ES2302330T3

ES2302330T3 - Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.

Info

Publication number: ES2302330T3
Application number: ES95912559T
Authority: ES
Inventors: Teresa M. Christianson; Dean W. Goddette; Beatrix Kottwitz; Karl-Heinz Maurer; Christian G. Paech; Winfried Pochandke; Joerg Poethkow; Irmgard Schmidt; Maria R. Tang; Horst Upadek; Albrecht Weiss; Charles Ronald Wilson
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1994-02-24
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 2008-07-01
Anticipated expiration: 2015-02-23
Also published as: DK0701605T3; DK1921148T3; EP1921148A3; EP1921147A2; EP0701605A4; DE69535736T2; EP0701605B2; ATE512227T1; EP0701605A1; EP1921148B1; EP1921148A2; EP1921147B1; EP0701605B1; JPH10507901A; DE69535736D1; EP1921147A3; DK1921147T3; ATE512226T1; ATE390487T1; JP3922391B2

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A PROTEASAS CON PROPIEDADES DE APLICACION MEJORADAS EN LIMPIADORES Y DETERGENTES. LAS MEJORAS SE CONSIGUEN SUSTITUYENDO AMINOACIDOS POSITIVAMENTE CARGADOS O DESCARGADOS EN LA REGION DE UNION DEL SUSTRATO DE LA PROTEASA DE SUBTILISINA DEL TIPO SALVAJE.

Description

Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se relaciona con enzimas proteolíticas mutantes novedosas con propiedades mejoradas relativas a la enzima de tipo salvaje en formulaciones de limpieza y detergente, para las secuencias de nucleótido que codifican las proteasas mejoradas, y para los organismos huésped que contienen las secuencias de nucleótido que codifican las proteasas novedosas. Esta invención también incluye dentro de su objetivo un detergente nuevo y mejorado y composiciones de limpieza que contienen un cantidad de limpieza efectiva de dichas enzimas.

2. Descripción del oficio relacionado

Las subtilisinas son una familia de proteasas extracelulares bacterianas con masas moleculares de 20,000 a 45,000 daltons producidos por un bacilo del lodo por ejemplo Bacillus amyloliquefaciens. Las proteasas son enzimas que catalizan la hidrólisis del péptido ligado en sustratos de proteínas y péptidos y de éster unido en algún éster terminal. Las subtilisinas pertenecen al grupo de proteasas serina que da comienzo al ataque nucleofílico sobre el péptido (éster) unido por un residuo de serina en el sitio activo. Las subtilisinas son enzimas física y químicamente bien caracterizadas. La estructura tri-dimensional de varias subtilisinas se ha clarificado con detalle por estudios de difracción de rayos-X (Betzel, C., Pal, G.P., and Saenger, W. (1988) Eur. J. Biochem. 178, 155-171; Bott, R., Ultsch, M., Kossiakoff, A., Graycar, T., Katz, B., and Power, S. (1988) J. Biol. Chem. 263, 7895-7906; Goddette, D.W., Paech, C., Yang, S.S., Mielenz, J.R., Bystroff, C., Wilke, M., and Fletterick, R.J. (1992) J. Mol. Biol. 228, 580-595; Heinz. D.W., Priestle, J.P., Rahuel, J., Wilson, KS., and Grütter. M.G. (1991) J. Mol. Biol. 217, 353-371; Kraut, J. (1977) Annu. Rev. Biochem. 46, 331-358; Neidhart, D.J. and Petsko, G.A. (1988) Protein Eng. 2, 271-276; Teplyakov, A.V., Kuranova, I.P., Harutyunyan, E.H., Vainshtein, B.K., Frömmel, C., Höhne, W.-E., and Wilson, K.S. (1990) J. Mol. Biol. 214, 261-279). A pesar de esta riqueza de información, no han sido explicadas las diferencias estructura/función entre estas subtilisinas, estrechamente relacionadas.

Las subtilisinas se utilizan ampliamente en productos comerciales (por ejemplo, en detergentes de lavandería y lavado de platos, limpiadores de lentes de contacto) y para propósitos de investigación (catalizadores en química orgánica sintética). Un miembro de la familia subtilisina, una proteasa altamente alcalina para utilizar en formulaciones de detergente ha sido descrito en la aplicación de la patente WO 91/02792. Esta proteasa alcalina del Bacillus lentus (BLAP) se puede obtener en cantidades comerciales de la cepa Bacillus licheniformis ATCC 53926 transformadas por un plásmido de expresión que hospeda el gen BLAP de tipo salvaje bajo el control del gen alcalino B. licheniformis ATCC 53926 del promotor de la proteasa. La estructura de cristal de BLAP se ha deducido (Goddette, D.W., et al. (1992) J. Mol. Biol. 228, 580-595; WO 92/21760), y las coordenadas se han depositado con el Brookhaven Protein Data Bank. A menos que se indique de otra manera la numeración de las posiciones del aminoácido es de acuerdo con la secuencia en BLAP (269 aminoácidos), que difiere de aquella de la subtilisina BPN' (275 aminoácidos). Cuando se alinea para una homología de la secuencia óptima el siguiente patrón surge. En las posiciones de BLAP 1 a 35, 36 a 54, 55 a 160, y 161 a 269 corresponden a las posiciones 1 a 35, 37 a 55, 57 a 162, y 167 a 275, respectivamente, en la subtilisina BPN'.

Con el fin de describir las variantes de la proteasa de acuerdo con la invención, la siguiente nomenclatura se utiliza: [Aminoácido Original; La posición del N-terminal de la enzima madura; Aminoácido Sustituido]. Por ejemplo, la sustitución de valina con isoleucina en la posición 4 en BLAP se designa como V41. La lista de abreviaturas para los aminoácidos se muestra en la Tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Nomenclatura de Aminoácido

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Las mutaciones múltiples dentro la misma molécula de la proteína se indican como la suma de mutaciones individuales, i.e. S3T + V41 + A188P + V193M + V1991.

Protección contra inactivación térmica y química y la mejora del desempeño de lavado y limpieza son objetivos primarios en la investigación y desarrollo de las proteasas para aplicaciones técnicas así como para aplicaciones comerciales. Un gran número de enzimas incluyendo las subtilisinas han sido generadas por el mutagénesis azar y de sitio-específico y proporcionan algunas líneas directivas para una metodología racional para la mejora de estabilidad térmica y química (Estell, D.A., Graycar, T.P., and Wells, J.A. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6518-6521; Matsumura, M., Becktel, W.J., Levitt, M., and Matthews, B.W. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6562-6566; Pantoliano, M.W., Whitlow, M., Wood, J.F., Rollence, M.L., Finzel, B.C., Gilliland, G.L., Poulos, T.L., and Bryan, P.N. (1988) Biochemistry 27, 8311-8317; Russell, A.J. and Fersht, A.R. (1987) Nature 328, 496-500; Siezen, R.J., De Vos, W.M., Leunissen, J.A.M., and Dijkstra, B.W. (1991) Protein Eng. 4, 719-737; van Ee, J.H. (1991) Chimicaoggi (7/8). 31-35; Wells, J.A. and Estell, D.A. (1988) Trends Biochem. Sci. 13, 291-297). La modulación de actividad enzimática, en particular una tasa de mejoramiento u optimización para un subconjunto de sustratos, es un problema mucho más complejo. EP 0260105 indica la construcción de los mutantes de subtilisina BPN con relaciones alteradas de tasa de transesterificación/tasa de hidrólisis y especificidad del nucleófilo mediante el cambio de residuos de aminoácido específicos dentro de 15 A de la tríada catalítica. Russell, A.J., and Fersht, A.R. (1987) J. Mol. Biol. 193: 803-813, indica el aislamiento de un mutante de subtilisina BPN (D099S) que tuvo un cambio en la carga de la superficie 14 a 15\ring{A} a partir del sitio activo. Esta sustitución causa un efecto en la dependencia de pH de la reacción catalítica de la subtilisina. Ninguna de estas publicaciones indica como predecir las alteraciones de aminoácido que mejorarán el desempeño del lavado de la proteasa. EP 0130756, EP 0247647, y US 4,760,025 indican un método de mutación de saturación dónde una o múltiples mutaciones se introducen en la subtilisina BPN' en los residuos de aminoácido (numeración de BPN') Asp32, Asn155, Tyr104, Met222, Gly166, His64, Ser221, Gly169, Glu156, Ser33, Phe189, Tyr217, y/o Ala152. Utilizando esta metodología, se obtienen las proteasas mutantes que muestran estabilidad oxidativa mejorada, especificidad del sustrato alterado, y/o actividad del pH alterada. Estas publicaciones también indican que las mutaciones dentro de la región del sitio activo de la proteasa son las más probables para influir la actividad. Sin embargo, ninguna EP0130756, EP 0247647, ni US 4,760,025 indican un método para predecir las alteraciones de aminoácido que mejorarán el desempeño del lavado de la proteasa.

La mayor parte de la información en la actividad catalítica de subtilisinas ha sido recolectada por el examen de la hidrólisis de sustratos de péptidos pequeños, bien definidos. Sin embargo, se conoce poco acerca de las interacciones con grandes sustratos de proteínas. Esto es especialmente cierto por el desempeño del lavado de proteasas donde el sustrato se une a una superficie del tejido y la catálisis tiene lugar en la presencia de compuestos de interferencia tales como lejía, tensoactivos, y constructores.

EP 0328229 indica el aislamiento y la caracterización de mutantes de subtilisina PB92 con propiedades mejoradas para aplicaciones de detergente de lavandería basados en resultados de prueba de lavado. Esto indica que las propiedades bioquímicas no son parámetros confiables para predecir el desempeño de la enzima en el lavado. Los métodos para la selección de mutaciones involucran la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos en la misma categoría (polar, no-polar, aromática, cargada, alifática, y neutra), la sustitución de aminoácidos polares aspargina y glutamina por aminoácidos cargados, y el incremento del carácter aniónico de la proteasa en los sitios no involucrados con el sitio activo. Ningún método para identificar que aminoácidos específicos deberían ser alterados se enseña. La aplicación de la patente WO 91/00345 (Novo-Nordisk) indica un método para mejorar el desempeño del lavado de una subtilisina por la modificación del punto isoeléctrico de subtilisina Carlsberg y subtilisina 309 para igualar el pH de la solución de lavado, dónde la enzima se considera que se utilizará. Sin embargo, dado que las subtilisinas altamente alcalinas tienen valores de pH cercanos al pH de los detergentes bajo las condiciones de lavado Europeas, esta metodología no ofrece ninguna ventaja evidente. WO 91/00345 también indica que los cambios en los aminoácidos mayores de 15 \ring{A} de la tríada catalítica pueden dar lugar a cambios en las propiedades cinéticas de la enzima. Un total de 116 aminoácidos diferentes, de un total de 269 aminoácidos presentes en la subtilisina 309 se siguieren como posibles sitios para la sustitución, adición o deleción para modificar la carga eléctrica neta de la enzima.

La aplicación de la patente WO 92/11357 (Novo-Nordisk) indica el aumento de la estabilidad del pH y mejora de la posibilidad de lavado de las subtilisinas por reducción de cargas dependientes del pH de la molécula. Esto significa la introducción de mutaciones a la constancia sustancial de la metodología de carga sobre un rango de pH. Preferiblemente, un cambio de carga neta casi de cero en el rango de pH de 7 a 11. La aplicación de la Patente Europea No. 0 57 049 A1 revela ciertas enzimas proteolíticas mutantes. Estas enzimas se dice que tienen al menos 70% de homología con la secuencia de aminoácido de la proteasa serina PB92 y difieren por al menos un aminoácido correspondiente a 99, 102, 116, 126, 127, 128, 130, 160, 203, 211, y 212 en la proteasa serina PB92. La proteasa mutante se prepara mediante el cultivo de una cepa huésped del microorganismo transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN y que codifica una proteasa mutante para producir la proteasa mutante diseñada.

Las proteasas hasta ahora propuestas para utilizar en detergentes y auxiliares de lavado se seleccionaron por la alta actividad proteolítica. A cuenta de su baja especificidad, por consiguiente, puede ocurrir daño de la fibra o destrucción de la fibra por la proteasa en particular en el evento de lavado repetido de los tejidos de fibras proteinogénicas, por ejemplo textiles de forma de hoja de seda o lana. Por otra parte, cualquier reducción en la actividad de la proteasa resulta en una pérdida de poder de limpieza notable para el usuario del detergente. Por consiguiente, un problema dirigido por la presente invención fue desarrollar detergentes que contienen proteasas que deberían mostrar actividad reducida sobre las fibras proteinogénicas, más particularmente lana, para sustancialmente la misma actividad de lavado. Otro problema dirigido por la presente invención fue desarrollar proteasas específicas del lodo que son proteasas que quitan manchas específicas sobre los tejidos tales como manchas de huevo y manchas de sangre y formulaciones de detergente que contienen dichas proteasas específicas del lodo.

Resumen de la invención

La proteasa de tipo salvaje de las cuales las proteasas mutantes de acuerdo con la invención se derivan es una proteasa alcalina Bacillus lentus (BLAP) obtenida a partir de la DSM 5483 que tiene 269 residuos de aminoácido, una masa molecular de 26,823 daltons y un punto isoeléctrico calculado de 9.7 sobre la base de valores pk estándar. El gen BLAP se obtuvo por el aislamiento del ADN cromosómico a partir de la cepa B. lentus DSM 5483, construyendo las sondas de ADN que tienen homología a la secuencia putativa de ADNs que codifican las regiones de la proteasa B. lentus, preparando bancos genómicos a partir del ADN cromosómico aislado y la selección de bibliotecas para el gen de interés por hibridación con las sondas.

Los mutantes de la proteasa B. lentus DSM 5483 con mejora en la estabilidad térmica y del agente tensoactivo ha sido descrita en la aplicación de la patente Serial No. 07/706,691 archivada el 29 de Mayo de 1991. En general las mutaciones descritas en esta invención se introducen en la BLAP de tipo salvaje con las siguientes reposiciones de aminoácido: S3T, V41, A188P, V193M, y V1991 (numeración de acuerdo con la secuencia BLAP).

La investigación se dirige hacia el enlace de la proteasa con el sustrato de la proteína molecular alta sobre el tejido reflejando la importancia de los aminoácidos cargados situados en la proximidad del sitio de enlace del sustrato. Se podría demostrar que la eliminación de residuos de aminoácido cargados positivamente o la introducción de residuos de aminoácido cargados negativamente en la región del bolsillo de unión del sustrato de la proteasa conduce hacia un mejor desempeño del lavado comparado con el tipo salvaje.

La presente invención también se relaciona con composiciones de detergentes para el lavado de tejidos compuestos de fibras proteinogénicas tales como lana sin causar daño a tales fibras. Los detergentes se comprenden de al menos un agente tensoactivo y una cantidad activa proteolíticamente de una proteasa que tiene un índice de actividad de queratinasa/caseinasa inferior de cerca de 0.80.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con composiciones de detergentes que son efectivos particularmente en la eliminación de manchas tales como manchas de sangre y huevo y especialmente combinaciones de tales manchas a partir de los tejidos. Los detergentes se comprenden de una combinación de proteasas que son variantes del Bacillus lentus DSM 5483 y al menos un agente tensoactivo.

Breve descripción de las figuras

Figura 3 muestra la secuencia de ADN para el fragmento AvaI/C laI a partir de la región N-terminal del gen alcalino ATCC 53926 de la proteasa discutido en el Ejemplo 2. El fragmento incluye el promotor putativo, sitio de enlace ribosómico, codón de iniciación, y la mayoría de la pre secuencia. El fragmento de 292 pares de base se flanquea por los sitios de restricción AvaI y ClaI en sus terminales 5' y 3', respectivamente.

Depósito de microorganismos

Bacillus licheniformis E312 con el plásmido pBC56M131 se deposita como ATCC 68614. Escherichia coli WK6 con el plásmido pMC13C se deposita como ATCC 68615. E. coli GM33 con el plásmido pCB13C se deposita como ATCC 68616. E. coli WK6 con el plásmido pMa5-8 se deposita como ATCC 68617. E. coli WK6 con pMc5-8 se deposita como ATCC 68618.

Descripción de las modalidades preferidas

Un aspecto de la presente invención se relaciona con una proteasa mutante con mejora del desempeño del lavado. El desempeño mejorado del lavado se obtuvo por la introducción de alteraciones de aminoácido dentro de una región del bolsillo de unión del sustrato de la enzima que resulta en una carga negativa aumentada. De acuerdo con la presente invención, esto se puede lograr por el incremento del número de residuos de aminoácidos cargados negativamente o la disminución del número de residuos de aminoácido cargados positivamente en la región del bolsillo de unión del sustrato de la proteasa dentro 7A de un enlace de la molécula sustrato tal como AAPF. En particular, alteraciones de aminoácido en las posiciones 99, 154 y 211 dentro de las variantes de la Proteasa Alcalina Bacillus lentus (BLAP) M130 y M131 se mostraron para potenciar el desempeño del lavado de la enzima.

Un segundo aspecto de la presente invención se relaciona con las enzimas proteolíticas mutantes que tienen una mejora del desempeño del lavado relativa a la proteasa de tipo salvaje como se determina por pruebas de laboratorio. Las mutaciones descritas en esta invención se introducen en las variantes de BLAP M130 o M131 que han sido previamente descritas en la aplicación de la patente Serial No. 07/706,691 archivada el 29 de Mayo, 1991. Ambas M130 y M131 se ha demostrado que han mejorado la estabilidad en comparación con la proteasa de tipo salvaje. El mutante M130 contiene cuatro alteraciones de aminoácido: S3T; A188P/ V193M y V1991. El mutante M131 contiene cinco alteraciones de aminoácido: S37; V41; A188P; V193M y V1991. El sistema utilizado para designar la primera lista de las proteasas preferidas del residuo de aminoácido en la forma madura de BLAP en la posición numerada seguido por la reposición del aminoácido utilizando la letra aceptada del aminoácido codificado. Las secuencias de aminoácidos para las proteasas M130 y M131 se dan en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 1, respectivamente, contenidas en la aplicación de la patente Serie No. 07/706,691 archivada el 29 de Mayo, 1991. Ambas M130 y M131 sirvieron como la base para las alteraciones adicionales de aminoácido para lograr las proteasas con desempeño mejorado de lavado. Las proteasas mutantes de acuerdo con la invención se caracterizan por al menos una alteración de aminoácido que resulta en una carga positiva reducida o una carga negativa aumentada en la región del bolsillo de unión del sustrato, en donde dicha alteración de aminoácido es L211D de acuerdo con la numeración de la SEQ ID No. 22. En otra modalidad, las proteasas mutantes son aquellas derivadas por la reposición de al menos un residuo de aminoácido de las proteasas mutantes M130 o M131 en donde dicho residuo de aminoácido se selecciona del grupo que consiste de arginina en la posición 99 o serina en la posición 154 en adición a la leucina en la posición 211. La Tabla 2 proporciona una descripción de las proteasas mutantes BLAP que incluyen F11, F43, F44, F45, F46, F47, F49, F54 y F55. Por ejemplo F11 mostró en la Tabla 2 se deriva de M130 y contiene una arginina en la posición 99 reemplazada por una serina (R99S) junto con las otras mutaciones presentes en M130 que incluyen: una serina en la posición 3 reemplazada por una treonina (S3T); una alanina en la posición 188 reemplazada por una prolina (A188P); una valina en la posición 193 reemplazada por una metionina (V193M) y una valina en la posición 199 reemplazada por una isoleucina (V1991). De las proteasas mutantes restantes, F43 a través de F49 se derivan de M131. Los mutantes F54 y F55 se derivan a partir del mutante F49. Las secuencias de aminoácidos de las enzimas proteolíticas preferidas F11, F43, F44,
F45, F46, F47, F49, F54 y F55 se dan en la SEQ ID NO:10 a la SEQ ID NO:18, respectivamente, de esta aplicación.

Otro aspecto de esta invención se relaciona con los genes que codifican las proteasas mutantes. La construcción genética de todas las proteasas mutantes en esta invención se describen con detalle en el Ejemplo 2. En todos los casos las mutaciones que introducen las alteraciones de aminoácido se construyen utilizando procedimientos conocidos. Las secuencias de ADN que codifica las formas maduras de las proteasas referidas F11, F43, F44, F45, F46, F47, F49, F54 y F55. Cada gen híbrido que codifica una de las proteasas mutantes enumeradas arriba se abarca en la dirección de la transcripción, un promotor, un sitio de enlace ribosómico, y codón de iniciación y la principal porción de la pre región del gen alcalino del B. licheniformis ATCC 53926 de la proteasa, ligado operablemente a una porción de la pre región y toda la pro región y caracterizada por al menos una alteración de aminoácido que resulta en una carga positiva reducida o una carga negativa aumentada en la región del bolsillo de unión del sustrato, en donde dicha alteración de aminoácido es L211D de acuerdo con la numeración de la SEQ ID No. 22. En otra modalidad, las proteasas mutantes son regiones maduras de una variante del gen BLAP seguido por la transcripción de la secuencia de terminación por el gen alcalino de la proteasa a partir de ATCC 53926. El gen híbrido se puede integrar en el cromosoma del huésped o se realiza en un plásmido que replica dentro de la cepa Bacillus de elección. En particular, el plásmido pUB110 o un derivado de pUB110 es el plásmido de elección para la producción de la proteasa en cepas del Bacillus subtilis y el plásmido pBC16 o un derivado de pBC16 es la elección para la producción de la proteasa en cepas de B. licheniformis. Las proteasas mutantes se producen mediante el cultivo las cepas de Bacillus transformadas por plásmidos que contienen los genes híbridos en un medio apropiado.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con composiciones de detergentes que contienen al menos un agente tensoactivo y una cantidad activa proteolíticamente de una proteasa que tiene un índice de actividad queratinasa/caseinasa (a partir de ahora se refiere como al índice KC) inferior de cerca de 0.80, preferiblemente menor de aproximadamente 0.70 y más preferiblemente en el rango de cerca de 0.2 a aproximadamente 0.65.

El detergente preferiblemente tiene una actividad proteolítica en el rango de cerca de 100 PU/g a alrededor de 7500 PU/g.

La presente invención también se relaciona con el uso de proteasas con un índice KC inferior de cerca de 0.80, preferiblemente menor de aproximadamente 0.70 y más preferiblemente en el rango de cerca de 0.2 a aproximadamente 0.65 para el lavado de textiles de fibras proteinogénicas o textiles que consisten al menos en parte de fibras proteinogénicas.

El índice KC incluye la actividad de la proteasa con respecto a dos sustratos diferentes, caseína y queratina.

La actividad proteolítica de una solución de la proteasa que, en el caso de caseína como sustrato, produce una absorción de 0.500 OD bajo las condiciones de medición descritas, se define como 10 PU (unidades de proteasa) por ml. Los resultados de limpieza observados por el usuario de un detergente que contiene la proteasa, se correlacionan con esta actividad expresada en PU. El daño observado a un tejido de fibras proteinogénicas, se correlaciona con el índice KC para un resultado de limpieza constante.

Como era de esperar, a la luz del problema indicado anteriormente, sólo una mínima diferencia en las actividades hacia la caseína y queratina se observó en el caso de las proteasas comerciales, el índice KC que es relativamente cercano a 1. Se encontró que las proteasas con índices de KC inferiores del 0.80 tienen que ser utilizados para lograr un grado significantemente notable no mayor del daño para un tejido proteinogénico.

Se ha encontrado sorprendentemente que las proteasas que tienen las propiedades mencionadas arriba pueden influir sinérgicamente en el efecto de ciertos otros ingredientes del detergente y que, inversamente, la actividad proteolítica de la proteasa se puede mejorar sinergísticamente mediante ciertos otros ingredientes del detergente. Estos efectos ocurren en particular en el caso dónde el componente del agente tensoactivo de las composiciones de acuerdo con la invención, contienen agentes tensoactivos no-iónicos, copoliesteres de liberación del lodo (más particularmente aquellos que contienen unidades de ácido tereftálico), constructores orgánicos insolubles en agua, constructores orgánicos e inorgánicos solubles en agua (más particularmente sobre la base de carbohidratos oxidados) y agentes tensoactivos aniónicos sintéticos del tipo sulfato y sulfonato, pero no muy fuerte -si de algún modo- en el caso de alquilbencenosulfonatos. Los detergentes de acuerdo con la invención preferiblemente contienen ingredientes de las propiedades se mejoran o que resaltan las propiedades de la proteasa.

Las proteasas apropiadas para utilizar de acuerdo con la invención incluyen variantes diseñadas genéticamente del Bacillus lentus DSM 5483. Estas variantes se pueden preparar de acuerdo con el método publicado en la aplicación de la patente US serial número 08/201,120 archivada el 02/24/94 y en la patente US número 5,340,735. Las variantes preferidas del Bacillus lentus DSM 5483 (BLAP) se enumeran en la Tabla 2 en el Ejemplo 2.

En referencia a la Tabla 2, el sistema utilizado para identificar las variantes, es el mismo que se utiliza en la patente US número 5,340,735 y se explica en esta. Por ejemplo, el mutante F49 se identifica como S3T + V41 + A188P + V 193M + V199I + L211D. Dicha proteasa es una variante del mutante Bacillus lentus DSM 5483 en donde el residuo de serina en la posición 3 se reemplaza por la treonina, el residuo de valina en la posición 4 se reemplaza por la isoleucina, el residuo de alanina en la posición 188 se reemplaza por la prolina, el residuo de valina en la posición 193 se reemplaza por la metionina, el residuo de valina en la posición 199 se reemplaza por la isoleucina, y el residuo de leucina en la posición 211 se reemplaza por el ácido aspártico. La secuencia de aminoácido de la proteasa BLAP de tipo salvaje se publica como una secuencia ID número 52 en la patente US número 5,340,735.

Se ha encontrado que algunas variantes del Bacillus lentus DSM 5483 mostraron actividad preferencial hacia las manchas de sangre mientras otros mostraron actividad preferencial hacia las manchas de huevo. Los mutantes que son efectivos particularmente para eliminar las manchas de sangre y huevo a partir de los tejidos son aquellos mutantes hechos, haciendo las siguientes reposiciones en la proteína de tipo salvaje Bacillus lentus DSM 5483: R99G, R99A, R99S, S154D, S154E, L221D. Los mutantes que tienen reposición de residuos de aminoácido en las posiciones 99 y 154 son efectivos particularmente para eliminar manchas de sangre. Los mutantes que tienen reposición de residuos de aminoácido en la posición 211 son efectivos particularmente para eliminar manchas de huevo. Se ha encontrado que una combinación de enzimas mutantes que tienen reposición de los residuos de aminoácido en las posiciones 99 y 154 y aquellos que tienen reposición de residuos de aminoácido en la posición 211 son efectivos particularmente para eliminar una combinación de manchas de sangre y huevo.

Por consiguiente otro aspecto de la presente invención se relaciona con las composiciones de detergentes que son efectivos particularmente para eliminar combinaciones de manchas tales como manchas de sangre y huevo de los tejidos. Los detergentes se comprenden de una combinación de proteasas que son variantes DSM 5483 del Bacillus lentus y un agente tensoactivo no-iónico, un agente tensoactivo aniónico, un jabón, o una combinación de tales agentes tensoactivos. Las combinaciones de proteasa incluyen de dos o más de las variantes DSM 5483 del Bacillus lentus enumeradas en la Tabla anterior. Una combinación preferida particularmente es F46 + F49 para eliminar las manchas que consisten de manchas de sangre y de huevo.

En una modalidad preferida, un detergente de acuerdo con la invención contiene agentes tensoactivos no-iónicos seleccionados de poliglicósidos de alquilo grasos, polialcoxilatos de alquilo grasos, más particularmente etoxilatos y/o propoxilatos, polihidroxiamidas de ácidos grasos y/o productos de etoxilación y/o propoxilación de alquilaminas grasas, dioles vicinales, ésteres de alquilo de ácidos grasos y/o aminas de ácido graso y mezclas de estos, más particularmente en una cantidad del 2% en peso a 25% en peso.

En otra modalidad preferida, un detergente de acuerdo con la invención contiene un agente tensoactivo aniónico sintético del tipo sulfato y/o sulfonato, más particularmente alquilsulfato graso, alquiletersulfato graso, ésteres de ácido sulfograso y/o disal de ácido sulfograsos, más particularmente en una cantidad del 2% en peso a 25% en peso. El agente tensoactivo aniónico preferiblemente se selecciona del alquilo o alquenilsulfatos y/o el alquilo o alqueniletersulfatos en el grupo alquilo o alquenilo que contiene 8 a 22 átomos de carbono y, más particularmente, 12 a 18 átomos de carbono.

En otra modalidad preferida, un detergente de acuerdo con la invención contiene constructores solubles en agua y/o insolubles en agua, más particularmente seleccionados de aluminosilicato de metal alcalino, silicato de metal alcalino cristalino con un módulo de > 1, policarboxilato monomérico, policarboxilato polimérico y mezclas de estos, más particularmente en cantidades de 2.5% en peso a 60% en peso.

Otra, aunque menos preferida, modalidad de un detergente de acuerdo con la invención pretendida para el lavado de tejidos de lana o seda pueden contener agentes blanqueadores basados en peroxígeno, más particularmente peróxido de hidrógeno, perborato tetrahidrato de metal alcalino, perborato monohidrato de metal alcalino y/o percarbonato de metal alcalino, más particularmente en cantidades de 5% en peso a 70% en peso, y opcionalmente activadores de blanqueo, más particularmente en cantidades de 2% en peso a 10% en peso.

Finalmente, otra modalidad de un detergente de acuerdo con la invención contiene agentes liberadores de lodo sobre la base de copoliesteres de ácidos dicarboxílicos y glicoles que pueden estar presentes en particular en cantidades de 0.01 % en peso a 5% en peso. Estos agentes liberadores de lodo, que son efectivos particularmente en virtud de su similitud química a las fibras de poliester, sino que también son capaces de desarrollar el efecto necesario en tejidos de otros materiales son copoliesteres que contienen unidades de ácido dicarboxílico, unidades de alquilenglicol y unidades de polialquilenglicol. Los copoliésteres que liberan el lodo del tipo mencionado y su uso en detergentes se han conocido durante algún tiempo.

Las composiciones de detergentes de acuerdo con la invención contienen al menos un agente tensoactivo que incluye jabones. Los agentes tensoactivos pueden ser agentes tensoactivos noiónicos o aniónicos o una combinación de agentes tensoactivos noiónicos o aniónicos o una combinación de agentes tensoactivos noiónicos o aniónicos y uno o más jabones.

Apropiados agentes tensoactivos no-iónicos incluyen los alcoxilatos, más particularmente etoxilatos y/o propoxilatos, de alcoholes lineales o ramificados saturados o mono- a poli-insaturados que contienen de 10 a 22 átomos de carbono y preferiblemente 12 a 18 átomos de carbono. El grado de alcoxilación de los alcoholes es por lo general entre 1 y 20 y preferiblemente entre 3 y 10. Se pueden obtener de manera conocida, mediante la reacción de los alcoholes correspondientes con los óxidos de alquileno correspondientes. Los derivados de los alcoholes grasos particularmente son apropiados, aunque sus isómeros de cadena ramificada, más particularmente así llamados oxoalcoholes, también se pueden utilizar para la producción de alcoxilatos útiles. Por consiguiente, los alcoxilatos, más particularmente etoxilatos, de alcoholes primarios que contienen grupos lineales, más particularmente grupos dodecil, tetradecil, hexadecil u octadecil, y mezclas de estos se pueden utilizar. Además, los productos de alcoxilación correspondientes de alquilaminas, dioles vicinales y amidas de ácido carboxílico correspondiente a los alcoholes mencionados anteriormente en lo que respecta a la fracción alquilo también son apropiados. Los poliglicosidos de alquilo apropiados para la incorporación en los detergentes de acuerdo con la invención son compuestos correspondientes a la fórmula general
(G)_{n}-OR^{1}, dónde R^{1} es un radical alquilo o alquenilo que contiene de 8 a 22 átomos de carbono, G es una unidad de glicosa y n es un número de 1 a 10. El componente glucósido (G)_{n} es un oligómero o polímero de monómeros aldosa o cetosa de origen natural, incluyendo en particular glucosa, manosa, fructosa, galactosa, talosa, gulosa, altrosa, alosa, idosa, ribosa, arabinosa, xilosa y lixosa. Los oligómeros que consisten de dichos monómeros unidos al glucósido se caracterizan no sólo por el tipo de azúcares presentes en ellos, sino también por su número, el así llamado grado de oligomerización. Como una cantidad determinada analíticamente, el grado de oligomerización n es por lo general un número fraccionado que puede asumir un valor de 1 a 10 y, en el caso de los glucósidos preferiblemente utilizando, un valor inferior de 1.5 y, más particularmente, entre 1.2 y 1.4. La glucosa es la unidad de monómero preferido en virtud de su disponibilidad al alcance. El sustituyente alquilo o alquenilo R^{1} de los glucósidos también preferiblemente desprendidos de los derivados asequibles fácilmente de materias primas renovables, más particularmente a partir de alcoholes grasos, aunque los isómeros de cadena ramificada de estos, más particularmente los así llamados oxoalcoholes, también se pueden utilizar para la producción de glucósidos útiles. Por consiguiente, los alcoholes primarios con grupos lineales octil, decil, dodecil, tetradecil, hexadecil u octadecil y mezclas de estos, son apropiados particularmente. Los glucósidos de alquilo preferidos particularmente contienen un grupo alquilo grasa de coco, i.e. mezclas en las cuales - esencialmente - R^{1} es dodecil y R^{1} es tetradecil.

El agente tensoactivo no-iónico preferiblemente esta presente en los detergentes de acuerdo con la invención en cantidades de 1% en peso a 30% en peso y más preferiblemente en cantidades de 1% en peso a 25% en peso.

Además de o en lugar del agente tensoactivo no-iónico, los detergentes de acuerdo con la invención pueden contener otros agentes tensoactivos, preferiblemente agentes tensoactivos aniónicos sintéticos del tipo sulfato o sulfonato, en cantidades de preferiblemente no más del 20% en peso y, más preferiblemente, en cantidades de 0.1% en peso a 18% en peso, sobre la base del detergente como un todo. Los agentes tensoactivos aniónicos particularmente apropiados para utilizar en los detergentes de acuerdo con la invención son los alquilo y/o alquenilsulfatos que contienen de 8 a 22 átomos de carbono que contienen un metal alcalino, ion amonio o alquilo- o hidroxialquilo-sustituido amonio como contraion. Los derivados de alcoholes grasos que contienen de 12 a 18 átomos de carbono y análogos de cadena ramificada de estos, los así llamados oxoalcoholes, se prefieren. El alquilo y los alquenilsulfatos se pueden preparar de manera conocida por reacción del componente de alcohol correspondiente con un agente de sulfatación típico, más particularmente trióxido de azufre o ácido clorosulfónico, y la posterior neutralización con bases de metal alcalino, amonio o alquilo- o amonio hidroxialquilo-sustituido. Alquilo y/o alquenilsulfatos tales como estos, preferiblemente se presentan en los detergentes de acuerdo con la invención en cantidades de 0.1% en peso a 20% en peso y más preferiblemente en cantidades de 0.5% en peso a 18% en peso.

Los agentes tensoactivos apropiados del tipo sulfato también incluyen los productos sulfatados de alcoxilación de los alcoholes mencionados, los así llamados éter sulfatos. Estos éteres sulfatos preferiblemente contienen de 2 a 30 y, más particularmente, 4 a 10 grupos de etilen glicol por molécula. Los agentes tensoactivos aniónicos apropiados del tipo sulfonato incluyen los \alpha-sulfoesteres obtenibles por la reacción de ésteres de ácido graso con trióxido de azufre y la posterior neutralización, más particularmente los productos de sulfonación derivados de ácidos grasos C_{8-22} y preferiblemente C_{12-18} y C_{1-6} y preferiblemente alcoholes lineales C_{1-4}, y los ácidos sulfograsos que se desprenden de estos productos de sulfonación a través de una saponificación formal.

Otros ingredientes opcionales de superficie-activa incluyen jabones; los jabones apropiados que son jabones de ácido graso saturado, tales como las sales de ácido laurico, ácido mirístico, ácido palmítico o ácido esteárico, y jabones derivados de mezclas de ácido graso natural, por ejemplo aceite de coco, aceite de grano de palma o ácidos grasos de grasa de animal. Las mezclas de jabones de las cuales el 50% en peso a 100% en peso consisten de jabones de ácido graso saturado C_{12-18} y hasta 50% en peso de jabón de ácido oleico particularmente se prefieren. Preferiblemente el jabón esta presente en cantidades de 0.1% en peso a 5% en peso. Sin embargo, grandes cantidades de jabón de hasta 20% en peso pueden estar presentes en particular en detergentes líquidos.

Un detergente de acuerdo con la invención preferiblemente contiene 20% en peso a 55% en peso de constructores orgánicos y/o inorgánicos, solubles en agua y/o insoluble en agua. Los constructores orgánicos solubles en agua incluyen, en particular, aquellos de la clase de ácidos policarboxílicos, más particularmente ácido cítrico y ácidos de azúcar, y la clase de ácidos (poli)carboxílicos poliméricos, más particularmente los policarboxilatos obtenibles por oxidación de polisacáridos, ácidos acrílicos poliméricos, ácidos metacrílicos, ácidos maleicos y copolímeros de estos que aún pueden contener pequeñas cantidades de sustancias polimerizables con ningún ácido carboxílico funcional en la forma copolimerizada. El peso molecular relativo de los homopolímeros de ácidos carboxílicos insaturados es por lo general en el rango de 5,000 a 200,000 mientras que el peso molecular relativo de los copolímeros es en el rango de 2,000 a 200,000 y preferiblemente en el rango de 50,000 a 120,000, sobre la base de ácido libre. Un particularmente preferido copolímero ácido acrílico/ácido maléico tiene un peso molecular relativo de 50,000 a 100,000. Los compuestos apropiados, pero menos preferidos de esta clase son los copolímeros de ácido acrílico o ácido metacrílico con ésteres de vinilo, tales como ésteres de vinilmetil, ésteres de vinilo, etileno, propileno y estireno, en los que el ácido constituye al menos 50% en peso. Otros constructores orgánicos apropiados solubles en agua son terpolímeros que contienen dos ácidos carboxílicos y/o sales de estos como monómeros y vinil alcohol y/o un derivado de vinil alcohol o un carbohidrato como el tercer monómero. El primer monómero ácido o su sal derivada de un ácido carboxílico C_{3-8} monoetilenicamente insaturado y preferiblemente de un ácido monocarboxílico C_{3-4}, más particularmente de ácido (met)acrílico. El segundo monómero ácido o su sal puede ser un derivado de un ácido dicarboxílico C_{4-8}, preferiblemente un ácido dicarboxílico C_{4-8}, siendo preferido particularmente el ácido maléico. En este caso, la tercera unidad de monómero se forma por un vinil alcohol y/o preferiblemente por un vinil alcohol esterificado. Los derivados del vinil alcohol en la forma de un éster de ácidos carboxílicos de cadena corta, preferiblemente ácidos carboxílicos C_{1-4}, con vinil alcohol se prefieren particularmente. Los terpolímeros preferidos contienen 60% en peso a 95% en peso y, más particularmente, 70% en peso a 90% en peso de ácido (met) acrílico o (met)acrilato, más preferiblemente ácido acrílico o acrilato, y ácido maléico o maleato y 5% en peso a 40% en peso y preferiblemente 10% en peso a 30% en peso de vinil alcohol y/o vinil acetato. Los terpolímeros en los que la relación en peso del ácido (met) acrílico o (met)acrilato con el ácido maléico o maleato es entre 1:1 y 4:1, preferiblemente entre 2:1 y 3:1 y más preferiblemente entre 2:1 y 2.5:1 se prefieren más particularmente (ambas las cantidades y las relaciones en peso que son sobre la base de los ácidos). El segundo monómero ácido o su sal incluso puede ser un derivado de un ácido alil sulfónico sustituido en la posición-2 por un radical alquilo, preferiblemente por un radical alquilo C_{1-4}, o por un radical aromático preferiblemente derivado del benceno o derivados del benceno. Los terpolímeros preferidos contienen 40% en peso a 60% en peso y más particularmente 45% en peso a 55% en peso de ácido (met) acrílico o (met)acrilato, más preferiblemente ácido acrílico o acrilato, 10% en peso a 30% en peso y preferiblemente 15% en peso a 25% en peso de ácido metalil sulfónico o metalil sulfonato y, como el tercer monómero, 15% en peso a 40% en peso y preferiblemente 20% en peso a 40% en peso de un carbohidrato. Este carbohidrato puede ser, por ejemplo, un mono-, di-, oligo- o polisacárido, siendo preferidos los mono-, di- o oligosacáridos, siendo particularmente preferida la sacarosa. Los puntos de debilidad responsables de la biodegradabilidad del polímero probablemente se incorporan en esta, a través del uso del tercer monómero. Estos terpolímeros por lo general tienen un peso molecular relativo en el rango de 1,000 a 200,000, preferiblemente en el rango de 200 a 50,000 y más preferiblemente en el rango de 3,000 a 10,000. Se pueden utilizar en la forma de soluciones acuosas, preferiblemente 30 a 50% en peso de soluciones acuosas, particularmente para la producción de detergentes líquidos. Todos los ácidos policarboxílicos mencionados son por lo general utilizados en las formas de sus sales solubles en agua, más particularmente sus sales de metal alcalino.

Los constructores orgánicos del tipo en cuestión preferiblemente se presentan en cantidades de hasta 40% en peso, más preferiblemente en cantidades de hasta 25% en peso y más preferiblemente en cantidades de 1% en peso a 5% en peso. Las cantidades cercanas al límite superior mencionado son preferiblemente utilizadas en forma de pasta o líquido, más particularmente detergentes, que contienen agua de acuerdo con la invención.

Los alumosilicatos de metal alcalino cristalinos o amorfos en particular se utilizan como los constructores inorgánicos insolubles en agua, dispersables en agua en cantidades de hasta 50% en peso y preferiblemente en cantidades de no más del 40% en peso y, en detergentes líquidos, en cantidades del 1% en peso a 5% en peso. Entre estos alumosilicatos, alumosilicatos de sodio cristalinos en calidad de detergente, más particularmente se prefieren, zeolite A, P y opcionalmente X. Las cantidades cercanas al límite superior mencionado preferiblemente se utilizan en detergentes particulados sólidos. Los alumosilicatos apropiados no contienen partículas mayores de 30 \mum en tamaño, al menos 80% en peso que consiste de partículas debajo de 10 \mum en tamaño. Su capacidad de enlace de calcio es por lo general en el rango de 100 a 200 mg de CaO por gramo.

Los sustituyentes o sustituyentes parciales apropiados para el alumosilicato mencionado son silicatos cristalinos de metal alcalino que pueden estar presentes ya sea por cuenta propia o en mezcla con silicatos amorfos. Los silicatos de metal alcalino apropiados para utilizar como constructores en los detergentes de acuerdo con la invención preferiblemente tienen una relación molar de óxido de metal alcalino con el SiO_{2} inferior del 0.95 y, más particularmente, en el rango de 1:1.1 a 1:12 y pueden estar presentes en forma amorfa o cristalina. Los silicatos de metal alcalino preferidos son los silicatos de sodio, más particularmente silicatos de sodio amorfos, con una relación molar de Na_{2}O con SiO_{2} de 1:2 a 1:2.8. Los silicatos de metal alcalino amorfos tales como estos son comercialmente disponibles, por ejemplo, como PORTIL®. Aquellos con una relación molar de Na_{2}O con SiO_{2} de 1:1.9 a 1:2.8 preferiblemente se utilizan en forma sólida y no en la forma de una solución en la producción de detergentes de acuerdo con la invención. Los silicatos cristalinos preferidos, que pueden estar presentes ya sea por cuenta propia o en mezcla con silicatos amorfos, son silicatos de capa cristalinos con la fórmula general Na_{2}Si_{x}O_{2x+1}\cdotyH_{2}O, en la que x -los así llamados módulos- es un número de 1.9 a 4 y y es un número de 0 a 20, siendo los valores preferidos para x 2, 3 o 4. Los silicatos de capa cristalinos preferidos son aquellos en los cuales x en la fórmula general asume el valor 2 o 3. Ambos \beta- y \delta-disilicatos de sodio (Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O) particularmente se prefieren. Los \delta-silicatos de sodio con un módulo de 1.9 a 3.2 se prefieren. Sustancialmente silicatos cristalinos libres de agua de metal alcalino correspondiente a la anterior fórmula general, en la que x es un número de 1.9 a 2.1 también se pueden utilizar en detergentes de acuerdo con la invención. Otra modalidad preferida de detergentes de acuerdo con la invención son silicatos cristalinos de capa de sodio que tienen un módulo de 2 a 3. Los silicatos cristalinos de sodio con un módulo de 1.9 a 3.5 se utilizan en otra modalidad preferida de detergentes de acuerdo con la invención. El contenido del silicato de metal alcalino de los detergentes de acuerdo con la invención es preferiblemente 1% en peso a 50% en peso y más preferiblemente 5% en peso a 35% en peso, sobre la base de la sustancia activa anhidra. Si un aluminosilicato de metal alcalino, más particularmente zeolite, también esta presente como un constructor adicional, el contenido del silicato de metal alcalino es preferiblemente 1% en peso a 15% en peso y más preferiblemente 2% en peso a 8% en peso, sobre la base de sustancia activa anhidra. En ese caso, la relación en peso de alumosilicato con el silicato, sobre la base de sustancias activas anhidras, es preferiblemente 4:1 a 10:1. En detergentes que contienen silicatos tanto amorfos como cristalinos de metal alcalino, la relación en peso de silicatos amorfos de metal alcalino con silicatos cristalinos de metal alcalino es preferiblemente 1:2 a 2:1 y más preferiblemente 1:1 a 2:1.

Además del constructor inorgánico mencionado, otras sustancias inorgánicas solubles en agua o insolubles en agua se pueden utilizar en los detergentes de acuerdo con la invención. Los carbonatos de metal alcalino, hidrógenocarbonatos de metal alcalino y sulfatos de metal alcalino y mezclas de estos son apropiados a este respecto. El material inorgánico adicional puede estar presente en cantidades de hasta 70% en peso, pero esta ausente por completo de preferencia.

Para ajustar opcionalmente un valor de pH ácido o suavemente alcalino, en particular, cerca de 8.0 a 9.5 en una solución acuosa del 1% en peso, los detergentes de acuerdo con la invención pueden contener ácidos sólidos inorgánicos y/o orgánicos o sales de ácidos, por ejemplo hidrógeno sulfatos de metal alcalino, ácido succínico, ácido adípico o ácido glutárico y mezclas de estos. Las sustancias ácidas tales como estos preferiblemente se presentan en los detergentes de acuerdo con la invención en cantidades de no más del 5% en peso y, más particularmente, en cantidades del 0.1% en peso a 3% en peso.

Los detergentes de acuerdo con la invención adicionalmente pueden contener otros ingredientes típicos de detergentes. Estos ingredientes opcionales incluyen, en particular, agentes complejantes de metales pesados, por ejemplo ácidos aminopolicarboxílicos, ácidos aminohidroxipolicarboxílicos, ácidos polifosfónicos y/o ácidos aminopolifosfónicos, inhibidores de redeposición, por ejemplo ésteres de celulosa, inhibidores de transferencia de coloración, por ejemplo polivinil pirrolidonas, inhibidores de espuma, por ejemplo organopolisiloxanos o parafinas, solventes y abrillantadores ópticos, por ejemplo derivados de ácido disulfónico estilbeno. Los detergentes de acuerdo con la invención preferiblemente contienen hasta 1% en peso y, más particularmente, 0.01% en peso a 0.5% en peso de abrillantadores ópticos, más particularmente compuestos de la clase de ácidos 4,4'-bis-(2,4,6-triaminos-triazinil)-estilbeno-2,2'-disulfónicos sustituidos, hasta 5% en peso y, más particularmente, 0.1% en peso a 2% en peso de agentes acomplejantes para metales pesados, más particularmente ácidos aminoalquilen fosfónicos y sales de estos, hasta 3% en peso y, más particularmente, 0.5% en peso a 2% en peso de inhibidores de deposición y hasta 2% en peso y, más particularmente, 0.1% en peso a 1% en peso de inhibidores de espuma, los porcentajes en peso mencionados se base en el detergente como un todo.

Además de agua, los solventes que se utilizan en particular en detergentes líquidos de acuerdo con la invención son preferiblemente solventes miscibles en agua, incluyendo-alcoholes inferiores, por ejemplo etanol, propanol, isopropanol butanoles isoméricos, glicerol, glicoles inferiores, por ejemplo etileno y propilenglicol, y los ésteres derivados de las clases de compuestos mencionados.

Los estabilizadores de enzimas típicos opcionalmente presentes, más particularmente en detergentes líquidos de acuerdo con la invención, incluyen aminoalcoholes, por ejemplo mono-, di-, trietanolamina y propanolamina y mezclas de estos, los ácidos carboxílicos inferiores, ácido bórico o boratos de metal alcalino, y combinaciones de ácido bórico/ácido carboxílico.

Los inhibidores de espuma apropiados incluyen jabones de cadena larga, más particularmente jabón behénico, aminas de ácido graso, parafinas, ceras, ceras microcristalinas, organopolisiloxanos y mezclas de estos que, además, pueden contener microfina, opcionalmente silanizados o por otra parte silica hidrofobizada. Para utilizar en detergentes particulados de acuerdo con la invención, inhibidores de espuma tales como estos preferiblemente se depositan sobre soportes granulares solubles en agua.

Además, el detergente de acuerdo con la invención puede contener inhibidores de redeposición. La función de inhibidores de redeposición es mantener el lodo aislado de las fibras suspendidas en el licor y de esta manera prevenir la decoloración de las fibras. Los inhibidores de redeposición apropiados son coloides orgánicos soluble en agua, por lo general, por ejemplo las sales solubles en agua de ácidos carboxílicos poliméricos, goma, gelatina, sales de ácidos carboxílicos éter o ácidos éter sulfónicos o almidón o celulosa o sales de ésteres de ácido sulfúrico ácido de celulosa o almidón. Las poliamidas solubles en agua que contienen grupos ácidos también son apropiadas para este propósito. Las preparaciones solubles en almidón y otros productos de almidón de aquellos mencionados arriba, por ejemplo en parte almidón hidrolizado, también se pueden utilizar. Preferiblemente se utilizan, sodio carboximetilcelulosa, metil celulosa, metil hidroxietil celulosa y mezclas de estos.

Los agentes blanqueadores que se pueden utilizar como otros ingredientes de detergentes de acuerdo con la invención son por lo general los compuestos utilizados en detergentes, tales como perborato, que puede estar presente como tetrahidrato o monohidrato, percarbonato, perpirofosfato y persilicato que por lo general se presentan en la forma de sales de metal alcalino, más particularmente sales de sodio. Los agentes blanqueadores tales como estos preferiblemente se presentan en detergentes de acuerdo con la invención en cantidades de hasta 25% en peso, más preferiblemente en cantidades de hasta 15% en peso y más preferiblemente en cantidades de 5% en peso a 15% en peso, sobre la base del detergente como un todo.

Los activadores de blanqueo presentes como un componente opcional incluyen los compuestos N-acil u O-acil usualmente utilizados, por ejemplo alquilendiaminas poliaciladas, más particularmente tetraacetil etilendiamina, glicoluriles acilados, más particularmente tetraacetil glicoluril, hidantoinas N-aciladas, hidrazidas, triazoles, urazoles, diquetopiperazinas, sulfurilamidas y cianuratos, también anhídridos carboxílicos, más particularmente anhídrido ftálico, ésteres de ácido carboxílico, más particularmente fenol sulfonato isononanoil de sodio, y derivados de azúcar acilados, más particularmente pentaacetil glucosa. Para evitar la interacción con los compuestos durante el almacenamiento, los activadores de blanqueo pueden haber sido recubiertos con sustancias que forman cáscaras o granulados de manera conocida, tetraacetil etilendiamina granulada con carboximetilcelulosa con tamaños de partícula medios de 0.01 mm a 0.8 mm, y/o 1,5-diacetil-2,4-dioxohexahidro-1,3,5-triazina granulada, siendo preferida particularmente. Los activadores de blanqueo preferiblemente se presentan en detergentes de acuerdo con la invención en cantidades de hasta 8%
en peso y más particularmente en cantidades de 2% en peso a 6% en peso, sobre la base del detergente como un todo.

Las enzimas opcionalmente presentes además de la proteasa incluyen, en particular, enzimas de la clase de lipasas, cutinasas, amilasas, celulasas, pululanasas, oxidasas y peroxidasas y mezclas de estas. Preferiblemente se utilizan, las enzimas obtenidas de cepas de hongos o bacterias.

Las amilasas apropiadas para utilizar en detergentes de acuerdo con la invención incluyen las enzimas obtenibles de bacterias u hongos que tienen un pH óptimo preferiblemente en el rango alcalino hasta cerca de pH 10. Los productos comerciales útiles son, por ejemplo, TERMAMYL® y MAXAMYL®. La amilasa preferiblemente se utiliza en el detergente de acuerdo con la invención en tales cantidades que el detergente final contiene 0.01 KNU/g a 2 KNU/g ("Unidades Kilo Novo" por gramo de acuerdo con el método estándar de la Novo Company, siendo 1 KNU la cantidad de enzima que degrada 5.26 kg de almidón a pH 5.6/37ºC como se determina por el método descrito por Methods in Enzymology, Vol. 1, 1955, page 149), preferiblemente 0.015 KNU/g a 1.8 KNU/g y más preferiblemente 0.03 KNU/g a 1.6 KNU/g.

La celulasa apropiada para utilizar de acuerdo con la invención también pertenece a las enzimas obtenibles de bacterias u hongos que tienen un pH óptimo preferiblemente en el rango casi neutro a suavemente alcalino de pH de 6 a 9.5. Preferiblemente se utilizan en el detergente de acuerdo con la invención en tales cantidades que el detergente final tiene una actividad celulolítica de 0.05 IU/g a 1.5 IU/g ("Unidades Internacionales" por gramo, sobre la base de la hidrólisis enzimática de Na carboximetilcelulosa a pH 9.0/40ºC, preferiblemente 0.07 IU/g a 1.4 IU/g y más preferiblemente 0.1 IU/g a 1.3 IU/g. Los productos comerciales apropiados son, por ejemplo, CELLUZYME®, un producto de Novo Nordisk, o KAC®, un producto de Kao.

Las enzimas se pueden adsorber de manera conocida sobre soportes, encapsulados en sustancias que forman una capa y/o granulada en conjunción con sustancias soporte, para hacer luego más fácil su manipulación y protección contra la inactivación prematura, si son para ser incorporados en detergentes particulados. Las enzimas opcionalmente presentes además con la proteasa preferiblemente se presentan en detergentes de acuerdo con la invención en cantidades de hasta 2% en peso y más preferiblemente en cantidades de 0.01% en peso a 1.5% en peso, sobre la base del detergente como un todo.

En una modalidad preferida, un detergente de acuerdo con la invención es particulado y contiene 20% en peso a 55% en peso del constructor inorgánico, hasta 15% en peso y más particularmente de 2% en peso a 12% en peso del constructor orgánico soluble en agua, 2.5% en peso a 20% en peso de agente tensoactivo aniónico sintético, 1% en peso a 20% en peso de agente tensoactivo no-iónico, hasta 25% en peso y, más particularmente, del 1% en peso a 15% en peso del agente blanqueador, hasta 8% en peso y, más particularmente, de 0.5% en peso a 6% en peso del activador de blanqueo y hasta 20% en peso y, más particularmente, de 0.1% en peso a 15% en peso de sales inorgánicas, más particularmente carbonato de metal alcalino y/o sulfato, y hasta 2% en peso y, más particularmente, de 0.4% en peso a 1.2% en peso de enzimas particuladas además de proteasa, más particularmente lipasa, cutinasa, amilasa, celulasa, pululanasa, oxidasa y/o peroxidasa.

En otra modalidad preferida, un detergente en forma de polvo de acuerdo con la invención se pretende en particular para utilizar como un detergente ligero contiene 20% en peso a 55% en peso de los constructores inorgánicos, hasta 15% en peso y, más particularmente, de 2% en peso a 12% en peso de constructores orgánicos solubles en agua, de 4% en peso a 24% en peso de agente tensoactivo no-iónico, hasta 15% en peso y, más particularmente, del 1% en peso a 10% en peso de agente tensoactivo aniónico sintético, hasta 65% en peso y, más particularmente, de 1% en peso a 30% en peso de sales inorgánicas, más particularmente carbonato de metal alcalino y/o sulfato, y ninguno de los dos agentes blanqueadores ni activadores de blanqueo.

Otra modalidad preferida del detergente de acuerdo con la invención es un detergente líquido que contiene 5% en peso a 35% en peso de constructores orgánicos solubles en agua, hasta 15% en peso y, más particularmente, de 0.1% en peso a 5% en peso de constructores inorgánicos insolubles en agua, hasta 15% en peso y, más particularmente, de 0.5% en peso a 10% en peso de agente tensoactivo aniónico sintético, de 1% en peso a 25% en peso de agente tensoactivo no-iónico, hasta 15% en peso y, más particularmente, de 4% en peso a 12% en peso de jabón y hasta 30% en peso y, más particularmente, de 1% en peso a 25% en peso de agua y/o solvente miscible en agua y también hasta 10% en peso y, más particularmente, de 0.01% en peso a 7.5% en peso de un enzima que estabiliza el sistema. La proteasa en cada una de las modalidades preferidas citadas anteriormente es una variante F49 que tiene las sustituciones del aminoácido S3T + V41 + A188P + V193M + V1991 + L211D.

Los detergentes particulados de acuerdo con la invención se pueden producir muy fácilmente, mezclando las partículas individuales en un mezclador estándar, más particularmente un mezclador de tambor, mezclador de rodillo, mezclador de cinta o mezclador de caída libre, otros componentes en forma de polvo opcional y, si se desea, incluso componentes líquido o licuados, incluyendo en particular agentes tensoactivos no-iónicos, sino también colorantes y fragancias, siendo opcionalmente incorporadas por aspersión. Los componentes capaces de resistir altas temperaturas se convierten preferiblemente en un producto en forma de polvo de manera conocida, mediante secado por aspersión de una suspensión acuosa y el polvo obtenido se mezcla con la proteasa y, opcionalmente, otras sustancias enzimáticas y otros componentes sensibles al calor, incluyendo en particular agentes blanqueadores. La incorporación de constituyentes individuales, mezclando en gránulos o un extruido que los contiene, también es posible y se prefiere particularmente para la producción de detergentes de acuerdo con la invención con densidades aparentes altas de, preferiblemente, 650 g/l a 900 g/l. Los detergentes fluidos o líquidos de acuerdo con la invención se pueden producir simplemente mezclando los ingredientes o compuestos de estos que pueden estar presentes en forma líquida o en la forma de una solución en agua o un solvente dado.

Ejemplo 1 Identificación de los Sitios en BLAP para la Mutagénesis

Una variedad de subtilisinas naturales y otras serina proteasas se probaron para su eficiencia en el lavado. Los resultados mostraron que la posibilidad de lavado se relaciona con el número y distribución de residuos de aminoácidos cargados en la región de enlace del sustrato. Una mejora en el desempeño del lavado se vio con un mayor número de residuos de aminoácidos cargados negativamente o con una disminución del número de residuos de aminoácidos cargados positivamente en la región de enlace del sustrato. Por consiguiente, los mutantes BLAP reivindicados aquí tienen
una reducida carga neta positiva en la región de enlace del sustrato y muestran una mejora en la posibilidad de lavado.

El desempeño mejorado del lavado se obtuvo por la introducción de alteraciones de aminoácido dentro del bolsillo de unión del sustrato que resultó en una variación en carga. Las alteraciones se hicieron para los aminoácidos que residen dentro del bolsillo de unión del sustrato de ya sea la variante BLAP M130 o la variante BLAP M131. El bolsillo de unión del sustrato de estas enzimas se define como la región dentro 7 A de un sustrato de molécula de enlace, AAPF. La AAPF unida a la enzima se modeló sobre los datos cristalográficos de complejos subtilisina-inhibidor encontrados en la literatura y disponibles del Brookhaven Protein Data Bank. La estructura de las variantes BLAP M130 y M131 dentro del bolsillo de unión del sustrato es esencialmente idéntica a la BLAP de tipo salvaje basándose en cristalografía de rayos X. La estructura de BLAP de tipo salvaje a una resolución 1.4A ha sido publicada en la aplicación de la patente Serie No. 07/706,691 archivada el 29 de Mayo, 1991 y las correspondientes coordenadas atómicas depositadas con el Brookhaven Protein Data Bank. En particular, las alteraciones de aminoácido en las posiciones 99, 154 y 211 dentro de las variantes BLAP M130 y M131 se mostraron que potencian el desempeño del lavado de la enzima. Los aminoácidos parentales que ocupan estos sitios, Arginina 99, Serina 154, y Leucina 211 se describen en la Figura 1. Los tres aminoácidos se localizan dentro del radio 7A específico de AAPF.

Ejemplo 2 Construcción de los Genes Mutantes del Gen BLAP A. Construcción de los mutantes M130 y M131

Los genes que expresan las proteasas del mutante B. lentus DSM 5483 de acuerdo con la invención se hacen mediante la alteración de uno o más codones del gen alcalino de la proteasa de tipo salvaje B. lentus DSM 5483. La proteasa M130 se derivó de BLAP por la introducción de las mutaciones S3T, A188P, V193M y V199I. La proteasa M131 se derivó de BLAP por la introducción de las mutaciones S3T, V4I, A188P, V193M, y V199I. Los genes que codifican las proteasas M130 y M131 se construyeron utilizando el procedimiento pMac (Stanssens, P., Opsomer, C., McKeown, Y.M., Kramer, W., Zabeau, M., and Fritz, H.-J. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 4441-4445). Las proteasas M130 y M131 han sido previamente descritas en la aplicación de la patente Serie No. 07/706,691 archivada el 29 de Mayo, 1991. Las proteasas M130 y M131 muestran una mejora en la estabilidad térmica y del agente tensoactivo sobre la BLAP de tipo salvaje y sirvió como la base para desarrollar proteasas con desempeño mejorado de lavado. Las técnicas genéticas utilizadas para modificar el gen BLAP para producir las proteasas M130 y M131 también han sido descritas en la aplicación de la patente WO 91/02792.

Las proteasas M130 y M131 se derivaron de la proteasa alcalina (BLAP) de B. lentus DSM 5483 mediante mutagénesis del sitio-específico de ADN que codifica la forma madura de BLAP de tipo salvaje. El fragmento de ADN que codifica la forma madura de BLAP de tipo salvaje se preparó utilizando el plásmido pCB13C. El plásmido pCB13C contiene una fusión híbrida entre el gen de la proteasa de B. licheniformis ATCC 53926 y el gen BLAP de B. lentus DSM 5483. Específicamente, esta fusión híbrida contiene el ADN que codifica el promotor, sitio de enlace ribosómico, y 21 residuos de la pre secuencia del gen de la proteasa ATCC 53926 fusionado a una secuencia de ADN que codifica los últimos cinco residuos de la pre secuencia de BLAP y todos los residuos pro y maduros de BLAP. Esta fusión se refiere como a la fusión ClaI debido a que este sitio de restricción se localiza en la unión entre los ADN de ATCC 53926 y DSM 5483. Un nuevo sitio de restricción ClaI tuvo que ser introducido en el gen alcalino ATCC 53926 de la proteasa cercano a la unión de las pre y pro secuencias. El sitio C/al se introdujo en el gen alcalino ATCC 53926 de la proteasa, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar un fragmento de ADN que contiene la información de la secuencia de la parte N-terminal del gen alcalino ATCC 53926 de la proteasa. El fragmento amplificado incluyó el promotor de la proteasa alcalina ATCC 53926, sitio de enlace ribosómico, codón de iniciación, y más de la pre-secuencia. La secuencia de ADN de este fragmento se muestra en la Figura 3. Este fragmento de ADN de 292 bp se flanqueo por los sitios de restricción AvaI y C/als en sus terminales 5' y 3', respectivamente. El gen BLAP ya contenido del sitio Clal de origen natural en la posición correspondiente. El análisis de la secuencia de ADN a través de la fusión de los genes ATCC 53926 y BLAP confirmó el ADN y las secuencias de aminoácidos esperados.

Para realizar la mutagénesis, el gen BLAP se subclona en el vector de mutagénesis pMa5-8. Esto se logra sintetizando un fragmento de ADN que contiene el gen de la fusión ClaI y la terminación de la transcripción ATCC 53926 como un casete SalI utilizando la PCR. La PCR se realizó utilizando las condiciones como se describen por el fabricante (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT). En la PCR, dos oligonucleótidos sintéticos que llevan los sitios Sa/I se utilizan como cebadores y el ADN del vector pCB13C de Escherichia coli como una plantilla. Después del corte del producto de PCR con Sa/l, este fragmento se clona en el plásmido pMc5-8 mutagénico que se ha cortado previamente con Sa/I y defosforilado con fosfatasa alcalina bacteriana. Los plásmidos pMc5-8, y pMa5-8 se obtuvieron de H.-J. Fritz y se describen por Stanssens, P., et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 4441-4454. Los sitios Sa/I se seleccionan para permitir que el fragmento de PCR sea clonado en el pMc5-8 en ambas orientaciones. La mezcla de unión se transforma en E. coli WK6. Los transformantes resistentes al cloranfenicol (CmR) se seleccionan para la presencia de un inserto y una construcción correcta del plásmido pMc13C se identifica. Una vez que el gen se clona en el vector pMc5-8 y los sitios deseables para la mutación se identifican, la(s) mutación(s) se introduce utilizando oligonucleótidos sintéticos de ADN de acuerdo con una modificación de un protocolo publicado (Stanssens, P., et. al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 4441-4454). El oligonucleótido que contiene la(s) mutación(s) que se introducen se alinea a una estructura bicatenaria incompleta (gd) que lleva el gen BLAP sobre un segmento de ADN monocatenario (ss). El bicatenario incompleto se puede formar por hibridación lineal del ADN ss de pMc13C con ADN de pMa5-8 desnaturalizado y restringido. El plásmido pMa5-8 contiene un gen activo resistente a la penicilina pero tiene un punto que inactiva la mutación en el gen de resistencia al cloranfenicol, mientras que el plásmido pMc13C contiene, además a un gen BLAP intacto, un gen activo de resistencia al cloranfenicol, pero tiene un punto que inactiva la mutación en el gen resistente a la penicilina. El producto hibridizado es el ADN gd que en un heterodúplex bicatenario con un ADN ss discontinuo abarcando el gen BLAP clonado completo. El oligonucleótido mutante es capaz de hibridizar con un homólogo de ADNs de BLAP dentro del hueco y el hueco remanente se llena mediante una polimerasa de ADN I (fragmento Klenow) y se liga utilizando T4 ADN ligasa (New England Biolabs Inc., Beverly, MA [NEB]). La eficiencia mutagénica de dicho sistema se puede mejorar por el uso de Exonucleasa III (Exo III, NEB). La Exo III es una exodeoxiribonucleasa que digiere el ADN bicatenario del terminal 3'. Como se necesita un terminal 3' libre, ADN ss circular cerrado o ADN ds no se afecta por esta enzima. Un tratamiento posterior del producto de la reacción de relleno con Exo III elimina cualquier especie con huecos solo parcialmente llenos. Esto mejora significativamente la eficiencia mutagénica y es el método de mutagénesis preferido. El producto de la reacción de relleno entonces se transforma en una cepa E. coli (WK6mutS) carente de reparación y se seleccionan transformantes resistentes a la ampicilina (ApR). La replicación de los plásmido heterodúplex transformado resulta en dos progenies diferentes. Una progenie contiene el gen BLAP de tipo salvaje y el gen intacto de resistencia al cloranfenicol, pero un gen inactivo resistente a la penicilina. La otra progenie contiene un gen BLAP que lleva la mutación de interés y es resistente a la ampicilina pero no al cloranfenicol.

La selección de los transformantes mutantes ApR, CmS con ampicilina no es suficiente para detener algún crecimiento de fondo de la progenie ApS, CmR que lleva el gen BLAP de tipo salvaje. Por consiguiente, es necesario realizar una segunda transformación en E. coli utilizando el ADN del plásmido preparado de los transformantes ApR de la cepa WK6mutS. Esta segunda transformación utiliza una baja concentración del plásmido con un gran número de células receptoras de una cepa deficiente supresora de E. coli tal como WK6. Esta metodología disminuye la probabilidad de una célula receptora que reciba el ADN del plásmido de ambas progenies. Los transformantes ApR se seleccionan y el ADN del plásmido de varios transformantes se aísla y selecciona para la presencia de la mutación. El derivado mutante pMa de la primera ronda de mutagénesis se puede utilizar para una segunda ronda de mutagénesis, preparando ADN ss de aquella especie e hibridizarla a XbaI/H indIII restringido y ADN desnaturalizado de pMc5-8. El plásmido pMc5-8 es idéntico al pMa5-8 excepto que este contiene un gen activo de resistencia al cloranfenicol y un gen inactivo resistente a la penicilina. El procedimiento general es el mismo como aquel descrito anteriormente. La construcción de los genes que codifican las proteasas M130 y M131 requiere de dos rondas de mutagénesis. En la primera ronda de la mutagénesis un oligonucleótido se diseñó para introducir las mutaciones A188P, V193M, y V1991. En una segunda ronda de mutagénesis un oligonucleótido se diseñó para introducir la mutación S3T en el caso de M130 y las mutaciones S3T y V41 en el caso de M131. La presencia de todas estas mutaciones se verificó, mediante la secuenciación de ADN.

B. Construcción de los Genes que Codifican Nuevas Proteasas con Rendimiento de Lavado Mejorado

Las mutaciones R99G, R99A, R99S, S154D, S154E y L211D se introdujeron en el gen que codifica la proteasa M131 utilizando mutagénesis de PCR mediante extensión traslapada. La mutación R99S se introdujo en el gen que codifica la proteasa M130 utilizando mutagénesis de PCR por extensión traslapada. La construcción pCB76M131 se utilizó para construir los mutantes F43, F44, F45, F46, F47, y F49 (Tabla 2). La construcción pCB76M130 se utilizó para construir el mutante F11 y la construcción pCB76F49 (un mutante recientemente construido) se utilizó para construir los mutantes F54 y F55.

TABLA 2 Descripción de las BLAP Mutantes

2

Los materiales necesarios para realizar este procedimiento incluyen: un ADN Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus); kit GeneAmp (Perkin Elmer Cetus); AmpliWax (Perkin Elmer Cetus); y tubos de polipropileno estériles de 0.5 ml (Perkin Elmer Cetus); concentradores Microcon-100 (Amicon, Beverly, MA); solución reguladora TE (tris 10 mM-(hidroximetil)aminometano [Tris], etilendiamina disódica ácido tetracético 1 mM (EDTA), ajustado a pH 8 con HCl 2N); equipo de electroforesis Minigel (Hoefer Scientific, San Francisco, CA); 1% (peso/vol.) gel agarosa SeaKem (FMC, Rockland, ME) en solución reguladora TBE (Tris 0.089 M, ácido bórico 0.089 M, EDTA 2 mM); 0.5 \mug\cdotml^{-1} de bromuro de etidio en agua; enzimas de restricción Nhel (NEB), XbaI (NEB); y SstI (BRL, Gaithersburg, MD).

Las PCR se llevaron a cabo utilizando el kit GeneAmp y AmpliWax como indica por el fabricante. Se sometieron a 1 ciclo de desnaturalización (3 minutos, 95ºC), hibridación (2 minutos, 50ºC) y extensión (2 minutos, 72ºC) y 30 ciclos de desnaturalización (1 minuto, 94ºC), hibridación (1 minuto, 50ºC) y extensión (1 minuto, 72ºC) utilizando un ADN Thermal Cycler. Cada ciclo se extendió por 10 seg. a 72ºC.

La mutagénesis de sitio dirigido por extensión traslapada se describe por (Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K, and Pease, L.R. (1989) Gen 77, 51-59). Para las BLAP mutantes F43, F44, F45, F46, F47 y F49 10 ng de ADN del plásmido pCB76M131 se utilizó como plantilla para la ronda inicial de mutagénesis. Para el mutante F11 de BLAP 10 ng de ADN del plásmido pCB76M130 se utilizó como plantilla, y para las BLAP mutantes F54 y F55 10 ng de ADN pCB76F49 se utilizó como plantilla. Las formas pUB110 de estos plásmidos se seleccionaron debido a que proporcionan rendimientos más altos de proteasa en el huésped B. subtilis DB104 que las formas pBC16 de los plásmidos. El fragmento de PCRs se verificó por electroforesis de gel de agarosa y se limpió utilizando un concentrador Microcon-100 (Amicon) después de cada ronda de PCR. Después de la segunda ronda de PCR, los fragmentos se sometieron a digestión con ya sea Nhel/Xbal o Nhel/Sstl (dependiendo de la localización de la mutación pretendida) y se clonaron de nuevo en ADN del pCB76M131 en el caso de los mutantes F43, F44, F45, F46, F47 y F49, ADN de pCB76M130 en el caso del mutante F11 y pCB76F49 en el caso de los mutantes F54 y F55 utilizando células competentes de B. subtilis DB104 como se describe previamente. El aislamiento del ADN del plásmido se logró utilizando mini columnas de intercambio iónico (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA) y las mutaciones se verificaron por secuenciación del ADN ds Sanger como se describe previamente.

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Ejemplo 3 Clonación de los Genes Mutantes de la Proteasa A. Clonación del Mutante de las Proteasas Producido vía el Sistema pMac

Las proteasas M130 y M131 se pueden producir por transferencia del gen respectivo que codifica ya sea M130 o M131 del particular vector derivado E. coli pMc13C en un vector del plásmido que puede replicar en Bacillus. Para lograr esto, el gen mutante deseado se separa del plásmido pMc13C apropiado, por digestión con las endonucleasas de restricción AvaI y SstI, seguido por la unión al fragmento más grande AvaI/SstI de ya sea el plásmido pH70 o pC51. Estos fragmentos AvaI/SstI de pH70 y pC51 incluyen las secuencias de ADN necesarias para la replicación en Bacillus y codifican tanto la resistencia a la canamisina (Km^{R}) como la resistencia a la tetraciclina (Tc^{R}), respectivamente. El plásmido pH70 se construye por clonación del gen alcalino ATCC 53926 de la proteasa llevado en un fragmento EcoRI/BamHI de ADN en el plásmido pU8110 Km^{R} entre los sitios EcoRI y BamHI. El plásmido pC51 se construye por clonación del gen ATCC 53926 de la proteasa llevado en un fragmento EcoRI/ BamHI en el plásmido pBC16 Tc^{R} entre los sitios EcoRI y BamHI. El fragmento más grande AvaI/SstI de tanto pH70 como pC51 utilizado para la clonación del fragmento de ADN que codifica tanto M130 como M131 primero se purifica de otros fragmentos de ADN del plásmido, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en una columna de intercambio aniónico (Gen-Pak FAX, diámetro 4.6 mm, largo 100 mm; Waters, Milford, MA). Las condiciones para la elución del ADN son una velocidad de flujo de 0.75 ml\cdotmin ^{-1} con un gradiente de 50% de Solución reguladora A (Tris 25 mM, que contiene EDTA 1 mM y ajustado a pH 8.0 con HCl 2N) y Solución reguladora B (Tris 25 mM, que contiene EDTA 1 mM, NaCl 1 M, y ajustado a pH 8.0 con HCl 2N) a 30% de Solución reguladora A y 70% de Solución reguladora B en 30 min.

Los dos ADN's ligados se transforman en B. subtilis DB104. Los genes que codifican las principales proteasas alcalinas y neutras presentes en esta cepa han sido inactivadas (Kawamura, F. and Doi, R.A. (1984) J. Bacteriol. 160, 442-444). Las células de B. subtilis DB104 transformadas por estos plásmidos crecieron en un agar nutriente de leche descremada en la presencia de tanto canamicina como tetraciclina. Los transformantes de DB104 que fabrican la proteasa mutante se identifican por la formación de zonas claras de hidrólisis en la leche descremada. La confirmación de que los transformantes que producen la proteasa llevan un gen del plásmido-sostenido M130 o M131 con la(s)
mutación(s) deseada(s) se logra, purificando el ADN del plásmido de un cultivo de cada transformante. El ADN del plásmido se purifica fuera de la proteína celular y ADN cromosómico por precipitación SDS-sal seguido por la cromatografía sobre una columna de intercambio iónico QIAGEN (QIAGEN,Inc., Chatsworth, CA). Los ADNs del plásmido AvaI/SstI digeridos de diferentes transformantes se comparan con derivados AvaI/SstI-digeridos del plásmido pH70 o pC51 conocidos que llevan un gen intacto BLAP. La restricción digerida de estos plásmidos se compara por electroforesis de gel de agarosa para identificar los plásmidos que tienen el fragmento AvaI/SstI de tamaño apropiado de ADNs. Los seleccionados ADNs del plásmido, entonces se secuencian a través de la región de las mutaciones esperadas M130 o M131 para confirmar que la(s) deseada(s) mutación(es) están presentes. Los genes M130 y M131 clonados en el derivado de plásmido pC51 (TcR) se designan plásmidos pCB56M130 y pCB56M131 respectivamente, mientras los mismos genes clonados en un derivado del plásmido pH70 se designan plásmidos pCB76M130 y pCB76M131 respectivamente. Uno o más clones de cada mutación BLAP se almacenan congelados en 15% glicerol a -70ºC y también se cultivan en matraces oscilantes para producir la proteasa mutante para su caracterización.

B. Clonación del Mutante de las proteasas Producidos vía Procedimiento de PCR solapante

Como se describe arriba, los fragmentos de PCR amplificados se clonaron de nuevo en plásmidos pCB76M130, pCB76M131 o pCB76F49. Para la expresión en la producción B. licheniformis de la cepa del fragmento AvaI/SstI que lleva los genes modificados M130, M131 o F49 se clonan otra vez en el vector tipo pC51 como se describe previamente.

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Ejemplo 4 Producción del Mutante de las proteasas

La proteína BLAP de tipo salvaje y las proteínas mutantes se produjeron mediante Bacillus subtilis DB 104 transformados en matraces oscilantes. Un bucle dosificador caliente se utilizó para pasar cada cepa de mutante de un cultivo criovial congelado sobre un agar de leche descremada-LB que contiene ya sea 20 \mug\cdotml^{-1} de canamicina o 15 \mug\cdotml^{-1} de tetraciclina. Las placas se incubaron a 37ºC por 20 a 24 horas. Una única, colonia aislada que produce una buena zona de hidrólisis de la leche descremada se manipuló en un frasco erlenmeyer de 250 ml que contiene cerca de 50 ml de Caldo Luria (LB) que contenía ya sea 20 \mug\cdotml^{-1} de canamicina o 15 \mug\cdotml^{-1} de tetraciclina. El caldo se incubó en un New Brunswick Series 25 Incubator Shaker a 37ºC con agitación a 280 rpm por 7 a 8 horas. 2.5 ml del precultivo turbio se transfirió en 50 ml de MLBSP que contiene ya sea 20 \mug\cdotml^{-1} de canamicina o 15 \mug\cdotml^{-1} de tetraciclina en cada una de cuatro matraces de 500 ml amortiguados, o 5 ml de precultivo se utilizó como un inóculo por 100 ml de caldo MLBSP con antibiótico contenido en cada uno de los dos 500 ml matraces amortiguados (un 5%, v/v, se transfiere). Todos los matraces se incubaron a 240 rpm y 37ºC por 64 horas. Después de 64 horas de incubación, el contenido de un conjunto de matraces para cada cultivo se consolidó, transfirió a tubos de centrífuga de 50 mL, y se centrifugó a 20,000 x gav. por 15 minutos a 4ºC. El caldo se filtró a través de Miracloth (Calbiochem Corp., #475855) en un matraz de 400 mL colocado en hielo. El pH de la solución se ajustó a 5.8, mediante la adición de ácido acético glacial. Después de 30 minutos de agitación, los desechos finos se eliminaron por centrifugación a 20,000 x gav por 15 minutos. El volumen del sobrenadante se registró. Alícuotas de 1 ml se repartieron para el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida nativo y desnaturalizado (PhastSystem, Pharmacia), para la determinación de la actividad proteolítica total por el método HPE, y por titulación del sitio activo. El caldo se almacenó en hielo hasta que la proteasa se pueda purificar. Para un almacenamiento a largo plazo o para el traslado el caldo se mezcla con un volumen igual de propano-1,2-diol. La composición del medio MLBSP utilizado para la producción de BLAP en cultivos en matraces oscilantes se describe en la Tabla 3

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TABLA 3 Composición de Medio MLBSP ^{1}

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Ejemplo 5 Purificación de BLAP y sus Proteínas mutantes

Si no se menciona de otro modo, todas las etapas posteriores se realizaron en hielo o a 4ºC. Las muestras del caldo como se obtuvieron en el Ejemplo 3 se filtraron a través de un filtro de 0.2 \mum, y el filtrado se concentró por ultrafiltración. La membrana de retención tuvo un límite de peso molecular nominal de 10,000 montados en un casete Minitan (Millipore) o en una celda de ultrafiltración (Amicon). Para un posterior traslado o almacenamiento extendido, soluciones del caldo se mezclaron con un volumen igual de propano- 1,2-diol para estabilizar la proteasa. Por otra parte, el concentrado se dializó por 16 horas contra fosfato de sodio 20 mM, pH 7.0 ("solución reguladora de fosfato"), o contra 20 mM N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), que contiene CaCl_{2} 1 mM y ajustado a pH 7.8 con NaOH ('solución reguladora HEPES'). El dialisado se clarificó por centrifugación (20,000 x gav. por 10 minutos) y el pH de la solución, si es necesario, se vuelve a ajustar. Las muestras dializadas contra solución reguladora de fosfato se equilibraron por 15 minutos con 5% (peso/vol.) de DEAE-celulosa previamente equilibrada en la misma solución reguladora para atrapar las proteínas cargadas negativamente. Después de la eliminación de la DEAE-celulosa por centrifugación o filtración el sobrenadante se cargó en una columna de intercambio catiónico (S-Sepharose Fast Flow, Pharmacia; diámetro 16 mm, largo 90 mm, volumen del lecho 18 ml, velocidad de flujo50 ml\cdoth^{-1}) previamente equilibrada con solución reguladora de fosfato. Las muestras dializadas contra HEPES solución reguladora se aplicaron directamente a una columna de intercambio catiónico (S-Sepharose Fast Flow, Pharmacia; diámetro 15 mm, largo 75 mm, volumen del lecho 13 ml, velocidad de flujo 50 ml\cdoth^{-1}) previamente equilibrada con solución reguladora HEPES. Cuando todos los subproductos coloreados se eluyeron, la columna se lavó con 3 a 5 volúmenes de la columna con solución reguladora de aplicación. La proteasa se eluyó del intercambiador catiónico, incluyendo NaCl 1.0 M en la solución reguladora de fosfato o NaCl 0.25 M en la solución reguladora HEPES. Las fracciones que contienen la enzima activa se mezclaron.

La enzima purificada en solución reguladora de fosfato se concentró y se le quito la sal por ultrafiltración utilizando tubos Centricon (límite de peso molecular 10,000; Amicon). La concentración de la proteína se determinó por el método de ácido bicincóninico (método BCUn, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Para la estabilización de la proteasa 50% (v/v) se adicionó propano-1,2-diol a la solución stock.

Las fracciones mezcladas con enzima purificada en solución reguladora HEPES se mezclaron con un exceso de volumen 5 a 8-veces de acetona a -20ºC. La proteína se deja precipitar por 4 minutos, y la mezcla se centrifugó por 4 minutos a 6,600 x gav. El sobrenadante se desechó, el pellet se expone brevemente al vacío (aspirador de agua) para retirar más de la acetona, y el pellet se disolvió en 20 mM ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), que contiene CaCl_{2} 1 mM y ajustada a pH 5.8 con NaOH 2N, para dar una concentración aproximada de la proteína de 30 mg\cdotml^{-1}. La solución se clarificó por centrifugación en una centrifuga Eppendorf por 3 minutos a toda velocidad (13,000 x g_{max}) y se almacenaron congelados hasta que se utilizan. La concentración de la proteína se determinó por el método biuret (Gornall, A.G., Bardawill, C.S., and David, M.M. (1948) J. Biol. Chem. 177, 751-766).

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Ejemplo 6 Determinación de la Proteasa Activa

La concentración de la enzima activa se determinó por la titulación del sitio activo con el inhibidor fenilmetil sulfonilfluoruro. Una solución de la proteasa se preparó en fosfato de sodio 10 mM, pH 6.5, a una concentración aproximada de 100 \muM sobre la base de la determinación de la proteína. Las concentraciones del inhibidor fueron equivalentes a una relación molar estimada de 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 y 1.25. Las mezclas se dejaron reaccionar por una hora a temperatura ambiente. La actividad de la enzima residual se midió espectrofotométricamente por el método AAPF-pNUn (ver más adelante).

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Ejemplo 7 Determinación de la Actividad Proteolítica

Dos ensayos de proteasas diferentes se utilizaron. Con el método HPE de actividad de la proteasa se estabilizó a una única concentración de caseina como sustrato. En el ensayo de AAPF-pNA inicial de los índices de catálisis sostenidas de succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenilalanil- p -nitroanilida (AAPF-pNA; Bachem Bioscience, Philadelphia, PA) se utilizaron para determinar los parámetros cinéticos K_{m}, k_{cat}, y k_{cat}/K_{m}.

A. Ensayo de la Proteasa por el Método HPE

La actividad proteolítica se determinó por un ensayo discontinuo utilizando caseina como un sustrato. Las concentraciones finales de la solución del sustrato fueron de 12 mg.ml^{-1} de caseina (preparada de acuerdo con Hammarsten; Merck, Darmstadt, #2242) y Tris 30 mM en agua potable sintética. El agua potable sintética es una solución de 0.029% (peso/vol.) de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0.014% (peso/vol.) de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O, y 0.021% (peso/vol.) NaHCO_{3} con una dureza de 15ºdH. La solución del sustrato se calienta a 70ºC y el pH se ajusta a 8.5 a 50ºC utilizando NaOH 0.1 N. La solución de la proteasa se prepara con 2% (peso/vol.) de tripolifosfato pentasodio anhidro en agua potable sintética, ajustado a pH 8.5 con ácido clorhídrico. Para 600 \mul de solución de caseina del sustrato 200 \mul de solución de enzima se adiciona. La mezcla se incuba a 50ºC por 15 minutos. La reacción se termina por la adición de 600 \mul de 0.44 M ácido tricloroacético (TCA), acetato de sodio 0.22 M en 3% (v/v) de ácido acético glacial. Después de enfriar en hielo por 15 minutos, la proteína insoluble en TCA se retira por centrifugación, una alícuota de 900 \mul se mezcla con 300 \mul de NaOH 2N y la absorbancia de esta mezcla que contiene los péptidos solubles en TCA se registra a 290 nm. Los valores de control se producen adicionando 600 \mul de solución de TCA a 600 \mul de solución de caseina seguido por 200 \mul de solución de enzima.

Una solución de la proteasa que produce, bajo las condiciones de este ensayo un cambio de absorbancia de 0.500 OD a 290 nm se declara que tienen una actividad de 10 HPE por ml. Los datos para las proteínas de los mutantes BLAP y BLAP se resumen abajo (Tabla 4).

B. Ensayo de la Proteasa con el sustrato Cromogénico AAPF-pNA

Las muestras de proteasa se diluyeron con 50% (v/v) de 1,2-propanediol en Tris 100 mM, se ajusta con HCl 2N a pH 8.6 a 25ºC ("solución reguladora Tris-propanodiol"), en los que fueron estables por al menos 6h a temperatura ambiente. Una solución stock de 160 mM AAPF-pNA se preparó en dimetilsulfóxido seco sobre cuentas de tamiz molecular (Aldrich; 4 A, 4-8 malla) por al menos 24h previo al uso. Los puntos de ensayo fijos se realizaron a 25ºC con AAPF-pNA 1.6 mM en Tris 100 mM, se ajusta con HCl 2N a pH 8.6 a 25ºC, en un volumen total de 1.020 ml. El sustrato se adicionó a la solución reguladora de ensayo 1 minuto antes de el inicio del ensayo y la reacción se comenzó por la adición de la enzima a una concentración final de 20 ng a 1.3 \mug de proteína por ml (0.75 a 48.5 nM enzima) dependiendo de la actividad específica. La liberación de la p-nitroanilida se monitoreó a 410 nm, y un coeficiente de extinción molar de 8,480 M^{-1}cm^{-1} se utilizó para calcular la cantidad y concentración del producto formado (DelMar, E.G., Largman, C., Brodrick, J.W., y Geokas, M.C. (1979) Anal Biochem. 99, 316-320).

Los parámetros cinéticos se calcularon de un registro velocidad vs. concentración del sustrato, construido de índices iniciales medidos una vez cada 12 diferentes concentraciones de AAPF-pNA fluctuando de 0.16 a 3.2 mM. Los datos se ajustaron a una curva hiperbólica y ponderado proporcionalmente utilizando el programa ENZFITTER (Leatherbarrow, R.J. (1987) ENZFITTER. Biosoft, Cambridge, UK). Un peso molecular nominal de 26.8 kDa se utilizó en todos los cálculos que requieren la interconversión de concentración de la proteína y molaridad de enzima proteasa (Tabla 4).

TABLA 4 Datos cinéticos de los Mutantes BLAP y BLAP de las Proteasas

9

Ejemplo 8 Verificación de la Estructura de la Proteína

Las mutaciones introducidas en el BLAP se verificaron, mediante el análisis de secuencia de ADN a través de la cercanía del punto de mutación. Sin embargo, se conoce que ocurren mutaciones espontáneas fuera de la región de la mutagénesis de sitio-dirigida y fue imperativo establecer que la propiedad determinada de un proteasa mutante ciertamente resida con la secuencia de aminoácido deducida de la secuencia del nucleótido. Por consiguiente, un mapa tríptico de BLAP se produjo que se verificó por análisis de la secuencia de aminoácido de cada uno de los picos individuales y al que todas las proteínas BLAP mutantes se compararon. No solo en péptidos con \leq 17 residuos de aminoácido, pero también en péptidos 5T, 7T, y 10T con 48, 44, y 49 residuos de aminoácido, una sustitución única (incluso conservadora) resultó en un cambio significante en el tiempo de retención bajo las condiciones de la separación. Particularmente cercana denominadas se resolvieron por la co-digestión de cantidades iguales de la referencia (BLAP) y la proteína mutante.

Una alícuota de hasta 5 mg de proteasa de una solución stock se colocó en hielo en tubo Eppendorf de 2.2-ml, entonces se mezcla con 1.0 ml de HCl 0.15 N y agua (ambas heladas) para dar una concentración final de 3.33 mg\cdotml^{-1} de proteína y 0.1 N HCl en un volumen total de 1.5 ml. Después de la mezcla ha sido incubado por 30 minutos, la proteína se precipitó por la adición de 165 \mul de 50% (peso/vol.) ácido tricloroacético (TCA) helado. El precipitado se deja decantar sobre hielo por 5 minutos y luego se forman pellets por centrifugación durante 4 minutos a 13,000 x g_{max} (centrifuga Eppendorf). El pellet se lavó una vez con 1 ml de 80% (v/v) de acetona y se secó brevemente con vacío.

Todas las soluciones reactivos y agua necesitados para la digestión del tríptico se pasaron a través de un filtro de 0.45 \mum (Ultrafree- MC, Millipore Products) previo al uso. El pellet de la proteína desnaturalizada (5 mg; 185 nmol) se disolvió en 90 \mul del bicarbonato de amonio 0.8 M, que contiene úrea 8 M. Esta solución se diluyó lentamente con 360 \mul de agua y luego se pasa por centrifugación a través de un filtro de 0.45 \mum. Las etapas posteriores se llevaron a cabo en microtubos siliconizados de 0.5-ml (Phenix Res. Products). Una alícuota de 300 \mul se mezcla con 13 \mul de 2.5 mg\cdotml^{-1} de tripsina en HCl 1 mM (relación de masa de BLAP:tripsina = 100:1). Para un control, 100 \mul de la solución de la proteína se mezcla con 4.5 \mul de HCl 1 mM. La alícuota remanente de 50 \mul de la solución de la proteína se mezcla con 5 \mul de 10% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) y utilizado como control de la materia prima. Las dos otras soluciones se incubaron por 10 minutos a 37ºC. Las reacciones se terminaron adicionando 30 \mul y 10 \mul de 10% (v/v) de TFA para la digestión y el control, respectivamente. La mezcla de péptidos se separó por HPLC de fase reversa.

El equipo de HPLC fue de Waters y consiste de un automuestreador (modelo 715 Ultra Wisp), un sistema de bomba dual (modelo 600E) y un detector de arreglo de diodos (modelo 990). El muestreo y la formación del gradiente se programó por el programa de software de Waters "990* Powerline". Los péptidos del tríptico se separaron sobre una columna C18 (Vydac modelo 218TP54; 4.6 x 250 mm; tamaño de partícula 5 \mu; tamaño de poro 300 \ring{A}). En línea con la columna de separación fue un guarda columna C18 (modelo Vydac 218FSK104, tamaño de partícula 10\mu). La columna de separación y el guarda columna se alojan en un conjunto de calentamiento de columna a 301ºC. El sistema de solvente utilizado fue: Solvente A = 0.1% (v/v) TFA en agua; Solvente B = 0.08% (v/v) TFA en acetonitrlo. Después de cargar la muestra de la columna C18 se desarrollo por 3 minutos con Solvente A seguido por un gradiente de 0 a 35% (v/v) de Solvente B en Solvente A en 70 minutos. A los 70 minutos el aumento del gradiente a 100% del Solvente B en 15 minutos y luego se regresa a 100% del Solvente A en 15 minutos. Previo a la siguiente inyección, la columna se equilibró por al menos 20 minutos con el Solvente A.

El cambio de absorbancia se registró a 215 nm y a 280 nm. Las cantidades de mezclas de péptidos separados para propósitos analíticos y preparitivos fluctuando de 11 \mug (0.4 nmol) a 500 \mug (18 nmol) en un volumen de 5 a 50 \mul a concentraciones de 2.2 a 10 mg\cdotml^{-1}.

Para la secuenciación del péptido, el eluato fue fraccionado a mano de acuerdo con el cambio de absorbancia observado en el registrador adjunto. Previos estudios con \beta-mercaptoetanol mostraron que el tiempo de retraso del tiempo de registro con el tiempo de elución del sistema fue menor de 2 segundos. Las fracciones se concentraron con vacío en un Speed Vac Concentrator (Savant, Hicksville, NY) a menos de 100 \mul y se llevan a 100 \mul con TFA acuoso para lograr una concentración final de TFA del 1%. Se tomó cuidado que durante la concentración las muestras no alcanzan completa sequedad.

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Ejemplo 9 Caracterización de las proteasas por Estabilidad Tenside

La estabilidad del mutante de las proteasas a los tensoactivos se probó con SDS como detergente aniónico típico. La estabilidad se probó en carbonato de sodio 50 mM, pH 10.5 a 50ºC, que contiene 1% (peso/vol.) de SDS. La proteínas de la proteasa se incubaron a una concentración final de la proteína de 0.25 mg\cdotml^{-1}. Periódicamente, una alícuota se retira de la mezcla de incubación y se diluye en solución reguladora Tris-propanodiol enfriada en hielo. La actividad residual de la proteasa se determinó por el ensayo AAPF-pNA a una concentración del sustrato de 1.1 mM. La estabilidad se expresa como vida media (t1/2) de la actividad determinada de registros semi-logarítmicos de actividad residual como función de tiempo.

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Ejemplo 10 Desempeño de lavado de los mutantes de la Proteasa

El desempeño del lavado se probó con una prueba de lavado especialmente desarrollada utilizando tejidos de muestras de algodón manchadas con huevo y hollín (ER) y con sangre, leche y hollín (BMR). Las pruebas de lavado se realizaron en un medidor de lavado Atlas (tipo LP 2), equipado con recipientes de prueba de acero inoxidable, que contienen una composición definida de detergente más la proteasa para ser probada.

El algodón pre-lavado se manchó con una cantidad definida de lodo y aire-seco por 6 días. Los vasos de laboratorio del medidor de lavado se llenaron con 1 muestra de tejido manchada y 3 muestras de tejidos de algodón sin manchas. Se adicionaron diez bolas metálicas (diámetro 10 mm) para tratamiento mecánico. El tiempo de lavado fue de 30 minutos con una temperatura final de 30ºC alcanzada después de 4 minutos de calentamiento.

Los detergentes de lavandería para estas pruebas fueron de composición típica para uso Europeo (Jakobi, G. and Löhr, A. (1987) Detergents and Textile Washing, VCH, Weinheim, Germany). Las concentraciones de un detergente de tejido delicado para tejidos de fácil-cuidado y coloreados (agentes tensoactivos aniónicos 5-15% (peso/peso), 1-5% (peso/peso) agentes tensoactivos no-iónicos), un detergente compacto pesado (8% (peso/peso) agentes tensoactivos aniónicos, 6% (peso/peso) agentes tensoactivos no-iónicos, con tetraacetiletilendiamina (TAED) y perborato de lejía) y un detergente concentrado super compacto (18% (peso/peso) agentes tensoactivos aniónicos, 2.5% (peso/peso) agentes tensoactivos no-iónicos, con TAED y perborato de lejía) fueron 0.5 g, 0.5 g, y 0.4 g, respectivamente, en 100 ml de agua a 16ºdH. El detergente super compacto es un detergente granulado extruido, descrito por la aplicación de las patentes número (WO 91/02047, WO 91/13678, WO 93/02176, WO 93/15180, WO 94/01526). En todos los casos el pH fue 10.4. Una proteasa se adicionó a las soluciones de lavado en la base de su actividad enzimática medida en HPE a una relación de 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 y 1000 HPE por gramo de detergente.

Posterior al lavado, el tejido se enjuagó con corridas de agua potable, aire-seco y se planchó. El efecto de lavado enzimático se determinó por el cambio (\DeltaRem) de la remisión (%Rem) a 440 nm (400-500 nm) medidos en un instrumento de medición de diferencia de color Dr. Lange (Micro Color). \DeltaRem es la diferencia en remisión después del lavado con la proteasa añadida y la remisión después de lavado sin proteasa añadida. Los resultados de las pruebas de desempeño de lavado se presentan en la Tablas 5 y 6.

La mejora en el desempeño de lavado se determinó por la relación de enzima de tipo salvaje necesaria para lograr un \DeltaRem estándar, contra la cantidad de enzima mutante para lograr un efecto idéntico. De esta manera una mejora de 2 indica que mitad de la enzima mutante si se necesita para conseguir el mismo efecto como con la enzima de tipo salvaje.

TABLA 5 Efecto de Lavado de los mutantes de las Proteínas BLAP y BLAP sobre Manchas de Sangre-Leche-Hollín

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TABLA 6 Efecto de Lavado de los Mutantes de las Proteínas BLAP y BLAP sobre Manchas de Hollín y huevo

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Ejemplo 11

Una composición enzimática de detergente se prepara mezclando cerca de 30% en peso de una preparación concentrada de un proteasa mutante como se define en la reivindicación 6, con cerca de 5% en peso de celulosa, 5% en peso de sacarosa, 20% en peso de harina de trigo, 30% en peso de almidón, 5% en peso de carboximetilcelulosa y 5% de polietilenglicol (mw 20,000). La mezcla resultante se granula por granulación de extrusión. Después del secado, el granulado tien una actividad de 70,000 a 250,000 HPE/g. El granulado se recubre con polietilenglicol (mw 6000) que contiene TiO_{2}. La enzima de proteasa granulada, entonces se mezcla con 100 g de Detergente Compacto Pesado (Porsil supra) que contienen perborato de sodio\TAED resultando en una actividad de la proteasa estándar de 1200 HPE/g.

Ejemplo 12

Una composición enzimática de detergente se prepara de acuerdo con el Ejemplo 11 excepto la proteasa que se reemplaza por la proteasa como se define en la reivindicación 7.

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Ejemplo 13

Una composición enzimática de detergente líquido se prepara mezclando junto con una temperatura ambiente cerca de 13% en peso del ácido alquilbenceno-sulfónico lineal C_{10}-C_{13}, cerca de 5% en peso de alquilpoliglicósido(C_{12}-C_{14}), cerca de 10% en peso de un alcohol polietoxilato C_{13} que tiene 7 unidades EO, cerca de 6% en peso de ácido laurico, cerca de 7% en peso de ácido oleico, cerca de 5% en peso de trietanolamina, cerca de 5% en peso de propanodiol 1,2, cerca de 2% en peso de hidróxido de sodio, cerca de 1% en peso de ácido cítrico, cerca de 7% en peso de etanol, cerca de 1% en peso de ácido cítrico cerca de 7% en peso de etanol, cerca de ácido 1-hidroxietano-1,1-difosfónico y siendo el remanente agua.

El pH de la solución resultante es 8.1 (medidos como una solución acuosa al 10%). Una cantidad suficiente de la proteasa como se define en la reivindicación 6 se adiciona para producir una composición que tiene cerca de 0.5% en peso de proteasa líquida concentrada (1250 HPE/g).

Ejemplo 14

El índice KC de la proteasa F49 y, por comparación, el índice KCs de tres proteasas comerciales se determinó por el método descrito anteriormente. Se obtuvieron los siguientes resultados:

12

Ejemplo 15

1 g de lana yam se adicionó a 50 ml de una solución reguladora de carbonato de sodio que contiene F49 (pH 10.5) con una actividad proteolítica de 5.6 PU/ml y el conjunto se dejó reaccionar por 1 hora a temperatura ambiente. La cantidad de aminoácidos liberados y los péptidos luego se determinaron con TNBS (determinación del control en solución reguladora sin proteasa). El valor obtenido de lana dañada bajo estas condiciones por la proteasa BLAP se colocó a 100%. Bajo estas condiciones, la proteasa F49 tuvo un valor de 31%.

Ejemplo 16

La prueba descrita en el Ejemplo 2 se repitió utilizando 1 g de seda yam. Los siguientes valores de la seda dañada se obtuvieron:

13

Ejemplo 17

En una máquina de lavado MIELE® Electronic W 793, los artículos de ropa de lana se lavaron 9 veces a 40ºC (dureza de agua 16ºd, relación del licor 1:15) en la presencia de lavado de balasto de algodón (carga total 1.2 kg). 98 g de un detergente de color libre de enzima (prueba control), para que 49 ml de una solución BLAP 140 (prueba de comparación) o una cantidad activa a partes iguales, expresada en PU de F 49 (invención) ha sido adicionada, se utilizaron en el licor de lavado. Los tejidos de lana lavados se secaron y pedazos de dimensiones específicas se cortaron y pesaron. La reducción en peso, expresada en % del valor antes del lavado, se muestra en la siguiente Tabla:

a) Mezcla de 80% de lana Merino y 20% de poliamida

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Ejemplo 18

Ejemplo 4 se repitió utilizando calcetines grises de lana pura, la proteasas otra vez se utilizaron en cantidades de igual actividad (1080 PU/g del detergente); en contraste con el Ejemplo 4, 5 los lavados se llevaron a cabo a 60ºC. La reducción en peso fue solo del 10.7% dónde la proteasa F 49 se utilizó y 40.5% dónde BLAP® se utilizó.

Ejemplo 19

Una solución que contiene 12 g/l del sustrato (caseina o queratina) y 30 mM de tripolifosfato de sodio en agua con una dureza de 15ºdH (que contiene 0.058% en peso de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0.028% en peso de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O y 0.042% en peso de NaHCO_{3}) se calienta a 70ºC y el pH se ajusta a un valor de 8.5 por adición de NaOH 0.1 N a 50ºC 200 \mul de una solución de la enzima para ser probada en 2% en peso de solución reguladora de sodio tripolifosfato (pH 8.5) se adicionaron a 600 \mul de la solución del sustrato. La mezcla de reacción se incuba por 15 minutos a 50ºC. La reacción luego se termina por adición de 500 \mul de solución de TCA (0.44 M de ácido tricloroacético y 0.22 M de acetato de sodio en 3% por volumen de ácido acético) y enfriar (baño de hielo a 0ºC, 15 minutos). La proteína insoluble en TCA se retira por centrifugación y 900 \mul de la fase sobrenadante se diluyen con 300 \mul de NaOH 2N. La absorción de esta solución a 290 nm se determina con un espectrómetro de absorción, el valor cero de absorción tiene que ser determinado por la medición de una solución centrifugada preparada mezclando 600 \mul de la solución de TCA mencionada anteriormente con 600 \mul de la solución del sustrato mencionada anteriormente y posterior adición de la solución de enzima.

Ejemplo 20

Los tejidos de algodón pre-lavado se mancharon con cantidades iguales de lodo y aire seco por 3 días. Los vasos de laboratorio del Launderometer se llenaron con 6 muestras de tejidos manchados y de algodón sin manchas y 10 bolas metálicas (1 cm de diámetro) y se lavaron en un laundrometer Atlas tipo LP-2 por 30 minutos con una temperatura final de 30ºC, que fue alcanzada después de 4 minutos de calentamiento. Un formulación de detergente especialmente fino se utilizó para tejidos coloreados y de fácil cuidado (0.75 g/100 ml). Un detergente compacto pesado (0.5 g/100 ml) y un detergente concentrado super compacto (0.4 g/100 ml) también se utilizaron. La composición de los detergentes se describe en "Detergents y Textile Washing", G. Jacobi & A. Löhr, VCH, Weinheim, ISBN 0-89573-687-X, 1987. El agua utilizada fue 16º dH y el pH fue 4. Las actividades de la enzima de los detergentes fueron 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700, y 1000 HPE/g de detergente. Después del lavado, las muestras de tejido de prueba se enjuagaron con agua potable, aire seco, y se plancharon. El efecto de lavado enzimático se determinó por el cambio (\DeltaRem) en la remisión (%Rem) a 440 nm medidos utilizando un instrumento de medición de diferencia de color Dr. Lange Micro Color, siendo el \DeltaRem la diferencia en remisión después del lavado con la proteasa añadida y la remisión después del lavado sin proteasa. Los resultados de desempeño de lavado para varios detergentes que contienen la enzima y las composiciones de detergentes que contienen una combinación de enzimas se dan en la Tablas 2 y 3 abajo. Cada entrada es una relación de la cantidad de mutante de enzima que logra un \DeltaRem estándar, contra la cantidad de la enzima de tipo salvaje para lograr un efecto de limpieza idéntico. Una entrada de 2 indica que el doble de la enzima de tipo salvaje fue necesario como un mutante particular para lograr el mismo efecto de limpieza. Los datos también mostraron que una composición de detergente que contiene una combinación de mutantes F46 y F49 produjo un efecto de limpieza mayor que la media de las enzimas individuales.

TABLA 2 Efecto de Lavado de las Enzimas sobre Manchas de Sangre-Leche-Hollín

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TABLA 3 Efecto de Lavado de las enzimas sobre las Manchas de Huevo-Hollín

140

Ejemplo 21

Una composición similar como se describe en el ejemplo 13 se prepara excepto que la proteasa se reemplaza por la proteasa como se define en la reivindicación 7.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos patentes citados en la descripción

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\bulletHO, S.N.; HUNT, H.D.; HORTON, R.M.; PULLEN, J.K; PEASE, L.R. Gene, 1989, vol. 77, 51-59 [0073]

\bulletKAWAMURA, F.; DOI, R.A. J. Bacteriol., 1984, vol. 160, 442-444 [0075]

\bulletGORNALL, A.G.; BARDAWILL, C.S.; DAVID, M.M. J. Biol. Chem., 1948, vol. 177, 751-766 [0081]

\bulletDELMAR, E.G.; LARGMAN, C.; BRODRICK, J.W.; GEOKAS, M.C. Anal Biochem., 1979, vol. 99, 316-320

\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): APLICANTE: Wilson, Charles R

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteasas con Rendimiento de Lavado Mejorado

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Henkel Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 140 Germantown Pike, Suite 150

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Plymouth Meeting

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Pennsylvania

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 19462

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE APLICACIÓN ACTUALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE APLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE ARCHIVO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): ABOGADO/INFORMACIÓN DEL AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Drach, John E.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 32891

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: H0587

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 215-832-2215

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 215-941-6067

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 807 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5483

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: S3T, R99S, A188P, V193M, V199I

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:1:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 807 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5483

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: S3T, V41, R99G, A188P, V193M, V1991

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 807 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5483

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: S3T, V41, R99A, A188P, V193M, V1991

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 807 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5483

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: S3T, V41, R99S, A188P, V193M, V1991

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 807 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5483

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: S3T, V41, S154E, A188P, V193M, V1991

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 807 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5483

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: S3T, V41, S154D, A188P, V193M, V1991

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 807 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5483

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: S3T, V41, A188P, V193M, V1991, L211D

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 807 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5483

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: S3T, V41, R99G, A188P, V193M, V1991, L211D

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 807 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5483

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: S3T, V41, S154E, A188P, V193M, V1991, L211D

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 269 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Serina Proteasa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5843

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: F11

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 269 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Serina Proteasa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5843

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: F43

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 269 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Serina Proteasa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5843

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: F44

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 269 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Serina Proteasa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5843

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: F45

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 269 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Serina Proteasa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5843

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: F46

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 269 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Serina Proteasa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5843

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: F47

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 269 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Serina Proteasa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5843

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: F49

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 269 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Serina Proteasa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5843

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: F54

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 269 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Serina Proteasa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Bacillus lentus DSM 5843

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: F55

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen

\vskip0.400000\baselineskip

<130> H 587/876/939 PCT/EP

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 95912559.2

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1995-02-23

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 08/201120

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1994-02-24

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 08/373818

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1995-01-17

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F44

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F46

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F49

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F55

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

58

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

64

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone F55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone M130

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone M131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

75

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone M130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

77

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus lentus DSM 5483 clone M131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1727

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus licheniformis ATCC 53926

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(313)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (314)..(1450)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sigpéptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (314)..(397)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> matpéptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (626)..(1447)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1394)..(1563)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 3'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1451)..(1727)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (84)..(89)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio de restricción Ava I

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (376)..(381)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio de restricción Cla I

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (638)..(643)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio de restricción Nco I

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mis crasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (950)..(955)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio de restricción Kpn I

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mis crasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1394)..(1399)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio de restricción Kpn I

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mis crasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1558)..(1563)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio de restricción Kpn I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

81

82

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 378

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus licheniformis ATCC 53926

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

Claims

1. Una proteasa subtilisina mutante, caracterizado por al menos una alteración de aminoácido que resulta en una carga positiva reducida o un carga negativa aumentada en la región del bolsillo de unión del sustrato, en donde dicha alteración de aminoácido es L211D de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO. 22.

2. La proteasa mutante de acuerdo con la reivindicación 1, derivada de la proteasa descrita por la SEQ ID NO. 22 por la siguiente alteración del aminoácido: L211D.

3. La proteasa mutante de acuerdo con la reivindicación 1, derivada de la proteasa descrita por la SEQ ID NO. 24 por la siguiente alteración de aminoácido: L211D, preferiblemente una proteasa descrita por la SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17 o SEQ ID NO. 18.

4. La proteasa mutante de acuerdo con la reivindicación 1, derivada de la proteasa descrita por la SEQ ID NO 23 por una de las siguientes alteraciones adicionales de aminoácido: R99G, R99A o R99S.

5. Gen que codifica por un proteasa mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, preferiblemente descrita por la SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 9.

6. Gen híbrido, que comprende, en la dirección de transcripción, un promotor, un sitio de enlace ribosómico, un codón de iniciación, la principal porción de la pre-región de la SEQ ID NO. 25 ligada operablemente a una porción de una pre región y todas las pro y regiones maduras del gen respectivo de acuerdo con la reivindicación 5 seguido por la transcripción de la secuencia de terminación del gen de la proteasa SEQ ID NO. 25.

7. Plásmido capaz de una replicación en especies del género Bacillus en donde dicho plásmido lleva un gen de proteasa mutante de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Un huésped transformado del género Bacillus que comprende un plásmido de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Una célula de huésped Bacillus transformada de acuerdo con la reivindicación 8 en donde dicha célula de huésped es el Bacillus licheniformis ATCC 53926.

10. Una célula de huésped Bacillus transformada de acuerdo con la reivindicación 8 en donde dicha célula de huésped es el Bacillus subtilis.

11. Una composición de detergente que comprende al menos un agente tensoactivo y una proteasa subtilisina mutada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Una composición de detergente de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende una cantidad activa proteolíticamente de dicha proteasa mutada en donde dicha proteasa tiene un índice de actividad queracinasa/caseinasa (índice KC) inferior del 0.80, preferiblemente inferior del 0.70, por otro lado preferiblemente entre 0.2 y 0.65.

13. Una composición de detergente de acuerdo con la reivindicación 12 para el lavado de tejidos compuestos de fibras proteinogénicas.

14. Una composición de detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en donde dicha proteasa tiene una actividad proteolítica de 100 PU/g a 7500 PU/g.

15. Una composición de detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 donde dicha proteasa se codifica por la SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17 o SEQ ID NO. 18, preferiblemente SEQ ID NO. 16.

16. Una composición de detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en donde al menos dicho agente tensoactivo comprende un agente tensoactivo no-iónico seleccionado del grupo que consiste de un poliglicósido alquilo graso, un polialcoxilato alquilo graso, un polihidroxamida de ácido graso, una alquilamina grasa etoxilada, una alquilamina grasa propoxilada, un diol vicinal etoxilado, un diol vicinal propoxilado, un alquiléster de ácido graso etoxilado, un alquiléster de ácido graso propoxilado, una amida de ácido graso etoxilado, una amida de ácido graso propoxilado, y mezclas de estos.

17. Una composición de detergente de acuerdo con la reivindicación 16 en donde dicho agente tensoactivo no-iónico esta presente en una cantidad del 2% al 25% en peso.

18. Una composición de detergente de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 que además comprende un agente tensoactivo aniónico seleccionado del grupo que consiste de un alquilsulfato graso, un alquiletersulfato graso, un éster de ácido graso sulfo, una disal de ácido graso sulfo, y combinaciones de estos.

19. Una composición de detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en donde al menos dicho agente tensoactivo se comprende de un agente tensoactivo aniónico seleccionado del grupo que consiste de un alquilsulfato graso, un alquiletersulfato graso, un éster de ácido graso sulfo, una disal de ácido graso sulfo, y combinaciones de estos.

20. Una composición de detergente de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 en donde dicho agente tensoactivo aniónico esta presente en una cantidad del 2% al 25% en peso.

21. Una composición de detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 en donde dicho agente tensoactivo aniónico se selecciona del grupo que consiste de un alquilsulfato, un alquenilsulfato, un alquiletersulfato, un alqueniletersulfato en donde el grupo alquilo o alquenilo contiene de 8 a 22 átomos de carbono, preferiblemente de 12 a 18 átomos de carbono.

22. Una composición de detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21 que además comprende un constructor seleccionado del grupo que consiste de un aluminosilicato de metal alcalino, un silicato metal alcalino cristalino con un módulo superior de 1, un policarboxilato monomérico, un policarboxilato polimérico y mezclas de estos.

23. Una composición de detergente de acuerdo con la reivindicación 22 en donde dicho constructor esta presente en una cantidad del 2.5% al 60% en peso.

24. Una composición de detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 23 que además comprende del 20% al 55% en peso de un constructor inorgánico; hasta 15% en peso de un constructor orgánico soluble en agua; del 2.5% a 20% en peso de un agente tensoactivo aniónico; de 1% a 20% en peso de un agente tensoactivo no-iónico; hasta 25% en peso de un agente blanqueador; hasta 8% en peso de un activador de blanqueo; hasta 20% en peso de una sal inorgánica; de 0.4% a 1.2% en peso de enzimas, preferiblemente lipasas, cutinasas, amilasas, celulasas, pululanasas, oxidasas, peroxidasas o mezclas de estos.

25. Una composición de detergente de acuerdo con la reivindicación 24 en donde dicha sal inorgánica es un carbonato de metal alcalino, un hidrógenocarbonato de metal alcalino, o un sulfato de metal alcalino.

26. Una composición de detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 25 que adicionalmente comprende una segunda proteasa subtilisina mutante, en donde dicha segunda proteasa mutante se caracteriza por al menos una alteración de aminoácido que resulta en una carga positiva reducida o una carga negativa aumentada en la región del bolsillo de unión del sustrato, y se selecciona del grupo de las alteraciones de aminoácido R99D, R99E, R99G, R99A, R99S de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO. 22, o es una variante con las alteraciones de aminoácido S3T/V4I/S154E/A188P/V193M/V199I o S3T/V4I/S1S4D/A188P/V193M/V199I.

27. Una composición de detergente de acuerdo con la reivindicación 26 donde dicha primera proteasa mutante se codifica por la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO. 16.

28. Una composición de detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 27 donde dicha segunda proteasa mutante se codifica por la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO. 14.

29. Una composición que comprende una primera y una segunda proteasa subtilisina mutante, en donde dicha primera proteasa mutante es una proteasa mutante de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 y en donde dicha segunda proteasa mutante se caracteriza por al menos una alteración de aminoácido que resulta en una carga positiva reducida o una carga negativa aumentada en la región del bolsillo de unión del sustrato, seleccionado del grupo de las alteraciones de aminoácido R99D, R99E, R99G, R99A, R99S de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO. 22, o es una variante con las alteraciones de aminoácido S3TN41/S154EIA188P/V193M/V1991 o S3T/V41/S154D/A188P/V193M/V199I.

30. Una composición de acuerdo con la reivindicación 29 donde dicha primera proteasa mutante se codifica por la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO. 16.

31. Una composición de acuerdo con la reivindicación 29 o 30 donde dicha segunda proteasa mutante se codifica por la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO. 14.

32. Un método para el lavado de tejidos que comprende el contacto de dicho tejido con una composición de detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 28.

33. Un método para el lavado de tejidos de acuerdo con la reivindicación 32 en donde dichos tejidos son compuestos de fibras proteinogénicas.

34. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 32 o 33 para eliminar las manchas de la ropa que tiene ambas manchas de sangre y huevo.