ES2302701T3 - N3'-p5' tiofosforamidatos oligonucleotidicos: su sintesis y uso. - Google Patents

N3'-p5' tiofosforamidatos oligonucleotidicos: su sintesis y uso. Download PDF

Info

Publication number
ES2302701T3
ES2302701T3 ES00961689T ES00961689T ES2302701T3 ES 2302701 T3 ES2302701 T3 ES 2302701T3 ES 00961689 T ES00961689 T ES 00961689T ES 00961689 T ES00961689 T ES 00961689T ES 2302701 T3 ES2302701 T3 ES 2302701T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
oligonucleotide
thiophosphoramidate
telomerase
accordance
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES00961689T
Other languages
English (en)
Inventor
Sergei Gryaznov
Krisztina Pongracz
Tracy Matray
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Geron Corp
Original Assignee
Geron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Geron Corp filed Critical Geron Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2302701T3 publication Critical patent/ES2302701T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un oligonucleótido que comprende una secuencia no homopolímera de subunidades de nucleósido, unidas por al menos un enlace entre las subunidades que es un N3-->P5'' tiofosforamidato definido por la fórmula: 3''-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5'' en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, y sus sales, y en donde el oligonucleótido puede inhibir o reducir la actividad de telomerasa en al menos 10% comparada con un control en el cual la enzima no está tratada con el oligonucleótido.

Description

N3'-P5' tiofosforamidatos oligonucleotídicos: su síntesis y uso.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a oligonucleótidos que tienen una nueva cadena principal de azúcar-fosfato que contiene enlaces internucleosídicos 3'-NHP(O)(S)O-5'. Más particularmente, la presente invención se refiere a composiciones oligonucleotídicas con tiofosforamidato, a su uso como agentes de diagnóstico o agentes terapéuticos y a métodos para sintetizar oligonucleótidos con tiofosforamidato.
Antecedentes de la invención
La química de los polímeros de ácidos nucleicos ha jugado un papel crucial en el desarrollo de muchas tecnologías en los campos farmacéutico, de diagnóstico y analítico y más particularmente, en los campos más limitados de los compuestos terapéuticos antisentido y antigenes, la química combinatoria, la amplificación de señales de DNA ramificado y los diagnósticos y análisis de DNA basados en chips (por ejemplo, Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990; Milligan et al., J. Med. Chem., 36:1923-1937, 1993; DeMesmaeker et al., Current Opinion in Structural Biology, 5:343-355, 1995; Roush, Science, 276: 1192-1193, 1997; Thuong et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32: 666-690, 1993; Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 5381-5383, 1992; Gold et al., Ann. Rev. Biochem., 64: 763-797, 1995; Gallop et al., J. Med. Chem., 37: 1233-1258, 1994; Gordon et al., J. Med. Chem., 37: 1385-1401, 1994; Gryaznov, solicitud de patente internacional PCT/US94/07557; Urdea et al., patente de EE.UU. No. 5.124.246; Southern et al., Genomics, 13:1008-1017, 1992; McGall et al., patente de EE.UU. No. 5.412.087; Fodor et al., patente de EE.UU. No. 5.424.186; Pirrung et al., patente de EE.UU. No. 5.405.783).
Mucha de esta química ha sido dirigida a mejorar la fuerza de unión, especificidad y resistencia a la nucleasa de los polímeros naturales de ácidos nucleicos, tales como el DNA. Desafortunadamente, las mejoras en una propiedad, tal como la resistencia a la nucleasa, implican frecuentemente las descompensaciones de otras propiedades, tales como la fuerza de unión. Abundan ejemplos de dichas descompensaciones: los ácidos nucleicos peptídicos (abreviadamente en lo sucesivo PNA por la expresión inglesa Peptide Nucleic Acids) presentan buena resistencia a la nucleasa y buena fuerza de unión, pero en los cultivos de ensayo tienen una reducida absorción celular (por ejemplo, Hanvey et al., Science, 258; 1481-1485, 1992); los fosforotioatos tienen buena resistencia a la nucleasa y buena solubilidad, pero se sintetizan típicamente como mezclas P-quirales y presentan varios efectos biológicos no específicos de la secuencia (por ejemplo, Stein et al., Science, 261:1004-1012, 1993); los metilfosfonatos tienen buena resistencia a la nucleasa y buena absorción celular, pero también se sintetizan típicamente como mezclas P-quirales y tienen una reducida estabilidad del dúplex (por ejemplo, Mesmaeker et al., (antes citado); y así sucesivamente.
Recientemente, se ha desarrollado una nueva clase de análogos de oligonucleótidos que tiene los llamados enlaces internucleosídicos N3'\rightarrowP5' fosforamidato, que presentan propiedades de unión, resistencia a la nucleasa y solubilidad favorables (Gryaznov andLetsinger, Nucleic Acids Research, 20:3403-3409, 1992; Chen et al., Nucleic Acids Research, 23: 2661-2668, 1995; Gryaznov et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 5798-5802, 1995; y Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc., 116: 3143-3144, 1994). Los compuestos de fosforamidato contienen un grupo 3'-amino en cada uno de los residuos nucleosídicos de 2'-desoxifuranosa que reemplaza a un átomo de 3'-oxígeno. La síntesis y las propiedades de los N3'\rightarrowP5' fosforamidatos oligonucleotídicos también están descritas por Gryaznov et al., en las patentes de EE.UU. Nº 5.591.607, 5.599.922, 5.726.297; y Hirschbein et al., en la patente de EE.UU. 5.824.793.
Los N3'\rightarrowP5' fosforamidatos oligonucleotídicos forman estructuras dúplex inusualmente estables con DNA complementario y especialmente, con cadenas de RNA, así como estructuras tríplex estables con dúplex de DNA, y también son resistentes a las nucleasas (Chen et al., Nucleic Acids Research, 23: 2661-2668, 1995; Gryaznov et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 5798-5802 (1995). Además los N3'\rightarrowP5' fosforamidatos oligonucleotídicos son agentes antisentido más potentes que los derivados de fosforotioato, tanto in vitro como in vivo (Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 3966-3971, 1997). Al mismo tiempo, los fosforamidatos tienen aparentemente baja afinidad por las proteínas intracelulares y extracelulares y mayor susceptibilidad a los ácidos con relación a los correspondientes fosfodiésteres naturales (Gryaznov et al., Nucleic Acids Research, 24:1508-1514, 1996). Estos aspectos de los fosforamidatos oligonucleotídicos afectan potencialmente de manera adversa a sus propiedades farmacológicas para algunas aplicaciones. En particular, la estabilidad frente a los ácidos de un oligonucleótido es una cualidad importante, dado el deseo de usar los agentes oligonucleótidos como compuestos terapéuticos por vía oral.
Con el fin de evitar los problemas antes descritos, asociados a los análogos de oligonucleótidos, se buscó una nueva clase de compuestos que incorporasen las mejores características tanto de los fosforamidatos como de los fosforotioatos oligonucleotídicos. La presente invención describe la síntesis, propiedades y usos de los N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos oligonucleotídicos.
Sumario de la invención
Las composiciones y los métodos de la presente invención se refieren a polinucleótidos que tienen subunidades nucleosídicas contiguas unidas por enlaces entre las subunidades. En los polinucleótidos de la presente invención, al menos dos subunidades contiguas están unidas por un enlace entre subunidades N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, definido por la fórmula: 3'[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5', donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo y sus sales. En una realización preferida de la invención, R es hidrógeno o una de sus sales. Los polinucleótidos de la invención pueden estar formados de tal manera que todos los enlaces entre las subunidades son N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato. Alternativamente, los polinucleótidos de la invención pueden contener una segunda clase de enlaces entre subunidades, tales como enlaces fosfodiéster, fosfotriéster, metilfosfonato, P'3\rightarrowN5' fosforamidato, N'3\rightarrowP5' fosforamidato y fosforotioato. El compuesto de la invención puede inhibir o reducir la actividad de telomerasa en al menos el 10% en comparación con un control o testigo en el que la enzima no ha sido tratada con el oligonucleótido.
Un enlace ilustrativo entre las subunidades N'3'\rightarrowP5' tiofosforamidato tiene la fórmula:
1
en donde B es una purina o pirimidina o uno de sus análogos, Z es SR en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y arilo y sus sales; y R_{1} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, O-R_{2}, S-R_{2} y halógeno, en donde R_{2} es H, alquilo o (CH_{2})_{n}W(CH_{2})_{m}H, en donde n está entre 1 y 10, m está entre 0 y 10 y W es O, S ó NH. Las subunidades nucleosídicas que constituyen los polinucleótidos pueden seleccionarse para estar en una secuencia definida; tal como una secuencia de bases complementaria con una secuencia monocatenaria diana de ácidos nucleicos o una secuencia que permita la formación de una estructura tríplex entre el polinucleótido y un dúplex diana. Las subunidades nucleosídicas unidas por al menos un enlace entre subunidades N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, como se ha descrito antes, tienen resistencia superior a la hidrólisis ácida, pero retienen la misma estabilidad térmica en comparación con los oligonucleótidos que tienen enlaces entre subunidades de fosforamidato.
La presente invención también incluye un método para sintetizar un N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato oligonucleotídico. En este método se une un primer 5'-succinil-3'-aminotritil-2',3'-didesoxi-nucleósido, a un soporte en fase sólida. El primer nucleósido tiene adicionalmente un grupo 3'-amino protegido. El grupo 3'-amino protegido se desprotege luego para formar un grupo 3'-amino libre, al que se añade un segundo nucleósido. El grupo 3'-amino libre del primer nucleósido se hace reaccionar con un monómero de aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropil-aminofosforamidita protegido en 3' para formar un enlace internucleosídico N3'\rightarrowP5' fosforamidita. El grupo internucleosídico fosforamidita se sulfura luego para formar un enlace internucleosídico N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato entre las nucleósidos primero y segundo.
En otra realización de la invención, se proporciona un método para hibridar un oligonucleótido con tiofosforamidato de la invención a una diana de DNA o RNA. El polinucleótido con tiofosforamidato comprende una secuencia de subunidades nucleosídicas unidas por al menos una subunidad definida por la fórmula:
2
en donde B es una purina o pirimidina o uno de sus análogos, Z es SR y R_{1} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, O-R_{2}, S-R_{2} y halógeno, en donde R_{2} es H, alquilo o (CH_{2})_{n}W(CH_{2})_{m}H, en donde n está entre 1 y 10, m está entre 0 y 10 y W es O, S ó NH. El polinucleótido con tiofosforamidato se pone en contacto con la diana de RNA para permitir la formación de un complejo de hibridación entre el polinucleótido y la diana de RNA.
La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y kits que incluyen un polinucleótido que tiene al menos un enlace N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, como se ha descrito antes. Los oligonucleótidos de la invención son particularmente útiles en aplicaciones terapéuticas orales basadas en hibridación, tales como aplicaciones antigénicas y antisentido, incluyendo la inhibición de la actividad de la enzima telomerasa.
Breve descripción de los dibujos
Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas concomitantes de esta invención se podrán apreciar más fácilmente, así como llegar a entender mejor por medio de la siguiente descripción detallada, cuando se considere conjuntamente con los dibujos anexos, en donde:
La Figura 1A muestra la estructura del enlace internucleosídico de los fosforotioatos oligonucleotídicos;
La Figura 1B muestra la estructura del enlace internucleosídico de los fosforamidatos oligonucleotídicos;
La Figura 1C muestra la estructura del enlace internucleosídico de tiofosforamidatos oligonucletídicos ilustrativos de la invención.
La Figura 2 muestra una representación esquemática de la síntesis, etapa a etapa, de tiofosforamidatos oligonucleotídicos uniformemente modificados.
La Figura 3 muestra una representación esquemática de la conversión de un tiofosforamidato dinucleotídico en su correspondiente fosforamidato, así como los productos resultantes de la hidrólisis del tiofosforamidato dinucleotídico.
La Figura 4 muestra los resultados de un análisis de inhibición de telomerasa in vitro efectuado usando cantidades crecientes del oligonucleótido con tiofosforamidato de SEQ ID NO:2, que es complementario del RNA de telomerasa, o de SEQ ID NO:4, que contiene desapareamientos de nucleótidos.
La Figura 5 muestra los resultados de unos análisis de inhibición de telomerasa in vitro efectuado usando cantidades crecientes del oligonucleótido con tiofosforamidato de SEQ ID. NO:10 que es complementario del RNA de telomerasa.
La Figura 6 muestra los resultados de las SEQ ID NO:2 y 10 que son complementarias del RNA de telomerasa y de la SEQ ID NO:4 que contiene desapareamientos de nucleótidos en el desarrollo de células HME50-5E.
La Figura 7 muestra los resultados de los oligonucleótidos con tiofosforamidato en la longitud del telómero de células HME50-5E.
La Figura 8 ilustra los valores CI_{50} medidos para el oligonucleótido con tiofosforamidato SEQ ID NO:2.
Descripción detallada Definiciones
Un "grupo alquilo" se refiere a un grupo alquilo o alquilo sustituido que tiene de 1 a 20 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo y similares. Alquilo inferior se refiere típicamente al que tiene de 1 a 5 átomos de carbono. Alquilo intermedio se refiere típicamente al que tiene 6 a 10 átomos de carbono.
Un "grupo arilo" se refiere a un grupo de anillos aromáticos que tiene de 5 a 20 átomos de carbono, tales como fenilo, naftilo, antrilo o grupos arilo sustituido, tales como las sustituciones con alquilo o arilo, como tolilo, etilfenilo, bifenililo, etc. También están incluidos los grupos de anillos aromáticos heterocíclicos que tienen uno o más átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre en el anillo.
"Oligonucleótidos" se refiere típicamente a los polímeros de subunidades nucleosídicas que tienen entre alrededor de 3 y alrededor de 50 subunidades contiguas. Las subunidades nucleosídicas pueden estar unidas por medio de una variedad de enlaces entre subunidades, incluyendo, aunque sin limitación, los mostrados en las Figuras 1A a 1C. Además, "oligonucleótidos" incluyen modificaciones, conocidas por los expertos en la técnica, en la cadena principal de azúcar (por ejemplo, las subunidades ribosa o desoxirribosa), el azúcar (por ejemplo, sustituciones en 2'), la base y los extremos 3' y 5'. El término "polinucleótido", como se emplea en la presente memoria, tiene el mismo significado que "oligonucleótido" y se usa de manera intercambiable con "polinucleótido".
Siempre que un oligonucleótido se represente por una secuencia de letras, tal como "ATGUCCTG", se entenderá que los nucleótidos están en el orden 5'\rightarrow3', de izquierda a derecha.
Como se usa en la presente memoria, "nucleósido" incluye los nucleósidos naturales, incluyendo las formas 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, por ejemplo, como han descrito Komberg and Baker, DNA Replication, 2ª edición (Freeman, San Francisco, 1992) y sus análogos. "Análogos", con referencia a las nucleósidos, incluyen los nucleósidos sintéticos que tienen restos de base modificados y/o restos de azúcar modificados, por ejemplo, los descritos generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980). Dichos análogos incluyen los nucleósidos sintéticos diseñados para mejorar las propiedades de unión, por ejemplo, estabilidad, especificidad o similares, tal como han descrito Uhlmann and Peyman (Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990).
En la presente memoria se define que una "base" incluye: (i) bases típicas de DNA y de RNA (uracilo, timina, adenina, guanina y citosina) y (ii) bases modificadas o análogos de base (por ejemplo, 5-metil-citosina, 5-bromouracilo o inosina). Un análogo de base es un producto químico cuya estructura molecular imita a la de una base típica de DNA o de RNA.
Tal como se usa en la presente memoria, "pirimidina" significa las pirimidinas que existen en los nucleósidos naturales, incluyendo citosina, timina y uracilo, y sus análogos comunes, tales como los que contienen sustituyentes citosina, timina y uracilo, y sus análogos comunes, tales como los que contienen sustituyentes oxi, metilo, propinilo, metoxi, hidroxilo, amino, tio, halógeno y similares. El término, como se usa en la presente memoria, incluye además pirimidinas con grupos de protección comunes unidos, tales como N_{4}-benzoilcitosina. Más grupos de protección de pirimidina comunes han sido descritos por Beaucage and lyer (Tetrahedron 48:223-2311, 1992).
Tal como se usa en la presente memoria, "purina" significa las purinas que existen en los nucleósidos naturales, incluyendo adenina, guanina e hipoxantina, y sus análogos comunes, tales como los que contienen sustituyentes oxi, metilo, propinilo, metoxi, hidroxilo, amino, tio, halógeno y similares. El término, como se usa en la presente memoria, incluye además purinas con grupos de protección comunes unidos, tales como N_{2}-benzoilguanina, N_{2}-isobutirilguanina, N_{6}-benzoiladenina y similares. Más grupos de protección de purina, comunes han sido descritos por Beaucage and lyer (antes citados).
Tal como se usa en la presente memoria, el término "protegido", como componente de un nombre químico, se refiere a grupos de protección reconocidos en la técnica para un resto particular de un compuesto, por ejemplo, "hidroxilo protegido en 5'" con referencia a un nucleósido incluye trifenilmetilo (es decir, tritilo), p-anisildifenilmetilo (es decir, monometoxitritilo o MMT), di-p-anisilfenilmetilo (es decir, dimetoxitritilo o DMT) y similares. Los grupos protectores reconocidos en la técnica incluyen los descritos en las siguientes referencias: Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath and Broom, Chemical Reviews 77:183-217, 1977; Pon et al., Biotechniques, 6: 768-775, 1988; Ohtsuka et al., Nucleic Acids Research, 10: 6553-6570, 1982; Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª edición (John Wiley & Sons, New York, 1991), Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, Nueva York, 1987), Beaucage and lyer (antes citado) y referencias similares.
El término "halógeno" o "halo" se usa en su sentido convencional, para referirse a un sustituyente cloro, bromo, flúor o yodo. En los compuestos descritos y reivindicados en la presente memoria, los sustituyentes halógeno son generalmente flúor, bromo o cloro, de preferencia flúor o cloro.
Los compuestos de la presente invención pueden usarse para inhibir o reducir la actividad de la enzima telomerasa y/o la proliferación de células que tienen actividad de telomerasa. En estos contextos, la inhibición o reducción de la actividad enzimática o de la proliferación celular se refiere a un menor nivel de la actividad medida con relación a un experimento de control, en el que la enzima o las células no han sido tratadas con el compuesto de ensayo. En realizaciones particulares, la inhibición o reducción en la actividad medida es al menos una reducción o inhibición del 10%. Los expertos en la técnica apreciarán que para aplicaciones particulares pueden preferirse una reducción o inhibición de la actividad medida de al menos 20%, 50%, 75%, 90% o 100%.
La presente invención se refiere generalmente a oligonucleótidos que contienen al menos un enlace entre subunidades de tiofosforamidato, a métodos para sintetizar dichos polinucleótidos y a métodos para usar los oligonucleótidos de la invención como compuestos terapéuticos y para diagnóstico.
Los oligonucleótidos están representados por los que tienen la fórmula:
3
en donde
cada B se selecciona independientemente para que sea una purina o pirimidina o uno de sus análogos, tal como uracilo, timina, adenina, guanina, citosina, 5-metilcitosina, 5-bromouracilo e inosina,
Z_{1} es O ó NH,
Z_{2} es OR, SR o metilo, en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo y sus sales,
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, O-R_{2}, S-R_{2}, NHR_{2} y halógeno, en donde R_{2} es H, alquilo o (CH_{2})_{n}W(CH_{2})_{m}H, en donde n está entre 1 y 10, m está entre 0 y 10 y W es O, S ó NH,
R_{3} y R_{4} se seleccionan del grupo que consiste en hidroxilo, amino e hidrógeno y
m_{2} es un número entero entre 1 y 50.
\vskip1.000000\baselineskip
Las subunidades nucleosídicas que constituyen los nucleótidos de los polinucleótidos de la presente invención pueden seleccionarse para que estén en una secuencia definida, tal como una secuencia de bases capaz de hibridarse específicamente a una secuencia monocatenaria diana de ácidos nucleicos o a una secuencia que permita la formación de una estructura tríplex entre el polinucleótido y una estructura dúplex diana. Se prefiere que la secuencia de las subunidades nucleosídicas esté unidas por al menos una subunidad que sea un N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato definido por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde
B es una purina o una pirimidina o uno de sus análogos;
Z es SR, en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo y sus sales; y
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, O-R_{2}, S-R_{2} y halógeno, en donde R_{2} es H, alquilo o (CH_{2})_{n}
W(CH_{2})_{m}H, en donde n está entre 1 y 10, m está entre 0 y 10 y W es O, S ó NH.
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, todos los enlaces entre subunidades del polinucleótido pueden ser enlaces entre subunidades N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, definidos por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos de la invención pueden ser usados para hibridarse a secuencias de ácidos nucleicos diana, tales como RNA y DNA. Cuando sea conveniente, los oligonucleótidos de la presente invención pueden marcarse con un grupo informador, tal como marcadores radiactivos, marcadores de biotina, marcadores fluorescentes y similares, para facilitar la detección del polinucleótido propiamente dicho y su presencia, por ejemplo, en los complejos de hibridación.
Los oligonucleótidos también se pueden formular como una composición farmacéutica para la inhibición de la transcripción o traducción en una célula en un estado morboso relacionado con la sobre-expresión del gene diana.
Preferiblemente, la secuencia de subunidades nucleosídicas están unidas por al menos un enlace entre subunidades que es un N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato. Alternativamente, todos los enlaces entre subunidades del polinucleótido son enlaces entre subunidades N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, definidos por la fórmula:
6
En otros aspectos, la invención se refiere a un método en fase sólida para sintetizar N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos oligonucleotídicos, usando una modificación de la metodología de transferencia de fosforamidita de Nelson et al. (J. Organic Chemistry, 62: 7278-7287, 1997). La estrategia de síntesis empleó 3'-aminonucleósido protegido con 3'-NH-tritilo y 5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilaminofosforamiditas (Nelson et al., antes citado) que se compraron a Cruachem and JBL Scientífic, Inc. (Aston, PA and San Luis Obispo, CA, respectivamente). Cada ciclo de síntesis (véase la Figura 2) se efectuó utilizando los siguientes procedimientos químicos: 1) destritilación; 2) acoplamiento; 3) protección de los extremos (capping); y 4) sulfuración. Para una sulfuración en etapas del grupo fosforamidita inter-nucleosídico, formado después de la etapa de acoplamiento, el agente oxidante a base de yodo/agua se reemplazó por los agentes sulfurantes - ya sea por azufre elemental S_{8} o ya sea por el reactivo de Beaucage usado comúnmente - 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona (lyer et al., J. Organic Chemistry, 55: 4693-4699, 1990). Las síntesis de oligonucleótido se realizó (escala de síntesis 1 \mumol) con una solución al 1% del reactivo de Beaucage en acetonitrilo anhidro o S_{8} al 15% en CS_{2}/Et_{3}N 99/1 (v/v) como agente sulfurante.
Se pueden preparar oligonucleótidos quiméricos de N3'\rightarrowP5' fosforamidato-fosforotioamidato usando una o varias etapas de oxidación después de la etapa de acoplamiento, lo que da como resultado la formación de un grupo internucleosídico de fosforamidato. Similarmente, se puede preparar fosfodiéster-fosforotioamidatos usando nucleótidos protegidos con 5'-fosforamidita-3'-O-DMTr como bloques monómeros de construcción. Estos procedimientos de síntesis son conocidos en la técnica.
El dinucleósido de fosforamidato-timidina modelo TnpsTn se preparó usando ambos tipos de agentes sulfurantes y tiene un grupo internucleosídico 3'-NHP(O)(S)O-5'. Se analizaron las mezclas de reacción y se confirmó la estructura del compuesto por cromatografía de líquidos de alta resolución (abreviadamente HPLC por la expresión inglesa High Performance Liquid Chromatography) con intercambio de iones (abreviadamente IE por la expresión inglesa Ion Exchange) y de fase inversa (abreviadamente RP por la expresión inglesa Reverse Phase) y resonancia magnética nuclear con ^{31}P (abreviadamente en lo sucesivo ^{31}PMNR por la expresión inglesa ^{31}P magnetic nuclear resonanse). El análisis reveló que la sulfuración del grupo internucleosídico de fosforamidita con el reactivo de Beaucage daba como resultado la formación de aproximadamente 10-15% del dinucleósido oxidado con el enlace fosforamidato 3'-NHP(O)(O)O-5' (^{31}P MNR \delta, ppm 7,0 en D_{2}O). Alternativamente, la sulfuración con azufre molecular S_{8} produjo el dinucleótido deseado que contenía el grupo internucleosídico 3'-NHP(O)(S)O-5', con rendimiento prácticamente cuantitativo, como lo demostraron los análisis de ^{31}PMNR y HPLC con IE (^{31}P MNR \delta, ppm 56,4, 59,6 en D_{2}O, isómeros Rp, Sp).
Con relación a la eficacia de la sulfuración se obtuvieron resultados similares para la síntesis del undecámero (11-mero) modelo de oligonucleótido GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:1), donde la sulfuración con el reactivo de Beaucage dio como resultado el producto de longitud completa que contenía aproximadamente 15% de enlaces fosforamidato, como se demostró por análisis de ^{31}P MNR de la mezcla de reacción. Los desplazamientos químicos para los picos principales fueron aproximadamente 57 y 60 ppm (dobletes anchos) y 7 ppm (singulete ancho) que corresponden a los grupos tiofosforamidato y fosforamidato, respectivamente. En contraste, la sulfuración con S_{8} produjo únicamente sólo aproximadamente 2% de enlaces fosforamidato en el producto undecámero de acuerdo con el análisis de ^{31}P MNR. El análisis por HPLC con IE del oligómero estaba de acuerdo con el espectro de ^{31}P MNR. La estructura y pureza de los productos oligonucleótidos finales se confirmaron por el análisis de espectros de masas con MALDI-TOF^{1}, por ^{31}P MNR y por análisis electroforético en gel de poliacrilamida. La masa molecular de los oligómeros de tiofosforamidato GT_{2}AG_{3}T_{2}AG (SEQ ID NO:1) y TAG_{3}T_{2}AGACA_{2} (SEQ ID NO:2), se calculó que era 3.577,11 y 4.202,69, respectivamente. La masa molecular de los oligómeros de tiofosforamidato GT_{2}AG_{3}T_{2}AG (SEQ ID NO:1) y TAG_{3}T_{2}AGACA_{2} (SEQ ID NO:2)por espectroscopia de masas MALDI-TOF se determinó experimentalmente que era 3.577 y 4.203, respectivamente; la movilidad en PAGE al 15% con relación a los fosforamidatos isosecuenciales fue 0,95 y 0,97, respectivamente.
El nucleósido de fosforamidato modelo TnpsTn se convirtió cuantitativamente en el correspondiente fosforamidato TnpTn por tratamiento con solución de yodo 0,1M en piridina/THF/H_{2}O 1/4/0,1 (v/v), 55ºC, 15 minutos, como se demostróo por HPLC con IE y ^{31}P MNR \delta ppm 7,0) (véase la Figura 3). El tratamiento del dinucleótido TnpsTn con ácido acético al 10%, 55ºC, 48 horas, dio como resultado inesperadamente sólo la hidrólisis parcial (\sim10%) del enlace internucleosídico de fosforamidato. Para comparación bajo estas condiciones, se hidrolizó por completo el dímero precursor de fosforamidato TnpTn. La escisión del enlace N-P en el tiofosforamidato dinucleotídico fue acompañada por el proceso de desulfuración concomitante (\sim15%), seguido por la hidrólisis rápida del grupo fosforamidato resultante -NHP(O)(O)O-, como se demostró por HPLC con IE y ^{31}PMNR (Figura 3).
Los 2'-R_{3}N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos pueden obtenerse a partir de los correspondientes fosforamidatos como se describió antes. Los 2'-R_{3}N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos se obtuvieron por la metodología de transferencia de fosforamidita ideada para la síntesis de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos oligonucleotídicos. La síntesis de 2-O-alquil N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos está descrita detalladamente como ilustración de esta metodología.
Los bloques de construcción 4, 6, 11 y 15 de 2'-O-alquil-3'-aminonucleósido-5'-fosforamidita, apropiadamente protegidos, en donde alquilo es metilo, se prepararon de acuerdo con una serie de transformaciones químicas mostradas en los Esquemas 1 a 3 siguientes. Una etapa de la invención para la preparación de estos compuestos fue la metilación selectiva del grupo 2'-hidroxilo en presencia de la funcionalidad imino de las pirimidinas o del átomo N-7 de las purinas. Los dos monómeros a base de pirimidina se obtuvieron a partir del 3-azido-2'-O-acetil-5'-O-toluoil-3'-desoxi-\beta-D-ribofuranosiluracilo 1 conocido. Típicamente, se protegió en primer lugar el nitrógeno del grupo imino N-3/O-4 de 1 con un grupo protector, tal como mediante la reacción de propiolato de metilo, en presencia de dimetilaminopiridina (Esquema 1). A continuación se 2'-O-desacetiló el producto de reacción en bruto y a continuación se alquiló el grupo 2'-hidroxilo libre.
Esquema 1
\vskip1.000000\baselineskip
7
tal como por metilación usando yodometano y óxido de plata. Se eliminó el grupo protector N-3 y el grupo 3'-azido se redujo a amina, que a continuación se protegió inmediatamente, tal como con una reacción con cloruro de 4-monometoxitritilo, obteniéndose el precursor 3. A continuación se escindió el éster 5-toluoílico usando una solución alcalina, seguido por fosfitilación, usando protocolos conocidos, obteniéndose el monómero 2'-O-metil-uridina-fosforamidita 4. La 2'-O-metil-citosina-fosforamidita se obtuvo por conversión del producto intermedio de uridina 3 en el análogo de 3'-aminocitidina 5.
La síntesis del análogo de 2'-O-alquil-adenosina requirió el uso de grupos protectores voluminosos, principalmente para la amina exocíclíca, para evitar la alquilación de N-7 durante la metilación del grupo 2'-hidroxilo (Esquema 2). En primer lugar se desprotegió la 3'-azido-2'-O-acetil-5'-O-toluoil-N^{6}-benzoil-3'-desoxiadenosina 7, por ejemplo, por reacción con NH_{3}/MeOH (1/1, v/v) para proporcionar 3'-azido-3'-desoxiadenosina. A continuación, se volvieron a proteger selectivamente el grupo 5'-hidroxilo y el resto N-6 con grupos protectores voluminosos, tales como el grupo t-butildifenilsililo o el grupo 4-monometoxitritilo. La combinación de los dos sustituyentes grandes en las posiciones 5'-O y N-6 ocluían estéricamente N-7, permitiendo de esa manera la introducción selectiva de un grupo metilo en la posición 2' para producir el compuesto intermedio 8. A continuación se separó el grupo 4-monometoxitritilo de N-6, tal como por tratamiento con ácido tricloroacético al 3% en un disolvente orgánico, tal como diclorometano, después de lo cual se volvió a proteger N-6. El uso de cloruro de benzoílo para la nueva protección de N-6 dio como resultado la adición de dos grupos benzoílo. Subsiguientemente se separó el segundo grupo benzoílo por tratamiento con una base obteniéndose el compuesto intermedio 9. Después se redujo el grupo azida y el grupo 3'-amino resultante se protegió con 4-monometoxitritilo para formar 10. Finalmente, se escindió el grupo protector 5'-sililo y la fosfitilación dio como resultado el monómero 2'-O-metil-fosforamidita 11.
Esquema 2
\vskip1.000000\baselineskip
8
La síntesis de 2'-O-alquil-fosforamidita basada en la guanosina 15 se representa en el esquema 3. El 3'-azido-2'-O-acetil-5'-O-toluoil-N^{2}-isobutiril-O^{6}-difenilcarbamoil-3'-desoxiguanosina 12 se desbloqueó por tratamiento con una base. Se volvieron a proteger 5'-O- y O-6 por reacción con cloruro de t-butildifenilsililo. A continuación se 2'-O-alquiló el compuesto intermedio bis-sililado. Se desprotegió selectivamente el grupo O-6-sililo obteniéndose el compuesto 13. Se volvió a proteger el grupo N-2, se redujo el grupo 3'-azido y se protegió el grupo 3'-amino resultante obteniéndose el nucleósido 14. Finalmente, se obtuvo el monómero 2'-O-alquil-guanosina-fosforamidita 15 separando el grupo protector en 5' seguido de fosfitilación del 5'-hidroxilo no enmascarado.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema 3
9 
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización de la presente invención, la estabilidad frente a los ácidos de los oligonucleótidos se aumenta colocando subunidades unidas por enlaces entre subunidades N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato en los oligonucleótidos. Las propiedades de hibridación de los oligonucleótidos con tiofosforamidato se evaluaron con relación a las cadenas de DNA o RNA complementarios que tienen enlaces entre subunidades fosfodiéster o fosforamidato. Los datos de estabilidad térmica para las estructuras dúplex generados a partir de los oligonucleótidos de fosforamidato y los oligómeros de fosfodiéster se resumen en la Tabla 1 (Ejemplo 3).
La hibridación de los oligonucleótidos con tiofosforamidato con ácidos nucleicos complementarios es específica para la secuencia y viene determinada por el apareamiento apropiado de bases de Watson-Crick. El dúplex formado por el oligonucleótido de fosforamidato SEQ ID NO:3 con un solo desapareamiento de bases con un componente diana de RNA de telomerasa (Ejemplo 6, Tabla 2, experimento 2) es sustancialmente menos estable que el dúplex formado con el oligonucleótido SEQ ID NO:1 que es totalmente complementario con el componente RNA de telomerasa (Ejemplo 6, Tabla 2, experimento 1).
Aplicaciones de oligonucleótidos que contienen enlaces internucleosídicos 3'-NHP(O)(S)O-5' tiofosforamidato
Se sintetizó el 3'-NHP(O)(S)O-5' oligonucleotídico de la SEQ ID NO:2. Este compuesto era sorprendentemente estable frente a los ácidos y formó un complejo estable con una diana de RNA complementario. Los polinucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato de la presente invención tienen gran potencial para aplicaciones antisentido y antigenes en diagnóstico/terapéuticas. En una realización preferida de la presente invención los oligonucleótidos son oligodesoxirribonucleótidos.
A. Aplicaciones de inhibición de telomerasa
Recientemente, se ha comenzado a comprender los mecanismos mediante los que las células normales alcanzan el estado de senescencia, es decir, la pérdida de la capacidad de proliferación que normalmente experimentan las células en el proceso de envejecimiento celular. El DNA de los extremos, o telómeros, de los cromosomas de los eucariotas consiste usualmente en secuencias sencillas repetidas en tándem. Desde hace mucho los científicos saben que los telómeros tienen un importante papel biológico en el mantenimiento de la estructura y función de los cromosomas. Más recientemente, los científicos han supuesto que la pérdida acumulativa del DNA de los telómeros en las repetidas divisiones celulares puede actuar como un desencadenante de la senescencia y el envejecimiento celular y que la regulación de la telomerasa, una enzima implicada en el mantenimiento de la longitud del telómero, puede tener importantes implicaciones biológicas. Véase Harley, 1991, Mutation Research, 256:271-282. Losexperimentos de Bodnar et al., han confirmado la importancia de los telómeros y de la telomerasa en el control del periodo de vida replicativo de las células humanas normales cultivadas. Véase Bodnar et al., 1998, Science, 279: 349-352.
La telomerasa es una enzima ribonucleoproteínica que sintetiza una cadena del DNA telómero usando como molde una secuencia contenida en el componente RNA de la enzima. Véase Blackburn 1992, Annu. Rev. Biochem., 61: 113-129. El componente RNA de la telomerasa humana ha sido secuenciado y tiene una longitud de 460 nucleótidos que contienen una serie de repeticiones de secuencia de 11 bases que es complementaria con la repetición del telómero. Se ha inhibido la actividad de telomerasa humana mediante una variedad de oligonucleótidos complementarios del componente RNA de la telomerasa. Véase Norton et al., Nature Biotechnology, 14: 615,1996; Pitts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 11549-11554, 1998; y Glukhov et al., Bioch. Biophys. Res. Commun., 248: 368-371, 1999. Los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención son complementarios de 10 a 50 nucleótidos del RNA de telomerasa. Preferiblemente, los oligonucleótidos con tiofosforamidato inhibidores de telomerasa de la invención tienen una secuencia de 10 a 20 bases consecutivas que es complementaria del RNA de telomerasa.
También se han descrito métodos para detectar la actividad de telomerasa, así como para identificar los compuestos que regulan o afectan a la actividad de telomerasa, junto con métodos de terapia y diagnosis de la senescencia e inmortalización celular controlando la longitud del telómero y la actividad de la telomerasa. Véase Feng et al., 1995, Science 269:1236-1241; Kim et al., 1994, Science, 266:2011-2014; Publicación de patente PCT Nº 93/23572, publicada el 25de noviembre de 1993;ylas patentes de EE.UU. Nos. 5.656.638, 5.760.062, 5.767.278, 5.770.613 y 5.863.936.
La identificación de los compuestos que inhiben la actividad de telomerasa proporciona importantes beneficios a los esfuerzos en el tratamiento de enfermedades humanas. Los compuestos que inhiben la actividad de telomerasa pueden usarse para tratar trastornos mediados por telomerasa, tales como cáncer, puesto que las células cancerígenas expresan la actividad de telomerasa y las células somáticas humanas normales no poseen actividad de telomerasa a niveles biológicamente relevantes (es decir, a niveles suficientes para mantener la longitud del telómero durante muchas divisiones celulares). Desafortunadamente, han sido identificados y caracterizados pocos de dichos compuestos, especialmente los compuestos con elevada potencia o actividad y compuestos que estén biodisponibles después de administración oral. Por tanto, siguen necesitándose compuestos que actúen como inhibidores de la telomerasa, que tengan potencia o actividad relativamente alta y que estén oralmente biodisponibles, y composiciones y métodos para tratar el cáncer y otras enfermedades en las que esté presente anormalmente la actividad de telomerasa.
Los nuevos compuestos de oligonucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención son estables frente a los ácidos y, por consiguiente, tienen muchos usos valiosos como inhibidores de la actividad perjudicial de telomerasa, tal como, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer en seres humanos. Las composiciones farmacéuticas de oligonucleótidos con tiofosforamidato pueden emplearse en regímenes de tratamiento en los que se inhiben las células cancerígenas, in vivo, o pueden usarse para inhibir células cancerígenas ex vivo. Así pues, esta invención proporciona compuestos y composiciones terapéuticos para tratar el cáncer y métodos para tratar el cáncer en mamíferos (por ejemplo, vacas, caballos, ovejas, bueyes, cerdos y animales de interés veterinario, tales como gatos y perros). Además, los oligonucleótidos de fosforamidato de la presente invención pueden usarse también para tratar otros estados o enfermedades mediados por telomerasa, tales como, por ejemplo, otros trastornos hiperproliferantes o autoinmunes.
Como se ha indicado antes, la inmortalización de las células implica entre otros aspectos la activación de la telomerasa. Más específicamente, se ha demostrado la conexión entre la actividad de telomerasa y la capacidad de muchas líneas de células tumorales de permanecer inmortales por análisis de la actividad de telomerasa (Kim et al., véase anteriormente). Este análisis, suplementado por datos que indican que el acortamiento de la longitud del telómero puede proporcionar la señal para la senescencia replicativa en células normales (véase la solicitud de patente PCT Nº 93/23572) demuestra que la inhibición de la actividad de telomerasa puede ser una terapia eficaz contra el cáncer. Así pues, la actividad de telomerasa puede prevenir el inicio de la senescencia replicativa, por lo demás normal, impidiendo la reducción normal de la longitud del telómero y el cese simultáneo de la replicación celular que ocurre en las células somáticas normales, después de muchas divisiones celulares. En las células cancerígenas, donde el fenotipo maligno se debe a la pérdida de los controles del ciclo o desarrollo celular u otras lesiones genéticas, la ausencia de la actividad de telomerasa permite la pérdida del DNA telómero durante la división celular, lo que da como resultado transposiciones y anomalías cromosómicas que conducen finalmente a la muerte de las células. Sin embargo, en las células cancerígenas que tienen actividad de telomerasa, durante la división celular no se pierde el DNA del telómero, permitiendo que las células cancerígenas se vuelvan inmortales, lo que conduce a una prognosis terminal para el paciente. Los agentes capaces de inhibir la actividad de telomerasa en las células tumorales ofrecen beneficios terapéuticos respecto a una gran variedad de cánceres y otros estados (por ejemplo, infecciones fúngicas) en las que las células inmortalizadas que tienen actividad de telomerasa son un factor en el avance de la enfermedad o cuando se desea la inhibición de la actividad de telomerasa para fines de tratamiento. Los inhibidores de telomerasa de la invención pueden usarse también para inhibir la actividad de telomerasa en células de línea germinal, lo que puede ser útil para fines anticonceptivos.
Adicionalmente, se apreciará que se pueden obtener beneficios terapéuticos para el tratamiento del cáncer combinando un inhibidor de telomerasa de la invención con otros agentes anticancerígenos, incluyendo otros inhibidores de telomerasa, tales como los descritos en las patentes de EE.UU. Nº 5.656.638, 5.760.062, 5.767.278, 5.770.613 y 5.863.936. La elección de dichas combinaciones dependerá de diversos factores incluyendo, aunque sin estar limitados a ellos, el tipo de enfermedad, la edad y la salud general del paciente, la agresividad de la progresión de la enfermedad, la longitud del fragmento de restricción terminal (abreviadamente TRF, por la expresión inglesa Terminal Restriction Fragment) y la actividad de telomerasa de las células enfermas que van a ser tratadas y la capacidad del paciente para tolerar los agentes que están incluidos en la combinación. Por ejemplo, en los casos en los que la progresión del tumor ha alcanzado un estado avanzado, puede ser aconsejable combinar un compuesto inhibidor de telomerasa de la invención con otros agentes y regímenes terapéuticos que sean eficaces para reducir el tamaño del tumor (por ejemplo, radiación, cirugía, quimioterapia y/o tratamientos hormonales). Además, en algunos casos puede ser aconsejable combinar un agente inhibidor de telomerasa de la invención con uno o más agentes que traten los efectos secundarios de una enfermedad, por ejemplo, un analgésico, o agentes eficaces para estimular la propia respuesta inmune del paciente (por ejemplo, factor estimulante de colonias).
Los compuestos de la presente invención demuestran actividad inhibidora contra la actividad de telomerasa in vivo, como se puede demostrar en lo descrito a continuación. Las actividades in vitro de los compuestos de la invención también han sido demostradas usando los métodos descritos en la presente memoria. Tal como se usa en ella, el término "in vitro" se refiere a ensayos efectuados usando células vivas en cultivos de tejido. Dichos procedimientos también son conocidos como "ex vivo".
Los inhibidores de telomerasa oligonucleotídicos descritos en este apartado comprenden típicamente una secuencia que sea complementaria con el componente RNA de la telomerasa. La secuencia del componente RNA de telomerasa humana es proporcionada en la patente de EE.UU. Nº 5.776.679. También puede usarse el componente RNA de telomerasa de otras especies, dependiendo del sujeto al que se destina la terapia.
En general, el oligonucleótido comprenderá entre alrededor de 10 y 100 nucleótidos que son específicos de la telomerasa (es decir, que se hibridan con el componente RNA de la telomerasa a concentraciones menores o bajo condiciones de mayor exigencia que con otros componentes enzimáticos del RNA u otras moléculas de RNA que se espera que estén presentes y sean funcionalmente activas en las células diana o células presenciales terapéuticas). Están incluidos los oligonucleótidos entre alrededor de 10 y 25 nucleótidos, ilustrados por oligonucleótidos entre 12 y 15 nucleótidos citados en los ejemplos siguientes. En muchas circunstancias, el oligonucleótido será exactamente complementario de una secuencia consecutiva de la misma longitud en el RNA de la telomerasa. No obstante, ha de entenderse que la hibridación todavía puede ser específica aun cuando haya residuos o huecos o adiciones en el oligonucleótido desapareados, especialmente cuando la longitud de la secuencia complementaria correspondiente en el RNA sea mayor que 15 nucleótidos.
Un método usado para identificar los polinucleótidos con tiofosforamidato de la invención con secuencias específicas que inhiban la actividad de telomerasa implica colocar células, tejidos o, de preferencia, un extracto celular u otra preparación que contenga telomerasa en contacto con varias concentraciones conocidas de un oligonucleótido con tiofosforamidato que sea complementario con el componente RNA de la telomerasa, en un tampón compatible con la actividad de telomerasa. Se mide el nivel de actividad de telomerasa para cada concentración del polinucleótido con tiofosforamidato. Antes y después de la administración de un inhibidor de telomerasa, se puede determinar la actividad de telomerasa usando reactivos y métodos típicos. Por ejemplo, se puede medir la actividad de telomerasa en células cultivadas usando la valoración de actividad TRAP (Kim et al., Science, 266:2011, 1997; Weinrich et al., Nature Genetics, 17: 498,1997). Los siguientes kits de ensayo están disponibles en el comercio para fines de investigación: TRAPeze® XK Telomerase Detection Kit (Cat. s7707; Intergen Co., Purchase NY) y TeIoTAGGG Telomerase PCR ELISAplus (Cat 2,013,89; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).
La CI_{50} (la concentración del polinucleótido en la que se observa que la actividad observada para una preparación de muestra disminuye la mitad de su valor original o de control) para el polinucleótido se determina usando técnicas estándares. Se pueden emplear otros métodos para determinar la concentración inhibidora de un compuesto de la invención contra la telomerasa como será evidente para los expertos en la técnica basándose en la presente descripción.
Con los métodos antes descritos, se determinaron los valores de la CI_{50} para varios de los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención, y se encontró que eran inferiores a 10 nM (véase la Tabla 2, Ejemplo 6).
Respecto al tratamiento de enfermedades malignas usando polinucleótidos con tiofosforamidato que son complementarios con el componente RNA de la telomerasa, se espera inducir una crisis en las líneas de células positivas a la telomerasa. El tratamiento de células epiletiales de mama humanas HME50-5E que se inmortalizaron espontáneamente con el oligonucleótido con tiofosforamidato SEQ ID NO:2, dio como resultado la inhibición de la actividad de telomerasa, como se demostró por la disminución de la longitud del telómero (véase el Ejemplo 6 y la Figura 4). También se espera que el tratamiento de otras líneas de células positivas a la telomerasa, tales como las células HEK-293 y HeLa, con los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la invención que son complementarios con el componente de la secuencia de RNA de la telomerasa induzca una reducción de la longitud del telómero en las células tratadas.
También es de esperar que los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la invención induzcan la reducción del telómero durante la división celular en líneas de células de tumores humanos, tales como las líneas de células del tumor de ovarios OVCAR-5 y SK-OV-3. Sin embargo, es muy importante esperar que, en las células humanas normales usadas como control, tales como las células BJ de origen de fibroblastos, la reducción observada de la longitud del telómero no sea diferente de la correspondiente de las células tratadas con una sustancia de control, por ejemplo, un oligonucleótido con tiofosforamidato que tiene al menos un solo desapareamiento de las bases con la diana de RNA de telomerasa complementaria. También se espera que los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención no demuestren efectos citotóxicos importantes a las concentraciones inferiores a alrededor de 20 \muM en las células normales.
Además, la especificidad de los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención para el RNA de telomerasa puede determinarse efectuando ensayos de hibridación y comparando su actividad (CI_{50}) con la telomerasa y otras enzimas que se sabe que tienen componentes de RNA esenciales, tales como la ribonucleasa P. Se dice que los compuestos que tienen valores inferiores de la CI_{50} para la telomerasa en comparación con los valores de la CI_{50} para las demás enzimas que están siendo escrutadas poseen especificidad para la telomerasa.
También se puede efectuar ensayos in vivo usando un modelo de xenoinjerto de ratón, por ejemplo, en el que se injertan células de tumor OVCAR-5 en ratones atímicos, en los que se espera que los ratones tratados con el oligonucleótido con tiofosforamidato de la invención tengan masas tumorales que, por término medio, pueden aumentar durante un periodo que sigue a la dosificación inicial, pero que comenzarán a disminuir a medida que continúe el tratamiento. En contraste, se espera que los ratones tratados con un control (por ejemplo, un oligonucleótido con tiofosforamidato que tenga al menos un solo desapareamiento de bases con la diana de RNA de telomerasa complementario) tengan masas tumorales que continúen aumentando.
De lo anterior, los expertos en la técnica apreciarán que la presente invención también proporciona métodos para seleccionar regímenes de tratamiento que implican la administración de un oligonucleótido con tiofosforamidato de la invención. Para estos fines, puede ser útil efectuar un análisis del fragmento de restricción terminal (TRF) en el que se analiza el DNA de las células tumorales por digestión con enzimas de restricción específicas para secuencias distintas de la secuencia del telómero (T_{2}AG_{3})_{N}. Después de la digestión del DNA, se efectúa una electroforesis en gel para separar los fragmentos de restricción de acuerdo con su tamaño. Los fragmentos separados se sondan a continuación con sondas de ácido nucleico específicas para las secuencias del telómero, para determinar las longitudes de los fragmentos terminales que contienen el DNA del telómero de las células en la muestra. Midiendo la longitud del DNA del telómero, se puede estimar cuanto tiempo debe administrarse un inhibidor de telomerasa y si también debes emplearse otros métodos de terapia (por ejemplo, cirugía, quimioterapia y/o radiación). Además, durante el tratamiento, se pueden analizar las células para determinar si está ocurriendo una disminución de la longitud del telómero en las progresivas divisiones celulares que demuestra la eficacia del tratamiento.
Así pues, en un aspecto, la presente invención proporciona compuestos que pueden servir en la lucha contra el cáncer como armas importantes contra los tumores malignos que expresan telomerasa, tumores que incluyen tumores de piel, de tejido conjuntivo, adiposos, de mama, de pulmón, de estómago, de páncreas, de ovarios, de cuello uterino, de útero, de riñón, de vejiga, de colon, de próstata, del sistema nervioso central (SNC), de retina y del sistema circulatorio (tales como leucemia y linfoma). En particular, los polinucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención pueden proporcionar un método sumamente generalizado para tratar muchos de los tumores malignos, sí no la mayoría de ellos, como lo demuestra la gran variedad de líneas de células tumorales humanas y tumores que tienen actividad de telomerasa. En gran medida, los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención pueden ser eficaces para proporcionar tratamientos que discriminan entre las células malignas y las normales, con un elevado grado de precisión, evitando muchos de los efectos secundarios perjudiciales presentes en la mayoría de los regímenes quimioterapéuticos actuales, que se basan en agentes que matan indiscriminadamente las células que se dividen.
B. Otras aplicaciones antisentido
La terapia antisentido implica la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un ácido nucleico diana, típicamente a una molécula de RNA, localizada dentro de las células. Se le da el término antisentido debido a que los oligonucleótidos son típicamente complementarios de las moléculas de RNAm ("cadenas con sentido") que codifican un producto celular.
Los oligonucleótidos con tiofosforamidato descritos en la presente memoria son útiles para la inhibición antisentido de la expresión de genes (Matsukura et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4244-4248, 1989; Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 7790-7794, 1989; Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 4143-4146, 1986; Rittner and Sczakiel, Nucleic Acids Research, 19: 1421-1426, 1991; Stein and Cheng, Science, 261: 1004-1012, 1993). Los oligonucleótidos que contienen enlaces N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato tienen aplicaciones terapéuticas para un gran número de dianas médicamente significativas, que incluyen, aunque sin estar limitadas a ellas, la inhibición de la proliferación de células cancerígenas y la interferencia con virus infecciosos. Los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato son útiles tanto para aplicaciones veterinarias como humanas. La alta estabilidad frente a los ácidos de los oligonucleótidos de la invención y a su capacidad para actuar eficazmente como moléculas antisentido a concentraciones bajas (véase a continuación) hace que estos oligonucleótidos sean sumamente convenientes como agentes antisentido terapéuticos.
Los agentes antisentido necesitan típicamente unirse continuamente a todas las moléculas de RNA diana, para inactivarlas o proporcionar alternativamente un sustrato para la actividad de ribonucleasa H (Rnasa H) endógena. La sensibilidad de los complejos RNA/oligonucleótido, generados por los métodos de la presente invención, a la digestión con Rnasa H puede ser evaluada por métodos estándares (Donia et al., J. Biol. Chem., 268: 14514-14522, 1993; Kawasaki, et al., J. Medicinal Chem., 36: 831-841, 1993).
Los compuestos y métodos de la presente invención proporcionan varias ventajas con respecto a agentes antisentido más convencionales. En primer lugar, los oligonucleótidos con tiofosforamidato se unen más fuertemente a las dianas de RNA, que a los oligonucleótidos de fosfodiéster correspondientes. En segundo lugar, los oligonucleótidos con tiofosforamidato son más resistentes a la degradación en condiciones ácidas. En tercer lugar, en la absorción celular del compuesto, una cadena principal de polinucleótido con tiofosforamidato sin carga puede permitir una entrada más eficaz de los oligonucleótidos de fosforamidato en las células que un oligonucleótido con carga.
Además, cuando un RNA es codificado por una cadena principalmente de purina de una secuencia diana dúplex, los oligonucleótidos análogos de fosforamidato dirigidos al dúplex también tienen potencial para inactivar el DNA, es decir, la capacidad de inactivar un agente patógeno de forma tanto monocatenaria como bicatenaria (véase el estudio de las terapias antigenes siguiente).
Las moléculas de oligonucleótidos con tiofosforamidato específicas de una secuencia son agentes terapéuticos potencialmente potentes esencialmente para cualquier enfermedad o estado que, de alguna manera, implique al RNA. Los modos ilustrativos por los cuales dichas secuencias pueden ser dianas de aplicaciones terapéuticas, incluyen:
\vskip1.000000\baselineskip
a) elegir como dianas secuencias de RNA que expresen productos implicados en la propagación y/o el mantenimiento de agentes infecciosos, tales como bacterias, virus, levadura y otros hongos, por ejemplo, un RNAm específico de un agente infeccioso;
b) formar una molécula dúplex que dé como resultado la inducción de la escisión del RNA (por ejemplo, la escisión con Rnasa H de moléculas dúplex híbridas de RNA/DNA);
c) bloquear la interacción de una proteína con una secuencia de RNA (por ejemplo, la interacción de TAT y TAR, véase a continuación); y
d) elegir como dianas secuencias que provocan la expresión o la proliferación inapropiada de genes celulares; por ejemplo, los genes asociados con la regulación del ciclo celular; los procesos inflamatorios; la proliferación, migración y formación de matrices de células de la musculatura lisa (abreviadamente SMC, por la expresión inglesa Smoth Muscle Cells) (Liu et al., Circulation, 79:1374-1387, 1989); ciertos trastornos genéticos; y cánceres (protooncogenes).
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, se bloquea la traducción o el procesamiento de RNA de los genes celulares expresados inapropiadamente. Las secuencias dianas potenciales ilustrativas son protooncogenes, por ejemplo, incluyendo, aunque sin limitación, los siguientes: c-myc, c-myb, c-fos, c-kit, ras y BCR/ABL (por ejemplo, Wickstrom, editor, Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, Wiley-Liss, New York, NY, 1991; Zalewski, et al., Circulation Res., 88: 1190-1195, 1993; Calabretta, et al., Seminars in Cancer Biol., 3: 391-398, 1992; Calabretta, et al., Cancer Treatment Rev., 19: 169-179, 1993), oncogenes (por ejemplo, p53, Bayever, et al., Antisense Research and Development, 3:383-390, 1993), factores de transcripción (por ejemplo, NF.kappa.B, Cogswell, et al., J. Immunol., 150:2794-2804, 1993) ygenes virales (por ejemplo, papilomavirus, Cowsert, et al., Antimicrob. Agents and Chemo., 37:171-177, 1993; herpesvirus simplex, Kulka, et al., Antiviral Res., 20:115-130, 1993). Otra diana adecuada para terapia antisentido en hiperplasias es el componente proteínico de la telomerasa (véase el documento WO 99/50279), que frecuentemente es el componente limitante en la expresión de la telomerasa. La secuencia de transcriptasa inversa de la telomerasa humana es proporcionada por la patente de EE.UU. 6.093.809, el documento WO 98/14592 y pGRN121 (ATCC, Nº de acceso 209016). Para más ilustración, dos regiones de RNA de la proteína VIH-1 que pueden ser convertidas en dianas por los métodos de la presente invención son el elemento de respuesta a la proteína REV (abreviadamente RRE, por la expresión inglesa REV Response Element) y el elemento de respuesta a la transactivación de la proteína TAT (TAR). La actividad de REV requiere de la presencia del elemento de respuesta a REV (RRE), localizado en el gen de la envolvente de VIH (Malim et al., Nature, 338-254-257,1989; Malim et al., Cell, 58:205-214, 1989).
Se ha cartografiado el RRE hasta una región de 234nucleótidos, que se cree que forma cuatro estructuras de tramo lineal-bucle y una estructura de tramo ramificado-bucle (Malim et al., Nature, 338: 254-257, 1989). Los datos obtenidos de estudios de huellas (Holland et al., J. Virol., 64:5966-5975,1990; Kjems et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:683-687,1991) sugieren que la REV se une a seis pares de bases en una estructura de tramo lineal y a tres nucleótidos en una estructura de tramo lineal-bucle adyacente, del RRE. Cook, et al., (Nucleic Acids Research, 19:1577-1583) han identificado una región de unión de la REV mínima de alrededor de 40 nucleótidos en el tramo lineal-bucle II. Esta región de unión puede ser usada como diana para la generación de dúplex de RNA/DNA (por ejemplo, Li, et al., J. Virol., 67:6882-6888,1993) usando uno o más oligonucleótidos con tiofosforamidato, de acuerdo con los métodos de la presente invención.
La TAT de VIH-1 es esencial para la replicación viral y es un potente transactivador de la expresión de genes virales dirigida por repetición terminal larga (abreviadamente LTR, por la expresión inglesa Long Terminal Repeat) (Dayton, et al., Cell, 44: 941-947, 1986; Fisher et al., Nature, 320:367-371,1986). La transactivación inducida por la proteína TAT requiere la presencia del elemento TAR (véase la patente de EE.UU. Nº 5.837.835) que está localizado en el extremo 5' no traducido del elemento de RNAm viral.
El elemento TAR es capaz de formar una estructura estable de tramo lineal-bucle (Muesing, et al., Cell, 48:691-701, 1987). Se ha demostrado que la integridad del tramo lineal y una protuberancia de 3 nucleótidos (nt) en el tramo lineal de TAR son esenciales para la unión específica y de gran afinidad de la proteína TAT al elemento TAR (Roy, et al., Genes Dev., 4:1365-1373, 1990; Cordingley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:8985-8989, 1990; Dingwall, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:6925-6929, 1989; Weeks, et al., Science, 249:1281-1285, 1990). Esta región puede ser usada como diana para terapia antisentido siguiendo el método de la presente invención.
Además de ser la diana los sitios de unión de RNA de las proteínas REV, RRE y TAT, las secuencias de RNA que codifican las proteínas REV y TAT por sí mismas pueden actuar como dianas para bloquear la expresión de las proteínas.
El escrutinio inicial de los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, dirigidos a unirse a sitios dianas antisentido potenciales, incluye típicamente analizar la estabilidad térmica de las estructuras dúplex de RNA/DNA resultantes. Cuando se identifica un oligonucleótido con tiofosforamidato que se une a una secuencia diana de RNA seleccionada, se analiza adicionalmente el oligonucleótido para determinar la inhibición de la función del RNA in vitro. Se usan sistemas de ensayo de cultivo celular para dichos análisis in vitro (por ejemplo, virus de herpes simplex, Kulka et al., Antiviral Res., 20: 115-130, 1993; VIH-1, Li et al., J. Virol., 67: 5882-6888, 1993, Vickers et al., Nucleic Acids Research, 19:3359-3368, 1991; proliferación de células de la musculatura lisa en las coronarias, en casos de restenosis, Zalewski et al., Nucleic Acids Research, 15:1699-1715, 1987; IL-2R, Grigoriev et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 3501-3505, 1993; c-myb, Baer et al., Blood, 79:1319-1326, 1992; c-fos, Cutry et al., J. Biol. Chem., 264: 19700-19705, 1989; BCR/ABL, Szczylik et al., Science, 253: 562-565, 1991).
\vskip1.000000\baselineskip
C. Aplicaciones anti-genes
Se había demostrado con anterioridad la inhibición de la expresión de genes por medio de la formación de una estructura tríplex (Cooney et al., Science, 241: 456-459, 1989; Orson et al., Nucleic Acids Research., 19: 3435-3441, 1991; Postel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:8227-8231, 1991). La mayor estabilidad de las estructuras tríplex formadas cuando se emplean los oligonucleótidos análogos con tiofosforamidato con la tercera cadena, proporciona una herramienta más fuerte para las aplicaciones antigenes, incluyendo aplicaciones terapéuticas veterinarias y humanas.
Una región diana preferida se selecciona en base a las secuencias conocidas, usando reglas estándares para la formación de tríplex (Helene and Toulme, Biochem., Biophys. Acta, 1049:99-125, 1990). Típicamente la secuencia de oligonucleótido con tiofosforamidato es dirigida contra secuencias genéticas bicatenarias, en las que una cadena contiene predominantemente purinas y la otra cadena contiene predominantemente pirimidinas.
Los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención se analizan para determinar la formación de estructuras tríplex contra secuencias dianas dúplex seleccionadas, usando análisis de desplazamiento de bandas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.726.297, Ejemplo 4). Típicamente se usangeles de poliacrilamida de elevado porcentaje para análisis de desplazamiento de bandas y se ajustan los niveles de las condiciones de desnaturalización (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media Pa.; Sauer et al., editores, Methods in Enzymology Protein/DNA Interactions, Academic Press, 1991; Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Vol. 2, 1989) para reducir cualquier unión de fondo no específica.
La diana dúplex se marca (por ejemplo, usando un nucleótido radiactivo) y se mezcla con una tercera cadena de oligonucleótido, que se analiza para determinar su capacidad de formar estructuras tríplex con la diana dúplex. Un desplazamiento en la movilidad del oligonucleótido dúplex marcado indica la capacidad del oligonucleótido para formar estructuras tríplex.
La formación de estructuras tríplex es indicada en el análisis de desplazamiento de bandas por una movilidad disminuida en el gel de la estructura tríplex marcada con respecto a la estructura dúplex marcada.
Se puede evaluar numerosos sitios dianas potenciales mediante este método, incluyendo sitios dianas seleccionados de una gama completa de secuencias de DNA que tengan longitudes variables, así como complejidad variable. Las moléculas de unión del análogo con tiofosforamidato, específicas de una secuencia, son agentes terapéuticos potencialmente potentes para esencialmente cualquier enfermedad o estado que, de alguna manera, implique al DNA. Las secuencias dianas ilustrativas para dichos agentes terapéuticos incluyen: a) las secuencias de DNA implicadas en la propagación y/o el mantenimiento de agentes infecciosos, tales como bacterias, virus, levaduras y otros hongos; por ejemplo, que alteran el metabolismo del agente infeccioso; y b) las secuencias que provocan la expresión inapropiada o la proliferación de los genes celulares, tales como los oncogenes, por ejemplo, bloqueando o reduciendo la transcripción
de los genes celulares inapropiadamente expresados (tales como los genes asociados con ciertos trastornos genéticos).
La expresión o la replicación de genes pueden ser bloqueadas generando estructuras tríplex en regiones en las que se sabe que se unen las proteínas reguladoras (o moléculas) requeridas (por ejemplo, los factores asociados con la transcripción de VIH, como los sitios de iniciación del promotor y los sitios de unión SP1, McShan et al., J. Biol. Chem., 267: 5712-5721, 1992). Alternativamente, se pueden también usar como dianas secuencias específicas dentro de las regiones codificadoras de proteína de los genes (por ejemplo, los oncogenes).
Cuando se identifica un oligonucleótido análogo con tiofosforamidato que se une a una diana dúplex seleccionada, en los análisis de secuencias, por ejemplo, mediante el análisis de movilidad de desplazamiento de bandas en gel antes descrito, se analiza adicionalmente el análogo para determinar su capacidad de formar estructuras tríplex in vitro. Se usan sistemas de análisis de cultivo de células y análisis in vivo, tales como los descritos en la patente de EE.UU. 5.631.135.
Los sitios dianas pueden elegirse en la región de control de los genes, por ejemplo, en el sitio de iniciación de la transcripción o las regiones de unión de proteínas reguladoras (Helene and Toulme, 1990; Birg et al., 1990; Pastel et al., 1991; Cooney et al., 1988). También se puede elegir los sitios dianas de tal manera que también exista una diana en las secuencias de RNAm (es decir, una secuencia transcrita) lo que permite que los oligonucleótidos sean dirigidos también contra el sitio para funcionar también como mediadores de antisentido (véase anteriormente).
También se puede usar moléculas de DNA modificadas con tiofosforamidato para generar moléculas tríplex con una tercera cadena diana (o sea, un ácido nucleico monocatenario). Por ejemplo, se puede sintetizar una molécula de DNA que tenga dos regiones capaces de formar una estructura tríplex con una molécula como tercera cadena diana seleccionada. Típicamente, las dos regiones están enlazadas por medio de una región flexible que permita la asociación de las dos regiones con la tercera cadena para formar una estructura tríplex.
Las regiones de bisagra pueden comprender cualquier enlace flexible que mantenga juntas las dos regiones formadoras de tríplex y les permita asociarse con la tercera cadena para formar la estructura tríplex. Las dianas de tercera cadena se seleccionan para que tengan el contenido apropiado de purina/pirimidina, de modo que permitan la formación de las moléculas tríplex.
El enlace flexible puede conectar las dos regiones formadoras de tríplex (típicamente las cadenas de DNA complementarios) en cualquier orientación seleccionada, dependiendo de la naturaleza de la secuencia de base de la diana. Por ejemplo, cada una de las dos regiones formadoras de tríplex tiene extremos 5' y 3'; y estos extremos pueden estar conectados por la región de bisagra flexible en las siguientes orientaciones: 5' a 3', 3' a 5', 3' a 3' y 5' a 5'.
Adicionalmente, las moléculas de DNA dúplex que contienen por lo menos un enlace tiofosforamidato en cada cadena, pueden ser usadas como moléculas de señuelo para los factores de transcripción o las proteínas que se unen a DNA (por ejemplo, c-myb).
También se puede usar DNA monocatenario como un ácido nucleico diana para los oligonucleótidos de la presente invención utilizando, por ejemplo, estructuras de horquilla que contienen enlaces entre subunidades de tiofosforamidato. Los oligonucleótidos análogos con tiofosforamidato se pueden seleccionar para unión directa a la diana de DNA monocatenario. La unión de las dos cadenas de análogo de fosforamidato a la diana de DNA de una sola cadena, da como resultado la formación de una estructura tríplex.
D. Composiciones farmacéuticas
La presente invención incluye composiciones farmacéuticas útiles en terapias antisentido y antigenes. Las composiciones comprenden una cantidad eficaz de oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se puede incluir uno o más oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato (que tengan diferentes secuencias de bases o enlaces) en cualquier formulación dada.
Los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, cuando se emplean en aplicaciones terapéuticas, pueden ser formulados sin o con adición de un vehículo farmacéutico. El vehículo farmacéutico puede ser sólido o líquido. La formulación se administra luego en una dosis terapéuticamente eficaz a un sujeto que tenga necesidad de ella.
Se puede usar vehículos líquidos en la preparación de soluciones, emulsiones, suspensiones y composiciones presurizadas. Se disuelve o se suspende los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato en un excipiente líquido farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos adecuados de vehículos líquidos para administración parenteral de las preparaciones de oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato incluyen: agua (que contenga parcialmente aditivos, por ejemplo, derivados de celulosa, de preferencia solución de carboximetilcelulosa sódica), alcoholes (incluyendo alcoholes monohidroxilados y alcoholes polihidroxilados, por ejemplo, glicoles) y sus derivados; y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de cacahuete). El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados, incluyendo, pero sin limitación, los siguientes: solubilizantes, agentes de suspensión, emulsificantes, tampones, agentes espesantes, colorantes, reguladores de viscosidad, conservadores, estabilizadores y reguladores de osmolaridad.
Para administración parenteral de los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, el vehículo también puede ser un éster oleoso, tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos estériles son útiles en las composiciones en forma líquida estéril, para administración parenteral.
Las composiciones farmacéuticas líquidas, soluciones o suspensiones, pueden ser utilizadas, por ejemplo, para inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, intravenosa o para uso tópico. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, dirigidos contra una infección de citomegalovirus retinal, pueden ser administrados tópicamente mediante gotas para los ojos. Los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato también se pueden administrar intravascularmente o mediante una endoprótesis vascular impregnado con ácido micofenólico, por ejemplo, durante la cateterización con globo, para proporcionar efectos anti-restenosis localizados, inmediatamente después de la lesión.
El vehículo líquido para composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propulsor farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones presurizadas también pueden estar encapsuladas en lípidos para suministrarlas mediante inhalación. Para administración por medio de inhalación o insuflamiento intranasal o intrabronquial los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato se puede formular en una solución acuosa o parcialmente acuosa, que puede ser utilizada luego en la forma de un aerosol, por ejemplo, para tratamiento de infecciones de los pulmones, como Pneumocystis carnii.
Los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato se pueden administrar tópicamente en forma de una solución, una crema, una loción, por medio de formulación con vehículos farmacéuticamente aceptables que contengan el compuesto activo. Por ejemplo, para el tratamiento de verrugas genitales.
Los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato se puede administrar en vehículos de liposomas. El uso de liposomas para facilitar la absorción celular está descrito, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nº 4.897.355 y 4.394.448. Numerosas publicaciones describen la formulación y la preparación de liposomas.
Los requisitos de dosis para el tratamiento con oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato varían con las composiciones particulares empleadas, la ruta de administración, la gravedad de los síntomas presentados, la forma de los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato y el sujeto particular que se esté tratando.
Para uso como un ingrediente activo en una preparación farmacéutica, un oligonucleótido de esta invención se purifica generalmente para librarlo de otros componentes reactivos o inmunógenos potenciales, presentes en la mezcla en la que se preparan. Típicamente, se proporciona cada ingrediente activo en por lo menos alrededor de 90% de homogeneidad y, más preferible, de 95% o 99% de homogeneidad, como se determina mediante valoración funcional, cromatografía o electroforesis en gel. Luego se forma una composición con el ingrediente activo para constituir un medicamento de acuerdo con los procedimientos generalmente aceptados para obtener preparaciones farmacéuticas.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar a un sujeto, en una formulación y en una cantidad eficaces para obtener cualquier resultado clínicamente conveniente. Para el tratamiento del cáncer, los resultados deseables incluyen la reducción en la masa tumoral [según se determina por palpación o por formación de imagen, por ejemplo, mediante radiografía, exploración por tomografía asisitida por ordenador (abreviadamente CAT, por la expresión inglesa Computer Assisted Tomography) o formación de imagen por resonancia magnética (abreviadamente MRI, por la expresión inglesa Magnetic Resonance Imaging)]; reducción en la velocidad de crecimiento del tumor, reducción en la velocidad de formación de metástasis (según se determina, por ejemplo, mediante análisis histoquímico o por medio de muestras de biopsia), reducción de los marcadores bioquímicos [que incluyen marcadores generales, tales como el marcador de la velocidad de sedimentación de eritrocitos (abreviadamente ESR, por la expresión Erytrocyte Sedimentation Rate) y marcadores específicos de tumores, tales como el antígeno específico de próstata (abreviadamente PSA, por la expresión Prostate-Specific Antigen) en suero], y mejora en la calidad de vida (según se determina mediante determinación clínica, por ejemplo, puntuación de Karnofsky). Para el tratamiento de infecciones virales, los resultados deseables incluyen la reducción o eliminación de la infección, la formación de partículas infecciosas o la resolución de los síntomas asociados con la enfermedad.
La cantidad de oligonucleótido por dosis, y el número de dosis requeridas se pueden determinar empíricamente para obtener dichos efectos, utilizando ensayos in vitro y modelos animales (ilustrados en el Ejemplo 9). Se puede estimar un intervalo apropiado para el ensayo a partir de la concentración inhibidora del 50%, con telomerasa aislada o con células cultivadas. Las preparaciones de telomerasa aislada se pueden obtener de acuerdo con la patente de EE.UU. 5.968.506. Típicamente, la formulación y la vía de administración proporcionarán una concentración local en el sitio de la enfermedad de entre 1 \muM y 1 nM para un oligonucleótido estable de 12 a 15 nucleósidos, que sea 100% idéntico a una secuencia de RNA diana, específica para la enzima. La responsabilidad final de determinar el protocolo de administración está en manos del personal clínico que está a cargo.
En general, los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato se administran a una concentración que produzca resultados eficaces sin provocar ningún efecto secundario dañino o perjudicial (por ejemplo, una cantidad eficaz). Dicha concentración se puede lograr mediante administración de una sola dosis unitaria o mediante administración de la dosis, dividida en subunidades convenientes, a intervalos adecuados durante todo el día.
E. Aplicaciones de diagnóstico
Los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención también son útiles para análisis de diagnóstico para detectar RNA o DNA que tengan una secuencia diana dada. En una aplicación general, los oligonucleótidos con tiofosforamidato se marcan (por ejemplo, isotópicamente o con otro grupo informador detectable), y se usan como sondas para muestras de DNA o RNA que estén unidas a un soporte sólido (por ejemplo, membranas de nilón).
Alternativamente los oligonucleótidos con tiofosforamidato se pueden unir a un soporte sólido (por ejemplo, bolitas magnéticas) y moléculas homólogas de RNA o DNA en una muestra separada de los demás componentes de la muestra basado en su hibridación a análogos de fosforamidato inmovilizados. La unión de los oligonucleótidos con tiofosforamidato a un soporte sólido se puede llevar a cabo por métodos convencionales. La presencia del RNA o del DNA unido se puede detectar mediante métodos estándares, por ejemplo, usando un segundo informador marcado o una reacción en cadena de la polimerasa (véase las patentes de EE.UU. Nº 4.683.195 y 4.683.202).
Los análisis de diagnóstico se pueden llevar a cabo de acuerdo con procedimientos estándares, con ajuste adecuado de las condiciones de hibridación para permitir la hibridación del oligonucleótido con tiofosforamidato a la región diana. La capacidad de los oligonucleótidos con tiofosforamidato para unirse a temperatura elevada también puede ayudar a reducir al mínimo la competencia por unirse a una secuencia diana entre la sonda de oligonucleótidos con tiofosforamidato y cualquier oligonucleótido de fosfodiéster de una sola cadena correspondiente, que esté presente en la muestra de diagnóstico.
Los oligonucleótidos con tiofosforamidato diseñados para ser usados en los análisis de hibridación y otros protocolos descritos en esta descripción, pueden ser envasados en una forma de kit. El oligonucleótido se dispone en un recipiente, típicamente en un tampón adecuado para almacenamiento a largo plazo, y se acompaña opcionalmente con otros reactivos, normas o controles útiles para llevar a cabo la reacción. Típicamente el kit estará acompañado también por indicaciones escritas para uso del oligonucleótido en una reacción de hibridación o análisis de diagnóstico, ya sea como un impreso inserto en el producto o mediante un texto asociado en la distribución o la comercialización del kit.
F. Otras aplicaciones
En un aspecto, los oligonucleótidos con tiofosforamidato se pueden usar en métodos para aumentar el aislamiento de RNA o DNA de muestras. Por ejemplo, como se estudió anteriormente, los oligonucleótidos con tiofosforamidato se pueden fijar a un soporte sólido y se les puede usar para aislar secuencias de ácidos nucleicos complementarias, por ejemplo, para purificación de un RNAm específico a partir de una fracción poliA (Goldberg et al., Methods in Enzimology, 68:206-1979). Los oligonucleótidos con tiofosforamidato son ventajosos para dichas aplicaciones, puesto que pueden formar interacciones más estables con RNA y con DNA dúplex, que los oligonucleósidos de fosfodiéster estándares.
Se puede encontrar un gran número de aplicaciones en biología molecular para los oligonucleótidos con tiofosforamidato marcados con informador, en particular para detectar RNA en muestras. Los oligonucleótidos con tiofosforamidato se pueden marcar con informadores radiactivos (nucleósidos marcados con ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P o ^{35}S), biotina o marcadores fluorescentes (Gryaznov et al., Nucleic Acids Research, 20:3403-3409, 1992).Los oligonucleótidos con tiofosforamidato marcados se pueden usar como sondas eficaces, por ejemplo, en reacciones de hibridación de RNA (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media, Pa, Sambrook et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 1989).
También se puede usar moléculas de DNA bicatenarias, en donde cada cadena contiene por lo menos un enlace de tiofosforamidato, para aislamiento de proteínas que se unen al dúplex de DNA. En esta realización, el dúplex que contiene los enlaces entre las subunidades de tiofosforamidato se fija típicamente a un soporte sólido y luego la muestra que se sospecha que contiene una proteína de unión se hace pasar sobre el soporte, bajo condiciones de tampón que faciliten la unión de la proteína a su diana de DNA. Típicamente se eluye la proteína de la columna cambiando las condiciones del tampón.
Las moléculas de DNA que forman estructuras tríplex, descritas anteriormente que contienen los enlaces modificados de tiofosforamidato, se pueden usar también como reactivos de diagnóstico por ejemplo, para detectar la presencia de una molécula de DNA en una muestra.
Adicionalmente los complejos que contienen oligonucleótidos que tienen enlaces entre las subunidades de N3'\rightarrow
P5' tiofosforamidato se pueden usar para escrutar pequeñas moléculas útiles o proteínas de unión: por ejemplo, los complejos de oligonucleótido de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato se pueden usar con DNA dúplex para escrutar pequeñas moléculas, capaces de estabilizar adicionalmente la estructura tríplex. Son útiles tamices similares con los complejos de oligonucleótido de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato formados con moléculas de DNA y RNA monocatenarias.
G. Variaciones
Las variaciones en los oligonucleótidos con tiofosforamidato usados en los métodos de la presente invención incluyen modificaciones para facilitar la absorción del oligonucleótido por la célula (por ejemplo, la adición de un resto de colesterol (Letsinger, patente de EE.UU. Nº 4.958.013); la producción de oligonucleótidos quiméricos usando otros enlaces entre las subunidades (Goodchild, Bioconjugate Chem., 1:165-187, 1990); modificación con agentes de intercalamiento (por ejemplo, agentes intercaladores estabilizadores de tríplex, Wilson et al., Biochemistry, 32:10614-10621, 1993); y el uso de subunidades de ribosa en lugar de subunidades desoxirribosa.
Otras modificaciones incluyen las modificaciones en los extremos 5' y 3' de los oligonucleótidos (por ejemplo, -OH, -OR, -NHR, -NH_{2} y colesterol). Adicionalmente, la posición 2' de ribosa puede ser un sitio para numerosas modificaciones, incluyendo, pero sin limitación, la halogenación (por ejemplo, con -F).
Los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato también se pueden modificar por conjugación a un polipéptido que es absorbido por células específicas. Dichos polipéptidos útiles incluyen: hormonas peptídicas, antígenos y anticuerpos. Por ejemplo, se puede seleccionar un polipéptido que sea absorbido específicamente por una célula neoplásica, lo que daría como resultado el suministro específico de los oligonucleótidos de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato a ese tipo de células. El polipéptido y el oligonucleótido se pueden acoplar por medios conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional PCT Nº PCT/US89/02363, WO 8912110, publicada el 14 de diciembre de 1989, Ramachandr, K. et al.).
Las propiedades de dichos oligonucleótidos con tiofosforamidato, cuando se aplican a los métodos de la presente invención, pueden determinarse por los métodos descritos en la presente memoria.
Ejemplo 1 Métodos generales
Los espectros ^{31}P MNR se obtuvieron en un espectrómetro Varian a 400 MHz. Los espectros de ^{31}P MNR fueron referenciados contra ácido fosfórico acuoso al 85%. La HPLC con IE se realizó usando un sistema de cromatografía Dionex DX 500, con columnas de cambio de iones de Pharmacia Biotech Mono Q HR 5/5 o 10/16. Los análisis de espectros de masa se realizaron por Mass Consortium, San Diego, CA. El análisis MALDI-TOF de los oligonucleótidos se obtuvo usando un espectrómetro de masas de PerSpective Biosystems Voyager Elite con extracción retardada. Los experimentos de disociación térmica se realizaron en un espectrómetro Cary Bio 100 UV-Vis.
Todas las reacciones se realizaron en aparatos de vidrio secados en horno, bajo atmósfera de nitrógeno, a menos que se indique de otra manera. Los reactivos de síntesis de DNA obtenibles en el comercio se compraron a Glen Research (Sterling, VA). Los compuestos piridina anhidra, tolueno, diclorometano, diisopropiletilamina, trietilamina, anhídrido acético, 1,2-dicloroetano y dioxano se compraron a Aldrich (Milwaukee, WI).
Todos los oligonucleótidos que no tienen enlaces tiofosforamidato se sintetizaron en un sintetizador de DNA ABI 392 o 394, usando protocolos estándares para el método de acoplamiento basado en fosforamidita (Caruthers, Acc. Chem. Res., 24: 278-284, 1991). El ciclo de ensamblamiento de cadenas para la síntesis de fosforamidatos de oligonucleótido fue el siguiente: (i) destritilación, ácido tricloroacético al 3 por ciento en diclorometano, 1 minuto; (ii) acoplamiento, fosforamidita 0,1M y tetrazol 0,45M en acetonitrilo, 10 minutos; (iii) protección de grupos terminales (capping), anhídrido isobutírico 0,5M en THF/lutidina, 1/1, en v/v, 15 segundos; y (iv) oxidación, yodo 0,1M en THF/piridina/agua, 10/10/1, en v/v/v, 30 segundos.
Las etapas químicas dentro del ciclo fueron seguidas por lavado con acetonitrilo e inundación con argón seco durante 0,2-0,4 minutos. La escisión del soporte y la retirada de la base y de los grupos protectores de fosforamidato fueron logrados mediante tratamiento con amoniaco (EtOH, 3/1, en v/v, durante 6 horas a 55ºC. Los oligonucleótidos se concentraron hasta sequedad al vacío, después de lo cual se eliminaron los grupos 2'-terc.butildimetilsililo por tratamiento con TBAF 1M en THF durante 4-16 horas a 25ºC. Las mezclas de reacción se diluyeron con agua y se filtraron a través de un acrodisco de nilón 0,45 (de Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). Los oligonucleótidos se sometieron luego a análisis y se purificaron por HPLC con IE y finalmente se desalaron usando filtración en gel en una columna de Pharmacia NAP-5 o NAP-25. Las condiciones de gradiente para HPLC con IE fueron: disolvente A (NaOH 10 mM); disolvente B (NaOH 10 mM y CaCl 1,5M); disolvente A durante 3 minutos, luego un gradiente lineal de 0-80 por ciento de disolvente B en 50 minutos.
Ejemplo 2 Síntesis de N3'\rightarrowP5' fosforamidatos de arabino-fluoro-oligonucleótidos
La síntesis en fase sólida de los N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos de oligo-2'-arabino-fluoronucleótidos se basó en la reacción de transferencia de fosforamidita, empleando bloques de construcción monómeros de 5'-(O-cianoetil-N,N'-diisopropilamino)-fosforamiditas de 3'-amino-2'-ara-fluoro-nucleósidos protegidos con 3-MMTr. La preparación de los monómeros de nucleósido está ilustrada en el Esquema 4.
Esquema 4
10
El precursor de azúcar 1 (de Pfanstiehl) se convirtió en el compuesto intermedio 2 de alfa-1-bromo, con retención de la configuración C-1 de azúcar. El compuesto 2 se usó luego sin aislamiento, para una reacción de glicosilación del tipo S_{N}2 con bases de uracilo sililado y timina, lo que dio como resultado la formación de los nucleósidos 3. La estereoselectivídad de la reacción de glicosilación fue bastante alta pues más de 90% del nucleósido 3 formado tenía la configuración \beta-anómera deseada, según el análisis por ^{1}H MNR de la mezcla de reacción. El \beta-isómero puro del nucleósido 3 se aisló por cristalización en etanol. Subsiguientemente se eliminaron los grupos protectores 5'- y 3'-O-benzoílo de 3, con rendimientos casi cuantitativos, por tratamiento con amoniaco metanólico. Los grupos 5'-,3'-hidroxilo resultantes que contenían el producto nucleósido se convirtieron luego en el 2,3'-anhidronucleósido 4 en condiciones de reacción de Mitsunobu. El tratamiento de los 2,3'-anhidronucleósidos con azida de litio produjo el precursor 5 de 3'-azido. Este compuesto se convirtió luego en las fosforamiditas 7t,u, por reducción catalítica del grupo 3'-azido a 3'-amino por hidrogenación, seguida por 3'-tritilación, 5'-O-desprotección y 5'-O-fosfitilación. La citidina-fosforamidita 7c se obtuvo a partir del precursor de 3'-azido, usando el proceso de conversión de uracilo a citosina. Los rendimientos totales de las fosforamiditas 7c,t,u estuvieron en el intervalo de 8 a 12%, basado en el precursor de azúcar 1 de partida. La estructura de los monómeros se confirmó por ^{1}H, ^{31}P, ^{19}F MNR, y por análisis espectrométrico de masas. La síntesis del oligonucleótido usando el monómero 2'-arabino-fluoronucleótido se llevó a cabo luego en un sintetizador automático de DNA/RNA ABI 394, tal como se describe más adelante.
Ejemplo 3 Síntesis de N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos oligonucleotídicos
Se prepararon N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos oligonucleotídicos por la reacción de transferencia de amidita en un sintetizador ABI 394. Los bloques de construcción monómeros, totalmente protegidos, fueron 3'-aminonitril-nucleósido-5'-(2-cianoetil-N,N-diisopropil)fosforamidita, donde el nucleósido es 3'-desoxitimidina, 2',3'-didesoxi-N^{2}-isobutiril-guanosina, 2',3'-didesoxi-N^{6}-benzoil-adenosina o 2',3'-didesoxi-N^{4}-benzoil-citidina. Los 5'-succinil-3'-aminotritil-2',3'-didesoxinucleósidos se acoplaron con un vidrio de poro controlado que contenía un grupo alquil-amino de cadena larga (abreviadamente LCAA-CPG por la expresión inglesa Long Chain Alkyl Amino - Controlled Pore Glass), que se usó como soporte sólido. La síntesis se realizó en la dirección de 5' a 3'. Se usó el siguiente protocolo para el ensamblamiento de los N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos oligonucleotídicos: (i) destritilación, ácido dicloroacético al 3% en diclorometano; (ii) acoplamiento, fosforamidita 0,1M y tetrazol 0,45 M en acetonitrilo, 25 segundos; (iii) protección de grupos terminales (capping), anhídrido isobutírico/2,6-lutidina/THF 1/1/8 en v/v/v, como solución Cap A y solución Cap B estándar; (iv) sulfuración, S_{8} al 15% en disulfuro de carbono que contenía 1% de trietilamina, 1 minuto. Antes y después de la etapa de sulfuración la columna se lavó con disulfuro de carbono solo para impedir la precipitación de azufre elemental. Los tiofosforamidatos oligonucleotídicos se escindieron del soporte sólido y se desprotegieron con amoniaco acuoso concentrado. Los compuestos y se analizaron y purificaron por HPLC. La HPLC con IE se realizó usando una columna de cambio de iones DIONEX DNAPac^{TM}, a pH 12 (NaOH 10 mM), con un gradiente lineal de 1 %/minuto, NaOH 10 mM en NaCl 1,5M y un caudal de 1 mL/minuto. Los productos se desalaron en columnas de filtración por gel Sephadex NAP-5 (Pharmacia) y se liofilizaron a vacío. Los experimentos de ^{31}P MNR se realizaron en óxido de deuterio, y se analizó el grado de sulfuración (^{31}P MNR, \delta, ppm 58, 60, señales amplias, isómeros Rp, Sp).
El tiofosforamidato oligonucleotídico 5'-GTTAGGGTTAG-3' (SEQ ID NO:1) se sintetizó del siguiente modo: Un sintetizador ABI modelo 394 se puso a punto con soluciones 0,1M de 3'-tritilamino-2',3'-didesoxi-N^{6}-benzoil-adenosina (N^{2}-isobutirilguanosina y timidina) y 5'-(2-cianoetil-N,N-diisopropil)fosforamiditas. El frasco de reactivo de la estación Nº 10 se llenó con disulfuro de carbono solo y el frasco de reactivo Nº 15 se llenó con una solución de S_{8} al 15% en disulfuro de carbono que contenía 1% de trietilamina. Como activador se usó la solución 0,45M de tetrazol en acetonitrilo, comercialmente disponible. La solución Cap A (estación Nº 11) se reemplazó por solución 8/1/1 en v/v/v de tetrahidrofurano/anhídrido isobutírico/2, 6-lutidina. La solución Cap B también fue un reactivo comercialmente disponible. Se creó una nueva función para suministrar disulfuro de carbono desde la estación Nº 10 a la columna. El ciclo de síntesis de azufre por defecto se modificó del siguiente modo: se ajustó el tiempo de sulfuración en 1 minuto, y antes y después de la sulfuración se suministró a la columna disulfuro de carbono durante 20 segundos. La columna de síntesis se llenó con 1 \mumol de soporte sólido CPG (vidrio de poro controlado) cargado con N^{2}-isobutiril-3'-(tritil)amino-2',3'-didesoxiguanosina-5'-succinilo. La secuencia del compuesto se programó como GATTGGGATTG (5'\rightarrow3') (SEQ ID NO:11). El grupo tritilo se eliminó al finalizar la síntesis y la columna se lavó manualmente con disulfuro de carbono y acetonitrilo. El soporte sólido se retiró de la columna y se trató con 1 mL de amoniaco acuoso concentrado a 55ºC durante 6 horas, en un vial de vidrio herméticamente cerrado. Después de la filtración se evaporó la mayor parte del amoniaco y se desaló la solución restante usando columnas de filtración en gel Sephadex^{TM} NAP-5 (Pharmacia), y a continuación se liofilizó al vacío. El producto se analizó y purificó como se describió anteriormente. Todos los demás oligonucleótidos con tiofosforamidato que aparecen en la lista de la Tabla 2 (SEQ ID NO:2-4) se sintetizaron usando los métodos descritos en lo que antecede.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Propiedades de estabilidad frente a los ácidos y formación de dúplex de los N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos oligonucleotídicos
Los tiofosforamidatos oligonucleotídicos demostraron inesperadamente una mayor estabilidad frente a los ácidos con respecto a los correspondientes fosforamidato. Se podría esperar que la sustitución del oxígeno, no de puente, del grupo fosfato internucleótidos, por azufre, diera como resultado una disminución de la estabilidad frente a los ácidos del fosforamidato, dada la diferencia en las propiedades donadoras de electrones del azufre frente al oxígeno, lo que podría hacer más fácil la protonación del 3'-NH. Sin embargo, contrario a esta predicción, se encontró que los enlaces internucleótidos de tiofosforamidato eran más estables frente a los ácidos que sus correspondientes de oxo-fosforamidato.
Las semi-vidas del tiofosforamidato TAG_{3}T_{2}AGACA_{2} (SEQ ID NO:2) y su correspondiente fosforamidato en ácido acético acuoso al 40%, a la temperatura ambiente, fueron aproximadamente 6 horas y 0,5 hora, respectivamente, de acuerdo con el análisis por HPLC con IE (véase la Tabla 1). Además, la composición de los productos de hidrólisis fue diferente entre el tiofosforamidato y su correspondiente fosforamidato. La hidrólisis ácida del tiofosforamidato parece dar como resultado inicialmente la desulfuración, en lugar de la escisión de los grupos N-P internucleósidos, como ocurre con los fosforamidatos. Estos resultados indicaron una resistencia mucho mayor, a las condiciones ácidas, de los oligonucleótidos con tiofosforamidatos que la de los oligonucleótidos con fosforamidatos, lo que indica que esta nueva clase de oligonucleótidos con tiofosforamidato tiene un potencial mejorado para el desarrollo de agentes terapéuticos orales de oligonucleótido, en comparación con otros oligonucleótidos con fosforamidato.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
11
Se evaluaron las propiedades de formación de dúplex, de los fosforamidatos oligonucleotídicos con cadena complementaria de RNA usando experimentos de disociación térmica. Los resultados están recogidos en la Tabla 1. Los datos presentados muestran que los tiofosforamidatos oligonucleotídicos formaron complejos significativamente más estables que los oligómeros de fosfodiéster naturales isosecuenciales, en los que la diferencia en el P.f. fue alrededor de 25-27ºC por oligómero. El aumento en estabilidad térmica de los dúplex también fue similar al observado para los oligómeros de fosforamidato. Esto indica que la sustitución del oxígeno, no de puente, por el átomo de azufre en el grupo fosforamidato internucleósidos no alteró significativamente las propiedades de unión a RNA de estos compuestos, lo que estaba determinado por el plegamiento del azúcar de tipo N de los 3'-aminonucleósidos y por un aumento de la hidratación en la cadena principal de azúcar-fosfato.
Ejemplo 5 Preparación de extracto purificado por afinidad, que tiene actividad de telomerasa
Se prepararon rutinariamente extractos usados para escrutar inhibidores de telomerasa, a partir de células 293 que sobre-expresan la subunidad catalítica de la proteína telomerasa (hTERT). Se encontró que estas células tenían 2-5 veces más actividad de telomerasa que las células 293 originales. 200 ml de células empaquetadas (cosechadas de alrededor de 100 litros de cultivo) se resuspendieron en un volumen igual de tampón hipotónico (Hepes 10 mM, pH 7,9, MgCl_{2} 1 mM, DTT 1 mM, KCl 20 mM, PMSF 1 mM), y se sometieron a lisis usando un homogeneizador Dounce. La concentración de glicerol se ajustó a 10% y se añadió lentamente NaCl para dar una concentración final de 0,3M. Las células lisadas se agitaron durante 30 minutos, y luego se sedimentaron a 100.000 x g durante 1 hora. Al líquido sobrenadante S100 se añadió sulfato de amonio sólido, para alcanzar una saturación de 42%. El material se centrifugó, se volvió a suspender el sedimento en la quinta parte del volumen original y se dializó contra el tampón "A" que contenía NaCl 50 mM. Después de la diálisis, el extracto se centrifugó durante 30 minutos a 25.000 x g. Antes de la cromatografía por afinidad, se añadió Triton X-100^{TM} al 0,5%, KCl (0,3M) y 50 \mug/mL de tRNA. El oligo de afinidad (5'-biotinTEG-biotinTEG-biotinTEG-GTA GAC CTG TTA CCA guu agg guu ag 3' [SEQ ID NO:5] donde las letras minúsculas representan los 2'-O-metil-ribonucleótidos, y las letras mayúsculas representan los desoxinucleótidos) se añadió al extracto (1 mmol por 10 mL de extracto). Después de incubar 10 minutos a 30ºC, se añadieron bolitas de Neutravidina (Pierce; 250 \muL de una suspensión al 50%) y la mezcla se centrifugó durante la noche a 4ºC. Las bolitas se sedimentaron y se lavaron tres veces con tampón "B" que contenía KCl 0,3M, dos veces con tampón "B" que contenía KCl 0,6M y dos veces más con tampón B que contenía KCl 0,3M. La telomerasa se eluyó en tampón "B" que contenía KCl 0,3 M, Triton-X-100^{TM} al 0,15% y un exceso 2,5 molar del oligo de desplazamiento (5'-CTA ACC CTA ACT GGT AAC AGG TCT AC-3' [SEQ ID NO:6] a 0,5 mL por 125 \muL de bolitas empaquetadas de Neutravidina), durante treinta minutos, a la temperatura ambiente. Se llevó a cabo una segunda elución y se reunió con la primera. Los extractos purificados tuvieron típicamente actividades de 10 fmol de nucleótidos incorporados/minuto/\muL de extracto, o 200 nucleótidos/minuto/mg de proteína total.
12
Ejemplo 6 Inhibición de telomerasa por N3'\rightarrowP5' tiofosforamidatos oligonucleotídicos
Se ponen a punto tres valoraciones separadas de 100 \muL de telomerasa con los siguientes tampones: Tris-acetato 50 mM, pH 8,2, DTT 1 mM, EGTA 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, acetato de K 100 mM, dATP 500 \muM, TTP 500 \muM, [^{32}P-]
dGTP 10 \muM (25 Ci/mmol) y d(TTAGGG)_{3} (SEQ ID NO:7) 100 nM. A las reacciones individuales se añaden 2,5, 5 ó 10 \muL de telomerasa purificada por afinidad (véase el Ejemplo 4) y las reacciones se incuban a 37ºC. A los 45 y a los 90 minutos se separan de cada reacción partes alícuotas de 40 \muL y se añaden a 160 \muL de tampón de parada (NaCl 100 mM, pirofosfato de Na 10 mM, SDS al 0,2%, EDTA 2 mM, 100 \mug/mL de tRNA). Se añaden 10 \muL de ácido tricloroacético (TCA) (al 100%) y la muestra se incuba sobre hielo durante 30 minutos. La muestra se sedimenta en una microcentrífuga de fuerza 12000 x g) durante 15 minutos. El sedimento se lava con 1 mL de etanol al 95% y se vuelve a formar el sedimento en la microcentrífuga (fuerza de 12000 x g) durante cinco minutos. El sedimento se vuelve a suspender en 50 \muL de dH_{2}O y se transfiere a un tubo de ensayo de vidrio, de 12 x 75, que contiene 2,5 ml de una solución al 5% de TCA enfriada con hielo y pirofosfato de Na 10 mM. La muestra se incuba sobre hielo durante 30 minutos. La muestra se filtra a través de una membrana GFC (S&S) húmeda (dH_{2}O) de 2,5 cm, en un distribuidor de filtración a vacío. El filtro se lava tres veces a vacío con 5 mL de TCA al 1% enfriado con hielo, y una vez con 5 mL de etanol al 95%. El filtro se seca y se somete a recuento en un contador de centelleo, utilizando un fluido de centelleo. Se determina el número de fmoles de nucleótido incorporados a partir de la actividad específica del trazador radiactivo. La actividad del extracto se calcula en base al dNTP incorporado y se expresa como fmoles de dNTP/minuto/\muL de extracto.
Análisis de actividad de telomerasa Análisis de placas Flash Bio-Tel
Se proporciona un ensayo para la detección y/o la medición de la actividad de telomerasa, midiendo la adición de las repeticiones telómeras TTAGGG a un cebador sustrato de telomerasa biotinilado; una reacción catalizada por telomerasa. Los productos biotinilados se capturan en placas de microtitulación revestidas con estreptavidina. Se usa una sonda de oligonucleótido, complementaria de 3,5 repeticiones de telómero, marcada con ^{33}P, para medir los productos de telomerasa, como se describe más adelante. La sonda no unida se retira por lavado, y se determina la cantidad de sonda que se asocia a los productos de telomerasa capturados por recuento de centelleo.
Método
I.-
Los oligonucleótidos con tiofosforamidato se conservaron como soluciones madres concentradas y disueltos en PBS.
II.-
Para los ensayos, los oligonucleótidos con tiofosforamidato se diluyeron hasta una solución madre de trabajo 15X, en PBS y se distribuyeron 2 \muL en dos pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos (se analiza por duplicado).
III.-
El extracto de telomerasa se diluyó hasta una actividad específica de 0,04 a 0,09 fmol de dNTP incorpora- do/minuto/\muL de tampón de dilución de telomerasa, y se añadieron 18 \muL a cada pocillo de muestra, para preincubar con el compuesto durante 30 minutos a la temperatura ambiente.
IV.-
La reacción de telomerasa se inició por adición de 10 \muL de la mezcla madre a los pocillos que contenían extracto de telomerasa y el compuesto oligonucleótido que se está analizando. Las placas se sellaron y se incubaron a 37ºC durante 90 minutos.
V.-
La reacción se detuvo añadiendo 10 \muL de solución de captura por hibridación (abreviadamente HCS, por la expresión inglesa Hybridization Capture Solution).
VI.-
Se transfirieron 25 \muL de la mezcla de reacción a una placa FlashPlate^{TM} (NEN) revestida con estreptavidina, de 96 pocillos, y se incubó durante dos horas a la temperatura ambiente, con agitación moderada.
VII.-
Los pocillos se lavaron tres veces con 180 \muL de SSC 2X sin ninguna incubación.
VIII.-
Las cantidades de sonda asociada a los productos de telomerasa biotinilados se detectaron en un contador de destello.
\vskip1.000000\baselineskip
Tampones Tampón de dilución de telomerasa:
Tris-acetato 50 mM, pH 8,2
DTT 1 mM
EGTA 1 mM
MgCl_{2} 1 mM
BSA 830 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
Mezcla madre (MM)
Tris-acetato 50 mM, pH 8,2;
DTT 1 mM
EGTA 1 mM
MgCl_{2} 1 mM
Acetato de K 150 mM
dATP 10 \muM
dGTP 20 \muM
dTTP 120 \muM
Cebador biotinilado 100 nM (5'-biotin-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') [SEQ ID NO:8).
Sonda marcada 5,4 nM [5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCC-(^{33}P) A_{1-50}-3'] [SEQ ID NO:9); actividad específica aproximadamente 10^{9} cpm/\mug o más.
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de captura por hibridación (HCS)
12 X SSC (1X = NaCl 150 mM/ citrato de Na_{3} 30 mM)
EDTA 40 mM
Tris-HCl 40 mM, pH 7,0.
Usando el análisis antes indicado, se encontró que los oligonucleótidos con tiofosforamidato, representados por las SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 mostraban tener valores de CI_{50} para telomerasa inferiores a 1,0 nM (véase Tabla 2, experimentos 1 y 3).
TABLA 2 Evaluación de oligos 1-4 como inhibidores de telomerasa, en comparación con fosforamidatos
13
La secuencia de oligonucleótido 2 (SEQ ID NO:3) es un control de desapareamiento para los oligonucleótidos usados en el experimento 1 (SEQ ID NO:1). De manera similar, la secuencia de oligonucleótido 4 (SEQ ID NO:4) es un control de desapareamiento para el oligonucleótido (SEQ ID NO:2) usados en el experimento 3.
Los datos de inhibición de telomerasa presentados en la Tabla 2 muestran que los polinucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención son aproximadamente 2 a 3 veces mejores en la inhibición de la actividad de telomerasa, con respecto a los oligonucleótidos de fosforamidatos correspondientes. Así pues, los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la invención no solamente son más activos en el análisis de inhibición de telomerasa, en comparación con sus correspondientes de fosforamidato, sino que también son más resistentes a los ácidos que éstos. Esa combinación de características imparte a los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la invención una ventaja importante, en comparación con los polinucleótidos de fosforamidato.
Ejemplo 7 Actividad antitumoral de los oligonucleótidos con tiofosforamidato Estudios ex vivo a.- Reducción de la longitud del telómero en células tumorales
Se prepararon colonias de células epiteliales de mama humana (inmortalizadas espontáneamente) usando métodos y materiales estándares. Se prepararon las colonias sembrando placas de 15 centímetros con alrededor de 10^{6} células en cada placa. Las placas se incubaron para permitir que las colonias de células crecieran hasta aproximadamente 80% de confluencia, momento en el que cada colonia se dividió en dos grupos. Un grupo se expuso a una dosis subaguda del polinucleótido con tiofosforamidato de la SEQ ID NO:2, a una concentración predeterminada (por ejemplo, entre alrededor de 100 nM y alrededor de 20 \muM) durante un periodo aproximado de 4 a 8 horas después de sembrar la placa después de la división. Similarmente el segundo grupo de células se expuso al oligonucleótido de control de desapareamiento SEQ ID NO:4.
A cada grupo de células se le permitió que continuara dividiéndose y los grupos se dividieron nuevamente de igual manera (cercanos a la confluencia). Se sembró el mismo número de células para continuar el crecimiento. Cada cuarto día se añadió el oligonucleótido con tiofosforamidato de prueba o un oligonucleótido de control, a las muestras, a la misma concentración suministrada inicialmente. En un experimento las células se trataron adicionalmente con FuGENE6^{TM} (Boehringer-Mannheim), siguiendo las instrucciones del fabricante. FuGENE6^{TM} aumenta la absorción de oligonucleótidos por las células.
Se determinó la longitud del telómero digiriendo el DNA de las muestras de células usando enzimas de restricción específicas para secuencias diferentes de la secuencia T_{2}AG_{3} repetitiva de los telómeros humanos (análisis de TRF). El DNA digerido se separó por tamaños, usando técnicas estándares de electroforesis en gel, para determinar la longitud de las repeticiones telómeras que, después de sondar con una sonda de DNA de telómero, aparecen sobre el gel como una mancha de DNA de elevado peso molecular (aproximadamente 2 Kb-15 Kb). Las Figuras 4 y 5 muestran ejemplos de dichos experimentos.
Los resultados presentados en la Figura 4 indican que el oligonucleótido con tiofosforamidato de la SEQ ID NO:2, es un potente inhibidor in vitro de la actividad de telomerasa. En ausencia de FuGENE6^{TM}, el oligonucleótido con tiofosforamidato de la SEQ ID NO:2 indujo una gran disminución en la longitud del telómero cuando se incubó con células HME50-5E, en el intervalo de 1-20 \muM. Cuando las células se co-incubaron con FuGENE6 y el oligonucleótido con tiofosforamidato de la SEQ ID NO:2, se redujo el tamaño del telómero en comparación con las células de control, incluso a la concentración más baja probada (100 nM).
Los resultados presentados en la Figura 5 indican que el oligonucleótido con tiofosforamidato que tiene la secuencia CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:10) es un potente inhibidor in vitro de la actividad de telomerasa. Cuando las células se incubaron con el oligonucleótido con tiofosforamidato de la SEQ ID NO:10, se redujo el tamaño del telómero en comparación con las células de control, incluso a la concentración más baja ensayada (1 nM). Así pues, los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la invención son potentes inhibidores in vitro de la actividad de telomerasa en células epiteliales de mama humanas inmortalizadas.
En otro experimento las células HME50-5E se incubaron con uno de los polinucleótidos con tiofosforamidato mostrados en las SEQ ID NO:2 y 10. Se usó como control el oligonucleótido de desapareamiento de la SEQ ID NO:4. Todos los polinucleótidos se usaron a concentraciones de entre alrededor de 0,1 \muM y alrededor de 20 \muM, usando el protocolo antes descrito. Los datos sobre el desarrollo o crecimiento de las células, mostrados en la Figura 6, indican que las células entraron en crisis (es decir, cesaron en la función celular) en un tiempo de alrededor de 100 días después de la administración de los oligonucleótidos con tiofosforamidato de ensayo de la invención.
Adicionalmente el análisis TRF de las células (Figura 7) usando metodología estándar, muestra que los oligonucleótidos con tiofosforamidato de ensayo de la invención fueron eficaces en reducir la longitud del telómero. Las células HME50-5E se incubaron con uno de los polinucleótidos con tiofosforamidato mostrados en las SEQ ID NO:2 y 10. Como control se usó el oligonucleótido de desapareamiento de la SEQ ID NO:4. Todos los polinucleótidos se usaron a una concentración aproximada de 0,5 \muM, usando el protocolo antes descrito. La longitud de los telómeros se midió los días 10, 20, 40 y 80. Para las células que tenían el oligonucleótido de desapareamiento de control, la longitud del telómero se midió el día 90, y este punto de datos sirvió como punto final. Además de las células HME50-5E descritas arriba, se puede efectuar este análisis con cualquier línea de células positiva a la telomerasa, tal como las células HeLa o las células HEK-293.
\vskip1.000000\baselineskip
b.- Especificidad
Los polinucleótidos con tiofosforamidato de la invención se escrutan para determinar su actividad contra telomerasa (CI_{50}) y otras enzimas conocidas que tengan componentes de RNA realizando ensayos de hibridación o análisis de inhibición de enzimas, usando técnicas estándares. Los oligonucleótidos que tienen valores la CI_{50} menores para la telomerasa, en comparación con los valores de la CI_{50} para otras enzimas que están siendo escrutadas, se dice que poseen especificidad para la telomerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
c.- Citotoxicidad
La valoración de la muerte celular (XTT) por citotoxicidad se realizó usando los tipos de células HME50-5E, Caki-1, A431, ACHN y A549. Las líneas de células usadas en el valoración se expusieron al oligonucleótido con tiofosforamidato de la SEQ ID NO:2 durante 72 horas, a concentraciones que van desde alrededor de 1 \muM a alrededor de 100 \muM, en presencia y ausencia de lípidos. Durante ese periodo se determinó la densidad óptica (DO) de las muestras para luz de 540 nanómetros (nm). Los valores de la CI_{50} obtenidos para los diversos tipos de células (mostrados en la Figura 8) fueron generalmente inferiores a 1 \muM. Así pues, no es de esperar que se observen efectos citotóxicos significativos a concentraciones inferiores a alrededor de 100 \muM. Se apreciará que se pueden usar otras líneas de células tumorales, tales como las líneas de células tumorales de ovarios OVCAR-5 y SK-OV-3, para determinar la citotoxicidad, además de las líneas de células de control, como las células BJ humanas, normales. También se pueden usar otras valoraciones de citotoxicidad, tales como la valoración MTT (véase Berridge et al., Biochemica, 4:14-19, 1996) y la valoración alamarBlue^{TM} (patente de EE.UU. Nº 5.501.959).
Preferiblemente para observar cualesquiera efectos inhibidores de telomerasa los oligonucleótidos con tiofosforamidato deben administrarse a una concentración inferior al nivel de citotoxicidad. No obstante, puesto que la efectividad de muchos agentes quimioterapéuticos para el cáncer se deriva de sus efectos citotóxicos, está dentro del alcance de la presente invención que los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la presente invención sean administrados a cualquier dosis para la que se observen efectos quimioterapéuticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios en animales in vivo
Se puede construir un modelo de xenoinjerto de tumor humano, en el que las células tumorales OVCAR-5 se injertan en ratones atímicos, usando técnicas y materiales estándares. Los ratones se dividieron en dos grupos. Un grupo se trató intraperitonealmente con un oligonucleótido con tiofosforamidato de la invención. El otro grupo se trató con un control que comprende una mezcla de solución tampón de fosfato (PBS) y un oligonucleótido complementario con el RNA de telomerasa, pero que tiene por lo menos un desapareamiento de bases con la secuencia de RNA de telomerasa. Para los ratones de cada grupo se determina la masa tumoral media, periódicamente después del xenoinjerto, usando métodos y materiales estándares.
En el grupo tratado con el oligonucleótido con tiofosforamidato de la invención se espera que la masa tumoral media aumente después del tratamiento inicial durante un periodo de tiempo, después del cual se espera que dicha masa tumoral se estabilice y luego comience a disminuir. Las masas tumorales del grupo de control se espera que aumenten durante todo el estudio. Así pues, se espera que los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la invención disminuyan drásticamente la velocidad de crecimiento del tumor y, finalmente, induzcan la reducción en el tamaño de tumor y la eliminación del tumor.
Así pues, la presente invención proporciona nuevos oligonucleótidos con tiofosforamidato, y métodos para inhibir la actividad de telomerasa y para tratar estados morbosos en los que la actividad de telomerasa tiene efectos dañinos, especialmente el cáncer. Los oligonucleótidos con tiofosforamidato de la invención proporcionan un tratamiento sumamente selectivo y eficaz para células malignas, que requieren la actividad de telomerasa para permanecer inmortales; pero sin afectar las células no malignas.

Claims (28)

1. Un oligonucleótido que comprende una secuencia no homopolímera de subunidades de nucleósido, unidas por al menos un enlace entre las subunidades que es un N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato definido por la fórmula:
3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5'
en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, y sus sales, y
en donde el oligonucleótido puede inhibir o reducir la actividad de telomerasa en al menos 10% comparada con un control en el cual la enzima no está tratada con el oligonucleótido.
2. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido puede hibridarse específicamente con un componente RNA de telomerasa.
3. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 2, en donde el oligonucleótido se puede hibridar específicamente al componente RNA de telomerasa humana.
4. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que es exactamente complementaria de una secuencia del componente RNA de telomerasa.
5. El oligonucleótido de conformidad con las reivindicaciones 4 o 5, en donde el oligonucleótido comprende una secuencia que es exactamente complementaria del componente RNA de telomerasa humana.
6. El oligonucleótido de conformidad con las reivindicaciones 4 o 5, en donde la secuencia que es exactamente complementaria de la secuencia del componente RNA de telomerasa tiene una longitud de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos.
7. El nucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde todas los enlaces entre las subunidades son enlaces N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato.
8. El oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el oligonucleótido tiene una longitud de entre 10 y 100 nucleótidos.
9. El oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el oligonucleótido tiene una longitud entre 10 y 25 nucleótidos.
10. El oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 ó 9, que comprende por lo menos un enlace entre las subunidades, seleccionado del grupo que consiste de fosfodiéster, fosfotriéster, metilfosfonato, P3'\rightarrowN5' fosforamidato, N3'\rightarrowP5' fosforamidato y fosforotioato.
11. Un oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 , en donde el oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:1); TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:2) y CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:10).
12. Un oligonucleótido con N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, que tiene la siguiente secuencia: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:1), en donde el enlace tiofosforamidato está definido por la fórmula:
3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5'
en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, y sus sales.
13. Un oligonucleótido con N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, que tiene la siguiente secuencia: TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:2), en donde el enlace tiofosforamidato está definido por la fórmula:
3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5'
en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, y sus sales.
14. Un oligonucleótido con N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato, que tiene la siguiente secuencia: CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID No. 10), en donde el enlace tiofosforamidato está definido por la fórmula:
3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5'
en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, y sus sales.
15. Un oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el oligonucleótido incluye una modificación para facilitar la absorción del oligonucleótido por una célula.
16. Una composición farmacéutica, que comprende un oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, formulado en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
17. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, que comprende un oligonucleótido con N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato que tiene la siguiente secuencia: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO. 1), formulado en un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde el enlace tiofosforamidato está definido por la fórmula:
3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5'
en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, y sus sales.
18. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, que comprende un oligonucleótido con N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato que tiene la siguiente secuencia: TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:2), formulado en un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde el enlace tiofosforamidato está definido por la fórmula:
3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5'
en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, y sus sales.
19. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, que comprende un oligonucleótido con N3'\rightarrowP5' tiofosforamidato que tiene la siguiente secuencia: CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID No. 10), formulado en un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde el enlace tiofosforamidato está definido por la fórmula:
3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5'
en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, y sus sales.
20. Un método de inhibir la actividad de la enzima telomerasa en una célula in vitro, que comprende poner en contacto la célula con un oligonucleótido o una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. Un polinucleótido que comprende un oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1 que una secuencia de subunidades de nucleótido que contienen al menos una subunidad definida por la fórmula:
14
en donde
B es una purina o pirimidina, o uno de sus análogos,
Z es SR en donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y arilo y sus sales; y
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, O-R_{2}, S-R_{2} y halógeno, en donde R_{2} es H, alquilo o (CH_{2})_{n}
W(CH_{2})_{m}H, en donde n está entre 1 y 10, m está entre 0 y 10 y W es O, S ó NH.
22. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21, en donde todas las subunidades están definidas por la fórmula:
15
23. El polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 21 o 22, en donde el polinucleótido puede inhibir o reducir la actividad de la enzima telomerasa.
24. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 23, en donde el polinucleótido puede hibridarse específicamente con un componente RNA de telomerasa.
25. El polinucleótido de conformidad con la reivindicaciones 23, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que es exactamente complementaria de una secuencia del componente RNA de telomerasa.
26. Un oligonucleótido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, para uso en medicina.
27. Uso de un oligonucleótido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el uso de un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
28. Uso de un oligonucleótido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el uso de un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un estado mediado por telomerasa.
ES00961689T 1999-09-10 2000-09-08 N3'-p5' tiofosforamidatos oligonucleotidicos: su sintesis y uso. Expired - Lifetime ES2302701T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15320199P 1999-09-10 1999-09-10
US153201P 1999-09-10
US16044499P 1999-10-19 1999-10-19
US160444P 1999-10-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2302701T3 true ES2302701T3 (es) 2008-08-01

Family

ID=26850281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00961689T Expired - Lifetime ES2302701T3 (es) 1999-09-10 2000-09-08 N3'-p5' tiofosforamidatos oligonucleotidicos: su sintesis y uso.

Country Status (17)

Country Link
US (5) US6608036B1 (es)
EP (2) EP1992634A1 (es)
JP (2) JP4267233B2 (es)
KR (2) KR100858465B1 (es)
CN (1) CN1317291C (es)
AT (1) ATE391134T1 (es)
AU (2) AU767646B2 (es)
CA (1) CA2382521C (es)
CY (1) CY1108158T1 (es)
DE (1) DE60038495T2 (es)
DK (1) DK1210357T3 (es)
ES (1) ES2302701T3 (es)
HK (1) HK1049339B (es)
IL (2) IL148304A0 (es)
MX (1) MXPA02002577A (es)
PT (1) PT1210357E (es)
WO (1) WO2001018015A1 (es)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523389A (en) * 1992-09-29 1996-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of human immunodeficiency virus
US20030032610A1 (en) * 1996-06-03 2003-02-13 Gilchrest Barbara A. Method to inhibit cell growth using oligonucleotides
WO2000047599A1 (en) 1999-02-12 2000-08-17 Sankyo Company, Limited Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
KR100858465B1 (ko) * 1999-09-10 2008-09-16 제론 코포레이션 올리고뉴클레오티드 엔3'→피5' 티오포스포라미데이트,이의 합성 및 용도
AU2001251115A1 (en) 2000-03-31 2001-10-15 Trustees Of Boston University Use of locally applied dna fragments
AU2003244338C1 (en) * 2001-03-23 2008-07-24 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
EP1379689B1 (en) * 2001-03-23 2012-09-26 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
DE10159904A1 (de) * 2001-12-06 2003-07-03 Adnagen Ag Oligonukleotidanordnung, Verfahren zum Nukleotidnachweis sowie Vorrichtung hierfür
WO2004037842A1 (ja) * 2002-10-23 2004-05-06 Sankyo Company, Limited 糖部ｓ型配座の新規人工核酸
HUE043168T2 (hu) 2003-06-23 2019-08-28 Telomerase Activation Sciences Inc Készítmények telomeráz-aktivitás fokozására
US9248088B2 (en) 2003-06-25 2016-02-02 Telomerase Activation Sciences, Inc. Compositions and methods for skin conditioning
JP4690324B2 (ja) 2003-09-09 2011-06-01 ジェロン・コーポレーション テロメラーゼ阻害のための改変オリゴヌクレオチド
WO2005047506A1 (en) 2003-11-04 2005-05-26 Geron Corporation Rna amidates and thioamidates for rnai
TW200540180A (en) * 2004-05-28 2005-12-16 Sankyo Co Telomerase inhibitor ena oligonucleotide
SI3296312T1 (sl) 2004-07-02 2021-08-31 Geron Corporation Sinteza zaščitenih 3'-amino 5'-fosforamiditnih nukleozidnih monomerov
EP1828217A2 (en) * 2004-12-16 2007-09-05 Febit Biotech GmbH Polymerase-independent analysis of the sequence of polynucleotides
WO2006113426A2 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of telomerase and tubulin activities
US8153604B2 (en) * 2006-04-24 2012-04-10 Geron Corporation CNS-tumor treatment method and composition
SI2101789T1 (sl) 2006-10-30 2015-04-30 Geron Corporation Kombinirani inhibitor telomeraze in gemcitabin za zdravljenje raka
US8785409B2 (en) 2007-01-30 2014-07-22 Geron Corporation Compounds having anti-adhesive effects on cancer cells
US8011527B2 (en) * 2007-08-10 2011-09-06 Rexam Beverage Can Company Can end with countersink
HRP20160067T1 (hr) 2008-10-17 2016-03-25 Geron Corp Postupak za utvrđivanje osjetljivosti bolesnika na liječenje inhibicijom telomeraze
US8759318B2 (en) * 2009-01-09 2014-06-24 Inhibitex, Inc. Phosphoramidate derivatives of guanosine nucleoside compounds for treatment of viral infections
US8710200B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
ES2874774T3 (es) 2011-12-22 2021-11-05 Geron Corp Análogos de guanina como sustratos de telomerasa y afectores de la longitud de los telómeros
EP2830991A1 (en) 2012-03-26 2015-02-04 President and Fellows of Harvard College Lipid-coated nucleic acid nanostructures of defined shape
HK1214293A1 (zh) * 2012-10-26 2016-07-22 Geron Corporation C-myc反义寡核苷酸和利用其治疗细胞增殖性疾病的方法
US9228189B2 (en) 2012-10-26 2016-01-05 Geron Corporation C-myc antisense oligonucleotides and methods for using the same to treat cell-proliferative disorders
US9200327B2 (en) 2012-11-30 2015-12-01 Geron Corporation Diagnostic markers for treating cell proliferative disorders with telomerase inhibitors
US9375485B2 (en) 2012-12-07 2016-06-28 Geron Corporation Use of telomerase inhibitors for the treatment of myeloproliferative disorders and myeloproliferative neoplasms
US10138507B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Modernatx, Inc. Manufacturing methods for production of RNA transcripts
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
CN103382212B (zh) * 2013-07-06 2016-08-31 中国科学院成都生物研究所 5′位改性嘌呤霉素化合物及其制备方法和用途
RS62529B1 (sr) 2013-07-11 2021-11-30 Modernatx Inc Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe
EP3052512A4 (en) 2013-09-30 2017-02-22 Geron Corporation Phosphorodiamidate backbone linkage for oligonucleotides
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3065722A4 (en) * 2013-11-08 2017-11-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Nucleic acid nanostructures for in vivo agent delivery
CN106456694B (zh) 2013-12-20 2020-06-30 通用医疗公司 与循环肿瘤细胞相关的方法和测定法
JOP20200257A1 (ar) * 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
EP3157573A4 (en) 2014-06-19 2018-02-21 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
US10407683B2 (en) 2014-07-16 2019-09-10 Modernatx, Inc. Circular polynucleotides
EP3169693B1 (en) * 2014-07-16 2022-03-09 ModernaTX, Inc. Chimeric polynucleotides
EA035885B1 (ru) * 2015-04-23 2020-08-27 Джерон Корпорейшн Способы получения полинуклеотидов с использованием композиций солей поливалентных катионов
DK3350333T3 (da) 2015-09-17 2022-01-31 Modernatx Inc Polynukleotider, der indeholder en stabiliserende haleregion
US11434486B2 (en) 2015-09-17 2022-09-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
WO2017223176A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Modernatx, Inc. Methods and apparatus for filtration
EP3318276A1 (en) 2016-11-04 2018-05-09 Janssen Biotech, Inc. Combinations of a telomerase inhibitor and a bcl-2 inhibitor for the treatment of hematological cancers
IL315071A (en) * 2016-09-14 2024-10-01 Janssen Biopharma Llc Modified oligonucleotides and pharmaceutical compositions
CN116804031A (zh) * 2016-09-20 2023-09-26 科罗拉多州立大学董事会法人团体 使用亚磷酰胺化学法合成主链修饰的吗啉代寡核苷酸和嵌合体
TW201831684A (zh) * 2016-11-11 2018-09-01 美商艾洛斯生物製藥公司 用於ｃｃｃＤＮＡ之寡核苷酸標靶策略
JPWO2018221735A1 (ja) * 2017-06-02 2020-05-21 富田製薬株式会社 新規オリゴヌクレオチド
BR112020000410A2 (pt) 2017-07-10 2020-07-14 Geron Corporation processo aprimorado para preparar imetelstat
EP3658156B1 (en) 2017-07-28 2026-03-25 Geron Corporation Telomerase inhibitor for use in treating a myelodysplastic syndrome
MX2020002882A (es) * 2017-09-14 2020-10-05 Janssen Biopharma Inc Fosforamiditas de nucleósido modificado.
SG11202008895WA (en) 2018-03-13 2020-10-29 Janssen Pharmaceutica Nv Modified oligonucleotides for use in treatment of tauopathies
JP2021525507A (ja) * 2018-05-25 2021-09-27 ニューヨーク インスティチュート オブ テクノロジーＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 直接核酸配列決定方法
EP3818066B1 (en) 2018-07-05 2022-06-15 Agilent Technologies, Inc. Double coupling method for oligonucleotide synthesis
UA130012C2 (uk) 2018-11-29 2025-10-15 Джерон Корпорейшн Спосіб лікування мієлодиспластичного синдрому
WO2020210468A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid nanostructures crosslinked with oligolysine
WO2021198958A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 Janssen Biopharma, Inc. Nucleic acid polymers
CN118388567A (zh) * 2024-06-26 2024-07-26 广州表观生物科技有限公司 一种特异性靶向酪氨酸酶、制备方法及其应用

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4647529A (en) 1984-06-01 1987-03-03 Rodland Karin D Hybridization method of detecting nucleic acid sequences with probe containing thionucleotide
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5501959A (en) 1989-01-17 1996-03-26 Alamar Biosciences Laboratory, Inc. Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assays using resazurin and poising agents
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5506212A (en) 1990-01-11 1996-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides with substantially chirally pure phosphorothioate linkages
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5412087A (en) 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
US6017895A (en) 1992-02-10 2000-01-25 Genzyme Corporation Oligonucleotides possessing zwitterionic moieties
US5489508A (en) 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5645986A (en) * 1992-05-13 1997-07-08 Board Of Reagents, The University Of Texas System Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5654286A (en) * 1993-05-12 1997-08-05 Hostetler; Karl Y. Nucleotides for topical treatment of psoriasis, and methods for using same
JPH09500378A (ja) 1993-07-02 1997-01-14 リンクス セラピューティクス，インコーポレイティド 枝分れされそして複雑に結合された高分子構造体の集中的合成
US5637684A (en) 1994-02-23 1997-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5726297A (en) 1994-03-18 1998-03-10 Lynx Therapeutics, Inc. Oligodeoxyribonucleotide N3' P5' phosphoramidates
CZ274596A3 (en) 1994-03-18 1997-03-12 Lynx Therapeutics Oligonucleotide n3 - p5 phosphoramidates and process of their synthesis and hybridization
US5776679A (en) 1994-07-07 1998-07-07 Geron Corporation Assays for the DNA component of human telomerase
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
HUT78054A (hu) 1994-07-07 1999-07-28 Geron Corporation Emlőseredetű telomeráz RNS-összetevője
US5972605A (en) 1994-07-07 1999-10-26 Geron Corporation Assays for regulators of mammalian telomerase expression
US5583016A (en) 1994-07-07 1996-12-10 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5643890A (en) * 1995-01-31 1997-07-01 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Synthetic oligonucleotides which mimic telomeric sequences for use in treatment of cancer and other diseases
US5656638A (en) 1995-04-18 1997-08-12 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5863936A (en) 1995-04-18 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5760062A (en) 1995-04-18 1998-06-02 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US6004939A (en) 1995-07-06 1999-12-21 Ctrc Research Foundation Board Of Regents Methods for modulation and inhibition of telomerase
US5968506A (en) * 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
US5856096A (en) * 1995-09-20 1999-01-05 Ctrc Research Foundation Rapid and sensitive assays for detecting and distinguishing between processive and non-processive telomerase activities
US5770613A (en) 1995-09-29 1998-06-23 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5767278A (en) 1995-10-06 1998-06-16 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5684143A (en) 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
WO1997037891A1 (fr) 1996-04-05 1997-10-16 German Viktorovich Demidov Unite motrice et de transport comportant un module energetique
US6015710A (en) * 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
AU2445997A (en) 1996-04-10 1997-10-29 Lynx Therapeutics, Inc. Telomerase inhibitors
EP1736554B1 (en) * 1996-05-29 2013-10-09 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
EP0954585B1 (en) 1996-10-01 2009-11-25 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase promoter
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US6444650B1 (en) 1996-10-01 2002-09-03 Geron Corporation Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase
DE19720151A1 (de) * 1997-05-02 1998-11-05 Max Delbrueck Centrum Chimäre Oligonucleotide und ihre Verwendung
JPH11228451A (ja) * 1998-02-10 1999-08-24 Kureha Chem Ind Co Ltd 抗癌性増強医薬組成物
KR100858465B1 (ko) * 1999-09-10 2008-09-16 제론 코포레이션 올리고뉴클레오티드 엔3'→피5' 티오포스포라미데이트,이의 합성 및 용도
WO2001074136A2 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Geron Corporation Telomerase inhibitor polynucleotides
US6342358B1 (en) 2000-08-24 2002-01-29 The Regents Of The University Of California Human telomerase RNA elements
US7354706B2 (en) * 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003513887A (ja) 2003-04-15
WO2001018015A1 (en) 2001-03-15
CN1373768A (zh) 2002-10-09
EP1210357A1 (en) 2002-06-05
HK1049339A1 (en) 2003-05-09
US20050049408A1 (en) 2005-03-03
CY1108158T1 (el) 2014-02-12
IL148304A (en) 2007-10-31
EP1992634A1 (en) 2008-11-19
JP2009046483A (ja) 2009-03-05
CA2382521C (en) 2009-08-25
DE60038495D1 (de) 2008-05-15
AU7360900A (en) 2001-04-10
IL148304A0 (en) 2002-09-12
US20070037770A1 (en) 2007-02-15
EP1210357B1 (en) 2008-04-02
US6835826B2 (en) 2004-12-28
AU767646B2 (en) 2003-11-20
CA2382521A1 (en) 2001-03-15
JP4267233B2 (ja) 2009-05-27
HK1049339B (en) 2008-06-27
US20140349292A1 (en) 2014-11-27
KR100858465B1 (ko) 2008-09-16
PT1210357E (pt) 2008-06-11
DK1210357T3 (da) 2008-07-21
US6608036B1 (en) 2003-08-19
US20030212032A1 (en) 2003-11-13
DE60038495T2 (de) 2009-04-09
MXPA02002577A (es) 2003-10-14
AU2003262453A1 (en) 2003-12-18
US7138383B2 (en) 2006-11-21
CN1317291C (zh) 2007-05-23
KR20070112295A (ko) 2007-11-22
ATE391134T1 (de) 2008-04-15
KR20020092909A (ko) 2002-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2302701T3 (es) N3'-p5' tiofosforamidatos oligonucleotidicos: su sintesis y uso.
US10358459B2 (en) 2′-arabino-fluorooligonucleotide N3′˜P5′ phosphoramidates: their synthesis and use
EP1543021B1 (en) Oligonucleotide conjugates
EP1379689B1 (en) Oligonucleotide conjugates
HK1079531B (en) Oligonucleotide conjugates
HK1065063B (en) Oligonucleotide conjugates