos. Los criterios de
detección son:
A = el número de valores de fluorescencia usados
para determinar las primeras derivadas. Es conveniente usar números
impares, de manera que las primeras derivadas se correspondan con
números de ciclos enteros. Como se trata anteriormente, valores
razonables incluyen 3, 5, 7, 9 y 11. Preferentemente, 7 se usa como
el tamaño de ventana de la primera derivada.
B = el número de valores de la primera derivada
usados para determinar las segundas derivadas. De nuevo, es
conveniente usar números impares, de manera que los valores de la
segunda derivada también se correspondan con números de ciclos
enteros. Valores razonables incluyen 3, 5 y 7, siendo 3 el valor
preferido.
C = el factor de la banda de confianza. Este
factor determina la banda de confianza multiplicándolo por una
medida de la varianza, preferentemente la raíz cuadrada del error
cuadrático medio.
La primera etapa es calcular las primeras y
segundas derivadas. Aunque hay muchas formas para realizar esto, un
procedimiento preferido es determinar las primeras derivadas como la
pendiente de una recta de regresión lineal por A puntos, y asignar
el valor al número de ciclos central. No pueden asignarse primeras
derivadas a algunos ciclos a cada lado del extremo, pero las
primeras derivadas pueden proporcionarse para los ciclos (A + 1)/2
a N-(A - 1)/2. Similarmente, las segundas derivadas se calculan como
la pendiente de los puntos de la primera derivada y se asignan a
los ciclos (A + 1)/2 + (B - 1)/2 a [N - (A - 1)/2] - (B - 1)/2. El
cálculo de las primeras y segundas derivadas proporciona matrices
Y'i y Y''i, faltando algunos valores de los extremos. En la fig. 7,
las primeras y segundas derivadas se muestran como círculos negros
abiertos y círculos negros cerrados, respectivamente.
La siguiente etapa es determinar si la curva de
fluorescencia tiene una forma de buen comportamiento. Como se trata
anteriormente, la forma de buen comportamiento se produce cuando los
ciclos con fluorescencia mínima, segunda derivada máxima, primera
derivada máxima, segunda derivada mínima y fluorescencia máxima se
producen en ese orden, de bajo a alto número de ciclos.
Entonces se determina el nivel inicial. Si la
curva de fluorescencia no tiene la forma esperada, se usa el ciclo
cuya primera derivada sea la más próxima a cero. Si la curva de
fluorescencia tiene una forma de buen comportamiento, el ciclo cuya
primera derivada sea la más próxima a cero elegido de entre todos
los ciclos antes del ciclo con la segunda derivada máxima (de
nuevo, como número de ciclos de corte también puede usarse
cualquier ciclo entre la segunda derivada máxima y la segunda
derivada mínima). El nivel inicial se saca del valor de
fluorescencia del ciclo elegido con una pendiente de su primera
derivada. En la fig. 7, los A puntos que contribuyen al cálculo de
la primera derivada para el nivel inicial se muestran como puntos
negros grandes conectados por una línea.
La siguiente etapa es determinar el ciclo del
punto de prueba, es decir, el ciclo usado para comparar frente al
nivel inicial para determinar un resultado positivo o negativo. Si
la curva no se comporta bien, el punto de prueba es el último
ciclo. Si la curva de fluorescencia se comporta bien, el punto de
prueba es el ciclo con la fluorescencia más alejada del nivel
inicial. La fluorescencia en el punto de prueba de una muestra
negativa puede predecirse como la intersección del nivel inicial con
el ciclo del punto de prueba.
A continuación puede determinarse un intervalo
de confianza alrededor del punto de prueba negativo predicho.
Preferentemente, esto se hace encontrando la raíz cuadrada del error
cuadrático medio alrededor del nivel inicial de A puntos usados
para determinar el nivel inicial. Ésta se multiplica por C. El
producto se añade al punto de prueba negativo predicho para obtener
el límite superior de fluorescencia del intervalo de confianza y se
resta del punto de prueba negativo predicho para obtener el límite
inferior de la banda de confianza. Estos límites se muestran en la
fig. 7 como dos líneas horizontales continuas.
La etapa final es declarar la muestra positiva o
negativa. Si la fluorescencia en el punto de prueba está fuera del
intervalo de confianza, la muestra es positiva. Si está dentro del
intervalo, la muestra es negativa. Las figs. 7 y 8 son muestras que
son positivas, mientras que las figs. 9-11 son
muestras negativas.
Otra solución para el análisis automatizado de
la determinación de analito es usar algoritmos que empleen una o
más pruebas para obtener una puntuación agregada que defina, con
mayor precisión y robustez, si la muestra es positiva, negativa o
indeterminada. Se emplea una prueba similar para el análisis de la
banda de confianza, excepto que la prueba produce un valor, en
lugar de una llamada positiva o negativa.
\newpage
Se obtiene alta precisión si al menos se emplea
una prueba adicional, y preferentemente si se emplean cuatro
pruebas adicionales, lo más preferido si se emplean seis pruebas
adicionales, además de la prueba del intervalo de confianza. Cada
una de las pruebas produce una puntuación, T_{1}, T_{2}, ...,
T_{n}. La puntuación compuesta global para cada muestra se
calcula por la siguiente fórmula:
en la que los números
P_{1}, P_{2},..., P_{n} son factores de
corrección predeterminados para cada prueba, y Umbral es un
umbral de puntuación predeterminado que proporciona un valor divisor
conveniente entre llamadas negativas y positivas. Los intervalos se
eligen para llamadas definitivamente "positivas" y
definitivamente "negativas", y para las llamadas
"indeterminadas" o "imposibles de llamar". Si
Puntuación se usa directamente para fijar estos intervalos,
una muestra negativa tendrá un valor entre 0 y 1, una muestra
positiva tendrá un valor superior a 1, y se toma una decisión sobre
cuánto de aquellas dos regiones se necesita construir la región
"indeterminada". Una forma más conveniente para elegir los
intervalos es usar el logaritmo de Puntuación, en el que el
Valor de llamada es igual a
log(Puntuación):
Tomando el logaritmo de Puntuación, una
muestra negativa tendrá un valor negativo y una muestra positiva
tendrá un valor positivo. El logaritmo también facilita el
entendimiento del significado de Umbral ya que simplemente
desplaza los valores más negativos o más positivos. La región
indeterminada puede elegirse, por ejemplo, entre -1 y 1, y los
positivos y negativos definitivos pueden colocarse fuera de esa
región. De nuevo, tomar el logaritmo de Puntuación no es
esencial para la invención, pero aquí se muestra como un modo
conveniente para describir el procedimiento.
A continuación se describen pruebas individuales
que pueden usarse para proporcionar la Puntuación compuesta
y el Valor de llamada. Las definiciones matemáticas aplicadas
a las pruebas individuales que producen puntuaciones individuales
T_{i} de las señales de fluorescencia sólo deberían tomarse
como ejemplos, y se entiende que pueden usarse otras definiciones
matemáticas. Definiciones matemáticas alternativas pueden producir
diferentes valores de T_{i}, en cuyo caso, tanto el factor
de corrección P_{i} como el Umbral pueden tener que
reasignarse apropiadamente usando las enseñanzas descritas en este
documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba
1
Esta prueba mide la relación entre lo que se
considera señal y lo que se considera ruido de fondo. Un modo para
hacer esto es tomar la relación entre el cambio total en la
fluorescencia y la suma del cambio de fluorescencia absoluta vista
en cada ciclo de amplificación. Si la fluorescencia global aumenta
con el número de ciclos, la definición de la prueba es
en la que F_{j} representa
las mediciones de fluorescencia del instrumento tomadas en el ciclo
j. El subíndice representa el ciclo de amplificación y va
desde uno hasta el número total de ciclos. Se interroga una pequeña
ventana de números de ciclos (2m) (por ejemplo 2m=6),
y k es la variable del intervalo, o punto medio de la
ventana. El primer número de ciclos en cualquier ventana dada será
k-m, y el último número de ciclos
k+m. Si la fluorescencia global disminuye con el número de
ciclos, la definición de la prueba no se aplica. El valor de esta
prueba es mayor que o igual a uno. T_{1} es uno si la
fluorescencia aumenta en cada ciclo sucesivo dentro del intervalo
de 2m. Si hay ruido de fondo, y la fluorescencia disminuye
entre uno o más ciclos, entonces T_{1} será mayor que uno.
El fin principal de esta prueba es hacer una evaluación cualitativa
de muestras negativas, aunque si esta prueba se emplea sola, puede
engañar por las curvas de fluorescencia con un nivel inicial
creciente. Debe entenderse que hay otros modos para evaluar la
señal/ruido, y el procedimiento anteriormente mencionado se indica
como un ejemplo de un procedimiento tal. Puede obtenerse una alta
precisión en análisis automatizados usando la prueba señal/ruido en
combinación con la prueba del intervalo de confianza tratada a
continuación.
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Prueba
2
Esta prueba es esencialmente el análisis de la
banda de confianza tratado anteriormente, en que un segmento del
nivel inicial de la curva de fluorescencia se establece
dinámicamente como un intervalo de confianza o banda de confianza,
y el algoritmo determina si el valor de fluorescencia durante un
ciclo de amplificación seleccionado está dentro o fuera de la banda
de confianza. La diferencia es que el análisis de la banda de
confianza anterior produce una llamada positiva o negativa, mientras
que esta prueba del intervalo de confianza produce un valor. Esta
prueba del intervalo de confianza y la prueba señal/ruido se usan
ilustrativamente juntas para generar puntuaciones compuestas. Un
procedimiento matemático para puntuar esta prueba es ajustar
primero una recta a la curva usando regresión lineal y la suma de
los errores residuales al cuadrado se calcula a partir de la recta.
El error residual está normalizado a un valor predeterminado llamado
el Nivel de ruido de fondo.
Si el ajuste lineal se define como L (j) = A
j + B, en la que j es el número de ciclos, entonces la
prueba se define como
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El Nivel de ruido de fondo dependerá de
la instrumentación que se use para controlar la fluorescencia a
medida que avanza la reacción. Para el instrumento LightCycler®, el
Nivel de ruido de fondo = 0,05. El valor de T_{2}
es grande para muestras positivas, y próximo a uno para muestras
dominadas por el ruido de fondo. Por tanto, esta prueba identifica
señales positivas, pero puede omitir señales positivas de baja
amplitud. Como en las demás pruebas, hay otros modos para describir
matemáticamente la prueba del intervalo de confianza, y debe
entenderse que aquellas también funcionarán en esta invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba
3
Esta prueba mide si los datos a lo largo de
múltiples canales de detección son consistentes con el patrón
esperado para reacciones de amplificación positiva. La forma exacta
de esta prueba depende del diseño de los canales de detección y la
química indicadora específica que se usa para proporcionar la señal
de fluorescencia que refleja la cantidad de ácido nucleico. Aunque
la fluorescencia se controla normalmente por un canal de detección
primaria que es muy adecuado para reconocer el colorante indicador,
en la mayoría de los dispositivos de detección multicanal es
posible controlar la señal en otros canales y establecer la
característica de entrada esperada que deberían recibir estos
canal(es) secundario(s) en una reacción de
amplificación positiva sin problemas. Por ejemplo, si un canal
secundario puede recibir la emisión del colorante indicador, se
espera que el valor máximo de la segunda derivada en este canal sea
el mismo que en el canal primario. También se espera que la
intensidad de fluorescencia en el canal secundario sea
específicamente inferior a la del canal primario. En una situación
en la que la fluorescencia de un contaminante interfiere con todos
los canales, la diferencia esperada en la intensidad de
fluorescencia entre canales puede no observarse. Observando la
fluorescencia en uno o más canales secundarios, una reacción que de
otro modo se llamaría positiva, en el canal primario se marcará
como anómala. En otro ejemplo, si un canal secundario puede recibir
la emisión de un colorante donante, en vez del colorante indicador,
durante la amplificación puede observarse una disminución en la
señal de emisión y, aquí, el mínimo de la segunda derivada, no el
máximo, del canal secundario debería ser igual al máximo de la
segunda derivada del canal primario. Sea cual sea el patrón esperado
para la muestra positiva, si los datos de los canales múltiples
caen dentro de la tolerancia para el patrón esperado, entonces
T_{3} = 4/3, y si no, entonces T_{3} = ¾.
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba
4
Esta prueba mide la eficiencia de la reacción de
PCR como se mide por la curva de fluorescencia. Asume que la PCR
debería modelarse con saturación. El modelo de saturación de
fluorescencia apropiado más simple es
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\global\parskip0.980000\baselineskip
Entonces la transformación
es lineal con el número de ciclos.
Usando este modelo, la eficiencia es igual a 1+ A. La propia
prueba se define
como
en la que A se determina ajustando
la curva a una función de tres partes definida
por
en la que se requiere que
j_{2} - j_{1} sea al menos siete ciclos. Las
incógnitas A, B, c_{1} y c_{2} se eligen para minimizar la suma
de los errores residuales al cuadrado respecto a la curva de
fluorescencia.
El valor de T_{4} es más grande para
muestras positivas, que tienen alta eficiencia, que para muestras
negativas, que tienen baja eficiencia. Por tanto, esta prueba
distinguió muestras positivas de negativas. Para llamada
automatizada de alta precisión es eficaz usar esta prueba, junto con
las pruebas de consistencia de canales, relación señal/ruido e
intervalo de confianza.
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba
5
Como se trata anteriormente en el análisis de la
banda de confianza, una curva de amplificación de buen
comportamiento tiene una forma característica de s o forma
sigmoide. Esta prueba mide si la curva de fluorescencia tiene la
forma sigmoide esperada de una muestra que se ha amplificado. La
prueba determina si la curva de fluorescencia satisface la relación
de clasificación que es una característica de curvas sigmoidales,
concretamente que
El símbolo \prec se usa para denotar la
clasificación de los rasgos con respecto a la variable del ciclo
j. Las fórmulas en la relación de clasificación son
aproximaciones estándar de segundo orden de las primeras y segundas
derivadas de la curva sigmoidal. Sin embargo, a diferencia del
análisis de la banda de confianza tratado anteriormente, la
aproximación de la segunda derivada mínima se omite, ya que algunas
muestras positivas no satisfacen la clasificación incluida la
segunda derivada mínima. Si se satisface la relación, entonces
T_{5} = 4/3, y si la relación no se satisface, entonces
T_{5} = ¾. Por tanto, esta prueba es útil para distinguir
muestras positivas de negativas. Sin embargo, pueden engañar algunas
muestras negativas. Por tanto, como con cada una de las pruebas, es
preferible usar esta prueba en combinación con otras pruebas.
\vskip1.000000\baselineskip
Prueba
6
Esta prueba mide el cambio en la curva de
fluorescencia respecto al nivel inicial de la curva. La prueba
ajusta y luego resta un nivel inicial lineal de las curvas.
Entonces identifica los ciclos de ruido de fondo de la curva y
calcula la fluorescencia máxima en esa región. De este cálculo, la
prueba es
en la que a los valores de
fluorescencia usados se les ha restado el ruido de fondo de la
curva. El valor de T_{6} es grande para muestras positivas
y próximo a uno para muestras que están dominadas por ruido de
fondo. Por tanto, esta prueba identifica señales positivas, pero el
nivel inicial es difícil de determinar con precisión, y por tanto,
puede omitir algunas muestras
positivas.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Prueba
7
Esta prueba mide el cambio en la curva de
fluorescencia respecto a los de tres a cinco últimos ciclos. La
prueba ajusta una recta a los de tres a cinco últimos ciclos de la
curva usando regresión lineal.
Si el ajuste lineal se define como
L(j) = A^{(m)} j + B, en la que j es
el número de ciclos y m es el número de puntos usados para
determinar L(j), entonces la prueba se define como
El valor de T_{7} es mayor que uno para
muestras que tienen una pendiente positiva respecto a los pocos
últimos ciclos, y si no es igual a uno. Por tanto, esta prueba es
útil para identificar señales positivas de ascenso tardío. También
puede imaginarse que el algoritmo añada automáticamente ciclos extra
de amplificación si se determina que la muestra tiene una señal
positiva de ascenso tardío, y además opcionalmente, para obtener la
temperatura de fusión para verificar la identidad del producto por o
control continuo durante la amplificación o añadiendo una etapa de
análisis de fusión después de la amplificación.
Se prefieren usar las siete pruebas para una
alta precisión en la determinación automatizada del material
amplificado.
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El factor de corrección P_{i} y el
Umbral usados en la fórmula final se hallan usando
optimización numérica. Este procedimiento puede generalizarse del
siguiente modo: en primer lugar, se fija un intervalo deseado para
llamadas "positivas", "negativas", e "indeterminadas"
usando Puntuación o una manipulación matemática tal como
Valor de llamada (log(Puntuación)). En el caso del
Valor de llamada, un ejemplo ilustrado usa (-1, 1) para el
intervalo indeterminado, >1 para positivos y <-1 para
negativos, pero debe entenderse que los intervalos podrían fijarse
en una variedad de modos diferentes. Una vez que se han fijado los
intervalos, entonces los parámetros P_{i} y Umbral
se optimizan para producir tantas llamadas correctas como sea
posible y para minimizar las llamadas incorrectas. La optimización
se realiza preferentemente usando un gran conjunto (por ejemplo,
aproximadamente 4000) de representaciones de amplificación,
aproximadamente un tercio de las cuales son reacciones de PCR
elegidas por ser particularmente difíciles de clasificar basándose
sólo en el análisis de la banda de confianza, otro sexto son
reacciones que son fáciles de clasificar, otro tercio de
representaciones se crean con un generador de números aleatorios
gaussianos (media = 0, varianza = 0,05 que se basan en niveles
típicos de ruido de fondo de fluorescencia) y el resto se genera
por curvas de saturación construidas a partir de la función
Los parámetros m y C se generan usando
generadores de números aleatorios uniformes.
La función objetivo que se optimiza es la suma
ponderada de tres términos: el primer término es el número de
llamadas predichas que no coinciden con la clasificación conocida de
las muestras, el segundo término es el número de llamadas correctas
en la categoría de imposible de llamar o "indeterminada", y el
tercer término es el número de llamadas incorrectas fuera de la
categoría de imposible de llamar. Esta función está diseñada para
producir tantas llamadas correctas como sea posible, disminuir el
número de llamadas correctas en la región de imposible de llamar y
disminuir el número de llamadas erróneas fuera de la región de
imposible de llamar. La tolerancia relativa para llamadas negativas
falsas o positivas falsas se determina por el coeficiente de
ponderación de los tres términos.
\vskip1.000000\baselineskip
Con dos pruebas se usan preferentemente la
prueba de la relación señal/ruido (T_{1}) y la prueba del
intervalo de confianza (T_{2}). La optimización de los
parámetros P_{i} y Umbral se muestran aquí, como
ejemplo, usando el Valor de llamada. El Valor de
llamada de las dos pruebas se da por
El valor esperado para la prueba de la relación
señal/ruido (T_{1}) es uno para una muestra positiva y es
superior a uno para una muestra negativa. El valor esperado de la
prueba del intervalo de confianza (T_{2}) es uno para
muestras negativas y es superior a uno para muestras positivas. Como
log T_{1} será un número positivo para muestras negativas,
P_{1} debería ser negativo si el Valor de llamada va
a ser un número negativo para muestras negativas. Similarmente,
P_{2} debería ser positivo. Se espera que el Umbral
esté próximo a uno para este ejemplo porque uno es la línea
divisoria entre muestras positivas y negativas en T_{1} y
T_{2}.
Para realizar la optimización se hacen
conjeturas de los parámetros. Entonces, el Valor de llamada
se calcula para cada muestra y se determina tanto si las llamadas
hechas usando Valor de llamada son correctas como
incorrectas. Entonces se cuenta el número de llamadas incorrectas.
Este es el primer término de la suma. Se cuenta el número de
llamadas correctas en el intervalo (-1,1) y el número de llamadas
incorrectas fuera del intervalo (-1,1), y cada uno de estos
recuentos se divide entre 10 para generar el segundo y tercer
término que, a modo de ejemplo, se les da menos peso. Los tres
términos se añaden y la suma se asigna como el valor de la función
objetivo. Entonces, los valores cercanos en el espacio del parámetro
del factor de corrección se usan para hacer más pequeña la función
objetivo. El procedimiento se repite hasta que el valor de la
función objetivo no pueda hacerse más pequeño. Usando este
procedimiento, P_{1} tiene un intervalo de -6 a -4,
P_{2} un intervalo de 0,5 a 1,0, y el Umbral de 1,5
a 2,0 para el ejemplo ilustrado. Usando el mismo procedimiento
también pueden determinarse los valores de P_{i} y
Umbral para los procedimientos de análisis que combinan más
de dos pruebas. La tabla 1 muestra estos valores usando los ejemplos
ilustrados.
El análisis de siete pruebas, que combina las
siete pruebas, se realizó en 2005 reacciones, de las que 1273 se
clasificaron previamente como indeterminadas basándose sólo en la
prueba del intervalo de confianza, y 732 se consideraron fáciles de
llamar. Basándose en la clasificación conocida de las reacciones,
1988 (99,2%) se llamaron correctamente mediante el análisis de
siete pruebas. De las 17 (0,8%) que se llamaron incorrectamente, 13
(o 76% de incorrectas) cayeron dentro del intervalo (-1, 1). Por
tanto, la prueba combinada puede distinguir entre positivas y
negativas más sólidamente que la prueba del intervalo de confianza
sola. Este resultado se ilustra en la distribución bimodal de las
puntuaciones (fig. 12).
Para este ejemplo se usó el lenguaje de
programación Mathlab®, de MathWorks, Inc. Sin embargo, puede
cualquier lenguaje de programación adecuado.
En otra realización, las llamadas
"positivas" generadas por el procedimiento anterior se
confirmaron adicionalmente mediante retroalimentación automática
del valor de la temperatura de fusión (Tm) del producto amplificado.
Esta confirmación adicional es posible siempre y cuando los estados
hibridados y no hibridados de la sonda puedan distinguirse mediante
cambios en la señal de fluorescencia, como con colorantes de ADNb y
sondas de hibridación. La Tm de un producto amplificado puede
determinarse del siguiente modo: en un ciclo de amplificación
predeterminado y/o dinámicamente elegido, la fluorescencia se
controla continuamente entre la extensión y desnaturalización (o
hibridación y desnaturalización, en el caso de un procedimiento de
amplificación de dos etapas). Este control proporcionará un perfil
de fusión del producto amplificado. Alternativamente, una Tm puede
obtenerse añadiendo un procedimiento de fusión separado al final del
ciclo de amplificación, durante el cual la fluorescencia se
controla continuamente y se obtiene un perfil de fusión. El mínimo
(o máximo, dependiendo de si el diseño de sondas produce un
pico/valle de fusión) de la derivada de este perfil de fusión
determinará Tm. Entonces, el valor de Tm valor se comparará con la
Tm conocida del analito diana, y si los dos valores concuerdan, se
hace una llamada positiva verificada. Si no concuerdan, entonces no
se verifica una llamada "positiva". Esta técnica puede usarse,
por ejemplo, para identificar situaciones en las que se amplifica
un locus distinto del locus diana o en las que se producen dímeros
de cebadores.
Aunque todos los ejemplos anteriores se refieren
a procedimientos para determinar la presencia de un ácido nucleico,
la presente invención contempla adicionalmente el uso de los
procedimientos de análisis de múltiples pruebas para analizar la
presencia de analitos biológicos o químicos en una muestra, no se
restringe a ácidos nucleicos, y sin limitación para el uso de un
procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos.
Los datos obtenidos durante cualquier
procedimiento químico o biológico pueden usarse para análisis como
se enseña en este documento siempre que los datos se obtengan
periódicamente de una reacción que avanza con el tiempo que dé como
resultado un aumento (o disminución) en (1) la cantidad de un
analito que va a detectarse, (2) la cantidad de un sustrato
convertido directamente o indirectamente por el analito o (3) el
grado de otro cambio físico u óptico al sustrato que se produce
directamente o indirectamente por la presencia (o ausencia) de un
analito, y un aumento (o disminución) resultante de una señal
relacionada con estos cambios de cantidad o físicos. Tales
analitos, además de ácidos nucleicos, incluyen bacterias o similares
en cultivo en suspensión, proteínas, péptidos, enzimas o
anticuerpos en fluidos corporales o mezclas de reacción, toxinas y
otras sustancias que incluyen microorganismos en fluidos
medioambientales o mezclas de reacción. El procedimiento químico o
biológico de detección podría ser o en forma de amplificación del
analito, como en el caso de amplificación de ácidos nucleicos y
propagación bacteriana, o amplificación de señales, como en el caso
de sistemas indicadores de enzimas, transiciones de fase
(gelidificación o precipitación), o similares. Se entiende que en
las realizaciones en las que la señal disminuye, tales datos pueden
representarse inversamente para que puedan aplicarse al
procedimiento de análisis de múltiples pruebas de la presente
invención.
Preferentemente, los seguimientos de datos del
procedimiento químico o biológico tienen una fase de retraso
inicial durante la que la señal es demasiado baja para ser detectada
por el dispositivo de detección, seguida por un aumento (o
disminución) lineal o logarítmico lineal en la señal, y luego una
fase de meseta que se produce por al menos una de las siguientes:
(1) la señal excede el punto de saturación del dispositivo de
detección, (2) uno o más nutrientes o sustrato requerido para
aumentar (o disminuir) la señal se vuelve limitante, (3) el
producto de la reacción proporciona retroalimentación negativa y
ralentiza la reacción, o (4) degradación del sistema con el
tiempo.
Además, aunque la fluorescencia se usa en las
realizaciones ilustradas anteriormente, pueden usarse otros
sistemas de detección, siempre que la señal obtenida esté
relacionada con un cambio medible, tal como la cantidad del analito
que va a medirse, la cantidad del sustrato que se ha convertido
directamente o indirectamente por la presencia del analito o la
cantidad de un cambio óptico u otro físico al sustrato. Otros
procedimientos de detección incluyen, por ejemplo, absorbancia
óptica, densidad óptica, sistemas de detección enzimáticos,
colorimétricos, por quimioluminiscencia y radiactivos.
Como ejemplo ilustrativo, una muestra sospechosa
de albergar una bacteria particular se incuba en cultivo en
suspensión y se controla para la propagación bacteriana selectiva
mediante densidad óptica. El duplicado de bacterias produce el
mismo tipo de datos de curva logística que en la amplificación de
ácidos nucleicos, como se muestra en la fig. 2, excepto que la
escala de tiempo es normalmente mucho mayor para la propagación
bacteriana. La tarea en la detección automatizada del crecimiento
bacteriano es similar a la de la amplificación de ácidos nucleicos,
que es básicamente la de distinguir la señal real del ruido de
fondo. Por tanto, el análisis de múltiples pruebas puede adaptarse
fácilmente a automatizar la detección bacteriana. Similarmente, por
ejemplo, en ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), un
analito capturado sobre una superficie se detecta por un indicador
que está ligado a una enzima que cataliza la conversión del sustrato
para dar lugar a una señal de color o de fluorescencia. Las señales
colorimétricas o de fluorescencia de este tipo de procedimiento
tienen un retraso inicial y aumentan de un modo lineal con el
tiempo. Si la reacción se deja continuar suficientemente, entonces
o el sustrato se agotará o la señal superará el intervalo lineal de
detección. De nuevo aquí, el análisis de múltiples pruebas puede
adaptarse fácilmente para automatizar la detección de analito con
sistemas indicadores enzimáticos. Un ejemplo adicional es la
detección automatizada de enzimas en una muestra mediante uso de
indicadores colorimétricos para controlar la conversión del
sustrato. Similar al ejemplo de ELISA, la señal está relacionada
con la cantidad de sustrato que se ha convertido, en vez de con la
cantidad de enzima, y se entiende que los principios enseñados
anteriormente pueden aplicarse para determinar la presencia de la
enzima.
Claims (33)
1. Un procedimiento para determinar la presencia
de un ácido nucleico en una muestra que comprende las etapas de
- proporcionar una entidad fluorescente que pueda indicar la presencia del ácido nucleico y que pueda proporcionar una señal relacionada con la cantidad del ácido nucleico,
- amplificar el ácido nucleico mediante una pluralidad de ciclos de amplificación en presencia de la entidad fluorescente,
- medir la intensidad de fluorescencia de la entidad fluorescente en cada uno de la pluralidad de ciclos de amplificación para producir un valor fluorescente para cada ciclo relacionado con la cantidad de ácido nucleico presente en cada ciclo,
- obtener una puntuación individual de cada una de una pluralidad de pruebas, usando cada una de la pluralidad de pruebas los valores de fluorescencia para generar la puntuación individual,
- introducir las puntuaciones en una función para generar una puntuación compuesta y
- comparar la puntuación compuesta con intervalos predeterminados para hacer una llamada positiva, negativa o indeterminada de la presencia del ácido nucleico.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la pluralidad de pruebas comprende una prueba del intervalo
de confianza y una prueba de la relación señal/ruido.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en
el que la pluralidad de pruebas comprende además una prueba de
consistencia de canales y una prueba de eficiencia.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que la pluralidad de pruebas comprende además una prueba de
clasificación de función, una prueba de comparación del máximo con
el nivel inicial y una prueba de ascenso tardío.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que cada una de las puntuaciones individuales está corregida con
un factor de corrección predeterminado y en el que la puntuación
compuesta comprende el producto de cada una de las puntuaciones
individuales corregidas, divididas por un valor umbral
predeterminado.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en
el que la puntuación compuesta se genera según la fórmula
en la que T_{1},
T_{2} y T_{n} representan las puntuaciones
individuales de las
pruebas,
en la que P_{1}, P_{2} y
P_{n} representan los factores de corrección
predeterminados para cada prueba, y
en la que Umbral es el valor umbral
predeterminado que proporciona un valor divisor entre una llamada
negativa y una positiva.
7. El procedimiento de la reivindicación 5, en
el que la etapa de uso comprende
- generar un Valor de llamada, en el que el Valor de llamada comprende el logaritmo del producto de las puntuaciones.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
el que el Valor de llamada se genera según la fórmula
en la que P_{i} es un
factor de corrección elegido para cada prueba, T_{i} es la
puntuación de cada una de las pruebas y Umbral tiene un
valor elegido para proporcionar un punto divisor conveniente entre
llamadas positivas y
negativas.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que la muestra se llama positiva si Valor de llamada >
1 y la muestra se llama negativa si Valor de llamada <
-1.
10. El procedimiento de la reivindicación 4, que
comprende además las etapas de determinar si la muestra tiene una
señal positiva de ascenso tardío y realizar ciclos de amplificación
adicionales.
11. El procedimiento de la reivindicación 2, en
el que la pluralidad de pruebas comprende además al menos una
prueba seleccionada del grupo que está constituido por una prueba de
consistencia de canales, una prueba de eficiencia, una prueba de
clasificación de función, una prueba de comparación del máximo con
el nivel inicial y una prueba de ascenso tardío.
12. El procedimiento de la reivindicación 2, en
el que la presencia de un ácido nucleico se verifica adicionalmente
mediante análisis de la temperatura de fusión.
13. El procedimiento de la reivindicación 2, en
el que la etapa de uso comprende generar un Valor de llamada,
en el que el Valor de llamada comprende la suma del
logaritmo de cada una de las puntuaciones individuales.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que el Valor de llamada se genera según la fórmula:
en la
que
T_{1} es la puntuación de la prueba de
la relación señal/ruido,
T_{2} es la puntuación de la prueba del
intervalo de confianza,
P_{1} es un factor de corrección para
la prueba de la relación señal/ruido,
P_{2} es un factor de corrección para
la prueba del intervalo de confianza, y
Umbral tiene un valor elegido para
proporcionar un punto divisor entre llamadas positivas y
negativas.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que el valor de Umbral se elige para maximizar el mayor
número de llamadas positivas correctas cuando Valor de
llamada > 0 y para maximizar el mayor número de llamadas
negativas correctas cuando Valor de llamada < 0.
16. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que
T_{1} se calcula según la fórmula
y
T_{2} se calcula según la fórmula
en la que F representa un
valor de fluorescencia en un ciclo de
amplificación,
en la que j representa el ciclo de
amplificación y j va de uno al número total de ciclos,
en la que k es la variable del intervalo
o punto medio de una ventana,
en la que k-m es el
primer número de ciclos en la ventana,
en la que k+m es el último número de
ciclos en la ventana,
en la que L es el ajuste lineal en el
ciclo j de un ajuste lineal a la curva de fluorescencia
usando regresión lineal, y
en la que Nivel de ruido de fondo es un
valor predeterminado al que se normaliza el error residual después
de calcular a partir de la recta la suma de los errores residuales
al cuadrado.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que
P_{1} está entre -6,0 y -4,0,
P_{2} está entre 0,5 y 1,0, y
Umbral está entre 1,5 y 2,0.
18. Un dispositivo para determinar la presencia
de un ácido nucleico en una muestra que comprende
- un instrumento para el ciclado de temperatura para amplificar el ácido nucleico,
- un fluorímetro para detectar la fluorescencia durante la amplificación del ácido nucleico, obteniendo la fluorescencia de una entidad fluorescente capaz de proporcionar una señal relacionada con la cantidad del ácido nucleico, y
- un procesador para realizar rutinas de análisis, en el que el procesador está programado para obtener una puntuación individual de cada una de una pluralidad de pruebas, usando cada una de la pluralidad de pruebas valores de fluorescencia medidos mediante el fluorímetro para generar la puntuación individual, y usar las puntuaciones individuales para generar una puntuación compuesta para determinar si la presencia del ácido nucleico es positiva, negativa o indeterminada en la muestra.
19. El dispositivo de la reivindicación 18, en
el que la pluralidad de pruebas comprende una prueba del intervalo
de confianza y una prueba de la relación señal/ruido.
20. El dispositivo de la reivindicación 19, en
el que la pluralidad de pruebas comprende además una prueba de
consistencia de canales y una prueba de eficiencia.
21. El dispositivo de la reivindicación 20, en
el que la pluralidad de pruebas comprender además una prueba de
clasificación de función, una prueba de comparación del máximo con
el nivel inicial y una prueba de ascenso tardío.
22. El dispositivo de la reivindicación 18, en
el que el instrumento está configurado para ciclado térmico
rápido.
23. El dispositivo de la reivindicación 22, en
el que el instrumento emplea tubos capilares y control por aire
caliente.
24. El dispositivo de la reivindicación 18
proporcionado en un recipiente portátil para uso en campo.
25. Un procedimiento para determinar la
presencia de un analito en la muestra, que comprende las etapas
de
- poner en contacto el analito con un sustrato para efectuar un cambio medible seleccionado del grupo que está constituido por la cantidad del analito, la cantidad del sustrato y la cantidad de un cambio óptico o físico al sustrato, en el que el analito se pone en contacto con el sustrato durante un periodo de tiempo predeterminado,
- generar una señal relacionada con el cambio medible,
- medir la intensidad de señal durante dicho periodo de tiempo predeterminado, de forma que los valores de intensidad se obtienen para una pluralidad de momentos,
- obtener una puntuación individual de cada una de una pluralidad de pruebas, comprendiendo la pluralidad de pruebas una prueba del intervalo de confianza y una prueba de la relación señal/ruido,
- introducir las puntuaciones en una función para generar una puntuación compuesta, y
- comparar la puntuación compuesta con intervalos predeterminados para hacer una llamada positiva, negativa o indeterminada de la presencia del analito.
26. El procedimiento de la reivindicación 25, en
el que el analito es un ácido nucleico y el sustrato incluye
cebadores de PCR, dNTPs y una polimerasa.
27. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que la señal comprende una señal fluorescente y el cambio
medible es la cantidad del ácido nucleico.
28. El procedimiento de la reivindicación 25, en
el que el analito es una bacteria y el sustrato incluye
nutrientes.
29. El procedimiento de la reivindicación 28, en
el que la señal es densidad óptica y el cambio medible es la
cantidad de bacterias.
30. El procedimiento de la reivindicación 25, en
el que el sustrato es un sustrato para una enzima.
31. El procedimiento de la reivindicación 30, en
el que el analito es un antígeno, la señal se produce por una
enzima ligada al anticuerpo y el cambio medible es la cantidad de
sustrato convertida por la enzima.
32. El procedimiento de la reivindicación 30, en
el que el analito es un anticuerpo, la señal se produce por una
enzima ligada a un antígeno o a un segundo anticuerpo, y el cambio
medible es la cantidad del sustrato convertido por la enzima.
33. El procedimiento de la reivindicación 30, en
el que la señal se produce por un indicador colorimétrico y el
cambio medible es la cantidad de sustrato.
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