JPH10507901A - 改良酵素とこれを含有する洗剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、洗浄剤あるいは洗剤としての改良された適用特性を有するプロテアーゼに関する。この改良は、基質中の正に帯電しているかあるいは帯電していないアミノ酸を、野生型スブチリシンプロテアーゼの結合領域と置換することにより達成される。

Description

【発明の詳細な説明】 改良酵素とこれを含有する洗剤 発明の背景 １．技術分野 本特許は、クリーニングおよび配合洗剤に含まれる野生型酵素に比較して改善 された特性を有する新規な変異たんぱく質分解酵素、該改善プロテアーゼをコー ドする核酸配列、およびこの新規なプロテアーゼをコードする核酸配列を保有す る宿主生物に関する。本発明はまた、有効な洗浄力を有する量の上記酵素を含む 新しい改良された洗剤および洗浄合成物をも網羅するものである。 ２．関連技術の説明 スブチリシン(subtilisin)は、デンプン液化バチルス(Ｂacilius amyloliquef aciens)などの土壌バクテリアにより産生される分子量２万から４万５千ダルト ンの細菌の細胞外プロテアーゼの系統のひとつである。プロテアーゼとは、たん ぱく質やペプチド基質内のペプチド結合やある種の末端エステル(terminal este r)のエステル結合の加水分解を触媒する酵素である。スブチリシンは、ペプチド （エステル）結合への求核性攻撃(necleophilic attack)を、活性部位であるセ リン残基で開始するセリンプロテアーゼのグループに属する。スブチリシンは、 物理的および化学的によく解明された酵素である。数種類のスブチリシンの三次 元構造は、Ｘ線解析解析研究により詳細に解明されている(Ｂezel,Ｃ.,Ｇ.Ｐ.,a nd Ｓanger,Ｗ.(1988)Ｅur.Ｊ.Ｂiochem,178,155-171;Ｂott,Ｒ.,Ｕltsch,Ｍ., Ｋossiakoff,Ａ.,Ｇraycar,Ｔ.,Ｋatz,Ｂ.,and Ｐower,Ｓ.(1988)Ｊ.Ｂiol.Ｃhe m.263,7895-7906;Ｇoddette,Ｄ.Ｗ.,Ｐeach,Ｃ.,Ｙang,Ｓ.Ｓ.,Ｍielenz,Ｊ.Ｒ. ,Ｂystroff,Ｃ.,Ｗilke,Ｍ.,and Fletterick,Ｒ.Ｊ.(1992)Ｊ.Ｍol.Ｂiol.228,5 80-595;Ｈeinzs,Ｄ.Ｗ.,Ｐriestle,Ｊ.Ｐ.,Ｒahuel,Ｊ.,Ｗilson,Ｋ.Ｓ.and Ｇr utter,Ｍ.Ｇ.(1991)Ｊ.Ｍol.Ｂiol.217,353-371;Ｋraut,Ｊ.(1997)Ａnnu.Ｒev. Ｂiochem.46,331-358;Ｎeidhart,Ｄ.Ｊ.,and Ｐetsko,Ｇ.Ａ.(1988)Ｐrotein Ｅ ng.2,271-276;Ｔeplyakov,Ａ.Ｖ.,Ｋuranova,Ｉ.Ｐ.,Ｈarutytunyan,Ｅ.Ｈ.,Ｖa insthtein,Ｂ.Ｋ.,Ｆrommel,Ｃ.,Ｈohne,Ｗ.Ｅ.,and Ｗilson,Ｋ.Ｓ.(1990)Ｊ. Ｍol.Ｂiol.214261-279)。このように、多 くの情報があるにもかかわらず、これらの近しく関係するスブチリシン間の構造 ／機能の違いは未だ説明されていない。 スブチリシンは、市販の製品（例えば、洗濯および食器洗い用の洗剤、コンタ クトレンズクリーナーなど）や研究目的（合成有機化学における触媒）において 広く使用されている。ある系統のスブチリシン、配合洗剤に使用される強アルカ リ性プロテアーゼは、特許出願ＷＯ 91/02792に既に記載されている。このＢaci llus lentusアルカリ性プロテアーゼ（ＢＬＡＰ）は、Ｂacillus licheniformis ＡＴＣＣ53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子プロモーターの制御下で、野生型 ＢＬＡＰ遺伝子を有する表現プラスミドで形質転換させたＢacillus Ｌichenifo rmis ＡＴＣＣ53926株を利用して商業規模の量を入手できる。ＢＬＡＰの結晶構 造は既に解明されており(Ｇoddette,Ｄ.Ｗ.,et al,(1992)Ｊ.Ｍol.Ｂiol.228,58 0-595;ＷＯ 92/21760)、同等物はthe Ｂrookhaven Ｐrotein Ｄata Ｂankに寄託 されている。別に特に記載がないかぎり、アミノ酸の位置の番号は、ＢＬＡＰ（ ２６９アミノ酸）の配列によっており、これはスブチリシンＢＰＮ’（２７５ア ミノ酸）と異なっている。配列の相同性が最大になるように並べると、以下のパ ターンが出現する。ＢＬＡＰにおけるポジション１から３５、３６から５４、５ ５から１６０、１６１から２６９が、それぞれ スブチリシンＢＰＮ’における ポジション１ から３５、３７から５５、５７から１６２、１６７から２７５に 相当する。 本発明によるプロテアーゼの変種を説明するために、以下の用語が用いられる ；［元々のアミノ酸、成熟酵素のＮ末端からの位置；置換アミノ酸］。例えば、 ＢＬＡＰのポジション４のバリンのイソロイシンによる置換は、Ｖ４Ｉとする。 アミノ酸の略字のリストを表１に示す。 ひとつのたんぱく質分子内において複数の変異がある場合は、例えばＳ３Ｔ＋ Ｖ４１；Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９１などのように、個々の変異を足し て示す。 熱および化学的な不活性化に対する予防措置および洗浄能力の改善が、技術面 および商業面での応用に向けたプロテアーゼの研究開発の主たる目的である。ス ブチリシンを含む多数の酵素はランダムおよび位置特異的な突然変異誘発で作り だされ、これらは熱および化学的安定性の改善に向けての合理的アプローチに対 する幾らかの指針となった(Ｅstell,Ｄ.Ａ.,Ｇraycar,Ｔ.Ｐ.,and Ｗalls,Ｊ.Ａ .(1985)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem,260 6518-6521;Ｍatsumura,Ｍ.,Ｂecktel,Ｗ.Ｊ.,Ｌevi tt,Ｍ.,and Ｍatthews,Ｂ.Ｗ.(1989)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 86,6562-6 566;Ｐantoliano,Ｍ.Ｗ.,Ｗhitlow.Ｍ.,Ｗood,Ｊ.Ｆ.,Ｒollence,Ｍ.Ｌ,.Ｆinze l,Ｂ.Ｃ.,Ｇilliand,Ｇ.Ｌ.,Ｐoulos,Ｔ.Ｌ.,and Ｂryan,Ｐ.Ｎ.(1988)Ｂiochem istry 27,8311-8317;Ｒussell,Ａ.Ｊ.,and Ｆersht,Ａ.Ｒ.(1987)Ｎature 328,4 96-500;Ｓiezen,Ｒ.Ｊ.,Ｄe Ｖos,Ｗ.Ｍ.,Ｌeunissen,Ｊ.Ａ.Ｍ.,and Ｄijkstra ,Ｂ.Ｗ.(1991)Ｐrotein Ｅng.4,719-737;van Ｅe,Ｊ.Ｈ.(1991)Ｃhemiseoggi(7/ 8),31-36;Ｗells,Ｊ.Ａ.and Ｅstell,Ｄ.Ａ.(1988)Ｔrends Ｂiochem.Ｓci.13,2 91-297)。酵素活性の調節、特に速度増大や基質サブセットに対する最適化は、 かなり難解な問題である。ＥＰ0260105は、 catalytic triadの１５Ａ内の特定のアミノ酸残基を変えることによってtranses terfication速度／加水分解速度比率とnucleophile specificityが変更されたス ブチリシンＢＰＮ’変異株の作成を教授している。Ｒussell,Ａ.Ｊ.and Ｆersht ,Ａ.Ｒ.(1987)Ｊ.Ｍol.Ｂiol.193:803-813は、活性部位の１４Åから１５Åに表 面電荷が変っているスブチリシンＢＰＮ’変異株(Ｄ099Ｓ)を教授している。こ の置換は、スブチリシンの触媒反応におけるｐＨ依存性に影響を与えるものであ る。これらの発表のどちらも、プロテアーゼの洗浄能力の改善につながるアミノ 酸の置換を予測する方法を教授していない。ＥＰ0130756、ＥＰ0247647、ＵＳ4, 7609,025は、スブチリシンＢＰＮ’において、アミノ酸残基(ＢＰＮ’numbering )Ａｓｐ３２、Ａｓｎ１５５、Ｔｙｒ２１７、Ｍｅｔ２２２、Ｇｌｙ１６５、Ｈ ｉｓ６４、Ｓｅｒ２２１、Ｇｌｙ１６９、Ｇｌｕ１５６、Ｓｅｒ３３、Ｐｈｅ１ ８９、Ｔｙｒ２１７、および／またはＡｌａ１５２の一つまたは複数の変異を引 き起こすsaturation mutation methodを教授している。このアプローチを使用し て、酸化安定性が改善され、異なる基質特異性、および／または異なるｐＨ活性 を有する変異プロテアーゼを得ることができる。これらの発表はまた、プロテア ーゼの活性部位領域内での変異は活性に影響を与える可能性が高いことを教授す るものである。しかし、ＥＰ0130756、ＥＰ0247647、ＵＳ4,7609,025はいずれも 、プロテアーゼの洗浄能力の改善につながるアミノ酸の置換を予測する方法を教 授していない。 スブチリシンの触媒活性についての情報の大半は、構成の判明している小さい ペプチド基質の加水分解について調査することにより収集されたものである。こ れに対して大きなたんぱく質基質との相互作用については、ほとんどわかってい ない。基質がテキスタイルの表面に付着し、ブリーチ、tensides,ビルダーなど の干渉成分の存在下で触媒反応が起きる場合などは特にわかっていない。 ＥＰ0328229は、洗浄テストの結果に基づく洗濯用洗剤としての特性が改善さ れているＰＢ92スブチリシン変異体の単離および特性指摘を教授している。これ は、洗浄における酵素の能力を予測する場合は、生物化学的特性は信頼できるパ ラメーターではないことを教授する。変異体の選別方法のは、アミノ酸を同じカ テゴリー（極性、非極性、芳香族、帯電、脂肪族、中性）に属する他のアミノ酸 で置換、極性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸を帯電アミノ酸で置 換、そして活性部位以外の部位でのプロテアーゼのアニオン特性を増大させるこ とが含まれる。変更すべきアミノ酸を決定する方法は教授されていない。特許出 願ＷＯ91/00345（ノボノルディスク社）は、スブチリシンＣarlsbergとスブチリ シン３０９の等電点を、この酵素が使用されると想定される洗濯溶液のｐＨに合 うように修飾することにより、スブチリシンの洗浄能力を改善する方法が教授さ れている。しかし、ヨーロッパ諸国における洗濯状況下では、強アルカリ性スブ チリシンは洗剤のｐＨと非常に近いｐＩを有するため、この手法では明らかな利 点はない。ＷＯ91/00345はまた、catalytic triadから１５Åを越えるアミノ酸 を変えることにより酵素の反応速度特性を変化させられることを教授している。 スブチリシン３０９に存在する２６９のアミノ酸のうち１１６の異なるアミノ酸 が、酵素の総電荷を変化させるために置換、付加、削除できる可能性のある対象 としてあげられている。 ＷＯ92/11357（ノボノルディスク社）は、スブチリシン分子のｐＨ依存性電荷 を減少させることによりスブチリシンのｐＨ安定性が増大、洗浄力が改善される ことを教授する。このことは、一定のｐＨ範囲において実質的に電荷の一定を実 現するための突然変異の導入を意味する。好ましくは、ｐＨ範囲７から１１にお いて総電荷の変化をほぼ無くす。ヨーロッパ特許出願Ｎo.057049Ａ1は、変異た んぱく質分解酵素を開示している。これらの酵素は、ＰＢ９２セリンプロテアー ゼのアミノ酸配列と少なくとも７０％のホモロジーを有し、ＰＢ９２ seringプ ロテアーゼ中の９９、１０２、１１６、１２６、１２７、１２８、１３０、１６ ０、２０３、２１１、および２１２に相当する少なくとも一つのアミノ酸が異な るとされている。意図される変異プロテアーゼを製造するために、ＤＮＡからな り変異プロテアーゼをコードする表現ベクターで形質転換された微生物宿主株を 成育させて変異プロテアーゼが作成される。 洗剤および洗浄補助剤(washing aid)中で使用するために提案される本発明の プロテアーゼは、強いたんぱく質分解活性を有するものが選択された。特異性が 低いため、このプロテアーゼによる繊維の損傷や繊維の破壊は、特に例えばシル クやウールのシート形のテキスタイルなどたんぱく質原性繊維でできたファブ リックを繰り返し洗う場合に起こりうる。一方、プロテアーセ活性が少しでも低 下すると、洗剤の使用者が気付くほどの洗浄力の低下を引き起こす。したがって 本発明にかかる課題は、実質的には同じ洗浄力があり、たんぱく質原性繊維、よ り限定的にはウール、に対する活性が低いプロテアーゼ含有洗剤を開発すること である。本発明にかかるもうひとつの課題は、布についた卵や血液などの特定の 染みを除去する汚れに特異的なプロテアーゼおよび、このような汚れ特異的プロ テアーゼを含有する配合洗剤の開発である。 発明の要旨 本発明によるプロテアーゼ変異体が由来するところの野生型プロテアーゼは、 ２６９のアミノ酸残基と２６，８２３ダルトンの分子量を有し、標準ｐＫ値に基 づく計算による等電点が９．７のＤＳＭ５４８３から得られるＢacillus lentus アルカリ性プロテアーゼ（ＢＬＡＰ）である。ＢＬＡＰの遺伝子は、Ｂ.lentus ＤＳＭ５４８３の染色体ＤＮＡより単離し、Ｂ.lentusのプロテアーゼをコード する領域のputative ＤＮＡ配列のＤＮＡプローブを作成し、単離した染色体Ｄ ＮＡから遺伝子ライブラリーを作成し、プローブに対するハイブリダイゼーショ ンで目的の遺伝子についてライブラリーをスクリーニングすることで得られる。 熱および表面安定性が改善されたＢ.lentus ＤＳＭ５４８３プロテアーゼ変異 体は、１９９１年５月２９日に提出された特許出願Ｓerial Ｎo,07/706,691中に 記載されている。一般に、本発明に記載の突然変異は、野生型のＢＬＡＰに以下 のアミノ酸置換を導入する；Ｓ３Ｔ、Ｖ４１、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、および Ｖ１９９１（番号はＢＬＡＰ配列による）。 テキスタイル上の大きな分子のたんぱく質基質へのプロテアーゼの結合につい ての研究の結果、基質結合部位に近接する位置にあるアミノ酸の電荷が重要であ ることを示した。プロテアーゼの基質結合ポケット領域内において、プラスに帯 電したアミノ酸残基を除去またはマイナスに帯電したアミノ酸残基を導入するこ とで、野生型よりも高い洗浄力が得られることが示されたといえる。 本発明はまた、ウールなどのたんぱく質原性繊維からなるファブリックを、こ れらの繊維を損なう原因となることなく、洗うための洗剤合成物に関する。該洗 剤は、少なくとも１種類の表面活性剤とたんぱく質分解活性を発揮する量でkera tinase/caseinase活性比が少なくとも約０．８０のプロテアーゼからなる。 本発明の他の局面は、血液や卵等のシミそして特にこれらのシミが組み合わさ れたものをファブリックから除去するのに特に有効な洗剤成分に関する。この洗 剤は、Ｂacillus lentus ＤＳＭ５４８３変異体であるプロテアーゼの組み合わ せと少なくとも１種類の表面活性剤から構成される。 図面の簡単な説明 図１は、酵素に結合した合成基質ＡＡＰＦとの野生型ＢＬＡＰの基質結合領域 のモデルである。結合基質との関係におけるアルギニン９９、セリン１５４、お よびロイシン２１７の位置が示されている。 図２は、Ｂacillus licheniformls ＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼ遺伝子と Ｂacillus lentus ＤＳＭ５４８３ＢＬＡＰ遺伝子のハイブリッド遺伝子フュー ジョンを含む大腸菌プラスミドｐＣＢ１３Ｃの制限酵素切断マップを示す。ＡＴ ＣＣ５３９２６のプロモーター、リボソーム結合部位およびpresequence（５３ ９２６）は、proおよびmature ＢＬＡＰ遺伝子に融合された。ＡＴＣＣ５３９２ ６の転写ターミネータ（Ｔ−５３９２６）がＢＬＡＰのコード配列に付与されて いる。 図３は、実施例２で検討されるＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺 伝子のＮ末端領域由来のＡｖａＩ／ＣｌａＩフラグメントのＤＮＡ配列を示す。 このフラグメントには、putativeプロモーター、リボソーム結合部位、開始コド ン、およびpre sequenceの大半が含まれる。この２９２塩基対のフラグメントの 、それぞれ５’および３'末端はＡｖａＩおよびＣｌａＩ制限酵素切断部位とな る。 図４は、ｐＭａｃ５−８に由来しＢＬＡＰ遺伝子を含有する大腸菌プラスミド ｐＭｃ１３Ｃの制限酵素切断地図である。ｐＭｃ１３Ｃ中のアンピシリン耐性（ Ａｐ^R）遺伝子には、これを不活性化するanmber mutationを有している。このプ ラスミドは、さらにクロラムフェニコール耐性（Ｃｍ^R）もコードしている。 図５は、ＢacillusプラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３１の制限酵素切断地図で、Ｂ ＬＡＰ変異体Ｍ１３１をコードする遺伝子を含有する。図２でｐＣＢ１３Ｃにつ いて記載されているように、含まれるのはＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼとＢ ＬＡＰのハイブリッドフュージョンである。また、５３９２６アルカリ性プロテ アーゼ遺伝子の転写停止配列も存在している。これは、カナマイシン耐性をコー ドするｐＵＢ１１０を基にするプラスミドである。 図６は、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミド ｐＵＢ１１０に由来するＢａｃｉｌｌｕｓプラスミドｐＨ７０の制限酵素切断地 図を示す。プロテアーゼ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントが、 ｐＵＢ１１０のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ切断位置の間にクローニングされている 。このプラスミドは、実施例３、突然変異プロテアーゼ遺伝子のクローニング、 において検討されている。プラスミドｐＨ７０は、カナマイシン耐性をコードす る。 図７は、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含有するプラス ミドｐＢＣ１６に由来するＢacillusプラスミドｐＣ５１の制限酵素切断地図を 示す。プロテアーゼ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩが、プラスミドｐ ＢＣ１６上のＥｃｏＲＩ切断位置およびＢａｍＨＩ切断位置の間にクローニング されている。このプラスミドは、実施例３、突然変異プロテアーゼ遺伝子のクロ ーニング、において検討される。プラスミドｐＣ５１は、テトラサイクリン耐性 をコードする。 図８は、ＢＬＡＰ変異体Ｍ１３１の遺伝子をコードするＢacillusプラスミド ｐＢＣ５６Ｍ１３１の制限酵素切断地図を示す。図２でｐＣＢ１３Ｃについて説 明されているように、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子とＢＬ ＡＰ遺伝子間のハイブリッドフュージョンが含まれる。また、ＡＴＣＣ５３９２ ６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の転写停止配列も含まれる。これは、テトラサ イクリン耐性をコードするｐＢＣ１６を基としたプラスミドである。 図９は、ＢＬＡＰのトリプシン消化により得られるペプチドを示す。ＢＬＡＰ (ｌ/ｍｇ/ｍｌ)は、１．６Ｍ尿素、０．１６Ｍ ＮＨ₄ＨＣＯ₃中でトリプシン（ １ｍＭ ＨＣｌ中１％、ｗ／ｗ）で摂氏３７度で１０分間消化された。次いでサ ンプ ルを、１０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＣＡ）で最終的に１％ＴＣＡ濃度 となるまで酸性化した。実施例８に記載されるように、１０μｌのサンプルをＨ ＰＬＣカラムに注入してペプチドを分離した。トリプシン消化ペプチドは、以下 のＢＬＡＰ配列に相当する。フラグメント＃１−Ａｌａ１からＡｒｇ１０；フラ グメント＃２−Ｖａｌ１１からＡｒｇ１９；フラグメント＃３−Ｇｌｙ２０から Ｌｙｓ２７；フラグメント＃４−Ｖａｌ２８からＡｒｇ４４；フラグメント＃５ −Ｇｌｙ４５からＬｙｓ９２；フラグメント＃６−Ｖａｌ９３からＡｒｇ９９； フラグメント＃７−Ｇｌｙ１００からＡｒｇ１４３；フラグメント＃８−Ｇｌｙ １４４からＡｒｇ１６４；フラグメント＃９−Ｔｙｒ１６５からＡｒｇ１８０； フラグメント＃１０−Ａｌａ１８１からＬｙｓ２２９；フラグメント＃１１−Ｇ ｌｎ２３０からｌｙｓ２３１；フラグメント＃１２−Ａｓｎ２３２からＡｒｇ２ ４１；フラグメント＃１３−Ａｓｎ２４２からＬｙｓ２４５；およびフラグメン ト＃１４−Ａｓｎ２４６からＡｒｇ２６９。 微生物の寄託 プラスミドｐＢＣ５６Ｍ１３１を持ったＢacillus licheniformisは、ＡＴＣＣ ６８６１４として寄託されている。プラスミドｐＭＣ１３Ｃを持ったＥscherici a coli ＷＫ６は、ＡＴＣＣ６８６１５として寄託されている。プラスミドｐＣ Ｂ１３Ｃを持ったＥschericia coli ＧＭ３３は、ＡＴＣＣ６８６１６として寄 託されている。プラスミドｐＭａ５−８を持ったＥschericia coli ＷＫ６は、 ＡＴＣＣ６８６１７として寄託されている。プラスミドｐＭｃ５−８を持ったＥ schericia coli ＷＫ６は、ＡＴＣＣ６８６１８として寄託されている。 好ましい実施態様の説明 本発明の一つの局面は、アミノ酸置換を選択する方法とその結果として得られ る洗浄能力の改善された突然変異プロテアーゼに関する。洗浄力の改善は、酵素 の基質結合ポケットの領域内にマイナス荷電の増大となるようなアミノ酸置換を おこなうことによってえられる。本発明によれば、これはプロテアーゼの基質結 合ポケットの領域において、ＡＡＰＦなどのような結合基質分子の７Ａ以内に、 マイナスに帯電したアミノ酸残基数を増加させるかプラスに帯電したアミノ酸残 基数を減少させることでおこなうことができる。特に、Ｂacillus lentusアルカ リ性プロテアーゼ(ＢＬＡＰ)変異体Ｍ１３０およびＭ１３１の中のポジション９ ９、１５４、および２１１におけるアミノ酸置換は、酵素の洗浄力を向上させる ことが証明されている。 本発明の第二の局面は、実験テストにおいて野生型のプロテアーゼよりも高い 洗浄力をもつたんぱく質分解酵素変異体に関する。本発明に記載されるこの変異 は、以前に、１９９１年５月２９日に申請された特許出願Ｓerial Ｎo.07/06,69 1に記載されているＢＬＡＰ変異体Ｍ１３０およびＭ１３１に導入するものであ る。Ｍ１３０およびＭ１３１のどちらも、野生型のプロテアーゼよりも高い安定 性を有することが証明されている。変異体Ｍ１３０は、４つのアミノ酸置換、す なわちＳ３Ｔ、Ａ１８８Ｐ／Ｖ１９３Ｍおよび１９９Ｉを有する。変異体Ｍ１３ １は、５つのアミノ酸ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ、すなわち、Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ａ１ ８８Ｐ、Ｖ１９３ＭおよびＶ１９９Ｉを有する。好ましいプロテアーゼを決める ために使用されたシステムでは、よく使用される１文字によるアミノ酸コードを 使用し、まず番号付与したポジションにmature formのＢＬＡＰのアミノ酸残基 を全てリストアップし、次いでアミノ酸の置換をおこなう。Ｍ１３０およびＭ１ ３１のアミノ酸配列は、それぞれ１９９１年５月２９日に提出された特許出願Ｓ erial Ｎo.07/706,691に添付されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。Ｍ１３０およびＭ１３１のどちらも、より洗浄力の高い プロテアーゼを得るためにさらなるアミノ酸置換を行うための土台として使用さ れた。本発明による変異プロテアーゼは、変異プロテアーゼＭ１３０またはＭ１ ３１のアミノ酸残基の少なくともひとつを置換することにより得られるものであ り、ここにおいて、置換されるアミノ酸残基はポジション９９のアルギニン、ポ ジション１５４のセリン、およびポジション２１１のロイシンからなるグループ から選択される。表２は、本発明において特許請求されるＢＬＡＰ変異プロテア ーゼを示し、Ｆ１１、Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ４７、Ｆ４９、Ｆ５ ４およびＦ５５を含む。例えば表２に記載されるＦ１１は、Ｍ１３０に由来し、 Ｍ１３０に存在する他の変異、すなわちポジション３のセリンがスレオニン で置換（Ｓ３Ｔ）、ポジション１８８のアラニンがプロリンで置換（Ａ１８８Ｐ ）、ポジション１９３のバリンがメチオニンで置換（Ｖ１９３Ｍ）、ポジション １９９のバリンがイソロイシンで置換（Ｖ１９９Ｉ）、のほかにポジション９９ のアルギニンがセリンで置換されている（Ｒ９９Ｓ）。その他の変異プロテアー ゼについては、Ｆ４３からＦ４９は、Ｍ１３１に由来する。変異体Ｆ５４とＦ５ ５は、変異体Ｆ４９に由来する。好ましいたんぱく質分解酵素Ｆ１１、Ｆ４３、 Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ４７、Ｆ４９、Ｆ５４およびＦ５５のアミノ酸配列 は、それぞれ本出願のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記 載される。 本発明の他の局面は、表２に一覧される変異プロテアーゼをコードする遺伝子 に関する。本発明の全ての変異プロテアーゼの遺伝子構造は、実施例２において 詳細に記載される。いずれの場合にも、アミノ酸置換を起こす突然変異は既知の 手法を用いて行う。上記されたプロテアーゼＦ１１、Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、 Ｆ４６、Ｆ４７、Ｆ４９、Ｆ５４およびＦ５５の成熟型をコードするＤＮＡ配列 。上記にあげた変異プロテアーゼのひとつをコードする各ハイブリッド遺伝子は 、転写の方向に、プロモーター、リボゾーム結合部位および開始コドンとＢＬＡ Ｐ遺伝子変異体のproおよびmature領域の全てとpre領域の一部とoperablyに結合 したＢ.licheniformis ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のpre regionの主要部分、これに続くＡＴＣＣ５３９２６のアルカリ性プロテアーゼ 遺伝子に対する転写停止配列から構成される。ハイブリット遺伝子は、宿主の染 色体内に組み込むことも、選択したＢacillus株中で複製されるプラスミドに挿 入することもできる。特にＢacillusサブチリスの菌株においてプロテアーゼを 生産する場合はプラスミドｐＵＢ１１０またはｐＵＢ１１０由来のプラスミドが 選択、およびＢ.licheniformisの菌株でプロテアーゼを生産する場合はプラスミ ドｐＢＣ１６またはこれに由来するプラスミドが選択される。ハイブリッド遺伝 子を含むプラスミドで形質転換されたＢacillus株を適当な培地で成育させるこ とにより変異プロテアーゼが生産される。 本発明のもうひとつの局面は、少なくとも１種類の表面活性化剤と、たんぱく 質分解活性を有する量の、およそ０．８未満、好ましくはおよそ０．７未満、よ り好ましくはおよそ０．２からおよそ０．６５の範囲のケラチンナーゼ／カゼイ ナーゼ活性比（以下ＫＣ比とする）を有するプロテアーゼを含有する。 洗剤は、好ましくはおよそ１００ＰＵ/ｇからおよそ７５００ＰＵ/ｇの範囲の たんぱく質分解活性を有するものとする。 本発明は、またおよそ０．８未満、好ましくはおよそ０．７未満、より好まし くはおよそ０．２からおよそ０．６５の範囲のＫＣ比を有するプロテアーゼを、 たんぱく質原性の繊維からなるテキスタイルまたは少なくとも一部がたんぱく質 原性の繊維から成るテキスタイルの洗濯に使用することに関する。 ＫＣ比は、二種類の異なる基質、カゼインとケラチンに関するプロテアーゼの 活性にも関する。 カゼインを基質とした場合、記載の測定条件下にて吸光値が0.500 ＯＤとなる プロテアーゼ溶液のたんぱく質分解活性を、１ｍｌあたり１０ＰＵ（プロテアー ゼ単位）と定義する。プロテアーゼを含有する洗剤を使用する者が認める洗浄結 果は、ＰＵで表されるこの活性と相関する。たんぱく質原性繊維に対する認めら れた損傷は、一定の洗浄結果に対するＫＣ比と相関する。 上記の課題に鑑みて予想されるように、市販のプロテアーゼの場合、カゼイン とケラチンに対する活性の差はほんの僅かしか認められず、ＫＣ比は比較的１に 近い。たんぱく質原性繊維に対する損傷があまり認識されない程度にするために 、ＫＣ比が０．８０未満のプロテアーゼを使用する必要があることが分かる。 驚くべきことだが、上記の特性を有するプロテアーゼは、特定の他の洗剤成分 に相乗的に作用すること、および反対にプロテアーゼのたんぱく質分解活性が特 定の他の洗剤成分によって相乗的に高められていることが見いだされた。これら の作用は、特に、本発明による合成物成分中の表面活性剤成分に非イオン系表面 活性剤、soil-release copoyester（より詳細には、テレフタル酸ユニットを有 するもの）、非水溶性有機ビルダー、水溶性無機および有機ビルダー（より詳細 には酸化炭水化物）、硫酸塩およびスルホン酸塩型の合成アニオン系表面活性剤 、を含む場合に起きるが、アルキルベンゼンスルホン酸塩の場合はそんなに強い 作用ではない。本発明による洗剤は、好ましくはその特性が増強されたものまた はこれがプロテアーゼの特性を増強する成分を含む。 本発明にしたがって使用するに適当なプロテアーゼは、遺伝子工学で作成され たＢacillus lentus ＤＳＭ５４８３の変異体を含む。これらの変異体は、１９ ９４年２月２４日に提出された米国特許出願serial number 08/201,120に述べら れる方法に従って作成することができ、この出願の内容全ては、参考文献として 、本出願および米国特許番号5,340,735に取り入れられている。Ｂacillus lentu s ＤＳＭ５４８３（ＢＬＡＰ）の好ましい変異体は、実施例２の表２に一覧する 。 表２に関して、変異体の同定に使用するシステムは、米国特許番号5,340,735 で使用されたものと同じもので、そこにおいて説明されている。例えば、変異体 Ｆ４９は、Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ＋Ｌ２１１Ｄ と同定される。このようなプロテアーゼは、ポジション３のセリン残基がスレオ ニンで置換、ポジション４のバリンがイソロイシンで置換、ポジション１８８の アラニン残基がプロリンで置換、ポジション１９３のバリン残基がメチオニンで 置換、ポジション１９９のバリン残基がアスパラギン酸で置換されたＢacillus lentus ＤＳＭ５４８３変異体である。野生型のＢＬＡＰプロテアーゼのアミノ 酸配列は、米国特許番号5,340,735のシークエンスＩＤ番号５２として記載され ている。 Ｂacillus Ientus ＤＳＭ５４８３変異体には、血液のシミに選択的な活性を 示すものもあれば、卵のシミに選択的な活性を示すものもある。血液と卵のシミ をファブリックから除去するに特に有効な変異体は、野生型のＢacillus lentus ＤＳＭ ５４８３たんぱく質に以下の置換を起こすことで作成された変異体で ある、すなわちＲ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ、Ｓ１５４Ｄ、Ｓ１５４Ｅ、Ｌ２ ２１ＤおよびＬ２２１Ｅである。９９と１５４の位置のアミノ酸置換を有する変 異体は、血液のシミの除去に特に有効である。２２１の位置にアミノ酸置換を有 する変異体は、卵のシミの除去に特に有効である。ポジション９９と１５４に置 換アミノ酸を有する変異酵素と、ポジション２２１に置換アミノ酸を有する変異 酵素は、血液と卵のシミの組み合わせを除去するに特に有効である。 本発明の他の局面は、血液や卵のようなシミの組み合わせをファブリックから 除去するにとくに有効な洗剤合成物に関する。この洗剤は、Ｂaciillus lentus ＤＳＭ５４８３変異体であるプロテアーゼの組み合わせ、非イオン系表面活性剤 、アニオン系表面活性剤、石鹸、またはこれらの表面活性剤の組み合わせから なる。プロテアーゼの組み合わせには、上記の表に一覧されるＢacillus lentus ＤＳＭ５４８３変異体の二種類以上の全ての組み合わせが含まれる。血液と卵 のシミからなるシミを除去するに特に好ましい組み合わせは、Ｆ46＋Ｆ49である 。 一つの好ましい実施態様において、本発明による洗剤は、脂肪族アルキルポリ グルコシド類、脂肪族アルキルポリアルコキシレート類、更に詳細にはエトキシ レートおよび／またはプロポキシレート類、脂肪族ポリヒドロキシアミド類、お よび／または脂肪族アルキルアミン類のエトキシル化および／またはプロポキシ ル化産物、vicinal diol類、脂肪族アルキルエステルおよび／または脂肪族アミ ド類およびこれらの混合物を、さらに詳細には、重量比で２％から重量比で２５ ％までの量で含む。 他の好ましい実施態様においては、本発明による洗剤は、硫酸塩および／また はスルホン酸塩型の合成アニオン系表面活性剤、さらに詳細には脂肪族アルキル 硫酸塩、脂肪族アルキルエーテル硫酸塩、スルホ脂肪酸エステルおよび／または スルホ脂肪酸二塩を、さらに詳細には重量比で２％から重量比で２５％までの量 で含有する。アニオン系表面活性剤は、好ましくは、アルキルまたはアルケニル 基が８から２２個の炭素原子を有し、さらに好ましくは１２から１８個の炭素原 子を有するアルキルまたはアルケニル硫酸塩類および／またはアルキルまたはア ルケニルエーテル硫酸塩類から選択される。 他の好ましい実施態様において、本発明による洗剤は、水溶性および／または 非水溶性ビルダー、さらに詳細には、アルカリ金属alumosilicate、モジュール が１未満の結晶アルカリ金属ケイ酸塩、単量体のポリカルボン酸塩、重合ポリカ ルボン酸塩およびこれらの混合物から選択されるビルダーを、さらに詳細には重 量比で２．５％から重量比で６０％までの量で含有する。 ウールまたはシルクの生地の洗濯を目的とする、本発明の洗剤の別の、多少好 ましさは劣るが、実施態様においては、過酸化物を基にした漂白剤、さらに詳細 には過酸化水素、アルカリ金属perborate tetrahydrate、アルカリ金属perborat e monohydrateおよび／またはアルカリ金属percabonateを、さらに詳細には重量 比で５％から重量比で７０％までの量で、および任意洗濯で漂白剤活性化剤を、 さらに詳細には重量比で２％から重量比で１０％までの量で含有す る。 最後に、本発明による洗剤の別の実施態様においては、ジカルボン酸およびグ リコールのコポリエステルに基づくsoil-release剤を、特に重量比で０．０１％ から重量比５％までの量で含有する。これらのsoil-release剤は、ジカルボン酸 ユニット、アルキレングリコール、ポリアルキレングルコールユニットを含有す るコポリエステルで、その化学的類似性から特にポリエステル繊維に対して有効 であるが、また他の材質のファブリックで要求される効力を開発可能である。こ のタイプのsoil-relaseコポリエステルおよび洗剤中におけるその使用は、しば らく以前から知られている。 本発明による洗剤合成物は、石鹸を含む少なくとも一種類の表面活性剤を含有 する。この表面活性剤は、非イオン系またはアニオン系表面活性剤または非イオ ン系とアニオン系表面活性剤の組み合わせ、非イオン系およびアニオン系表面活 性剤と一種類以上の石鹸との組み合わせである。 適当な非イオン系表面活性剤にはalkoxylate、さらに詳細には炭素原子数１０ から２２、好ましくは炭素原子数１２から１８の飽和またはモノ−からポリ不飽 和直鎖または分岐型アルコールのethoxylateおよび／またはpropoxylateが含ま れる。アルコールのalkoxylationの程度は、一般に１から２０、好ましくは３か ら１０の間である。これらは、相当するアルコールを相当するalkylene oxideで 反応させることにより既知の方法で得られる。脂肪族アルコールの誘導物は特に 適当であるが、分岐鎖異性体、より詳細にはいわゆるoxoalocoholを使用して有 用なalkoxylateを作ることができる。したがって、直鎖基、より詳細にはdodecy l、tetradecyl、hexadecylまたはoctadecyl基およびこれらの混合物、を有する 第１アルコールのalkoxylate、詳細にはethoxylteが使用できる。さらに、アル キル基に関して上記したアルコールに相当するアルキルアミン、vicinaldiolお よびカルボン酸アミドの相当するalkoxylation産物も適当である。本発明による 洗剤に入れるに適当なアルキルポリグルコシドは、一般式（Ｇ）_n−ＯＲ¹に相当 する化合物であり、該式においてＲ¹は炭素原子数８から２２のアルキルまたは アルケニルラジカル、Ｇはグルコースユニット、ｎは１から１０の数値である。 グルコシド成分（Ｇ）_nは、自然に存在するアルドースまたはケトース モノマーのオリゴマーまたはポリマーで、特にグルコース、マンノース、フラク トース、ガラクトース、talose、gulose、altrose、allose、idose、リボース、 アラビノース、キシロース、lyxoseを含む。このようなグルコシドの結合したモ ノマーからなるオリゴマーは、その中にある糖のタイプで分類される以外に、そ の数、いわゆるオリゴメリゼーションの度合いで分類される。分析で測定される 量として、オリゴメリゼーションの度合いｎは、一般的に１から１０のbroken n umberで、好ましく使用されるグルコシドの場合は、１．５未満、さらに好まし くは１．２から１．４の間の値である。グルコースは、入手が容易であることか ら、好ましいモノマーユニットである。グルコシドのアルキルまたはアルケニル 置換体Ｒ¹もまた、好ましくは補充可能な原材料からなる容易に入手できる誘導 体、さらに好ましくは脂肪族アルコールから生成するが、これらの分岐鎖isomer 、さらに詳細にはいわゆるoxoalcoholも有用なグルコシドの製造に使用すること ができる。したがって直鎖オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサ デシル、またはオクタデシル基およびこれらの混合物を有する第１アルコールお よびこれらの混合物は特に適当である。特に好ましいアルキルグルコシドには、 ある種のcocofatty alkyl group、すなわち、基本的にＲ¹がドデシルおよびＲ¹ がテトラデシルの混合物がある。 本発明による洗剤に含まれる非イオン系表面活性剤は、好ましくは重量比で１ ％から重量比で３０％まで、さらに好ましくは重量比で１％から重量比で２５％ までの量である。 非イオン系表面活性剤に加え、またはこれに代わり、本発明による洗剤は、他 の表面活性剤、好ましくは硫酸塩またスルホン酸塩型の合成アニオン系表面活性 剤を、洗剤を１００として、好ましくは重量比で２０％未満さらに好ましくは重 量比で０．１％から１８％までの量で含んでもよい。本発明の洗剤中での使用に 特に適している合成アニオン系表面活性剤は、アルカリ金属、アンモニウムまた はアルキルまたはヒドロキシアルキル置換アンモニウムイオンを対イオンとして 含有する炭素原子数８から２２のアルキルおよび／またはアルケニル硫酸塩であ る。炭素原子数１２から１８の脂肪族アルコールおよびこれの分岐鎖アナログ、 いわゆるオキソアルコールは好ましい。アルキルおよびアルケニル硫酸塩は、相 当するアルコール成分を典型的な硫酸塩化剤さらに詳細には三酸化イオウまたは クロロスルホン酸、と反応させ、次いでアルカリ金属、アンモニウムまたはアル キル−またはヒドロキシルアルキル置換アンモニウム塩基で中和することによる 既知の方法で作成できる。これらのようなアルキルおよび／またはアルケニル硫 酸塩は、好ましくは本発明による洗剤中に重量比で０．１％から重量比で２０％ まで、さらに好ましくは重量比で０．５％から重量比で１８％までの間の量で含 まれる。 硫酸塩型の適当な表面活性剤には、上記アルコールのアルコキシル化産物、い わゆるエーテル硫酸塩が含まれる。これらのエーテル硫酸塩は、好ましくは一分 子あたり２から３０、さらに好ましくは４から１０のグリコール基を有する。ス ルホン酸塩型の適当なアニオン系表面活性剤には、脂肪酸エステルを三酸化イオ ウと反応させ次いで中和することによって得られるα-スルホエステル、さらに 好ましくは、Ｃ_8-22さらに好ましくははＣ_12-18脂肪酸およびＣ_1-6好ましくはＣ_1-4 直鎖アルコールに由来するスルホン化産物および、formalけん化中にこれら のスルホン化産物から生じるスルホ脂肪酸が含まれる。 この他の考えられる表面活性剤成分には石鹸が含まれるが、適切な石鹸はラウ リル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、またはステアリン酸の塩など飽和脂肪酸 石鹸、および例えばココナツ油、パーム種油、または獣脂の脂肪酸などのような 自然の脂肪酸混合物である。重量比でその５０％から重量比で１００％が飽和Ｃ_12-18 脂肪酸石鹸からなり、オレイン酸石鹸が重量比で５０％以下である石鹸混 合物が特に好ましい。石鹸含有量は、好ましくは重量比で０．１％から重量比で ５％までである。しかし、特定の液体石鹸においては、重量比で２０％以下の石 鹸を含有してもよい。 本発明による洗剤は、好ましくは重量比で２０％から重量比で５５％までの水 溶性および／または非水溶性、有機および／または無機ビルダーを含有する。水 溶性有機ビルダーには、特に、ポリカルボン酸のクラス、さらに詳細にはタエン 酸およびsugar acidのもの、および重合（ポリ）カルボン酸のクラス、さらに詳 細にはポリサッカライドの酸化により得られるポリカルボン酸塩、重合アクリル 酸、メタクリル酸、マレイン酸、および共重合体でカルボン酸基を有さない重合 可能な物質がまだ少量含まれるこれらの共重合体が含まれる。遊離の酸での計算 で、不飽和カルボン酸のホモ重合体の相対分子量が一般的に5,000から200,000の 範囲であるのに対して、共重合体の相対分子量は2,000から200,000の範囲、好ま しくは50,000から120,000である。特に好ましいアクリル／マレイン酸共重合体 の相対分子量は、50,000から100,000の範囲である。適当であるが好ましさが少 し劣る、このクラスの化合物は、アクリル酸またはメタクリル酸とビニルメチル エーテルなどのビニルエーテルとの共重合体、ビニルエステル、エチレン、プロ ピレン、およびスチレンで、ここにおいて酸が重量比で少なくとも５０％を占め ている。他の適当な水溶性有機ビルダーは、二つのカルボン酸および／またはこ れらの塩をモノマーとして、ビニルアルコールおよび／またはビニルアルコール 誘導体または炭水化物を三番目のモノマーとして含有するterpolymerである。一 つ目の酸性モノマーまたはその塩は、エチレン基をひとつ有する不飽和Ｃ_3-8カ ルボン酸から誘導される塩で、好ましくはＣ_3-4モノカルボン酸誘導体、さらに 好ましくは（メタ）アクリル酸誘導体である。二つ目の酸性モノマーまたはその 塩は、Ｃ_4-8ジカルボン酸誘導体、好ましくはＣ_4-8ジカルボン酸で、マレイン酸 が特に好ましい。この場合、三つ目のモノマーユニットは、ビニルアルコールお よび／または好ましくはエステル化されたビニルアルコールにより形成される。 短鎖カルボン酸、好ましくはＣ_1-4カルボン酸とビニルアルコールとのエステル の形のビニルアルコール誘導体が特に好ましい。好ましいterpolymerには、重量 比で６０％から重量比で９５％、さらに好ましくは重量比７０％から重量比９０ ％の（メタ）アクリル酸または（メタ）アクリル酸塩、さらに好ましくはアクリ ル酸またはアクリル酸およびマレイン酸またはマレイン酸塩、および重量比５％ から重量比４０％好ましくは重量比１０％から重量比３０％のビニルアルコール および／または酢酸ビニルを含む。（メタ）アタリル酸または（メタ）アタリル 酸塩のマレイン酸またはマレイン酸塩に対する重量比が１：１から４：１の範囲 内、好ましくは２：１から３：１、さらに好ましくは２：１から２．５：１のte rpolymerが最も好ましい（量も重量比もいずれも酸として）。二番目の酸性モノ マーまたはその塩も、２のポジションがアルキルラジカル、好ましくはＣ_1-4ア ルキルラジカル、または芳香族ラジカル、好ましくは ベンゼンまたはベンゼン誘導体に由来するもの、で置換されたアリルスルホン酸 誘導体であってもよい。好ましいterpolymerは、重量比で４０％から重量比６０ ％、さらに好ましくは重量比で４５％から重量比５５％までの（メタ）アクリル 酸または（メタ）アクリル酸塩、さらに好ましくはアクリル酸またはアクリル酸 塩と、重量比１０％から重量比３０％およびさらに好ましくは重量比１５％から 重量比２５％のメタアリルスルホン酸またはメタアリルスルホン酸塩と、三つ目 のモノマーとして重量比１５％から４０％さらに好ましくは重量比２０％から重 量比４０％の炭水化物を含有する。この炭水化物は、例えば、モノ−、ジ−、オ リゴ−またはポリサッカライド、好ましくはモノ−、ジ−、またはオリゴサッカ ライド、特に好ましくはシュークロースである。三つ目のモノマーを使用するこ とで、おそらくポリマーが容易に生分解するという弱点があるであろう。これら のterpolymerは一般に、1,000から200,000、好ましくは200から50,000、さらに 好ましくは3,000から10,000の範囲の相対分子量を有する。これらは、水溶液の 形態、好ましくは重量比３０％から５０％の水溶液として、特に液体洗剤の生産 に使用してもよい。上記のポリカルボン酸は全て、一般にその水溶性塩の形態、 さらに詳細にはアルカリ金属塩の形態で使用される。 問題のタイプの有機ビルダーの含有量は、好ましくは重量比４０％未満で、さ らに好ましくは重量比２５％以下、最も好ましくは重量比１％から５％である。 上記の上限付近の含有量は、本発明による洗剤のペースト状または液体状、さら に好ましくは水を含んだ洗剤での使用が好ましい。 結晶またはアモルファス状のアルカリ金属alumosilicateは特に、非水溶性、 水拡散性無機ビルダーとしては重量比５０％未満の量、好ましくは重量比４０％ 未満の量で、および液体洗剤中では重量比１％から５％の量で使用される。これ らのalumosilicateのなかでも、洗剤中の結晶alumosilicateナトリウム、特にゼ オライトＡ、ＰおよびＸが好ましい。上記の上限付近の量は、好ましくは固形粒 子状洗剤において使用される。適当なalumosilicateは、大きさ３０μｍより大 きい粒子を含まず、少なくとも重量比８０％が大きさ１０μｍより小さい粒子で なる。これらのカルシウム結合能力は、一般に１００から２００ ｍｇＣａＯ／ ｇの範囲にある。 上記のalumosillcateに対する適当な置換体または部分的置換体は、単体とし てまたはアモルファスケイ酸塩との混合物として存在する結晶アルカリ金属ケイ 酸塩である。本発明による洗剤中のビルダーとして使用するに適当なアルカリ金 属ケイ酸塩は、好ましくはアルカリ金属オキシドのＳｉＯ₂に対するモル比が０ ．９５未満および、さらに好ましくは１：１．１から１：１．２の範囲であり、 アモルファスまたは結晶形態で存在する。好ましいアルカリ金属ケイ酸塩は、ケ イ酸ナトリウム、さらに好ましくはアモルファスのケイ酸ナトリウムで、Ｎａ₂ ＯのＳｉＯ₂に対するモル比が１：２から１：２．８である。こういったアモル ファスのケイ酸ナトリウムは市販されており、例えばＰＯＲＴＩＬ(登録商標)な どがある。Ｎａ₂ＯのＳｉＯ₂に対するモル比が１：１．９から１：２．８のもの は、固形中で好ましく使用されるが、本発明による洗剤の製造における溶液の形 態では使用されない。単体としてまたはアモルファスケイ酸塩との混合物として 存在する好ましい結晶アルカリ金属ケイ酸塩は、一般式Ｎａ₂Ｓｉ_xＯ_2x+1・ｙＨ₂ Ｏ、式中Ｘ−いわゆるモジュールーは１．９から４、ｙは０から２０の値、好 ましいｘ値は２、３または４である、を有する結晶層状構造のケイ酸塩である。 好ましい結晶層状構造のケイ酸塩は、一般式中のｘが２または３のものである。 βおよびσジケイ酸ナトリウム（Ｎａ₂Ｓｉ₂Ｏ₅・ｙＨ₂Ｏ）はどちらも、特に好 ましい。モジュールが１．９から３．２のσジケイ酸ナトリウムは好ましい。ｘ の値が１．９から２．１の上記の一般式に相当する実質的に水を含まない結晶ア ルカリ金属ケイ酸塩もまた、本発明の洗剤に使用することができる。本発明によ る洗剤の別の好ましい実施態様は、モジュールが２から３の結晶層状ケイ酸ナト リウムである。モジュールが１．９から３．５の結晶ケイ酸ナトリウムは、本発 明の洗剤の別の好ましい実施態様において使用される。本発明による洗剤のアル カリ金属ケイ酸塩の含有量は、無水活性物質として、好ましくは重量比１％から 重量比５０％、さらに好ましくは重量比５％から重量比３５％である。この他の ビルダーとしてアルカリ金属alumosilicate、さらに詳細にはゼオライト、が存 在する場合は、アルカリ金属ケイ酸塩の含有量は、無水活性物質として、重量比 １％から重量比１５％、さらに好ましくは重量比２％から重量比６％である。こ の場合、almosilicateのケイ酸塩に対する重量比率は、無水活性物質 として、好ましくは４：１から１０：１である。アモルファスおよび結晶アルカ リ金属ケイ酸塩の両方を含む洗剤においては、アモルファスアルカリ金属ケイ酸 塩の結晶アルカリ金属ケイ酸塩に対する重量比率は、好ましくは１：２から２： １、さらに好ましくは１：１から２：１である。 上記の無機ビルダーの他に、本発明の洗剤において他の水溶性または非水溶性 の無機物質を使用することもできる。アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水 素塩、およびアルカリ金属硫酸塩、およびこれらの混合物が、この場合に適当で ある。この他の無機物質は、重量比で７０％までの量で含有する場合があるが、 好ましくは含有しないほうがよい。 重量比１％の水溶液でのｐＨ値を酸性または弱アルカリ性、特に約８．０から ９．５、に任意に調整するために、本発明の洗剤には固形の無機および／または 有機酸または酸性塩類、例えば硫酸水素のアルカリ金属塩、コハク酸、アジピン 酸またはグルタル酸およびこれらの混合物を含有してもよい。これらのような酸 性物質は、本発明による洗剤中に、好ましくは重量比５％未満の量、更に好まし くは重量比０．１％から３％までの量で含有される。 本発明による洗剤は、この他に他の典型的な洗剤成分を含有してもよい。これ らの任意成分、特に例えばアミノポリカルボン酸、アミノヒドロキシポリカルボ ン酸、ポリリン酸、および／またはアミノポリリン酸などの重金属の錯体化剤、 例えばセルロースエーテルなどの再沈着防止剤、例えばポリビニルピロリドンな どのdye transfer inhibitor、例えばorganopolysiloxaneまたはパラフィン等の foam inhibitor、溶剤および、例えばスチルベン、ジスルホン酸誘導体などのop tical brightenerを含有してもよい。本発明による洗剤は、好ましくは重量比１ ％未満、より好ましくは重量比０．０１％から重量比０．５％のoptical bright emer、さらに詳細には置換4,4'-bis-(2,4,6-triamino-s-triazinyl)-stilbene-2 ,2'-disulfonic acidのクラスの化合物、重量比５％未満より好ましくは重量比 ０．１％から重量比２％の重金属の錯体化剤、より詳細にはアミノアルキレンリ ン酸とその塩、重量比３％未満より好ましくは重量比０．５％から重量比２％の 再沈着防止剤、および重量比２％未満より好ましくは重量比０．１％から重量比 １％のfoam inhibitorを含有するが、上記の重量比は洗剤を１００と するものである。 水の他に、特に本発明による液体洗剤中で使用される溶剤は、好ましくは例え ばエタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール異性体などの低級 アルコール、グリセロール、例えばエチレンおよびプロピレングリコールのよう な低級グリコール、上記化合物のクラスから誘導されるエーテル等の水混合性溶 剤である。 任意で含有される典型的な酵素安定剤、さらに詳細には本発明の液体洗剤中に は、例えばモノ、ジ、トリエタノールアミンおよびプロパノールアミンおよびこ れらの混合物のようなアミノアルコール、低級カルボン酸、ホウ酸またはアルカ リ金属ホウ酸塩、およびホウ酸／カルボン酸の組み合わせ物がある。 適当なfoam inhibitorには、長鎖の石鹸、より詳細にはbehenic soap、脂肪酸 アミド、パラフィン、ワックス、微小結晶ワックス、organopolysiloxaneおよび これらの混合物でさらにmicrofine、optically silanizedまたはその他のhydrop hobicized silicaが含まれる。特に本発明の洗剤における使用においては、これ らのfoam inhibitorは好ましくは顆粒状の水溶性支持剤上に沈着させる。 さらに本発明による洗剤は、再沈着防止剤を含有することもできる。再沈着防 止剤の機能は、繊維から剥がされた汚れを溶液中にけん濁状態に維持し、これに より繊維の変色を防止する。適当な再沈着防止剤は、水溶性で、一般に有機コロ イドで、例えば重合カルボン酸の水溶性塩、糊、ゼラチン、エーテルカルボン酸 またはエーテルスルホン酸の塩、またはスターチまたはセルロースまたはセルロ ースまたはスターチの酸性の硫酸エステル塩がある。酸性基を有する水溶性ポリ アミドもまた、この目的に適当である。可溶性スターチ調製物および上記以外の スターチ製品、例えば部分的に加水分解されたスターチなども使用できる。ナト リウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチ ルセルロースおよびこれらの混合物も好ましく使用される。 本発明の洗剤のこの他の成分として使用できる漂白剤は、一般的に洗剤中で使 用される過酸化化合物で、tetrahydrateまたはmonohydrateとして含有される過 ホウ酸塩、percarbonate、perpyrophosphateおよび一般にアルカリ金属塩、 さらに詳細にはナトリウム塩として存在するpersilicateがある。このような漂 白剤は、本発明による洗剤中において、洗剤を１００として、好ましくは重量比 ２５％未満、さらに好ましくは重量比１５％未満、最も好ましくは重量比５％か ら重量比１５％までの量で含有される。 任意の成分としての漂白剤活性化剤には、典型的に用いられるＮ-アシルまた はＯ-アシル化合物、例えばポリアシル化アルキレンジアミン、さらに詳細には テトラアセチルエチレンジアミン、acylated glycolurils、さらに詳細にはtetr aacetyl glycoluril、Ｎ-アシル化ヒダントイン、ヒドラジド、トリアゾール、 ウラゾール、ジケトピペラジン、sulfurylamindeおよびcyanurate、また無水カ ルボン酸さらに詳細には無水フタル酸、カルボン酸エステルさらに詳細にはsodi um isononanoyl phenol sulfonateおよびアシル化糖誘導体さらに詳細にはペン タアセチルグルコースがある。保存中における過酸化化合物との相互作用を起こ さないために、漂白剤活性化剤はshell-forming物質で被覆するか既知の方法で 顆粒化されるが、カルボキシメチルセルロースで平均粒子径０．０１ｍｍから０ ．８ｍｍに顆粒化されたテトラアセチルエチレンジアミン、および／または顆粒 化された1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazineが特に好ましい。漂 白剤活性化剤は、好ましくは本発明の洗剤中に、洗剤を１００として重量比で８ ％未満、さらに好ましくは重量比２％から重量比６％までの量で含有される。 プロテアーゼの他に任意で含有される酵素には、特にリピダーゼ、クチナーゼ 、アミラーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、オキシダーゼおよびペルオキシダー ゼのクラスのものおよびこの混合物が含まれる。真菌や細菌株から得られる酵素 が好ましく使用される。 本発明の洗剤中での使用に適当なアミラーゼには、好ましくは約ｐＨ１０未満 のアルカリ領域に最適ｐＨを有する細菌または真菌から得られる酵素が含まれる 。有用な市販の製品は、例えばＴＥＲＭＡＮＹＬ（登録商標）、ＭＡＸＡＭＹＬ （登録商標）である。本発明による洗剤中においてアミラーゼは、最終的洗剤が ０．０１ ＫＶＵ/ｇから２ ＫＮＵ/ｇ(Ｎovo Ｃompanyの標準方法によるグラム あたり"Ｋilo Ｎovo Ｕnit"、１ ＫＮＵはＭethod in Ｅraymlology,Ｖol.1,199 5,page149に記載される方法で測定した場合にｐＨ５．６／摂氏３７ 度で５．２６ｇのスターチを分解する酵素量）、好ましくは０．０１５ ＫＮＵ/ ｇから１．８ ＫＮＵ/ｇ、さらに好ましくは０．０３ ＫＮＵ/ｇから１．６ Ｋ ＮＵ/ｇの範囲を有するような含有量で使用される。 本発明にしたがった使用に適当なセルラーゼもまた、好ましくはほぼ中性から 弱アルカリ性領域、６から９．５の最適ｐＨを有する細菌または真菌から得られ る酵素に属するものである。これらは、本発明による洗剤中で、最終洗剤が０． ０５ＩＵ/ｇから１．５ＩＵ/ｇ（ｐＨ ９．０／摂氏４０度におけるＮacarboxy methyl celluloseの酵素分解に基づく１グラムあたりの"Ｉntemational Ｕnits" 、好ましくは０．０７ＩＵ/ｇから１．４ＩＵ/ｇ、さらに好ましくは０．１ＩＵ /ｇから１．３ＩＵ/ｇのセルロース分解活性を有するような量で好ましく使用さ れる。適当な市販製品は、例えばＮovo Ｎordiskの製品ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ^TMま たは花王の製品であるＫＡＣ（登録商標）である。 粒子状の洗剤に入れた場合に、取扱いをより容易にし使用前に不活性化するこ とを防止するために、酵素は、既知の方法で支持体上に吸着、shell-forming物 質中に封入、および／または支持物質と共に顆粒化される。プロテアーゼの他に 任意で含まれる酵素は、本発明による洗剤中に、洗剤を１００として好ましくは 重量比２％未満、さらに好ましくは重量比０．０１％から重量比１．５％の量で 含有される。 一つの好ましい実施態様において、本発明による洗剤は、粒子状で重量比で２ ０％から重量比５０％の無機ビルダー、重量比１５％未満、さらに詳細には重量 比２％から重量比１２％の水溶性有機ビルダー、重量比２．５％から重量比２０ ％の合成アニオン系表面活性剤、重量比１％から重量比２０％の非イオン系表面 活性剤、重量比２５％未満、より詳細には重量比１％から重量比１５％の漂白剤 、重量比８％未満、さらに詳細には重量比０．５％から重量比６％の漂白剤活性 化剤、および重量比２０％未満さらに詳細には重量比０．１％から重量比１５％ の無機塩さらに詳細にはアルカリ金属カルボン酸塩および／または硫酸塩、およ び重量比２％未満より詳細には重量比０．４％から重量比１．２％のプロテアー ゼ以外の粒子状酵素より詳細にはリパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラー ゼ、プルラナーゼ、オキシダーゼおよび／またはペルオキシダーゼを含む。 他の好ましい実施態様において、特に軽い汚れ用の洗剤として使用する本発明 による粉末洗剤は、重量比２０％から重量比５５％の無機ビルダー、重量比１５ ％未満さらに詳細には重量比２％から重量比１２％の水溶性有機ビルダー、重量 比４％から重量比２４％の非イオン系表面活性剤、重量比１５％未満、さらに詳 細には重量比１％から重量比１０％の合成アニオン系表面活性剤、重量比６５％ 未満さらに詳細には重量比１％から重量比３０％の無機塩さらに詳細にはアルカ リ金属カルボン酸塩および／または硫酸塩を含み、漂白剤も漂白剤活性化剤も含 まない。 本発明による洗剤の他の好ましい実施態様は、液体洗剤で、重量比５％から３ ５％の水溶性有機ビルダー、重量比１５％未満、さらに詳細には重量比０．１％ から重量比５％の非水溶性無機ビルダー、重量比１５％未満さらに詳細には重量 比０．５％から重量比１０％の合成アニオン系表面活性剤、重量比１％から重量 比２５％の非イオン系表面活性剤、重量比１５％未満、さらに詳細には重量比４ ％から重量比１２％の石鹸、および重量比３０％未満、さらに詳細には重量比１ ％から重量比２５％の水および／または水混合性溶剤、および重量比１０％未満 、さらに詳細には重量比０．０１％から重量比７．５％の酵素安定化システムを 含有する。上記の各好ましい実施態様のプロテアーゼは、Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１ ８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ＋Ｌ２１１Ｄのアミノ酸置換を有する変異体Ｆ 49である。 本発明による粒子状洗剤は、個々の粒子を標準的なミキサー、より詳細にはド ラムミキサー、ローラーミキサー、リボンミキサー、またはfree-fallミキサー 、で混合し、他の任意の粉末成分および、必要な場合は、特に非イオン系表面活 性剤、それに染料や香料を含む液体または液化成分をスプレーすることで任意に 混合できる。高温に耐えられる成分は、好ましくは水溶性slurryのスプレー乾燥 による既知の方法で粉末状態の製品にされ、得られた粉末は、プロテアーゼおよ び任意で他の酵素性物質および特に漂白剤など他の熱に弱い成分と混合される。 個々の成分の添加は、これらを含有する顆粒またはextrudateにミキシングして おこなうことも可能であり、特に好ましくは６５０ｇ/ｌから９００ｇ/ｌという 見かけ密度の高い本発明による洗剤の製造に特に好ましい。本発明による流体ま たは液体洗剤は、液体状または水または定められた溶媒中の溶液の形態で存在す る材 料または成分を単に混合する。 実施例１ 突然変異のためのＢＬＡＰ中のサイトの確認 多数の天然サブチリシンや他のプロテアーゼの洗浄力をテストした。その結果 、洗浄力は、基質結合領域中における帯電アミノ酸残基の数と分布に関係がある ことが示された。基質結合領域において、マイナスに帯電したアミノ酸残基数が 増加しているか、またはプラスに帯電したアミノ酸残基数が減少していることで 洗浄力が改善されていることが認められた。したがって、本出願で特許を請求す るＢＬＡＰ変異体は、基質結合領域のプラスの実効電荷（net charge）が少なく 、洗浄力が改善されている。 洗浄力の改善は、結果として荷電の変化に至る、基質結合ポケット内のアミノ 酸を変化させることで得た。変化は、ＢＬＡＰ変異体Ｍ１３０またはＢＬＡＰ変 異体Ｍ１３１のいずれかの基質結合ポケット内に存在するアミノ酸について行っ た。これらの酵素の基質結合ポケットは、結合基質分子ＡＡＰＦの７Å内の領域 と定義される。図１は、合成基質ＡＡＰＦと結合した野生型ＢＬＡＰの基質結合 ポケットの特徴的な構造を示す。酵素に結合したＡＡＰＦは、文献に記載されて おりＢrookhaven Ｐrotein Ｂankで入手可能なサブチリシン−インヒビタ複合体 の結晶学データに基づいて作成された。Ｘ線結晶学に基づくと、ＢＬＡＰ変異体 Ｍ１３０およびＢＬＡＰ変異体Ｍ１３１の基質結合ポケット内の構造は、本質的 に野生型ＢＬＡＰと同一である。１．４Åレゾルーション（resolution）に対す る野生型ＢＬＡＰの構造は、１９９１年５月２９日に提出された特許出願Ｓeria l Ｎo.07/706,691中に記載されており、相当する原子配位（atomic coordinates ）はＢrookhaven Ｐrotein Ｂankに寄託されている。特に、ＢＬＡＰ変異体Ｍ１ ３０およびＭ１３１内のポジション９９、１５４、２１１のアミノ酸変化により 、酵素の洗浄力が高まることが示された。これらの部位を占める元々のアミノ酸 、アルギニン９９、セリン１５４およびロイシン２１１を図１に示す。３つ全て のアミノ酸は、ＡＡＰＦの半径７Åで特定される範囲内に存在する。 実施例２ ＢＬＡＰ遺伝子の突然変異遺伝子の作成 Ａ．変異体Ｍ１３０とＭ１３１の作成 本発明による突然変異Ｂ.lentus ＤＳＭ５４８３プロテアーゼを発現する遺伝 子は、野生型のＢ.lentus ＤＳＭ５４８３アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の一つ または複数のコドンを変えることによって作成される。プロテアーゼＭ１３０は 、突然変異Ｓ３Ｔ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３ＭおよびＶ１９９Ｉを引き起こすこと によりＢＬＡＰから得られた。プロテアーゼＭ１３１は、突然変異Ｓ３Ｔ、Ｖ４ Ｉ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３ＭおよびＶ１９９Ｉを引き起こすことによりＢＬＡＰ から得られた。Ｍ１３０およびＭ１３１プロテアーゼをコードする遺伝子は、ｐ Ｍａｃ法を使用して作成された(Ｓtanssens,Ｐ.,Ｏpsomer,Ｃ.,ＭcＫeown,Ｙ.Ｍ .,Ｋramer,Ｗ.,Ｚabeau,Ｍ.,and Ｆritz,Ｈ.-Ｊ.(1989)Ｎucleic Ａcids Ｒes,1 7,4441-4445)。プロテアーゼＭ１３０およびＭ１３１は、１９９１年５月２９日 に提出された特許出願Ｓerial Ｎo.07/706,691に既に記載されている。プロテア ーゼＭ１３０およびＭ１３１は、野生型ＢＬＡＰに比べて熱および表面活性剤に 対する安定性が高くなっており、より高い洗浄力を有するプロテアーゼの開発に おける基礎となった。Ｍ１３０およびＭ１３１プロテアーゼ作成のためのＢＬＡ Ｐ遺伝子の修飾に使用された遺伝子技術もまた、特許出願ＷＯ 91/02792に記載 されている。本出願において、技術水準を示す目的でＷＯ91/02792中の記載を参 考として引用した。 プロテアーゼＭ１３０およびＭ１３１は、Ｂ.lentus ＤＳＭ５４８３アルカリ 性プロテアーゼ（ＢＬＡＰ）から野生型ＢＬＡＰを成熟した形態でコードするＤ ＮＡの部位特異的な突然変異誘発により作成された。野生型ＢＬＡＰを成熟した 形態でコードするＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐＣＢ１３Ｃ（図２）を用 いて作成された。プラスミドｐＣＢ１３Ｃは、Ｂ.licheniformis ＡＴＣＣ５３ ９２６プロテアーゼ遺伝子とＢ.lentus ＤＳＭ５４８３ＢＬＡＰ遺伝子からなる ハイブリッドフュージョン（hybrid fusion）を含有する。特に、このハイブリ ッドフュージョンは、ＢＬＡＰのpre sequenceの最後の５残基とＢＬＡＰの不活 性型（pro）および成熟型（mature）残基すべてをコードするＤＮＡに融合され た ＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼ遺伝子のプロモーター、リボソーム結合部位、 および予備配列（pre sequence）の２１残基をコードするＤＮＡを含有する。こ のフュージョンは、Ｃ／ａｌフュージョンと呼ばれるが、これはこの制限部位（ restriction site）がＡＴＣＣ５３９２６とＤＳＭ５４８３ＤＮＡの間の継ぎ目 に存在するためである。ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子中の 予備配列およびプロ配列（pro sequence）の継ぎ目の近くに新しいＣ／ａｌ制限 部位を導入する必要がある。ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子 のＮ末端部分からの情報を含むＤＮＡフラグメンドを増幅するためには、ポリメ ラーゼ鎖反応(polymerasec hain reaciton、ＰＣＲ）を使用して、ＡＴＣＣ５３ ９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子中にＣ／ａｌ制限部位を導入した。増幅さ れたフラグメントは、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼプロモーター 、リボソーム結合部位、開始コドン、および大半の予備配列が含まれる。このフ ラグメントのＤＮＡ配列を図３に示す。この２９２ bpのＤＮＡフラグメントは 、ＡｖａＩおよびＣ／ａｌ制限部位をそれぞれ５’および３’末端に有する。Ｂ ＬＡＰ遺伝子はすでに自然発生性のＣ／ａｌ部位を対応する位置に有していた。 ＡＴＣＣ５３９２６およびＢＬＡＰ遺伝子のフュージョンのＤＮＡ配列分析の結 果、予想されたＤＮＡとアミノ酸配列が確認された。 突然変異誘発を行うために、ＢＬＡＰ遺伝子を突然変異誘発ベクターｐＭａ５ 〜８中にサブクローンニングする。これは、ＰＣＲを使用して、Ｃ／ａｌフュー ジョン遺伝子とＳａ／ＩカセットとしたＡＴＣＣ５３９２６転写ターミネーター を含むＤＮＡフラグメントを合成しておこなう。ＰＣＲは、メーカー(Ｐerkin Ｅlmer Ｃetus,Ｎorwalk,ＣＴ)が記載する条件を使用して実施され、ＰＣＲでは 、Ｓａ／Ｉ部位を有する二つの合成オリゴヌクレオチドがプライマーとして、大 腸菌ベクターｐＣＢ１３ＣＤＮＡがテンプレートとして使用される。ＰＣＲ産物 をＳａ／Ｉで切断した後、このフラグメントを事前にＳａ／Ｉで切断し細菌のア リカリ性ホスファターゼで脱リン酸化された突然変異誘発プラスミドｐＭｃ５〜 ８中にクローンニングする。プラスミドｐＭｃ５〜８およびｐＭａ５〜８は、Ｈ .-Ｊ.Ｆitzから入手したもので、Ｓtanssens,Ｐ.らによるＮucleic Ａcids Ｒes ,17,4441-4-154(1989)に記載されている。ＰＣＲフラグメントがｐＭｃ５〜８中 で、どちらの方向にもクローンされるようにＳａ／Ｉ部位が選択される。ライゲ ーションミックス(ligation mix)を、大腸菌ＷＫ６中に取り込ませる。挿入され たＤＮＡを有するものを選択するのに、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍ^R)形質 転換体をスクリーニングし、正しいプラスミド構築物ｐＭｃ１３Ｃが図４に示さ れるように同定される。いったん遺伝子がｐＭｃ５〜８ベクター中にクローニン グされ意図する部位に突然変異が確認されれば、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド を使用して公表されている修飾方法(Ｓtanssens,Ｐ.らによるＮucleic Ａcids Ｒes,17,4441-4454(1989))で突然変異が導入される。導入された突然変異を含有 するオリゴヌクレオチドを一本鎖の（ｓｓ）ＤＮＡのセグメント上にＢＬＡＰ遺 伝子を有するギャップド・デュプレックス（gapped duplex,gd）構造とアニーリ ングさせる。ｐＭｃ１３Ｃからの直鎖ｓｓＤＮＡを、変成させ制限酵素で切断さ れたｐＭａ５〜８ＤＮＡとアニーリングすることでギャップド・デュプレックス 構造を形成することができる。プラスミドｐＭａ５〜８は、活性なアンピシリン 耐性遺伝子を有するが、クロラムフェニコール耐性遺伝子中に不活性化点突然変 異を有し、一方でプラスミドｐＭｃ１３Ｃは、無傷のＢＬＡＰ遺伝子のほかに活 性なクロラムフェニコール耐性遺伝子を有するが、アンピシリン耐性遺伝子中に 不活性化点突然変異を有する。アニーリングされた物質は、クローンされたＢＬ ＡＰ遺伝子全体をスパニング（spanning）するｓｓＤＮＡギャップ（ｇａｐ）の 二重鎖のヘテロ二本鎖である。突然変異オリゴヌクレオチドは、ギャップ内の同 類のssＤＮＡとアニーリングすることができ、残りのギャップにはＤＮＡポリメ ラーゼ(Ｋlenowフラグメント)が充填され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs Ｉnc.,Ｂeverly,ＭＡ[ＮＥＢ])を使用してライゲート(ligate)される 。このようなシステムの突然変異誘発効果は、エキソヌクレアーゼIII(Ｅxo III ,ＮＥＢ)を使用することで向上させることができる。Ｅｘｏ ＩＩＩは、３’末 端から二重鎖ＤＮＡを分解（digest）するエキソデオキシリボヌクレアーゼであ る。遊離した３’末端を必要とするために、この酵素は閉じた環状ｓｓＤＮＡま たはｄｓＤＮＡには作用しない。次いでＥｘｏ ＩＩＩによるフィル・イン（fil l-in）反応の産物を処理して、完全に埋まっていないギャップを有するスピーシ ズ（species）を除去する。この処理は突然変異誘発効果を大きく向上させ、好 まし い突然変異誘発方法である。フィル・イン反応の産物は修復機能の欠如した大腸 菌株（ＷＫ６ｍｕｔＳ）に取り込ませ、アンピシリン耐性形質転換体（Ａｐ^R） を選別する。形質転換したヘテロ二本鎖プラスミドの複製の結果、二種類の異な る後代が得られる。一方の後代は野生型のＢＬＡＰ遺伝子と無傷のクロラムフェ ニコール耐性遺伝子と、不活性なアンピシリン耐性遺伝子を有する。もう一方の 後代は、意図する突然変異を持つＢＬＡＰ遺伝子を有し、アンピシリン耐性であ るが、クロラムフェニコール耐性は有さない。 野生型のＢＬＡＰ遺伝子を有するＡｐ^R、Ｃｍ^Rの後代のバックグラウンド・グ ロウス（background growth）を完全に排除するには、Ａｐ^R、Ｃｍ^R突然形質転 換体をアンピシリンで選別するだけでは不十分である。したがって、ＷＫ６ｍｕ ｔＳ株のＡｐ^R形質転換体から得たプラスミドＤＮＡを使用して、第二の形質転 換処理を大腸菌に対しておこなう必要がある。この第二の形質転換では、ＷＫ６ などの大腸菌のサプレッサー欠失（suppressor deficient）株をレシピエント細 胞(recipient cells)とし、プラスミド濃度を低くして大量のレシピエント細胞 を使用する。この処理で、双方の後代に由来するプラスミドＤＮＡを得るレシピ エント細胞の可能性が低下する。Ａｐ^R形質転換体を選別し、幾つかの形質転換 体からのプラスミドＤＮＡを単離し、突然変異が起こっているかどうかについて スクリーニングする。一回目の突然変異誘発処理で得られるｐＭａ突然変異体を 、この変異体のｓｓＤＮＡを取り出してｐＭｃ５〜８のＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩ Ｉで切断後、変成させたＤＮＡとアニーリングさせて、二回目の突然変異誘発に 使用することができる。プラスミドｐＭｃ５〜８は、活性なクロラムフェニコー ル耐性遺伝子と不活性なアンピシリン耐性遺伝子を有することを除いて、ｐＭａ ５〜８と同一である。一般的な方法は上記に記載されるものと同様である。プロ テアーゼＭ１３０とＭ１３１をコードする遺伝子の作成は、二回の突然変異誘発 が必要である。一回目の突然変異誘発でオリゴヌクレオチドに、突然変異Ａ１８ ８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉが導入される。二回目の突然変異誘発では、Ｍ１ ３０の場合はＳ３Ｔの突然変異を、Ｍ１３１の場合はＳ３ＴとＶ４Ｉの突然変異 をオリゴヌクレオチドに導入するように設計された。これらの突然変異の発生は 、全てＤＮＡ配列分析により確認された。 Ｂ．洗浄力の改善された新しいプロテアーゼをコードする遺伝子の作成 突然変異Ｒ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ、Ｓ１５４Ｄ、Ｓ１５４Ｅ、Ｌ２１１ Ｄが、オーバーラップ・イクステンション（overlap extension）によるＰＣＲ 突然変異誘発を使用して、Ｍ１３１プロテアーゼをコードする遺伝子に導入され た。突然変異Ｒ９９Ｓが、overlap extensionによるＰＣＲ突然変異誘発を使用 して、Ｍ１３０プロテアーゼをコードする遺伝子に導入された。作成プラスミド ｐＣＢ７６Ｍ１３１（図５）を使用して、突然変異体Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、 Ｆ４６、Ｆ４７およびＦ４９（表２）が作成された。作成プラスミドｐＣＢ７６ Ｍ１３０を使用して突然変異体Ｆ１１が、作成プラスミドｐＣＢ７６Ｆ４９（新 たに作成された突然変異体）を使用して突然変異体Ｆ５４とＦ５５が作成された 。 この手順の実施に必要な材料としては次のものが含まれる：ＡＤＮＡサーマル ・サイクラ（ＡＤＮＡ Ｔhemal Ｃycler、Ｐerkin Ｅlmer Ｃetus）、ジーンア ンプキット（ＧeneＡmp kit、Ｐerkin Ｅlmer Ｃetus）、アンプリワックス（Ａ mpliＷax、Ｐerkin Ｅlmer Ｃetus）、０．５ｍｌポリプロピレン製無菌試験管 （Ｐerkin Ｅlmer Ｃetus）、ミクロコン-100濃縮器（Ｍicrocon-100 concentra tors、Ａmicon,Ｂeverly,ＭＡ）、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−（ヒドロキシ メチル）アミノメタン［Ｔris］、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） 二ナトリウム、２ＮのＨＣｌでｐＨ８に調整）、ミニゲル電気泳動装置（Ｍinig el electrophoresis apparatus、Ｈoefer Ｓcientific,Ｓan Ｆrancisco,ＣＡ） 、ＴＢＥ緩衝液（０．０８９Ｍトリス、０．０８９Ｍホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ ）中１％（ｗ/ｖ）のシーケム・アガロースゲル（Ｓeakem agarose gl、ＦＭＣ ，Ｒockland,ＭＥ）、水中０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム、制限酵素Ｎｈｅｌ （ＮＥＢ）、制限酵素Ｘｂａｌ（ＮＥＢ）、および制限酵素Ｓｓｔｌ(ＢＲＬ,Ｇ aithersburg,ＭＤ)。 製造業者が規定した通りにジーンアンプキットおよびアンプリワックスを使用 してＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、ＤＮＡサーマルサイクラーを使用して、１サ イクルの変性（３分、９５℃）、アニーリング（２分、５０℃）およびイクステ ンション（２分、７２℃）と、３０サイクルの変性（１分、９４℃）、アニーリ ング（１分、５０℃）およびイクステンション（１分、７２℃）を行った。７２ ℃で１０秒間、各サイクルを延長した。 オーバーラップ・イクステンションによる部位指定突然変異誘発については、 （Ｈo,Ｓ.Ｎ.,Ｈunt,Ｈ.Ｄ.,Ｈorton,Ｒ.Ｍ.,Ｐullen,Ｊ.Ｋ.,and Ｐease,Ｌ.Ｒ .,Ｇene77,51-59,1989年）に記載されている。ＢＬＡＰ突然変異体Ｆ４３、Ｆ４ ４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ４７、Ｆ４９の場合、突然変異誘発の第１ラウンドの鋳 型として１０ｎｇのpＣＢ76Ｍ131プラスミドＤＮＡを使用した。ＢＬＡＰ突然変 異体Ｆ１１の場合、鋳型として１０ｎｇのpＣＢ76Ｍ130プラスミドＤＮＡを使用 し、ＢＬＡＰ突然変異体Ｆ５４およびＦ５５の場合、鋳型として１０ｎｇのpＣ Ｂ76Ｆ49 ＤＮＡを使用した。これらのプラスミドのpＵＢ110型は、各プラスミ ドのpＢＣ16型よりＢ.subtilis ＤＢ104宿主におけるプロテアーゼの収量が多い ため、pＵＢ110型を選択した。各ラウンドのＰＣＲ後、ＰＣＲフラグメントをア ガロースゲル電 気泳動で確認し、マイクロコン-100濃縮器（Ａmicon）を使用して洗浄した。第 ２ラウンドのＰＣＲ後に、（意図した突然変異の位置によって）Ｎｈｅｌ／Ｘｂ ａｌまたはＮｈｅｌ／Ｓｓｔｌでこのフラグメントを分解し、前述のようにＢ.s ubtilis ＤＢ104感応細胞を使用して、突然変異体Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ ４６、Ｆ４７、Ｆ４９の場合にはpＣＢ76Ｍ131 ＤＮＡに、突然変異体Ｆ１１の 場合にはpＣＢ76Ｍ130 ＤＮＡに、突然変異体Ｆ５４およびＦ５５の場合にはpＣ Ｂ76Ｆ49に戻してクローニングした。イオン交換ミニカラム（ＱＩＡＧＥＮ,Ｉn c.,Ｃhatsworth,ＣＡ）を使用してプラスミドＤＮＡ単離を遂行し、前述のよう にしてサンガー（Ｓanger）ds ＤＮＡ配列決定によって突然変異を確認した。 実施例３ 突然変異体プロテアーゼ遺伝子のクローニング Ａ．ｐＭａｃ系により産生される突然変異体プロテアーゼのクローニング プロテアーゼＭ１３０およびプロテアーゼＭ１３１は、特定の大腸菌pＭＣ13 Ｃ誘導体ベクター由来のＭ１３０またはＭ１３１のいずれかをコードするそれぞ れの遺伝子を、Ｂaccilusで複製できるプラスミドベクターに転移することによ って産生することができる。これを遂行するためには、制限エンドヌクレアーゼ ＡｖａｌおよびＳｓｔｌで分解することによって当該pＭc13Ｃプラスミドから所 望の突然変異体遺伝子を分離し、引き続いてプラスミドｐＨ７０（第６図）また はプラスミドｐＣ５１（第７図）のいずれかに由来する、より大きいＡｖａｌ／ Ｓｓｔｌフラグメントに結合する。これらのｐＨ７０およびｐＣ５１由来のＡｖ ａｌ／ＳｓｔｌフラグメントはＢacillusにおける複製に必要なＤＮＡ配列を含 み、それぞれカナマイシン耐性（Ｋｍ^R）かテトラサイクリイン耐性（Ｔｃ^R）の いずれかをコードする。プラスミドｐＨ７０は、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮ Ａフラグメントに担持されているＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺 伝子を、ＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間のＫｍ^RプラスミドｐＵＢ１１０ にクローニングすることによって構築する。プラスミドｐＣ５１は、ＥｃｏＲＩ ／ＢａｍＨＩフラグメントに担持されているＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼ遺 伝子を、ＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間のＴｃ^Rプラスミ ドｐＢＣ１６にクローニングすることによって構築する。Ｍ１３０かＭ１３１の いずれかをコードするＤＮＡフラグメントのクローニングに使用されるｐＨ７０ またはｐＣ５１由来の、より大きいＡｖａｌ／Ｓｓｔｌフラグメントがまず、陰 イオン交換カラム（Ｇen-Ｐak ＦＡＸ、直径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍ、Ｗat ers,Ｍilford,ＭＡ）を用いた高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により、 他のプラスミドＤＮＡフラグメントから精製される。ＤＮＡ溶出条件は、流速０ ．７５ｍｌ／分で、３０分で緩衝液Ａ（１ｍＭ ＥＤＴＡを含み、２Ｎ ＨＣｌで ｐＨ８．０に調整した、２５ｍＭトリス）と緩衝液Ｂ（１ｍＭ ＥＤＴＡおよび １Ｍ ＮａＣｌを含み、２Ｎ ＨＣｌでｐＨ８．０に調整した、２５ｍＭトリス） 各々５０％から緩衝液Ａ３０％と緩衝液Ｂ７０％までの勾配である。 結合した２つのＤＮＡをＢ.subtilis ＤＢ104に転換する。この菌株に存在す る主アルカリ性プロテアーゼおよび中性プロテアーゼをコードする遺伝子は、不 活性化されている（Ｋawamura,ＦおよびＤoi,Ｒ.Ａ,Ｊ.Ｂacteriol.160,442-444 ,1984年）。これらのプラスミドによって形質転換されたＢ.subtilis ＤＢ104の 細胞は、カナマイシンかテトラサイクリンのいずれかの存在下、栄養ミルク寒天 で培養する。突然変異体プロテアーゼを製造するＤＢ１０４の形質転換細胞は、 スキムミルクにおける加水分解の透明帯域の形成によって同定する。プロテアー ゼ産生形質転換細胞がプラスミド由来のＭ１３０遺伝子またはＭ１３１遺伝子と 希望する突然変異を担持していることの確認は、各形質転換細胞の培養由来のプ ラスミドＤＮＡを精製することによって遂行される。プラスミドＤＮＡを細胞蛋 白質から除去し、ＳＤＳ塩沈殿に後続するＱＩＡＧＥＮイオン交換カラム(ＱＬ ＡＧＥＮ,Ｉnc.,Ｃhatsworth,ＣＡ)によるクロマトグラフィで染色体ＤＮＡを除 去する。異なる形質転換細胞由来の各Ａｖａｌ／Ｓｓｔｌ分解プラスミドＤＮＡ を、無傷のＢＬＡＰ遺伝子を担持することがわかっているプラスミドｐＨ７０ま たはプラスミドｐＣ５１のＡｖａｌ／Ｓｓｔｌ分解誘導体と比較する。適当なサ イズのＡｖａｌ／Ｓｓｔｌ ＤＮＡフラグメントを有するプラスミドを同定する ために、これらのプラスミドの制限分解物をアガロースゲル電気泳動で比較する 。希望する突然変異が存在することを確認するため、選択された各プラスミドＤ ＮＡ の、予測されるＭ１３０突然変異またはＭ１３１突然変異の領域全体の配列を測 定する。プラスミドｐＣ５１の誘導体（ＴｃＲ）にクローニングされた遺伝子Ｍ １３０および遺伝子Ｍ１３１は、それぞれプラスミドｐＣＢ５６Ｍ１３０および プラスミドｐＣＢ５６Ｍ１３１と呼ばれる（第８図）が、プラスミドｐＨ７０の 誘導体にクローニングされた同一遺伝子はそれぞれプラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３ ０およびプラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３１と呼ばれる（第５図）。各ＢＬＡＰ突然 変異の１つ以上のクローンを１５％グリセロール中、−７０℃で凍結保存し、併 せてキャラクタリゼーション用の突然変異体プロテアーゼを産生するために振と うフラスコで培養する。 Ｂ．ＰＣＲオーバーラップ法により産生される突然変異体プリテアーゼのクロ ーニング 上記の通り、増幅されたＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３０ 、プラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３１またはｐＣＢ７６Ｆ４９に戻してクローニング する。Ｂ.licheniformis産生菌株に発現させる場合は、前述の通り、変更した（ modified）Ｍ１３０、Ｍ１３１またはＦ４９遺伝子を担持しているＡｖａｌ／Ｓ ｓｔｌフラグメントをｐＣ５１型ベクターに戻してクローニングする。 実施例４ 突然変異体プロテアーゼの産生 野生型ＢＬＡＰ蛋白質および突然変異体蛋白質を、振とうフラスコ内の形質転 換Ｂacillus subtilis ＤＢ 104に産生させた。ホットループ（hot loop）を使 用して、凍結低温生育培養から、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンまたは１５μｇ ／ｍｌのテトラサイクリンのいずれかを含むＬＢスキムミルク寒天へ各突然変異 体菌株を線状に接種した。プレートを３７℃で２０〜２４時間保温（incubate） した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンか１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンのい ずれかを含むルリアブイヨン（Ｌuria Ｂroth、ＬＢ）約５０ｍｌが入った２５ ０ｍｌエルレンマイヤー（Ｅrlenmeyer）フラスコに、スキムミルクの加水分解 の完全な帯域を形成する分離コロニー１個を採集した。このブイヨンを、ニュー ・ブランスウイッ ク・シリーズ２５インキュベータ・シェーカ（Ｎew Ｂrunswick Ｓeries 25 Ｉn cubator Ｓhaker）で２８０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で７〜８時間保温し た。濁った予備培養液２．５ｍｌを、５００ｍｌ緩衝化フラスコ４本の各々に入 っている、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンか１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン を含む５０ｍｌのＭＬＢＳＰに移すか、予備培養液５ｍｌを、５００ｍｌ緩衝化 フラスコ２本の各々に入っている抗生物質を含むＭＬＢＳＰブイヨン１００ｍｌ の接種材料として使用した（５％、ｖ／ｖ、転移）。すべてのフラスコを２４０ ｒｐｍ、３７℃で６４時間保温した。６４時間保温した後、各培養液について１ 組のフラスコの内容物を合併して５０ｍｌ遠心分離管に移し、４℃、20,000×ｇ_av で１５分間遠心分離した。このブイヨンを、ミラクロス（Ｍiracloth、Ｃalbi ochem Ｃorp.,＃475855）を通過させて氷上の４００ｍｌビーカー内にろ過した 。この溶液に氷酢酸を加えて、ｐＨを５．８に調整した。３０分間撹拌した後、 20,000×ｇ_avで１５分間遠心分離して細屑を除去した。上清の体積を記録した。 未変性（native）ポリアクリルアミドゲル電気泳動および変性ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（ＰhastＳystem,Ｐharmacia）による分析用、ＨＰＥ法による総 蛋白質分解活性の測定用、および活性部位滴定用に、部分標本１ｍｌを取って置 いた。プロテアーゼが精製できるまで、ブイヨンを氷上で保存した。長期保存ま たは輸送するために、ブイヨンを等量のプロパン−１，２−ジオールと混合した 。振とうフラスコ培養でＢＬＡＰを産生するのに使用したＭＬＢＳＰ培地の組成 を表に示す。 実施例５ ＢＬＡＰおよびその突然変異体蛋白質の精製 そうでないという記述がなければ、次のすべてのステップは、氷上または４℃ で実施した。実施例３で得られたブイヨンサンプルを、０．２μｍフィルターを 通過させてろ過し、ろ液を限外ろ過で濃縮した。ミニタンカセットＭinitan Ｃa ssette（Ｍillipore）または限外ろ過セル（Ａmicon）に取り付けた保持膜の名 目上の分子量カットオフは10,000であった。その後、搬送したり長期間貯蔵した りするために、ブイヨン溶液を等量のプロパン−１，２−ジオールと混合してプ ロテアーゼ安定化させた。さもなければ、ｐＨ７．０（「リン酸緩衝液」）の２ ０ｍＭリン酸ナトリウム、または１ｍＭのＣａＣｌ₂を含み、ＮａＯＨでｐＨ７ ．８に調整した２０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（ ２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）（「ＨＥＰＥＳ緩衝液」）で１６時間、 濃縮物を透析した。透析物を遠心分離（20,000×ｇ_av、１０分）で清澄にし、必 要に応じて、溶液のｐＨを再調整した。陰性に帯電した蛋白質を捕捉するため、 リン酸緩衝液に対して透析したサンプルを、同緩衝液で予め平衡化しておいた５ ％（ｗ／ｖ）ＤＥＡＥセルロースで１５分間平衡化した。遠心分離またはろ過で ＤＥＡＥ−セルロースを除去後、その上清を、リン酸緩衝液で予め平衡化してお いた陽イオン交換カラム（Ｓ-Ｓepharose Ｆast Ｆlow,Ｐharmacia、直径１６ｍ ｍ、長さ９０ｍｍ、床量１８ｍｌ、流速５０ｍｌ／時）に充填した。ＨＥＰＥＳ 緩衝液で透析したサンプルは、ＨＥＰＥＳ緩衝液で予め平衡化しておいた陽イオ ン交換カラム（Ｓ-Ｓepharose Ｆast Ｆlow,Ｐharmacia、直径１５ｍｍ、長さ７ ５ｍｍ、床量１３ｍｌ、流速５０ｍｌ／時）に直接加えた。すべての着色副産物 が溶出したら、カラムの３〜５倍量の使用緩衝液でカラムを洗浄した。１．０Ｍ のＮａＣｌをリン酸緩衝液に含めるか、または０．２５ＭのＮａＣｌをＨＥＰＥ Ｓ緩衝液に含めることにより、陽イオン交換体からプロテアーゼを溶出させた。 活性酵素を含む分画をプールした。 リン酸緩衝液中で精製した酵素を、セントリコン管Ｃentricon tube（分子量 カットオフ10,000、Ａmicon）を使用した限外ろ過により濃縮し、脱塩した。蛋 白質濃度は、ビシンコニン酸法（ＢＣＡ法、Ｐierce Ｃhemical Ｃo.,Ｒockford ,ＩＬ）で測定した。プロテアーゼを安定化させるため、５０％（ｖ／ｖ）プロ パン−１，２−ジオールを貯蔵溶液に加えた。 ＨＥＰＥＳ緩衝液中で精製した酵素を含むプール分画を、５〜８倍量過剰の、 −２０℃のアセトンと混合した。蛋白質を４分間沈殿させ、その混合物を6,600 ×ｇ_av.で４分間遠心分離した。上清を捨て、アセトンの大部分を除去するため にペレットを暫時真空（水分アスピレータ）に曝し、蛋白質濃度が約３０ｍｇ／ ｍｌとなるように、１ｍＭＣａＣｌ₂を含み、２ＮのＮａＯＨでｐＨ５．８に調 整した２０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）にペレッ トを溶解した。エッペンドルフ遠心分離器（Ｅppendorf centrifuge）で、全速 （13,000×ｇ_max.）で３分間遠心分離して溶液を清澄にし、使用するまで凍結保 存した。蛋白質濃度は、ビウレット法（Ｇornall,Ａ.Ｇ.,Ｂardawill,Ｃ.Ｓ.,Ｄ avid Ｍ.Ｍ.,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem..177,751-766,1948年）で測定した。 実施例６ 活性プロテアーゼの測定 活性酵素濃度は、フェニルメチルフッ化スルホニルをインヒビタとして用いた 活性部位滴定により測定した。プロテアーゼ溶液は、１０ｍＭリン酸ナトリウム 、ｐＨ６．５中で、蛋白質測定に基づいて約１００μＭの濃度で調製した。イン ヒビタ濃度は、推定モル比０．２５、０．５、０．７５、１．０および１．２５ と等価であった。室温で１時間、混合物を反応させた。ＡＡＰＦ−ｐＮＡ法（下 記参照）により、分光測光で残余酵素活性を測定した。 実施例７ 蛋白質分解活性の測定 ２種類の異なるプロテアーゼ分析法を使用した。ＨＰＥ法で、基質として１種 類の濃度のカゼインでプロテアーゼ活性を確立した。ＡＡＰＦ−ｐＮＡ分析法で 、スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−フェニルアラ ニル−ｐ−ニトロアニリド（ＡＡＰＦ−ｐＮＡ、Ｂachem Ｂioscience, Ｐhiladelphia,ＰＡ）支持触媒（supported catalysis）の初速を使用して速度 パラメータＫ_m、Ｋ_catおよびＫ_cat／Ｋ_mを測定した。 Ａ．ＨＰＥ法によるプロテアーゼ活性 カゼインを基質として使用する不連続分析で蛋白質分解活性を測定した。基質 溶液の最終濃度は合成水道水中、１２ｍｇ／ｍｌのカゼイン（Ｈammarsten、Ｍe rck,Ｄamstadt,＃2242に従って調製）および３０ｍＭのトリスであった。合成水 道水は０．０２９％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０１４％（ｗ／ｖ）Ｍ ｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、および０．０２１％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ₃の溶液で、その 硬度は１５°ｄＨ（deutsche Ｈarte、ドイツの硬度）であった。基質溶液を７ ０℃に加熱し、０．１ＮのＮａＯＨを使用してｐＨを５０℃で８．５に調製した 。合成水道水中２％（ｗ／ｖ）無水トリポリリン酸五ナトリウムを含むプロテア ーゼ溶液を調製し、塩酸でｐＨを８．５に調整した。カゼイン基質溶液６００μ ｌに、酵素溶液２００μｌを加えた。混合物を５０℃で１５分間、保温した。６ ００μｌの０．４４Ｍトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、３％（ｖ／ｖ）氷酢酸中の０ ．２２Ｍ酢酸ナトリウムを加えて反応を停止させた。氷上で１５分間冷却した後 、遠心分離でＴＣＡ不溶性蛋白質を除去し、９００μｌのアリコートを２ＮのＮ ａＯＨ３００μｌと混合し、ＴＣＡ可溶性ペプチドを含むこの混合物の２９０ｎ ｍにおける吸光度を記録した。ＴＣＡ溶液６００μｌをカゼイン溶液６００μｌ に加え、続いて酵素溶液２００μｌを加えて、コントロール値を求めた。 この分析条件で、２９０ｍｍで０．５００ＯＤの吸光度変化をもたらしたプロ テアーゼ溶液を、ｍｌ当たり１０ＨＰＥの活性を有すると表した。ＢＬＡＰ蛋白 質およびＢＬＡＰ突然変異体蛋白質のデータを以下にまとめる（表４）。 Ｂ．色素原基質ＡＡＰＦ−ｐＮＡによるプロテアーゼ分析 プロテアーゼ・サンプルを１００ｍＭトリス中５０％（ｖ／ｖ）１，２−プロ パンジオールで希釈し、２ＮのＨＣｌを用いて２５℃でｐＨ８．６に調整した（ トリス−プロパンジオール緩衝液）。ここで、プロテアーゼ・サンプルは室温で 少なくとも６時間安定していた。１６０ｍＭのＡＡＰＦ−ｐＮＡの原液は、使用 する少なくとも２４時間前に、モレキュラーシーブビーズ（Ａldrich,４Å、４ 〜８メッシュ）で乾燥させたジメチルスルホキシドで調製した。２ＮのＨＣｌを 用いて２５℃でｐＨ８．６に調製した１００ｍＭトリス中１．６ｍＭのＡＡＰＦ −ｐＮＡを用いて、２５℃、総量１．０２０ｍｌで、固定点分析を実施した。分 析開始の１分前に基質を分析緩衝液に加え、比活性に応じてｍｌ当たり蛋白質が ２０ｎｇ〜１．３μｇ（０．７５〜４８．５ｎＭの酵素）の最終濃度で酵素を添 加することにより反応を開始させた。４１０ｎｍでｐ−ニトロアニリドの遊離を モニタリングし、モル吸光係数８，４８０／Ｍ・ｃｍを使用して生成産物の量お よび濃度を算出した（ＤelＭar,Ｅ.Ｇ.,Ｌargman,Ｃ.,Ｂrodrick,Ｊ.Ｗ.,及びＧ eokas,Ｍ.Ｃ.,Ａnal Ｂiochem.99,316-320,1979年）。 ０．１６〜３．２ｍＭの範囲の異なる１２種類のＡＡＰＦ−ｐＮＡ濃度で各々 １度測定した初速から作成した速度対基質濃度プロットから速度パラメータを算 出した。データを双曲線にあてはめ、プログラムＥＮＺＦＩＴＴＥＲ（Ｌeather barrow，Ｒ.Ｊ.(1987年)ＥＮＺＦＩＴＴＥＲ,Ｂiosoft,Ｃambridge,ＵＫ）を使 用して、比例して重みをつけた。蛋白質濃度とプロテアーゼ酵素のモル濃度の変 換を必要とするすべての計算に、名目上の分子量２６．８ｋＤａを使用した（表 ４）。 実施例８ 蛋白質構造確認 ＢＬＡＰに導入した突然変異は、突然変異点のすぐ隣のＤＮＡ配列分析で確認 した。しかし、部位特異的変異領域外の自然突然変異が起こることは判明してお り、判定された突然変異体プロテアーゼの特性が、ヌクレオチド配列から導かれ るアミノ酸配列とともに実際に存在することを実証することが肝要であった。そ こで、個々のピークのアミノ酸配列分析によって確認されたＢＬＡＰのトリプシ ン・マップを作成し（第９図）、すべてのＢＬＡＰ蛋白質と比較した。アミノ酸 残基１７個またはそれ以下であるペプチドばかりでなく、アミノ酸残基が４８個 、４４個および４９個であるペプチド５Ｔ、７Ｔおよび１０Ｔ（第９図）でも、 １つの（保存的（conservative）であっても）置換で分離条件での保持時間がか なり変化した。特に間一髪の危機脱出は、等量の標準（ＢＬＡＰ）と突然変異体 蛋白質の共分解（co-digestion）によって解決された。 貯蔵溶液のプロテアーゼの部分標本５ｍｇまでを２．２ｍｌエペンドルフ管内 の氷上に置き、蛋白質最終濃度３．３３ｍｇ／ｍｌ、総量１．５ｍ１中０．１Ｎ のＨＣｌとなるように、０．１５ＮのＨＣｌを１．０ｍｌおよび水（両者とも冷 却した）と混合した。混合物を３０分間保温した後、冷却した５０％（ｗ／ｖ） トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１６５μｌを加えて蛋白質を沈殿させた。この沈殿を 氷上に５分間放置し、13,000×ｇ_max（エッペンドルフ遠心分離器）で４分間遠 心分離してペレット化させた。このペレットを８０％（ｖ／ｖ）アセトン１ｍｌ で１度洗浄し、真空で短時間乾燥させた。 トリプシン分解に必要なすべての試薬溶液および水は、使用する前に０．４５ μｍフィルター（Ｕltrafree-ＭＣ,Ｍillipore Ｐroduct）を通過させた。８Ｍ の尿素を含む０．８Ｍ炭酸水素アンモニウム９０μｌに変性蛋白質のペレット（ ５ｍｇ、１８５ｎｍｏｌ）を溶解した。この溶液を水３６０μｌでゆっくり希釈 し、遠心分離により０．４５μｍフィルタを通過させた。シリコン処理した０． ５ｍｌ微小試験管（Ｐhenix Ｒes.Ｐroducts)内で、後続のステップを実施した 。標本３００μｌのアリコートを１ｍＭのＨＣｌ中2.5ｍｇ／ｍｌのトリプシン １３μｌと混合した（ＢＬＡＰ：トリプシンの質量比＝１００：１）。コントロ ール用に、蛋白質溶 液１００μｌを４．５μｌの１ｍＭのＨＣｌと混合した。残りの蛋白質溶液部分 標本５０μｌを１０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５μｌと混合し、 出発材料のコントロールとして使用した。他の２種類の溶液を３７℃で１０分間 保温した。１０％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ３０μｌおよび１０μｌを、それぞれ分解物 およびコントロールに加えて反応を停止させた。ペプチド混合物を逆相ＨＰＬＣ で分離した。 ＨＰＬＣ装置はＷatersのもので、自動サンプラー（モデル７１５Ｕltra Ｗis p）、二重ポンプシステム（モデル６００Ｅ）および二極管配列検出器（モデル ９９０）で構成されていた。サンプル採取および勾配形成は、Ｗalterのソフト ウエアプログラム「９９０＋Ｐowerline」で管理した。トリプシンペプチド類は 、Ｃ₁₈カラム（Ｖydacモデル２１８ＴＰ５４、４．６×２５０ｍｍ、粒子サイズ ５μ、孔サイズ３００Å）で分離させた。Ｃ₁₈保護カラム（Ｖydacモデル２１８ ＦＳＫ１０４、粒子サイズ１０μ）は、分離カラムと一直線をなしていた。分離 カラムおよび保護カラムは、３０±１℃に設定したカラムヒーター内に収容した 。使用した溶媒系は、溶媒Ａ＝水中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝アセト ニトリル中０．０８％（ｖ／ｖ）ＴＦＡであった。サンプルの充填後、Ｃ₁₈カラ ムを溶媒Ａで３分間展開した後、勾配を７０分で溶媒Ａ中溶媒Ｂ０％から３５％ （ｖ／ｖ）にした。７０分で、勾配を１５分で１００％溶媒Ｂに上昇させ、次に １５分で１００％溶媒Ａに戻した。次に注入する前に、カラムを溶媒Ａで少なく とも２０分間平衡化した。 ２１５ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度の変化を記録した。分析用および 予備用に分離したペプチド混合物の量は、体積５〜５０μｌ中に１１μｇ（０． ４ｎｍｏｌ）〜５００μｇ（１８ｎｍｏｌ）の範囲で、２．２〜１０ｍｇ／ｍｌ の濃度範囲であった。 ペプチド配列決定のため、取り付けた記録装置で観察された吸光度の変化にし たがって、溶出液を手動分別した。β−メルカプトエタノールを用いた以前の試 験では、記録時刻からシステムより溶出する時刻までの遅延時間は２秒未満であ った。Ｓpeed Ｖac Ｃoncentrator（Ｓavant,Ｈickville,ＮＹ）内で分画を１０ ０μｌ未満まで真空濃縮し、最終ＴＦＡ濃度１％を達成するため、ＴＦＡ水溶液 で１ ００μｌとした。濃縮中にサンプルが完全に乾燥しないように注意した。 実施例９ 界面活性剤安定性によるプロテアーゼの特性化 典型的な陰イオン洗剤としてＳＤＳを用いて、界面活性剤に対するプロテアー ゼ突然変異体の安定性を試験した。１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含み、５０℃でｐＨ が１０．５の５０ｍＭ炭酸ナトリウムで安定性を試験した。最終蛋白質濃度０． ２５ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼ蛋白質を保温した。保温した混合物から部分標本 を定期的に取り出し、氷上で冷却したトリス−プロパンジオール緩衝液で希釈し た。基質濃度１．１ｍＭで、ＡＡＰＦ−ｐＮＡ分析により残余プロテアーゼの活 性を測定した。安定性は、時間の関数としての残余活性の片対数プロットから求 めた活性の半減期（ｔ_{1 ／2}）として表した。 実施例１０ プロテアーゼ突然変異体の洗浄能力 卵と煤煙（ＥＲ）で汚損した木綿の布切れ、および血液、牛乳および煤煙（Ｂ ＭＲ）で汚損した木綿の布切れを使用し、特別に開発した試験で洗浄能力を試験 した。各々明確に規定された洗剤組成物と試験プロテアーゼが入ったステンレス スチール試験容器を備え付けた、Ａtlas洗濯器（タイプＬＰ２）で洗浄試験を実 施した。 予め洗濯した木綿を、明確に規定された量の汚れで汚損し、６日間風乾させた 。洗濯器のビーカを、汚損した木綿の布切れ１枚と汚損していない木綿の布切れ ３枚で満たす。機械的処理のため、金属ボール（直径１０ｍｍ）を加えた。洗濯 時間は３０分で、加熱４分後に、最終温度の３０℃に達した。 これらの試験用の洗濯洗剤は、ヨーロッパで使用される典型的な組成のもので あった（Ｊakobi,Ｇ.Ｌohr,Ａ.Ｄetergents and Ｔextile Ｗashing,ＶＣＨ,Ｗe inheim,Ｇermay,1987年）。取り扱いが簡単な（easy-care）着色織物用のデリケ ートな織物用洗剤（５〜１５％（ｗ／ｗ）陰イオン界面活性剤、１〜５％（ｗ／ ｗ）非イオン界面活性剤）、強力なコンパクト洗剤（８％（ｗ／ｗ） 陰イオン界面活性剤、６％（ｗ／ｗ）非イオン界面活性剤、テトラアセチルエチ レンジアミン（ＴＡＥＤ）および過ホウ酸塩漂白剤を含む）、および超コンパク ト洗剤濃縮物（１８％（ｗ／ｗ）陰イオン界面活性剤、２．５％（ｗ／ｗ）非イ オン界面活性剤、ＴＡＥＤおよび過ホウ酸塩漂白剤を含む）の濃度は、１６°ｄ Ｈ（deutsche Ｈarte、ドイツの硬度）の水１００ｍｌ中、それぞれ０．５ｇ、 ０．５ｇ、および０．４ｇであった。超コンパクト洗剤は、幾つかの特許出願（ ＷＯ９１／０２０４７、ＷＯ９１／１３６７８、ＷＯ９３／０２１７６、ＷＯ９ ３／１５１８０、ＷＯ９４／０１５２６）に記載されている、押し出し洗剤顆粒 である。全例ともｐＨは１０．４であった。洗剤グラム当たり０、５０、１００ 、２００、３００、４００、５００、７００および１０００ＨＰＥの比率のＨＰ Ｅで測定した酵素活性に基づいて、プロテアーゼを洗濯液に加えた。 洗濯後、織物を流水ですすぎ、風乾させてアイロンをかけた。Ｄr.Ｌange色差 測定装置（Ｍicro Ｃolor）で測定した４４０ｎｍ（４００ｎｍ〜５００ｎｍ） における軽減（％Ｒｅｍ）の変化（△Ｒｅｍ）によって酵素の洗浄効果を測定し た。△Ｒｅｍは、プロテアーゼを添加して洗濯した後の軽減とプロテアーゼを添 加せずに洗濯した後の軽減との差である。洗浄能力試験の結果を表５および表６ に示す。 洗浄能力の改善は、標準△Ｒｅｍの達成に必要な野生型酵素と同じ効果を達成 するために必要な突然変異体酵素の量の比率によって測定した。したがって、改 善が２であるということは、野生型酵素と同じ効果を得るのに、半量の突然変異 体酵素が必要なことを示す。 実施例１１ 特許請求項６で定義されているプロテアーゼ突然変異体の濃縮製剤を約３０重 量％、セルロースを約５重量％、サッカロースを５重量％、小麦粉を２０重量％ 、デンプンを３０重量％、カルボキシメチルセルロースを５重量％、および ポリエチレングリコール（分子量20,000）を５重量％混合して、酵素洗剤組成物 を調製する。結果として生じる混合物を押し出し造粒によって造粒する。乾燥後 、この顆粒の活性は70,000〜250,000ＨＰＥ／ｇである。ＴｉＯ₂を含むポリエチ レングリコール（分子量６０００）で、この顆粒をコーティングする。過ホウ酸 塩／ＴＡＥＤを含む強力コンパクト洗剤（Ｐorsil supra）１００ｇとプロテア ーゼ酵素顆粒を混合すると、標準プロテアーゼ活性１２００ＨＰＥ／ｇになる。 実施例１２ プロテアーゼを特許請求項７に定義されているプロテアーゼを使用したこと以 外は、実施例１１と同様にして酵素洗剤組成を調製した。 実施例１３ 約１３重量％のＣ１０〜Ｃ１３直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、約５重量％ のアルキルポリグリコシド（Ｃ１２〜Ｃ１４）、約１０重量％のＥＯユニットを ７個有するＣ１３アルコールポリエトキシレート、約６重量％のラウリン酸、約 ７重量％のオレイン酸、約５重量％のトリエタノラミン、約５重量％のプロパン ジオール１，２、約２重量％の水酸化ナトリウム、約１重量％のクエン酸、約７ 重量％のエタノール、約１重量％のヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸お よび水を室温で一緒に混合して液体酵素洗剤組成物を調製する。 結果として得られた溶液のｐＨは８．１である（１０％水溶液として測定した ）。約０．５重量％の液体プロテアーゼ濃度（１２５０ＨＰＥ／ｇ）を有する組 成物を得るために、特許請求項６に定義された十分量のプロテアーゼを加える。 実施例１４ 比較のため、プロテアーゼＦ４９のＫＣ比および３種類の市販のプロテアーゼ のＫＣ比を上記の方法で測定し、次の結果を得た。 プロテアーゼ ＫＣ比 ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）a 0.92 ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）b 0.80 ＢＬＡＰ（商標） 0.83 Ｆ49 0.63 ａ）製造業者：オランダ、Ｇist Ｂrocades ｂ）製造業者：デンマーク、Ｎovo Ｎordisk 実施例１５ 蛋白質分解活性が５．６ＰＵ／ｍｌのＦ４９−含有炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ Ｈ１０．５）５０ｍｌに紡毛糸１ｇを加え、全体を室温で１時間反応させた。遊 離した各アミノ酸およびペプチドの量をＴＮＢＳで測定した（コントロール測定 はプロテアーゼを含まない緩衝溶液中）。以上のプロテアーゼＢＬＡＰの条件で 得られた毛糸の損傷値を１００％とした。以上の条件で、プロテアーゼＦ４９の 値は３１％であった。 実施例１６ 絹糸１ｇを使用して、実施例２に記述されている試験を繰り返した。次の絹糸 損傷が得られた。 プロテアーゼ 絹糸損傷 ＢＬＡＰ（商標） 100％ ＥＳＰＥＲＡＳＥ（商標）a 165％ ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）a 89％ Ｆ49 28％ ａ）製造業者：デンマーク、Ｎovo Ｎordisk 実施例１７ ＭＩＥＬＥ（商標）Ｅlectronic Ｗ793洗濯機で、バラスト洗いの（ballast w ashing）木綿の洗濯物の存在下、４０℃（水の硬度１６°ｄ、液比１：１５）で ９回、羊毛衣類を洗濯した（総荷重１．２ｋｇ）。無酵素有色洗剤９８ｇ（コン トロール試 験）、およびそれにＢＬＡＰ１４０溶液４９ｍｌ（比較試験）またはＦ４９（発 明）のＰＵで表した、同等に活性な量を加えておいたものを洗浄液剤で使用した 。洗濯した毛織物を乾燥させ、特定の寸法の一部分を切り取り重量を測定した。 洗濯前の値の％で表した重量の減少を下表に示す。 ａ）メリノウール８０％とポリアミド２０％の混合物。 実施例１８ 純毛の灰色のソックスを使用して実施例４を繰り返し、同等の活性の量のプロ テアーゼ（１０８０ＰＵ／ｇの洗剤）を再度使用した。実施例４と違って、５回 の洗濯を６０℃で実施した。プロテアーゼＦ４９を使用した場合、重量の減少は 僅か１０．７％であり、ＢＬＡＰ（商標）を使用した場合は４０．５％であった 。 実施例１９ 硬度が１５°ｄＨの水（０．０５８重量％のＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０２８ 重量％のＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏおよび０．０４２重量％のＮａＨＣＯ₃を含む）に １２ｇ/ｌの基質（カゼインまたはケラチン）および３０ｍＭのトリポリリン酸 ナトリウムを含む溶液を７０℃に加熱し、５０℃の０．１ＮのＮａＯＨを加えて ｐＨを８．５に調製した。２重量％トリポリリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８． ５）中で試験が行われる酵素溶液２００μｌを６００μｌの基質溶液に加える。 反応混合物を５０℃で１５分間保温する。ＴＣＡ溶液（３体積％酢酸中０．４４ Ｍのトリクロロ酢酸および０．２２Ｍの酢酸ナトリウム）５００μｌを加えて反 応を停止させる。ＴＣＡに不溶性の蛋白質を遠心分離で除去し、上清相９００μ ｌを３００μｌの２ＮのＮａＯＨで希釈する。この溶液の２９０ｎｍにおける吸 収を、吸光スペクトルで測定する。吸光ゼロ値は、上述のＴＣＡ溶液６００μｌ と上述の基質溶液６００μｌとを混合し、次に酵素溶液を加えて調製した遠心分 離液の測定によって決定しなければならない。 実施例２０ 予め洗濯した木綿織物を等量の汚れで汚損し、３日間風乾した。洗濯器（laun derometer）のビーカを汚損した木綿と汚損していない木綿の布切れ６枚および 金属ボール１０個（直径１ｃｍ）で満たし、選択時間は３０分で、加熱４分後に 最終温度の３０℃に到達した。Ａtlas ＬＰ-2タイプ洗濯器で洗濯した。微細特 殊（fine specialty）洗剤を、取り扱いが簡単な（easy-care）着色織物用に使 用した（０．７５ｇ/１００ｍｌ）。強力なコンパクト洗剤（０．５ｇ／１００ ｍｌ）および超コンパクト洗剤濃縮物（０．４ｇ／１００ｍｌ）も使用した。洗 剤の組成は、「洗剤と織物の洗濯(Ｄetergents and Textile Washing)」、Ｇ.Ｊ acobi＆Ａ．Ｌohr,ＶＣＨ,Ｗeinheim,ＩＳＢＮ 0-89573-687-Ｘ、1987年に記述 されている。使用した水は１６°ｄＨ（ドイツの硬度）で、ｐＨは４であった。 洗剤の酵素活性は、０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７０ ０および１０００ＨＰＥ/ｇ洗剤であった。洗濯後、試験布切れを水道水ですす ぎ、風乾し、アイロンをかけた。Ｄr.Ｌange色差測定装置Ｍicro Ｃolorを使用 して測定した４４０ｎｍにおける軽減（％Ｒｅｍ）の変化（△Ｒｅｍ）によって 酵素の洗浄効果を測定した。△Ｒｅｍは、プロテアーゼを添加して洗濯した後の 軽減とプロテアーゼを添加せずに洗濯した後の軽減との差である。種々の酵素を 含む洗剤および酵素の組合せを含む洗剤組成物の洗浄能力の結果を下記の表２お よび表３に示す。各記載事項は、標準△Ｒｅｍを達成する突然変異体酵素の量の 同じ洗浄効果を達成するための野生型酵素の量に対する比率である。改善が２で あるということは、同じ洗浄効果を達成するのに特定の突然変異体の２倍の野生 型酵素が必要であることを示す。データ、突然変異体Ｆ４６と突然変異体Ｆ４９ の組合せを含む洗剤組成物は、個々の酵素の平均より洗浄効果が大きいことも示 す。 実施例２１ プロテアーゼを特許請求項７に定義されているプロテアーゼと置き換えたこと 以外は実施例１３に記載の組成物と同様な組成物を調製する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/56 Ｃ１２Ｒ 1:125） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ (72)発明者 カットウィッツ，ビートリックス ドイツ連邦共和国，デュッセルドルフ デ ー−40593，アーデンバッカー アレー 51 (72)発明者 マーラー，カール−ハインツ ドイツ連邦共和国，エルクラース デー− 40699，デッヘンシュトラーセ ５ (72)発明者 ペーシ クリスチャン，ジー. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94014，ダリー シティ，セカンド アベ ニュー，240 (72)発明者 ポチャンドキー，ウィンフリード ドイツ連邦共和国，モンハイム デー− 40789，ヘーグルシュトラーセ 19, (72)発明者 プースカウ，ヨルグ ドイツ連邦共和国，デュッセルドルフ デ ー−40229，ハセラー リッヒトウェグ 79, (72)発明者 シュミット，イルムガード ドイツ連邦共和国，ソーリンゲン デー− 42697，フォーシスシュトラーセ 70エー, (72)発明者 タン マリア，アール. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94533，フェアーフィールド，クリフウッ ド ドライブ，2043 (72)発明者 ウッパダック，フォースト ドイツ連邦共和国，ラーティンゲン デー −40883，イム サンドファレスト 26 (72)発明者 ワイス，アルブレスト ドイツ連邦共和国，ランゲンフェルド デ ー−40764，フォーレレンウェグ 37 (72)発明者 ウィルソン チャールズ，ロナルド. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 95401，サンタ ローザ，パチェコ プレ イス，2323

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．スブチリシン（subtilisin）プロテアーゼのアミノ酸配列が一つ以上突然変 異し、その結果分子の基質結合領域付近の正の負荷が減少または負の負荷が上昇 していることを特徴とする、スブチリシンプロテアーゼの突然変異体。 ２．１９９１年５月２９日に出願された米国特許出願０７／７０６，６９１号中 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されたバチルス・レントゥス（Ｂacillus lent us）ＤＳＭ５４８３アルカリ性プロテアーゼ成熟体の少なくとも一つのアミノ酸 残基を置換して得られるバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３プロテアーゼの突 然変異体において、アルギニン−９９、セリン−１５４及びロイシン−２１１か らなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基を、グルタミン酸またはア スパラギン酸残基で置換して得られるバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３プロ テアーゼの突然変異体。 ３．１９９１年５月２９日に出願された米国特許出願０７／７０６，６９１号中 のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたアルカリ性プロテアーゼの突然変異体Ｍ１ ３１(Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ)の少なくとも一つ のアミノ酸残基を置換して得られるバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３プロテ アーゼの突然変異体において、セリン−１５４及びロイシン−２１１からなる群 から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基を、グルタミン酸またはアスパラギ ン酸残基で置換して得られるバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３プロテアーゼ の突然変異体。 ４．１９９１年５月２９日に出願された米国特許出願０７／７０６，６９１号中 のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されたバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３ア ルカリ性プロテアーゼ成熟体の少なくとも一つのアミノ酸残基を置換して得られ るバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３プロテアーゼの突然変異体において、ア ルギニン−９９のアミノ酸残基を、グリシン、アラニンまたはセリン残基で置換 して得られるバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３プロテアーゼの突然変異体。 ５．１９９１年５月２９日に出願された米国特許出願０７／７０６，６９１号中 のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたアルカリ性プロテアーゼの突然変異体Ｍ１ ３１(Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ)の少なくとも一つ のアミノ酸残基を置 換して得られるバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３プロテアーゼの突然変異体 において、アルギニン−９９のアミノ酸残基を、グリシン、アラニンまたはセリ ン残基で置換して得られるバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３プロテアーゼの 突然変異体。 ６．プロテアーゼが、Ｒ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ、Ｒ９９Ｅ、Ｌ２１１Ｄ、 Ｌ２１１Ｅ、Ｓ１５４Ｄ、Ｓ１５４Ｅのうちの、１または２以上の突然変異をし たスブチリシンのプロテアーゼであることを特徴とする、突然変異をしたスブチ リシンプロテアーゼを含む酵素洗剤組成物。 ７．突然変異をしたスブチリシンプロテアーゼが、Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｒ９９Ｇ、 Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ、Ｓ１５４Ｄ、Ｓ１５４Ｅ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１ ９９Ｉ、Ｌ２１１Ｄ、Ｌ２１１Ｅの突然変異うちの、１または２以上の突然変異 をしたプロテアーゼであることを特徴とする、突然変異をしたバチルス・レント ゥスＤＳＭ５４８３アルカリ性プロテアーゼを含む酵素洗浄剤組成物。 ８．１９９１年５月２９日に出願された米国特許出願０７／７０６，６９１号中 のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアルカリ性プロテアーゼの突然変異体Ｍ１ ３０(Ｓ３Ｔ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ)の少なくとも一つのアミノ 酸残基を置換して得られるバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３プロテアーゼの 突然変異体において、アルギニン−９９のアミノ酸残基を、グリシン、アラニン またはセリン残基で置換して得られるバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３プロ テアーゼの突然変異体。 ９．転写方向において、プロモーター、リボゾーム結合部位、開始コドン、前領 域の一部に連鎖操作（operably linked）できるＢaillus licheniformis ＡＴＣ Ｃ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の前領域の主要部分、及び、ＡＴＣ Ｃ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ転写ターミネーターが続く、バチルス・レ ントゥスＤＳＭ５４８３アルカリ性プロテアーゼ（ＢＬＡＰ）変異型Ｍ１３０を コードする遺伝子の全ての不活性部分（pro）及び成熟領域からなる、ＢＬＡＰ をコードする突然変異遺伝子において、前記ＢＬＡＰ遺伝子のコドンが、Ｓｅｒ ３、Ａｌａ１８８、Ｖａｌ１９３、Ｖａｌ１９９及びＡｒｇ９９の位置のアミノ 酸の置換によって得られたプロテアーゼをコードする突然変異遺伝子を産生する ように変異された突然変異遺伝子。 １０．３位のセリンをトレオニンで、１８８位のアラニンをプロリンで、１９３ 位のバリンをメチオニンで、１９９位のバリンをイソロイシンで、及び９９位の アルギニンをグリシン、アラニンまたはセリンで置換した、前記プロテアーゼの 突然変異体をコードする請求項９に記載の突然変異遺伝子。 １１．転写方向において、プロモーター、リボゾーム結合部位、開始コドン、前 領域の一部に連鎖操作できるＢacillus licheniformis ＡＴＣＣ５３９２６アル カリ性プロテアーゼ遺伝子の前領域の主要部分、及び、ＡＴＣＣ５３９２６アル カリ性プロテアーゼ転写ターミネーターが続く、バチルス・レントゥスＤＳＭ５ ４８３アルカリ性プロテアーゼ（ＢＬＡＰ）変異型Ｍ１３１をコードする遺伝子 の全ての不活性部分及び成熟領域からなる、ＢＬＡＰをコードする突然変異遺伝 子において、前記ＢＬＡＰ遺伝子のコドンが、Ｓｅｒ３、Ｖａｌ４、Ａｌａ１８ ８、Ｖａｌ１９３及びＶａｌ１９９の位置のアミノ酸の置換、及び、Ａｒｇ９９ 、Ｓｅｒ１５４及びＬｅｕ２１１の少なくとも一つのアミノ酸の置換とによって 得られたプロテアーゼをコードする突然変異遺伝子を産生するように変異された 突然変異遺伝子。 １２．３位のセリンをトレオニンで、４位のバリンをイソロイシンで、１８８位 のアラニンをプロリンで、１９３位のバリンをメチオニンで、１９９位のバリン をイソロイシンで、及び９９位のアルギニンをグリシン、アラニンまたはセリン で置換した、前記突然変異プロテアーゼをコードする請求項１１に記載の突然変 異遺伝子。 １３．３位のセリンをトレオニンで、４位のバリンをイソロイシンで、１８８位 のアラニンをプロリンで、１９３位のバリンをメチオニンで、１９９位のバリン をイソロイシンで、及び１５４位のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸 で置換した、前記突然変異プロテアーゼをコードする請求項１１に記載の突然変 異遺伝子。 １４．３位のセリンをトレオニンで、４位のバリンをイソロイシンで、１８８位 のアラニンをプロリンで、１９３位のバリンをメチオニンで、１９９位のバリン をイソロイシンで、及び２１１位のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン 酸で置換した、前記突然変異プロテアーゼをコードする請求項１１に記載の突然 変異遺伝子。 １５．３位のセリンをトレオニンで、４位のバリンをイソロイシンで、１８８位 のアラニンをプロリンで、１９３位のバリンをメチオニンで、１９９位のバリン をイソロイシンで、９９位のアルギニンをグリシン、アラニンまたはセリンで、 及び２１１位のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換した、前記 突然変異プロテアーゼをコードする請求項１１に記載の突然変異遺伝子。 １６．３位のセリンをトレオニンで、４位のバリンをイソロイシンで、１８８位 のアラニンをプロリンで、１９３位のバリンをメチオニンで、１９９位のバリン をイソロイシンで、１５４位のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸で、 及び２１１位のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換した、前記 突然変異プロテアーゼをコードする請求項１１に記載の突然変異遺伝子。 １７．請求項９に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つ、Ｂacillus sp.に おいて複製されるプラスミド。 １８．請求項１０に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つ、Ｂacillus sp. において複製されるプラスミド。 １９．請求項１１に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つ、Ｂacillus sp. において複製されるプラスミド。 ２０．請求項１２に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つ、Ｂacillus sp. において複製されるプラスミド。 ２１．請求項１３に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つ、Ｂacillus sp. において複製されるプラスミド。 ２２．請求項１４に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つ、Ｂacillus sp. において複製されるプラスミド。 ２３．請求項１５に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つ、Ｂacillus sp. において複製されるプラスミド。 ２４．請求項１６に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つ、Ｂacillus sp. において複製されるプラスミド。 ２５．請求項９に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つプラスミドを含む、 形質転換したバチルス（Ｂacillus）である宿主。 ２６．請求項１０に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つプラスミドを含む 、形質転換したバチルスである宿主。 ２７．請求項１１に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つプラスミドを含む 、形質転換したバチルスである宿主。 ２８．請求項１２に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つプラスミドを含む 、形質転換したバチルスである宿主。 ２９．請求項１３に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つプラスミドを含む 、形質転換したバチルスである宿主。 ３０．請求項１４に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つプラスミドを含む 、形質転換したバチルスである宿主。 ３１．請求項１５に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つプラスミドを含む 、形質転換したバチルスである宿主。 ３２．請求項１６に記載の突然変異プロテアーゼ遺伝子を持つプラスミドを含む 、形質転換したバチルスである宿主。 ３３．前記宿主細胞が、Ｂacillus licheniformis ＡＴＣＣ ５３９２６である 、請求項１７に記載の形質転換したバチルス宿主細胞。 ３４．前記宿主細胞がバチルス・スブチリス（Ｂacillus subtilis）である、請 求項１７に記載の形質転換したバチルス宿主細胞。 ３５．前記宿主細胞がＢacillus licheniformis ＡＴＣＣ ５３９２６である、 請求項１９に記載の形質転換したバチルス宿主菌株。 ３６．前記宿主細胞がＢacillus subtilisである、請求項１９に記載の形質転換 したバチルス宿主菌株。 ３７．少なくとも１種の界面活性剤、及び、タンパク質加水分解活性量の、ケラ チナーゼ／カゼイナーゼ活性比（ＫＣ比）が約０．８０未満のプロテアーゼを含 む、タンパク質繊維の（proteinogenic）生地を洗浄する洗浄剤組成物。 ３８．前記プロテアーゼのＫＣ比が約０．７０未満である、請求項３７に記載の 洗浄剤。 ３９．前記ＫＣ比が約０．２〜約０．６５である、請求項３７に記載の洗浄剤。 ４０．前記プロテアーゼのタンパク質加水分解活性が約１００ＰＵ／ｇ〜約７５ ００ＰＵ／ｇである、請求項３７に記載の洗浄剤。 ４１．前記プロテアーゼがバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３の突然変異体の 変異型Ｆ４９である、請求項３７に記載の洗浄剤。 ４２．タンパク質加水分解活性量の、ケラチナーゼ／カゼイナーゼ活性比が約０ ．８０未満のプロテアーゼ、及び、脂肪族アルキルポリグリコシド、脂肪族アル キルポリアルコキシレート、脂肪酸ポリヒドロキシアミド、エトキシ化脂肪族ア ルキルアミン、プロポキシ化脂肪族アルキルアミン、エトキシ化ビシナルジオー ル、プロポキシ化ビシナルジオール、エトキシ化脂肪酸アルキルエステル、プロ ポキシ化脂肪酸アルキルエステル、エトキシ化脂肪酸アミド、プロポキシ化脂肪 酸アミド、及びそれらの混合物からなる群より選ばれるノニオン界面活性剤を含 む、タンパク質繊維の生地を洗浄する洗浄剤組成物。 ４３．前記ノニオン界面活性剤を約２〜約２５重量％含む、請求項４２に記載の 洗浄剤。 ４４．硫酸脂肪族アルキル、脂肪族アルキルエーテル硫酸塩、スルホ脂肪酸（su lfofatty acid）エステル、スルホ脂肪酸二塩、及びそれらの混合物からなる群 より選ばれるアニオン界面活性剤をさらに含む、請求項４２に記載の洗浄剤。 ４５．タンパク質加水分解活性量の、ケラチナーゼ／カゼイナーゼ活性比が約０ ．８０未満のプロテアーゼ、及び、硫酸脂肪族アルキル、脂肪族アルキルエーテ ル硫酸塩、スルホ脂肪酸エステル、スルホ脂肪酸二塩、及びそれらの混合物から なる群より選ばれるアニオン界面活性剤を含む、タンパク質繊維の生地からなる 生地を洗浄する洗浄剤組成物。 ４６．前記アニオン界面活性剤を約２〜約２５重量％含む、請求項４５に記載の 洗浄剤。 ４７．前記アニオン界面活性剤が、アルキル基またはアルケニル基の炭素数が約 ８〜約２２の、硫酸アルキル、硫酸アルケニル、硫酸アルキルエーテル、硫酸ア ルケニルエーテルからなる群より選ばれる、請求項４５に記載の洗浄剤。 ４８．前記アルキル基またはアルケニル基の炭素数が約１２〜約１８である、請 求項４７に記載の洗浄剤。 ４９．アルカリ金属アルミニウムケイ酸塩（alumosilicate）、モジュラスが１ より大きい結晶性アルカリ金属ケイ酸塩、単量体ポリカルボキシレート、重合体 ポリカルボキシレート、及びそれらの混合物からなる群より選ばれる１種のビル ダーをさらに含む、請求項３７に記載の洗浄剤。 ５０．前記ビルダーを約２．５〜約６０重量％含む、請求項３７に記載の洗浄剤 。 ５１．約２０〜約５５重量％の無機ビルダーと、約１５重量％以下の水溶性有機 ビルダーと、約２．５〜約２０重量％のアニオン界面活性剤と、約１〜約２０重 量％のノニオン界面活性剤と、約２５重量％以下の漂白剤と、約８重量％以下の 漂白活性化剤と、約２０重量％以下の無機塩と、約０．４〜約１．２重量％のリ パーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、オキシダーゼま たはペルオキシダーゼと、タンパク質加水分解活性量の、ケラチナーゼ／カゼイ ナーゼ活性比が約０．８０未満のプロテアーゼとを含む、タンパク質繊維の生地 からなる生地を洗浄する洗浄剤組成物。 ５２．前記有機ビルダーの量が約２〜約１２重量％、前記漂白剤の量が約１〜約 １５重量％、前記漂白活性化剤の量が約０．５〜約６重量％、前記無機塩の量が 約０．１〜約１５重量％、前記リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ 、プルラナーゼ、オキシダーゼまたはペルオキシダーゼの量が約０．４〜約１． ２重量％である、請求項５１に記載の洗浄剤。 ５３．前記無機塩がアルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩、またはアル カリ金属硫酸塩である、請求項５１に記載の洗浄剤。 ５４．約２０〜約５５重量％の無機ビルダーと、約１５重量％以下の水溶性有機 ビルダーと、約１５重量％以下のアニオン界面活性剤と、約４〜約２４重量％の ノニオン界面活性剤と、約６５重量％以下の無機塩と、タンパク質加水分解活性 量の、ケラチナーゼ／カゼイナーゼ活性比が約０．８０未満のプロテアーゼとを 含む、タンパク質繊維の生地からなる生地を洗浄する洗浄剤組成物。 ５５．前記有機ビルダーの量が約２〜約１２重量％、前記アニオン界面活性剤の 量が約１〜約１０重量％、前記無機塩の量が約１〜約３０重量％である、請求項 ５４に記載の洗浄剤。 ５６．第一及び第二のプロテアーゼの突然変異体を含む組成物において、第一の プロテアーゼの突然変異体は、９９位及び１５４位の少なくとも一方のアミノ酸 残基がバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３と異なっており、第二のプロテアー ゼの突然変異体は、少なくとも２１１位のアミノ酸残基がバチルス・レントゥス ＤＳＭ５４８３と異なっている組成物。 ５７．前記第一のプロテアーゼの突然変異体がＦ４６である、請求項５６に記載 の組成物。 ５８．前記第二のプロテアーゼの突然変異体がＦ４９である、請求項５６に記載 の組成物。 ５９．少なくとも一種の界面活性剤、及び、少なくとも第一及び第二のプロテア ーゼの突然変異体を含む洗浄剤組成物において、第一のプロテアーゼの突然変異 体は、９９位及び１５４位の少なくとも一方のアミノ酸残基がバチルス・レント ゥスＤＳＭ５４８３と異なっており、第二のプロテアーゼの突然変異体は、少な くとも２１１位のアミノ酸残基がバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３と異なっ ている洗浄剤組成物。 ６０．タンパク質繊維の生地からなる生地を、少なくとも一種の界面活性剤と、 タンパク質加水分解活性量の、ケラチナーゼ／カゼイナーゼ活性比が約０．８０ 未満のプロテアーゼとを含む組成物に接触させる工程を含む、タンパク質繊維の 生地からなる生地を洗浄する方法。 ６１．前記プロテアーゼのＫＣ比が約０．７０未満である、請求項６０に記載の 方法。 ６２．前記ＫＣ比が約０．２〜約０．６５である、請求項６０に記載の方法。 ６３．前記プロテアーゼのタンパク質加水分解活性が約１００ＰＵ／ｇ〜約７５ ００ＰＵ／ｇである、請求項６０に記載の方法。 ６４．前記プロテアーゼがバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３の突然変異体の 変異型Ｆ４９である、請求項６０に記載の方法。 ６５．前記界面活性剤が、脂肪族アルキルポリグリコシド、脂肪族アルキルポリ アルコキシレート、脂肪酸ポリヒドロキシアミド、エトキシ化脂肪族アルキルア ミン、プロポキシ化脂肪族アルキルアミン、エトキシ化ビシナルジオール、プロ ポキシ化ビシナルジオール、エトキシ化脂肪酸アルキルエステル、プロポキシ化 脂肪酸アルキルエステル、エトキシ化脂肪酸アミド、プロポキシ化脂肪酸アミド 、及びそれらの混合物からなる群より選ばれるノニオン界面活性剤である、請求 項６０に記載の方法。 ６６．前記ノニオン界面活性剤を約２〜約２５重量％含む、請求項６０に記載の 方法。 ６７．前記界面活性剤が、さらに、脂肪族アルキル硫酸塩、脂肪族アルキルエー テル硫酸塩、スルホ脂肪酸エステル、スルホ脂肪酸二塩、及びそれらの混合物か らなる群より選ばれるアニオン界面活性剤を含む、請求項６０に記載の方法。 ６８．タンパク質繊維の生地からなる生地を、タンパク質加水分解活性量の、ケ ラチナーゼ／カゼイナーゼ活性比が約０．８０未満のプロテアーゼと、脂肪族ア ルキル硫酸塩、脂肪族アルキルエーテル硫酸塩、スルホ脂肪酸エステル、スルホ 脂肪酸二塩、及びそれらの混合物からなる群より選ばれるアニオン界面活性剤と に接触させる工程を含む、タンパク質繊維の生地からなる生地を洗浄する方法。 ６９．前記アニオン界面活性剤を約２〜約２５重量％含む、請求項６８に記載の 方法。 ７０．前記アニオン界面活性剤が、アルキル基またはアルケニル基の炭素数が約 ８〜約２２の、硫酸アルキル、硫酸アルケニル、硫酸アルキルエーテル、硫酸ア ルケニルエーテルからなる群より選ばれる、請求項６９に記載の方法。 ７１．前記アルキル基またはアルケニル基の炭素数が約１２〜約１８である、請 求項７０に記載の方法。 ７２．前記組成物が、さらに、アルカリ金属アルミニウムケイ酸塩、モジュラス が１以上の結晶アルカリ金属ケイ酸塩脂肪族アルキル硫酸塩、単量体ポリカルボ キシレート、重合体ポリカルボキシレート、及びそれらの混合物からなる群より 選ばれるビルダーを含む、請求項６０に記載の方法。 ７３．前記ビルダーを約２．５〜約６０重量％含む、請求項７２に記載の方法。 ７４．タンパク質繊維の生地からなる生地を、約２０〜約５５重量％の無機ビル ダーと、約１５重量％以下の水溶性有機ビルダーと、約２．５〜約２０重量％の アニオン界面活性剤と、約１〜約２０重量％のノニオン界面活性剤と、約２５重 量％以下の漂白剤と、約８重量％以下の漂白活性化剤と、約２０重量％以下の無 機塩と、約０．４〜約１．２重量％のリパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セル ラーゼ、プルラナーゼ、オキシダーゼまたはペルオキシダーゼと、タンパク質加 水分解活性量の、ケラチナーゼ／カゼイナーゼ活性比が約０．８０未満のプロテ アーゼとを含む洗浄剤組成物に接触させる工程を含む、タンパク質繊維の生地か らなる生地を洗浄する方法。 ７５．前記有機ビルダーの量が約２〜約１２重量％、前記漂白剤の量が約１〜約 １５重量％、前記漂白活性化剤の量が約０．５〜約６重量％、前記無機塩の量が 約０．１〜約１５重量％、前記リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ 、プルラナーゼ、オキシダーゼまたはペルオキシダーゼの量が約０．４〜約１． ２重量％である、請求項７４に記載の方法。 ７６．前記無機塩がアルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩、またはアル カリ金属硫酸塩である、請求項７４に記載の方法。 ７７．タンパク質繊維の生地からなる生地を、約２０〜約５５重量％の無機ビル ダーと、約１５重量％以下の水溶性有機ビルダーと、約１５重量％以下のアニオ ン界面活性剤と、約４〜約２４重量％のノニオン界面活性剤と、約６５重量％以 下の無機塩と、タンパク質加水分解活性量の、ケラチナーゼ／カゼイナーゼ活性 比が約０．８０未満のプロテアーゼとを含む洗浄剤組成物に接触させる工程を含 む、タンパク質繊維の生地からなる生地を洗浄する方法。 ７８．前記有機ビルダーの量が約２〜約１２重量％、前記アニオン界面活性剤の 量が約１〜約１０重量％、前記無機塩の量が約１〜約３０重量％である、請求項 ７７に記載の方法。 ７９．少なくとも一種の界面活性剤と、タンパク質加水分解活性量の第一及び第 二のプロテアーゼの突然変異体を含む組成物において、第一のプロテアーゼの突 然変異体は、９９位及び１５４位の少なくとも一方のアミノ酸残基がバチルス・ レントゥスＤＳＭ５４８３と異なっており、第二のプロテアーゼの突然変異体は 、少なくとも２１１位のアミノ酸残基がバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３と 異なっている組成物。 ８０．前記第一のプロテアーゼの突然変異体がＦ４６である、請求項７９に記載 の組成物。 ８１．前記第二のプロテアーゼの突然変異体がＦ４９である、請求項７９に記載 の組成物。 ８２．少なくとも一種の界面活性剤と、タンパク質加水分解活性量の第一及び第 二のプロテアーゼの突然変異体を含む組成物において、各プロテアーゼが、Ｒ９ ９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ、Ｓ１５４Ｄ、Ｓ１５４Ｅ、Ｌ２２１Ｄ、Ｌ２２１Ｅ 、及びそれらの混合物からなる群より選ばれる一つのアミノ酸置換体を有する組 成物。 ８３．血液及び卵のしみが付いた布を、少なくとも一種の界面活性剤と、タンパ ク質加水分解活性量の第一及び第二のプロテアーゼの突然変異体を含む組成物に 接触させることにより布からしみを抜く方法において、第一のプロテアーゼの突 然変異体は、９９位及び１５４位の少なくとも一方のアミノ酸残基がバチルス・ レントゥス ＤＳＭ５４８３と異なっており、第二のプロテアーゼの突然変異体 は、少なくとも２１１位のアミノ酸残基がバチルス・レントゥス ＤＳＭ５４８ ３と異なっている方法。 ８４．前記第一のプロテアーゼの突然変異体がＦ４６である、請求項８３に記載 の方法。 ８５．前記第二のプロテアーゼの突然変異体がＦ４９である、請求項８３に記載 の方法。 ８６．血液及び卵の染みが付いた布を、少なくとも一種の界面活性剤と、タンパ ク質加水分解活性量の第一及び第二のプロテアーゼの突然変異体を含む組成物に 接触させることにより布からしみを抜く方法において、各プロテアーゼが、Ｒ９ ９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ、Ｓ１５４Ｄ、Ｓ１５４Ｅ、Ｌ２２１Ｄ、Ｌ２２１Ｅ 、及びそれらの混合物からなる群より選ばれる一つのアミノ酸置換体を有する方 法。