ES2251048T3 - Metodos, aparatos y productos de programas informaticos para determinar cantidades de secuencias de acido nucleico en muestras. - Google Patents
Metodos, aparatos y productos de programas informaticos para determinar cantidades de secuencias de acido nucleico en muestras.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA DETERMINAR CANTIDADES DE SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS EN MUESTRAS, QUE INCLUYEN LAS ETAPAS DE AMPLIFICAR UNA SERIE DE CANTIDADES CONOCIDAS DE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO EN MUESTRAS RESPECTIVAS DE CALIBRACION, Y UNA CANTIDAD DESCONOCIDA DE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO EN UNA MUESTRA DE ENSAYO, EN PARALELO, DURANTE UN INTERVALO DE TIEMPO. ESTAS MUESTRAS PUEDEN SER AMPLIFICADAS CON EL USO DE UN PROCEDIMIENTO DE AMPLIFICACION ISOTERMICA, COMO LA AMPLIFICACION POR DESPLAZAMIENTO DE LAS HEBRAS (ADH) O UN PROCEDIMIENTO DE AMPLIFICACION DE CICLO TERMICO COMO LA REACCION DE LA CADENA DE POLIMERASA (RCP), POR EJEMPLO. LAS INDICACIONES DE LAS CANTIDADES DE SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE SE ESTAN AMPLIFICANDO EN LAS MUESTRAS DE CALIBRACION Y ENSAYO SE MIDEN A CONTINUACION CON EL USO DE TECNICAS CONVENCIONALES, EN PUNTOS DE MEDICION EN EL INTERVALO DE TIEMPO. SE REALIZAN ENTONCES PASOS PARA DETERMINAR UN PRIMER NIVEL DE CORTE POTENCIAL, UN PRIMER CONJUNTO DE PUNTOS DE TIEMPO CORRESPONDIENTE EN EL INTERVALO DE TIEMPO, AL QUE LAS INDICACIONES DE LAS CANTIDADES DE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE SE ESTA AMPLIFICANDO EN CADA UNA DE LAS MUESTRAS DE CALIBRACION ES IGUAL AL PRIMER NIVEL DE CORTE. ESTE PASO SE REPITE A CONTINUACION PARA CADA UNO DE UNA SERIE DE DIFERENTES NIVELES DE CORTE POTENCIALES, DE MANERA QUE PUEDAN OBTENERSE CONJUNTOS RESPECTIVOS DE PUNTOS DE TIEMPO EN EL INTERVALO DE TIEMPO PARA CADA NIVEL DE CORTE EN POTENCIA. SEGUN UN ASPECTO PREFERIDO DE LA PRESENTE INVENCION, SE REALIZA A CONTINUACION UNA ETAPA PARA DETERMINAR, EN RELACION CON UN CRITERIO ESTADISTICO, CUAL DE LAS SERIES DE PUNTOS DEL INTERVALO DE TIEMPO SATISFACE MEJOR EL CRITERIO ESTADISTICO CONTRA LAS CANTIDADES CONOCIDAS DE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO EN LAS MUESTRAS DE CALIBRACION. ACTO SEGUIDO SE DETERMINA UNA CANTIDAD DE SECUENCIA DE ACIDOS NUCLEICOS EN LA MUESTRA DE ENSAYO, BASANDOSE EN EL CONJUNTO DE PUNTOS DETERMINADO, PARA SATISFACER MEJOR O DE LA MEJOR MANERA POSIBLE EL CRITERIO ESTADISTICO. LA PRECISION DE ESTA DETERMINACION PUEDE MEJORARSE CON EL USO DE UN NUMERO RELATIVAMENTE ELEVADO DE NIVELES DE CORTE EN POTENCIA.
Description
Métodos, aparatos y productos de programas
informáticos para determinar cantidades de secuencias de ácido
nucleico en muestras.
Esta invención se refiere a métodos, aparatos y
productos de programas informáticos para caracterizar secuencias de
ácidos nucleicos, y más particularmente a métodos, aparatos y
productos de programas informáticos para determinar cantidades de
secuencias de ácidos nucleicos en muestras.
El análisis cuantitativo de secuencias nucleicas
desempeña un papel cada vez más importante en los campos de la
investigación biológica y médica. Por ejemplo, el análisis génico
cuantitativo se ha utilizado para determinar la cantidad de genoma
de un gen particular, como en el caso del oncogén
HER-2 humano, que se amplifica en aproximadamente el
30% de los cánceres de mama humanos. D.J. Slamon et al.,
Science 235, 177-182 (1987). Más
recientemente, la cuantificación génica y del genoma también se ha
utilizado en la determinación y monitorización de los niveles de
virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en un paciente a través de
las diferentes fases de la infección y la enfermedad por el VIH.
M.R. Furtado et al., J. Virol. 69,
2092-2100 (1995). Se ha sugerido que los niveles
superiores de VIH circulante y la falta de control efectivo de la
replicación del virus tras la infección pueden asociarse a
pronóstico de enfermedad negativo; en otras palabras, puede haber
una asociación entre el nivel vírico (replicación de VIH) y la
patogenia de la enfermedad. M. Paitak et al., Science
259, 1749-1754 (1993). Por consiguiente, una
determinación precisa de los niveles de ácido nucleico del VIH al
comienzo de una infección puede servir como una herramienta útil en
el diagnóstico de la enfermedad, mientras que la capacidad de
monitorizar correctamente los niveles cambiantes del ácido nucleico
vírico en un paciente a lo largo del transcurso de una enfermedad
puede proporcionar a los médicos información crítica con respecto a
la eficacia del tratamiento y la progresión de la enfermedad.
Adicionalmente, la determinación de los niveles en plasma de ARN de
VIH asociado al virión representa un marcador de replicación vírica
con aplicabilidad extendida potencial en la evaluación de la
actividad de tratamiento antirretrovírico, citado anteriormente.
Se han descrito varios métodos para el análisis
cuantitativo de secuencias de ácidos nucleicos. La reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR de la transcriptasa inversa
(PCR-TI) han permitido el análisis de pequeñas
cantidades de partida de ácido nucleico (es decir, tan pequeño como
un equivalente celular). Véase, por ejemplo, S. Edmands et
al. 1994, PCR Methods Applic. 3, 317-19;
I.R. Rodríguez et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20,
3528. Informes tempranos de PCR cuantitativa notifican la
cuantificación del producto de PCR, pero no miden la cantidad
inicial de la secuencia diana. F. Ferre 1992, PCR Methods
Applic. 2, 1-9. En general, estos métodos
implican medir el producto de PCR al final de la ciclado térmico de
temperatura y refieren este nivel a la concentración de ADN de
partida. Desgraciadamente, la cantidad absoluta de producto generado
no siempre soporta una relación consistente con respecto a la
cantidad de secuencia diana presente al inicio de la reacción,
particularmente para muestras clínicas. Un análisis de "criterio
de valoración" de este tipo revela la presencia o ausencia de
ácido nucleico de partida, pero generalmente no proporciona una
medida precisa del número de dianas de ADN, citado anteriormente.
Tanto la cinética como la eficacia de la amplificación de una
secuencia diana son dependientes de la abundancia de partida de esa
secuencia, y de la correspondencia entre la secuencia de los
cebadores y el molde diana, y puede estar afectada por los
inhibidores presentes en la muestra. En el análisis por PCR de
muestras de ARN, las eficacias variables tanto en las etapas de
transcripción inversa como de amplificación son fuentes potenciales
de variabilidad. Por estas razones, la comparación de la cantidad de
producto de PCR derivado de muestra con respecto a la cantidad de
producto a partir de un patrón de control externo amplificado no
proporciona una base rigurosa para la cuantificación.
Un enfoque específico a la amplificación de ácido
nucleico es medir la cantidad de producto de PCR en la fase
logarítmica de la reacción antes de la meseta. Véase, por
ejemplo, Kellogg et al. 1990, Anal. Biochem. 189,
202-208; S. Pang et al. 1990, Nature
343, 85-89. Este método requiere que cada muestra
tenga iguales cantidades de entrada de ácido nucleico y que cada
muestra en el análisis se amplifique con igual eficacia hasta el
análisis cuantitativo. Una secuencia génica (contenida en todas las
muestras a una cantidad relativamente constante) puede utilizarse
para la normalización de la eficacia de la amplificación de muestra.
Sin embargo, usando los métodos convencionales de detección y
cuantificación por PCR, es extremadamente laborioso asegurar que
todas las muestras se analizan durante la fase logarítmica de la
reacción, tanto para el gen diana como para el gen de
normalización.
Se ha desarrollado otro método, la PCR
competitiva cuantitativa (PCR-CC), y también se ha
utilizado ampliamente para la cuantificación por PCR. Véase, por
ejemplo, P.D. Siebert y J.W Larrick 1992, Nature 359,
557-558; M.J. Piatak et al. 1993,
BioTechniques 14, 70-81; X. Tan et al.
1994, Biochim. Biophys. Acta 1215, 157-162;
L. Raeymaekers 1995, Genome Res. 5, 91-94. La
PCR-CC se basa en la inclusión de una cantidad
conocida de un competidor de control interno en cada mezcla de
reacción. La eficacia de cada reacción se normaliza al competidor
interno. Para obtener una cuantificación relativa, el producto de
PRC diana desconocido se compara con el producto de PCR competidor
conocido, usando normalmente electroforesis en gel. Se mide la
cantidad relativa de ADN competidor y específico de diana; esta
razón se utiliza para calcular el número de partida de moldes diana.
Básicamente, en este tipo de análisis, cuanto mayor sea la razón de
producto específico de diana con respecto a producto específico de
competidor, mayor será la concentración de ADN de partida. El éxito
de un ensayo de PCR-CC se basa en el desarrollo de
un control interno que se amplifica con la misma eficacia que la
molécula diana. Sin embargo, el diseño del competidor y la
validación de las eficacias de amplificación requieren mucho
esfuerzo. En el método de PCR-CC de la
cuantificación de ARN, un molde de ARN competitivo que se
corresponde con la secuencia diana de interés, pero diferenciándose
de ésta en virtud de una deleción interna introducida, se utiliza en
una valoración competitiva de las etapas de transcripción inversa y
PCR, proporcionando un estricto control interno. Véase, por ejemplo,
A. Rashtchian 1994, PCR Methods. Applic. 4,
S83-S91. M. Clementi et al. 1993, PCR
Methods Applic. 2, 191-196; M.
Becker-Andre 1991, Meth. Molec. Cell. Biol.
2, 189-201; R.K. McCulloch et al. 1995,
PCR Methods Applic. 4, 219-226. El aumento de
las cantidades de números de copia conocidos de moldes competitivos
se añade a las partes de replicación de la muestra de prueba, y la
cuantificación se basa en la determinación de las cantidades
relativas (no absolutas) de los productos amplificados de tamaño
diferente derivados del tipo natural y moldes competitivos, después
de la separación electroforética.
Además de requerir tiempo y un oneroso
tratamiento aguas abajo tal como hibridación o electroforesis en
gel, estos ensayos están limitados en el intervalo dinámico (es
decir, sensibilidad con respecto a un intervalo de concentraciones
de ácido nucleico diana). Por ejemplo, en ensayos competitivos, la
sensibilidad con respecto a las diferencias de concentración de
molde puede ponerse en peligro cuando ni el ADN diana ni el
competidor añadido estén enormemente en exceso con respecto al otro.
El intervalo dinámico de los ensayos que miden la cantidad de
producto final también puede limitarse porque el número de ciclos
elegidos de algunas reacciones puede haber alcanzado un nivel de
"meseta" de producto antes que las otras reacciones. Véase, por
ejemplo, L. Raeymaekers, citado anteriormente. Por tanto, las
diferencias en los niveles de molde de partida en estas reacciones
pueden no estar bien reflejadas. Además, pequeñas diferencias en la
cantidad medida de producto pueden dar como resultado cálculos
aproximadas ampliamente variables de la concentración de molde de
partida, lo que conduce a inexactitudes debido a las condiciones
variables de reacción o a la presencia de inhibidores.
En un intento por reducir la cantidad de análisis
requeridos después de la amplificación para determinar la cantidad
de ácido nucleico inicial, se han desarrollado métodos adicionales
para medir la amplificación de los ácidos nucleicos en "tiempo
real". Generalmente, estos métodos aprovechan los marcajes
fluorescentes (por ejemplo, colorantes fluorescentes) que pueden
indicar la cantidad de ácido nucleico que se está amplificando y
utilizan la relación entre el número de ciclos requeridos para
conseguir un nivel elegido de señal fluorescente y la concentración
de dianas amplificables al inicio del proceso de PCR. Por ejemplo,
el documento EP-A-0 640 828 describe
un ensayo cuantitativo para una secuencia diana de ácido nucleico
amplificable que correlaciona el número de ciclos de temperatura
necesarios para alcanzar una cierta concentración de la secuencia
diana con respecto a la cantidad de ADN diana presente al principio
del proceso de PCR. En este sistema de ensayo, se prepara un
conjunto de mezclas de reacción para la amplificación, incluyendo
una preparación una concentración desconocida de secuencia diana y
otras que contienen concentraciones conocidas (patrones) de la
secuencia. Las mezclas de reacción también contienen colorante
fluorescente que fluoresce cuando se une al ADN de doble cadena. Las
mezclas de reacción se ciclan térmicamente en paralelo durante un
número determinado de ciclos para conseguir una amplificación
suficiente de las dianas. La fluorescencia emitida de las mezclas de
reacción se monitoriza en tiempo real (es decir, como se produce en
las reacciones de amplificación) y se determina el número de ciclos
necesarios para que cada mezcla de reacción emita fluorescencia
hasta un umbral de intensidad arbitrario (valor de fluorescencia
arbitrario o AFV). El número de ciclos necesarios (C_{T}) para la
mezcla de ácido nucleico desconocido para alcanzar el valor de AFV
se compara entonces con el número de ciclos necesarios para las
mezclas conocidas para alcanzar el valor de AFV. Este método se basa
en una correlación directa entre el número de ciclos necesarios para
conseguir una intensidad de fluorescencia dada y el logaritmo de la
concentración de las dianas de ácido nucleico. Por tanto, esta
relación se utiliza para obtener la cantidad inicial de la secuencia
de ácido nucleico diana en la mezcla de concentración desconocida.
El método proporciona la selección de un umbral arbitrario a partir
del cual se miden los números de los ciclos de amplificación, ya que
los perfiles de amplificación registrados (curvas de amplificación)
se analizan para encontrar un AFV con el que comparar los perfiles
de amplificación desconocidos con el perfil de amplificación patrón.
Sin embargo, no se da importancia particular a la selección inicial
del AFV o valor de corte, ya que se elige un valor de AFV a modo de
ejemplo que esté en el medio de un intervalo en el que las curvas de
amplificación son relativamente lineales (es decir, en la transición
desde una amplificación exponencial hacia arriba hacia un curvado
hacia abajo para dar una asíntota). Además, se notifican resultados
similares en la cuantificación de ácidos nucleicos para un intervalo
bastante amplio de valores de AFV. Un inconveniente de este método
conocido es que por debajo de un número de copias inicial de
10^{3} moléculas de secuencia diana, el método es poco fidedigno
para determinar con precisión la concentración inicial. Otro
inconveniente de este método es que supone que la forma de cada
curva de amplificación permanece igual, independientemente de si
realmente lo hace o no. Finalmente, sólo se toman unos pocos puntos
de datos próximos al valor de corte arbitrario para determinar la
concentración inicial de ácido nucleico diana.
C.A. Heid et al. 1996 (Genome
Research 6, 986-994) y U. Gibson et al.
1996 (Genome Research 6, 995-1001) notifican
métodos de PCR cuantitativa en tiempo real para análisis de
cuantificación de ADN y ARN, respectivamente. Ambos ensayos utilizan
sistemas de notificación de fluorescencia dual y están basados en el
uso del ensayo de la 5'-nucleasa descrito por
Holland et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
7276-7280. En estos métodos, un algoritmo
informático genera una representación de la amplificación mediante
la comparación de la cantidad de emisión de colorante notificada con
el número de ciclos de amplificación que han tenido lugar. El
algoritmo calcula el ciclo (C_{T}) en el que cada amplificación de
PCR alcanza un umbral o corte arbitrariamente seleccionado (es
decir, normalmente 10 veces la desviación estándar del nivel
inicial). El umbral de emisión fluorescente relativo se basa en el
nivel inicial de la emisión de colorante notificada durante los
10-15 primeros ciclos de amplificación. Se demostró
que el calor de C_{T} calculado es proporcional al número de
copias diana presentes en la muestra. Por tanto, se encuentra que el
valor de C_{T} es una medición cuantitativa de las copias de la
diana encontradas en cualquier muestra.
Tal como se indicó en la explicación anterior, la
técnica anterior enseña que una forma de realizar análisis
cuantitativos de amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real es
seleccionar un número de lecturas justamente por encima y por debajo
del nivel de corte elegido, ajustar una regresión lineal a esos
puntos y resolver para el "número de ciclos" en el que la recta
ajustada atraviesa el nivel de corte. Por consiguiente, la selección
de un nivel de corte es algo arbitrario, como seleccionar un nivel
de corte aproximadamente 10 veces el de un valor de nivel inicial, o
el máximo valor de muestras que no contienen dianas, o un cierto
nivel de corte por encima de lo que se ha considerado "ruido"
aceptable. Un inconveniente de tales criterios de selección de corte
es que si el valor de corte se corresponde con un punto de tiempo en
la amplificación durante la cual la velocidad de amplificación está
cambiando (es decir, pronto en la amplificación), un ajuste lineal
de los datos será inadecuado.
Hasta ahora no se han apreciado que pequeñas
diferencias en las selección de los niveles de corte utilizados en
los algoritmos de cuantificación pueden tener un efecto sustancial
en la calidad final (es decir, precisión) de la cuantificación.
Sigue habiendo la necesidad de proporcionar un objetivo y método
automático de seleccionar valores de corte preferidos que permita a
los usuarios de los métodos de amplificación determinar las
concentraciones iniciales de los ácidos nucleicos diana de una forma
más precisa y fidedigna que los métodos actuales. Por tanto, sigue
habiendo la necesidad de proporcionar métodos para determinar
niveles de corte dinámicos que pueden variarse fácilmente de un
experimento o determinación a otro.
Por tanto, un objeto de la presente invención es
proporcionar métodos, aparatos y productos de programas informáticos
mejorados para determinar cantidades de secuencias de ácidos
nucleicos en muestras de prueba.
También es un objeto de la presente invención
proporcionar métodos, aparatos y productos de programas informáticos
para medir con más precisión cantidades de secuencias de ácidos
nucleicos de muestras de prueba, usando una pluralidad de muestras
de calibración y control que contienen cantidades conocidas
respectivas de la secuencia de ácido nucleico en las mismas.
Estos y otros objetos, características y ventajas
se proporcionan según la presente invención, mediante métodos,
aparatos y productos de programas informáticos para determinar
cantidades de secuencias de ácidos nucleicos que se han amplificado,
usando un nivel de corte preferido que se determina mediante un
criterio estadístico. En particular, según una realización de la
presente invención, se amplifican en paralelo una pluralidad de
cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en muestras
de calibración respectivas (es decir, patrones) y una cantidad
desconocida de la secuencia de ácido nucleico en una muestra de
prueba durante un intervalo de tiempo. Estas muestras pueden
amplificarse usando un método de reacción de amplificación
isotérmico tal como amplificación por desplazamiento de cadenas
(SDA) o un método de reacción de ciclado térmico tal como la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo. Entonces, se
miden los indicios de las cantidades de la secuencia de ácido
nucleico que se están amplificando en las muestras de calibración y
de prueba usando técnicas convencionales, en los puntos de medición
en el intervalo de tiempo. Los indicios de las cantidades de la
secuencia de ácido nucleico que se están amplificando pueden tomar
la forma de señales de fluorescencia (por ejemplo, intensidades de
fluorescencia o transferencia de energía fluorescente detectable) si
las muestras contienen indicadores fluorescentes en las mismas (por
ejemplo, colorantes fluorescentes, marcadores, intercaladores,
etc.). También pueden utilizarse otros indicios que son adecuados
para la medición en tiempo real (por ejemplo, señales
radioactivas).
Entonces, se realiza una etapa para determinar
para un primer nivel de corte potencial, un primer conjunto
correspondiente de puntos de tiempo en el intervalo de tiempo en el
que los indicios medidos de las cantidades de la secuencia de ácido
nucleico que se está amplificando en cada una de las muestras de
calibración son iguales al primer nivel de corte. Esta etapa se
repite entonces para cada uno de varios niveles diferentes de corte
potenciales, de manera que pueden obtenerse los conjuntos
respectivos de puntos de tiempo en el intervalo de tiempo para cada
nivel de corte potencial. Según un aspecto preferido de la presente
invención, se realiza entonces una etapa para determinar, con
respecto a un criterio estadístico, cuál de los conjuntos de puntos
en el intervalo de tiempo satisface mejor el criterio estadístico
con respecto a las cantidades conocidas de la secuencia de ácido
nucleico en las muestras de calibración. Entonces se determina una
cantidad de la secuencia de ácido nucleico en la muestra de prueba
basándose en el conjunto de puntos determinado que mejor o el mejor
que satisface el criterio estadístico.
La etapa para determinar cuál de los conjuntos de
puntos satisface mejor el criterio estadístico puede comprender la
etapa de determinar cuál de los conjuntos de puntos en el intervalo
de tiempo proporciona un mejor ajuste lineal frente a los logaritmos
de las cantidades de partida conocidas de la secuencia de ácido
nucleico en las muestras de calibración. Preferiblemente, esta etapa
comprende las etapas de ajustar rectas de regresión a
"gráficas" respectivas de cada uno de los conjuntos de puntos
de tiempo en el intervalo de tiempo frente a logaritmos de las
cantidades de partida conocidas de la secuencia de ácido nucleico en
las muestras de calibración. Entonces, se determinan las
desviaciones estándar de los ajustes entre cada uno de los conjuntos
de puntos de tiempo y rectas de regresión respectivas. El conjunto
de puntos de tiempo que corresponde preferiblemente a la desviación
estándar más pequeña del ajuste se utiliza entonces para seleccionar
el nivel de corte preferido de los niveles de corte potenciales y
luego determinar la cantidad de partida del ácido nucleico en la
muestra de prueba basado en el nivel de corte preferido. Este
resultado ventajoso se consigue preferiblemente mediante la
determinación de un tiempo en el que los indicios medidos de las
cantidades de la secuencia de ácido nucleico en la muestra de prueba
iguale el nivel de corte preferido y después ajustar ese tiempo a la
recta de regresión "preferida" correspondiente al conjunto
preferido de puntos de tiempo. El logaritmo de la concentración de
partida de la secuencia de ácido nucleico en la muestra de prueba
puede determinarse entonces a partir de la recta de regresión
preferida.
Según otro aspecto preferido de la presente
invención, se realiza una operación de ajuste a curva para estimar
con más precisión el nivel de corte de indicios preferidos (por
ejemplo, nivel de corte preferido de señales de fluorescencia). En
particular, las curvas de "datos" respectivas se ajustan
preferiblemente a "gráficas" de puntos diferenciados de las
señales de fluorescencia medidas de muestras calibración
individuales y de prueba frente a puntos en el intervalo de tiempo
en el que se midieron las señales de fluorescencia correspondientes.
En el presente documento, puede realizarse una operación de
suavizado de curvas no paramétricas una vez de que los puntos
diferenciados se hayan normalizado a un nivel inicial común. Tal
como determinaron los inventores en el presente documento, incluso
es posible mejorar adicionalmente la precisión del nivel de corte de
indicios preferido mediante la determinación de las curvas del
límite de confianza inferior para cada una de las curvas de datos
"suavizadas". Las curvas del límite de confianza inferior
también pueden suavizarse usando una operación de suavizado no
paramétrica. Cada uno de los conjuntos de puntos de tiempo
anteriormente descritos en el intervalo de tiempo pueden
determinarse entonces mediante la determinación de intersecciones
entre cada una de las curvas del límite de confianza inferior
suavizadas y los respectivos niveles de corte potenciales.
Tal como se describió anteriormente, puede
utilizarse un conjunto de puntos de tiempo que se corresponden con
la desviación estándar más pequeña del ajuste para determinar con
precisión un nivel de corte preferido y entonces determinar la
cantidad de partida del ácido nucleico en la muestra de prueba
basándose en el nivel de corte preferido. Sin embargo, según otro
aspecto de la presente invención, las muestras control que contienen
cantidades de partida conocidas de la secuencia de ácido nucleico
también pueden utilizarse para facilitar la determinación de un
nivel de corte preferido. En particular, una vez las rectas de
regresión respectivas se han ajustado para cada conjunto de puntos
de tiempo en el intervalo de tiempo correspondiente a las muestras
de calibración, puede determinarse un error de predicción medio
(APE) entre cada recta de regresión y las de un conjunto respectivo
de puntos de tiempo correspondientes a las muestras control. El
nivel de corte potencial correspondiente a la recta de regresión que
tiene el error de predicción medio más bajo asociado al mismo puede
utilizarse entonces para determinar la concentración de partida de
la secuencia de ácido nucleico en la muestra de prueba.
Otra realización preferida de la presente
invención incluye un aparato para determinar una cantidad de una
secuencia de ácido nucleico en una muestra de prueba. Este aparato
preferido comprende un medio, tal como una herramienta de medición
de fluorescencia para medir indicios de las cantidades de una
secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en al menos una
muestra de prueba, que contiene una cantidad de partida desconocida
de la secuencia de ácido nucleico en la misma, y también que se está
amplificando en una pluralidad de muestras de calibración, que
contiene cantidades de partida conocidas respectivas de la secuencia
de ácido nucleico en la misma, en puntos de medición respectivos en
el intervalo de tiempo. También se proporciona un producto de
programa informático para controlar el funcionamiento del medio de
medición y realizar operaciones numéricas relacionadas con las
etapas anteriormente mencionadas.
En particular, el producto de programa
informático preferido comprende un medio de almacenamiento legible
por ordenador que tiene un medio de código de programas legibles por
ordenador incorporado en el medio. El medio de código de programas
legibles por ordenador preferido comprende un medio de código de
programas legibles por ordenador para determinar, para un primer
nivel de corte de indicios potencial, primeros puntos en el
intervalo de tiempo a los que los indicios de las cantidades de la
secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras
de calibración son iguales al primer nivel de corte. El medio de
código de programa también se proporciona preferiblemente para
determinar, para un segundo nivel de corte de indicios potencial,
segundos puntos en el intervalo de tiempo en el que los indicios de
las cantidades de la secuencia de ácido nucleico que se está
amplificando en las muestras de calibración son iguales al segundo
nivel de corte. Además, el medio de código de programa determina,
con respecto a un criterio estadístico, tal como la desviación
estándar más pequeña del ajuste a una recta de regresión o el error
de predicción medio más pequeño con respecto a un recta de
regresión, cuál de la primera o segunda pluralidad de puntos en el
intervalo de tiempo satisface mejor el criterio estadístico frente a
las cantidades conocidas de la secuencia de ácido nucleico en las
muestras de calibración. La cantidad de partida de la secuencia de
ácido nucleico en la muestra de prueba se determina entonces,
basándose en la de los puntos de corte primeros o segundos
determinada para satisfacer mejor el criterio estadístico. El medio
de código de programa preferido también se proporciona para realizar
las etapas más detalladas de las anteriormente descritas, tales como
las operaciones numéricas. Por tanto, la presente invención
proporciona una herramienta que puede determinar con más precisión
las cantidades de secuencias de ácidos nucleicos en muestras de
prueba, mediante la determinación más precisa de los niveles de
corte a los que se evalúan las mediciones de los indicios de las
cantidades de las secuencias de ácidos nucleicos en muestras de
calibración.
La figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra
las etapas realizadas por los métodos de determinación de cantidades
de secuencias de ácidos nucleicos en muestras, según la presente
invención.
La figura 2 es una representación gráfica de los
datos de amplificación para la calibración y las muestras de prueba
que contienen cantidades de una secuencia de ácido nucleico en las
mismas.
La figura 3 es una representación gráfica de los
datos de amplificación y las curvas de suavizado determinadas a
partir de los mismos usando una operación de suavizado no
paramétrica, según la presente invención.
La figura 4A es una representación gráfica del
tiempo para exceder un nivel de corte potencial frente a la
concentración de partida de ácido nucleico, para un nivel de corte
de fluorescencia potencial de 1,12.
La figura 4B es una representación gráfica del
tiempo para exceder un nivel de corte potencial frente a la
concentración de partida de ácido nucleico, para un nivel de corte
de fluorescencia potencial de 1,103.
La figura 4C es una representación gráfica del
tiempo para exceder un nivel de corte potencial frente a la
concentración de partida de ácido nucleico, para un nivel de corte
de fluorescencia potencial de 1,094.
La figura 5 es una representación gráfica que
compara los niveles de corte de fluorescencia preferidos
determinados usando diferentes criterios estadísticos.
La figura 6 ilustra una descripción de hardware
general de aparatos para determinar cantidades de secuencias de
ácidos nucleicos en muestras de prueba, según la presente
invención.
La presente invención se describirá ahora en más
detalle a continuación con referencia a los dibujos adjuntos, en los
que se muestran las realizaciones preferidas de la invención. Sin
embargo, esta invención se realiza de diferentes formas y no debe
interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas en el
presente documento. Más bien, estas realizaciones se proporcionan de
manera que esta descripción se describa cuidadosamente y por
completo, y transmita completamente el alcance de la invención a los
expertos en la técnica. Números iguales se refieren a elementos
iguales en todo el documento.
Con respecto a las figuras 1-5,
ahora se describirán más detalladamente los métodos 10 preferidos
para determinar cantidades de secuencias de ácidos nucleicos en
muestras. Estos métodos incluyen las etapas 12, 14 de amplificar una
pluralidad de cantidades de partida conocidas de una secuencia de
ácido nucleico (por ejemplo, ARN, ADN) en muestras de calibración
respectivas (es decir, patrones) y también amplificar una cantidad
de partida desconocida de la secuencia de ácido nucleico en al menos
una muestra de prueba durante intervalos de tiempo respectivos.
Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico en las muestras de
calibración y de prueba son las mismas, sin embargo, las muestras
pueden contener posiblemente diferentes secuencias de ácidos
nucleicos o pueden amplificarse diferentes cantidades de diferentes
secuencias de ácidos nucleicos en paralelo en una muestra compuesta.
Estas etapas amplificación pueden realizarse usando técnicas
convencionales y pueden realizarse por separado para cada muestra
durante intervalos de tiempo respectivos que no se solapen. Estos
intervalos de tiempo separados pueden normalizarse entonces a un
tiempo de partida y tiempo de intervalo comunes con fines de
análisis. Sin embargo, más preferiblemente, las etapas 12, 14 de
amplificar cada una de las secuencias de ácidos nucleicos en las
muestras de calibración y de prueba se realizan en paralelo en
muestras separadas, durante un intervalo de tiempo único.
Como entenderán los expertos en la técnica, las
muestras pueden amplificarse según cualquier método de amplificación
de ácidos nucleicos conocido, incluyendo tanto los métodos de
amplificación de ciclado térmico como los métodos de amplificación
isotérmicos. La presente invención es ventajosa en mejorar la
cuantificación de ácidos nucleicos amplificados o bien por métodos
de ciclado térmico o bien por métodos isotérmicos, aunque la
presente invención puede proporcionar ventajas particulares a los
métodos de amplificación isotérmicos. Los métodos de ciclado térmico
adecuados útiles en la práctica de la presente invención incluyen,
pero sin limitarse a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR;
documentos U.S-A-4 683 202,
US-A-4 683 195 y
US-A-4 965 188); PCR de la
transcriptasa inversa (PCR-TI); reacción en cadena
de la ADN ligasa (LCR; solicitud de patente internacional número
WO-A-89/09835); y amplificación
basada en la transcripción (D.Y. Kwoh et al. 1989, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177). Los métodos
de amplificación isotérmicos adecuados útiles en la práctica de la
presente invención incluyen, pero sin limitarse a, amplificación por
desplazamiento de cadenas (SDA; Walker et al. 1992, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396);
Q-\beta replicasa (Lizardi et al. 1988,
Bio/Technology 6, 1197-1202); amplificación
basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA; R. Sooknanan y L.
Malek 1995, Bio/Technology 13, 563-65); y
replicación de secuencia autosostenida (3SR; Guatelli et al.
1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,
1874-1878). Métodos de SDA a modo de ejemplo se
describen en los documentos U.S.-A-5 445 166
concedido a Walker y US-A-5 270 184
concedido a Walker et al.
Los indicios de las cantidades de la secuencia de
ácido nucleico que se están amplificando en las muestras de
calibración y de prueba se miden entonces en puntos de medición
respectivos en el intervalo de tiempo, etapa 16, usando una
herramienta de medición tal como el detector de secuencias modelo
7700, fabricado y distribuido por Applied Biosystems, una división
de Perkin Elmer, Foster City, California, o el Fluoroskan II,
fabricado por LabSystems, Inc., Rochester, Nueva York. Los indicios
de las cantidades de la secuencia de ácido nucleico que se está
amplificando en las muestras de calibración y de prueba pueden tomar
la forma de señales de fluorescencia (por ejemplo, intensidades de
fluorescencia o transferencia de energía fluorescente) si las
muestras contienen indicadores de fluorescencia (por ejemplo,
marcajes fluorescentes) en las mismas. Por consiguiente, la
herramienta de medición puede contener uno o más fotodetectores para
medir las señales de fluorescencia de las muestras sometidas a
amplificación en paralelo. La herramienta de medición también puede
contener un motor de velocidad gradual controlado por ordenador, de
manera que cada calibración y muestra de prueba puede disponerse
como una matriz de muestras y posicionarse automática y
repetidamente enfrente de un fotodetector durante la etapa de
medición de la intensidad de fluorescencia. Una herramienta de
medición preferida se describe en más detalle a continuación en el
presente documento con referencia a la figura 6.
Tal como se dispuso anteriormente, los indicios
de la concentración de ácido nucleico diana pueden tomar la forma de
señales fluorescentes, aunque los expertos en la técnica apreciarán
que se conocen otros indicios de concentración de ácido nucleico y
que pueden utilizarse en la práctica de la presente invención. Como
ilustración, los indicios de la concentración de ácido nucleico
pueden proporcionarse por marcador que producen señales detectables
por fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción o
absorción de rayos X, magnetismo o actividad enzimática. Marcadores
adecuados incluyen, por ejemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos
radioactivos (por ejemplo, ^{32}P o ^{125}I), reactivos con alta
densidad electrónica, enzimas y ligandos que tienen componentes de
unión específicos (por ejemplo, biotina-avidina). El
marcaje de ácidos nucleicos puede conseguirse mediante un número de
medios, incluyendo la modificación química de un cebador o muestra
de ácido nucleico. Los marcadores fluorescentes adecuados pueden
incluir marcadores de unión no covalente (por ejemplo, colorantes
intercalantes) tal como bromuro de etidio, bromuro de propidio,
cromomicina, naranja de acridina y similares. Sin embargo, en la
práctica de la presente invención, se prefiere el uso de agentes
fluorescentes unidos covalentemente. Tales marcadores fluorescentes
unidos covalentemente incluyen fluoresceína y derivados de la misma
tal como FAM, HEX, TET y JOE (todos pueden obtenerse de la división
Applied Biosystems de Perkin Elmer, Foster City, California);
rodamina y derivados tales como Texas Red (Molecular Probes, Eugene,
Oregón); ROX y TAMRA (Applied Biosystems, Foster City, CA); Lucifer
Yellow; derivados de cumarina y similares. Otros indicios preferidos
de la concentración de ácido nucleico es la transferencia de energía
de fluorescencia (FET), en la que se utilizan un marcador indicador
fluorescente (o "donador") y un marcador inhibidor de la
fluorescencia (o "aceptor") conjuntamente para producir un
señal detectable que es proporcional a la cantidad de producto de
ácido nucleico amplificado (por ejemplo, en forma de ácido nucleico
de doble cadena) presente en la mezcla de reacción. Todavía otro
método de detección útil en la práctica de la presente invención es
la detección por polarización de fluorescencia (FP) de la
amplificación de ácido nucleico, descrito en el documento
U.S.-A-5 593 867 concedido a Walker et
al.
Después de medir los indicios de cantidades de
secuencias de ácidos nucleicos en la etapa 16, entonces se realiza
la etapa 18 para determinar un primer nivel de corte potencial (por
ejemplo, un primer nivel de fluorescencia normalizado), un primer
conjunto de puntos de tiempo correspondiente en el intervalo de
tiempo en el que los indicios (por ejemplo, señal de fluorescencia)
de las cantidades de la secuencia de ácido nucleico que se está
amplificando en cada una de las muestras de calibración y de prueba
son iguales al primer nivel de corte. Esta etapa se repite entonces
para cada uno de una pluralidad de diferentes niveles de corte
potenciales, de manera que pueden obtenerse conjuntos respectivos de
puntos de tiempo en el intervalo de tiempo para cada nivel de corte
potencial. Tal como se describe en más detalle más adelante en el
presente documento, los "indicios" (por ejemplo, señales de
fluorescencia) pueden ser indicios no filtrados (es decir, datos
brutos) o los indicios pueden estar filtrados, por ejemplo, mediante
la generación de una curva de límite de confianza inferior de los
indicios no filtrados.
Según un aspecto preferido de la presente
invención, se realiza entonces una etapa 20 para determinar, con
respecto a un criterio estadístico, cuál de los conjuntos de puntos
en el intervalo de tiempo satisface mejor el criterio estadístico
frente a las cantidades conocidas de la secuencia de ácido nucleico
en las muestras de calibración. Entonces, se determina una cantidad
de la secuencia de ácido nucleico en la muestra de prueba, basándose
en el conjunto de puntos determinados que mejor o el que mejor que
satisface el criterio estadístico. Por ejemplo, tal como se explica
con más detalle a continuación en el presente documento con
referencia a las figuras 2-5, la etapa de determinar
cuál de los conjuntos de puntos de tiempo satisface mejor el
criterio estadístico, puede comprender la etapa de determinar cuál
de los conjuntos de puntos de tiempo en el intervalo de tiempo
proporciona un mejor ajuste lineal frente a los logaritmos de las
cantidades de partida conocidas de la secuencia de ácido nucleico en
las muestras de calibración. Preferiblemente, esta etapa comprende
las etapas de ajustar rectas de regresión a "gráficas"
respectivas de cada uno de los conjuntos de puntos de tiempo en el
intervalo de tiempo frente a logaritmos de las cantidades de partida
conocidas de la secuencia de ácido nucleico en las muestras de
calibración. Entonces, se determinan las desviaciones estándar de
los ajustes entre cada uno de los conjuntos de puntos de tiempo y
rectas de regresión respectivas. El conjunto de puntos de tiempo que
corresponde preferiblemente a la desviación estándar más pequeña del
ajuste se utiliza entonces para seleccionar el nivel de corte
preferido y entonces determinar la cantidad de partida de la
secuencia de ácido nucleico en la muestra de prueba basándose en el
nivel de corte preferido.
La determinación del conjunto de puntos que
satisface mejor el criterio estadístico se consigue preferiblemente
mediante la determinación de un tiempo en el que la señal de
fluorescencia filtrada (o no filtrada) de la muestra de prueba es
igual al nivel de corte preferido y el ajuste de ese tiempo a la
recta de regresión "preferida" correspondiente al conjunto
preferido de puntos de tiempo. Entonces, se realiza una etapa 22
para determinar la concentración de partida de la secuencia de ácido
nucleico en las muestras de prueba a partir de la recta de regresión
preferida. Según otro aspecto de la presente invención, las muestras
control que contienen cantidades de partida conocidas de la
secuencia de ácido nucleico también pueden utilizarse para facilitar
la determinación de un nivel de corte preferido. En particular, una
vez ajustadas las rectas de regresión respectivas para cada conjunto
de puntos de tiempo en el intervalo de tiempo correspondiente a las
muestras de calibración, puede determinarse un error de predicción
medio (APE) entre cada recta de regresión y las de un conjunto
respectivo de puntos de tiempo correspondientes a las muestras
control. El nivel de corte potencial correspondiente a la recta de
regresión que tiene el error de predicción medio más bajo asociado
al mismo puede utilizarse entonces para determinar la concentración
de partida de la secuencia de ácido nucleico en la muestra de
prueba. También puede utilizarse otro criterio estadístico. Por
ejemplo, puede minimizarse un error de predicción de validación
cruzada para hacer posible la determinación de una concentración de
partida. Alternativamente, si se utilizan múltiples criterios
diferentes, pueden utilizarse como "media" del nivel de corte
preferido conseguido por cada criterio diferente.
Tal como se describe más detalladamente a
continuación en el presente documento, la etapa 18 de determinar
conjuntos de puntos en el intervalo de tiempo para cada uno de los
niveles de corte potenciales puede incluir las etapas iniciales de
ajustar curvas a las gráficas respectivas de los indicios medidos de
las cantidades de la secuencia de ácido nucleico que se están
amplificando en las muestras de calibración o de prueba respectivas
frente a los puntos de tiempo de medición respectivos, usando una
operación de suavizado de curvas no paramétricas. Por tanto, la
amplificación de cada muestra puede representarse por un conjunto de
puntos de datos diferenciados que contienen un conjunto de valores
de x que consisten en puntos de tiempo de medición y un conjunto de
valores de y correspondientes que consisten en señales de
fluorescencia medidas. Estos valores de x e y para cada muestra se
normalizan a un nivel inicial común usando técnicas convencionales y
entonces se realiza una operación de suavizado no paramétrica en
cada uno de los conjuntos de valores de x e y.
En particular, para cada conjunto de valores de x
e y que se corresponden con una muestra de calibración o de prueba
respectiva y forman una curva de amplificación respectiva, se
obtiene un ajuste de onditas ("wavelet") y una curva de
amplificación suave por medio de una operación de contracción de
ondas ("waveshrink") que está comercialmente disponible en el
módulo S+WAVELETS® del paquete de software S-PLUS®.
Este paquete de software está comercialmente disponible de MathSoft,
Inc., Seattle, Washington. Como entenderán los expertos en la
técnica, por la operación de suavizado preferida de la curva
suavizada se genera normalmente un cálculo aproximado del ruido en
los conjuntos de valores de x e y y/o una desviación estándar
(\sigma).
A continuación, según otro aspecto preferido de
la presente invención, se determina una curva de límite de confianza
(LCL) inferior para cada curva de amplificación, de manera que puede
determinarse un cálculo aproximado del tiempo de amplificación
necesario para alcanzar un nivel de corte potencial con sensibilidad
reducida al ruido en los índices medidos (valores de y) o
irregularidades locales en las velocidades de amplificación. Cada
curva de límite de confianza inferior puede determinarse, por
ejemplo, mediante la resta de 2\sigma (u otro valor preferido) de
la señal de fluorescencia de los valores de y para cada curva de
amplificación suavizada. Cada curva de límite de confianza inferior
se "suaviza" preferiblemente usando una operación de suavizado
no paramétrica tal como una operación de ajustes a placa fina
("thin-plate splines") que puede obtenerse a
partir del módulo FUNFITS en el archivo de programa STATLIB. Este
archivo está disponible en la página web http://lib.stat.cmu.edu.
Estas curvas de límite de confianza inferior representan una
relación entre los indicios medidos, como filtrados y el tiempo.
Con fines de ilustración, ahora se describirá una
aplicación de las operaciones anteriormente descritas. En
particular, con respecto a la figura 2, se ilustran las gráficas
x-y de los indicios normalizados no filtrados de las
cantidades de una secuencia de ácido nucleico (es decir, señal de
fluorescencia) que se está amplificando en una pluralidad de
muestras de calibración y de prueba frente al tiempo (es decir,
curvas de amplificación). También se realizaron las operaciones de
suavizado por onditas, tal como se describió anteriormente, para
generar una curva de suavizado para cada una de las curvas de
amplificación. Estas curvas de suavizado se ilustran con las rectas
continuas. En esta aplicación, las muestras de calibración (es
decir, patrones) se prepararon para amplificación mediante adiciones
conocidas de 0, 0, 40, 400, 4000, 15.000 y 40.000 copias diana de
una secuencia de ácido nucleico en tampones de reacción usando
técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Estas muestras de
calibración se ilustran por la leyenda en la figura 2 como CS1=0,
CS2=0, CS3=40, CS4=400, CS5=4.000, CS6=15.000 y CS7=40.000. Para
verificar la precisión de la presente invención, también se
prepararon seis muestras "desconocidas" de prueba. En tres de
las muestras de prueba realizaron adiciones conocidas con 1.144
copias diana de la secuencia de ácido nucleico y en las otras tres
muestras de prueba se realizaron adiciones conocidas con 10.560
copias diana. Estas muestras de prueba se ilustran en la leyenda
como T1=1.144, T2=1.144, T3=1.144, T4=10.560, T5=10.560 y T6=10.560.
Estas seis muestras de prueba también se trataron como muestras
control para ilustrar un criterio estadístico basado en el error de
predicción medio (APE), tal como se explica más detalladamente a
continuación en el presente
\hbox{documento.}
Las operaciones numéricas se realizan entonces en
las curvas de amplificación (CS1-7 y
T1-6) de la figura 2 para generar las curvas de
límite de confianza inferior respectivas que ilustran las relaciones
entre las señales de fluorescencia "filtradas" y el tiempo de
amplificación. En particular, pueden realizarse operaciones de
contracción de ondas para generar curvas de amplificación suavizadas
y determinar una desviación estándar respectiva de cada curva. Las
curvas de límite de confianza inferior pueden determinarse entonces
mediante "filtrado" de las curvas de amplificación mediante la
resta de "2\sigma" de la señal de fluorescencia en cada punto
de tiempo de medición. Esta operación se realiza preferiblemente de
manera que los cálculos aproximados posteriormente determinados de
los tiempos de amplificación necesarios para alcanzar un nivel de
corte de fluorescencia potencial puedan determinarse con
sensibilidad reducida al ruido o irregularidades locales. Las curvas
de límite de confianza inferior (SLCL) "suavizadas" pueden
determinarse entonces mediante la realización de un ajuste a placa
fina para cada una de las curvas de límite de confianza inferior,
usando el paquete de software anteriormente mencionado. También
pueden utilizarse otras técnicas de suavizado. Tales técnicas pueden
incluir, por ejemplo, suavizadores de kernal ("kernal
smoothers"), ajustadores cúbicos ("cubic splines"),
ajustadores b ("b-splines") y regresión
localmente ponderada. Entonces, puede seleccionarse un intervalo
adecuadamente expansivo de niveles de corte de fluorescencia
potenciales (FCL_{L}-FCL_{H}). Tal como
determinó el inventor en el presente documento, una selección
precisa de un nivel de corte preferido es crítico para la
determinación parecida de la cantidad de partida de una secuencia de
ácido nucleico en una muestra de prueba.
Como ilustración, las operaciones anteriormente
descritas pueden realizarse para determinar una curva de límite de
confianza inferior suavizada (SLCL_{CS4}) a partir de los datos de
amplificación correspondientes a la cuarta muestra de calibración
CS4. Esta curva de límite de confianza inferior se ilustra mejor en
la figura 3. Entonces, pueden realizarse las mismas operaciones para
generar curvas de límite de confianza inferior suavizadas a partir
de cada una de las otras curvas de amplificación correspondientes a
las otras muestras. Entonces, se determinan numéricamente las
intersecciones entre cada una de las curvas de límite de confianza
inferior suavizadas y cada una de una pluralidad de niveles de corte
de fluorescencia potenciales espaciados en el intervalo
(FCL_{L}-FCL_{H}), usando técnicas conocidas por
los expertos en la técnica. Entonces, se determinan los conjuntos de
puntos de tiempo a lo largo del eje x en el intervalo
T_{L}-T_{H} a partir de las intersecciones entre
un nivel de corte de fluorescencia respectivo y cada una de las
curvas de límite de confianza inferior suavizadas que intersectan el
nivel de corte respectivo.
Con respecto a la figura 4A y usando un nivel de
corte de fluorescencia potencial de 1,12 como ejemplo, puede
determinarse una gráfica de los puntos de tiempo (determinados a
partir de las intersecciones entre cada una de las curvas de SLCL y
una recta horizontal en y = 1,12) frente a los logaritmos de las
concentraciones de partida conocidas de las muestras de calibración
(eje x). Entonces, puede ajustarse una recta de regresión
(RL_{1,12}) a la gráfica de los puntos de tiempo frente a los
logaritmos de las concentraciones de partida conocidas, tal como se
ilustra. Usando técnicas convencionales bien conocidas por los
expertos en la técnica, también se determina que la desviación
estándar del ajuste entre la recta de regresión y los puntos en la
gráfica es de 0,428. Entonces, se determina, usando un nivel de
corte de fluorescencia potencial de 1,103, la gráfica de los puntos
de tiempo (determinada a partir de las intersecciones entre cada una
de las curvas de SLCL y una recta horizontal en y = 1,103) frente a
los logaritmos de las concentraciones de partida conocidas de las
muestras de calibración (eje x), tal como se ilustra mejor en la
figura 4B. Entonces, se ajusta una recta de regresión (RL_{1,103})
a la gráfica de los puntos de tiempo frente a los logaritmos de las
concentraciones de partida conocidas. Entonces, se determina que la
desviación estándar del ajuste entre la recta de regresión y los
puntos en la gráfica es de 0,180. Finalmente, usando un nivel de
corte de fluorescencia potencial de 1,094, puede determinarse una
gráfica de los puntos de tiempo (determinada a partir de las
intersecciones entre cada una de las curvas de SLCL y una recta
horizontal a y = 1,094) frente a los logaritmos de las
concentraciones de partida conocidas de las muestras de calibración
(eje x), tal como se ilustra mejor en la figura 4C. Entonces, se
ajusta una recta de regresión (RL_{1,094}) a la gráfica de los
puntos de tiempo frente a los logaritmos de las concentraciones de
partida conocidas, tal como se ilustra. Entonces, se determina que
la desviación estándar del ajuste entre la recta de regresión y los
puntos en la gráfica es de 0,226.
Tal como se describe anteriormente, el nivel de
corte que da la desviación estándar más baja del ajuste se utiliza
entonces para trazar las intersecciones entre el nivel de corte y
las curvas de límite de confianza inferior suavizadas seleccionados
correspondientes a las muestras de prueba, a los logaritmos de las
concentraciones de partida de las muestras de prueba. Por ejemplo,
basándose en un análisis de exactamente tres niveles de corte de
fluorescencia potenciales en el intervalo
FCL_{L}-FCL_{H}, debería utilizarse la recta de
regresión RL_{1,103} correspondiente a un nivel de corte de
fluorescencia normalizado de 1,103 para determinar la concentración
de partida de las muestras de prueba T1-T6.
Según otra realización de la presente invención,
puede amplificarse una pluralidad de muestras de "control" que
tienen concentraciones conocidas de la secuencia de ácido nucleico
en las mismas en paralelo con las muestras de calibración y de
prueba. Entonces, pueden compararse los tiempos correspondientes a
las intersecciones (es decir, tiempos de intersección) entre un
nivel de corte de fluorescencia potencial (por ejemplo, 1,12, 1,103
y 1,094) y las curvas de límite de confianza inferior suavizadas
correspondientes a las muestras control con rectas de regresión
respectivas. Entonces, puede determinarse un error de predicción
medio como la media aritmética de cada uno de los errores en el
tiempo entre un tiempo de intersección respectivo y el "tiempo de
intersección" correspondiente predicho por la recta de regresión
a la concentración de partida conocida de la muestra control.
Basándose en el recta de regresión de la figura
4A, se determina un error de predicción medio (APE) del 26,8% si las
muestras de "prueba" T1-T6 (que tienen
concentraciones de partida conocidas en las mismas) se tratan como
muestras control C1-C6 sólo para fines de
ilustración. Tal como muestra la leyenda de la figura 4A, las
concentraciones de partida conocidas de las muestras de prueba (es
decir, las copias diana de 1.144 y 10.560) se predicen entre
904-2.406 copias diana para las muestras de
"control" C1-C3 y entre
10.323-14.858 copias diana para las muestras control
C4-C6. Basándose en el recta de regresión de la
figura 4B, se encuentra un error de predicción medio (APE) del 9%
para las muestras de "control" C1-C6.
Finalmente, tal como muestra la leyenda de la figura 4B, las
concentraciones de partida conocidas de las muestras de prueba se
predicen entre 1.042-1.875 copias diana para las
muestras control C1-C3 y entre
8.865-13.179 copias diana para las muestras control
C4-C6. Basándose en el recta de regresión de la
figura 4C, se encuentra un error de predicción medio (APE) del 0,9%
para las muestras "control" C1-C6. Tal como
muestra la leyenda de la figura 4C, las concentraciones de partida
conocidas de las muestras de prueba se predicen entre
1.049-1.675 copias diana para las muestras control
C1-C3 y entre 8.236-12.264 copias
diana para las muestras control C4-C6. Según esta
realización, el nivel de corte que da el error de predicción medio
más bajo se utiliza entonces preferiblemente para trazar las
intersecciones entre el nivel de corte y las curvas de límite de
confianza inferior suavizadas seleccionadas correspondientes a las
muestras de prueba, para los logaritmos de las concentraciones de
partida de las muestras de prueba. Por ejemplo, basándose en el
análisis de APE para sólo tres niveles de corte de fluorescencia
potenciales en el intervalo FCL_{L}-FCL_{H},
debería utilizarse la recta de regresión RL_{1,094}
correspondiente a un nivel de corte de fluorescencia normalizado de
1,094 para determinar la concentración de partida de las muestras de
prueba T1-T6.
Con referencia ahora a la figura 5, se ilustra
una comparación entre los dos criterios estadísticos anteriormente
descritos. En particular, una representación de la desviación
estándar del ajuste para una recta de regresión frente al nivel de
corte potencial da un nivel de corte preferido de 1,103. Una
representación del error de predicción medio (APE) frente al nivel
de corte potencial da un nivel de corte preferido de 1,094 que es
relativamente próximo a 1,103. Como entenderán los expertos en la
técnica, la figura 5 ilustra la dependencia de dos medidas de
"bondad" en la calibración, concretamente, la precisión
(desviación estándar de la recta de regresión) y la tendencia media
(error de predicción medio), en la elección de los niveles de corte.
Por tanto, elecciones aceptables del criterio estadístico pueden dar
niveles de corte que son aproximadamente iguales. Además, tal como
se ilustra mediante el gran número de puntos de datos
x-y en la figura 5, pueden determinarse cálculos
aproximados más precisos de las cantidades de partida de la
secuencia de ácido nucleico en las muestras de prueba usando un
número mayor de niveles de corte potenciales estrechamente
espaciados.
Otra realización preferida de la presente
invención incluye un aparato 30 para determinar cantidades de
secuencias de ácidos nucleicos en muestras de prueba. Este aparato
preferido comprende un medio 32, tal como herramienta de medición de
fluorescencia anteriormente mencionada, para medir indicios de las
cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está
amplificando en al menos una muestra de prueba (que contiene una
cantidad de partida desconocida de la secuencia de ácido nucleico en
la misma) y en una pluralidad de muestras de calibración (que
contiene cantidades de partida conocidas de la secuencia de ácido
nucleico respectivas en las mismas), en puntos de medición
respectivos en el intervalo de tiempo. El aparato 30 también
funciona bajo control informático. En particular, la herramienta 32
de medición está preferiblemente acoplada operativamente a un
controlador 34 informático de uso general o aplicación específica.
El controlador 34 comprende preferiblemente un producto de programa
informático para controlar el funcionamiento de la herramienta 32 de
medición y realizar operaciones numéricas relacionadas con las
etapas anteriormente mencionadas. El controlador 34 puede aceptar un
sistema y otros datos relacionados por medio de un archivo 36,
entrada 38 de disco o bus 40 de datos. También se proporcionan
preferiblemente un visualizador 42 y una impresora 44 para exponer
visualmente las operaciones realizadas por el controlador 34. Los
expertos en la técnica entenderán que las funciones realizadas por
el controlador 34 pueden realizarse en su totalidad o en parte como
módulos de software que se ejecutan en un sistema informático de
propósito general. Alternativamente, puede proporcionarse un sistema
autónomo con los circuitos integrados específicos para la aplicación
para realizar las funciones y operaciones anteriormente
mencionadas.
En particular, un producto de programa
informático preferido comprende un medio de almacenamiento legible
por ordenador que tiene un medio de código de programas legibles por
ordenador incorporado en el medio. El medio de código de programas
legibles por ordenador preferido comprende un medio de código de
programas legibles por ordenador para determinar, para un primer
nivel de corte de indicios potencial, primeros puntos en el
intervalo de tiempo a los que los indicios de las cantidades de la
secuencia de ácido nucleico que se están amplificando en las
muestras de calibración son iguales al primer nivel de corte. El
medio de código de programa también se proporciona preferiblemente
para determinar para un segundo nivel de corte de indicios
potencial, segundos puntos en el intervalo de tiempo en el que los
indicios de las cantidades de la secuencia de ácido nucleico que se
está amplificando en las muestras de calibración son iguales al
segundo nivel de corte. Además, el medio de código de programa
determina, con respecto a un criterio estadístico, tal como la
desviación estándar más pequeña del ajuste para una recta de
regresión o el error de predicción medio más pequeño con respecto a
un recta de regresión, cuál de la primera o segunda pluralidad de
puntos en el intervalo de tiempo satisface mejor el criterio
estadístico frente a las cantidades conocidas de la secuencia de
ácido nucleico en las muestras de calibración. La cantidad de
partida de la secuencia de ácido nucleico en la muestra de prueba se
determina entonces, basándose en los puntos de corte primeros o
segundos determinados para satisfacer mejor el criterio estadístico.
El medio de código de programa preferido también se proporciona para
realizar las etapas más detalladas de las anteriormente descritas,
tales como las operaciones numéricas. Por tanto, la presente
invención proporciona una herramienta que puede determinar con más
precisión las cantidades de secuencias de ácidos nucleicos en
muestras de prueba, mediante la determinación más precisa de los
niveles de corte a los que se evalúan las mediciones de los indicios
de las cantidades de las secuencias de ácidos nucleicos en muestras
de calibración.
En los dibujos y en la memoria descriptiva se han
dado a conocer realizaciones preferidas habituales de la invención
y, aunque se emplean términos específicos, sólo se utilizan en un
sentido genérico y descriptivo y no con fines de limitación,
exponiéndose el alcance de la invención en las siguientes
reivindicaciones. Además, la terminología en las reivindicaciones
que se refiere a las gráficas, rectas y curvas de ajuste para las
gráficas y que determinan curvas pretende incluir el tratamiento de
datos (por ejemplo, datos de x-y) y variables
internas a una unidad de tratamiento que contiene memoria (por
ejemplo, ordenador) y como se entenderá por los expertos en la
técnica no está limitado a los actos físicos de imprimir o
representar rectas, curvas y gráficas.
Claims (14)
1. Método de determinación de una cantidad de una
secuencia de ácido nucleico en una muestra, que comprende las etapas
de:
- amplificar una pluralidad de cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en muestras de calibración respectivas y una cantidad desconocida de una secuencia de ácido nucleico en una muestra de prueba, durante un intervalo de tiempo;
- medir los indicios de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración y de prueba, en los puntos de medición en el intervalo de tiempo;
- determinar para un primer nivel de corte, primeros puntos en el intervalo de tiempo en el que los indicios de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración son iguales al primer nivel de corte, usando los indicios medidos de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración;
- determinar para un segundo nivel de corte, segundos puntos en el intervalo de tiempo en el que los indicios de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se están amplificando en las muestras de calibración son iguales al segundo nivel de corte, usando los indicios medidos de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se están amplificando en las muestras de calibración;
- determinar, con respecto a un criterio estadístico, cuál de los primeros o segundos puntos en el intervalo de tiempo proporciona un valor de error de regresión más pequeño, basándose en el criterio estadístico frente a las cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en las muestras de calibración; y
- determinar una cantidad de una secuencia de ácido nucleico en la muestra de prueba, basándose en la de los primeros o segundos puntos de corte determinados para proporcionar el valor de error de regresión más pequeño, basándose en el criterio estadístico;
en el que dicha etapa de determinar
cuál de los puntos primero o segundo en el intervalo de tiempo
proporciona un valor de error de regresión más pequeño, basándose en
el criterio estadístico que comprende la etapa de determinar cuál de
los puntos primero o segundo en el intervalo de tiempo proporciona
un error de regresión más pequeño frente a los logaritmos de las
cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en las
muestras de
calibración.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha etapa de determinar los primeros puntos en el intervalo de
tiempo comprende las etapas de:
- ajustar una primera curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una primera de las muestras de calibración frente a los primeros de los puntos de medición en el intervalo de tiempo, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- determinar una primera curva de límite de confianza inferior a partir de la primera curva;
- ajustar una segunda curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una segunda de las muestras de calibración frente a los segundos de los puntos de medición en el intervalo de tiempo, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- determinar una segunda curva de límite de confianza inferior a partir de la segunda curva;
- determinar primeras intersecciones entre el primer nivel de corte y las primeras y segundas curvas de límite de confianza inferior; y
- determinar los primeros puntos en el intervalo de tiempo de las primeras intersecciones.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha etapa de determinar los primeros puntos en el intervalo de
tiempo comprende las etapas de:
- ajustar una primera curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una primera de las muestras de calibración frente a los primeros de los puntos de medición en el intervalo de tiempo, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- ajustar una segunda curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se están amplificando en una segunda de las muestras de calibración frente a los segundos de los puntos de medición en el intervalo de tiempo, usando una operación de suavizado no paramétrica;
\newpage
- determinar primeras intersecciones entre el primer nivel de corte y las primeras y segundas curvas de límite de confianza inferior; y
- determinar los primeros puntos en el intervalo de tiempo de las primeras intersecciones.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha etapa de determinar primeros puntos en el intervalo de tiempo
comprende las etapas de:
- ajustar una primera curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una primera de las muestras de calibración frente a los primeros de los puntos de medición en el intervalo de tiempo, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- determinar una primera curva de límite de confianza inferior a partir de la primera curva, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- ajustar una segunda curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una segunda de las muestras de calibración frente a los segundos de los puntos de medición en el intervalo de tiempo, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- determinar una segunda curva de límite de confianza inferior a partir de la segunda curva usando una operación de suavizado no paramétrica;
- determinar primeras intersecciones entre el primer nivel de corte y las primeras y segundas curvas de límite de confianza inferior; y
- determinar los primeros puntos en el intervalo de tiempo de las primeras intersecciones.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha etapa de amplificación comprende amplificar una pluralidad de
cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en muestras
de calibración respectivas y de control respectivas y una cantidad
desconocida de una secuencia de ácido nucleico en una muestra de
prueba, durante el intervalo de tiempo;
- en el que dicha etapa de determinar primeros puntos en el intervalo de tiempo comprende determinar, para un primer nivel de corte, primeros puntos en el intervalo de tiempo en el que los indicios de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración y de control son iguales al primer nivel de corte, basándose en los indicios medidos de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración; y
- en el que dicha etapa de determinar cuál de los primeros o segundos puntos en el intervalo de tiempo proporciona un valor de error de regresión más pequeño, basándose en el criterio estadístico que comprende la etapa de fijar una primera recta a un gráfico de los primeros puntos frente a los logaritmos de las cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en las muestras de calibración y después determinar un error de predicción medio entre los de los primeros puntos correspondientes a las muestras de control y la primera recta.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha etapa de determinar primeros puntos en el intervalo de tiempo
comprende las etapas de:
- determinar una primera curva de límite de confianza inferior a partir de una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una primera de las muestras de calibración frente a los primeros de los puntos de medición en el intervalo de tiempo;
- determinar una segunda curva de límite de confianza inferior a partir de una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se están amplificando en una segunda de las muestras de calibración frente a los segundos de los puntos de medición en el intervalo de tiempo;
- determinar las primeras intersecciones entre el primer nivel de corte y las primera y segundas curvas de límite de confianza inferior; y
- determinar los primeros puntos en el intervalo de tiempo de las primeras intersecciones.
7. Aparato para determinar una cantidad de una
secuencia de ácido nucleico en una muestra de prueba, que
comprende:
- medio para medir los indicios de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una muestra de prueba, que contiene una cantidad de partida desconocida de una secuencia de ácido nucleico en la misma, y en una pluralidad de muestras de calibración, que contienen cantidades conocidas respectivas de una secuencia de ácido nucleico en las mismas, en los puntos de medición en un intervalo de tiempo; y
- un producto de programa informático que comprende un medio de almacenamiento legible por ordenador que tiene un medio de código de programas legibles por ordenador incorporado en dicho medio, comprendiendo dicho medio de código de programas legibles por ordenador:
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar para un primer nivel de corte, primeros puntos, en el intervalo de tiempo en el que los indicios de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración son iguales al primer nivel de corte, usando los indicios medidos de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar para un segundo nivel de corte, segundos puntos, en el intervalo de tiempo en el que los indicios de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración son iguales al segundo nivel de corte, usando los indicios medidos de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar, con respecto a un criterio estadístico, cuál de los primeros o segundos puntos en el intervalo de tiempo proporciona un valor de error de regresión más pequeño, basándose en el criterio estadístico frente a las cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en las muestras de calibración; y
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar una cantidad de una secuencia de ácido nucleico en la muestra de prueba, basándose en las de los primeros o segundos puntos de corte determinados para proporciona un valor de error de regresión más pequeño, basándose en el criterio estadístico;
- en el que dicha etapa de determinar cuál de los puntos primero o segundo en el intervalo de tiempo proporciona un valor de error de regresión más pequeño, basándose en el criterio estadístico que comprende la etapa de determinar cuál de los puntos primero o segundo en el intervalo de tiempo proporciona un error de regresión lineal más pequeño frente a los logaritmos de las cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en las muestras de calibración.
8. Aparato según la reivindicación 7, en el que
dicho medio de código de programas legibles por ordenador para
determinar primeros puntos en el intervalo de tiempo comprende:
- medio de código de programas legibles por ordenador para ajustar una primera curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una primera de las muestras de calibración frente a los primeros de los puntos de medición en el intervalo de tiempo;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar una primera curva de límite de confianza inferior a partir de la primera curva;
- medio de código de programas legibles por ordenador para ajustar una segunda curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una segunda de las muestras de calibración frente a los segundos de los puntos de medición en el intervalo de tiempo;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar una segunda curva de límite de confianza inferior a partir de la segunda curva;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar las primeras intersecciones entre el primer nivel de corte y las primera y segundas curvas de límite de confianza inferior; y
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar los primeros puntos en el intervalo de tiempo de las primeras intersecciones.
9. Aparatos según la reivindicación 7, en el que
dicho medio de código de programas legibles por ordenador para
determinar primeros puntos en el intervalo de tiempo comprende:
- medio de código de programas legibles por ordenador para ajustar una primera curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una primera de las muestras de calibración frente a los primeros de los puntos de medición en el intervalo de tiempo, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar una primera curva de límite de confianza inferior a partir de la primera curva;
- medio de código de programas legibles por ordenador para ajustar una segunda curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una segunda de las muestras de calibración frente a los segundos de los puntos de medición en el intervalo de tiempo, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar una segunda curva de límite de confianza inferior a partir de la segunda curva;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar primer intersecciones entre el primer nivel de corte y las primera y segundas curvas de límite de confianza inferior; y
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar los primeros puntos en el intervalo de tiempo de las primeras intersecciones.
10. Aparato según la reivindicación 7, en el que
dicho medio de código de programas legibles por ordenador para
determinar primeros puntos en el intervalo de tiempo comprende:
- medio de código de programas legibles por ordenador para ajustar una primera curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una primera de las muestras de calibración frente a los primeros de los puntos de medición en el intervalo de tiempo, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar una primera curva de límite de confianza inferior a partir de la primera curva, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- medio de código de programas legibles por ordenador para ajustar una segunda curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una segunda de las muestras de calibración frente a los segundos de los puntos de medición en el intervalo de tiempo, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar una segunda curva de límite de confianza inferior a partir de la segunda curva, usando una operación de suavizado no paramétrica;
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar primeras intersecciones entre el primer nivel de corte y las primeras y segundas curvas de límite de confianza inferior suavizadas; y
- medio de código de programas legibles por ordenador para determinar los primeros puntos en el intervalo de tiempo de las primeras intersecciones.
11. Aparato según la reivindicación 7, en el que
dicha etapa de determinar cuál de los primeros o segundos puntos en
el intervalo de tiempo proporciona un error de regresión lineal más
pequeño comprende las etapas de:
- ajustar una primera recta de regresión a una gráfica de los primeros puntos frente a logaritmos de las cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en las muestras de calibración;
- ajustar una segunda recta de regresión a una gráfica de los segundo puntos frente a logaritmos de las cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en las muestras de calibración;
- determinar una desviación estándar del ajuste entre los primeros puntos y la primera recta de regresión; y
- determinar una desviación estándar del ajuste entre los segundos puntos y la segunda recta de regresión.
12. Aparato según la reivindicación 7, en el que
dicha etapa de determinar primeros puntos en el intervalo de tiempo
comprende las etapas de:
- ajustar una primera curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una primera de las muestras de calibración frente a los primeros de los puntos de medición en el intervalo de tiempo;
- determinar una primera curva de límite de confianza inferior a partir de la primera curva;
- ajustar una segunda curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una segunda de las muestras de calibración frente a los segundos de los puntos de medición en el intervalo de tiempo;
- determinar una segunda curva de límite de confianza inferior a partir de la segunda curva;
\newpage
- determinar primeras intersecciones entre el primer nivel de corte y las primera y segundas curvas de límite de confianza inferior; y
- determinar los primeros puntos en el intervalo de tiempo de las primeras intersecciones.
13. Producto de programa informático legible por
un máquina que tiene un medio acoplado operativamente al mismo para
medir los indicios de cantidades de una secuencia de ácido nucleico
que se están amplificando en una muestra de prueba, que contiene una
cantidad de partida desconocida de una secuencia de ácido nucleico
en las mismas, y en una pluralidad de muestras de calibración, que
contiene cantidades conocidas respectivas de una secuencia de ácido
nucleico en las mismas, en los puntos de medición en un intervalo de
tiempo, e incorporando tangiblemente un programa de instrucciones
que puede ejecutar la máquina para realizar las etapas del método
de:
- determinar para un primer nivel de corte, primeros puntos, en el intervalo de tiempo en el que los indicios de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración son iguales al primer nivel de corte, usando los indicios medidos de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración;
- determinar para un segundo nivel de corte, segundos puntos, en el intervalo de tiempo en el que los indicios de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración son iguales al segundo nivel de corte, usando los indicios medidos de las cantidades de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en las muestras de calibración;
- determinar, con respecto a un criterio estadístico, cuál de los primeros o segundos puntos en el intervalo de tiempo proporciona un valor de error de regresión más pequeño, basándose en el criterio estadístico frente a las cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en las muestras de calibración; y
- determinar una cantidad de una secuencia de ácido nucleico en la muestra de prueba, basándose en la de los primeros o segundos niveles de corte determinados para proporcionar el valor de error de regresión más pequeño basándose en el criterio estadístico;
- en el que la etapa de determinar cuál de los primeros o segundos puntos en el intervalo de tiempo proporciona un valor de error de regresión más pequeño basándose en los criterios estadísticos, que comprende la etapa de determinar cuál de los primeros o segundos puntos en el intervalo de tiempo proporciona un valor de error de regresión más pequeño frente a los logaritmos de las cantidades conocidas de una secuencia de ácido nucleico en las muestras de calibración.
14. Producto de programa informático según la
reivindicación 13, en el que dicha etapa de determinar cuál de los
primeros o segundos puntos en el intervalo de tiempo comprende las
etapas de:
- ajustar una primera curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una primera de las muestras de calibración frente a los primeros de los puntos de medición en el intervalo de tiempo;
- determinar una primera curva de límite de confianza inferior a partir de la primera curva;
- ajustar una segunda curva a una gráfica de los indicios medidos de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando en una segunda de las muestras de calibración frente a los segundos de los puntos de medición en el intervalo de tiempo;
- determinar una segunda curva de límite de confianza inferior a partir de la segunda curva;
- determinar primeras intersecciones entre el primer nivel de corte y las primera y segundas curvas de límite de confianza inferior; y
- determinar los primeros puntos en el intervalo de tiempo de las primeras intersecciones.
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| US6277578B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-21 | Promega Corporation | Deploymerization method for nucleic acid detection of an amplified nucleic acid target |
| US6270974B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Exogenous nucleic acid detection |
| US6703211B1 (en) | 1998-03-13 | 2004-03-09 | Promega Corporation | Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP |
| US6066458A (en) * | 1998-05-18 | 2000-05-23 | Becton, Dickinson And Company | Methods, apparatus and computer program products for determining quantities of nucleic acid sequences in samples using standard curves and amplification ratio estimates |
| US6573047B1 (en) | 1999-04-13 | 2003-06-03 | Dna Sciences, Inc. | Detection of nucleotide sequence variation through fluorescence resonance energy transfer label generation |
| US6180349B1 (en) | 1999-05-18 | 2001-01-30 | The Regents Of The University Of California | Quantitative PCR method to enumerate DNA copy number |
| US6516276B1 (en) * | 1999-06-18 | 2003-02-04 | Eos Biotechnology, Inc. | Method and apparatus for analysis of data from biomolecular arrays |
| EP1210358A4 (en) * | 1999-08-13 | 2005-01-05 | Univ Brandeis | PROOF OF NUCLEIC ACIDS |
| AU1939001A (en) | 1999-12-02 | 2001-06-12 | Dna Sciences, Inc. | Methods for determining single nucleotide variations and genotyping |
| US6783934B1 (en) | 2000-05-01 | 2004-08-31 | Cepheid, Inc. | Methods for quantitative analysis of nucleic acid amplification reaction |
| EP1158449A3 (en) * | 2000-05-19 | 2004-12-15 | Becton Dickinson and Company | Computerized method and apparatus for analyzing readings of nucleic acid assays |
| US6355433B1 (en) | 2000-06-02 | 2002-03-12 | Dna Sciences, Inc. | Determination of nucleotide sequence variations through limited primer extension |
| US7226732B2 (en) * | 2001-07-16 | 2007-06-05 | Cepheid | Methods, apparatus, and computer programs for verifying the integrity of a probe |
| US7363168B2 (en) * | 2001-10-02 | 2008-04-22 | Stratagene California | Adaptive baseline algorithm for quantitative PCR |
| EP1463796B1 (en) | 2001-11-30 | 2013-01-09 | Fluidigm Corporation | Microfluidic device and methods of using same |
| DE60335116D1 (de) * | 2002-06-28 | 2011-01-05 | Primeradx Inc | Verfahren zum nachweis von sequenzunterschieden |
| NL1021160C2 (nl) * | 2002-07-26 | 2004-01-27 | Multigen Internat B V | Werkwijze voor het bepalen van het kopieaantal van een nucleotidevolgorde. |
| EP1615721B1 (en) | 2003-04-03 | 2014-06-18 | Fluidigm Corporation | Microfluidic devices and methods of using same |
| TWI375796B (en) * | 2003-04-18 | 2012-11-01 | Becton Dickinson Co | Immuno-amplification |
| US20050233314A1 (en) * | 2003-06-30 | 2005-10-20 | National Health Research Institutes | Sensitive and quantitative detection of pathogens by real-time nested PCR |
| AU2005233583B2 (en) * | 2004-04-08 | 2011-02-03 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modulating cardiac contractility |
| ATE418346T1 (de) * | 2004-04-08 | 2009-01-15 | Sangamo Biosciences Inc | Zusammensetzungen zur behandlung von neuropathischen und neurodegenerativen erkrankungen |
| US20050233332A1 (en) * | 2004-04-14 | 2005-10-20 | Collis Matthew P | Multiple fluorophore detector system |
| US20060009916A1 (en) * | 2004-07-06 | 2006-01-12 | Xitong Li | Quantitative PCR data analysis system (QDAS) |
| CA2599004C (en) | 2005-02-28 | 2015-05-26 | Sangamo Biosciences, Inc. | Anti-angiogenic methods and compositions |
| EP1861512A4 (en) | 2005-03-18 | 2009-12-09 | Fluidigm Corp | THERMAL REACTION DEVICE AND USE METHOD THEREFOR |
| WO2007019410A2 (en) * | 2005-08-05 | 2007-02-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Mammalian obestatin receptors |
| US8831887B2 (en) * | 2005-10-12 | 2014-09-09 | The Research Foundation For The State University Of New York | Absolute PCR quantification |
| DK2623605T3 (en) | 2007-04-09 | 2019-03-25 | Univ Florida | RAAV VECTOR COMPOSITIONS WITH TYROSIN MODIFIED CAPSIDE PROTEINS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF |
| ES2380844T3 (es) | 2007-09-07 | 2012-05-18 | Fluidigm Corporation | Determinación de la variación en el número de copias, métodos y sistemas |
| JP2010538612A (ja) * | 2007-09-07 | 2010-12-16 | サード ウェーブ テクノロジーズ，インコーポレーテッド | 標的の定量化のための方法およびアプリケーション |
| JP5530185B2 (ja) * | 2008-02-05 | 2014-06-25 | オリンパス株式会社 | 核酸検出方法及び核酸検出用キット |
| US9121055B2 (en) * | 2008-04-24 | 2015-09-01 | 3M Innovative Properties Company | Analysis of nucleic acid amplification curves using wavelet transformation |
| CA2767616A1 (en) | 2009-07-09 | 2011-01-13 | The Scripps Research Institute | Gene expression profiles associated with chronic allograft nephropathy |
| JP2012533545A (ja) | 2009-07-14 | 2012-12-27 | ベス・イスラエル・ディーコネス・メディカル・センター，インコーポレイテッド | 肝臓の増殖を増大させる方法 |
| CA2823193C (en) | 2010-12-27 | 2017-06-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Quantitating high titer samples by digital pcr |
| CA2863121A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbott Molecular Inc. | Microorganism nucleic acid purification from host samples |
| US9850515B2 (en) | 2013-02-08 | 2017-12-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Affinity-based partition assay for detection of target molecules |
| US9896717B2 (en) | 2013-05-09 | 2018-02-20 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Magnetic immuno digital PCR assay |
| EP2986761B1 (en) | 2014-02-13 | 2018-08-15 | Bio-rad Laboratories, Inc. | Chromosome conformation capture in droplet partitions |
| US11104951B2 (en) | 2014-05-22 | 2021-08-31 | The Scripps Research Institute | Molecular signatures for distinguishing liver transplant rejections or injuries |
| CA2949959C (en) | 2014-05-22 | 2026-07-21 | Northwestern University | Gene expression profiles associated with sub-clinical kidney transplant rejection |
| WO2015179777A2 (en) | 2014-05-22 | 2015-11-26 | The Scripps Research Institute | Gene expression profiles associated with sub-clinical kidney transplant rejection |
| EP3146077A4 (en) | 2014-05-22 | 2018-05-02 | The Scripps Research Institute | Tissue molecular signatures of kidney transplant rejections |
| US10443100B2 (en) | 2014-05-22 | 2019-10-15 | The Scripps Research Institute | Gene expression profiles associated with sub-clinical kidney transplant rejection |
| MX2016017136A (es) | 2014-06-27 | 2017-05-10 | Abbott Lab | Composiciones y metodos para detectar pegivirus 2 de humano (hpgv-2). |
| EP3271849B1 (en) | 2015-03-17 | 2021-09-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detection of genome editing |
| KR20250099416A (ko) | 2018-03-02 | 2025-07-01 | 퀀텀사이트, 인크. | 조직으로부터 관심 영역의 단리 및 발현 분석을 위한 방법, 조성물, 및 장치 |
| US12582726B1 (en) | 2019-04-05 | 2026-03-24 | Earli Inc. | Synthetic cancer-specific promoters |
| EP3946470A4 (en) | 2019-04-05 | 2023-05-31 | Earli Inc. | IMPROVED METHODS AND COMPOSITIONS FOR SYNTHETIC BIOMARKERS |
| US12496305B2 (en) | 2019-07-30 | 2025-12-16 | The Cleveland Clinic Foundation | Detection for determining corticosteroid responsiveness |
| WO2022115705A2 (en) | 2020-11-30 | 2022-06-02 | Enigma Biointelligence, Inc. | Non-invasive assessment of alzheimer's disease |
| US20240374761A1 (en) | 2021-05-05 | 2024-11-14 | Radius Pharmaceuticals, Inc. | Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor |
| WO2023006642A1 (en) | 2021-07-26 | 2023-02-02 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Assay methods for titration of retrovirus and retroviral vectors |
| WO2026024668A1 (en) | 2024-07-22 | 2026-01-29 | Abbott Laboratories | Method of determining a volume of a liquid in a sample |
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Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5219727A (en) * | 1989-08-21 | 1993-06-15 | Hoffmann-Laroche Inc. | Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction |
| US5455166A (en) * | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| US5994056A (en) * | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| US5270184A (en) * | 1991-11-19 | 1993-12-14 | Becton, Dickinson And Company | Nucleic acid target generation |
| US5650277A (en) * | 1992-07-02 | 1997-07-22 | Diagenetics Ltd. | Method of determining the presence and quantifying the number of di- and trinucleotide repeats |
| CA2129787A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-02-28 | Russell G. Higuchi | Monitoring multiple amplification reactions simultaneously and analyzing same |
| US5547861A (en) * | 1994-04-18 | 1996-08-20 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acid amplification |
| JP2909216B2 (ja) * | 1994-04-29 | 1999-06-23 | パーキン‐エルマー コーポレイション | 核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置 |
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| US5550025A (en) * | 1995-07-19 | 1996-08-27 | Becton, Dickinson And Company | Detection of hydrophobic amplification products by extraction into an organic phase |
| US5863736A (en) * | 1997-05-23 | 1999-01-26 | Becton, Dickinson And Company | Method, apparatus and computer program products for determining quantities of nucleic acid sequences in samples |
-
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