ES2303336T3 - Cnp-gen del cerdo y proteina precursora. - Google Patents
Cnp-gen del cerdo y proteina precursora. Download PDFInfo
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Abstract
SE DESCRIBEN EL GEN Y CADN DE UN CNP DERIVADO DE PROCEINA (PEPTIDO NATRIURETICO DE TIPO C), Y UNA PROTEINA PRECURSORA DE CNP DERIVADA DE PROCEINA Y DERIVADOS DE LOS MISMOS. EL PRECURSOR DE CNP DERIVADO DE PROCEINA ESTA REPRESENTADO POR LA SIGUIENTE SECUENCIA DE AMINOACIDO: MET HIS LEU SER GIN LEU LEU ALA CYS ALA LEU LEU LEU THR LEU LEU SER LEU ARG PRO SER GLU ALA LYS PRO GLY ALA PRO PRO LYS VAL PRO ARG THR PRO PRO GLY GLU GLU VAL ALA GLU PRO GLN ALA ALA GLY GLY GLY GLN LYS LYS GLY ASP LYS THR PRO GLY GLY GLY GLY ALA ASN LEU LYS GLY ASP ARG SER ARG LEU LEU ARG ASP LEU ARG VAL ASP THR LYS SER ARG ALA ALA TRP ALA ARG LEU LEU HIS GLU HIS PRO ASN ALA ARG LYS TYR LYS GLY GLY ASN LYS LYS GLY LEU SER LYS GLY CYS PHE GLY LEU LYS LEU ASP ARG LLE GLY SER MET SER GLY LEU GLY CYS. ESTOS DERIVADOS SON NUEVOS Y TIENEN ACTIVIDADES NATRIURETICAS E HIPOTENSORAS.
Description
CNP-gen del cerdo y proteína
precursora.
Esta invención se relaciona con el gen y el ADNc
de un CNP derivado de cerdo (péptido natriurético de tipo C), así
como con una proteína precursora del CNP derivado de cerdo.
Recientemente, se han descubierto péptidos
asignables a dos familias peptídicas diferentes denominadas
"péptido natriurético atrial (ANP)" y "péptido natriurético
cerebral (BNP)" como hormonas o transmisores nerviosos que
regulan el equilibrio homeostático del volumen de fluidos corporales
y de la presión sanguínea in vivo. Se han desvelado también
las estructuras de esos péptidos y su mecanismo de biosíntesis, así
como sus acciones fisiológicas.
Muy recientemente, los presentes inventores
descubrieron en el cerebro porcino un nuevo péptido que fue
denominado "péptido natriurético de tipo C (CNP)" y que
pertenecía a una tercera familia de péptidos.
La primera pista hacia el descubrimiento del ANP
fue publicada por de Bold y col. en 1981. Al ver que se producía
una diuresis significativa cuando se inyectaba intravenosamente un
extracto bruto atrial de rata en otra rata, de Bold y col.
describieron la existencia de un factor promotor de la natriuresis
en el atrio (de Bold, A.J. y col., Life Sci., 28, 89, 1981).
Kangawa y col. aislaron posteriormente ese factor del atrio humano,
desvelaron su estructura y lo denominaron "péptido natriurético
atrial (ANP)" (Kangawa, K. y col., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 118, 131, 1984; Kangawa, K. y col., Nature, 313, 397, 1985;
Publicación de Patente Japonesa Nº 19520/1988; Descripción Pública
de Patente Japonesa Nº 184098/1985 y 260596/1985). Se ha visto que
el ANP humano (hANP) tal como se produce en el atrio se clasifica
en tres tipos, los tipos \alpha, \beta y \gamma, según su
peso molecular: el hANP de tipo \alpha
(\alpha-hANP) es un péptido de una sola cadena que
consiste en 28 aminoácidos que tienen un único enlace
S-S en la molécula; el hANP de tipo \beta
(\beta-hANP) es un dímero antiparalelo que tiene
un enlace S-S formado entre las moléculas de
\alpha-hANP, y el hANP de tipo \gamma
(\gamma-hANP) es una proteína de elevado peso
molecular compuesta por 126 aminoácidos, con el
\alpha-hANP contenido en la porción
C-terminal. Además, se ha aislado el ADNc para el
hANP y se han identificado las rutas de biosíntesis de \alpha-,
\beta- y \gamma-hANP en base al análisis de ese
ADNc, llegando a la conclusión de que cada uno de esos tres tipos
de hANP es biosintetizado a partir de una proteína precursora común
(Oikawa, S. y col., Nature, 309, 724, 1984).
Es ya sabido que, entre los tres tipos de hANP,
el \alpha-hANP es principalmente segregado a la
sangre.
Después de que se desvelara por vez primera la
estructura del hANP, se han estudiado también las estructuras de
ANP derivados de otros mamíferos (Descripciones Públicas de Patente
Japonesa Nº 184097/1985 y Nº 7298/1986) y hoy se dispone de los
siguientes conocimientos: los ANP tienen secuencias de aminoácidos
similares en un amplio espectro de mamíferos, desde roedores hasta
humanos; el ANP de tipo \alpha (\alpha-ANP)
tiene la misma secuencia de aminoácidos en mamíferos superiores,
incluidos los humanos, los perros y los cerdos, y los ANP de tipo
\alpha derivados de ratas y de conejos tienen enteramente la misma
secuencia de aminoácidos que el \alpha-hANP,
excepto por el hecho de que el residuo de metionina en posición 12
está substituido por un residuo de isoleucina (Oikawa, S. y col.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 132, 892, 1985; Forssmann, W.G. y
col., Anat. Embryol., 168, 307, 1983).
Se obtuvo el primer aislado de ANP del atrio,
pero estudios posteriores que implicaban la preparación de
anticuerpos anti-ANP y el examen de su distribución
in vivo han mostrado que el ANP se produce también en el
cerebro, así como en el atrio, excepto por el hecho de que, en el
cerebro, el extremo N del \alpha-ANP está cortado
para dar un \alpha-ANP [4-28] y
\alpha-ANP [5-28] más cortos
(Ueda, S. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 1055, 1987).
Dado que se ha descrito que en el hipotálamo y en el tegmentum
pontino del cerebro aparecen neuronas que contienen ANP
(Cantin, M. y col., Histochemistry, 80, 113, 1984; Saper, C.B. y
col., Science, 227, 1047, 1985), se especula actualmente que el ANP
puede también funcionar en el cerebro como transmisor nervioso que
participa en la regulación del sistema cardiovascular. Las acciones
fisiológicas del ANP son diversas, pero no se limitan solamente a
una marcada acción natriurética; recientemente se ha visto que es
capaz no sólo de reducir la presión sanguínea, sino también de
suprimir la producción de aldosterona por el córtex adrenal. Está,
por lo tanto, claro hoy en día que el ANP tal como es segregado por
el atrio a la sangre no sólo funciona como hormona que regula el
equilibrio homeostático del volumen de fluidos corporales y la
presión sanguínea, sino que en el cerebro funciona también como
transmisor nervioso para que el sistema nervioso regule el
equilibrio homeostático del volumen de fluidos corporales y la
presión
sanguínea.
sanguínea.
El péptido natriurético cerebral (BNP) fue
primeramente aislado del cerebro porcino e identificado por Sudoh y
col. en 1988 (Sudoh, T. y col., Nature, 332, 78, 1988). El primer
aislado de BNP (pBNP-26) es un péptido que consiste
en 26 residuos de aminoácido que tienen un único enlace
S-S en la molécula y, aunque es similar al ANP en
su estructura, es decir, en términos de la secuencia primaria de
aminoácidos y del modo de unión S-S (que produce
una estructura de anillo compuesta por 17 residuos de aminoácido),
el BNP es claramente distinguible del ANP. Como en el caso del ANP,
se han verificado las acciones natriuréticas e hipotensoras para el
BNP, que ha sido, por lo tanto, denominado "péptido natriurético
cerebral (BNP)". En un tiempo posterior, se aisló
pBNP-32, compuesto por 32 residuos de aminoácido,
con 6 aminoácidos unidos al extremo N del pBNP-26, a
partir del cerebro porcino (Sudoh, T. y col., Biochem. Byophys.
Res. Commun., 155, 726, 1988); a partir del atrio porcino, se aisló
también y se identificó un péptido denominado
"\gamma-BNP" compuesto por 106 aminoácidos
(Minamino, N. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 402,
1988).
Hasta la fecha, se han aislado los ADNc de los
BNP humano y de rata y también han quedado claras las estructuras
de los precursores de esos BNP (Sudoh, T. y col., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 159, 1427, 1989; Kojima, M. y col., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 159, 1420, 1989).
En base a estos resultados, se ha visto que los
péptidos de la familia BNP son biosintetizados a partir de
precursores enteramente diferentes del ANP.
Como ya se ha mencionado, el BNP fue
primeramente aislado del cerebro. Se vio posteriormente que el BNP
estaba presente en el cerebro porcino en una cantidad diez veces
mayor que el ANP y que, al igual que el ANP, el BNP aparecía
también en el atrio (aunque en una cantidad de sólo un
2-3% del ANP) para ser segregado a la sangre
(Minamino, N. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 155, 740,
1988; Aburaya, M. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 165, 872,
1989). A partir de estos hechos, se vio que, al igual que el ANP, el
BNP funcionaba como transmisor nervioso en el cerebro y también
funcionaba como hormona para ser segregada del atrio a la sangre,
en cualquiera de los casos ayudando a regular el equilibrio
homeostático del volumen de fluidos corporales y de la presión
sanguínea. Como queda ejemplificado por los péptidos natriuréticos,
no un solo péptido, sino una pluralidad de péptidos, pueden
participar en la regulación de una determinada acción fisiológica
in vivo (por ejemplo, la homeostasis del volumen de fluidos
corporales y de la presión sanguínea) y el péptido opioide, la
taquikinina y la endotelina han sido hasta ahora reconocidos como
otros ejemplos de dichos péptidos. Es sabido que existen tres
familias diferentes para cada uno de esos péptidos (Hollt, V.,
Trend Neuro. Sci., 6, 24, 1983; Nakanishi, S., Physiol. Review, 67,
1117, 1987; Inoue, A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86,
2863, 1989). Esto había aumentado la posibilidad de que, aparte de
los péptidos natriuréticos, que hasta la fecha se sabe que son
asignables a las familias ANP y BNP, podrían existir péptidos que
pudieran ser clasificados en una tercera familia. En este sentido,
los presentes inventores consiguieron recientemente descubrir dos
nuevos péptidos del cerebro porcino que no pertenecían a la familia
del ANP o del BNP, sino que pertenecían a una tercera familia de
péptidos natriuréticos. Esos péptidos fueron denominados "péptido
natriurético de tipo C (CNP)". Sudoh T. y col. han identificado
el péptido natriurético de tipo C (CNP), que es un nuevo miembro de
la familia de péptidos natriuréticos. El péptido allí descrito fue
obtenido de extractos de cerebro porcino. El primer CNP descubierto
era un péptido compuesto por 22 residuos de aminoácido (este
péptido es aquí en adelante abreviado como
"CNP-22"); la estructura de este péptido es
similar a, pero claramente distinguible de, las del ANP y BNP.
Dicho más específicamente, el CNP-22 es similar al
ANP y al BNP en el sentido de que tiene una estructura de anillo
compuesta por 17 residuos de aminoácido basada en la unión
intramolecular S-S y de que la secuencia primaria de
aminoácidos que forma esta estructura de anillo en el
CNP-22 es altamente homóloga a la del
\alpha-ANP y a la del BNP-32. De
hecho, 12 de los 17 residuos de aminoácido eran idénticos entre
esos tres péptidos.
Sin embargo, excepto para la porción estructural
del anillo, el CNP-22 es enteramente diferente del
\alpha-ANP y del BNP-32 en las
porciones N- y C-terminales. Se ve un rasgo
particularmente característico en la estructura de la porción
C-terminal; en el caso del
\alpha-ANP, están presentes 5 residuos de
aminoácido (en el caso del BNP-32, 6 residuos de
aminoácido) en el extremo C del residuo de cisteína que forma la
estructura del anillo, produciendo así una estructura de
"cola", pero no está presente ninguna estructura de "cola"
de este tipo en el CNP-22, ya que su extremo C es
un residuo de cisteína.
Tal como se ha descrito anteriormente, el
CNP-22 tiene una estructura obviamente diferente de
la de \alpha-ANP y BNP-32;
además, se ha verificado que, cuando se administra a ratas, el
CNP-22 exhibe acciones natriurética e hipotensora
obvias y se ha visto, por lo tanto, que el CNP-22 es
un nuevo péptido asignable a una tercera familia de péptidos
natriuréticos in vivo (Solicitud de Patente Japonesa Nº
105047/1990). Los presentes inventores prepararon posteriormente
anticuerpos anti-CNP-22 y
purificaron, a partir de cerebro porcino, aquellos péptidos que
exhibían inmunorreactividad con esos anticuerpos. Como resultado,
los presentes inventores consiguieron aislar un péptido denominado
"CNP-53". Un análisis de su estructura mostró
que el CNP-53 era un péptido compuesto por 53
residuos de aminoácido que contenía CNP-22 en el
extremo C, es decir, un péptido que tenía 31 residuos de aminoácido
adicionales unidos al extremo N del CNP-22 (véase la
solicitud de patente comúnmente asignada adjuntada como anexo y
depositada en la misma fecha que la solicitud en cuestión).
Resumiendo, se han obtenido hasta la fecha las
siguientes observaciones: al menos existen en mamíferos tres
familias (familia del ANP, familia del BNP y familia del CNP) de
péptidos natriuréticos que tienen estructuras obviamente
diferentes; los péptidos de las familias del ANP y del BNP no sólo
son segregados del atrio a la sangre y funcionan como hormonas que
regulan el equilibrio homeostático del volumen de fluidos corporales
y de la presión sanguínea, sino que también son biosintetizados en
el cerebro, donde funcionan como transmisores nerviosos para que el
sistema nervioso regule el equilibrio homeostático del volumen de
fluidos corporales y de la presión sanguínea. Sin embargo, los
recientemente descubiertos péptidos de la familia del CNP
(CNP-22 y CNP-53) se producen en
cantidades tan pequeñas en el cerebro en comparación con el ANP y el
BNP, que hasta la fecha no se ha obtenido ninguna información
detallada con respecto al mecanismo de biosíntesis del CNP, a su
distribución in vivo y a sus acciones fisiológicas.
La presente invención ha sido realizada en estas
circunstancias y tiene como objeto aislar y analizar los genes y
los ADNc del CNP-22. Esto puede conducir a los
precursores para identificar la secuencia primaria de aminoácidos
de la proteína precursora del CNP porcino, y puede proporcionar
también un procedimiento para producir mediante ingeniería genética
toda o parte de la proteína codificada por el gen de dicha proteína
precursora.
La Fig. 1 es un diagrama en el cual se muestran
las secuencias de bases de los cebadores de ADN sintético (KF 225 y
KF 226) utilizados para amplificar específicamente la región génica
codificante de CNP-53 a partir de un gen
cromosómico porcino utilizando PCR y la sonda mixta de ADN (KF 206)
utilizada para aislar el gen, junto con la secuencia primaria de
aminoácidos de CNP-53.
La Fig. 2(a) es un mapa de enzimas de
restricción para el gen cromosómico (fragmento de ADN BamHI) de una
proteína precursora de CNP porcino.
La Fig. 2(b) es un diagrama que muestra
la estrategia de determinación de la secuencia de bases de ADN del
gen.
La Fig. 2(c) es un diagrama que muestra
la secuencia de bases del cebador de ADN sintético utilizado en la
determinación de la secuencia de bases.
La Fig. 3 es un diagrama que muestra la
secuencia de bases de ADN del gen cromosómico (fragmento de ADN
BamHI) codificante de la proteína precursora del CNP porcino y la
secuencia primaria de aminoácidos de la proteína precursora del CNP
porcino codificada por los exones en la región génica
estructural.
La Fig. 4 ilustra cómo preparar el vector de
expresión en células animales pSV2CNP.
La Fig. 5 es un diagrama que muestra toda la
secuencia de bases del ADNc CNP y la secuencia primaria de
aminoácidos de la proteína precursora del CNP porcino codificada
por el ADNc.
La Fig. 6 es un gráfico que muestra el perfil de
elución obtenido separando en una columna de filtración por gel
sephadex G-75 las proteínas y los péptidos
contenidos en el sobrenadante del cultivo de células
COS-1/pSV2CNP, así como la inmunorreactividad de
las fracciones de elución resultantes con un antisuero
anti-CNP-22.
El CNP-22 y el
CNP-53 previamente aislados por los presentes
inventores existían en el cerebro porcino en cantidades
extremadamente más pequeñas que el ANP y el BNP. Además, el tejido
responsable de la producción de esos péptidos en el cerebro
permanece aún por identificar. En estas circunstancias, los
presentes inventores pensaron que sería difícil aislar directamente
el ADNc correspondiente al CNP e identificar la estructura de la
proteína precursora de CNP en base al análisis de ese ADNc. En lugar
de ello, los presentes inventores planearon un proyecto para aislar
el gen CNP del cromosoma porcino e identificar la estructura de la
proteína precursora del CNP analizando el cromosoma aislado.
En la presente invención, se preparó una sonda
de ADN para uso en el aislamiento del gen CNP mediante el siguiente
procedimiento. En primer lugar, tal como se muestra en la Fig. 1, se
prepararon cebadores de ADN (KF 225 y KF 226) correspondientes a la
secuencia primaria amino del CNP-53 en las porciones
N- y C-terminales. En la Fig. 1, la N que aparece
en la secuencia de bases de KF 206 significa una de A, T, C o G. Se
llevó a cabo entonces, utilizando esos cebadores, una reacción en
cadena de polimerasa (PCR) según el método de Saiki y col. (Saiki,
R.K. y col., Science, 239, 487, 1988), mediante la cual se
amplificó específicamente sólo la región de ADN del gen cromosómico
porcino que codificaba para la secuencia primaria de aminoácidos del
CNP-53. Se introdujo el ADN amplificado en un
vector plasmídico antes de aislar un clon (DH1/pCNP5) que
incorporaba el ADN deseado.
Se recuperó el pCNP5 plasmídico del DH1/pCNP5
así obtenido y se analizó para verificar que contenía un fragmento
de ADN compuesto por 147 pares de bases (pb) amplificado por PCR
(cuyo fragmento de ADN es a partir de ahora abreviado aquí como
DC-53) y que DC-53 era un ADN
codificante de la secuencia primaria de aminoácidos de
CNP-53. A partir de estos resultados, quedó al
menos claro que no había ningún intrón contenido en la región génica
codificante de la secuencia primaria de aminoácidos de
CNP-53. A continuación, se utilizó la sonda de ADN
(DC-53) así preparada para estudiar una librería
génica cromosómica porcina (fago \lambda que incorpora el
fragmento génico cromosómico porcino), mediante lo cual se obtuvo un
clon (\lambdaCNP6) que se hibridaba con DC-53.
Tras ser analizado, el clon \lambda-CNP6 resultó
contener aproximadamente 14 kpb del gen cromosómico porcino.
También se vio que un fragmento de ADN BamHI compuesto por
aproximadamente 2 kpb de esas 14 kpb se hibridaba con una sonda de
ADN DC-53. En base a estos resultados, se determinó
toda la secuencia de bases del fragmento de ADN BamHI compuesto por
aproximadamente 2 kpb mediante el procedimiento mostrado en la Fig.
2. Como resultado de ello, se vio que el fragmento de ADN BamHI
contenía no sólo una región génica estructural codificante de toda
la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora del CNP
porcino, sino también la región promotora del gen del CNP porcino
(véase la Fig. 3).
En primer lugar, con respecto a la región
promotora, se vio que existía una caja TATA compartida por las
regiones promotoras de genes eucarióticos en las posiciones
133-138 de la secuencia de bases de ADN mostrada en
la Fig. 3; también se vio que dos cajas GC y una caja Y que se
creía participaban en el control de la expresión génica estaban
presentes secuencia arriba de la caja TATA. A partir de estos
hechos, se concluyó que la región en cuestión era la región
promotora del gen precursor de CNP.
En cuanto a la región génica estructural, ATG
estaba presente en las posiciones 310-312 secuencia
abajo (lado 3') de la secuencia de bases de la caja TATA; dado que
el ATG era el primer codon de metionina que aparecía secuencia
abajo (lado 3') de la caja TATA y que la secuencia de bases
alrededor de ese codon concordaba con la secuencia consenso de un
codon de iniciación de la traducción, A/G NNATG (N significa
cualquiera de A, T, G y C), que se sabe existe en eucariontes. En
base a estos hechos, los presentes inventores estimaron que el ATG
de interés sería un codon de iniciación de la traducción para el
precursor de CNP porcino.
Secuencia abajo de este codon ATG de iniciación
de la traducción, existe un marco abierto de lectura codificante de
40 residuos de aminoácido y continúa hasta un codon de finalización
de la traducción (TGA) presente en las posiciones
430-432. Sin embargo, las secuencias de aminoácidos
que corresponden a CNP-22 y CNP-53
no aparecen en la secuencia primaria de aminoácidos del péptido que
se puede predecir a partir de dicho marco abierto de lectura. Por
otra parte, el fragmento de ADN BamHI de interés contiene un marco
abierto de lectura que codifica para 134 residuos de aminoácido
desde la posición 725 hasta la 1126 de la secuencia de bases y se
vio que las secuencias primarias de aminoácidos que corresponden a
CNP-22 y CNP-53 aparecían en la
secuencia primaria de aminoácidos del péptido predecible a partir
de dicho marco abierto de lectura. En base a estos análisis, se vio
que el gen estructural del CNP porcino contenía al menos un intrón;
en otras palabras, la proteína precursora de CNP porcino en el gen
es codificada en al menos dos exones. Esto está también apoyado por
los dos hechos siguientes: existe una secuencia de bases similar a
C/A AGGT A/G ATG, que se sabe es la secuencia consenso de un
donador de ayustamiento, en un área próxima a la posición 400 de la
secuencia de bases y existe una secuencia de bases similar a
(Py)n N C/T AGG (Py significa un residuo de piridina y N
significa cualquiera de las bases A, T, C y G), que se sabe es la
secuencia consenso de un aceptor de ayustamiento, en el lado 5' de
la posición 840 de la secuencia de bases. En base a estos hechos, el
presente inventor supuso que la región de ADN desde la posición 399
hasta la posición 838 de la secuencia de bases podría ser un intrón,
que podría probablemente ser eliminado por ayustamiento cuando se
producía un ARNm maduro codificante de la proteína precursora de
CNP. En otras palabras, se estimó que la proteína precursora de CNP
sería un polipéptido compuesto por un total de 126 residuos de
aminoácido que estaría codificado por dos exones, iniciándose el
primero de ellos en la posición 310 de la secuencia de bases y
acabando en la posición 399 e iniciándose el segundo en la posición
838. Con objeto de verificar esta estimación, los presentes
inventores expresaron la región génica estructural del gen
precursor de CNP en células animales y analizaron la estructura del
ARNm transcrito de ese gen estructural, así como la proteína
traducida de dicho ARNm.
Con este fin, los presentes inventores
prepararon primeramente un plásmido pSV2CNP que tenía la región
génica estructural del gen precursor de CNP unida al promotor
inicial de SV 40 (véase la Fig. 4) e introdujeron el plásmido en
células COS-1 (cuyas células son aquí abreviadas en
adelante como COS-1/pSV2CNP), mediante lo cual se
expresó el gen estructural en las células animales bajo el control
del promotor SV 40.
Para el análisis del ARNm, se tomó el siguiente
procedimiento. Se extrajo todo el ARN de
COS-1/pSV2CNP y a continuación, utilizando una
columna de oligo-dT celulosa, se preparó
poli(A)^{+} ARN, que fue utilizado para preparar
una librería de ADNc. Se rastreó entonces la librería de ADNc usando
ADN DC-53 para aislar un clon DH1/pCNP ADNc 1, que
se hibridaría con la sonda de ADN. Se aisló además un ADNc 1 pCNP
plasmídico del clon para determinar la secuencia total de bases de
la región de ADNc. Como resultado, se vio que el ARNm maduro (ADNc)
derivado del gen estructural del gen CNP no contenía la región que
los presentes inventores predecían que correspondería a un intrón
(véase la Fig. 5). La región de ADN localizada en las posiciones
400-838 de la secuencia de bases mostrada en la Fig.
3 era un intrón, pero se vio que se eliminaba por ayustamiento
cuando se preparaba un ARNm maduro codificante de la proteína
precursora de CNP. En estas circunstancias, los presentes
inventores consiguieron finalmente establecer las posiciones de los
exones y un intrón en la región génica estructural del gen CNP.
También consiguieron identificar la proteína precursora de CNP como
un polipéptido compuesto por 126 residuos de aminoácido que tenía la
secuencia primaria de aminoácidos mostrada en la Fig. 5. En la
secuencia primaria de aminoácidos así identificada de la proteína
precursora del CNP porcino (en adelante abreviada como prepro CNP),
CNP-22 y CNP-53 estaban presentes en
la región C-terminal de PrePro CNP, mientras que
estaba presente una región rica en residuos de aminoácido
hidrofóbicos (en las posiciones 10-16 de la
secuencia primaria de aminoácidos mostrada en la Fig. 5) en la
región N-terminal de PrePro CNP, y, a la vista de
estos hechos, existe una elevada posibilidad de que el péptido señal
necesario para la secreción exista en la región
N-terminal de PrePro CNP.
Considerando los hechos anteriormente
discutidos, el CNP-22 y el CNP-53
son presumiblemente biosintetizados por la ruta siguiente. En
primer lugar, el PrePro CNP compuesto por 126 residuos de aminoácido
es traducido a partir del ARNm. Luego, se escinde el péptido señal
presente en la región N-terminal del PrePro CNP para
la conversión en Pro CNP en el proceso de secreción. Además, el Pro
CNP es escindido por una enzima procesadora en posiciones
específicos (entre las posiciones 73 y 74 de la secuencia primaria
de aminoácidos y entre las posiciones 104 y 105 de la misma
secuencia que se muestra en la Fig. 5) para ser convertido en
CNP-53 y CNP-22.
Con objeto de verificar esta suposición, los
presentes inventores analizaron entonces la proteína en el
sobrenadante de cultivo de COS-1/pSV2CNP mediante
el siguiente procedimiento. En primer lugar, se recogió y concentró
el sobrenadante líquido de un cultivo de
COS-1/pSV2CNP. Luego se fraccionaron las proteínas y
los péptidos contenidos en el concentrado por peso molecular usando
Sephadex G-75. Se sometió entonces una porción de
cada fracción de elución a radioinmunoensayo (RIA) usando un
antisuero anti-CNP-22, mediante lo
cual se determinaron las cantidades de los péptidos y proteínas que
estaban presentes en cada fracción y que mostraban
inmunorreactividad con el anticuerpo
anti-CNP-22.
Los resultados son mostrados en la Fig. 6, en
donde las posiciones de elución de \gamma-rANP (1)
y \alpha-rANP (2) de la columna están indicadas
por una flecha. Como puede verse por la Fig. 6, las proteínas y los
péptidos que mostraban inmunorreactividad con el antisuero
anti-CNP-22 estaban presentes en
fracciones con pesos moleculares de aproximadamente 16 kd y en
fracciones con pesos moleculares de aproximadamente
3-10 kd. Esto llevó a la conclusión de que Pro CNP
era segregado y expresado en células COS-1/pSV2CNP.
También puede verse por la Fig. 6 que los péptidos que mostraban
inmunorreactividad con el antisuero
anti-CNP-22 aparecían a pesos
moleculares de aproximadamente 3-7 kd. Esto condujo
también a la conclusión de que parte de Pro CNP era además
convertido en péptidos de pesos moleculares inferiores (cada uno
con una estructura CNP-22 en su región
C-terminal) en células COS-1.
En resumen, los presentes inventores aislaron
genes cromosómicos y ADNc codificantes de las proteínas precursoras
de los CNP porcinos (CNP-22 y
CNP-53) y las analizaron para identificar las
secuencias primarias de aminoácidos de las proteínas precursoras de
los CNP porcinos. Al mismo tiempo, produjeron con éxito por un
método de ingeniería genética todas o parte de las proteínas
codificadas por ese gen o ADNc. La presente invención ha sido
conseguida en estas circunstancias.
Los siguientes ejemplos son facilitados con
fines de mayor ilustración de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se amplificó la región génica cromosómica
codificante de la secuencia amino primaria de CNP-53
in vitro mediante el siguiente método. En primer lugar, se
sintetizaron químicamente dos cebadores de ADN (KF 225 y KF 226)
que correspondían a la secuencia primaria de aminoácidos de
CNP-53 en sus regiones N- y
C-terminales (véase la Fig. 1). Se introdujo un
sitio de reconocimiento de enzima de restricción (PstI)
artificialmente en las regiones 5' terminales de KF 225 y KF 226
para facilitar la subclonación del gen después de su amplificación
(en la Fig. 1, las bases artificialmente convertidas están indicadas
por letras minúsculas del alfabeto). A continuación, utilizando los
cebadores de ADN, se llevó a cabo una reacción en cadena de
polimerasa (PCR) según el método de Saiki y col., (Saiki, P.K. y
col., Science, 239, 487, 1988) mediante el siguiente procedimiento.
Se añadieron KF 225 y KF 226, cada uno con un peso de 1,26 \mug, y
un ADN porcino (1 \mug) a 100 \mul de una solución de reacción
[Tris-HCl 10 mM (pH 8,5), MgCl_{2} 2,5 mM, KCl 50
mM, NPTs 0,2 mM y gelatina al 0,02%]. Se añadieron a la solución 5
unidades de ADN polimerasa de Thermus aquaticus (New England
BioLabs) para llevar a cabo la PCR a través de 30 ciclos,
consistiendo cada ciclo en un sucesivo calentamiento a 90ºC durante
1,5 min., a 65ºC durante 2 min. y a 70ºC durante 1,5 min. En el
ciclo 10, se añadieron 5 unidades más de la ADN polimerasa
mencionada anteriormente a la solución de reacción. Los genes
amplificados de esta forma fueron recuperados por precipitación con
etanol.
Para obtener un fragmento de ADN codificante de
la secuencia primaria de aminoácidos del CNP-53
deseado, los fragmentos de ADN amplificados en A fueron subclonados
en un vector plasmídico pUC 118 antes de tratar los genes
amplificados con una enzima de restricción PstI. Los fragmentos
génicos tratados fueron introducidos en pUC 118 (Takara Shuzo Co.,
Ltd.) en el sitio PstI, que fue usado para transformar DH1 derivado
de la cepa 12 de E. coli con objeto de preparar una librería
génica. A continuación, se rastreó la librería génica utilizando
una sonda KF 206 de ADN mixta químicamente sintetizada (sonda de ADN
mixta oligonucleotídica correspondiente a la porción de la
secuencia amino primaria de CNP-53 mostrada en la
Fig. 1 que comenzaba con leucina (Leu) en la posición 16 y
finalizaba con asparraguina (Asn) en la posición 21; 32 mezclas de
14-meros) según el método de Wood (Wood, W.I. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 1585, 1985), mediante lo
cual se obtuvo un clon DH1/pCNP5 que se hibridaba con KF 206. En
una etapa posterior, se separó y purificó un plásmido (pCNP5) a
partir del clon en la forma habitual. El plásmido purificado fue
escindido con una enzima de restricción PstI. Al ser analizado, se
vio que pCNP5 contenía un fragmento de ADN PstI compuesto por
aproximadamente 150 pb. Con objeto de verificar que el fragmento de
ADN PstI era un fragmento génico codificante de la secuencia
primaria de amino-ácidos del objetivo final, CNP-53,
se clonó dicho fragmento de ADN PstI en el fago M13 y se determinó
la secuencia de bases de ADN de interés con SEQUENASE (United States
Biochemical Corporation) por el método didesoxi (Sanger, F. y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463, 1977). Como resultado, se
vio que el fragmento de ADN PstI era un gen compuesto por un total
de 147 pb y que tenía una secuencia de bases de ADN codificante de
CNP-53.
Se preparó una sonda de ADN
(DC-53) para uso en la clonación de un gen
codificante de la proteína precursora del CNP porcino mediante un
método que consistía en la escisión del plásmido pCNP5 antes
mencionado con una enzima de restricción PstI, el aislamiento de un
fragmento de ADN de 147 pb y el radiomarcaje del fragmento de ADN
por traslado de muescas utilizando
(\alpha-^{32}P) dCTP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se infectó LE 392 derivado de la cepa K12 de
E. coli con una librería de ADN de fagos de genes
cromosómicos porcinos (producto de Clonetech Co.) conservada a 4ºC.
Se plaquearon las células en un medio LB (10 g de bactotriptona, 5
g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, bactoagar al 1,5%, volumen
total 1 L) y se cultivaron durante la noche a 37ºC. Se enfrió la
placa a 4ºC durante 30 min. y se dejó reposar un filtro de
nitrocelulosa (producto de Shleicher & Schnell Co.) sobre la
placa del fago durante 5 minutos. A continuación, se retiró el
filtro de la placa, se secó con aire, se sumergió en una solución
alcalina de desnaturalización (NaOH 0,5 M y NaCl 1,5 M) durante 1
minuto y se sumergió después en una solución neutralizante
(Tris-HCl 0,5 M, pH 7,0; NaCl 1,5 M) durante 1
minuto. Posteriormente, se aclaró el filtro de nitrocelulosa con una
solución SSC 3x (SSC NaCl 20x, 175,3 g; citrato trisódico, 88,2 g;
volumen total, 1 L), se secó con aire y se trató con calor a vacío
a 80ºC durante 120 minutos.
Utilizando el filtro de nitrocelulosa así
preparado, se llevó a cabo una hibridación de placa en las
siguientes condiciones. En primer lugar, se añadió una solución de
prehibridación [SSC 3x; solución 1x de Denhardt (consistente en
albúmina, polivinilpirrolidona y Ficoll, cada uno en un peso de 0,2
mg/ml); ADN de esperma de salmón, 50 \mug/ml; SDS al 0,1%] al
filtro de nitrocelulosa y se llevó a cabo una prehibridación a 65ºC
durante 3 horas. Se llevó a cabo después una hibridación utilizando
10^{6} cpm de la sonda de ADN DC-53 y 1 m de la
solución de prehibridación para dos láminas del filtro de
nitrocelulosa durante la noche a 65ºC. A continuación, se lavó el
filtro tres veces con una solución SSC 3x que contenía SDS al 0,1%,
haciendo cada lavado a 65ºC durante 30 minutos; se secó el filtro
lavado con aire y se sometió a autorradiografía a -80ºC durante 24
horas. Rastreando aproximadamente 2 x 10^{6} clones de este modo,
se obtuvieron cinco clones que se hibridaban con la sonda de ADN
DC-53. Uno de estos clones fue denominado
"\lambdaCNP6" y sometido a análisis en las etapas
siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se preparó ADN a partir del fago \lambdaCNP6
en la forma habitual. A continuación, se escindió el ADN del fago
con enzimas de restricción BamHI, HindIII y PstI y se separaron los
fragmentos resultantes de ADN y se analizaron por electroforesis en
un gel de agarosa. Se vio que \lambdaCNP6 era un fago que contenía
un gen cromosómico porcino de aproximadamente 14 kpb. El análisis
por Southern blotting utilizando la sonda de ADN
DC-53 mostró que cada uno del fragmento de ADN BamHI
de aproximadamente 2 kpb, del fragmento de ADN HindIII de
aproximadamente 3 kpb y del fragmento de ADN PstI de aproximadamente
5 kpb, se hibridaba con la sonda de ADN DC-53. Se
determinó la secuencia total de bases del ADN BamHI que tenía el
peso molecular más bajo (2 kpb) de esos tres fragmentos que se
hibridaban con la sonda de ADN DC-53 mediante el
método siguiente para cada una de las hebras superior e
inferior.
inferior.
Con objeto de determinar la secuencia de bases
de la hebra superior del fragmento de ADN BamHI, se subclonó
primeramente este último en un vector plasmídico pUC 118 (Takara
Shuzo Co., Ltd.) en el sitio BamHI para preparar pUC CNP6. Se
escindió luego pUC CNP6 con enzimas de restricción XbaI y SphI y,
utilizando un kit de eliminación de kilosecuenciación TAKARA
(Takara Shuzo Co., Ltd.), se prepararon plásmidos de deleción, o
plásmidos que tenían eliminado el extremo izquierdo de ADN del ADN
BamHI en longitudes variables, tal como se muestra en la Fig.
2(a). A continuación, se analizó la longitud de la deleción
por electroforesis en un gel de agarosa y se seleccionaron 9 clones
que tenían deleciones hasta alcanzar longitudes apropiadas.
Finalmente, esos clones fueron infectados con un fago "helper"
M13KO7 y se recuperó un ADN de una sola hebra (hebra superior).
Utilizando un cebador universal, usando el ADN recuperado como
plantilla, se determinó la secuencia de bases de ADN de la hebra
superior del fragmento de ADN BamHI por el método didesoxi con
SEQUENASE (United States Biochemical Corporation). En cuanto a las
regiones cuyas secuencias de bases no pudieron ser determinadas a
causa de la no disponibilidad de clones mutantes de deleción de
longitudes apropiadas por el método descrito anteriormente, sus
secuencias de bases de ADN fueron determinadas usando como cebador
los oligonucleótidos KF 248, KF 249 y KF 250 [véase la Fig.
2(c)], que fueron químicamente sintetizados en base a las
secuencias de bases ya
determinadas.
determinadas.
En cuanto a la secuencia de bases de la hebra
inferior, la hebra superior de un fragmento de ADN BamHI de 2 kpb
fue subclonada en el fago M13 y, utilizando el subclón como
plantilla, se determinó la secuencia de bases por el método
didesoxi usando un cebador universal y los cebadores
oligonucleotídicos, KF 239, KF 243, KF 244, KF 245, KF 246, KF 247,
KF 252 y KF 254 [véase la Fig. 2(c)], que fueron químicamente
sintetizados en base a la secuencia de bases de la hebra superior
determinada mediante el procedimiento anterior. Las regiones cuyas
secuencias de bases fueron determinadas utilizando un cebador
universal están identificadas por flechas continuas en la Fig.
2(b) y aquéllas cuyas secuencias de bases fueron determinadas
usando cebadores oligonucleotídicos químicamente sintetizados están
identificadas por flechas discontinuas en la Fig. 2(b).
La secuencia de bases de la hebra superior del
fragmento de ADN BamHI que fue determinada por el método
anteriormente descrito y la secuencia de aminoácidos codificada en
los sitios de exón predecible por esa secuencia de bases son
mostradas en la Fig. 3.
\newpage
Ejemplo
4
Utilizando el gen precursor del CNP porcino
(fragmento de ADN BamHI) aislado y analizado en el Ejemplo 3, se
expresó la región génica estructural del gen precursor del CNP
porcino en células animales y no sólo se analizó la estructura del
ARNm transcrito a partir de dicho gen estructural, sino también la
proteína traducida a partir de dicho ARNm.
Tal como se muestra en la Fig. 4, se escindió
primeramente un vector plasmídico pSV2dhfr (Bethesda Research
Laboratories, Inc.) con una enzima de restricción Bgl II. A
continuación, se hizo que los sitios escindidos con Bgl II tuvieran
un extremo romo y a continuación fueron tratados con una enzima de
restricción HindIII para eliminar la región de ADNc de una ácido
deshidrofólico-reductasa de ratón (dhfr de ratón)
del pSV2dhfr. En siguiente lugar, se escindió un plásmido pUC
CNPdel [cuyo plásmido era uno de los plásmidos de deleción
preparados en el Ejemplo 3 cuando se determinó la secuencia de bases
del ADN de la hebra superior del fragmento de ADN BamHI y tiene
eliminados 166 pb del extremo 5' del fragmento de ADN BamHI mostrado
en la Fig. 3; la célula huésped transformada con este plásmido fue
denominada "Escherichia coli SMB318" y fue depositada en
el Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science
and Technology, el 10 de Julio de 1990, bajo el Número de Acceso
2997 (FERM BP-2997)] con enzimas de restricción
HindIII y RsaI para obtener un fragmento de ADN compuesto por 989
pb. Este fragmento de ADN fue ligado con el fragmento de ADN
HindIII-Bgl II de pSV2dhfr, que había sido
preparado mediante el método anteriormente mencionado, mediante lo
cual se preparó un vector de expresión del gen estructural de CNP
porcino pSV2CNP.
Se analizó la estructura del ARNm transcrito a
partir del gen estructural del CNP porcino mediante el siguiente
procedimiento.
En primer lugar, se introdujo el plásmido
pSV2CNP (10 \mug) en células COS-1 derivadas de
riñón de mono (7,5 x 10^{5} células) usando el Kit de
Transfección Cellphect (Pharmacia). Las células transfectadas fueron
cultivadas en 8 ml de un DMEM (Medio de Eagles Modificado de
Dulbeco, GIBCO) que contenía un 10% de FCS (suero fetal de ternera,
GIBCO) en presencia de CO_{2} a 37ºC durante 72 h. A continuación,
se separó el sobrenadante del cultivo de las células. Se guardó el
sobrenadante así obtenido a -70ºC y se utilizó en el análisis de
proteínas tal como se describirá a continuación en C. Por otra
parte, las células fueron utilizadas en el análisis del ARNm según
se va a describir justo a continuación.
Utilizando un método de tiocianato de guanidina,
se extrajeron 800 \mug de ARN total de aproximadamente 10^{7}
células de COS-1/pSV2CNP. Después, usando una
columna de oligo(dT)celulosa, se prepararon
aproximadamente 150 \mug de poli(A)^{+} ARN a
partir de 800 \mug de ARN total. A continuación, usando 10 \mug
de poli(A)^{+} ARN, se preparó una librería de ADNc
mediante el método de Okayama-Berg (Molec. Cell
Biol., 2, 161-170, 1982) para obtener
aproximadamente 2 x 10^{5} clones independientes. Se rastreó la
librería de ADNc consistente en aproximadamente 4 x 10^{3} clones
de la forma usual utilizando la sonda de ADN DC-53
preparada en el Ejemplo 1, mediante lo cual se obtuvieron clones
que se hibridaban con la sonda de ADN DC-53 y se les
denominó "ADNc 1 DHI/pCNP".
En una etapa posterior, se separó el plásmido
(ADNc 1 pCNP) y se purificó a partir de los clones del modo
habitual, se escindió con varias enzimas de restricción y se
analizó. Como resultado, se vio que el ADNc 1 pCNP contenía
aproximadamente 14 kb de ADNc. Para el análisis final de ARNm, se
subclonó el ADNc de 1,4 kb en el fago M13 y se determinó la
secuencia de bases de ADN por el método didesoxi usando SEQUENASE
(United States Biochemical Corporation). La Fig. 5 muestra la
secuencia de bases de ADN así determinada del ADNc y la secuencia
primaria de aminoácidos predecible por la secuencia de bases del
ADN.
Se analizó la proteína traducida del ARNm CNP
por el procedimiento siguiente. En primer lugar, se disolvió el
sobrenadante (75 ml) de COS-1/pSV2CNP preparado en
el Ejemplo 4-B, seguido de concentración y
desplazamiento salino con Sep-pak. Se liofilizó
luego la muestra y se disolvió en 5 ml de solución 1 M de ácido
acético. A continuación, se fraccionaron las proteínas y los
péptidos contenidos en la solución en una columna Sephadex
G-75 (1,8 x 137 cm, Pharmacia) según el peso
molecular (velocidad de flujo: 7,7 ml/h, tamaño de fracción: 5 ml).
Finalmente, se sometió una porción (40 \mul) de cada fracción
eluida a un sistema de radioinmunoensayo ("RIA") utilizando un
antisuero anti-CNP-22 [para detalles
del sistema RIA, véase la solicitud de patente comúnmente asignada
sobre un nuevo péptido porcino fisiológicamente activo
(CNP-53)] para determinar las cantidades de péptido
y proteína (ir-CNP-22) que estaban
presentes en cada fracción y que mostraban inmunorreactividad con
el anticuerpo anti-CNP-22.
El resultado es mostrado en la Fig. 6, por la
que puede verse que aparecían una proteína y un péptido que
mostraban inmunorreactividad con el antisuero
anti-CNP-22 en las fracciones
eluidas (\neq36-44) con pesos moleculares de
aproximadamente 16 kd y en las fracciones eluidas
(\neq45-66) con pesos moleculares de
3-10 kd. Los resultados del RIA mostraron también
que el sobrenadante del cultivo de COS-1/pSV2CNP
contenía 150 ng, en términos de CNP-22, de una
proteína y un péptido que exhibían inmunorreactividad con el
antisuero anti-CNP-22.
Según la presente invención, la región de ADN de
un gen cromosómico porcino que codificaba para
CNP-53 fue específicamente amplificada por PCR para
preparar una sonda de ADN (DC-53). A continuación,
usando la DC-53, se aisló un gen cromosómico
codificante de la proteína precursora del CNP porcino
(CNP-22 y CNP-53) y se identificó
su estructura. Tal como se muestra en la Fig. 3, el fragmento de ADN
BamHI aislado en la presente invención resultó contener no sólo la
región génica estructural codificante de toda la secuencia de
aminoácidos de la proteína precursora del CNP porcino (que es
codificada en dos exones en su región génica estructural), sino
también la región promotora del gen CNP porcino.
En la etapa siguiente, la región del gen
estructural del gen cromosómico fue expresada en células
COS-1 derivadas de riñón de mono y la estructura
del ARNm (ADNc) transcrito a partir del gen estructural, así como la
proteína traducida a partir del ARNm, fueron analizadas. Como
resultado, se vio que la proteína precursora del CNP porcino era un
polipéptido que tenía la secuencia primaria de aminoácidos mostrada
en la Fig. 5 y que estaba compuesta por 126 residuos de aminoácido
en total. También se vio que estaba presente un péptido señal en la
región N-terminal de la proteína precursora (prepro
CNP) y que tanto el CNP-22 como el
CNP-53 in vivo eran péptidos segregados al
exterior de las células. Se vio además que, expresando el gen
estructural del CNP porcino en células animales, se podían producir
un péptido y una proteína que mostraban inmunorreactividad con un
anticuerpo anti-CNP-22.
Los genes y los ADNc de los precursores del CNP
porcino fueron aislados e identificados por la presente invención.
Si se usan como sondas de ADN, se pueden aislar el gen o el ADNc del
CNP derivado de las células de otros animales distintos del cerdo
y, analizándolos, se puede identificar el CNP de animales no
porcinos. Tal como se muestra en el Ejemplo 4-C, el
gen o el ADNc codificantes del precursor de CNP porcino pueden ser
expresados en células animales y la proteína o el péptido
segregados al exterior de las células pueden ser aislados e
identificados para disponer de información más detallada acerca del
mecanismo que se halla tras la biosíntesis de los CNP porcinos. El
pro CNP, que carece de un péptido señal procedente de pre pro CNP,
no ha sido hasta la fecha aislado e identificado in vivo, ni
lo han sido diversos péptidos que tienen aminoácidos adicionales
unidos al extremo N de CNP-53 [al menos 5 residuos
de lisina (Lys) y al menos 3 residuos de arginina (Arg) están
presentes en la secuencia primaria de aminoácidos de pre pro CNP
entre las posiciones 24 y 73, con Lys en las posiciones 30, 51, 52,
55 y 65 y Arg en las posiciones 33, 68 y 70, de forma que es
probable que pro CNP sea escindido específicamente in vivo
en el extremo C de cualquiera de esos residuos de aminoácidos
básicos con enzimas procesadoras y, además de CNP-22
y CNP-53, que han sido hasta ahora identificados
in vivo, existe una gran posibilidad de que existan péptidos
que tengan aminoácidos adicionales unidos al extremo N de
CNP-53], pero, según la presente invención, incluso
esos péptidos pueden ser aislados e identificados con el fin de
examinar sus actividades fisiológicas.
También se vio que el gen de la proteína
precursora del CNP porcino mostrado en la Fig. 3 contenía no sólo
una región génica estructural codificante del precursor del CNP
porcino, sino también una región promotora capaz de expresar el gen
estructural de interés. En vista del hecho de que
CNP-22 y CNP-53 fueron aislados en
el cerebro, el promotor funcionará con más probabilidad en el
cerebro de un modo específico. De aquí que, si un gen codificante
de una proteína adecuada está unido secuencia abajo del promotor y
si la combinación es utilizada para preparar un ratón transgénico,
la proteína de interés pueda ser expresada específicamente en el
cerebro del ratón transgénico, haciendo posible analizar las
acciones fisiológicas de la proteína a nivel individual.
La información obtenida por la presente
invención en relación al gen cromosómico, al ADNc y a la secuencia
primaria de aminoácidos de las proteínas precursoras del CNP porcino
hará grandes contribuciones no sólo a los futuros estudios para
desvelar el mecanismo que se halla detrás de la biosíntesis y las
acciones fisiológicas del CNP en mamíferos, sino también a los
esfuerzos por establecer aplicaciones farmacéuticas de péptidos
asignables a la familia CNP.
<110> Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen y proteína precursora del CNP
porcino
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
PED-11-1EPB
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa domesticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa domesticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa domasticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es cualquier base
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m es a o g
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> y es c o t
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m es a o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Sus scrofa domesticus
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<220>
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<221> CDS
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<222> (144)..(521)
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<223>
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<212> PRT
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<213> Sus scrofa domesticus
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<400> 22
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\hskip0,7cm
Claims (2)
1. Un ADN con la siguiente secuencia de bases:
GGT TTG TCC AAG GGC TGC TTC GGC CTC AAA CTG GAC CGG ATC GGC TCC ATG
AGC GGC CTG GGA TGT, que codifica para un polipéptido de 22 residuos
de aminoácido.
2. Uso de un ADN según la reivindicación 1 como
sonda.
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