JPH0794473B2 - 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 - Google Patents
新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤Info
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- JPH0794473B2 JPH0794473B2 JP59038816A JP3881684A JPH0794473B2 JP H0794473 B2 JPH0794473 B2 JP H0794473B2 JP 59038816 A JP59038816 A JP 59038816A JP 3881684 A JP3881684 A JP 3881684A JP H0794473 B2 JPH0794473 B2 JP H0794473B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明は、ひな直腸筋標本弛緩作用、利尿作用及びナ
トリウム利尿作用を有するペプチド並びにその塩、並び
にこれらを含んで成る利尿剤に関する。
トリウム利尿作用を有するペプチド並びにその塩、並び
にこれらを含んで成る利尿剤に関する。
（発明の背景） 種々の体液性因子、すなわち生理活性物質が、物理的因
子、例えば心拍出量、欠管壁の弾性等と共に血圧を規定
する重要な因子であることはよく知られている。この体
液性因子が関与する系として、レニン−アンジオテンシ
ン−アルドステロン系、カテコラミン系、プロスタグラ
ンジン系、カリクレイン−キニン系と共にナトリウム利
尿ホルモン系が存在し、ウァベイン様物質といわれるナ
トリウム利尿ホルモンが血圧の上昇に関与することもす
でに周知である。
子、例えば心拍出量、欠管壁の弾性等と共に血圧を規定
する重要な因子であることはよく知られている。この体
液性因子が関与する系として、レニン−アンジオテンシ
ン−アルドステロン系、カテコラミン系、プロスタグラ
ンジン系、カリクレイン−キニン系と共にナトリウム利
尿ホルモン系が存在し、ウァベイン様物質といわれるナ
トリウム利尿ホルモンが血圧の上昇に関与することもす
でに周知である。
なお、この明細書において「ナトリウム利尿」とはカリ
ウムイオンに対してナトリウムイオンを選択的に排泄す
る利尿を言う。
ウムイオンに対してナトリウムイオンを選択的に排泄す
る利尿を言う。
（従来技術） 従来から、本態性高血圧の治療にナトリウムイオンの排
泄を目的として、利尿剤、例えばフロセマイド（Frosem
ide）が用いられている。しかしながら、この物質とこ
の発明の物質とは構造が全く異る。
泄を目的として、利尿剤、例えばフロセマイド（Frosem
ide）が用いられている。しかしながら、この物質とこ
の発明の物質とは構造が全く異る。
一方、ヒトの心房中には、ペプチドホルモン産生細胞中
に見られる顆粒と形態的に類似する顆粒が存在すること
が知られている〔J.D.Jamieson及びG.E.Palade,J.Ccll
Biol.,23,151（1964）〕。また、ラットの心房のホモジ
ネート物及びその顆粒が、ラットに対してナトリウム利
尿を起すことも知られている〔A.J.DeBold等、Life Sc
i.,28,89（1981）;R.Keeler,Can.J.Physiol.Pharmaco
l.,60,1078（1982）等〕。さらに、最近において、Mark
G.Currie S.等はヒト、ウサギ、ブタ及びラットの心房
中にナトリウム利尿作用を有する分子量２万〜３万のペ
プチド様物質及び分子量１万以下のペプチド様物質が存
在することを示唆した〔Science,221,71〜73（198
3）〕。最近になって、アミノ酸数28個のラット由来の
ペプチドが同定された〔B.B.R.C.Vol.117,No.3,895〜86
5頁（1983）〕（文献１）。また本発明者等は、ヒト由
来のα−hANPを見出し、その構造及び薬理活性を明らか
にした〔特願昭58−243675;B.B.R.C.Vol.118,No.1,131
〜139頁（1984）〕。
に見られる顆粒と形態的に類似する顆粒が存在すること
が知られている〔J.D.Jamieson及びG.E.Palade,J.Ccll
Biol.,23,151（1964）〕。また、ラットの心房のホモジ
ネート物及びその顆粒が、ラットに対してナトリウム利
尿を起すことも知られている〔A.J.DeBold等、Life Sc
i.,28,89（1981）;R.Keeler,Can.J.Physiol.Pharmaco
l.,60,1078（1982）等〕。さらに、最近において、Mark
G.Currie S.等はヒト、ウサギ、ブタ及びラットの心房
中にナトリウム利尿作用を有する分子量２万〜３万のペ
プチド様物質及び分子量１万以下のペプチド様物質が存
在することを示唆した〔Science,221,71〜73（198
3）〕。最近になって、アミノ酸数28個のラット由来の
ペプチドが同定された〔B.B.R.C.Vol.117,No.3,895〜86
5頁（1983）〕（文献１）。また本発明者等は、ヒト由
来のα−hANPを見出し、その構造及び薬理活性を明らか
にした〔特願昭58−243675;B.B.R.C.Vol.118,No.1,131
〜139頁（1984）〕。
本発明者等は、ナトリウム選択性が高く効果的な利尿作
用を有する物質を見出すべく鋭意研究を行った結果、ラ
ットの心房から、48個のアミノ酸で構成され約5000の分
子量を有する全く新しいペプチドを単離することに成功
し、このペプチドの構造を決定すると共に、このペプチ
ドが顕著な、ひな直腸筋標本弛緩作用、利尿作用、及び
ナトリウム利尿作用を有することを見出し、この発明を
完成した。
用を有する物質を見出すべく鋭意研究を行った結果、ラ
ットの心房から、48個のアミノ酸で構成され約5000の分
子量を有する全く新しいペプチドを単離することに成功
し、このペプチドの構造を決定すると共に、このペプチ
ドが顕著な、ひな直腸筋標本弛緩作用、利尿作用、及び
ナトリウム利尿作用を有することを見出し、この発明を
完成した。
すなわち、この発明は、顕著な利尿作用、特にナトリウ
ム利尿作用を有する新規なペプチド、及び該ペプチドを
含んで成る利尿剤を提供することを目的とする。
ム利尿作用を有する新規なペプチド、及び該ペプチドを
含んで成る利尿剤を提供することを目的とする。
なお、この明細書において、この新規ペプチドをβ−rA
NP（β−rat atrial natriuretic polypeptide）と称す
る。
NP（β−rat atrial natriuretic polypeptide）と称す
る。
（発明の構成） （Ａ）β−rANPの構造及び物理化学的性質 この発明のペプチドβ−rANPは次の構造式（Ｉ）で
表わされる。
表わされる。
上記の構造式（Ｉ）において、と、と、及び
とは直接に結合しており、又このアミノ酸鎖は左側に
アミノ末端を有し右側にカルボキシ末端を有する。式
中、Aspはアスパラギン酸、Asnはアスパラギン、Alaは
アラニン、Argはアルギニン、Ileはイソロイシン、Gly
はグリシン、Gluはグルタミン酸、Glnはグルタミン、Cy
sは1/2シスチン、Serはセリン、Tyrはチロシン、Pheは
フェニルアラニン、Metはメチオニン、Leuはロイシン、
Proはプロリン、Lysはリジン、をそれぞれ表わし、いず
れもＬ−アミノ酸である。
とは直接に結合しており、又このアミノ酸鎖は左側に
アミノ末端を有し右側にカルボキシ末端を有する。式
中、Aspはアスパラギン酸、Asnはアスパラギン、Alaは
アラニン、Argはアルギニン、Ileはイソロイシン、Gly
はグリシン、Gluはグルタミン酸、Glnはグルタミン、Cy
sは1/2シスチン、Serはセリン、Tyrはチロシン、Pheは
フェニルアラニン、Metはメチオニン、Leuはロイシン、
Proはプロリン、Lysはリジン、をそれぞれ表わし、いず
れもＬ−アミノ酸である。
この発明のβ−rANPは、Ｃ末端側に部分構造として前述
の文献（１）のペプチドを含む。またこのβ−rANPは、
前記α−hANPの12位のMetがIleに変わった部分構造を含
む。
の文献（１）のペプチドを含む。またこのβ−rANPは、
前記α−hANPの12位のMetがIleに変わった部分構造を含
む。
分子量：約5000（ゲル過法による。） 紫外線吸収スペクトル:Max＝275nm。
呈色反応：エールリッヒ反応陰性、坂口反応、及び
パウリ反応いずれも陽性。
パウリ反応いずれも陽性。
酸性・中性・塩基性の別：塩基性 溶剤に対する溶解性：水、メタノール及び酢酸に溶
解し、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチルエーテル、ヘキ
サン、石油エーテル、ベンゼン及びクロロホルムに難溶
である。
解し、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチルエーテル、ヘキ
サン、石油エーテル、ベンゼン及びクロロホルムに難溶
である。
アミノ酸組成 本発明のペプチドβ−rANP、β−rANPを還元した後カル
ボキシメチル化したもの（RCM−β−rAMP）、及びRCM−
β−rANPのトリプシン消化物のアミノ酸組成、並びにβ
−rANP鎖中におけるトリプシン消化断片（Ｔ−１〜Ｔ−
11）の位置を次の表に示す。
ボキシメチル化したもの（RCM−β−rAMP）、及びRCM−
β−rANPのトリプシン消化物のアミノ酸組成、並びにβ
−rANP鎖中におけるトリプシン消化断片（Ｔ−１〜Ｔ−
11）の位置を次の表に示す。
なお、この化合物は前記のごとく塩基性であり、無機
酸、例えば塩酸、硫酸、燐酸等、又は有機酸、例えば蟻
酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、クエン酸等と共に
常法に従って酸付加塩に転換することができる。
酸、例えば塩酸、硫酸、燐酸等、又は有機酸、例えば蟻
酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、クエン酸等と共に
常法に従って酸付加塩に転換することができる。
（Ｂ）β−rANPの生物学的性質 この発明のペプチドβ−rANPは顕著なひな直腸筋標本弛
緩作用、利尿作用、及びナトリウム利尿作用を有する。
緩作用、利尿作用、及びナトリウム利尿作用を有する。
試験方法 雄性SD系ラット（体重300〜400g）にペントバルビター
ン60mg/kgを腹腔内投与することによつて麻酔し、以下L
ife Sciences,Vol.28,pp39〜94に記載されている方法に
準じて行った。
ン60mg/kgを腹腔内投与することによつて麻酔し、以下L
ife Sciences,Vol.28,pp39〜94に記載されている方法に
準じて行った。
気道確保のため、気管カニューレ（PE−240 Clay−Adam
s）を施し、股動脈に血圧測定用の動脈カニューレ（PE
−10にPE−50を接続）を挿入し、股静脈にリンゲル液投
与用の静脈カニューレを挿入した。この静脈カニューレ
を通して1.2mlのリンゲル液を約10分間にわたって注入
した後1.2ml/時の速度で定常注入（constant infusio
n）を行った。
s）を施し、股動脈に血圧測定用の動脈カニューレ（PE
−10にPE−50を接続）を挿入し、股静脈にリンゲル液投
与用の静脈カニューレを挿入した。この静脈カニューレ
を通して1.2mlのリンゲル液を約10分間にわたって注入
した後1.2ml/時の速度で定常注入（constant infusio
n）を行った。
シラスティック・チューブ（内径0.02インチ、外径0.03
7インチ、ダウコーニング社製）の膀胱カニューレから
試験管内に採尿した。この採尿は被験物質を投与する前
30分間と投与後５分間又はその後経時的に行い、この尿
試料の分析値を比較することにより被験物質の作用を測
定した。
7インチ、ダウコーニング社製）の膀胱カニューレから
試験管内に採尿した。この採尿は被験物質を投与する前
30分間と投与後５分間又はその後経時的に行い、この尿
試料の分析値を比較することにより被験物質の作用を測
定した。
被験物質β−rANPは、その所定量を５μｇのバシトラシ
ン（抗菌剤）と共に50μｌの滅菌生理食塩水に溶解し、
頸静脈から投与した。
ン（抗菌剤）と共に50μｌの滅菌生理食塩水に溶解し、
頸静脈から投与した。
β−rANPの投与量は0.4nモル（群II）及び0.8nモル（群
III）の２段階とし、対照としてβ−rANPを投与せずバ
シトラシンのみを投与する群（群Ｉ）、及び比較のため
β−rANPの代りに公知のナトリウム利尿剤であるフロセ
マイドを1.21μモル投与する群（群IV）を設けた。
III）の２段階とし、対照としてβ−rANPを投与せずバ
シトラシンのみを投与する群（群Ｉ）、及び比較のため
β−rANPの代りに公知のナトリウム利尿剤であるフロセ
マイドを1.21μモル投与する群（群IV）を設けた。
結果 この試験において第１表に示す結果が得られた。
この表から明らかなごとく、この発明のペプチドβ−rA
NPは顕著な利尿作用及びナトリウム利尿作用を有する。
すなわち、この発明のβ−rANPを0.8nモル投与した場
合、その利尿作用及びナトリウム利尿作用は公知の利尿
剤であるフロセマイドを1.21μモル投与した場合のそれ
にほぼ匹敵する。この投与量（0.8nモル）において、こ
の発明のβ−rANPは尿排泄量を約14倍に増加せしめ、ナ
トリウムの排泄量を約18倍に増加せしめた。又、被験化
合物を投与しない場合の尿中のNa/K比がおよび0.3であ
るのに対し、β−rANPを0.8nモル投与した場合この比は
約1.25に上昇し、この発明のβ−rANPがNaを選択的に排
泄するナトリウム利尿剤として有用であることが示唆さ
れた。
NPは顕著な利尿作用及びナトリウム利尿作用を有する。
すなわち、この発明のβ−rANPを0.8nモル投与した場
合、その利尿作用及びナトリウム利尿作用は公知の利尿
剤であるフロセマイドを1.21μモル投与した場合のそれ
にほぼ匹敵する。この投与量（0.8nモル）において、こ
の発明のβ−rANPは尿排泄量を約14倍に増加せしめ、ナ
トリウムの排泄量を約18倍に増加せしめた。又、被験化
合物を投与しない場合の尿中のNa/K比がおよび0.3であ
るのに対し、β−rANPを0.8nモル投与した場合この比は
約1.25に上昇し、この発明のβ−rANPがNaを選択的に排
泄するナトリウム利尿剤として有用であることが示唆さ
れた。
さらに、被験物質を投与した後経時的に採尿して経過を
観察した場合の結果は第１図のようであった。この図か
ら明らかなごとく、この発明のβ−rANPの利尿作用及び
ナトリウム利尿作用は公知の利尿剤であるフロセマイド
のそれよりも急速に生じた。
観察した場合の結果は第１図のようであった。この図か
ら明らかなごとく、この発明のβ−rANPの利尿作用及び
ナトリウム利尿作用は公知の利尿剤であるフロセマイド
のそれよりも急速に生じた。
また、被験物質を静脈内投与した前後30分間に採尿した
場合の尿，ナトリウムイオン，カリウムイオン，塩素イ
オンとの相対比は第２表のとおりである。
場合の尿，ナトリウムイオン，カリウムイオン，塩素イ
オンとの相対比は第２表のとおりである。
この表からあきらかなごとくβ−rANPは等モル比でα−
hANPと同程度、フロセマイドの約1000倍の活性を有する
ことが示される。
hANPと同程度、フロセマイドの約1000倍の活性を有する
ことが示される。
β−rANPの利尿剤としての適性 前記のごとくこの発明のペプチドβ−rANPは顕著な利尿
作用及びナトリウム利尿作用を有する。
作用及びナトリウム利尿作用を有する。
このペプチドは繰返し投与しても抗体産生を惹起せず、
アナフィラキシーショックを起こさない。また、この発
明のペプチドはＬ−アミノ酸のみからなり、投与後、生
体内の各種プロテアーゼにより徐々に分解されるため毒
作用をほとんど有しない。
アナフィラキシーショックを起こさない。また、この発
明のペプチドはＬ−アミノ酸のみからなり、投与後、生
体内の各種プロテアーゼにより徐々に分解されるため毒
作用をほとんど有しない。
前記のごとく、β−rANPはμg/kgのオーダーで効果を発
揮し、毒性が非常に低いから、１μg/kg〜1mg/kgの範囲
で投与することができ、１μg/kg〜100μg/kgの範囲で
投与するのが好ましい。
揮し、毒性が非常に低いから、１μg/kg〜1mg/kgの範囲
で投与することができ、１μg/kg〜100μg/kgの範囲で
投与するのが好ましい。
この発明のβ−rANPは、ペプチド系医薬の投与に一般に
使用されている投与方法、すなわち非経口的投与方法、
例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等によって投
与するのが好ましい。経口投与した場合、β−rANPは消
化管内で分解を受けるためこの投与方法は一般的には効
果的でないが、消化管内で分解を受けにくい製剤、例え
ば活性成分であるβ−rANPをリポゾーム中に抱容したマ
イクロカプセル剤として経口投与することも可能であ
る。又、直腸，舌下，鼻内など消化管以外の粘膜から吸
収せしめる投与方法を採用することも可能であり、この
場合、例えば坐剤，舌下錠，点鼻スプレー剤等の形で投
与することができる。
使用されている投与方法、すなわち非経口的投与方法、
例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等によって投
与するのが好ましい。経口投与した場合、β−rANPは消
化管内で分解を受けるためこの投与方法は一般的には効
果的でないが、消化管内で分解を受けにくい製剤、例え
ば活性成分であるβ−rANPをリポゾーム中に抱容したマ
イクロカプセル剤として経口投与することも可能であ
る。又、直腸，舌下，鼻内など消化管以外の粘膜から吸
収せしめる投与方法を採用することも可能であり、この
場合、例えば坐剤，舌下錠，点鼻スプレー剤等の形で投
与することができる。
（Ｃ）β−rANPの製造方法 この発明のペプチドβ−rANPは、ラットの心房組織を適
当な酸性溶媒、例えば燐酸緩衝液，塩酸含有酢酸等の中
でホモジネートと、ヒナ直腸標本弛緩活性を指標とし
て、遠心分離，等電沈澱，溶媒抽出，限外過，ゲル
過，吸着クロマトグラフィー等、ペプチドの精製に常用
される各種処理を適宜組合わせて分子量約5000のペプチ
ドを分離することにより得られる。
当な酸性溶媒、例えば燐酸緩衝液，塩酸含有酢酸等の中
でホモジネートと、ヒナ直腸標本弛緩活性を指標とし
て、遠心分離，等電沈澱，溶媒抽出，限外過，ゲル
過，吸着クロマトグラフィー等、ペプチドの精製に常用
される各種処理を適宜組合わせて分子量約5000のペプチ
ドを分離することにより得られる。
また、この発明のペプチドβ−rANPは、ペプチドの合成
に常用される固相法、又は液相法によっても製造するこ
とができる。この合成は、例えば矢島治明、榊原俊平
著、日本生化学会編、生化学実験講座（Ｉ）；蛋白質の
化学、４巻、208〜495頁、（株）東京化学同人発行（19
77）；及び泉屋信夫ほか著、ペプチド合成、丸善（株）
発行（1975）に記載されているメリフィールド（Merrif
ield）等の方法に準じて行うことができる。
に常用される固相法、又は液相法によっても製造するこ
とができる。この合成は、例えば矢島治明、榊原俊平
著、日本生化学会編、生化学実験講座（Ｉ）；蛋白質の
化学、４巻、208〜495頁、（株）東京化学同人発行（19
77）；及び泉屋信夫ほか著、ペプチド合成、丸善（株）
発行（1975）に記載されているメリフィールド（Merrif
ield）等の方法に準じて行うことができる。
実施例１ 屠殺後すみやかに摘出したラットの心房（258匹から得
た）52.5gを、10倍量の1M酢酸で10分間煮沸することに
より内在するプロテアーゼを失活せしめた。これを冷却
した後、４℃において、ポリトロンミキサーでホモジナ
イズすることにより抽出した。得られた抽出液を12,000
×Ｇで30分間遠心分離を行い、上清420mlを得た。
た）52.5gを、10倍量の1M酢酸で10分間煮沸することに
より内在するプロテアーゼを失活せしめた。これを冷却
した後、４℃において、ポリトロンミキサーでホモジナ
イズすることにより抽出した。得られた抽出液を12,000
×Ｇで30分間遠心分離を行い、上清420mlを得た。
この上清を限外過（アミコン社製UM−２を使用）する
ことにより濃縮脱塩し、濃縮液50mlを得た。この濃縮液
に、アセトンを滴加してその最終濃度を66％にすること
によりアセトン沈澱を行い、沈殿を除去した後、その上
清を減圧下で濃縮乾固し、得られた残渣を100mlの1M酢
酸溶液に溶解した。この溶解液を1M酢酸溶液で平衡化し
たSP−セファデックス（Sephadex）Ｃ−25（ファルマシ
ア製,1.5×17.5cm）でゲル過した。
ことにより濃縮脱塩し、濃縮液50mlを得た。この濃縮液
に、アセトンを滴加してその最終濃度を66％にすること
によりアセトン沈澱を行い、沈殿を除去した後、その上
清を減圧下で濃縮乾固し、得られた残渣を100mlの1M酢
酸溶液に溶解した。この溶解液を1M酢酸溶液で平衡化し
たSP−セファデックス（Sephadex）Ｃ−25（ファルマシ
ア製,1.5×17.5cm）でゲル過した。
溶出液として、1M酢酸溶液,2Mピリジン溶液、及び2Mピ
リジン−1M酢酸溶液（pH5.0）を用い、この順序で溶出
を行い、それぞれフラクションSP−I,SP−II,SP−IIIを
得た。このフラクションSP−IIIを凍結乾燥することに
より凍結乾燥物113mgを得、これを1M酢酸溶液に溶解
し、セファデックスＧ−25によりゲル過（カラムサイ
ズ1.8×135cm;流速10.2ml/時間；フラクションサイズ5m
l）した。これにより、ヒナ直腸筋標本弛緩活性を有す
るβ画分（フラクションNo.42〜51,分子量約5000）を得
た。この溶出パターンを第２図に示す。このβ画分のフ
ラクションNo.47〜51を一つに合せ、陽イオン交換高速
液体クロマトグラフィー（HPLC）に付した。このクロマ
トグラフィーにおいては、TSK−CM2SW〔東洋曹達（株）
製カラム；カラム・サイズ7.6×300mm〕を用い、溶出溶
媒として（Ａ）10mM酢酸アンモニウム（pH6.6）：アセ
トニトリル（90:10）、及び（Ｂ）1.0M酢酸アンモニウ
ム（pH6.6）：アセトニトリル（90:10）を用い、直線グ
ラジェント法により酢酸濃度を10mMから0.75Mまで変化
させて140分間溶出し、単一のヒナ直腸筋標本弛緩活性
画分（フラクションNo.58,59、リテンションタイム121
〜130分）を得た。この結果を第３図に示す。次にこれ
を逆相HPLCに付した。このクロマトグラフィーにおいて
は、TSK LS−410 ODS SIL（サイズ4.0×250mm,東洋曹達
（株）製）を使用し、流速1.0ml/分とし、溶出溶媒は、
（Ａ）水：アセトニトリル:10％トリフルオロ酢酸（90:
10:1）、及び（Ｂ）水：アセトニトリル:10％トリフル
オロ酢酸（40:60:1）を使用した。まず（Ａ）を15分間
流した後、（Ａ）から（Ｂ）へ直線グラジェント法で、
合わせて60分間溶出した（第４図）。主要ピークを分取
し、純粋なβ−rANPを90nモル（468μｇ）を得た。
リジン−1M酢酸溶液（pH5.0）を用い、この順序で溶出
を行い、それぞれフラクションSP−I,SP−II,SP−IIIを
得た。このフラクションSP−IIIを凍結乾燥することに
より凍結乾燥物113mgを得、これを1M酢酸溶液に溶解
し、セファデックスＧ−25によりゲル過（カラムサイ
ズ1.8×135cm;流速10.2ml/時間；フラクションサイズ5m
l）した。これにより、ヒナ直腸筋標本弛緩活性を有す
るβ画分（フラクションNo.42〜51,分子量約5000）を得
た。この溶出パターンを第２図に示す。このβ画分のフ
ラクションNo.47〜51を一つに合せ、陽イオン交換高速
液体クロマトグラフィー（HPLC）に付した。このクロマ
トグラフィーにおいては、TSK−CM2SW〔東洋曹達（株）
製カラム；カラム・サイズ7.6×300mm〕を用い、溶出溶
媒として（Ａ）10mM酢酸アンモニウム（pH6.6）：アセ
トニトリル（90:10）、及び（Ｂ）1.0M酢酸アンモニウ
ム（pH6.6）：アセトニトリル（90:10）を用い、直線グ
ラジェント法により酢酸濃度を10mMから0.75Mまで変化
させて140分間溶出し、単一のヒナ直腸筋標本弛緩活性
画分（フラクションNo.58,59、リテンションタイム121
〜130分）を得た。この結果を第３図に示す。次にこれ
を逆相HPLCに付した。このクロマトグラフィーにおいて
は、TSK LS−410 ODS SIL（サイズ4.0×250mm,東洋曹達
（株）製）を使用し、流速1.0ml/分とし、溶出溶媒は、
（Ａ）水：アセトニトリル:10％トリフルオロ酢酸（90:
10:1）、及び（Ｂ）水：アセトニトリル:10％トリフル
オロ酢酸（40:60:1）を使用した。まず（Ａ）を15分間
流した後、（Ａ）から（Ｂ）へ直線グラジェント法で、
合わせて60分間溶出した（第４図）。主要ピークを分取
し、純粋なβ−rANPを90nモル（468μｇ）を得た。
第１図はこの発明のβ−rANPの利尿作用及びナトリウム
利尿作用の時間経過をフロセマイド及びα−hANPと比較
して示したものであり、第２図はゲル過におけるβ−
rANPの溶出を示し、そして第３図はイオン交換高速液体
クロマトグラフィーにおけるβ−rANPの溶出を示し、そ
して第４図は逆相クロマトグラフィーの結果を示す。
利尿作用の時間経過をフロセマイド及びα−hANPと比較
して示したものであり、第２図はゲル過におけるβ−
rANPの溶出を示し、そして第３図はイオン交換高速液体
クロマトグラフィーにおけるβ−rANPの溶出を示し、そ
して第４図は逆相クロマトグラフィーの結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ. 167（Ｎｏ．２），Ｐ．352−356（1984)
Claims (2)
- 【請求項１】次の構造式（Ｉ）、 （式中と、と、及びとは直接に結合してい
る） で表わされるペプチド、及びその酸付加塩。 - 【請求項２】次の構造式（Ｉ）、 （式中、と、と、及びとは直接に結合して
いる） で表わされるペプチド又はその酸付加塩を含んで成る利
尿剤。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP59038816A JPH0794473B2 (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
| US06/706,381 US4657891A (en) | 1984-03-02 | 1985-02-27 | Diuretic peptide, and production and use thereof |
| EP85301364A EP0153865A3 (en) | 1984-03-02 | 1985-02-28 | Diuretic peptide, and production and use thereof |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59038816A JPH0794473B2 (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60184097A JPS60184097A (ja) | 1985-09-19 |
| JPH0794473B2 true JPH0794473B2 (ja) | 1995-10-11 |
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ID=12535788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| NZ212291A (en) * | 1984-06-08 | 1991-10-25 | Suntory Ltd | Peptide from human atrium cordis having diuretic action, dna coding therefor and pharmaceutical compositions thereof |
| DE3509958A1 (de) * | 1985-03-20 | 1986-09-25 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Monoklonale antikoerper gegen atriale, natriuretische peptide vom menschen |
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- 1984-03-02 JP JP59038816A patent/JPH0794473B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
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- 1985-02-27 US US06/706,381 patent/US4657891A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-02-28 EP EP85301364A patent/EP0153865A3/en not_active Ceased
- 1985-03-01 CA CA000475562A patent/CA1245636A/en not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１６７（Ｎｏ．２），Ｐ．３５２−３５６（１９８４） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0153865A2 (en) | 1985-09-04 |
| CA1245636A (en) | 1988-11-29 |
| EP0153865A3 (en) | 1987-07-15 |
| JPS60184097A (ja) | 1985-09-19 |
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