ES2302707T3 - Activacion del sistema inmunitario por un inductor nf-kappa b y un antigeno. - Google Patents

Abstract

Utilización de (a) un inductor de NF-kB o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un inductor de NF-kB unido de manera operativa a elementos reguladores necesarios para la expresión de dicho ácido nucleico y (b) una molécula antigénica o polinucleótido que codifica una molécula antigénica para la fabricación de medicamentos para estimular la presentación de antígenos o estimular una respuesta inmune.

Description

Activación del sistema inmunitario por un inductor NF-\kappaB y un antígeno.

La invención se refiere a la activación del sistema inmune mediante la utilización de inductores de NF-\kappaB y a la utilización de dichos inductores para tratar enfermedades infecciosas y cáncer.

La presentación de los antígenos es una etapa crítica en el inicio de la respuesta inmune y se sabe que las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígenos más potentes para células T sin activación previa (naive). Esto se debe particularmente a su alta expresión de MHC y moléculas coestimuladoras (Hart (1997) Blood 90, 3245-3287). Si embargo, se sabe poco acerca de las rutas bioquímicas que regulan la función de presentación de antígenos debido, en parte, a la dificultad de transfectar DC. Utilizando un inhibidor de la degradación de I\kappaB, PSI, que produce una inhibición eficaz de la activación de NF-\kappaB, los inventores muestran aquí la supresión de la capacidad de las DC para inducir una reacción mixta de linfocitos. El mecanismo suprimió la función de las DC y disminuyó la presentación de antígeno e implicó la regulación a la baja de múltiples etapas, incluyendo moléculas coestimuladoras (CD86 y CD80), HLA clase II (DQ>DR) así como citoquinas tales como IL-12. Además, las células T expuestas a dichas DC fueron incapaces de estimularse por encuentros posteriores con DC normales. Estos resultados indican que NF-\kappaB es una diana eficaz para bloquear la presentación de antígenos.

Las células dendríticas tienen una gran importancia en la presentación de antígenos a células T sin activación previa (naive) en la respuesta inmune primaria. Son células procedentes de la médula ósea que fueron descritas por primera vez a principios de los 70 por Steinman y Cohn (1973) J. Exp. Med. 179, 1109. Los estudios sobre las células dendríticas se vieron impedidos inicialmente por la dificultad de aislarlas en un número suficiente, pero este problema se solucionó en parte por la aceptación de que podía generarse un subconjunto de DC in vitro mediante el cultivo de células CD34+ o monocitos humanos con GM-CSF e IL-4. Estas DC cultivadas tienen el fenotipo de DC inmaduras y pueden madurar en células con una alta expresión de MHC y de CD80/86 mediante la incubación con TNF\alpha o LPS (Bender et al (1996) J. Immunol. Methods 196, 121; Romani et al (1996) J. Immunol. Methods (1996) 196, 137 ; Reddy et al (1997) Blood 90, 3 640).

Las DC también pueden proceder de un intermedio CD14+ en una fase posterior a la de unidad formadora de colonias en la sangre periférica. Las DC migran a sitios periféricos en la piel, mucosa, bazo y timo. Se han implicado en una variedad de procesos clínicamente importantes, incluyendo rechazo de aloinjertos, trastornos atópicos, autoinmunidad e inmunidad anti-tumoral.

Las DC pueden cultivarse ex vivo a partir de células madre CD34+ o monocitos CD14+ de sangre periférica utilizando citoquinas, principalmente GM-CSF, IL-4 y TNF\alpha Scabolsc et al (1995) J. Immunol. 154, 5651-5661. Las DC de estas dos fuentes son inmunocompetentes y pueden internalizar los antígenos presentados exógenamente, procesarlos y presentarlos a células T citotóxicas (Grabbe et al (1995) Immunology Today 16, 117-121; Girolomoni y Ricciardi-Cast-agnoli (1997) Immunology Today 18, 102-104). Las DC pueden transferir inmunidad tumoral específica de antígeno generada in vivo (Kwak et al (1995) Lancet 345, 1016-1020) y las DC autólogas pulsadas con antígeno tumoral ex vivo pueden inducir un efecto anti-tumoral mensurable (Hsu et al (1996) Nature Medicine 2, 52-58). Las DC pueden pulsarse eficazmente utilizando un lisado crudo de membrana tumoral, péptidos o fragmentos de péptidos purificados. La expansión ex vivo de células dendríticas autólogas de pacientes, carga con un antígeno peptídico y reinfusión como inmunoterapia adoptiva, se describe, por ejemplo, en WO/00/26249.

La importancia de la presentación de antígenos en la generación de la respuesta inmune se confirmó mediante la demostración de que el bloqueo de la presentación de antígenos regula a la baja las respuestas inmunes y es útil para tratar modelos animales de enfermedades. Así, se ha utilizado un anticuerpo frente a la clase II de MHC murina para tratar encefalomielitis alérgica experimental (Smith et al (1994) Immunology 83, 1) y el bloqueo de las moléculas coestimuladoras CD80/86 con anticuerpos o la proteína de fusión CTLa4-Ig es beneficioso en transplantes o modelos animales de artritis (Lu et al (1999) Gene Ther. 6, 554-563). Esto ha dado lugar a una investigación de nuevas vías para regular a la baja la presentación de antígenos que puede ser útil en enfermedades humanas o en transplantes.

Se ha especulado que NF-\kappaB está implicado en el sistema inmune. Esto se resume, por ejemplo, en el artículo de Baeueurle P.A. y Henkel T. (Annual Reviews in Immunology, 1994, Vol. 12, páginas 141-179). Sin embargo, nadie ha mostrado que NF-\kappaB sea crucial en la activación e inhibición del sistema inmune, ya que los efectos de activar o inactivar NF-\kappaB en células presentadoras de antígenos no eran susceptibles de ser estudiados previamente. Los inventores, por primera vez, han demostrado el papel clave de NF-\kappaB en la respuesta inmune.

La activación de proteínas semejantes al factor de transcripción NF-\kappaB resulta de la modificación posterior a la traducción lo que permite la translocación del factor de transcripción preformado desde el citoplasma al núcleo. Esta translocación está controlada por la fosforilación y degradación de una proteína inhibidora denominada I\kappaB, que forma un complejo con NF-\kappaB y de esta manera lo mantiene en el citoplasma. La estimulación de la célula mediante señales apropiadas da lugar a la modificación de I\kappaB que a su vez resulta en su disociación y/o la degradación de NF-\kappaB.

La unión de la proteína I\kappaB a NF-\kappaB enmascara la señal de localización nuclear (NLS) de NF-\kappaB. Después de la estimulación de la célula con agentes específicos, que dependen del tipo de célula y de la etapa de desarrollo celular, I\kappaB se modifica de manera que se impide la unión a NF-\kappaB, lo que da lugar a la disociación de NF-\kappaB de I\kappaB.

NF-\kappaB es una proteína heterodimérica que consiste en una subunidad de 50 kD (p50) y una subunidad de 65 kD (p65). Los ADNc de p50 y p65 se han clonado y se ha mostrado que son homólogos en una región de 300 aminoácidos.

Recientemente, se ha clonado un miembro adicional de la familia de NF-\kappaB, ReI B, como un gen de respuesta inmediata-temprana a partir de fibroblastos estimulados con suero.

Tanto p50 como p65 son capaces de formar homodímeros, aunque con propiedades diferentes: mientras los homodímeros de p50 tienen una fuerte afinidad de unión al ADN pero no pueden transactivar la transcripción, los homodímeros de p65 pueden unirse sólo débilmente al ADN pero son capaces de transactivación. P50 se sintetiza como la parte amino terminal del precursor de 100 kD (p110), que no tiene actividad de unión al ADN ni de dimerización. La parte carboxilo terminal contiene ocho repeticiones de anquirina, un resto encontrado en muchas proteínas implicadas en el control del ciclo celular y en la diferenciación.

Se han identificado cinco miembros de la familia I\kappaB: I\kappaB\alpha, I\kappaB\beta, p105/I\kappaB\gamma, p110/ I\kappaB\Delta e I\kappaB\varepsilon (Baeuerle y Baltimore, Cell 1996, Vol. 87, páginas 13-20). Todos los miembros de la familia semejantes a I\kappaB contienen múltiples repeticiones de anquirina, que son esenciales para la inhibición de la activación de NF-\kappaB.

Los inventores han encontrado que muchas de las características clave de la respuesta inflamatoria en los macrófagos humanos y en el sinovio reumatoide eran dependientes del factor de transcripción NF-\kappaB. Los inventores han estudiado el fármaco inhibidor del proteosoma, PSI, que se describió inicialmente como un inhibidor de la actividad semejante a quimiotripsina del proteosoma. Se encontró que la producción de muchos mediadores proinflamatorios, tales como TNF\alpha, IL-6, IL-2 era dependiente de NF-\kappaB (que se puede inhibir con AdvI\kappaB\alpha descrito en PCT/GB98/02753) mientras que no se afectaban las citoquinas y mediadores anti-inflamatorios, es decir, IL-10, antagonista del receptor de IL-1, IL-11. Esto nos sugirió que NF-\kappaB se segregaba precisamente entre estas dos clases de mediadores y, de esta manera, planteaba la cuestión, a la vista de la cercana relación entre los sistemas inflamatorio e inmune, del papel que NF-\kappaB podría desempeñar en la inducción de la inmunidad.

Los inventores investigaron, en primer lugar, el efecto del fármaco inhibidor del proteosoma, PSI, que no requiere la utilización de terapia génica. Se sabe que éste inhibe la degradación de I\kappaB y, por lo tanto, la activación de NF-\kappaB en la función inmunoestimuladora de las células dendríticas, que es el evento temprano clave en la generación de una respuesta inmune primaria.

Mostraron que el tratamiento con PSI de DC maduras procedentes de monocitos inhibía su capacidad de inducir la proliferación de células T en la respuesta mixta de linfocitos. Para elucidar el mecanismo de este efecto, se realizó análisis de superficie celular, ensayos de citoquinas y co-cultivos, que sugirieron que el bloqueo de NF-\kappaB permite que los mecanismos inmunosupresores se vuelvan operativos en la interacción entre las células dendríticas y las
células T.

Además, los inventores han demostrado que los cambios resultan en una respuesta anérgica. Es decir, que resultan en la incapacidad de producir una respuesta inmune, incluso después de la eliminación del compuesto inhibidor original.

Los inventores también han constatado que NF-\kappaB también puede utilizarse como una diana para inducir o modular una respuesta inmune. Esto es inesperado, ya que Feuillard et al (1996) Eur. J. Immunol. 26, 2547-2551; Granelli-Pipemo et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10948 han mostrado que NF-\kappaB ya está activado en DC y, por lo tanto, no se esperaría que una activación adicional fuera beneficiosa.

Un primer aspecto de la invención proporciona la utilización de (a) un inductor de NF-\kappaB o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un inductor de NF-\kappaB unido de manera operativa a elementos reguladores necesarios para la expresión de dicho ácido nucleico y (b) una molécula antigénica o polinucleótido que codifica una molécula antigénica para la fabricación de medicamentos para estimular la presentación de antígenos o estimular una respuesta inmune.

Una dosis eficaz farmacéuticamente significa una cantidad suficiente para inducir la respuesta deseada en un mamífero. Esta cantidad puede determinarse mediante ensayos clínicos y experimentales rutinarios conocidos en la técnica.

Por mamífero, entendemos cualquier mamífero pero especialmente un ser humano.

Como resulta claro a partir de los ejemplos de activadores de NF-\kappaB indicados en la presente memoria, se prefiere que el activador entre en la célula y actúe dentro de la célula, es decir, actúe como un activador de NF-\kappaB intracelular, por ejemplo, un modulador intracelular de los eventos de señalización intracelulares que dan lugar a la activación de NF-\kappaB.

"Unido de manera operativa" se refiere a la yuxtaposición de manera que pueda realizarse la función normal de los componentes. Así, una secuencia codificadora "unida de manera operativa" a elementos reguladores se refiere a una configuración en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica el inductor de NF-\kappaB puede expresarse bajo el control de las secuencias reguladoras.

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"Secuencias reguladoras" se refiere a secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de una secuencia codificadora unida de manera operativa en un organismo anfitrión particular. Por ejemplo, las secuencias reguladoras que son adecuadas para las células eucariotas son promotores, señales de poliadenilación y amplificadores.

"Vectores" significa una molécula de ADN que comprende un ADN de hebra única, hebra doble, circular o superenrollada. Los vectores adecuados incluyen retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, pox virus y plásmidos bacterianos. Los vectores retrovirales son retrovirus que se replican mediante la integración aleatoria de su genoma en el del anfitrión. Los vectores retrovirales adecuados se describen en WO 92/07573.

El adenovirus es un virus con ADN lineal de hebra doble. Los vectores adenovirales adecuados se describen en Rosenfeld et al, Science, 1991, Vol. 252, página 432.

Los virus adeno-asociados (AAV) pertenecen a la familia de los parvo virus y consisten en un ADN de hebra única de aproximadamente 4-6 KB.

Los vectores pox virus son virus grandes y tienen varios sitios en los que pueden insertarse genes. Son termoestables y pueden almacenarse a temperatura ambiente. Los estudios de seguridad indican que los vectores pox virus son defectuosos en la replicación y no pueden transmitirse de anfitrión a anfitrión o al medio ambiente.

Los vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un inductor de NF-\kappaB pueden introducirse en un mamífero en forma de liposomas de una manera conocida en la técnica. Alternativamente, pueden utilizarse liposomas en forma de aerosoles con el fin de acceder al cuerpo a través de la membrana mucosal o el pulmón. Dichas técnicas son conocidas en la técnica.

Los inmunoliposomas (liposomas dirigidos por anticuerpos) son especialmente útiles para dirigir a tipos celulares que sobreexpresan una proteína de superficie celular para la que hay anticuerpos disponibles, como resulta posible con células dendríticas o precursores, por ejemplo, utilizando anticuerpos frente a CD1, CD14 o CD83 (u otra molécula de superficie de células dendríticas o células precursoras, como se ha indicado anteriormente). Para la preparación de inmuno-liposomas, se sintetiza MPB-PE (N-[4-(p-maleimido-fenil)butiril]-fosfatidiletanolamina) según el método de Martin y Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257, 286-288. MPB-PE se incorpora en las bicapas del liposoma para permitir un acoplamiento covalente del anticuerpo, o fragmento de éste, a la superficie del liposoma. El liposoma se carga convenientemente con el ADN u otra construcción genética de la invención para administrar a las células diana, por ejemplo, formando dichos liposomas en una disolución del ADN u otra construcción genética, seguido de la extrusión secuencial a través de filtros de membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 0,6 \mum y 0,2\mum bajo presiones de nitrógeno de hasta 0,8 MPa. Después de la extrusión, la construcción de ADN atrapada se separa de la construcción de ADN libre mediante ultracentrifugación a 80.000 x g durante 45 min. Se mezclan MPB-PE-liposomas preparados en el momento en tampón desoxigenado con anticuerpo preparado en el momento (o fragmento de éste) y las reacciones de acoplamiento se llevan a cabo en una atmósfera de nitrógeno a 4^{0}C bajo una rotación constante toda la noche. Los inmunoliposomas se separan de los anticuerpos no conjugados mediante ultracentrifugación a 80.000 x g durante 45 min. Los inmunoliposomas pueden inyectarse, por ejemplo, intraperitonealmente o directamente en un sitio en el que están presentes las células diana, por ejemplo, subcutáneamente.

La invención proporciona la estimulación de la presentación de antígenos o la estimulación de una respuesta inmune en un mamífero, tal como un ser humano, mediante la administración de una cantidad eficaz farmacéuticamente de un inductor de NF-\kappaB (que es un inductor intracelular de la función APC, tal como DC).

Un "amplificador intracelular de la función APC" es un amplificador de la función celular de presentación de antígenos, tal como un amplificador de la función DC, y puede ser un amplificador de la señalización intracelular en la APC.

El término "función APC" incluye la capacidad de presentar antígenos, la capacidad de expresar MHC Clase II, la capacidad de expresar moléculas de superficie celular tales como moléculas coestimuladoras incluyendo CD80 y CD86, la capacidad de producir citoquinas y la capacidad de inducir anergia en lugar de activación. En "señalización intracelular en la APC" incluimos la comunicación entre la membrana y el núcleo, la señalización que controla la expresión génica (incluyendo la expresión de CD80 y CD86) y el control de la organización del citoesqueleto.

Para evitar cualquier duda, las citoquinas y las moléculas que contienen un resto CPG no son inductores o amplificadores intracelulares de la función APC ya que actúan extracelularmente.

Preferiblemente, los medicamentos de la invención se utilizan para tratar (incluyendo profilácticamente) enfermedades infecciosas o cánceres mediante la estimulación del sistema inmune del mamífero. Las enfermedades infecciosas incluyen enfermedades relacionadas con priones, incluyendo encefalopatías espongiformes. Los medicamentos pueden utilizarse para tratar (incluyendo profilácticamente) enfermedades o condiciones caracterizadas por tipos aberrantes y/o niveles aberrantemente altos de moléculas (perjudiciales), por ejemplo, polipéptidos, en el cuerpo, por ejemplo, niveles de mediadores inflamatorios (por ejemplo, citoquinas) asociados con inflamación crónica; productos de degradación o células o matriz de tejido conjuntivo, por ejemplo, fragmentos de fibronectina; polipéptido \beta-amiloide (asociado con la enfermedad de Alzheimer). La estimulación de una respuesta del sistema inmune frente a dichas moléculas puede ayudar a eliminar las moléculas del cuerpo, ayudando de esta manera a la resolución o prevención de la condición.

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Se prefiere que el antígeno del cáncer sea, o tenga al menos un epítopo presente en, cualquiera de las siguientes:

i) proteínas celulares normales que se expresan en niveles anormalmente altos en tumores; por ejemplo, ciclina D1 en varios tumores; ciclina E en cáncer de mama, mdm 2 en varios tumores; EGF-R, erb-B2, erb-B3, FGF-R, receptor del factor de crecimiento semejante a la insulina, Met, myc, p53 y BCL-2 se expresan en varios tumores.

ii) proteínas celulares normales que están mutadas en tumores; por ejemplo, mutaciones de Ras en varios tumores; mutaciones de p53 en varios tumores; translocación BCR/ABL en CML y ALL; mutaciones del receptor de CSF-1 en AML y MDS; mutaciones de APC en cáncer de colon; mutaciones de RET en MEN2A, 2B y FMTC; mutaciones de EGFR en gliomas; translocación PL/RARA en PML; translocación E2A-PBX1 en leucemias pre B y en leucemias agudas de la infancia.

iii) proteínas codificadas por virus en tumores asociados con infecciones virales; por ejemplo, proteínas del virus de papiloma humano en cáncer cervical; proteínas del virus de Epstein-Barr en los linfomas de células B y en el linfoma de Hodgkin; proteínas de HT-LV-1 en leucemia de células T de adultos; proteínas de los virus de la hepatitis B y C en carcinoma hepatocelular; proteínas del virus semejante al herpes en el sarcoma de Kaposi.

iv) proteínas codificadas por HIV en pacientes infectados con HIV.

Así, los antígenos asociados a cáncer anteriores pueden dividirse en tres categorías principales: (i) antígenos propios normales expresados en niveles altos en células tumorales; (ii) antígenos propios mutados expresados en células tumorales; (iii) antígenos virales expresados en tumores asociados con infecciones virales. Se prefiere la categoría (i).

En la categoría (i) se incluyen tres subtipos:

a) proteínas celulares normales que están sobreexpresadas;

b) proteínas que se expresan de manera específica de tejido en células normales pero también en tumores; y

c) proteínas que son antígenos embrionarios, silenciosos en la mayoría de los tejidos adultos pero que se expresan de manera aberrante en tumores.

Los ejemplos de b) y c) son:

b) antígenos de diferenciación específicos de tejido como dianas para CTL reactivos frente a tumores tales como GATA-1, IKAROS, SCL (expresado en el linaje hematopoyético y en leucemias); y regiones constantes de inmunoglobulinas (para el tratamiento de mieloma múltiple); y

c) antígeno 1 del tumor de Wilms (WT1) para el tratamiento de leucemias y del tumor de Wilms y antígenos carcinoembrionarios (CEA como proteína fetal) para tumores hepáticos e intestinales.

En una realización, el antígeno asociado a cáncer puede proporcionarse por el extracto crudo de una muestra de tumor.

La sobreexpresión de proteínas codificadas por oncogenes en tumores humanos y oncogenes mutados expresados en tumores humanos se describen en Stauss y Dahl (1995) Tumour Immunology, Dalgleish/Browning, Capítulo 7, incorporado en la presente memoria por referencia.

Así, se prefiere que el paciente que se va a tratar tenga cáncer; más preferiblemente uno cualquiera de cáncer de mama; cáncer de vejiga; cáncer de pulmón; cáncer de próstata; cáncer de tiroides; leucemias y linfomas tales como CML, ALL, AML, PML; cáncer de colon; glioma; seminoma; cáncer de hígado, cáncer pancreático; cáncer de vejiga; cáncer renal; cáncer cervical; cáncer testicular; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de ovario; neuroblastoma y melanoma.

CML es leucemia mielocítica crónica; ALL es leucemia linfoblástica aguda; AML es leucemia mielocítica aguda; y PML es leucemia pro-mielocítica.

Alternativamente, el paciente puede tener o presentar riesgo de tener cualquier enfermedad causada por un patógeno, particularmente una bacteria, levadura, virus, tripanosoma y semejantes. Se prefiere que la enfermedad esté causada por una infección crónica con un patógeno. También se prefiere que el patógeno sea uno que no se elimine fácilmente por el sistema inmune del anfitrión.

Se prefiere que la enfermedad sea una infección viral; más preferiblemente, una enfermedad causada por uno cualquiera de HIV, virus del papiloma, virus de Epstein-Barr, HTLV-1, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus del herpes o cualquier virus que cause una infección crónica. Se prefiere particularmente que el virus sea HIV.

En algunas enfermedades tales como determinados tipos de enfermedades tiroideas se producen cantidades anormalmente altas de una hormona producida por las células. Así, el método de la invención puede utilizarse para promover la eliminación de las células que producen cantidades elevadas de la hormona. El antígeno puede ser la hormona o enzimas biosintéticas implicadas en la síntesis de la hormona, que pueden sobreproducirse por la célula.

Los pacientes con una infección bacteriana, particularmente una infección que causa una infección crónica, también pueden tratarse de manera útil. La infección bacteriana puede ser una infección intracelular. Así, el método puede ser útil para tratar la tuberculosis.

Los inventores han constatado que el papel fundamental de NF-\kappaB permite su estimulación para producir un incremento en la respuesta inmune en el mamífero, por ejemplo, el ser humano.

El incremento de la respuesta inmune en pacientes que tienen una enfermedad infecciosa o cáncer o una condición caracterizada por tipos aberrantes y/o niveles aberrantemente altos de moléculas en el cuerpo puede ayudar en el tratamiento del paciente por el incremento de la respuesta inmune propia del cuerpo frente a la enfermedad infecciosa o cáncer o condición.

Los inductores preferidos de NF-\kappaB incluyen MEKKI, NIK, IKK1, IKK2, TRAF2, TRAF5, TRAF6, TAK, TPL-2 o Rel B u otras subunidades de NF-\kappaB, por ejemplo, p65 o cReI. También pueden utilizarse fragmentos o muteínas de dichos inductores capaces de inducir NF-\kappaB. Los inductores pueden estar codificados por vectores adecuados y ser introducidos en las células de un paciente que se va a tratar.

Un inductor preferido de NF-\kappaB puede ser un mutante dominante negativo de MyD88 (es decir, capaz de inhibir la señalización por moléculas de MyD88 salvajes, por ejemplo, en una célula en la que están presentes moléculas de MyD88 salvajes e inhibidoras). La inhibición puede producirse a partir del bloqueo de la interacción de MyD88 salvaje endógena con una pareja de unión de MyD88 endógena, por ejemplo, un Receptor Semejante a Toll (TLR). El mutante dominante negativo puede ser MyD881pr (Burns et al (1998) J Biol Chem 273(20), 12203-12209) o un fragmento de MyD88 que carece de un dominio de muerte (véase Burns et al (1998) y las referencias que se revisan en ese artículo). Se considera que MyD88 (proteína de diferenciación mieloide) tiene una organización modular que consiste en un dominio N-terminal de muerte (DD) separado por un conector corto de un dominio C-terminal Toll (revisado en Burns et al (1998)). El DD N-terminal está relacionado con un resto de aproximadamente 90 aminoácidos que se considera que media las interacciones proteína-proteína con otras secuencias DD formando bien homo o heterodímeros (Boldin et al (1995) J Biol Chem 270, 387-391).

La molécula de MyD88 inhibidora puede ser una molécula de MyD88 que es menos capaz que MyD88, preferiblemente sustancialmente incapaz, de unirse a un DD, por ejemplo, el DD de MyD88 o de IRAK. Por ejemplo, la MyD88 inhibidora puede ser menos capaz que MyD88, preferiblemente sustancialmente incapaz, de dimerizarse a través del DD. La molécula de MyD88 inhibidora puede ser una versión truncada de MyD88, por ejemplo, una molécula de MyD88 en la que está delecionado todo o parte del dominio denominado Dominio De Muerte. Puede ser una molécula de MyD88 mutada, por ejemplo, una molécula de MyD88 mutada en el DD, por ejemplo, con una mutación no conservativa. Por ejemplo, puede estar mutada en la posición equivalente a Phe56 de la MyD88 de ratón de longitud completa, por ejemplo, a Asn. Puede ser la molécula de MyD88 mutada denominada MyD881pr, como se ha indicado anteriormente, en la que los 53 aminoácidos N terminales de MyD88 también están ausentes Burns et al (1998) J. Biol. Chem. 273, 12203-12209. MyD881pr tiene una mutación puntual (F56N; numeración de la secuencia de ratón) cuando se compara con MyD88 de tipo salvaje, por ejemplo, MyD88 de ratón de tipo salvaje. Esta mutación puntual está en el DD y evita la dimerización del DD (Burns et al (1998)). La mutación corresponde a la mutación 1pr^{cp} que se sabe que suprime la señalización citotóxica de Fas, probablemente alterando la conformación del dominio DD (Nagata (1994) Semin Immunol 6, 3-8; Huang et al (1996) Nature 384, 638-641).

Las construcciones de MyD88 de tipo salvaje y MyD88 dominante negativo (MyD88-1pr) se han publicado (Burns K. et al J. Biol. Chem 1998) pero MyD88-1pr se describe de manera errónea como una mutación de un único aminoácido en su dominio de muerte, en la que Phe^{56} está mutada a Asn. Esta mutación corresponde a la mutación 1pr^{cp} presente en el dominio de muerte del ligando Fas que suprime su señalización consiguiente mediante la alteración de la conformación del dominio de muerte. Realmente, además de la mutación puntual, existe una deleción en su dominio N-terminal de 53 aminoácidos (están ausentes los pares de bases 1-159 de la secuencia genebank). Esta deleción resulta en la ausencia de parte del dominio de muerte.

Se prefiere que la MyD88 inhibidora comprenda un dominio Toll funcional, es decir, un dominio Toll que es capaz de interaccionar con un dominio Toll, por ejemplo, el dominio Toll de una MyD88 de tipo salvaje, por ejemplo, MyD88 humana o de ratón de tipo salvaje o una TLR. Se prefiere que la MyD88 inhibidora comprenda el dominio Toll de MyD88 de longitud completa. Un dominio Toll de longitud completa puede ser necesario para la interacción de los dominios Toll-Toll.

Los métodos para medir las interacciones proteína-proteína (y su amplificación o alteración) serán muy conocidos para los expertos en la técnica. Los métodos adecuados para medir las interacciones DD y Toll-Toll también se describen en Burns et al (1998). Los métodos adecuados pueden incluir, por ejemplo, interacciones de dos híbridos en levadura, co-purificación, ELISA, co-inmunoprecipitación, técnicas de transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET) y métodos de resonancia de plasmón superficial. Así, una molécula de MyD88 puede considerarse capaz de unirse a o interaccionar con un dominio DD o Toll si puede detectarse una interacción entre dicho polipéptido MyD88 y un polipéptido que comprende un dominio DD o Toll mediante métodos de ELISA, co-inmunoprecipitación o resonancia de plasmón superficial o mediante un método de interacción de dos híbridos en levadura o de co-purificación. El método preferido es resonancia de plasmón superficial.

El trabajo preliminar indica que MEKK1 puede inducir NF-\kappaB y amplificar la APC tal como la función DC. Se prefiere que el inductor sea capaz de inducir NF-\kappaB en las DC o precursores de éstas.

Así, la invención proporciona una molécula que comprende (1) una parte (parte moduladora) que comprende o codifica un inductor de NF-\kappaB, y (2) una parte que comprende o codifica una molécula antigénica (parte antigénica). En particular, la invención proporciona un polinucleótido que codifica un antígeno y un inductor de NF-\kappaB. Preferiblemente, la molécula es o comprende una vacuna de ADN que codifica un antígeno y un inductor de NF-\kappaB. La vacuna de ADN puede comprender un polinucleótido recombinante que comprende una parte que codifica un inductor de NF-\kappaB y una parte que codifica una molécula antigénica. Alternativamente, la molécula antigénica puede estar codificada por otra molécula de polinucleótido; esto es menos preferido.

Los amplificadores preferidos son MEKK y un mutante dominante negativo de MyD88, por ejemplo, MyD881pr.

Se apreciará que los amplificadores/inductores preferidos tal como se han descrito anteriormente pueden utilizarse en las vacunas de la invención.

La molécula antigénica puede comprender más de una copia de uno o más epítopos. Por ejemplo, puede comprender una única copia de una secuencia de aminoácidos que forma un único epítopo, por ejemplo, una secuencia de entre aproximadamente 8 y 30 aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 10 a 18 aminoácidos, aún más preferiblemente aproximadamente 15 aminoácidos de longitud. Puede comprender múltiples copias de dicha secuencia de formación de epítopo o una única o múltiples copias de al menos dos secuencias diferentes de formación de epítopos. Las secuencias antigénicas pueden concatenarse para formar una estructura semejante a un dominio o pueden disponerse en diferentes puntos en un polipéptido que actúa de vehículo. El polinucleótido puede codificar una o varias moléculas antigénicas diferentes, cada una de las cuales puede tener una o más partes antigénicas o epítopos.

Las vacunas de ADN que codifican un inductor de NF-\kappaB para utilizarse en la invención incluyen secuencias de ADN que incorporan un antígeno de interés procedente de un patógeno, por ejemplo, hepatitis A, B, C, etc, HIV, HTLV, influenza, tuberculosis, malaria o alternativamente un antígeno específico de un cáncer o moléculas aberrantes tales como \beta-amiloide, como se ha discutido anteriormente, o un prión. Además, dichas vacunas también incluyen un inductor de NF-\kappaB, posiblemente dos o más inductores de NF-\kappaB para un efecto máximo. Tanto el antígeno como el activador estarán bajo el control de secuencias promotoras adecuadas para regular la expresión del antígeno y de los activadores. El vector para utilizarse en la estimulación de una respuesta inmune comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un inductor de NF-\kappaB unida de manera operativa a elementos reguladores necesarios para expresar dicha secuencia. El vector puede comprender un promotor inducible para permitir la producción de una respuesta inmune incrementada mediante la activación incrementada de NF-\kappaB.

La utilización de vacunas de poliepítopos recombinantes para la administración de múltiples epítopos CTL CD8 se describe en Thomson et al (1996) J. Immunol. 157, 822-826 y en WO 96/03144. Respecto a la presente invención, puede ser deseable incluir en una única vacuna, un péptido (o un ácido nucleico que codifica un péptido) en la que el péptido incluye, en cualquier orden, una o más secuencias de aminoácidos antigénicas (por ejemplo, cada una de entre aproximadamente 8 y 18 aminoácidos de longitud), por ejemplo, procedentes de un antígeno asociado a tumores y un epítopo estimulador de células T CD4 (tal como del toxoide del tétanos). Dichas vacunas de "cuentas en un collar" son típicamente vacunas de ADN.

La molécula antigénica puede comprender un epítopo presente en células transformadas o cancerosas (es decir, un antígeno o epítopo asociado a tumores, por ejemplo, el antígeno MAGE-1 producido por una alta proporción de tumores de melanoma humanos (van der Bruggen et al (1991) Science 254, 1643)). Alternativamente, puede comprender un epítopo presente en un organismo patogénico, por ejemplo, un virus o en una célula (preferiblemente una célula humana) infectada por un organismo patogénico, por ejemplo, una célula infectada por un virus, como se ha indicado anteriormente.

El epítopo puede ser un epítopo de célula T, es decir, un epítopo que es capaz de inducir una respuesta de las células T (respuesta TH-1), preferiblemente una respuesta de células T citotóxicas CD8+ pero alternativamente una respuesta de células T colaboradoras CD4+ (respuesta TH-2) como es muy conocido para los expertos en la técnica. Una respuesta de células T citotóxicas puede ser indeseable en determinados casos, por ejemplo, cuando el antígeno es un antígeno micobacteriano (por ejemplo, antígeno de Mycobacterium tuberculosis o M. leprae).

El inductor o antígeno puede ser un compuesto peptidomimético, por ejemplo, un compuesto peptidomimético correspondiente a un polipéptido inductor discutido anteriormente.

El término "peptidomimético" se refiere a un compuesto que mimetiza la conformación y las características deseables de un péptido particular como un agente terapéutico, pero que no tiene características potencialmente indeseables. Por ejemplo, la morfina es un compuesto que puede administrarse oralmente y que es un peptidomimético del péptido endorfina.

Las aplicaciones terapéuticas que implican péptidos pueden ser limitadas debido a la falta de biodisponibilidad oral y a la degradación proteolítica. Típicamente, por ejemplo, los péptidos se degradan rápidamente in vivo por exo y endopeptidasas, lo que resulta en unas vidas medias biológicas generalmente muy cortas. Otra deficiencia de los péptidos como agentes terapéuticos potenciales es su falta de biodisponibilidad a través de la administración oral. La degradación de los péptidos por enzimas proteolíticas en el tracto gastrointestinal es probablemente un factor contribuyente importante. El problema es, sin embargo, más complicado porque se ha constatado que incluso los péptidos pequeños, cíclicos que no están sometidos a una inactivación metabólica rápida presentan, sin embargo, una disponibilidad oral baja. Esto es debido, probablemente, a un transporte pobre a través de la membrana intestinal y al aclaramiento rápido de la sangre por la extracción hepática y la excreción posterior en el intestino. Estas observaciones sugieren que múltiples enlaces amida pueden interferir con la biodisponibilidad oral. Se piensa que los enlaces peptídicos que unen los restos de aminoácidos en la cadena peptídica pueden degradarse cuando el fármaco peptídico se administra
oralmente.

Existen diferentes métodos para el diseño y la síntesis de peptidomiméticos. En un método, tal como el descrito por Sherman y Spatola, J. Am. Chem. Soc., 112: 433 (1990), uno o más enlaces amida se reemplazan de una manera esencialmente isotérica por varios grupos químicos funcionales. Este método por etapas ha sido exitoso ya que se han obtenido análogos activos. En algunos casos, se ha mostrado que estos análogos poseen vidas medias biológicas más largas que sus equivalentes naturales. Sin embargo, este método tiene limitaciones. El reemplazo exitoso de más de un enlace amida ha sido poco corriente. Consecuentemente, los análogos resultantes han permanecido susceptibles a la inactivación enzimática en otra parte de la molécula. Cuando se reemplaza el enlace peptídico se prefiere que el resto conector nuevo tenga sustancialmente la misma distribución de carga y sustancialmente la misma planaridad que un enlace peptídico.

Los peptidomiméticos retro-inversos, en los que los enlaces peptídicos están invertidos, pueden sintetizarse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en Mézière et al (1997) J. Immunol. 159: 3230-3237. Este método implica hacer pseudopéptidos que contienen cambios que afectan a la parte central y no a la orientación de las cadenas laterales. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteolisis.

En otro método, se han utilizado varios aminoácidos no codificados o modificados tales como D-aminoácidos y N-metil aminoácidos para modificar péptidos de mamíferos. Alternativamente, se ha estabilizado una conformación presumiblemente bioactiva mediante una modificación covalente, tal como ciclación o mediante la incorporación de \gamma-lactama u otros tipos de puentes. Véase, por ejemplo, Veber et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 2636 (1978) y Thursell et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 111: 166 (1983).

Un asunto habitual en muchas de las estrategias sintéticas ha sido la introducción de algún resto cíclico en una estructura basada en péptidos. El resto cíclico restringe el espacio conformacional de la estructura peptídica y esto resulta, frecuentemente, en una afinidad incrementada del péptido por un receptor biológico particular. Una ventaja añadida de esta estrategia es que la introducción de un resto cíclico en un péptido puede resultar también en que el péptido tenga una sensibilidad disminuida frente a las peptidasas celulares.

Un método para la síntesis de peptidomiméticos cíclicos estabilizados es metátesis con cierre de anillo (RCM). Este método implica etapas de síntesis de un precursor del péptido y ponerlo en contacto con un catalizador RCM para rendir un péptido restringido conformacionalmente. Los precursores del péptido adecuados pueden contener dos o más enlaces C-C insaturados. El método puede llevarse a cabo utilizando técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida. En esta realización, el precursor, que está anclado a un soporte sólido, se pone en contacto con un catalizador RCM y el producto se escinde del soporte sólido para rendir un péptido restringido conformacionalmente.

Los polipéptidos en los que uno o más restos de aminoácidos están modificados químicamente, antes o después de que el polipéptido se haya sintetizado, pueden utilizarse como antígeno siempre que la función del polipéptido, es decir, la producción de una respuesta inmune específica in vivo, permanezca sustancialmente inalterada. Dichas modificaciones incluyen la formación de sales con ácidos o bases, especialmente ácidos y bases orgánicos o inorgánicos aceptables fisiológicamente, la formación de un éster o amida de un grupo carboxilo terminal y la unión de grupos protectores de aminoácidos tales como N-t-butoxicarbonilo. Dichas modificaciones pueden proteger al polipéptido frente al metabolismo in vivo.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un kit de partes, composición o molécula quimérica, que comprende (1) una parte moduladora que comprende o codifica un inductor de NF-\kappaB y (2) una parte antigénica que comprende o codifica una molécula antigénica.

Una o las dos partes de estos aspectos de la invención puede comprender además una parte translocadora y/o una parte de unión a las células. La parte de unión a las células es capaz, preferiblemente, de unirse a una célula dendrítica o un precursor de ésta. La parte translocadora puede ayudar a la internalización de la molécula o al menos la parte antigénica y, preferiblemente, la parte de inhibición o amplificación de la señalización. Así, los péptidos aplicados exógenamente pueden unirse a un péptido HIV tat. Esto puede dirigirlos a la vía MHC Clase I para la presentación por CTL (véase, por ejemplo, Kim et al (1997) J. Immunol. 159, 1666-1668. Las moléculas quiméricas que pueden adaptarse según la presente invención se describen en WO 95/3148.

Las células dendríticas pueden caracterizarse mediante la expresión de las moléculas de la superficie celular CD80, CD86, CD40, CDIa, HLA-DR y/o CD83. Las células dendríticas inmaduras pueden ser CD34+ o CD14+. Así, la parte de unión a las células puede ser capaz de unirse a una o más de estas moléculas de la superficie celular (por ejemplo, un anticuerpo capaz de unirse a dicha molécula).

Las DC inmaduras muestran una captura y procesamiento del antígeno incrementados. Muestran unos niveles intracelulares altos de MHC Clase I y II; endocitosis y fagocitosis incrementadas; CCR1, CCR5 y CCR6 altos; CCR7 bajo; CD68 alto; CD40, CD54, CD80, CD83 y CD86 bajos; y no DC-LAMP.

Las DC maduras muestran un procesamiento del antígeno incrementado. Muestran unos niveles superficiales altos de MHC Clase I y II; endocitosis y fagocitosis bajas; CCR1, CCR5 y CCR6 bajos; CCR7 alto; CD68 bajo; CD40, CD54, CD80, CD83 y CD86 altos; DC-LAMP alto; y fascina p55 alto.

Dicha parte de unión a las células puede ser útil para dirigir a cualquier inductor de NF-\kappaB como se describe en la presente memoria, por ejemplo, ácido nucleico o vacuna de ADN, a una APC tal como una DC o DC inmadura.

Preferiblemente, el polinucleótido o vacuna de ADN es capaz de expresar el o los polipéptidos codificados en el paciente, aún más preferiblemente en una APC tal como una DC o una DC inmadura del paciente. El o los polipéptidos, por ejemplo inductor/activador de NF-\kappaB, o antígeno, según sea apropiado, pueden expresarse a partir de cualquier polinucleótido adecuado (construcción genética) como se describe en la presente memoria y administrarse al paciente. Típicamente, la construcción genética que expresa el polipéptido comprende dicha secuencia que codifica el polipéptido unida de manera operativa a un promotor que puede expresar la molécula del polinucleótido transcrito (por ejemplo, ARNin) en una célula del paciente, que puede traducirse para sintetizar dicho polipéptido. Los promotores adecuados serán conocidos para los expertos en la técnica y pueden incluir promotores para, por ejemplo, genes constitutivos expresados de manera ubicua o para genes específicos de tejido, dependiendo de donde se desea expresar dicho polipéptido (por ejemplo, en células dendríticas o precursores de éstas). Preferiblemente, se utiliza un promotor selectivo para las células dendríticas o los precursores dendríticos aunque esto no es esencial, particularmente si la administración o internalización del polinucleótido está dirigida a las células seleccionadas, es decir, células dendríticas o precursores.

Los promotores que pueden ser selectivos para células dendríticas pueden ser los promotores de los genes CD36 o CD83.

El direccionamiento de la vacuna hacia poblaciones celulares específicas, por ejemplo, células presentadoras de antígenos, puede conseguirse, por ejemplo, bien mediante el sitio de inyección, utilización de vectores de direccionamiento y sistemas de administración o purificación selectiva de dicha población celular a partir del paciente y administración ex vivo del péptido o ácido nucleico (por ejemplo, las células dendríticas pueden separarse como se describe en Zhou et al (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651). Además, los vectores de direccionamiento pueden comprender un promotor específico de tejido o tumor que dirige la expresión del antígeno en un sitio adecuado.

Como se ha indicado anteriormente, puede ser deseable utilizar un promotor inducible. Se apreciará que puede ser deseable tener la capacidad de regular temporalmente la expresión del o de los polipéptidos (por ejemplo, activador/inductor de NF-\kappaB) en la célula. Así, puede ser deseable que la expresión del o de los polipéptidos esté directamente o indirectamente (véase más adelante) bajo el control de un promotor que pueda regularse, por ejemplo, mediante la concentración de una molécula pequeña que puede administrarse al paciente cuando se desee activar o reprimir (dependiendo de si la molécula pequeña produce la activación o la represión de dicho promotor) la expresión del polipéptido. Se apreciará que esto puede tener un beneficio particular si la construcción de expresión es estable, es decir, capaz de expresar el polipéptido (en presencia de cualesquiera moléculas reguladoras necesarias) en dicha célula durante un periodo de al menos una semana, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho meses o más. Una construcción preferida de la invención, puede comprender un promotor regulable. Los ejemplos de promotores regulables incluyen los referidos en los artículos siguientes: Rivera et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15), 8657-62 (control por rapamicina, un fármaco biodisponible oralmente, utilizando dos vectores de adenovirus o virus adeno-asociados (AAV) diferentes, uno que codifica un gen diana inducible de la hormona de crecimiento humana (hGH) y el otro un factor de transcripción bipartido regulado por rapamicina); Magari et al (1997) J Clin Invest 100(11), 2865-72 (control por rapamicina); Bueler (1999) Biol Chem 380(6), 613-22 (revisión de vectores virales adeno-asociados); Bohl et al (1998) Blood 92(5), 1512-7 (control por doxiciclina en vector adeno-asociado); Abruzzese et al (1996) J Mol Med 74(7), 379-92 (revisa los factores de inducción, por ejemplo, hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, citostáticos, irradiación, choque por calor y elementos de respuesta asociados). También pueden utilizarse vectores inducibles con tetraciclina. Éstos se activan con un antibiótico relativamente no tóxico que se ha mostrado útil para regular la expresión en cultivos de células de mamífero. También pueden ser útiles los inductores basados en esteroides especialmente debido a que el complejo del receptor de esteroides entra en el núcleo donde el vector de ADN debe separarse antes de la transcripción.

Este sistema puede mejorarse más mediante la regulación de la expresión a dos niveles, por ejemplo, utilizando un promotor específico de tejido y un promotor controlado por un inductor/represor exógeno, por ejemplo, una molécula pequeña inductora, como se ha discutido anteriormente y conocida para los expertos en la técnica. Así, un nivel de regulación puede implicar la unión del gen apropiado que codifica el polipéptido a un promotor inducible mientras que un nivel más de regulación supone la utilización de un promotor específico de tejido para dirigir el gen que codifica el factor de transcripción inducible indispensable que controla la expresión del polipéptido (por ejemplo,
NF-\kappaB o gen que codifica el inductor/activador) desde el promotor inducible. El control puede mejorarse más mediante el direccionamiento específico a un tipo de célula de la construcción genética.

Las utilizaciones de las construcciones de la invención pueden evaluarse, por ejemplo, en APC tales como células dendríticas generadas in vitro, como es conocido para los expertos en la técnica, antes de evaluarlas en animales completos. Los métodos adecuados se describen en el Ejemplo 1.

Las construcciones genéticas de la invención pueden prepararse utilizando métodos muy conocidos en la técnica.

Las vacunas y vectores de la invención (moléculas terapéuticas de la invención) pueden formularse con vehículos, rellenos u otros aditivos adecuados aceptables farmacéuticamente. Pueden administrarse mediante cualquier medio adecuado tal como por vía intramuscular, intravenosa, oral, anal, intranasal, etc. Puede preferirse la administración subcutánea o intramuscular. Se apreciará que un inductor, por ejemplo, una molécula pequeña inductora como se ha discutido anteriormente, puede administrarse preferiblemente por vía oral.

Puede ser deseable perfundir localmente un área que comprende las células diana con el vehículo de administración adecuado que comprende la molécula terapéutica, por ejemplo la construcción genética, durante un periodo de tiempo; adicionalmente o alternativamente el vehículo de administración o molécula terapéutica puede inyectarse directamente en áreas accesibles que comprenden las células diana, por ejemplo, por vía subcutánea. Los métodos para administrar las construcciones genéticas, por ejemplo construcciones de vectores adenovirales, a las células de un paciente serán muy conocidos para los expertos en la técnica.

En particular, puede utilizarse un protocolo de terapia adoptiva o una pistola de genes para administrar la construcción a células dendríticas, por ejemplo, en la piel.

Se describe un método de terapia adoptiva que incluye las etapas de (1) obtener células presentadoras de antígenos o precursores de éstas, preferiblemente células dendríticas o precursores de éstas, de un paciente; (2) poner en contacto dichas células presentadoras de antígenos con un inductor/activador de NF-\kappaB como se describe en la presente memoria y antígeno frente al que se requiere una respuesta inmune o molécula quimérica o polinucleótido como se ha discutido anteriormente, ex vivo; y (3) reintroducir las células presentadoras de antígenos tratadas de esta manera en el paciente.

De manera adecuada, las células dendríticas son células dendríticas autólogas que se exponen a un activador de
NF-\kappaB y un antígeno. La terapia de células T utilizando células dendríticas autólogas expuestas a péptidos de un antígeno asociado a tumores se describe en Murphy et al (1996) The Prostate 29, 371-380 y Tjua et al (1997) The Prostate 32, 272-278.

Las células presentadoras de antígenos, tales como las células dendríticas, se ponen en contacto con un polinucleótido que codifica el activador/inductor de NF-\kappaB. El polinucleótido puede ser cualquier polinucleótido adecuado y se prefiere que sea capaz de transducir la célula dendrítica lo que resulta, por lo tanto, en la activación de la presentación de antígenos por la célula presentadora de antígenos.

Convenientemente, el polinucleótido puede estar comprendido en un polinucleótido viral o virus, como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, se ha mostrado que las células dendríticas transducidas con adenovirus inducen inmunidad antitumoral específica de antígeno respecto a MUC1 (véase Gong et al (1997) Gene Ther. 4, 1023-1028). De manera similar, pueden utilizarse sistemas basados en adenovirus (véase, por ejemplo, Wan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); pueden utilizarse sistemas retrovirales (Specht et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 y Szabolcs et al (1997) Blood 90, 2160-2167); también puede utilizarse transferencia mediada por partículas a células dendríticas (Tuting et al (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); y también puede utilizarse ARN (Ashley et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1177-1182).

Las APC, tales como las células dendríticas, pueden proceder del paciente (es decir, células dendríticas autólogas) o de un individuo o individuos sanos (MHC compatibles o incompatibles), tratadas in vitro como se ha indicado anteriormente, seguido de terapia adoptiva, es decir, introducción de las células dendríticas manipuladas de esta manera in vivo, lo que puede activar respuestas CTL. Por "individuo sano" queremos decir que el individuo tiene en general una buena salud, preferiblemente tiene un sistema inmune competente y, más preferiblemente, no padece ninguna enfermedad que pueda comprobarse y detectarse fácilmente.

Se prefiere administrar entre aproximadamente 10^{3} y 10^{11} DC al paciente; más preferiblemente entre 10^{6} y 10^{7} DC.

Las APC, tales como las DC, pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente. Se prefiere que las DC se administren por vía intravenosa. También se prefiere que las DC se administren localmente en el sitio de la enfermedad (tal como un tumor o infección viral o bacteriana local). La administración local se prefiere particularmente para el cáncer. Convenientemente, las DC se administran en una arteria que suministra al sitio de la enfermedad o al tejido donde está localizada la enfermedad.

Las células (o vacuna) pueden administrarse a un paciente que está siendo tratado para la enfermedad mediante otro método. Así, aunque el método de tratamiento descrito puede utilizarse solo es deseable utilizarlo como una terapia adyuvante.

Las APC, tales como las DC, o la vacuna pueden administrarse antes, durante o después de la otra terapia.

Cuando la enfermedad que se va a tratar es un cáncer, es preferible que el cáncer haya sido, esté siendo o vaya a ser tratado con una terapia o cirugía convencional así como con la invención. Convenientemente, dependiendo de la terapia, el cáncer se trata con radioterapia o quimioterapia.

Cuando la enfermedad que se va a tratar es una infección por un patógeno, es preferible que la infección haya sido, esté siendo o vaya a ser tratada con una terapia o cirugía convencional.

Si el paciente que se va a tratar tiene una infección por HIV, es preferible que la invención se utilice como un adyuvante a otro tratamiento, por ejemplo, tratamiento con un inhibidor de la transcriptasa inversa tal como AZT ó 3TC o terapia de combinación, por ejemplo, HART (terapia retroviral altamente activa).

Cuando la inmunoterapia adoptiva de la invención se utiliza para tratar un tumor sólido se prefiere que las APC tales como las DC o la vacuna se administren como el primer tratamiento después de la cirugía.

Cuando la inmunoterapia adoptiva de la invención se utiliza para tratar leucemia se prefiere que las APC tales como las DC o la vacuna se administren después de la radioterapia o quimioterapia. También se prefiere que los pacientes con leucemia se traten también con las DC en combinación con transplante de médula ósea.

La terapia oncológica, por ejemplo, la inmunoterapia adoptiva, puede ser más eficaz para controlar o eliminar la enfermedad residual mínima que para la reducción de la enfermedad global. Es concebible que la inmunoterapia pueda incrementar temporalmente las dimensiones de la enfermedad global debido al influjo de linfocitos T citotóxicos. La magnitud y volumen de la enfermedad pueden evaluarse después de la terapia pero no utilizarse como un punto final formal. Los pacientes se someten a un seguimiento de manera rutinaria a largo plazo para asegurar que no se manifiestan eventos adversos a largo plazo.

Las estrategias de administración o direccionamiento adicionales pueden incluir las siguientes. Puede utilizarse penetración balística de nanopartículas recubiertas de ADN/proteína impulsadas por aire comprimido (por ejemplo, utilizando un dispositivo de BioRad) de las células en cultivo o in vivo. Las construcciones que se van a administrar deberían tener preferiblemente promotores específicos de tipos celulares.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del recipiente pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agente espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en contenedores de dosis unitaria o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y viales sellados y pueden almacenarse en condición liofilizada que sólo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su utilización. Las disoluciones y suspensiones para inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo que es muy conocido para los expertos en la técnica. Los pulverizadores nasales pueden ser un formato útil.

La dosis de la construcción depende, por ejemplo, del tamaño de la construcción y del propósito para el que se administra. En general, el intervalo se calcula tomando como base el área superficial del tejido que se va a tratar. La dosis eficaz de la construcción puede depender del tamaño de la construcción y del vehículo de administración/método de direccionamiento utilizado y de la composición química del oligonucleótido aunque el experto en la técnica puede determinar una dosis adecuada utilizando, por ejemplo, datos del animal y sistemas de ensayo in vivo indicados anteriormente.

La construcción puede administrarse al paciente, por ejemplo, sistémicamente tanto para propósitos terapéuticos como profilácticos. La construcción puede administrarse, por ejemplo, mediante cualquier método eficaz, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, por vía parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular) o mediante medios orales, nasales u otros medios que permitan que la construcción, por ejemplo, acceda y circule en el torrente sanguíneo del paciente. Las construcciones administradas sistémicamente se administran preferiblemente además de la construcción administrada localmente aunque también son útiles en ausencia de la administración local.

Se piensa que la internalización del ácido nucleico y la expresión del polipéptido codificado por las células dendríticas puede ser el mecanismo para el cebado de la respuesta inmune; sin embargo, las células dendríticas pueden no estar transfectadas pero son aún así importantes ya que pueden tomar el péptido expresado de células transfectadas en el tejido.

Se prefiere que la vacuna, tal como una vacuna de ADN, se administre en el músculo. También se prefiere que la vacuna se administre sobre o en la piel.

Como se ha indicado anteriormente, la invención proporciona un kit de partes o composición o una molécula quimérica, que comprende (1) una parte moduladora que comprende o codifica un inductor de NF-\kappaB y (2) una parte antigénica que comprende o codifica una molécula antigénica.

Con relación a cualquier aspecto previo de la invención, particularmente una vacuna como se ha descrito previamente, o dicho kit, molécula quimérica o composición, la molécula antigénica comprende preferiblemente un epítopo presente en células transformadas o cancerosas o en un organismo patogénico o en una célula infectada por un organismo patogénico.

Así, la invención proporciona una vacuna eficaz contra el cáncer o células cancerosas o tumorales cancerosas o contra un organismo patogénico o célula infectada por un organismo patogénico, que comprende una cantidad eficaz de un inductor de NF-\kappaB como se ha descrito anteriormente o de un polinucleótido que codifica un inductor de NF-\kappaB y que comprende además un antígeno o un polinucleótido que codifica un antígeno, que tiene un epítopo presente en las células cancerosas o tumorales o el organismo patogénico o célula infectada por un organismo patogénico. La vacuna es preferiblemente una vacuna de ácido nucleico.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un inductor de NF-\kappaB, vacuna, molécula, polinucleótido, kit de partes, composición o molécula quimérica de cualquiera de los aspectos anteriores de la invención y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

La invención proporciona además una vacuna, molécula, polinucleótido, kit de partes, composición o molécula quimérica de cualquier aspecto anterior de la invención para utilizarse en medicina. La invención proporciona además la utilización de una vacuna, molécula, polinucleótido, kit de partes, composición o molécula quimérica de cualquiera de los aspectos anteriores de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que necesite la estimulación de la presentación de antígenos.

Resultará evidente que la invención proporciona medicamentos para matar células diana en un paciente, células diana que expresan de manera aberrante un primer epítopo, comprendiendo el método las etapas de poner en contacto ex vivo APC, tales como células dendríticas obtenidas de un paciente, con (1) un inductor de NF-\kappaB y (2)

dicho epítopo o con un polinucleótido o vector de expresión que codifica dicho epítopo.

Las células diana pueden ser células cancerosas.

Para evitar cualquier duda, siempre que se utilice el término "célula dendrítica" o "células dendríticas", el término incluye cualquier célula presentadora de antígenos adecuada a no ser que el contexto sugiera otra cosa. Se prefiere que la célula presentadora de antígenos sea una célula dendrítica.

A continuación se describirán las realizaciones preferidas de la invención.

Leyendas de las figuras

Figura 1

Viabilidad celular de DC tratadas con PSI. DC maduras se dejaron sin tratar o se trataron con varias dosis de PSI durante 4 h. Después de lavar, las células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado como se describe sin medio condicionado de monocitos. 6 días después del tratamiento, las células se resuspendieron en PBS que contenía 10 \mug/ml de yoduro de propidio PI y se analizaron en FACS scan.

Figura 2

Capacidad inmunoestimuladora de DC tratadas con el inhibidor de proteosoma Cbz-Ile-Glu(O-terc-bitil)-Ala-leucinal (PSI). DC maduras se trataron con PSI (0,1 \muM:\blacktriangle), (0,5 \muM:\sqbullet), (1 \muM:\bullet) o sin PSI (\bigcirc) durante 4 h. Después de lavar, se plaqueron diferentes números de cada categoría de DC y 10^{5} células de alo-linfocitos en una placa de 96 pocillos. La proliferación se determinó en el día 6 utilizando el ensayo de incorporación de ^{3}H-TdR. (Cada punto representa media +/- SEM de cinco experimentos diferentes).

Figura 3

El efecto de PSI en la expresión de los antígenos de superficie se estudió utilizando anticuerpos monoclonales, HLA-DR, CD86 (conjugado con PE); Pharmigen, San Diego, CA). En el día 6 después del tratamiento con PSI, se fenotiparon poblaciones de no tratadas (línea verde), tratadas con PSI (0,1 \muM) (línea azul punteada), tratadas con PSI (1 \muM) (línea roja punteada) con los MoAb listados anteriormente y se analizaron en FACScan (Becton Dickinson).

Figura 4

Falta de recuperación de la respuesta de proliferación en alo-MLR. DC maduras se trataron con vehículo (A) o PSI (1 \muM) (B) durante 4 h. Después de lavar, un número graduado de cada DC tratada y 10^{5} células de alo-linfocitos se plaquearon en una placa de 96 pocillos con vehículo (\bigcirc, \bullet), 2 ng/ml de IL-2 (\Box, \sqbullet) ó 10 g/ml de Ab anti CD28 (\triangle, \blacktriangle). La proliferación se determinó en el día 6 utilizando el ensayo de incorporación de ^{3}H-TdR. (Cada punto representa media +/- SEM de tres experimentos diferentes).

Figura 5

DC pretratadas con PSI inhiben la capacidad de crecimiento de linfocitos en alo-MLR. DC maduras se trataron con PSI como se ha descrito anteriormente. Después de lavar, cada DC se mezcló para hacer diferentes composiciones: sólo DC tratadas con vehículo (\bigcirc), 1/4 de DC tratadas con PSI mezcladas con 3/4 de DC tratadas con vehículo (\bullet), 1/8 de DC tratadas con PSI mezcladas con % de DC tratadas con vehículo (\sqbullet) o sólo DC tratadas con PSI (\blacktriangle). Se plaquearon números graduados de cada mezcla y 10^{5} células de alo-linfocitos en una placa de 96 pocillos. La proliferación se determinó en el día 6 utilizando el ensayo de incorporación de ^{3}H-TdR.

Figura 6

Respuesta alterada de alo-linfocitos precultivados con DC tratadas con PSI o no tratadas. Los linfocitos se co-cultivaron con 1/10 de DC tratadas con PSI (\bullet, \blacktriangle) o no tratadas (\bigcirc, \triangle). Después de 2 días, cada DC se eliminó en una placa recubierta con CD83, CD86. Los linfocitos se cultivaron durante 4 días más utilizando DC tratadas con vehículo (\bullet, \bigcirc) o DC tratadas con PSI (1 \muM) (\triangle,\blacktriangle). La proliferación se determinó mediante el ensayo de incorporación de ^{3}H-TdR. (Cada punto representa media +/- SEM de tres experimentos diferentes).

Figura 7

Expresión reducida de los antígenos de superficie en alo-linfocitos por DC pretratadas con PSI. Los linfocitos se cultivaron durante 6 días en las mismas condiciones que el experimento con alo-MLR utilizando DC tratadas con vehículo (línea verde) o DC tratadas con PSI (1 \muM) (línea roja). Cada linfocito se fenotipó con MoAb, CD3, CD25 (conjugados con PE; Pharmigen), (CD54) (conjugado con PE; Serotec), CD50 (conjugado con FITC; Serotec) y se analizaron con FACScan.

Figura 8

Producción de citoquinas en alo-linfocitos co-cultivados con DC tratadas con vehículo o tratadas con PSI. DC maduras se trataron con vehículo o PSI (1 \muM) como se ha descrito anteriormente. Los alo-linfocitos y cada DC se plaquearon a 2 x 10^{5} células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se estimularon con PMA (10 nM) o no se estimularon durante 49 hr. Los sobrenadantes se analizaron para IL-2, IL-4 e interferón-\gamma mediante ELISA.

Figura 9

Producción de citoquinas en DC tratadas con vehículo o PSI. DC maduras se trataron con vehículo o PSI (1 \muM) como se ha descrito anteriormente. Cada DC y alo-linfocitos se plaquearon a 2 x 10^{5} células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se estimularon con PMA (10 nM) o no se estimularon durante 48 hr. Los sobrenadantes se analizaron para IL-6, IL-8, IL-12 y TNF\alpha mediante ELISA.

Figura 10

La expresión de MEKK-1 incrementa mucho la presentación de antígenos de células dendríticas derivadas de monocitos en MLR alogénica. Brevemente, se generaron células dendríticas cultivando monocitos de sangre periférica con 50 ng/ml de GM-CSF y 10 mg/ml de IL-4. En el día 5, se infectaron durante 2 horas con un adenovirus sin inserto o que codifica MEKK-1 (m.o.i. 100:1) o no se infectaron. Después de 2 días, se cultivaron 10^{4} células dendríticas con 10^{5} células T alogénicas purificadas durante 5 días en placas de 96 pocillos de fondo plano, se expusieron toda la noche a 0,5 \muCi/pocillo y se recogieron al día siguiente. Las células dendríticas que codificaban MEKK-1 fueron 4 veces más potentes en la inducción de la proliferación de las células T que las DC no infectadas, mientras que esto no se cumplió en las células dendríticas infectadas con un adenovirus sin inserto.

Figura 11

La expresión del inhibidor dominante negativo de MyD88 (MyD881pr) en células dendríticas induce la activación de NF-\kappaB

Se generaron DC inmaduras a partir de monocitos de sangre periférica después de 5 días de cultivo con 50 ng/ml de GM-CSF y 10 ng/ml de IL-4. Después, no se infectaron o se infectaron en medio sin suero con un adenovirus control sin inserto (Ad0) y un adenovirus que codifica MyD88 dominante negativo (AdMyD88-Ipr). Se utilizó una mutiplicidad de infección de 100. Después de 6 h y 24 h de expresión, las células se lisaron y sus extractos nucleares se examinaron para detectar la actividad de unión a ADN de NF-\kappaB mediante EMSA. Sorprendentemente, la expresión de MyD881pr podía inducir por sí misma la activación de NF-\kappaB lo que contrasta completamente con lo que se ha encontrado anteriormente.

\newpage

Figura 12

La expresión de MyD88 dominante negativo (inhibidor) pero no del tipo salvaje induce la producción de TNF\alpha por sí misma y no inhibe la producción de TNF\alpha inducida por LPS en células dendríticas

Se generaron DC inmaduras a partir de monocitos de sangre periférica después de 5 días de cultivo con 50 ng/ml de GM-CSF y 10 ng/ml de IL-4. Después, no se infectaron o se infectaron en medio sin suero con un adenovirus control que codifica \beta-gal (Ad\beta-gal), un adenovirus que codifica MyD88 dominante negativo (AdI-pr) y un adenovirus que codifica MyD88 de tipo salvaje (AdMyD88wt). Se ha mostrado que Adtoll no es funcional y debe ignorarse. Se utilizó una multiplicidad de infección de 100. Después de 24 h, las células se estimularon con 100 ng/ml de LPS. Sorprendentemente, la expresión de MyD88 dominante negativo podía inducir la producción de TNF\alpha de la célula dendrítica por sí misma en ausencia de una estimulación adicional. Además, no podía inhibir la producción de TNF-\alpha inducida por LPS, un descubrimiento que contrasta con descubrimientos anteriores.

Figura 13

La expresión de MyD88 de tipo salvaje suprime la producción de TNF\alpha inducida por MyD88-Ipr (dominante negativo) en células dendríticas

Se generaron DC inmaduras a partir de monocitos de sangre periférica después de 5 días de cultivo con 50 ng/ml de GM-CSF y 10 ng/ml de IL-4. Después, no se infectaron o se infectaron en medio sin suero con un adenovirus control que codifica \beta-gal (Ad\beta-gal), un adenovirus que codifica MyD88 de tipo salvaje (AdMyD88wt) y un adenovirus que codifica MyD88 dominante negativo (AdMyD881pr). En algunos casos, se utilizó una infección doble con Adlpr y Ad\beta-gal o AdMyD88wt en proporciones 1:1 y 1:5. Se utilizó una multiplicidad de infección de 100 para las infecciones únicas. Después de 24 h, los sobrenadantes se recogieron y se analizaron. Sorprendentemente, la expresión de MyD88 dominante negativo podía inducir la producción de TNF-\alpha por las células dendríticas por sí misma, en ausencia de una estimulación adicional. Myd88 de tipo salvaje fue capaz de inhibir la producción de TNF inducida por Myd881pr.

Figura 14

La expresión de MyD88 dominante negativo en células dendríticas incrementa la proliferación de células T específicas de antígeno

Se generaron DC inmaduras a partir de monocitos de sangre periférica después de 5 días de cultivo con 50 ng/ml de GM-CSF y 10 ng/ml de IL-4. Después, no se infectaron o se infectaron en medio sin suero con un adenovirus control sin inserto (Ad0), un adenovirus que codifica proteína verde fluorescente como antígeno prototipo (AdGFP) y un adenovirus que codifica GFP unida a MyD88 dominante negativo (AdGFP-Ipr). Después de 48 h, se cultivaron dosis graduadas de células dendríticas con 2x10^{4} células T específicas de antígeno y se midió la proliferación en el día 3. La administración del antígeno GFP a las células dendríticas indujo la proliferación de células T específicas de antígeno que se incrementó por la expresión de MyD88 dominante negativo. Esto concuerda con nuestro resultado inesperado de que la inhibición de la actividad de MyD88 en las células dendríticas induce la activación de la célula dendrítica.

Figura 15

La expresión de MyD88 dominante negativo en células dendríticas incrementa la reacción mixta de linfocitos alogénica (MLR)

Se generaron DC inmaduras a partir de monocitos de sangre periférica después de 5 días de cultivo con 50 ng/ml de GM-CSF y 10 ng/ml de IL-4. Después, no se infectaron o se infectaron en medio sin suero con un adenovirus control sin inserto (Ad0) y un adenovirus que codifica la forma dominante negativa de MyD88 (AdIpr). Después de 48 h, se cultivaron dosis graduadas de células dendríticas con 1x10^{5} células T alogénicas y se midió la proliferación en el día 6. La expresión de MyD88 dominante negativo incrementa la proliferación de células T alogénicas, un descubrimiento que es indicativo de una presentación de antígenos incrementada en DC.

Figura 16

La expresión de MyD88 dominante negativo en células dendríticas incrementa la expresión de moléculas coestimuladoras (CD80, CD86)

Se generaron DC inmaduras a partir de monocitos de sangre periférica después de 5 días de cultivo con 50 ng/ml de GM-CSF y 10 ng/ml de IL-4. Después, no se infectaron o se infectaron en medio sin suero con un adenovirus control que codifica GFP y con un adenovirus que codifica MyD88 dominante negativo (AdIpr). Después de 48 h, las células dendríticas se recogieron y se tiñeron para CD80 y CD86, dos moléculas coestimuladoras muy importantes que se requieren para una función eficaz de presentación de antígenos. La expresión de la forma dominante negativa de MyD88 incrementó la expresión en superficie de CD80 y CD86, lo que es indicativo de una función de presentación de antígenos incrementada en la célula dendrítica.

Figura 17

La expresión de MyD88 dominante negativo en macrófagos induce la fosforilación de p38 MAPK

Se diferenciaron macrófagos humanos a partir de monocitos de sangre periférica mediante la adición de 100 ng/ml de M-CSF durante 2-3 días en 5% FCS RPMI. Después, no se infectaron, se infectaron en medio sin suero con un adenovirus control que codifica \beta-gal o se infectaron con un adenovirus que codifica MyD88 dominante negativo (AdIpr). Se utilizó una moi de 100 (ó 50 en un caso) como se muestra. Después de 6, 24 y 48 h, las células se lisaron y los extractos se ensayaron para detectar actividad p38 MAPK utilizando transferencia western y anticuerpos específicos fosfo-p38 MAPK. Inesperadamente, la expresión de MyD88 dominante negativo induce la actividad p38 MAPK en macrófagos humanos.

Figura 18

La expresión de MyD88 dominante negativo en macrófagos induce la fosforilación de IRAK

Se diferenciaron macrófagos humanos a partir de monocitos de sangre periférica mediante la adición de 100 ng/ml de M-CSF durante 2-3 días en 5% FCS RPMI. También se utilizaron células HELA cultivadas en 5% FCS DMEM. Ambos tipos celulares no se infectaron, se infectaron en medio sin suero con un adenovirus control que codifica \beta-gal, un adenovirus que codifica MyD88 de tipo salvaje o un adenovirus que codifica MyD88 dominante negativo (AdMyD881pr). Se utilizó una moi de 100. Después de 5 min ó 12 h, las células se lisaron y los extractos se ensayaron para detectar IRAK y fosfo-IRAK utilizando transferencia western. En las células HELA, se encontró que la expresión de MyD88 dominante negativo (MyD88-1pr) inhibía la activación de IRAK inducida por IL-1. Inesperadamente, sin embargo, la expresión de MyD88 dominante negativo induce la actividad IRAK en macrófagos humanos que no está incrementada por la adición de LPS. Este descubrimiento sugiere que la actividad de MyD88 también se requiere para una señal inhibidora en los macrófagos (pero no en las células HELA) que inhibe la fosforilación de IRAK y su bloqueo resulta en la activación de IRAK.

Figura 19

La expresión de MyD88 dominante negativo en macrófagos induce la fosforilación de I\kappaB\alpha

Se diferenciaron macrófagos humanos a partir de monocitos de sangre periférica mediante la adición de 100 ng/ml de M-CSF durante 2-3 días en 5% FCS RPMI. Las células se infectaron en medio sin suero con un adenovirus control que codifica \beta-gal o un adenovirus que codifica MyD88 dominante negativo (AdIpr). Se utilizó una moi de 100. Después de 24 h, las células se lisaron y los extractos se ensayaron para detectar fosfo-I\kappaB\alpha utilizando transferencia western. Inesperadamente, la expresión de MyD88 dominante negativo induce la fosforilación de I\kappaB\alpha en los macrófagos humanos.

Figura 20

La expresión de MyD88 dominante negativo pero no del tipo salvaje en macrófagos induce la producción de TNF\alpha, IL-6 e IL-8 en ausencia de ningún estímulo

Se diferenciaron macrófagos humanos a partir de monocitos de sangre periférica mediante la adición de 100 ng/ml de M-CSF durante 2-3 días en 5% FCS RPMI. Después, no se infectaron, se infectaron en medio sin suero con un adenovirus control que codifica \beta-gal, se infectaron con un adenovirus que codifica MyD88 de tipo salvaje o se infectaron con un adenovirus que codifica MyD88 dominante negativo (AdIpr). Se utilizó una moi de 100. (a) Después de 48 h, se recogieron los sobrenadantes y se ensayaron para detectar la producción de TNF\alpha, IL-6 e IL-8 en ausencia de ningún estímulo más. La producción de citoquinas podía detectarse en las células que codifican MyD88 dominante negativo pero no en las células que codifican MyD88 de tipo salvaje ni en las células control. Esto sugirió que el bloqueo de la actividad de MyD88 en los macrófagos, al igual que en las células dendríticas pero no HSF ni HUVEC, resulta en la activación de las células y en la liberación de citoquinas inflamatorias. (b) A las 0 h, 4 h, 24 h y 48 h de expresión, se recogieron los sobrenadantes y se ensayaron mediante ELISA para detectar TNF, IL-6 e IL-8. Sólo se muestran los resultados de las células que codifican MyD88 dominante negativo (MyD88-1pr) ya que las células control o las células que codifican MyD88 de tipo salvaje tenían niveles basales de producción de citoquinas.

Materiales y métodos 1. Reactivos

GM-CSF y TNF\alpha humanos recombinantes fueron donaciones del Dr. Glenn Larsen (GI) y del Dr D Tracey (BASF), respectivamente. IL-4 humana recombinante se obtuvo de R&D Systems (Minneapolis, EEUU). PMA, LPS y lonomicina se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St Louis, EEUU). El inhibidor de proteosoma Cbz-Ile-Glu(O-terc-butil-Ala-cerernal (PSI) se obtuvo de Calbiochem (Nottingham, Reino Unido). M-CSF se obtuvo del Genetics Institute (Boston, EEUU).

2. Preparación de células mononucleadas de sangre periférica

Las células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) se obtuvieron mediante centrifugación en densidad de restos de leucoféresis de voluntarios sanos (North London Blood Transfusion Service, Colindale, Reino Unido). Se diluyeron restos heparinizados 2X con HBSS y 25 ml se añadieron cuidadosamente formando una capa sobre volúmenes iguales de Ficoll-Hypaque lymphoprep (Nycomed, Oslo, Noruega) en tubos estériles de 50 ml antes de centrifugarlo durante 30 minutos a 2.000 rpm a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, la capa de la interfase se recogió y se lavó dos veces con HBSS (centrifugada durante 10 minutos a 2.000 rpm). Las PBMC se recogieron y se resuspendieron en 30 ml de RPMI que contenía 5% de FCS.

3. Aislamiento de células T y monocitos de sangre periférica y cultivo de células HeLa

Las células T y los monocitos de sangre periférica se obtuvieron a partir de PBMC después de la separación célula célula en un elutriador Beckman JE6. La elutriación se realizó en RPMI que contenía 1% de FCS (medio de elutriación). La pureza de los linfocitos y monocitos se evaluó mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales anti-humanos conjugados con fluorocromo frente a CD45, CD3, CD14, y CD19 (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido). Las fracciones de linfocitos T contenían típicamente ~80% de células que expresan CD3, ~6% de células que expresan CD19 y <1% de células que expresan CD14. Las fracciones de monocitos consistieron rutinariamente en >85% de células que expresan CD14, <0,5% de células que expresan CD19 y <3% de células que expresan CD3. Las células HeLa se mantuvieron en DMEM con 5% de FCS y 1% de penicilina/estreptomicina.

4. Diferenciación de monocitos con M-CSF para la infección adenoviral

Para optimizar la infección adenoviral, se cultivaron monocitos recién elutriados a 1x10^{6} células/ml en placas petri de 10 cm (Falcon, Reino Unido) con 100 ng/ml de M-CSF (Genetics Institute, Boston, EEUU). Después de 2-3 días se lavaron con PBS para eliminar las células no adherentes y el resto de monocitos adherentes se incubó con 10 ml de disolución de disociación celular (Sigma, Reino Unido) durante 1 h a 37^{0}C. La suspensión celular se lavó dos veces en RPMI que contenía 5% de FCS y la viabilidad celular (90%) se evaluó mediante exclusión de azul de tripán. El 99% de las células en esta etapa eran positivas para CD14 por tinción FACS y se cultivaron a 1x10^{6}/ml en placas de cultivo de fondo plano de 24 pocillos o de 48 pocillos (Falcon, Reino Unido) para experimentos adicionales.

5. Diferenciación de monocitos en células dendríticas

Se cultivaron monocitos recién elutriados a 1x10^{6} células/ml en placas petri de 10 cm (Falcon, Reino Unido) en RPMI con 5% de FCS suplementado con 50 ng/ml de GM-CSF y 10 ng/ml de IL-4 durante 5-6 días. En el día 3, se repusieron las citoquinas. Este método presenta varias ventajas comparado con la diferenciación de células dendríticas directamente a partir de precursores de la sangre o de la médula ósea. Además de ser sencillo y de proporcionar un alto número de células, genera una población de células homogénea con un fenotipo "DC inmaduro" estable. Este fenotipo puede dirigirse hacia la maduración mediante la adición a las DC de TNF\alpha (10 ng/ml), LPS (100 ng/ml) o medio condicionado de monocitos (50% v/v) durante 2-3 días adicionales.

6. Medio condicionado de monocitos

Se prepararon placas recubiertas con Ig (100 mm, Falcon) inmediatamente antes de su utilización mediante la adición de 5 ml de gamma-globulina humana (10 mg/ml, Sigma Chemical Co.) durante 10 min. Las placas se lavaron tres veces con medio RPMI 1640 (sin suero) antes de utilizarlas. Las placas recubiertas con Ig se recubrieron con monocitos elutriados (3x10^{7}) durante 1 hr en volúmenes de 7 ml. Las células no adherentes se eliminaron por lavado y las células adheridas a gamma-globulina se incubaron en medio RPMI 1640 completo fresco a 37^{0}C durante 24 hr.

7. Vectores adenovirales y su propagación

Los vectores adenovirales recombinantes deficientes en la replicación que codifican \beta-galactosidasa de E.coli (Ad\beta-gal) o que no tienen inserto (Ad0) fueron proporcionados por los Dres. A.Byrnes y M.Wood (Oxford University, Reino Unido). El adenovirus que expresa GFP (AdGFP) se generó por recombinación doble de AdTrack con el plásmido adenoviral AdEasy-1 proporcionado por el Prof. B. Vogelstein (The Howard Huges Medical Institute, Baltimore, MD). AdMyD88wt y AdMyD881pr se generaron a partir de plásmidos proporcionados por el Dr. Xu (University of Texas, Southwestern) y el Dr. K. Burns (Lausanne, Suiza). En particular, pAdTrack-CMV se utilizó para AdMEKK-Iwt, mientras que para AdMyD88wt y AdMyD881pr se utilizó un vector derivado de pAdTrack.CMV, denominado AdTrack.CMVKS 17. pAdTrack.CMVS 17 se construyó eliminando el sitio EcoRI de AdTrack.CMV así como su sitio de clonación múltiple (MCS) e insertando el sitio de clonación múltiple mayor del vector pBCSK(+) (Stratagene). Los virus recombinantes se generaron en células bacterianas BJ5183 transformadas por el método de choque de calor con 1\mug de las construcciones linearizadas pAdTrack.CMV-MEKK1wt, AdTrack.CMVKS17-MyD88wt o AdTrack.CMVKS17-MyD881pr y 100ng de vector adenoviral deficiente en la replicación pAdEasy-1. Los clones recombinantes positivos se seleccionaron mediante su resistencia a la kanamicina. Después de la selección, el ADN extraído se utilizó para la propagación del virus en las células humanas embrionarias de riñón 293. Los virus se purificaron mediante ultracentrifugación en dos gradientes de cloruro de cesio, como se describe en He et al. (He T.C. et al (1988). Science 281: 1509-12). Las titulaciones de las diluciones madre de los virus se determinaron mediante ensayo en placa, en células HEK 293, después de una exposición durante 1 hora en medio DMEM sin suero (Gibco BRL) y de recubrirlos posteriormente con una mezcla (1,5%) agarosa/(2xDMEM con 4% de FCS) (v/v1:1) e incubarlos durante 10-14 días. (He T.C. et al. (1998). Science 281: 1509-12).

9. Infección adenoviral de las células

Se recogieron macrófagos diferenciados con M-CSF y células dendríticas inmaduras o maduras, se contaron y se volvieron a plaquear. Después, se infectaron en RPMI sin suero con adenovirus deficientes en la replicación que sobreexpresan el gen de interés. Se utilizó una multiplicidad de infección de 100 para los macrófagos y las DC inmaduras y de 300 para las DC maduras. Después de 2 h, el virus se eliminó y las células se cultivaron en medio completo durante 1-2 días más para permitir la sobreexpresión de la proteína de interés. Después, se utilizaron en experimentos adicionales.

10. Establecimiento de líneas de células T específicas de antígeno

La proteína verde fluorescente se obtuvo de Clontech. Para establecer líneas de células T policlonales específicas de antígeno, se cultivaron 1x10^{6} PBMC/ml con el antígeno (1 \mug/ml para la proteína verde fluorescente ó 5 \mug/ml para el toxoide del tétanos) durante 7 días y después con IL-2 a 20 ng/ml durante 10-14 días más. Cada 4 días se reponía la IL-2. Esto resultó en la expansión de las células T específicas de antígeno y en la muerte celular de la mayoría de las demás poblaciones celulares presentes en PBMC. Después de 17-21 días de cultivo, se incluyó una etapa de reestimulación mediante el cultivo de las células T con PBMC autólogas irradiadas en una proporción 1:1 y antígeno fresco en ausencia de IL-2. Después de 4 días, se añadió IL-2 durante otros 10-14 días. El ciclo de reestimulación se repitió al menos 4 veces antes de utilizar las células T específicas de antígeno en experimentos adicionales.

11. Ensayos de proliferación de las células T específicas de antígeno

Para evaluar la especificidad de las líneas de células T específicas de antígeno, se cultivaron 1x10^{5} células T específicas de antígeno con 1x10^{5} PBMC autólogas irradiadas y varias concentraciones de antígeno en placas de microtitulación con fondo plano de 96 pocillos. Después de 3 días, las células se pulsaron con [^{3}H]Timidina toda la noche y se recogieron al día siguiente.

Para medir la proliferación de las células T específicas de antígeno inducida por las células dendríticas, se cultivaron 1x10^{5} células T específicas de antígeno con dosis graduadas de células dendríticas irradiadas o tratadas con mitomicina que no había sido pulsadas, que se habían pulsado con antígeno, sin infectar o infectadas con adenovirus. La incorporación de [^{3}H]Timidina se midió después de 2 días. Todos los ensayos de proliferación específicos de antígeno se realizaron en triplicado.

12. Reacción mixta de linfocitos (MLR)

Para ensayar la capacidad inmunoestimuladora de DC no irradiadas o irradiadas (3.000 rad de una fuente de ^{137}Cs), se cultivaron DC sin infectar, infectadas con adenovirus, tratadas con LPS o tratadas con medio condicionado de monocitos en dosis graduadas con 1x10^{5} células T alogénicas elutriadas en cuadriplicado en una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (Falcon). La proliferación se midió en el día 5 mediante la incorporación de timidina después de un pulso de 16 h con [^{3}H] timidina (0,5 \muCi/pocillo; Amersham Life Science, Reino Unido).

13. Análisis de citoquinas

Las células se pre-trataron con vehículo ó 1 \muM de PSI durante 4 h o se infectaron con vectores adenovirales durante 2 h. Las DC tratadas con PSI se utilizaron directamente en los experimentos, mientras que las células infectadas se cultivaron adicionalmente durante 2 días para permitir que se produzca la sobreexpresión de la proteína relevante. 24 h después de la estimulación de las células, se recogieron los sobrenadantes del cultivo y se almacenaron congelados. Los niveles de citoquinas en los sobrenadantes del cultivo celular se midieron mediante técnicas estándar de ELISA tipo sandwich con 2 ó 3 capas utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para TNF\alpha, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12 e IFN\gamma. Las parejas de anticuerpos y los estándares para estos ensayos se obtuvieron de Pharmigen, con la excepción de los reactivos IL-12 que fueron un obsequio del Genetics Institute (Boston, EEUU).

14. Tinción inmunofluorescente y citometría de flujo

Para la tinción FACS, primero se recogieron las células. Para las células adherentes cuando se necesitaba que los receptores de la superficie estuvieran intactos, se utilizó una disolución templada de 2% de EDTA en PBS durante 20 min a 37^{0}C. Después de que las células estuvieron en disolución, se lavaron una vez y se resuspendieron en tampón de lavado FACS helado. Todas las incubaciones posteriores se realizaron a 4^{0}C. Para cada análisis, se incubaron 5x10^{5} células con el anticuerpo específico de antígeno relevante o isotipo control durante 30 min y después se lavaron dos veces con tampón de lavado FACS. Las células se examinaron mediante citometría de flujo. Las células estaban listas para análisis en un citómetro de flujo FACScan (Becton and Dickinson) utilizando CellQuest (Becton Dickinson). Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente a HLA-DR, HLA-A,B,C, CD80, CD86, CD3, CD14 y CD25 se obtuvieron de Pharmigen, San Diego, EEUU).

15. Preparación de extractos proteicos citosólicos

Los extractos citosólicos se prepararon para investigar los eventos bioquímicos implicados en la transducción de señales por transferencia western. Las células adherentes se rasparon de la placa/matraz de cultivo tisular en PBS fresco y se recogieron mediante centrifugación (13.000 g durante 10 segundos a 4^{0}C). Las células no adherentes se sedimentaron de manera similar mediante centrifugación y se lavaron una vez con PBS fresco. Después de desechar los sobrenadantes, se añadió una cantidad apropiada de tampón de lisis hipotónico helado (Whiteside S.T. et al (1992). Nucleic Acids Res. 20: 1531-8), dependiendo del número de células que se quiere lisar (50-100 \mul por 1x10^{6} células). Después de incubar en hielo durante 10 minutos, los lisados se centrifugaron (13.000 g, 5 minutos, 4^{0}C) con el fin de eliminar los núcleos y los restos celulares. Los lisados aclarados se pasaron a tubos frescos, se congelaron y se almacenaron a -20^{0}C para la posterior estimación de la concentración de proteína y utilización en transferencia western.

16. Preparación de extractos proteicos nucleares

Los extractos proteicos nucleares se prepararon para estudiar la activación y translocación de NF-\kappaB desde el citosol al núcleo y su capacidad de unión al ADN. Después de lisar las células en tampón de lisis hipotónico (véase la sección), los núcleos se sedimentaron mediante centrifugación (13.000 g durante 5 minutos a 4^{0}C), se lavaron una vez con tampón de lisis hipotónico para eliminar las proteínas citosólicas contaminantes y se resuspendió en tampón de extracción hipertónico durante 1-2 horas a 4^{0}C con agitación. El tampón de lisis hipotónico impide la salida de las proteínas fuera del núcleo durante la lisis, mientras que el tampón de extracción hipertónico hace que la membrana nuclear sea porosa, lo que permite que las proteínas nucleares salgan a la disolución.

Después de centrifugar (13.000 g durante 10 minutos a 4^{0}C) los sobrenadantes que contienen las proteínas nucleares se pasaron a tubos frescos y se almacenaron a -70^{0}C. Este método de preparación de extractos nucleares se basa en el de Whiteside S.T. et al (1992). Nucleic Acids Res. 20: 1531-8.

17. Inmunoprecipitación

Para inmunoprecipitar IRAK, los extractos citosólicos se incubaron con 3 \mug de anticuerpo anti-IRAK durante 1 h a 4^{0}C con agitación suave. Después, se añadieron 50 \mul de 50% de proteína G sefarosa (Amersham) y se dejó otras 2 h con agitación. Posteriormente, se recogió el IRAK unido a la proteína G sefarosa, se lavó cuatro veces, se resuspendió en tampón de carga de Transferencia Western, se hirvió durante 5 min y después se utilizó inmediatamente para Transferencia Western.

18. Ensayo de concentración de proteínas

Antes de utilizar los extractos citosólicos o nucleares en cualquier procedimiento experimental adicional (por ejemplo, transferencia western, ensayos de cambio de la movilidad electroforética), fue necesario determinar su concentración de proteínas con el fin de asegurar que en cada muestra estaban presentes cantidades equivalentes de proteínas. Las concentraciones de proteínas se evaluaron mediante el ensayo de Bradford. Brevemente, se añadieron en triplicado 20 \mul de extractos diluidos apropiadamente a una placa de cultivo tisular de 96 pocillos junto con 20 \mul de una serie de concentraciones de BSA (Sigma, Reino Unido) en un intervalo de 10-1.000 \mug/ml utilizadas como estándar. Se añadieron 200 \mul de reactivo de Bradford a cada pocillo y se midió la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro (Multiscan Bichromatic, Labsystems). A partir de la curva lineal estándar formada por el intervalo de concentraciones de BSA se determinaron las cantidades de proteína en los extractos citosólico y nuclear.

19. Transferencia western y ensayo de cambio de la movilidad electroforética

Las proteínas citosólicas se separaron mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10% (p/v), seguido de electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa. I\kappaB\alpha e IRAK se detectaron utilizando anticuerpos obtenidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, EEUU) y Upstate Biotechnology (EEUU), respectivamente, mientras que las formas fosforiladas de I\kappaB\alpha, p38 y p42/44 MAPK se detectaron con anticuerpos de New England Biolabs.

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Resultados 1. PSI inhibe la función inmunoestimuladora de DC

PSI es un inhibidor de la actividad del proteosoma y como tal es capaz de inhibir la degradación y la posterior activación de NF-\kappaB inducida por I\kappaB\alpha. Utilizamos PSI para examinar la función de NF-\kappaB en la actividad de las células dendríticas (DC) particularmente con relación a la presentación de antígenos y a la activación de las células T. Hemos mostrado previamente que PSI es capaz de inhibir la activación de NF-\kappaB a concentraciones de hasta 1 \muM. Para ensayar el efecto de PSI en la viabilidad de las DC, se incubaron DC maduras con concentraciones de PSI en el intervalo 0,1 \muM a 5 \muM. Las concentraciones >5 \muM mostraron alguna toxicidad (Figura 1), según el método de tinción con yoduro de propidio (PI), por lo que los estudios funcionales sólo se realizaron en el intervalo 0,1 a 2 \muM, utilizando 1 \muM en la mayoría de los experimentos. Para evaluar el papel de NF-\kappaB en la función de las DC, se incubaron DC maduras con 0,3 \muM, 0,5 \muM ó 1 \muM de PSI durante 3 horas y las células se lavaron. Como PSI es un péptido activado que se une irreversiblemente a los proteosomas, la función de las DC puede evaluarse en el periodo de 6 días de la MLR a pesar del corto periodo de exposición al fármaco.

La exposición de células T a DC tratadas con PSI (PSI-DC) en un ensayo MLR alogénico tuvo un profundo efecto en la respuesta de los linfocitos que fue titulable con la concentración de PSI. Se encontró que mientras el pretratamiento de las DC con PSI a 0,1 \muM no tuvo un efecto detectable, 0,5 \muM y 1 \muM resultaron en un fracaso de las células T para proliferar en respuesta a la activación (Figura 2).

2. PSI reduce la expresión en la superficie de moléculas implicadas en la presentación de antígenos

Las células T en la MLR reconocen a los antígenos HLA clase II, de los que HLA-DR es el más abundante y, por lo tanto, su expresión se evaluó 6 días después del tratamiento con PSI. Se vio un efecto mínimo (por FACS) en DR a 0,1 \muM de PSI aunque se encontró una reducción importante a 1 \muM (Figura 3). CD86 es la molécula coestimuladora principal expresada en DC y su expresión también se redujo virtualmente hasta los niveles basales a 1 \muM de PSI (Figura 3).

3. La inhibición de MLR por células dendríticas tratadas con PSI no se revierte con IL-2 o anticuerpo anti CD28

Existen dos posibilidades generales respecto al mecanismo de la baja respuesta proliferativa de las células T a PSI-DC. Una es que estas DC no son estimuladoras y las células T no están respondiendo por esta razón. La segunda es que las células T han sido "desactivadas" activamente por procesos de tolerancia o regulación inmune activa. Para empezar a discriminar entre estas posibilidades, intentamos estimular las células T con IL-2 o anti CD28 a concentraciones (2 ng/ml de IL-2 ó 10 \mug/ml de anti CD28).

IL-2 o anti CD28 se añadió al mismo tiempo cuando se plaquearon las células T y las DC. La proliferación se evaluó en el día 6 y reveló que IL-2 tenía un efecto muy ligero en la restauración de la proliferación, sin embargo, esto fue independiente del número de DC y a pesar del tratamiento con PSI (Figura 4a).

El mismo grado de inmunoestimulación se vio con DC sin tratar (Figura 4b). Anti CD28 no tuvo un efecto restaurador, que se hubiera esperado a la vista de la regulación a la baja del ligando principal de CD28, CD86, por PSI (Figura 3). Estos resultados son consistentes con mecanismos múltiples y, por lo tanto, sugieren experimentos adicionales.

4. Inhibición de la MLR inducida por DC por DC pretratadas con PSI

Un medio para detectar si PSI-DC estaban generando efectos inhibidores es cultivar las células T con una mezcla de DC tratadas y no tratadas con PSI. Si las PSI-DC sólo fueran no estimuladoras, las DC tratadas con PSI deberían tener unos efectos mínimos en la respuesta proliferativa. Sin embargo, se encontró que la presencia de tan poco como 1/8 ó 1/4 de PSI-DC, resultó en una reducción de 3-5 veces de la respuesta, según la pendiente de las curvas de respuesta de la proliferación (Figura 5). A continuación, investigamos si la exposición a PSI-DC induciría una falta de respuesta a largo plazo en las células T. Las células T se expusieron a DC normales o a PSI-DC como se ha descrito previamente después de lo cual las células T se recogieron y se trataron con una DC por segunda vez y se midió la respuesta proliferativa (Figura 6). Las células T expuestas a DC normales en ambas ocasiones respondieron y, como era de esperar, las células T no respondieron a dos ciclos de PSI-DC. Sin embargo, las células T que se habían estimulado con PSI-DC antes de las DC normales tampoco fueron capaces de responder (Figura 6). Esto indicaría que los efectos de la exposición a PSI-DC son prolongados y las células T adquieren un estado de falta de respuesta o anérgico. Como se esperaba, las células T expuestas a PSI-DC en el segundo ciclo después de DC normales tampoco proliferaron.

5. Análisis de los antígenos de la superficie celular de linfocitos T expuestos a células dendríticas tratadas con PSI

Para investigar el mecanismo del efecto de DC tratadas con PSI, analizamos linfocitos T después de 6 días de cultivo. Según lo previsto, los rendimientos de células T fueron bajos. La expresión de CD3 en la superficie celular se redujo. Sin embargo, fue más dramática la marcada disminución de la expresión de CD25, que se suprimió virtualmente comparada con los controles (Figura 7).

Se analizó la expresión de moléculas implicadas en la adhesión de la superficie celular, tales como CD11a (LFA-1) y de uno de sus receptores ICAM-1 CD54. Ambas se redujeron en linfocitos tratados con PSI siendo el grado de reducción de CD54 similar al de CD3 mientras que la expresión de CD11a sólo se redujo ligeramente (Figura 7).

6. La exposición de células T a PSI-DC resulta en la producción de IL-4 pero no de IL-2 ni IFN\gamma

La producción de citoquinas es una de las respuestas clave de las células T a la estimulación por DC, expresándose IL-2, IFN\gamma e IL-4 (Figura 8). Por lo tanto, investigamos qué tipo de respuesta se produce con la exposición a PSI-DC. IL-2 y la citoquina clave de Th1, IFN\gamma, no se produjeron en respuesta a PSI-DC. Sin embargo, la producción de IL-4 no se vio afectada. Estos datos sugieren que PSI-DC son capaces de transmitir algunas señales a las células T. Esto apoyaría nuestra anterior observación de que PSI-DC inducen un tipo de estado de falta de respuesta en las células T que se piensa que requiere una señal activa.

7. La producción de TNF pero no de IL-8 por las DC se inhibe por PSI

También investigamos el efecto de PSI sobre las citoquinas producidas por las DC después de MLR. La expresión de TNF y, en menor medida, de IL-6 se inhibieron por PSI-DC durante la MLR. Por el contrario, la producción de IL-8 no se vio afectada (Figura 9). Al igual que con los resultados en las células T esto muestra la naturaleza discriminatoria del tratamiento con PSI e indica que NF-\kappaB tiene un papel en la expresión de TNF y de IL-6 pero no en la de IL-8.

8. La activación de DC con MEKK-1 resulta en una respuesta MLR incrementada

Debido a que la inhibición de NF-\kappaB inhibe la función de las DC, se investigó el efecto de la activación potencial de las DC utilizando MEKK estimulador de NF-\kappaB. Se utilizó MEKK1 activador codificado para infectar DC a una m.o.i. de 150:1. Cuando se utilizó en una MLR dichas MEKK1 DC fueron 4 veces más activas que las DC normales (Figura 10).

9. Myd881pr activa NF-\kappaB

Hemos encontrado que un potente inductor de NF-\kappaB es una muteína de Myd88 que contiene una deleción de los primeros 53 aminoácidos y una mutación puntual Phe56Asn denominada Myd881pr. Myd881pr inhibe normalmente la señalización del receptor semejante a Toll, por ejemplo, los receptores de IL-1 (1). Sin embargo, hemos observado que la introducción de Myd881pr, mediante vectores adenovirales, en DC inmaduras induce una potente activación de la actividad nuclear de NF-\kappaB que es detectable seis horas después de la infección con AdMyd88 y, más fuertemente, 24 horas después de la infección (Figura 11).

10. Myd881pr induce la producción de TNF por DC inmaduras

Al igual que con MEKK1, estábamos interesados en ver si Myd881pr también activaría la función de las DC. La infección de DC inmaduras con AdMyd881pr resultó en la producción espontánea de TNF por las células 24 horas después de la infección. Además, Myd881pr no tenía efecto inhibitorio sobre la producción de TNF inducida por LPS. Myd88wt no indujo la producción de TNF en las DC (Figura 12).

11. Myd881pr incrementa la presentación de antígenos por las DC

Debido a que la inhibición de NF-\kappaB inhibe la función de las DC, se investigó el efecto de activar potencialmente las DC utilizando el Myd881pr estimulador de NF-\kappaB. Se infectaron DC inmaduras con AdMyd881pr (que también expresa GFP), Ad0 o AdGFP (Proteína Verde Fluorescente). Después de 24 horas, se cultivaron varias concentraciones de DC infectadas con 2x10^{4} células T específicas del antígeno GFP y se midió la respuesta como proliferación de las células T en tres días. La administración de GFP a las células dendríticas indujo una proliferación de las células T específicas de antígeno que se incrementó por Myd881pr (Figura 14). Este resultado concuerda con la activación de NF-\kappaB y la producción de TNF por Myd881pr mostrada en las figuras anteriores (Figuras 11 y 12).

12. Myd881pr también incrementa la reacción mixta de linfocitos (MLR) alogénica inducida por las DC

Otro ensayo del efecto de la actividad de la función de NF-\kappaB en las DC fue investigar la respuesta MLR. Se infectaron DC inmaduras con Ad0 y AdMyd881pr y, después de 48 horas, se cultivaron dosis graduadas de las DC infectadas con 10^{5} células T alogénicas y se midieron las respuestas como proliferación después de seis días de cultivo. La infección con AdMyd881pr incrementó la respuesta MLR por encima de la de Ad0 o de las células no infectadas. Esto fue más notable con números bajos de DC en los que la respuesta de los controles fue sólo igual a las células T solas, donde la respuesta de las DC que expresan Myd881pr fue mayor (Figura 15).

13. La expresión de Myd881pr incrementa la expresión de las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86

La expresión de las moléculas de la superficie celular CD80 y CD86 es importante para la función de presentación de antígenos de las DC. En la figura 16, mostramos que la expresión de Myd881pr en las DC (por infección adenoviral) incrementó la expresión tanto de CD80 como de CD86, cuando se compara con DC no infectadas o células infectadas con virus control.

14. Myd881pr también activa otras moléculas de señalización además de NF-\kappaB

Hemos mostrado que Myd881pr es un inductor potente de NF-\kappaB. También observamos que esta molécula podría activar otras vías de señalización, esta vez en macrófagos, tales como p38 MAPK, una quinasa que se sabe que está implicada en mecanismos celulares tales como el control de la expresión de citoquinas (Figura 17). Además, en macrófagos, Myd881pr también activó IRAK1, un elemento clave de los mecanismos de señalización de TLR e IL-1R (Figura 18).

Referencias

1. Burns, K., F. Martinon, C., Esslinger, H., Pahl, P., Schneider, J.L., Bodmer, F., Di Marco, L., French y J. Tschopp. 1998. MyD88, an adapter protein involved in interleukin-1 signaling. J Biol Chem 273, no. 20:12203.

Discusión

Se ha mostrado que el tratamiento de DC con PSI, un inhibidor del proteosoma, a concentraciones capaces de bloquear la inducción de NF-\kappaB, reduce la respuesta proliferativa en la MLR. Esto sugiere que la función de NF-\kappaB está implicada en la estimulación de células T no cebadas en la MLR. Debido a que la especificidad de PSI es por el proteosoma, podría por lo tanto afectar potencialmente la función de otros factores de transcripción, aunque esto no se ha mostrado en las publicaciones originales que describen la acción de este fármaco (Traenckner et al (1994) EMBO J. 13, 5433-5441; Traenckner y Baeuerie (1995) J. Cell. Sci. Supl. 19, 79-84; y Haas et al (1998) J. Leukoc. Biol. 63, 395-404). Se necesitarán otros experimentos independientes para verificar el papel de NF-\kappaB utilizando otros métodos y hemos iniciado estudios utilizando la infección de las DC con un adenovirus que sobreexpresa I\kappaB\alpha bajo el control del promotor de CMV. Esta sobreexpresión de I\kappaB\alpha inhibe NF-\kappaB y también inhibe la función de presentación de antígenos de las células dendríticas (Yoshimura et al, datos no publicados) lo que es compatible con los datos presentados en la presente memoria.

El mecanismo de la inmunogenicidad reducida de las DC tratadas con PSI se evaluó a diferentes niveles y resultó que en las DC estaban regulados a la baja múltiples aspectos de la función de presentación de antígenos de la célula. En primer lugar, se estudiaron los efectos en la expresión de las moléculas de la superficie celular por las que las DC estimulan a las células T y se encontró una marcada reducción en la expresión de HLA-DR y CD86, siendo ambas moléculas importantes tanto para el reconocimiento del antígeno como para la activación de CD28. También se encontraron reducciones en las citoquinas derivadas de las DC tales como IL-12 y TNF\alpha, que se sabe que son importantes en la activación temprana de las células T. Por el contrario, no hubo cambios en la producción de otras citoquinas tales como IL-6 o IL-8 en cocultivos de células T/DC. Estos resultados indican que las DC tratadas con PSI tienen una expresión reducida de las tres clases principales de moléculas implicadas en la presentación de antígenos - la diana del reconocimiento de las células T (HLA-DR) las moléculas coestimuladoras (CD86) así como citoquinas inmunoestimuladoras (IL-12 y TNF\alpha).

Se plantearon cuestiones adicionales respecto al mecanismo de la falta de respuesta proliferativa de las células T. Podría deberse simplemente a una falta de inmunogenicidad de las DC o, alternativamente, podría deberse a la inducción de una forma de tolerancia inmunológica o de regulación inmune. El mecanismo se analizó adicionalmente mediante experimentos de cocultivo, añadiendo DC tratadas con PSI a DC sin tratar y analizando el efecto de la mezcla en células T no cebadas en la MLR. Se encontró que si tan sólo se añade 1/8 (12,5%) de DC tratadas con PSI a DC sin tratar hay una reducción significativa en la curva de dosis respuesta de la proliferación, equivalente a DC 3-5 veces menos activas. Este resultado, así como el hecho de que IL-2 y anti CD28 no estimularon estas células T (datos no mostrados), indica que hay un efecto inhibidor (inmunomodulador) de las DC tratadas con PSI en la función de las células T. Además, la exposición de células T a DC pretratadas con PSI indujo cambios importantes en la expresión de marcadores de la superficie de las células T, analizados en el día 6 del cocultivo: había una expresión reducida de CD3, CD25 virtualmente suprimida y alguna reducción en ICAM-1 y LFA-1. Se han publicado efectos similares en varios modelos de tolerancia Zanders et al (1983) Nature 303, 625-627; Zanders et al (1985) J. Immunol. 15, 302-305; Park et al (1997) Eur. J. Immunol. 15, 302-305; y Waldmann y Cubbold (1998) Ann. Rev. Immunol. 16, 619-644 y, por lo tanto, nos planteamos si las DC tratadas con PSI inducían tolerancia inmunológica. Esto se evaluó exponiendo en primer lugar células T alogénicas a DC tratadas con PSI durante 2 días y seleccionándolas después con CD83 y CD86. Las células T se expusieron durante 4 días a DC normales/o DC tratadas con PSI del mismo donante y su falta de respuesta es una evidencia de que al menos se había inducido una tolerancia inmunológica "de larga duración" (4-6 días). La definición formal de tolerancia incluye "especificidad de antígeno", que no podía ensayarse formalmente en esta clase de experimento, pero que se ha verificado posteriormente en una serie independiente de experimentos utilizando líneas de células T que responden a un antígeno soluble, el toxoide del tétanos (Calder et al., datos no publicados). Sin embargo, el término "tolerancia inmunológica" en este contexto es apropiado, ya que la reexposición se realizó con DC del mismo donante.

En otro conjunto de experimentos, se evaluó adicionalmente la función de las células T expuestas a DC tratadas con PSI. La producción de citoquinas por las células T estaba muy alterada. Así, la producción de IL-2 estaba inhibida más del 90%, al igual que la producción de IFN\gamma, siendo estos descubrimientos compatibles también con la inducción de tolerancia. IL-2 e IFN\gamma son citoquinas "Th1" y también fue interesante que la expresión de la citoquina "Th2", IL-4, no varió. Esto sugiere que la inducción del efecto inmunosupresor/tolerancia inducido por las DC tratadas con PSI puede estar restringido al subconjunto Th1. Se necesitan estudios adicionales con células T Th1 y Th2 purificadas para plantear este punto.

Los estudios mostrados en la presente memoria, y otros experimentos utilizando un adenovirus que sobreexpresa el inhibidor endógeno de NF\kappaB, I\kappaB\alpha, (Yoshimura et al., datos no publicados), indican que NF-\kappaB tiene un papel importante en la regulación de la presentación de antígenos. Esto concuerda con el descubrimiento previo de que NF-\kappaB es esencial para la maduración de las DC Rescizno et al (1998) J. Exp. Med. 188, 2175-2180. También es consistente con el concepto de que NF-\kappaB es el mecanismo principal mediante el que la inmunidad innata se transforma en inmunidad adaptativa. La denominada "señal de peligro", que activa el sistema inmune Matzinger (1994) Ann. Rev. Immunol. 12, 991-1045; Janeway et al (1996) Curr. Biol. 6, 519-522, activada a través de una amplia variedad de agentes microbianos o de otros agentes nocivos, parece que implica, por lo tanto, la activación de NF-\kappaB. Esto ya se ha establecido para LPS que requiere TLR4 para inducir la activación de NF-\kappaB Chow et al (1999) J. Biol. Chem. 274, 10689-10692.

En el contexto de la regulación de la presentación de antígenos es notable que los 3 aspectos, expresión de la diana para las células T (MHC), moléculas coestimuladoras (CD86) así como citoquinas inductoras (IL-2, TNF\alpha), están regulados de manera coordinada por NF-\kappaB. Esto da lugar a una predicción obvia de que los fármacos que bloquean NF-\kappaB (tal como PSI) pueden ser agentes inmunosupresores útiles in vivo, dependiendo claramente de su perfil de toxicidad. Probablemente, PSI es demasiado tóxico para una utilización sistémica aunque puede ser útil, sin embargo, para perfundir órganos diana, tales como riñones, para bloquear la función de APC antes de un transplante. Un corolario interesante de este trabajo es que la activación deliberada de NF-\kappaB puede proporcionar una buena estrategia para un efecto adyuvante útil para vacunas. Actualmente, se están realizando experimentos para ensayar esta hipótesis.

Actualmente, se están realizando experimentos adicionales para analizar más el mecanismo exacto por el que las DC tratadas con PSI afectan a la función de las células T:

1. El bloqueo de NF-\kappaB en las células presentadoras de antígenos inhibe la función de las células T, utilizando PSI u otros inhibidores del proteosoma, por ejemplo, u otros inhibidores de NF-\kappaB, por ejemplo, inhibidores del ADNc tales como I\kappaB, antisentido de NF-\kappaB constituyen fármacos inhibidores tales como

2. El bloqueo de NF-\kappaB en las DC induce tolerancia en las células T

3. La utilización de inhibidores de NF-\kappaB en) autoinmunidad

) transplante

) alergia

4. Corolario- si la inhibición de NF-\kappaB bloquea la presentación de antígenos y promueve la tolerancia, entonces la estimulación de NF-\kappaB regulará al alza la presentación de antígenos. Esto puede conseguirse de diferentes maneras posibles, activando vías que estimulan NF-\kappaB, con el fin de aumentar la vacunación. Éstas incluyen la utilización de adenovirus u otras transferencias de genes de MEKK1, NIK, IKK2, mutantes negativos dominantes de MyD88, TRAF2, TRAF6. Estas secuencias podrían incorporarse en la misma construcción genética que la que codifica el antígeno frente al que se desea la inmunización. La estimulación de NF-\kappaB también puede ser útil para modular la respuesta inmune en un paciente alérgico para alterar el equilibrio de la respuesta TH1:TH2 hacia una respuesta TH1.

Creemos que los resultados muestran que PSI produce un estado anérgico en las DC. Es decir, el fármaco induce un estado de falta de respuesta de las DC a largo plazo frente a los antígenos.

El corolario de las observaciones anteriores es que mediante la activación de una vía de señalización intracelular, tal como NF-\kappaB, en las DC, se activaría la célula y se incrementaría la función de presentación de antígenos. Hemos ensayado esto utilizando moléculas que activan la señalización intracelular de NF-\kappaB, MEKK1 y Myd881pr. Se ha descrito previamente que MEKK1 es un activador de NF-\kappaB entre otras vías y la introducción de MEKK1 en DC utilizando vectores adenovirales inducía la activación de la función de las DC determinada por MLR.

También hemos observado que una muteína de Myd88, Myd881pr, normalmente un inhibidor de la señalización de TLR y de los receptores de IL-1, también activaba NF-\kappaB en las DC. Cuando se expresó en las DC, Myd881pr incrementó la función de presentación de antígenos de las DC determinada por MLR o utilizando células T específicas de antígeno así como inducía la producción de citoquinas. Estos resultados abren la posibilidad de que cuando están asociadas con antígenos, las moléculas de señalización intracelular, tales como NF-\kappaB, pueden actuar como adyuvantes potentes. Esto podría proporcionar un nuevo método para el diseño de vacunas. El hecho de que Myd881pr también active p38 MAPK implicaría que otras moléculas de señalización que activan DC también podrían utilizarse para este propósito.

Claims (21)

1. Utilización de (a) un inductor de NF-\kappaB o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un inductor de NF-\kappaB unido de manera operativa a elementos reguladores necesarios para la expresión de dicho ácido nucleico y (b) una molécula antigénica o polinucleótido que codifica una molécula antigénica para la fabricación de medicamentos para estimular la presentación de antígenos o estimular una respuesta inmune.

2. Utilización según la reivindicación 1 para tratar una enfermedad infecciosa o un cáncer.

3. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el inductor se selecciona de MEKK1, NIK, IKK2, TRAF2, TRAF5, TRAF6, TAK, un mutante dominante negativo de Myd88, TP L-2, IRAK, receptores Toll y Rel B, y fragmentos o muteínas de éstos que son capaces de inducir NF-\kappaB.

4. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el vector es un adenovirus o lentivirus.

5. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el inductor está en la forma de una vacuna de ADN.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que el inductor está dirigido a células presentadoras de antígenos (APC) o precursores de éstas.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que dicho medicamento comprende APC o precursores de éstas que se exponen a dicho inductor in vitro.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en la que dichas APC son células dendríticas.

9. Un polinucleótido que codifica una molécula antigénica y un inductor de NF-\kappaB.

10. Un kit de partes, composición o molécula quimérica, que comprende (1) una parte moduladora que comprende o codifica un inductor de NF-\kappaB y (2) una parte antigénica que comprende o codifica una molécula antigénica.

11. La utilización, polinucleótido, kit de partes, composición o molécula quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molécula antigénica comprende un epítopo presente en células transformadas o cancerosas o en un organismo patogénico o en una célula infectada por un organismo patogénico o un polipéptido expresado en la enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía espongiforme.

12. Una vacuna adecuada para utilizarse frente a células cancerosas o tumorales o frente a un organismo patogénico o una célula infectada por un organismo patogénico o enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía espongiforme, comprendiendo dicha vacuna una cantidad eficaz de un inductor de NF-\kappaB o polinucleótido que codifica un inductor de NF-\kappaB, comprendiendo además un antígeno o polinucleótido que codifica un antígeno, que tiene un epítopo presente en las células cancerosas o tumorales o el organismo patogénico o célula infectada por el organismo patogénico o presente en un polipéptido asociado con la enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía espongiforme.

13. La vacuna de la reivindicación 12, en la que la vacuna es una vacuna de ácido nucleico.

14. Una composición farmacéutica que comprende una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, un polinucleótido, kit de partes, composición o molécula quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

15. Una vacuna, polinucleótido, kit de partes, composición o molécula quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 para utilizarse en medicina.

16. Un método para fabricar un medicamento adecuado para matar células diana en un paciente, moléculas diana que expresan de manera aberrante un epítopo, que comprende las etapas de poner en contacto, ex vivo, células presentadoras de antígeno (APC) obtenidas de un paciente con (1) un inductor de NF-\kappaB y; (2) dicho epítopo o un polinucleótido o vector de expresión que codifica dicho epítopo.

17. Un método según la reivindicación 16, en el que las células diana son células cancerosas.

18. Utilización de una vacuna, polinucleótido, kit de partes, composición o molécula quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que necesite la estimulación de una respuesta inmune y/o necesite tratamiento para una enfermedad infecciosa o cáncer o enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía espongiforme.

19. Utilización según la reivindicación 1 para tratar a un paciente que necesite la estimulación de la maduración y activación de APC.

20. Utilización de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la que el medicamento es adecuado para administrarse a un ser humano.

21. Un método según la reivindicación 16 o una utilización según la reivindicación 19 en la que dichas APC son células dendríticas.