ES2303342T3

ES2303342T3 - Agentes antivirales obtenidos de extractos de plantas y su uso para el tratamiento de infecciones viricas.

Info

Publication number: ES2303342T3
Application number: ES97933463T
Authority: ES
Inventors: Hsiu-Hsien Tsai; Shie-Ming Hwang
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-07-09
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 2008-08-01
Anticipated expiration: 2017-07-09
Also published as: NZ333707A; EP0914139B1; US5837257A; AU3664297A; CA2271622C; KR20000023648A; BR9710355A; DE69738535D1; KR100511514B1; JP2001516337A; WO1998001144A1; DE69738535T2; ATE387208T1; AU742854B2; EP0914139A2; CA2271622A1; US6214350B1; US5989556A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES DERIVADAS DE MEDICINAS CHINAS A BASE DE HIERBAS, PLANTAS MEDICINALES Y SUS EXTRACTOS, Y A SU USO PARA EL TRATAMIENTO DE ANIMALES INFECTADOS CON VIRUS, ESPECIALMENTE CON EL VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB), EL VIRUS DE LA HEPATITIS C (VHC) Y EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH). MAS CONCRETAMENTE, LAS COMPOSICIONES DE LA PRESENTE INVENCION SE DERIVAN DE DIVERSAS MEDICINAS CHINAS A BASE DE HIERBAS O PLANTAS MEDICINALES QUE TIENEN UN PROLONGADO HISTORIAL DE CONSUMO HUMANO. LAS COMPOSICIONES DE LA INVENCION SE OBTIENEN A TRAVES DE TECNICAS ESPECIFICAS Y HAN DEMOSTRADO UNA EXCELENTE EFICACIA PARA EL TRATAMIENTO DE LOS PORTADORES HUMANOS DEL VHB Y DE LOS PACIENTES DE HEPATITIS C. LAS COMPOSICIONES SEGUN LA INVENCION HAN MOSTRADO IGUALMENTE ACTIVIDADES ANTIVIRALES IN VITRO CONTRA EL VIRUS DE LA LEUCEMIA MURINA (VLMU) Y EL VIH. EL VIH ES EL VIRUS QUE SE SABE QUE PROVOCA EL SINDROME DE LA INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA (SIDA) EN LOS HUMANOS, Y EL SIDA PRESENTA PROBLEMAS ESPECIALES A LA COMUNIDAD MEDICA, QUE TRATA DE SOLUCIONAR LA PRESENTE INVENCION.

Description

Agentes antivirales obtenidos de extractos de plantas y su uso para el tratamiento de infecciones víricas.

Campo de la técnica

Esta invención se refiere a composiciones de la materia que comprenden componentes activos antivirales derivados de medicinas de hierbas chinas, plantas medicinales y extractos de las mismas, y a su uso para el tratamiento de humanos o animales infectados con virus, especialmente con el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV), y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). De forma más específica, las composiciones de la materia de la presente invención son derivadas de varias medicinas de hierbas chinas o de plantas medicinales que tienen una larga historia de consumo humano. Las composiciones de la materia de la invención se obtienen mediante técnicas específicas y han demostrado una eficacia destacable para el tratamiento de pacientes con hepatitis C y portadores de HBV. Las composiciones de la materia de acuerdo con la invención también han mostrado actividades antivirales in vitro frente al virus de la leucemia de murinos (MuLV) y VIH. El VIH es el virus conocido por causar el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en humanos y el SIDA presenta problemas especiales para la comunidad médica a los que está dirigida la presente invención. Se han aislado los principios activos de las medicinas de hierbas con principios activos antivirales individuales o plantas medicinales o los extractos de las mismas mediante técnicas de aislamiento específicas y han sido caracterizados mediante el uso de técnicas químicas aceptadas.

Antecedentes

La ciencia médica moderna está constantemente buscando nuevos y más poderosos agentes para prevenir, tratar o retardar infecciones bacterianas y víricas y curar las enfermedades que las causan. Las infecciones bacterianas y víricas de los humanos y de los animales domésticos cuestan billones de dólares anualmente. Las compañías farmacéuticas gastan cada año vastas sumas de dinero para identificar, caracterizar, y producir nuevos antibióticos y antivirales para combatir las cepas resistentes a los fármacos emergentes que se han transformado en un serio problema. Los tratamientos profilácticos de confianza para la prevención de enfermedades son también de mayor interés. Sin embargo, a pesar de los costes y de los esfuerzos para identificar tratamientos para las infecciones virales, las infecciones como la hepatitis y el SIDA, carecen todavía de terapias efectivas.

La hepatitis es una enfermedad del hígado humano. Se manifiesta con inflamación del hígado y está normalmente causada por las infecciones virales y algunas veces por agentes tóxicos. La hepatitis puede progresar a cirrosis del hígado, cáncer de hígado, y eventualmente la muerte. Es conocido que varios virus tales como los de la hepatitis A, B, C, D, E y G causan varios tipos de hepatitis víricas. Entre ellos, el HBV y el HCV son los más serios. El HBV es un virus del ADN con un tamaño del virión de 42 nm. El HCV es un virus de ARN con un tamaño de virión de 30-60 nm. Ver D. S. Chen, J. Fornos. Med. Assoc., 95 (1), 6-12 (1996).

La hepatitis B es un problema de salud importante en el mundo entero, especialmente en Asia y África. Aproximadamente 300 millones de personas están infectadas de forma crónica con el HBV en todo el mundo. Más de un millón de portadores de HBV se encuentran en los Estados Unidos. La infección del HBV es normalmente la causa principal de la cirrosis del hígado y del cáncer. Los portadores de HBV son no sólo reservas a largo plazo del virus sino también pueden desarrollar la enfermedad del hígado crónica y tienen un riesgo muy incrementado de desarrollar cirrosis del hígado y cáncer. La progresión a partir de la hepatitis B crónica a cirrosis es frecuentemente insidiosa y se produce sin un cambio destacable en los síntomas. Una vez los síntomas de la cirrosis o del cáncer se han manifestado, las terapias son de escaso valor.

La prevención de la infección del HBV es posible mediante vacunación que es segura y efectiva. Sin embargo, la vacunación no es efectiva en el tratamiento de aquellos ya infectados, es decir, los portadores y los pacientes. Se han utilizado muchos fármacos en el tratamiento de la hepatitis B crónica y ninguno ha demostrado ser efectivo, excepto el interferón. El tratamiento con interferón tiene un éxito limitado y ha estado frecuentemente asociado con efectos secundarios adversos tales como fatiga, fiebre, resfriados, dolores de cabeza, mialgias, artralgias, alopecia moderada, efectos psiquiátricos y trastornos asociados, fenómenos auto-inmunes y trastornos asociados y disfunción de la tiroides. El tratamiento con interferón durante dieciséis (16) semanas) ha demostrado ser efectivo con una pérdida sostenida de replicación viral en aproximadamente un 40% de los pacientes de hepatitis B. La gran mayoría de los que responden tienen unos niveles de aminotransferasa en suero normales y los porcentajes de recaídas parecen ser bajos. Ver R. P. Perrillo, Digestive Diseases and Sciences, 38 (4), 577-593 (1993). Sin embargo, se ha descrito un mayor porcentaje de recaídas a largo plazo (24%) en los pacientes chinos con hepatitis B crónica que provenían de la terapia con interferón. Ver A. S. F. Lok, H. T. Chung, V. W. S. Liu, & O. C. K. Ma, Gastroenterology, 105 (6), 1833-1838 (1993).

Además, el antígeno de la superficie de la hepatitis B en suero (HBsAg) desapareció en el 10-15% de los pacientes tratados con interferón. La pérdida de HBsAg coincidió con la desaparición del HBV. La mejoría de la histología del hígado fue mantenida años después en los pacientes negativos al HBsAg. La falta de progresión de la enfermedad pudo posiblemente, de este modo, dar lugar a la prevención del cáncer de hígado cuando el tratamiento se proporciona en la etapa de la infección pre-cirrótica. Ver R. P. Perrillo, Digestive Diseases and Sciences 38 (4), 577-593 (1993).

La hepatitis C ha sido previamente descrita como una hepatitis no-A no-B, que está causada por HCV. Hay aproximadamente 100 millones de portadores de HCV en todo el mundo. Un estimado de 3,5 millones de personas tienen hepatitis C crónica en los estados Unidos. La infección del HCV conducirá a cirrosis del hígado y cáncer con una menor manifestación clínica. La mayoría de los pacientes de hepatitis C no tienen síntomas particulares y de este modo pueden fácilmente ser pasados por alto hasta que es demasiado tarde para la terapia. Esto supone un problema potencialmente más serio que la hepatitis B. Los portadores de HCV también se transforman en reservas a largo plazo del virus y eventualmente desarrollan la enfermedad de hígado crónica y tienen un riesgo más incrementado de desarrollar la cirrosis del hígado y cáncer. Ver D. S. Chen., Science, 262, 369-370 (1993).

Actualmente no es asequible una inmunización efectiva, y la hepatitis C sólo puede ser controlada por medidas preventivas tales como la mejoría en la higiene y las condiciones sanitarias y la interrupción de la vía de transmisión. Actualmente, el único tratamiento aceptable para la hepatitis C crónica es el interferón que requiere al menos seis (6) meses de tratamiento. El tratamiento inicial tiene un porcentaje de respuesta de aproximadamente el 50%. Sin embargo, la mitad de los que responden recaen después del cese del tratamiento con interferón. Por consiguiente, sólo aproximadamente el 25% de los pacientes tienen una respuesta sostenida. Ver D. S. Chen, J. Formos. Med. Assoc., 95 (1), 6-12 (1996) y N. Terrault & T.Wright, New Engl. J. Med., 332 (22), 1509-1511 (1995). Debido a que la terapia con interferón tiene una eficacia limitada y a los frecuentes efectos adversos, se precisa un régimen más efectivo.

El SIDA (AIDS) es una enfermedad mortal causada por el VIH. Ha venido siendo una plaga a nivel mundial desde la primera descripción de la enfermedad en 1981 y el descubrimiento de su primera agente causante, el VIH, en 1983. Aproximadamente 13 millones de personas fueron infectadas con el VIH en el mundo entero en 1993 y el número ha incrementado hasta aproximadamente 21 millones en 1996. Ver B. Jasny, Science, 260 (5112), 1219 (1993) y P. Piot, Science, 272 (5270), 1855 (1996).

Se han aprobado varios fármacos para el tratamiento de esta enfermedad devastadora, tales como la azidovudina (AZT), didanosina (dideoxiinosina, ddI), d4T, zalcitabina (dideoxicitosina, ddC), nevirapina, lamivudina (epivir, 3TC), saquinavir (Invirase), ritonavir (Norvir), indinavir (Crixivan), y delavirdina (Rescriptor). Ver M. I. Johnston & D. F. Hoth, Science, 260 (5112), 1286-1293 (1993) y D. D. Richman, Science, 272 (5270), 1886-1888 (1996).

Todos los fármacos actualmente aprobados para el tratamiento del SIDA utilizan la inhibición de la proliferación viral y la inhibición de la transcriptasa reversa viral o los inhibidores de la proteasa viral. Se encuentran en desarrollo más inhibidores de la proteasa, tales como el nelfinavir y el saquinavir mejorado. Se ha ensayado una vacuna del SIDA (la vacuna de Salk) y se ha descubierto que varias proteínas que son quimioquinas a partir del CD8 actúan como supresores del VIH.

Además de los anteriores análogos de nucleósidos sintéticos, proteínas, y anticuerpos, se ha encontrado que varias plantas y sustancias derivadas de las plantas tienen actividad anti-VIH in vitro, tales como la Lonicera japonica y la Prunella vulgaris, y la glicirricina de la Glycyrrhiza radix. Ver R. S. Chang & H. W. Yeung, Antiviral Research, 9, 163-175 (1988) y M. Ito, y otros, Antiviral Research, 7 127-137 (1987).

A pesar de todos los fármacos asequibles para el tratamiento del VIH, todavía no hay cura para la enfermedad mortal. Los virus del VIH continúan mutando y se vuelven resistentes a los fármacos existentes tales como la transcriptasa reversa y los inhibidores de la proteasa. Recientemente, se ha encontrado efectiva una terapia utilizando dos (2) o tres (3) fármacos anti-VIH en combinación para disminuir de forma significativa las cargas de VIH en los pacientes de SIDA. Los resultados han sido prometedores. Sin embargo, los virus continúan desarrollando resistencia a los fármacos y los resultados a largo plazo (porcentajes de supervivencia y de curación) son todavía desconocidos. De este modo, las comunidades médicas de todo el mundo continúan investigando para encontrar fármacos que puedan prevenir las infecciones de VIH, tratar los portadores de VIH para prevenir que progresen hasta SIDA mortal, y para tratar los pacientes de SIDA.

Medicinas de Hierbas

El uso de fármacos de hierbas y remedios caseros ha sido conocido durante miles de años en China. Estas aproximaciones herbales para el tratamiento de numerosas enfermedades, desde la artritis a las infecciones virales, han sido previamente consideradas por la medicina occidental como no efectivas y peligrosas. Durante el siglo 19, muchos remedios caseros conteniendo hierbas fueron patentados y vendidos. Los fármacos modernos han reemplazado estos remedios, pero muchos fármacos modernos contienen ingredientes derivados de hierbas. Por ejemplo, en 1776 el botánico y físico inglés William Withering aprendió que un té herbal preparado por una mujer de una vieja granja era efectivo en el tratamiento de edema, o exceso de agua en los tejidos, que estaba causado por la incapacidad del corazón en bombear suficientemente fuerte. Encontró que un ingrediente del té, que estaba preparado a partir de hojas de la planta dedalera, fortaleciendo la capacidad de bombeo del corazón. El fármaco preparado de la planta dedalera es ahora conocido como digitalis.

Los remedios caseros es un término relativamente moderno en el Occidente y ha venido a significar el cuidado y tratamiento de la enfermedad por medio de una variedad de medicinas herbales. En años recientes, los remedios caseros han venido siendo de interés incrementado para mucha gente en la comunidad médica científica de Occidente.

Estado de la Técnica - Medicinas Herbales

Una medicina herbal china conocida como AEGINETIAE HERBA ha sido tradicionalmente utilizada para tratar enfermedades tales como hinchamiento y garganta irritada, infección del tracto urinario, osteomielitis, furúnculos, tonsilitis, bocio, faringitis, tiroiditis, enteritis, enfermedad del hígado, cáncer, reumatismo, hematemesis, neurastenia, rojez de ojos, almorranas, irregularidad menstrual, edema, ictericia, hernia, mordeduras de serpientes, y retardo en el desarrollo infantil. La AEGINETIAE HERBA se prepara a partir de la planta entera seca de Aeginetia indica que pertenece a la familia de la Orobanchaceae. La dosis de tratamiento que utiliza la planta seca es de forma típica entre 4 y 150 g por día. Debe señalarse que la planta tiene un sabor amargo y es tóxica.

Okubo y otros describen que un extracto de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,2 entre temperatura ambiente y 4ºC) obtenido de las semillas de Aeginetia indica muestra un excelente efecto carcioestático y posee potencia de inducción de la interleuquina-2 y el interferón-\gamma. El PBS fue una solución salina fisiológica tamponada con fosfato 0,1 M a pH 7,2, que no contenía iones calcio o magnesio. La sustancia extraída se conoce que es un polisacárido macromolecular que puede o no contener lípido A unido con proteína dependiendo de si la extracción es llevada a cabo utilizando butanol o fenol. La sustancia extraída fue soluble en agua e insoluble en n-butanol. Su peso molecular estuvo comprendido entre el intervalo de 100.000 a 200.000 daltons. Ver S. Okubo, M. Sato, & K. Himeno, patente U. S. No. 5.366.725, concedida el 22 de Noviembre de 1994.

Una medicina herbal china conocida como BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX ha sido utilizada de forma tradicional para tratar numerosas enfermedades tales como fiebre, flemones, erisipelas, garganta dolorida e hinchada, dolor de cabeza, ictericia, peste, leucorrea, y sífilis. La BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX se prepara a partir de rizoma y raíces secas de Baphicacanthes cusia, Strobilanthes cusia, Isatis tinctoria, isatis indigotica, o Polygonum tinctorium. Se ha descrito que esta medicina herbal ha mostrado inhibición del virus del resfriado in vitro. Una decocción de hervir la raíz de Isatis tinctoria en agua también mostró un efecto antibacteriano. La Baphicacanthes cusia y la Strobilanthes cusia pertenecen a la familia de Acanthaceae. La Isatis tinctoria y la Isatis indigotica pertenecen a la familia de Cruciferae. El Polygonum tinctorium pertenece a la familia de Polygonaceae. Las dosis de tratamiento son de forma típica entre 10 y 19 g por día para BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX.

Ho y otros describen el uso de un extracto de una mezcla de hierbas incluyendo Isatis tinctoria para la inhibición in vitro de la infección del VIH en células de linfocitos T de humanos y células de linaje fagocítico mononuclear. La actividad estuvo basada en los resultados de los ensayos de un extracto de agua de una mezcla de tres hierbas: Isatis tinctoria (o Isatis indigotica), Lonicera japonica, y Polygonum bistorta. Ver D. D. Ho & X. S. Li, patente U. S. No. 5.178.865, concedida el 12 de Enero de 1993.

Se ha identificado un compuesto conocido como triptantrina como el principal agente antifúngico en la hoja de la Strobilanthes cusia y como la principal sustancia antidermatifítica en la hoja de Polygonum tinctorium y Isatis tinctoria. Ver H. Y. Hsu, Y. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Vol. 2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 758-759 (1985).

La medicina herbal china conocida como BLECHNI RHIZOMA, que también es conocida como DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE RHIZOMA ha sido utilizada de forma tradicional para tratar enfermedades tales como daños de cortes, hinchamiento, fiebre, sarampión y erisipelas. La BLECHNI RHIZOMA se prepara a partir de raíces y tallos secos de Blechnum orientale que pertenece a la familia de Polypodiaceae o Blechnaceae. La DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE RHIZOMA es preparada a partir de raíces y tallos de Dryopteris crassirhizoma que pertenece a la familia de Aspidiaceae. También se han utilizado la Osmunda japonica (de la familia Osmundaceae), Woodwardia orientales y Woodwardia unigemmata (de la familia Blechnaceae), Athyrium acrostichoides (de la familia Aspidiaceae o Athyriaceae), Sphaeropteris lepifera (de la familia Cyatheaceae), Cyrtomium falcatum, y Cyrtomium fortunei (de la familia Aspidiaceae) para la preparación de estas medicinas herbales. Estas medicinas herbales tienen un sabor amargo y son astringentes y ligeramente tóxicas. Las dosis de tratamiento son de forma típica de entre 4 y 11 g por día.

El Blechnum orientale también ha mostrado un fuerte efecto de inhibición frente al virus de la gripe. El filmarone, la filicina, la aspidina, la albaspidina, y el ácido filícico que se encuentran en la Dryopteris crassirhizoma han sido caracterizados por tener un efecto antihelmíntico. Ver H. Y. Hsu, Y. P. Chen, S. G. Hsu, C. J. Chen & H. C. Chang, Concise Pharmacognosy, New Medicine Publishing Co. Taipei, R.O.C., 577-578 (1985); y H. Y. Hsu, Y. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 249-250 (1982).

Hozumi y otros, describen el rizoma de Dryopteris crassirhizoma como un agente contra el virus del herpes, un agente contra el virus de la polio, y un agente contra el virus de la varicela-zoster. El rizoma de Cyrtomium fortunei y el rizoma de Woodwardia orientalis son también descritos como agentes contra el virus del herpes, agentes contra el virus de la polio, contra el virus del sarampión, contra el virus de la varicela zoster, y agentes (CMV) contra los citomegalovirus, así como un agente de virus anti-ADN y anti-ARN. Ver T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba,
K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, patente U. S. No. 5.411.733, concedida el 2 de Mayo de 1995.

Una medicina herbal china conocida como BLETILLAE TUBER ha sido utilizada de forma tradicional para tratar enfermedades tales como la hemoptisis, la epistaxis, la hematemesis, los flemones, quemaduras, piel seca y agrietada, tuberculosis, úlcera gástrica, y dolores. El BLETILLAE TUBER tiene propiedades astringentes, antibacterianas y antifúngicas. El BLETILLAE TUBER se prepara a partir de tubérculo seco de Bletilla striata que pertenece a la familia de Orchidaceae. El BLETILLAE TUBER tiene un sabor agridulce, astringente y no es tóxico. La dosis de tratamiento es de forma típica de entre 2 y 11 g por día para de humano medio.

Las medicinas herbales chinas conocidas como CIRSII RHIZOMA ET RADIX y BREEAE RADIX se han utilizado tradicionalmente para tratar enfermedades tales como la hematesis, la hepatitis infecciosa aguda, las heridas por cortes, las irritaciones, y los flemones. El CIRSII RHIZOMA ET RADIX está preparado a partir del rizoma o las raíces secas de la planta o plantas enteras tales como Cirsium japonicum, Cirsium albescens, y Cirsium japonicum var. Australe que pertenecen a la familia de las Compositae. El BREEAE RADIX se prepara a partir de las raíces secas de plantas de la familia Compositae tales como la Breea segetum (también conocida como Cephalanoplos segetum) y la Breea setosum. Ambas medicinas herbales tienen un sabor dulce y ligeramente amargo, y no son tóxicas. La dosis de tratamiento es de forma típica de entre 5 y 75 g por día para el humano medio.

Una medicina herbal china conocida como DICHONDRAE HERBA se ha utilizado de forma tradicional para tratar enfermedades tales como la ictericia, la disentería, la gonorrea, edema, furúnculos inflamados, convulsión, encefalitis, reumatismo, hernia, diabetes mellitas, e hipertensión. La DICHONDRAE HERBA se prepara a partir de la planta entera seca de Dichondra repens ode la Dichondra micrantha que pertenece a la familia de Convolvulaceae. La planta tiene sabor amargo y no es tóxica. La dosis de tratamiento de la planta seca es de forma típica de entre 10 y 40 g por día. Se han identificado nueve (9) compuestos que se aislaron de los extractos con n-hexano y etanol de la planta entera de Dichondra micrantha. Estos compuestos son el maltol, la umbelliferona, la escopoletina, el umbeliferon-7-O-glucopiranósido, la escopolina, la astragalina, la isoquercitrina, el kaempferol-3-O-rutinósido, y el quercetin-3-O-rutinósido. Ver C. J. Chou, L. C. Lin, S. Y. Hsu y C. F. Chen, J. Chin. Med., 4, (2), 143-149 (1993).

Una medicina herbal china conocida como FORSYTHIAE FRUCTUS ha sido utilizada de forma tradicional para tratar enfermedades tales como irritaciones, flemones, inflamación de los nódulos linfáticos, uretritis, e hipertensión. También se ha encontrado que inhibe diferentes bacterias y virus de la gripe. La FORSYTHIAE FRUCTUS se ha preparado ha partir del fruto maduro secado de la Forsythia suspensa, la Forsythia viridissima, o la Forsythia coreana que pertenecen a la familia Oleaceae. La medicina herbal tiene un sabor amargo y no es tóxica. La dosis de tratamiento está comprendida de forma típica entre 3 y 11 g por día.

Hozumi y otros describen que el fruto de la Forsythia suspensa es un agente contra el virus de la polio y un agente contra el virus del sarampión útil en el tratamiento de estas infecciones virales. Ver T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa & S. Kadota, patente U.S. No. 5.411.733, concedida el 2 de Mayo de 1995.

Se ha descrito que los compuestos forsitósido A (encontrado en la hoja de la Forsythia suspensa), el forsitósido B (encontrado en el tallo de la Forsythia coreana), y el fositósido C y el forsitósido D (encontrados en el fruto de la Forsythia suspensa) muestran una actividad antibacteriana frente al Staphylococcus aureus a una concentración de menos de 2 mM. También se ha descrito que el suspensasido (encontrado en el fruto de la Forsythia suspensa, probablemente al igual que el forsitósido C) muestra una actividad antibacteriana frente al Staphylococcus aureus Terashima con una concentración de inhibición mínima (MIC) de 2,6 mg/mL. Ver H. Y. Hsu, T. P. Chen & M. Hong, The Chemical Constituents of Oriental Herbs, Vol. 2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 53-55, 142-143 (1985).

De forma tradicional se ha utilizado una medicina herbal china conocida como HEDYOTIS (también conocida como OLDENLANDIAE HERBA) para tratar enfermedades tales como la infección de la uretra, la faringitis, la laringitis, la tonsilitis, la coccigodinia sub-aguda o crónica, la apendicitis, el cáncer intestinal, el daño de contusiones y la enfermedad de los ojos. También se ha encontrado que tiene actividad antibacteriana débil in vitro. La HEDYOTIS se prepara a partir de la planta completa secada de Hedyotis difusa (también conocida como Oldenlandia difusa) que pertenece a la familia de la Rubiaceae. La medicina herbal tiene sabor dulce y no es tóxica. La dosis de tratamiento está comprendida de forma típica entre 19 y 300 g por día.

Las medicinas herbales chinas conocidas como LESPEDAZAE HERBA y SENECINIS HERBA han sido utilizadas de forma tradicional para tratar enfermedades tales como la incontinencia urinaria, la gonorrea, el asma, el dolor de estómago, el debilitamiento y la extenuación general, la diarrea, el daño por contusión, el daño en los ojos, la rojez de ojos, la enfermedad renal, la enfermedad inflamatoria aguda, las cataratas, la disentería, la enteritis, la ictericia, la gripe, la septicemia, las irritaciones, la inflamación, y una enfermedad de la palma. La LESPEDEZAE HERBA se prepara a partir de la planta entera secada de Lespedeza cuneata que pertenece a la familia de las Leguminosae. La SENECINIS HERBA se prepara a partir de la planta completa secada de Senecio Scandens que pertenece a la familia Compositae. Los extractos de la Lespedeza cuneata y de la Senecio scandens han demostrado que tienen un efecto antibacteriano. Ambas hierbas tienen un sabor agrio, son astringentes y amargas. La dosis de tratamiento está comprendida de forma típica entre 4 y 40 g por día.

Una medicina herbal china conocida como LIGUSTRI FRUCTUS ha sido utilizada de forma tradicional como un tónico para tratar enfermedades tales como el insomnio, el estreñimiento, el pelo blanco prematuro, la tuberculosis de los nódulos linfáticos del cuello y el edema. La LIGUSTRI FRUCTUS se prepara a partir del fruto maduro secado del Ligustrum lucidum o del Ligustrum japonicum que pertenece a la familia de las Oleaceae. Las hojas del Ligustrum lucidum se han utilizado como un agente antipirético, analgésico, y anti-inflamatorio. Las hojas del Ligustrum japonicum también se han utilizado para tratar enfermedades tales como la oftalmalgia, la estomatitis ulcerativa, la mastitis, la inflamación, y las quemaduras. Los frutos del Ligustrum lucidum tienen un sabor amargo y no son tóxicos. La dosis de tratamiento de los frutos secos está comprendida de forma típica entre los 6 y 20 g por día. La de las hojas secadas está comprendida de forma típica entre los 40 y los 75 g por día.

Una medicina herbal china conocida como LONICERAE FLOS ha sido utilizada de forma tradicional para tratar enfermedades tales como la fiebre, enfermedades infecciosas agudas, sarampión, carbunco, disentería, enteritis, tiña y enfermedades similares de la piel. La LONICERAE FLOS se prepara a partir de brotes de flores secadas de Lonicera japonica o de Lonicera confusa. Ambas plantas pertenecen a la familia Caprifoliaceae. La flor de la Lonicera japonica tiene propiedades diuréticas, antipiréticas, anti-inflamatorias, anti-convulsivas, antibacterianas y antivirales. Los brotes de las flores también han sido utilizados como un diurético. La medicina herbal tiene un sabor dulce y no es tóxica. La dosis de tratamiento está comprendida de forma típica entre 11 y 75 g por día para el humano típico.

Ho y otros, describen la actividad anti-VIH in vitro de una mezcla de Lonicera japonica, Isatis tinctoria (o Isatis indigotica) y de Polygonum bistorta o una mezcla de Lonbicera japonica con Scutellaria baicalensis. Las extracciones con agua de las mezclas, el tratamiento con etanol y la absorción sobre carbón y precipitación han sido descritas para la preparación de la composición activa anti-VIH. Ver D. D. Ho & X. S. Li, patente U. S. No. 5.178.865, concedida el 12 de Enero de 1993. Se ha descrito que varios taninos tales como los cafeoilquinatos aislados de la Lonicera japonica tienen un efecto inhibitorio en la actividad de la transcriptasa reversa del VIH-1. Ver C. W. Chang, M. T. Lin, S. S. Lee, K. C. S. C. Liu, F. L. Hsu, & J. Y. Lin, Antiviral Research, 27, 367-374 (1995).

Una mezcla de los extractos acuosos de los brotes de la flor de Lonicera japonica y de los frutos de la Forsythia suspensa con los flavonoides crudos de la Scutellaria baicalensis han mostrado tener propiedades antibacterianas y antivirales. Un grupo de pacientes con enfermedad respiratoria severa fueron tratados con la mezcla y respondieron tan bien como un grupo control en la terapia antibiótica. Ver P. J. Houghton, Z. Boxu, & Z. Xisheng, Phytother. Res., 7, 384-386 (1993).

Una medicina herbal china conocida como PHELLODENDRI CORTEX ha sido utilizada de forma tradicional para tratar enfermedades tales como la disentería, diarrea, ictericia, deposiciones con sangre, dolor abdominal, indigestión, enteritis bacteroide, y diarrea tuberculoide. La medicina herbal también ha sido utilizada para preparar un lavado de ojos, para fortalecer el estómago y el intestino, para estimular el apetito, y como un astringente, anti-inflamatorio, etc. Tiene propiedades antibacterianas, anti-inflamatorias, y cicatrizantes de heridas. La PHELLODENDRI CORTEX se prepara a partir de la corteza secada de plantas de la familia Rutaceae tales como el Phellodendron amurense, el Phellodendron chinense, el Phellodendron amurense var. Sachalinense, y el Phellodendron wilsonii. La PHELLODENDRI CORTEX tiene un sabor amargo y no es tóxico. Las dosis de tratamiento están comprendidas de forma típica entre 1 y 11 g por día.

Hozumi y otros describen la corteza del Phellodendron amurense como agente contra el virus del herpes, contra el virus de la polio, contra el virus del sarampión, contra el virus de la varicela zoster, y anti-CMV, así como agente anti virus de ADN y anti virus de ARN. Ver T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, patente U.S. No. 5.411.733, concedida el 2 de mayo de 1995.

Una medicina herbal china conocida como POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMA ha sido utilizada de forma tradicional para tratar enfermedades tales como la disentería, la menorragia, la dismenorrea, la disuria, el retardo en el crecimiento infantil, y la apendicitis. La POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMA se prepara a partir del rizoma secado del Polygonum cuspidatum, del Polygonum runcinatum, o del Polygonum reynoutria (también conocida como Reynoutria japonica) que pertenece a la familia de las Polygonaceae. Las hojas tiernas también se han utilizado para tratar las contusiones y las heridas de cortes. El extracto de la medicina herbal ha mostrado efectos antibacterianos y antivirales in vitro. El uso excesivo de la medicina herbal puede causar una ligera diarrea. La medicina herbal tiene un sabor amargo y la dosis de tratamiento está comprendida de forma típica entre 6 y 40 g por día.

Hozumi y otros describen las raíces y los rizomas del Polygonum cuspidatum como un agente contra el virus del herpes, un agente contra el virus de la polio, un agente contra el virus de la varicela zoster, y anti-CMV. Ver T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, patente U.S. No. 5.411.733, concedida el 2 de Mayo de 1995.

Se ha descrito el resveratrol como un componente anti-fúngico y anti-bacteriano en las raíces del Polygonum cuspidatum. Ver H. Y. Hsu, Y. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Vol. 2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 51 (1985).

Se ha utilizado una medicina herbal china conocida como PRUNELLAE SPICA para tratar enfermedades tales como el bocio, las hemorroides, la hinchazón de ojos, la oftalmalgia, la gonorrea, la enfermedad uterina, la mastitis, los abscesos de pecho, el cáncer de pecho, la artritis crónica, la conjuntivitis, y la hipertensión. La PRUNELLAE SPICA se prepara a partir de spica secada o de la planta entera de la Prunella vulgaris o de la Prunella vulgaris subs. Asiatica (también conocida como Prunella vulgaris var. Lilachina). Ambas plantas pertenecen a la familia Labiatae. La planta entera también puede ser utilizada como un diurético y también tiene efecto antibacteriano in vitro. La medicina herbal tiene sabor amargo y no es tóxica. La dosis de tratamiento está comprendida de forma típica entre 4 y 110 g por día para el humano promedio.

Hozumi y otros describen las espigas de la Prunella vulgaris como un agente contra el virus del herpes para el tratamiento de la infección por el virus del herpes. Ver T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, patente U. S. No. 5.411.733, concedida el 2 de Mayo de 1995. También se ha descrito que el extracto en agua de la Prunella vulgaris (hirviendo 3 g en 100 mL de agua durante 45 minutos) tiene actividad anti-VIH (cepa H9/3B). El extracto también muestra una actividad sinérgica anti-VIH con la zidovudina (AZT) y la didanosina (ddI). Sólo se observó un ligero efecto aditivo para la Prunella vulgaris y la zalcitabina (ddC). Ver J. F. John, R. Kuk, & A. Rosenthal, Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol., 94, 481 (1994).

Yamasaki y otros han evaluado in vitro doscientos cuatro (204) fármacos en crudo de uso común en Japón por su actividad anti-VIH-1 y han descrito que el extracto en agua caliente de la Prunella vulgaris (espigas) mostró una fuerte actividad in vitro anti-VIH-1 con una IC_{100} de 16 \mug/mL. Ver K. Yamasaki, T. Otake, H. Mori, M. Morimoto, N. Ueba, Y. Kurokawa, K. Shiota, & T. Yuge, Yakugaku Zasshi, 113 (11), 818-824 (1993).

Yao y otros han descrito que el extracto en agua de la planta entera secada de Prunella vulgaris fue activo en la inhibición in vitro de la replicación del VIH-1 con una relativamente baja toxicidad respecto a las células de MT-4. El extracto también fue activo en la inhibición de la transcriptasa reversa. El factor activo se purificó y se identificó como aniónico con un peso molecular de aproximadamente 10.000 daltons. Este componente activo puede ser el mismo que la prunellina, tal como se describe a continuación por Tabba, y otros El extracto purificado inhibió la replicación del VIH-1 en una línea de células linfoides MT-4, en la línea de células monocitoides U937, y en las células monocucleares de sangre periférica (PBMC) a concentraciones efectivas de 6, 30, y 12,5 \mug/mL, respectivamente. El pre-tratamiento de las células no infectadas con el extracto antes de la exposición viral no evitó la infección del VIH-1. La pre-incubación del VIH-1 con el extracto purificado disminuyó la infección de forma espectacular. El extracto purificado también fue capaz de bloquear la transmisión célula a célula del VIH-1, evitando la formación del sincitio, e interfiriendo con la capacidad tanto del VIH-1 como del gp120 purificado para unirse al CD4. El análisis de la PCR (reacción de la cadena de polimerasa) confirmó la ausencia de ADN proviral del VIH-1 en las células expuestas al virus en presencia del extracto. Los resultados sugirieron que el extracto purificado antagonizó la infección del VIH-1 de las células susceptibles impidiendo la unión viral del receptor del CD4. Ver X. J. Yao, M. A. Wainberg, & M. A. Parniak, Virology, 187 (1), 56-62 (1992).

Tabba y otros aislaron y caracterizaron de forma parcial un componente anti-VIH, la prunelina, a partir de los extractos acuosos de la inflorescencia secada de la Prunella vulgaris. La prunelina es un carbohidrato con una MIC (concentración inhibitoria mínima) de 2,2 \mug/mL frente al VIH-1 in vitro. Se identificó como un polisacárido parcialmente sulfatado con un peso molecular de aproximadamente 10.000 daltons. Ver H. D. Tabba, R. S. Chang, & K. M. Smith, Antiviral Research, 11, 263-273 (1989).

Zheng evaluó cuatrocientos setenta y dos (472) hierbas medicinales tradicionales para determinar el efecto antiviral en virus del herpes simplex 1 (HSV1). La Prunella vulgaris fue una de las diez hierbas que se encontró que eran altamente efectivas in vitro. Clínicamente, se trataron 78 casos de queratitis herpética debida al HSV1 con gotas para ojos de Prunella vulgaris y de Pyrrosia lingua. Entre ellos, 38 de los casos fueron curados de forma efectiva, 37 casos mostraron una mejoría, y 3 casos no mostraron ningún beneficio. Ver M. Zheng, J. Tradit. Chin. Med., 8 (3), 203-206 (1988).

El triterpeno 1 y el triterpeno 2 que se han aislado de la Prunella vulgaris han mostrado una actividad antiviral frente al HSV1. El triterpeno 1 se identificó como el ácido botulínico y el triterpeno 2 como el ácido 2\alpha,3\alpha-dihidroxiurs-12-en-28-oico. Se estimó que la EC_{50} era de 30 \mug/mL para el triterpeno 1 y de 8 \mug/mL para el triterpeno 2 por el ensayo de reducción de la placa. Ver S. Y. Ryu, C. K. Lee, C. O. Lee, H. S. Kin, & O. P. Zee, Arch. Pharmacal Res. (Seúl), 15 (3), 242-245 (1992).

Una medicina herbal china conocida como SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA ha sido utilizada de forma tradicional para tratar enfermedades tales como la hematemesis, la gonorrea con trazas de sangre, las irritaciones, el cáncer, las convulsiones, la neumonía, la enteritis, la coccigodinia, la apendicitis, el asma, la malaria, y el reumatismo. También se ha encontrado que posee efecto antibacteriano. Se preparó la SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA a partir de la planta entera secada de la Scutellaria barbata, la Scutellaria rivularis, o la Scutellaria dependens que pertenecen a la familia de Labiatae. La medicina herbal tiene un sabor amargo y no debe ser consumida por aquellos que tienen anemia. Las mujeres embarazadas deben evitar el tomar esta hierba. La dosis de tratamiento está comprendida de forma típica entre 4 y 300 g por día.

Se han utilizado las plantas enteras secas de la Scutellaria rivularis en los remedios caseros para el tratamiento de tumores, hepatitis, cirrosis del hígado, y otras enfermedades en China y Taiwan. Ver Y. L. Lin, Y. H. Kuo, G. H. Lee, y S. M. Peng, J. Chen. Research (S), 320-321 81987).

Se ha encontrado que la apigenina, aislada de la hierba entera de la Scutellaria rivularis, tiene actividad contra el virus de la gripe. Ver T. Nagai, y otros, Chem. Pharm. Bull., 38 (5), 1329-1332 (1990).

Se ha utilizado de forma tradicional una medicina herbal china conocida como SOLANI HERBA para tratar enfermedades tales como el bocio, la nefritis aguda, el cáncer y las irritaciones. La SOLANI HERBA se prepara a partir de la planta entera secada del Solanum rigrum que pertenece a la familia de las Solanaceae. El extracto de SOLANI HERBA ha demostrado propiedades anti-inflamatorias. La fruta también ha demostrado efectos en la supresión de la tos y el alivio de la inflamación bronquial. La medicina herbal tiene sabor amargo y ligeramente dulce, y no es tóxica. La dosis de tratamiento está comprendida de forma típica entre 11 y 60 g por día.

El componente solasonina (encontrado en la hierba entera, los frutos, las hojas y las bayas frescas no maduras del Solanum nigrum) tiene un efecto anti-inflamatorio similar a la cortisona. La solasonina y la solanina (también encontrada en el Solanum nigrum) poseen la capacidad de aumentar o disminuir el nivel de azúcar en sangre en ratas dependiendo de la situación de los animales. También se ha descrito que la solasonina tiene un efecto estimulante en el corazón, mientras que la solanina tiene un efecto supresor. Cuando se administra a pequeñas dosis, la solasonina incrementa el procedimiento estimulante del sistema nervioso central en animales (es decir, en ratas y conejos). Por otra parte, incrementa el procedimiento supresor cuando se administra a grandes dosis. La solasonina también puede disminuir la coagulabilidad de la sangre. Ver (1) H. Y. Hsu, Y. P. Chen, S. G. Hsu, J. S. Hsu, C. J. Chen & H. C. Chang, Concise Pharmacognosy, New Medicine Publishing Co., Taipei, R. O. C., 176-177 (1985); (2) H. Y. Hsu, Y. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U. S. A., 1400-1401, 1406 (1982); y (3) H. Y. Hsu, Y. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Vol. 2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 742 (1985).

Las combinaciones de medicinas herbales tales como la LONICERAE FLOS, la BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX, y la FORSYTHIAE FRUCTUS han sido utilizadas como agentes antipiréticos y desintoxicantes y para el tratamiento de la hepatitis aguda. Se han utilizado las medicinas herbales de BLECHENI RHIZOMA y POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMA junto con otras medicinas herbales en una fórmula para el tratamiento de la Hepatitis B. Las medicinas herbales SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA y LIGUSTRI FRUCTUS han sido añadidas de forma ocasional con otras medicinas herbales en la fórmula anterior para mejorar el tratamiento. La medicina herbal LIGUSTRI FRUCTUS ha sido utilizada de forma ocasional junto con otras medicinas herbales principalmente como una medicina tónica y la medicina herbal HEDYOTIS ha sido utilizada de forma ocasional junto con otras medicinas herbales como un agente desintoxicante. La medicina herbal PRUNELLAE SPICA también ha sido utilizada junto con otras medicinas herbales para aliviar el estrés del hígado.

Chang y Yeung seleccionaron los extractos en agua hirviendo de veintisiete (27) hierbas medicinales para la actividad anti-VIH. Encontraron que once (11) de los extractos eran activos en la inhibición del VIH en las células H9. La Lonicera japonica, la Prunella vulgaris, la Woodwardia unigemmata, y la Senecio scandens estuvieron entre el grupo de las activas con actividades moderadas. La Forsythia suspensa, la Isatis tinctoria, y la Polygonum cuspidatum estuvieron entre las ensayadas que no mostraron actividad en el ensayo anti-VIH. El extracto activo anti-VIH de la Viola yedoensis fue adicionalmente ensayado y se encontró que era bastante específico. El extracto no inactivó el VIH de forma extracelular y no inhibió el crecimiento de los virus del herpes simplex, del la polio, o de la estomatitis vesicular en cultivos de fibroblastos humanos. Ver R. S. Chang & H. W. Yeung, Antiviral Research, 9, 163-175 (1988).

Se han aislado agentes antivirales de la Syzygium aromaticum, de la Sapium sebiferum, de la Scutellaria baicalensis, y de la Scutellaria rivularis. El Eugeniin (un tanino) aislado de la Syzygium aromaticum y el galato de metilo aislado de la Sapium sebiferum mostraron actividad in vitro anti virus del herpes simples. También se ha descrito que los flavonoides de plantas, tales como la 5,7,4'-trihidroxi-8-metoxiflavona de la raíz de la Scutellaria baicalensis y la pigenina (5,7,4'-trihidroxiflavona) de la hierba entera de la Scutellaria rivularis, tienen actividad anti-virus de la gripe. Ver (1) T. Hozumi, y otros, patente U.S. No. 5.411.733 (1995); (2) M. Takechi & Y. Tanaka, Planta Medica, 42, 69-74 (1981); (3) C. J. M. Kane y otros, Bioscience Reports, 8, 85-94 (1988); y (4) T. Nagai, y otros, Chem. Pharm. Bull., 38 (5), 1329-1332 (1990).

Hozumi y otros, investigaron noventa y una (91) medicinas herbales que demostraron actividad antiviral. De forma más específica, cincuenta y dos (52) de ellas tuvieron actividad contra el virus del herpes, sesenta y cuatro (64) tuvieron actividad contra el virus de la polio, treinta y siete (37) tuvieron actividad contra el virus del sarampión, veintisiete (27) tuvieron actividad contra el virus de la varicela zoster, veintitrés (23) tuvieron actividad anti-CMV, y veintiocho (28) tuvieron actividad contra el virus del ADN y contra el virus del ARN. Ver. T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, patente U. S. No. 5.411.733, concedida el 2 de Mayo de 1995. La actividad anti virus del ADN y anti virus del ARN de las veintiocho (28) medicinas herbales descritas en la patente 5.411.733 estuvieron basadas en sus actividades contra el virus del herpes, contra el virus de la polio, contra el virus del sarampión, y/o contra el virus de la varicela zoster y anti-CMV. Sin embargo, la extrapolación para cubrir tanto las actividades anti virus del ADN y anti virus del ARN no encuentra fundamento en los experimentos que se llevaron a cabo.

Los datos de la presente invención, que se presentan a continuación, evidenciaron poca o ninguna actividad anti-VIH de las dos medicinas herbales a 2,5 y 0,5 mg/mL derivadas del rizoma de la Cyrtonium fortunei y de la corteza del Phellodendron amurense. Por el contrario, las tres (3) medicinas herbales que utilizaron la espiga de la Prunella vulgaris, el fruto de la Forsythia suspensa, y la raíz y el rizoma del Polygonum cuspidatum mostraron tener una actividad anti-VIH entre fuerte y moderada a 2,5 mg/mL. Otros autores también han descrito, al igual que se ha descrito anteriormente, que la Prunella vulgaris tiene una muy buena actividad anti-VIH.

Debe señalarse que en la práctica de la medicina tradicional china, se utilizaron las medicinas herbales para tratar los síntomas de los pacientes, no las enfermedades o los agentes que las causaban en sí mismas, y por consiguiente no se conoce que sean específicas de una enfermedad particular. Las medicinas herbales se prescribieron dependiendo de los síntomas del paciente individual. La composición de las medicinas herbales también varía caso por caso y puede incluso cambiar para cada paciente individual durante el curso del tratamiento de acuerdo con cada resultado del tratamiento. Por consiguiente es muy difícil describir una composición herbal en particular a partir del estado de la técnica adecuada para el tratamiento de una enfermedad específica.

La presente invención está dirigida al descubrimiento de composiciones herbales antivirales, de extractos de las mismas y de los constituyentes químicos activos de las mismas. Las composiciones herbales antivirales de esta invención son derivadas de hierbas individuales, mezclas de hierbas y medicinas herbales chinas comercialmente asequibles. Estas nuevas composiciones herbales y sus extractos y/o los principios activos han demostrado en la presente invención ser activos frente a enfermedades víricas tales como los portadores del HBV y del HCV, la hepatitis B, la hepatitis C, la infección del VIH y del SIDA.

Breve descripción de los dibujos

Para poner en conocimiento de las personas expertas en la materia de los principios de la invención, se hace referencia a los dibujos adjuntos que forman una parte de la presente memoria.

La Figura 1 es el perfil de UV de la HPSEC a 214 nm de la No. 5(5)E-A-AP1X, el componente activo precipitable en ácido purificado a tiempo uno de la No. 5(5)E-A en forma ácida; en donde la No. 5(5)E-A es la fracción de la No. 5(5) eluida en agua en C18-SPE-LC.

La Figura 2 es el perfil de UV de la HPSEC a 214 nm de la No. 5(5)E-C-AP, el componente activo precipitable en ácido de la No. 5(5)E-C en forma ácida; en donde la No. 5(5)E-C es la fracción de la No. 5(5) eluida en HCl al 1%/agua en C18-SPE-LC.

Para estas dos Figuras 1 y 2, la columna para el análisis por HPSEC (cromatografía de exclusión por tamaño de alta resolución) fue una columna Varian MicroPak de TSKgel-G3000 PW_{XL} (7,8 mm de diámetro interior x 30 cm de longitud) conectada en serie con una columna de protección TSK PW_{XL} (6,0 mm de diámetro interior x 4,0 cm de longitud), la fase móvil fue NH_{4}HCO_{3} 0,1 N a una velocidad de flujo de 0,80 mL/min, las muestras fueron preparadas en la fase móvil entre 0,92 y 0,93 mg/mL, y el volumen de inyección fue de 100 \muL.

La figura 3A es el perfil de UV de la HPSEC a 214 nm y la Figura 3B es el perfil de RI de la No. 5(5)E-A-AP1X. Las fracciones de la HPSEC recogidas se muestran como 6-18 y 7-12.

La Figura 4A es el perfil de UV de la HPSEC a 214 nm y la Figura 4B es el perfil de RI de la No. 5(5)E-C-AP. Las fracciones de la HPSEC recogidas se muestran como 6-18 y 7-12.

Las condiciones de la HPSEC para las Figuras 3A, 3B, 4A y 4B fueron las mismas que las de las Figuras 1 y 2 anteriores, excepto que las concentraciones de la muestra fueron de 6,1 a 6,2 mg/mL.

La Figura 5A es el perfil de UV de la HPSEC a 214 nm y la Figura 5B es el perfil de RI de la Fracción 8 de la HPSEC de la No. 5(5)E-C-AP purificada cromatográficamente. Las condiciones de la HPSEC fueron las mismas que las de las Figuras 1 y 2 anteriores, excepto que la fase móvil fue de NH_{4}HCO_{3} 0,2N y la concentración de la muestra fueron de 0,55 mg/mL.

La Figura 6A es el perfil de UV de la HPLC en C18 a 214 nm de la Fracción 8 de la HPSEC de la No. 5(5)E-C-AP purificada cromatográficamente y la Figura 6B es la de la Fracción 9 de la HPSEC de la No. 5(5)E-C-AP. La columna para el análisis de HPLC de C18 (cromatografía líquida de alta resolución de octadecilo) fue una columna de C18 de Rainin Microsorb-MV (partículas de 5 \mum, tamaño de poro de 100 \ring{A}, (4,6 mm de diámetro interior x 25 cm de longitud), la fase móvil fue NH_{4}HCO_{3} 0,1 N conteniendo etanol del 30% a una velocidad de flujo de 0,80 mL/min, la muestra se preparó en la fase móvil a 1,0 mg/mL, y el volumen de la inyección fue de 5 \muL.

La Figura 7 es el perfil de UV de la HPSEC a 214 nm de la No. 5(5)E-A-AP1X-NH_{4}, el componente activo precipitable de ácido purificado del tiempo uno de la No. 5/5)E-A en forma de sal de amonio.

Las condiciones de la HPSEC para esta Figura 7 y para las Figuras 13 y 17 de a continuación fueron las mismas para las de las Figuras 1 y 2 anteriores, excepto que la fase móvil fue de NH_{4}HCO_{3} 0,3 N conteniendo acetonitrilo del 30%, las muestras se prepararon en NH_{4}HCO_{3} 0,3 N, y las concentraciones de la muestra fueron de 0,65 mg/mL para la Figura 7 y de 1,4 mg/mL para las Figuras 13 y 17.

La Figura 8 es el perfil de UV de la HPSEC de la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo precipitable en ácido y extraíble en agua de la No. 5(5) en forma de la sal de amonio.

Las condiciones de la HPSEC para esta Figura 8 y para las Figuras 14, 18, 21, 24 y 27 de a continuación fueron las mismas que para las Figuras 1 y 2, excepto que las concentraciones de la muestra fueron de 1,0 mg/mL y el volumen de inyección fue de 50 \muL.

La Figura 9 es el gradiente del perfil de UV de la RP-HPLC de la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo extraíble en agua y precipitable en ácido de la No. 5(5) en forma de la sal de amonio.

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Para esta Figura 9 y para las Figuras 15, 19, 22, 25 y 28 de a continuación, la columna utilizada para el análisis de la RP-HPLC (cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa) fue una columna de PerSeptive Biosystems' POROS R2/H (4,6 mm de diámetro interior x 10 cm de longitud), la fase móvil fue bicarbonato amónico 0,1 N conteniendo etanol que varió entre el 2% y el 60% de acuerdo con el gradiente en la tabla 17 a una velocidad de flujo de 2,0 mL/min, las muestras se prepararon en bicarbonato amónico 0,1 N conteniendo un 2% de etanol a 1,0 mg/mL, y el volumen de la inyección fue de 20 \muL.

La Figura 10A es el espectro de UV de la No. 5(5)E-AP6X, la Figura 10B es el espectro de UV de la GE-AP6X, y la Figura 10C es el espectro de UV de la HE-AP6X. Se midieron los espectros de UV de las muestras en solución de bicarbonato amónico. No se utilizó ningún disolvente como blanco de corrección.

La Figura 11 es el espectro de IR de la No. 5(5)E-AP6X, el componente activo extraíble en agua y precipitable en ácido de la No. 5(5) en forma ácida.

La Figura 12 es el espectro de IR de la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo extraíble en agua y precipitable en ácido de la No. 5(5) en forma de sal amónica.

Para las Figuras 11 y 12 y para las Figuras 16, 20, 23, 26 y 29 de a continuación, el espectro de IR de cada muestra se determinó en pastilla de KBr.

La Figura 13 es el perfil de UV de la HPSEC a 214 nm del GE-AP, el componente activo de G extraíble en agua y precipitable en ácido, en forma ácida. Las condiciones de la HPSEC para esta Figura y para la Figura 17 de a continuación fueron las mismas que para las de la Figura 7 anterior, excepto que la concentración de la muestra fue de 1,4 mg/mL.

La Figura 14 es el perfil de UV de la HPSEC del GE-AP2X-NH_{4}, el componente activo de G extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica. Las condiciones de la HPSEC para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 8.

La Figura 15 es el perfil de UV de la RP-HPLC de gradiente del GE-AP2X-NH_{4}, el componente activo de G extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica. Las condiciones de la RP-HPLC de gradiente para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 9.

La Figura 16 es el espectro de IR del GE-AP2X-NH_{4}, el componente activo de G extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica.

La Figura 17 es el perfil de UV de la HPSEC a 214 nm del HE-AP, el componente activo de H extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de ácido. Las condiciones de la HPSEC para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 13.

La Figura 18 es el perfil de UV de la HPSEC del HE-AP1X-NH_{4}, el componente activo de H extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica. Las condiciones de la HPSEC para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 8.

La Figura 19 es el gradiente del perfil de UV de la RP-HPLC del HE-AP1X-NH_{4}, el componente activo de H extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica. Las condiciones de la RP-HPLC de gradiente para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 9.

La Figura 20 es el espectro de IR del HE-AP1X-NH_{4}, el componente activo de H extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica.

La Figura 21 es el perfil de UV de la HPSEC de la No. 5(8)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo de No. 5(8) extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica. Las condiciones de la HPSEC para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 8.

La Figura 22 es el gradiente del perfil de UV de la RP-HPLC de la No. 5(8)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo de la No. 5(8) extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica. Las condiciones de la RP-HPLC de gradiente para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 9.

La Figura 23 es el espectro de IR de la No. 5(8)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo de la No. 5(8) extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica.

La Figura 24 es el perfil de UV de la HPSEC de la No. 5(11)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo de la No. 5(11) extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica. Las condiciones de la HPSEC para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 8.

La Figura 25 es el gradiente del perfil de UV de la RP-HPLC de la No. 5(11)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo de la No. 5(11) extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica. Las condiciones de la RP-HPLC de gradiente para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 9.

La Figura 26 es el espectro de IR de la No. 5(11)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo de la No. 5(11) extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica.

La Figura 27 es el perfil de UV de la HPSEC de la No. 4(2)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo de la No. 4(2) extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica. Las condiciones de la HPSEC para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 8.

La Figura 28 es el gradiente del perfil de UV de la RP-HPLC de la No. 4(2)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo de la No. 4(2) extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica. Las condiciones de la RP-HPLC de gradiente para esta Figura fueron las mismas que las de la anterior Figura 9.

La Figura 29 es el espectro de IR de la No. 4(2)E-AP1X-NH_{4}, el componente activo de la No. 4(2) extraíble en agua y precipitable en ácido en forma de la sal amónica.

Un aspecto de la presente invención está dirigido a las composiciones de la materia que comprenden los componentes activos anti-VIH extraíbles en agua y precipitables en ácido obtenidos de varias medicinas herbales chinas o plantas medicinales caracterizadas por los perfiles de HPSEC de las Figuras 1, 2, 5A, 5B, 7, 8, 13, 14, 17, 18, 21, 24 y 27; los perfiles de la HPLC de C18 de las Figuras 6A y 6B; los perfiles de la RP-HPLC de gradiente de las Figuras 9, 15, 19, 22, 25 y 28; los espectros de UV de las Figuras 10A, 10B y 10C; y los espectros de IR de las Figuras 11, 12, 16, 20, 23, 26 y 29.

Resumen de la invención

Tal como se utiliza en la presente invención, se utilizará la siguiente nomenclatura para identificar las cuatro (4) mezclas de hierbas conocidas como HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45 y HHT888-54.

La HHT888-4, que no se encuentra dentro del alcance de la presente invención, es una mezcla de cinco (5) medicinas herbales chinas de una única hierba a una proporción preferida de No. 4(1) : No. 4(2) : No. 4(3) : No. 4(4) : No. 4(5) de aproximadamente 3 : 3 : 3 : 3 : 4 (peso/peso). La relación de pesos puede variaR hasta un 50% por componente. Por "variación de la relación de pesos en un 50%" se quiere significar que cada valor de cada componente de la relación puede ser incrementado o disminuido en un 50%. De este modo, como un ejemplo, 1 : 1 puede variar entre 1,5 : 0,5 hasta 0,5 : 1,5 (o 3 : 1 hasta 1 : 3).

La HHT888-5 es una mezcla de once (11) medicinas herbales chinas de única hierba, No. 5(1) hasta No. 5(11), preferiblemente en unas proporciones aproximadamente iguales en peso. La relación en peso puede variar hasta el 50% por componente.

La HHT888-45 es una mezcla de cuatro (4) hasta seis (6) medicinas herbales chinas en unas proporciones preferidas de No. 4(3) : No. 4(4) : No. 5(4) : No. 5(5) : No. 5(8) : No. 4(2) hasta aproximadamente 1 : 1 : 1 : 1 : 0-1 : 0-1 (peso/peso). El porcentaje de pesos puede variar hasta el 50% para cada componente.

La HHT888-54 es una mezcla de la No. 5(5) o H y al menos una medicina de única hierba seleccionada entre la No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 5(1), No. 5(2), No. 5(4), No. 5(7), No. 5(8) y No. 5(11), en donde el porcentaje de pesos preferidos de la No. 5(5) o H respecto a cada una de las otras medicinas herbales sea 1:1. De este modo, la HHT888-54, en una realización preferida consiste en la No. 5(5) o H más la No. 4(3), la No. 4(4), la No. 5(8) y la No. 5(11); la relación en pesos preferida es 1 : 1: 1 : 1 : 1. De forma más general, el porcentaje de pesos de la No. 5(5) o H respecto a la suma de las otras medicinas de única hierba está comprendida entre 1 : 10 y 10 : 1.

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Los componentes del HHT888-4 de única hierba son:

No. 4(1) =: HEDYOTIS (también conocida como OLDENLANDIAE HERBA)

\quad: Hedyotis difusa (también conocida como Oldenlandia difusa)

No. 4(2) =: SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA

\quad: Origen: Scutellaria barbata, Scutellaria rivularis, Scutellaria dependens

No. 4(3) =: LONICERAE FLOS

\quad: Origen: Lonicera japonica, Lonicera confusa

No. 4(4) =: PRUNELLAE SPICA

\quad: Origen: Prunella vulgaris, Prunella vulgaris subsp. asiatica (también conocida como Prunella vulgaris var. lilachina)

No. 4(5) =: SOLANI HERBA

\quad: Origen: Solanum nigrum

Los componentes del HHT888-5 de única hierba son:

No. 5(1) =: HEDYOTIS (también conocida como OLDENLANDIAE HERBA)

\quad: Origen: Hedyotis difusa (también conocida como Oldenlandia difusa)

No. 5(2) =: BLECHNI RHIZOMA o DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE RHIZOMA

\quad: Origen: Blechnum orientale, Dryopteris crassirhizoma, Osmunda japonica, Woodwardia orientales, Woodwardia unigemmata, Athyrium acrostichoides, Sphaeropteris lepifera, Cyrtomium falcatum, Cyrtomium fortunei

No. 5(3) =: CIRSII RHIZOMA ET RADIX y BREEAE RADIX

\quad: Origen: Cirsium japonicum, Cirsium albescens, Cirsium japonicum var. australe, Breea segetum (también conocida como Cephalanoplos segetum), Breea setosum

No. 5(4) =: LESPEDEZAE HERBA o SENECINIS HERBA

\quad: Origen: Lespedeza cuneata, Senecio scandens

No. 5(5) =: AEGINETIAE HERBA

\quad: Origen: Aeginetia indica

No. 5(6) =: BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX

\quad: Origen: Baphicacanthes cusia, Strobilanthes cusia, Isatis tinctoria, isatis indigotica, Polygonum tinctorium

No. 5(7) =: POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMA

\quad: Origen: Polygonum cuspidatum, Polygonum runcinatum, Polygonum reynoutria (también conocida como Reynoutria japonica)

No. 5(8) =: FORSYTHIAE FRUCTUS

\quad: Origen: Forsythia suspensa, Forsythia viridissima, Forsythia koreana

No. 5(9) =: PHELLODENDRI CORTEX

\quad: Origen: Phellodendron amurense, Phellodendron chinense, Phellodendron amurense var. sachalinense, Phellodendron wilsonii

No. 5(10) =: BLETILLAE TUBER

\quad: Origen: Bletilla striata

No. 5(11) =: LIGUSTRI FRUCTUS

\quad: Origen: Ligustrum lucidum, Ligustrum japonicum

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Los componentes del HHT888-45 de única hierba son:

No. 4(3) =: LONICERAE FLOS

\quad: Origen: Lonicera japonica, Lonicera confusa

No. 4(4) =: PRUNELLAE SPICA

No. 5(4) =: LESPEDEZAE HERBA o SENECINIS HERBA

\quad: Origen: Lespedeza cuneata, Senecio scandens

No. 5(5) =: AEGINETIAE HERBA

\quad: Origen: Aeginetia indica

No. 4(2) =: SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA (opcional)

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No. 5(8) =: FORSYTHIAE FRUCTUS (opcional)

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Los componentes del HHT888-54 de única hierba son:

No. 5(5) =: AEGINETIAE HERBA

\quad: Origen: Aeginetia indica; o

H =: DICHONDRAE HERBA

\quad: Origen: Dichondra repens o Dichondra micrantha; y al menos una seleccionada entre:

No. 4(2) =: SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA

No. 4(3) =: LONICERAE FLOS

\quad: Origen: Lonicera japonica, Lonicera confusa

No. 4(4) =: PRUNELLAE SPICA

No. 4(5) =: SOLANI HERBA

\quad: Origen: Solanum nigrum

No. 5(1) =: HEDYOTIS (también conocida como OLDENLANDIAE HERBA)

No. 5(2) =: BLECHNI RHIZOMA o DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE RHIZOMA

No. 5(4) =: LESPEDEZAE HERBA o SENECINIS HERBA

\quad: Origen: Lespedeza cuneata, Senecio scandens

No. 5(7) =: POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMA

No. 5(8) =: FORSYTHIAE FRUCTUS

No. 5(11) =: LIGUSTRI FRUCTUS

\quad: Origen: Ligustrum lucidum, Ligustrum japonicum

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Debe hacerse notar que la No. 4(1) es la misma que la No. 5(1) (HEDYOTIS). Los nombres de las medicinas herbales chinas para los componentes de hierba única se muestran en letras mayúsculas seguidas por sus orígenes de plantas listadas en cursiva.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45 y HHT888-54 incluyen las mezclas de hierbas actuales, los extractos acuosos de las mismas y los componentes activos o principios del extracto. De un modo similar, el uso de los términos No. 5(5), No. 5(8) y similares incluyen la hierba actual, los extractos de la misma y los agentes moleculares activos aislados.

También tal como se utiliza en la descripción y en las reivindicaciones, G es la hierba Aeginetia indica o la planta origen de la No. 5(5), No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(2), No. 5(3), No. 5(4), No. 5(5), No. 5(6), No. 5(7), No. 5(8), No. 5(9), No. 5(10), No.5(11) y H son los componentes de las hierbas únicas descritas anteriormente, incluyendo sus plantas origen respectivas.

Las descripciones específicas de las medicinas herbales chinas anteriores y de las hierbas medicinales puede encontrarse en las siguientes referencias: (1) H. C. Chang, Medicinal Herbs I, Holiday Publishing Co., Taipei, Taiwán, R. O. C., 15, 36, 100, 113, 127, 147 (1990); (2) H. C. Chang, Medicinal Herbs II, Holiday Publishing Co., Taipei, Taiwan, R. O. C., 15, 27, 131, 135, 155 (1991); (3) W. S. Kan, Pharmaceutical Botany, Nacional Research Institute Of Chinese Medicine, Taipei, Taiwán, R. O. C., 113, 124-130, 200-201, 206-207, 289-290, 353-354, 442-444, 460-461, 487-488, 497, 505, 513-514, 522, 527-529, 558, 562-563, 648-649 (1971); (4) M. S. Lee, Frequently Used Chinese Crude Drugs And Folk. Medicines Handbook, 12ª Ed., Sheng-Chang Medicinal Record Magazine Publishing Co., Taipei, Taiwan, R. O. C., 4-6, 17, 21, 29, 36, 38, 40, 48, 58, 64, 71, 79, 85 (1992); y (5) H. Y. Hsu, Y. P. Chen, S. G. Hsu, J. S. Hsu, C. J. Chen, & H. C. Chang, Concise Pharmacognosy, New Medicine Publishing Co., Taipei, Taiwan, R. O. C., 90, 97, 105-106, 117-118, 126-127, 130-131, 133, 138, 144-145, 152-153, 156-157, 161-162, 174, 176-177, 357-358, 381-382, 384-385, 456-457, 577-578 (1985).

La presente invención en sus aspectos más amplios se refiere a composiciones para uso en el tratamiento de infecciones virales, tal como se ha definido en las reivindicaciones anexas. Por ejemplo, las mezclas de hierbas designadas como HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, No. 5(5)-No. 4(3), No. 5(5)-No. 4(4), No. 5(5)-No. 5(11). De forma más específica, las infecciones virales son aquellas causadas por los HBV, HCV y VIH. Las mezclas antivirales de acuerdo con la invención han sido descritas anteriormente como HHT888-5, HHT888-45 y HHT888-54. Además, los agentes de hierba única designados como No. 4(2), No. 4(5), No. 5(5), No. 5(7), No. 5(8), No. 5(11) y H han mostrado que poseen actividad antiviral. En el estado de la técnica no se ha demostrado que estos agentes de hierba única tengan actividad antiviral.

También se han descrito composiciones de la materia caracterizadas por el análisis de HPSEC establecido en las Figuras 1 a 5, 7 y 8 para los componentes activos de No. 5(5). Las Figuras 13 y 14 caracterizan los componentes activos de G por la HPSEC, mientras que las Figuras 17 y 18 caracterizan H. La Figura 21, caracteriza No. 5(8) por el análisis de la HPSEC, la Fig. 24 caracteriza la No. 5(11), mientras que la Fig. 27 caracteriza la No. 4(2).

El gradiente del análisis de la HPLC de C18 establecido en las Figuras 6A y 6B caracteriza los componentes activos de la No. 5(5). El análisis de RP-HPLC establecido en la Fig. 9 caracteriza los componentes activos de la No. 5(5), mientras que la Fig. 15 caracteriza los activos de G, la Fig. 19 los activos para H, la Fig. 22 los activos para No. 5(8), la Fig. 25 los activos para No. 5(11) y Fig. 28 para los activos de No. 4(2). Los espectros de IR establecidos en las Figs. 11 y 12 caracterizan los activos para No. 5(5), la Fig. 16 caracteriza los activos para G, la Fig. 20 caracteriza los activos de H, la Fig. 23 caracteriza los activos para No. 5(8), la Fig. 26 caracteriza los activos para No. 5(11), mientras que la Fig. 29 caracteriza los activos para No. 4(2).

Un aspecto más específico de la presente invención reside en el descubrimiento de que la HHT888-5 es eficaz en reducir los virus de la hepatitis B en los portadores de HBV. Un aspecto adicional de la invención reside en el descubrimiento de que la HHT888-45 es eficaz en el tratamiento de los pacientes con hepatitis C y en devolver la función de su hígado a la normalidad.

Los inventores de la presente invención han demostrado que las mezclas de hierbas HHT888-4 y HHT888-5 y sus extractos acuosos tienen actividades anti-retrovirales frente a MuLV y VIH in vitro. Esta evidencia soporta fuertemente la conclusión de que tienen eficacia in vivo. Además, once (11) de los quince (15) componentes de hierba única de la HHT888-4 y HHT888-5, es decir las No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(2), No. 5(4), No. 5(5), No. 5(7), No. 5(8), No. 5(11), y la hierba medicinal H ha mostrado actividades anti-VIH por la supresión efectiva de la proliferación viral en linfocitos de sangre periférica de humano infectado por VIH (PBLs). Este modelo es altamente predictivo de la actividad anti-HIB in vivo.

El extracto en agua del componente de hierba único No. 5(5) preparado directamente a partir de su planta origen, Aeginetia indica, ha mostrado una buena actividad anti-VIH. Además, los extractos de agua de los componentes de hierba única No. 4(3), No. 4(4), y No. 5(11) han mostrado actividades anti-VIH entre fuerte y moderada. Los extractos en agua de los componentes de hierba única No. 4(2), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(4) y No. 5(8) han mostrado sólo débiles actividades anti-VIH.

En la presente invención se muestra que los componentes extraíbles en agua y precipitables en ácido de No. 4(2), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(5), No. 5(8) y H son agentes activos anti-VIH. También se han aislado componentes similares extraíbles en agua y precipitables en ácido a partir de la No. 4(4) y No. 5(11) y en la presente invención se muestra que son anti-VIH. Estos componentes activos anti-VIH extraíbles en agua y precipitables en ácido son similares, no han sido descritos anteriormente, y son nuevos y no obvios.

También se han aislado componentes activos anti-VIH extraíbles en agua y solubles en ácido de la No. 4(4) y No. 5(11). El componente activo extraíble en agua y soluble en ácido de la No. 4(4) puede ser el mismo que el polisacárido parcialmente sulfatado o la prunelina descrita anteriormente. Solo se ha aislado un componente activo del extracto de agua de la No. 4(3) que es soluble en ácido.

Hay descripciones adicionales como composiciones de la materia, las mezclas de hierbas HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45 y HHT888-54. Estas composiciones de la materia no han sido descritas anteriormente y no son obvias.

Se describe de forma adicional una composición de la materia que comprende al menos uno de los componentes activos anti-VIH individuales extraíble en agua y precipitable en ácido aislado de forma separada o en combinación a partir de las medicinas herbales de hierba única o de sus plantas origen seleccionado a partir del grupo que consiste en: No. 4(2), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(5), No. 5(8), No. 5(11) y H. Estas composiciones de la materia no han sido descritas anteriormente y son no obvias y nuevas.

La utilidad de las composiciones de la presente invención reside en su uso en el tratamiento de infecciones virales. Sin embargo, cualquier método de tratamiento descrito como tal está excluido de forma específica a partir del alcance de la presente invención. De forma adicional se describe un método de tratamiento de infecciones virales en un mamífero, de modo que dicho método comprende la administración a dicho mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de al menos una composición seleccionada entre el grupo que consiste en HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, No. 4(2), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(2), No. 5(4), No. 5(5), No. 5(7), No. 5(8), No. 5(11) y H y sus extractos respectivos o principios activos.

De forma más específica, se describe un método para la reducción de la carga viral de humanos infectados con HBV, de modo que dicho método comprende la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de una composición que comprende la HHT888-5 o un extracto obtenido de dicha HHT888-5.

También se describe un método para el tratamiento de humanos infectados con HCV, de modo que dicho método comprenda la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de una composición que comprende la HHT888-45 o un extracto obtenido de la HHT888-45.

También se describe un método de reducir la carga viral de un portador humano del HBV y un método de tratamiento o de prevención de la hepatitis B en un humano, de modo que dicho método comprenda la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de al menos una composición seleccionada entre la No. 5(5) y mezclas de la misma, y al menos un agente seleccionado entre el grupo que consiste en la No. 5(1), No. 5(2), No. 5(3), No. 5(4), No. 5(6), No. 5(7), No. 5(8), NO. 5(9), No. 5(10), y No. 5(11).

También se describe de forma adicional un método de tratamiento de un portador de HCV y un método de tratamiento o de prevención de la hepatitis C en un humano, de modo que dicho método comprenda la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de una composición que comprende la mezcla de la medicina herbal de hierba única No. 5(5), su extracto o principio activo y al menos una medicina herbal de hierba única, su extracto o el principio activo seleccionado entre el grupo que consiste en la No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 5(4), No. 5(8), y No. 5(11).

También se describe un método de tratamiento de la hepatitis B en un humano, de modo que dicho método comprenda la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de al menos una composición seleccionada entre la HHT888-45 y HHT888-5.

También se describe un método de tratamiento de la hepatitis B en un humano, de modo que dicho método comprenda la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de al menos una composición seleccionada entre: (1) una mezcla de una medicina de hierba única No. 5(5), su extracto o principio activo y al menos una medicina de hierba única, su extracto o principio activo seleccionado entre el grupo que consiste en la No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 5(4), No. 5(8), y No. 5(11); y (2) una mezcla de la medicina herbal de hierba única No. 5(5), su extracto o principio activo y al menos una medicina herbal de hierba única, su extracto o principio activo seleccionado entre el grupo que consiste en la No. 5(1), No. 5(2), No. 5(3), No. 5(4), No. 5(6), No. 5(7), No. 5(8), No. 5(9), No. 5(10), y No. 5(11).

También se describe de forma adicional un método para el tratamiento de humanos infectados con VIH, de modo que dicho método comprende la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de una composición que comprende la HHT888-4.

Se describe un método para el tratamiento de humanos infectados con VIH, de modo que dicho método comprende la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de una composición que comprende la HHT888-5.

Se describe un método para el tratamiento de humanos infectados con VIH, de modo que dicho método comprende la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de una composición que comprende la HHT888-45.

Se describe un método para el tratamiento de humanos infectados con VIH, HBV y HCV, de modo que dicho método comprende la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva (tal como entre 0,4 y 120 g por día) de una composición que comprende la HHT888-54.

También se describe un método para el tratamiento de humanos infectados con VIH, de modo que dicho método comprende la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende al menos una medicina herbal de hierba única, su extracto o principio activo seleccionado entre el grupo que consiste en la No. 4(2), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(2), No. 5(4), No. 5(5), No. 5(7), No. 5(8), No. 5(11) y H.

También se describen nuevas mezclas de hierbas y un método de tratamiento de humanos infectados con VIH, de modo que dicho método comprende la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de una mezcla de hierbas que comprende al menos una medicina herbal seleccionada entre el grupo que consiste en la No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(2), No. 5(4), No. 5(7), No. 5(8) y No. 5(11).

También se ha descrito un método para el tratamiento de humanos infectados con VIH, de modo que dicho método comprende la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de una mezcla que comprende al menos dos componentes antivirales aislados de las medicinas herbales de hierba única o sus plantas origen seleccionadas entre el grupo que consiste en la No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(2), No. 5(4), No. 5(5), No. 5(7), No. 5(8), No. 5(11) y H.

También se ha descrito un método para el tratamiento de humanos infectados con VIH, de modo que dicho método comprenda la administración a dicho humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprenda al menos uno de los componentes antivirales extraíbles en agua o precipitables en ácido o los componentes aislados de las medicinas herbales de hierba única o sus plantas origen seleccionadas entre el grupo que consiste en la No. 4(2), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(5), No. 5(8), No. 5(11) y H.

La dosis de las composiciones de la invención puede oscilar entre 0,4 y 120 g por día para el mamífero que precise la terapia. Un experto en la materia apreciará que dependiendo del peso del individuo y de la progresión de la infección viral, cuales son las dosis mayores de las composiciones que pueden requerirse. Ya que las composiciones de acuerdo con la invención han demostrado virtualmente no tener efectos secundarios, pueden iniciarse dosis mayores con una reducción de la manifestación con la dosis (es decir, reducción de la carga viral) del efecto terapéutico. Un experto en la materia puede adecuar cada relación de dosis para un individuo dado sin llevar a cabo experimentación. De forma más específica, las dosis para una composición dada puede oscilar entre 0,4 y 100 g por día, de forma más preferible entre 1,0 y 25 g por día. Preferiblemente, las composiciones son administradas al menos tres (3) veces por día, aunque la administración de un bolo será efectiva. De forma más específica, se ha encontrado que una dosis oral de 5,5 g tres (3) veces al día (total de 16,5 g por día) de la HHT888-5 es efectiva para reducir la carga de HBV en portadores. Se ha encontrado que la dosis oral de 2,7-5,7 g tres (3) veces al día (total de 8-17 g por día) de la mezcla de hierbas HHT888-45 es efectiva para volver el funcionamiento del hígado normal para pacientes de la hepatitis C. Dosis tan altas como de 121 g por día para la HHT888-5 y de 63 g por día para la HHT888-45 no han evidenciado serios efectos secundarios. Deberá apreciarse que las dosis señaladas en la presente invención son para la medicina herbal (extracto depositado en la planta molida o adsorbente) en forma seca. Además, los extractos de las composiciones de la invención incrementarán la concentración de los activos y por consiguiente se realizarán reducciones en los niveles de dosis. Se contemplan dosis tan bajas como del 10% de las señaladas en la presente invención para las composiciones inventivas.
La dosis preferida para la No. 5(5) para tratar la infección del HCV está comprendida entre 0,4 y 17 g por día.

Las composiciones de la invención son preferiblemente administradas de forma oral o entérica, aunque también se contempla la administración intravenosa (i. v.) y/o intramuscular (i. m.). Los expertos en la materia entenderán cómo pueden ser preparadas las formulaciones i. v. e i. m. y cómo pueden obtenerse dosis efectivas.

En el método un mamífero puede ser un humano o animal. El humano puede ser un adulto, joven o niño. De este modo, para los niños, la fórmula conteniendo los extractos de las plantas o los principios activos descritos a continuación será efectiva en el tratamiento de los niños infectados con HBV, HCV, o VIH. Para los niños y adultos, un producto nutricional o alimento médico, tal como leches o yogures, conteniendo los extractos de plantas o los principios activos descritos en la presente invención, será efectivo en el tratamiento de humanos infectados con HBV, HCV, o VIH.

También se describe un procedimiento para aislar los compuestos eficaces a partir de las medicinas herbales descritas o de los compuestos aislados de las plantas medicinales por sí mismos.

Las hierbas utilizadas como materiales de partida para esta invención pueden ser obtenidas de fuentes comerciales tal como las medicinas de hierba única que pueden ser mezcladas, o extraídas y concentradas, e introducidas en composiciones para la administración a un humano. Los extractos de plantas, una vez aisladas del material de la planta, pueden ser concentrados y, a continuación, colocados en la forma adecuada para la administración a un humano (es decir, pastillas, cápsulas y comprimidos). Los principios activos, una vez aislados de la planta o sintetizados, pueden entonces ser introducidos en composiciones para la administración a un humano y pueden tomar una variedad de formas tales como cápsulas, comprimidos, polvo, caramelos, geles, bebidas, tes, productos nutricionales, y similares.

También se describe un producto medicinal producido por el procedimiento comprendido por las etapas de: (a) poner en contacto el material de la planta roto en pequeños trozos tal como de la No. 5(1) al No. 5(11), de la No. 4(2) al No. 4(5), H, y mezclas de los mismos, con agua para formar una dispersión acuosa; (b) calentar la dispersión acuosa hasta aproximadamente 100ºC y mantener a dicha temperatura durante aproximadamente entre 0,5 y aproximadamente 3 horas; (c) separar el material de la planta insoluble de la fase acuosa; y (d) concentrar el soluble contenido en la fase acuosa. El soluto concentrado puede ser obtenido por medio de liofilización, secado por pulverización, evaporación o ultrafiltración.

También se describe un producto medicinal producido por el procedimiento que comprende las etapas de: (a) poner en contacto el material de la planta roto en pequeños trozos del grupo que consiste en la No. 4(2), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(5), No. 5(8), No. 5(11), H, y mezclas de los mismos, con agua para formar una dispersión acuosa; (b) calentar la dispersión acuosa hasta aproximadamente 100ºC y mantener a dicha temperatura durante aproximadamente entre 0,5 y aproximadamente 3 horas; (c) separar el material de la planta insoluble de la fase acuosa; (d) acidificar la solución acuosa con ácido (tal como ácido clorhídrico) hasta un pH de menos de aproximadamente 2,0; (e) separar el precipitado del ácido del sobrenadante; y (f) purificar el precipitado ácido por disolución en solución básica (tal como bicarbonato amónico 0,1 N) y precipitar de nuevo con ácido. De forma opcional, el precipitado ácido puede ser disuelto en una solución de bicarbonato amónico 0,1 N y concentrado. El soluto concentrado puede ser obtenido por liofilización, pulverización en seco, evaporación o ultrafiltración.

Ácidos representativos que son útiles en la acidificación de los extractos acuosos incluyen ácido clorhídrico, fosfórico, ácido acético glacial, ácido sulfúrico, y similares. Lo que es importante es que el ácido tenga un pKa suficiente para convertir los componentes activos en dicha forma de ácido. El pH del extracto debe ser menor que 3,0 y más preferiblemente que 2,0 para que se produzca la precipitación.

También se describe un producto medicinal producido por un procedimiento que comprende las etapas de: (a) poner en contacto al menos una medicina herbal seleccionada entre las: No. 4(2), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(5), No. 5(8), No. 5(11), H, y mezclas de los mismos, con agua para formar una dispersión acuosa; (b) agitar la dispersión acuosa a temperatura ambiente durante aproximadamente entre 0,5 y aproximadamente 3 horas; (c) separar el material de la planta insoluble de la fase acuosa; (d) acidificar la solución acuosa con ácido hasta un pH de aproximadamente menos de 2,0 para formar un precipitado; (e) separar el precipitado del ácido del sobrenadante del ácido; y (f) purificar el precipitado del ácido. El precipitado puede ser purificado por disolución repetitiva del mismo en una solución de bicarbonato amónico 0,1 N y precipitándolo de nuevo con ácido.

Esta solicitud establece que los datos disponibles en la presente invención descubren y describen totalmente las composiciones de la materia, sus preparaciones, las aplicaciones clínicas, y las herramientas analíticas utilizadas para caracterizar los diferentes componentes activos. Estos y otros aspectos de la invención se harán aparentes por los expertos en la materia como resultado de los siguientes ejemplos que se pretende que sean ilustrativos y no limitativos de la invención.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Para dar a conocer a los expertos en la materia los principios de la invención, se adjuntan los siguientes Ejemplos que se pretende que sean ilustrativos y no limitativos. Todos los porcentajes son porcentajes en peso a no ser que se especifique de otro modo.

Ejemplo 1 Preparación de Mezcla de Hierbas

En la preparación de composiciones herbales de acuerdo con la invención, Se obtuvieron medicinas herbales chinas en el formato de hierba única a partir de fuentes comerciales en forma de polvo. Se mezclaron las medicinas herbales de hierba única en proporciones apropiadas para preparar cada mezcla de hierba.

Se preparó la mezcla de hierbas para la HHT888-4 por mezcla de las No. 4(1), No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), y No. 4(5) a una relación en peso de 3 : 3 : 3 : 3 : 4. La mezcla de hierbas de la HHT888-5 fue preparada por mezcla de pesos iguales de las No. 5(1), No. 5(2), No. 5(3), No. 5(4), No. 5(5), No. 5(6), No. 5(7), No. 5(8), No. 5(9), No. 5(10), y No. 5(11).

Se preparó la mezcla de hierbas de la HHT888-45 por mezcla de entre 4 (4) y seis (6) de las medicinas herbales de hierba única: No. 4(3), No. 4(4), No. 5(4), No. 5(5), No. 5(8), y No. 4(2) a una relación de 1 : 1 : 1 : 1 : 0-1 :
0-1 en peso. La medicina herbal de hierba única No. 5(8) o No. 4(2), o ambas, no se utilizaron en algunos casos en la HHT888-45 para las administraciones iniciales. Una de las dos medicinas herbales de hierba única o ambas se utilizaron más tarde cuando se precisó incrementar la terapia. La relación en pesos de la medicina herbal de hierba única No. 4(2) en la mezcla de hierbas HHT888-45 también varió caso por caso entre 0,5 y 1 cuando se utilizó.

Hay que señalar que una mezcla de decocciones preparadas individualmente a partir de plantas de origen de las medicinas herbales de hierba única o una decocción preparada a partir de plantas de origen pre-mezcladas de los componentes de hierba única de cada mezcla de hierbas se encuentra incluida dentro del alcance de esta invención.

Ejemplo 2 Preparación de Medicinas Herbales de Hierba Única

El origen de plantas del cual se obtuvo la medicina herbal de hierba única se lista en las secciones del Estado de la Técnica y del Resumen de la presente solicitud. Debe entenderse que puede utilizarse más de una especie o género de plantas medicinales para preparar la misma medicina herbal. Por ejemplo, la medicina herbal No. 5(8) o FORSYTHIAE FRUCTUS puede ser preparada a partir de tres (3) especies de plantas del género Forsythia, es decir, Forsythia suspensa, Forsythia viridissima, Forsythia coreana o mezclas de las mismas. La medicina herbal No. 5(6) (BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX) puede prepararse a partir de una de las cinco (5) plantas Baphicacanthes cusia, Strobilanthes cusia, Isatis tinctoria, Isatis indigotica, Polygonum tinctorium o mezclas de las mismas. Las medicinas herbales se prepararon a partir de sus fuentes de plantas respectivas del modo
siguiente.

Se obtuvo una parte o partes adecuadas de la planta entera, se lavó con agua fría, se secó y se rompió en pequeñas fracciones. A continuación se extrajeron los materiales de la planta con agua hirviendo sobre una base de 1 parte en peso del material de la planta hasta aproximadamente entre 5 y 10 partes en peso del agua. La cantidad de agua utilizada debe cubrir al menos el material de la planta en el vaso de extracción. Se hirvieron las muestras durante entre 0,5 y una hora, pero no durante más de 3 horas, con el fin de permitir la extracción efectiva de los componentes deseados. La calefacción más corta o más larga no afectaría de forma sustancial a la extracción, excepto en el rendimiento y el coste. La solución acuosa fue separada del material de la planta por filtración.

La solución acuosa puede ser liofilizada o secada por pulverización, o reducida en volumen por calentamiento con o sin aplicar vacío. El concentrado puede entonces ser secado por pulverización o liofilizado o absorbido en una forma de polvo del mismo material de la planta, almidón u otro absorbente. De este modo se prepara la medicina herbal de hierba única.

Una decocción es la solución acuosa del material de la planta preparado por ebullición del material de la planta en agua tal como se ha descrito anteriormente durante aproximadamente entre 0,5 y una hora. La decocción puede ser directamente consumida después de su preparación y enfriada hasta una temperatura o hasta temperatura ambiente o preservada con una adecuada esterilización para su ulterior consumo. La esterilización puede ser llevada a cabo por microfiltración o por calor.

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Ejemplo 3 Tratamiento de los Portadores del Virus de la Hepatitis B

Se trataron veintinueve (29) portadores de HBV con niveles normales de transferasa de glutamina oxalacetato (SGOT) y transferasa de glutamina piruvato (SGPT) (enzimas del hígado), con la HHT888-5. En primer lugar se trataron varios portadores de HBV que tenían niveles elevados de SGOT y SGPT con otros remedios que volvieron sus niveles de enzimas del hígado a valores normales (8-40 unidades/mL para el SGOT y de 5-35 unidades/mL para el SGPT) pero que fracasaron en reducir la carga de HBV. Entonces se inició el tratamiento con la HHT888-5. La HHT888-5 se preparó tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 por mezcla de once (11) medicinas herbales de hierba única que se obtuvieron a partir de una fuente comercial y que se fabricaron siguiendo las normas de buena práctica de fabricación (GMP). Se obtuvo el consentimiento de cada paciente antes de que se iniciara su tra-
tamiento.

Se instruyó a los pacientes para tomar la HHT888-5 tres (3) veces al día. Cada dosis fue de 5,5 g. Cada paquete de 5,5 g de la mezcla de hierbas fue mezclada con agua caliente y consumida de forma oral. Se determinaron las valoraciones del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de cada paciente a intervalos tal como se muestra en la tabla 1 para monitorizar el progreso del tratamiento. Se valoró el HBsAg en suero utilizando un ensayo de hemaglutinación reverso-pasivo tal como se ha descrito en: (1) Instruction of "Taifu" Serodia-HBs Test Reagent for HBsAg Detection, Taifu Pharmaceutical Co., Ltd., Taoyuan, Taiwan, R.O.C.; (2) D. S. Chen & J. L. Sung, J. Formosan Med. Assoc., 77, 263-270 (1978); y (3) T. Juji & T. Yokochi, Japón, J. Exp. Med., 39, 615-620 (1969).

La Tabla 1 muestra los resultados del tratamiento de veintinueve (29) portadores de HBV. Los pacientes mostraron mejoría en su estado de enfermedad durante el curso del tratamiento, tal como las reducciones en su valoración del HBsAg y su estado de salud. Catorce portadores (14) (un 48%) cuyas valoraciones de HBsAg estuvieron comprendidas entre 20 y 81.920 fueron disminuidos de forma significativa (con reducciones de cuatro a 256 veces, o de positivo a negativos) después de entre 35 y 964 días de tratamiento. Cuatro (4) portadores (un 14%) redujeron sus valoraciones de HBsAg de 20, 40, y 2.560 a negativo (es decir, por debajo de un nivel de detección de 20 ng/mL) después de 56 a 153 días de tratamiento. Catorce (14) portadores (un 48%) no tuvieron un cambio significativo (disminución de la valoración de dos veces o incremento o ningún cambio) en las valoraciones de HBsAg durante el curso del tratamiento (63-284 días). Un portador (un 3%) tuvo un ligero incremento de la valoración de cuatro veces.

TABLA 1 Efectos Clínicos de la HHT888-5 en los Portadores del Virus de la Hepatitis B Valoración de HBsAG

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El tratamiento con la HHT888-5 establecido en este Ejemplo compara de modo muy favorable con la terapia con interferón actualmente aceptada. Los porcentajes de respuesta para la terapia de interferón y para el tratamiento con HHT888-5 para disminuir las valoraciones de HBsAg en pacientes infectados con HBV son comparables, aproximadamente del 40% respecto al 48% respectivamente. Los porcentajes de liberación de HBsAg en suero también fueron comparables para ambos, del 10-15% para la terapia de interferón y de aproximadamente el 14% para el tratamiento con HHT888-5. Además, la terapia de interferón es típicamente administrada de forma intramuscular o intravenosa, con frecuentes efectos adversos. El tratamiento de la HHT888-5 fue administrado por vía oral (por ejemplo bebiendo un té) sin ningún efecto secundario aparente en todos los pacientes tratados. La administración oral es mucho más conveniente y más económica que la administración intramuscular o intravenosa. De este modo la HHT888-5 puede ser consumida de forma segura y conveniente incluso durante una base de largo plazo para reducir o controlar la proliferación de HBV en portadores de HBV y en pacientes de hepatitis B.

Cuando la carga viral de HBV en un portador de HBV puede ser reducida o mantenida a un nivel suficientemente bajo, es mucho menos probable que el portador progrese a hepatitis, cirrosis del hígado, cáncer de hígado, y muerte. De este modo, la HHT888-5 puede ser utilizada para prevenir y tratar la hepatitis B, o incluso prevenir la cirrosis del hígado o el cáncer del hígado causado por la infección de HBV.

Ya que la HHT888-5 fue administrada en este Ejemplo por mezcla en primer lugar del polvo en agua y a continuación consumo oral, el aislamiento de los componentes activos del HHT888-5 y su administración a humanos también sería eficaz en el tratamiento del HBV. Se consiguieron dosis de la mezcla de hierbas de la HHT888-5 tan altas como de 120 g por día sin serios efectos secundarios.

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Ejemplo 4

(Este Ejemplo no cae dentro del alcance de la presente invención en tanto en cuanto se refiere a la mezcla de hierbas HHT888-4)

Valoración Antiretroviral de Mezclas de Hierbas y sus Extractos Acuosos

En este ejemplo, se ensayaron dos mezclas de hierbas, HHT888-4 y HHT888-5, para determinar sus actividades antiretrovirales y se encontró que eran activos frente a EMuLV y VIH en un ensayo in vitro. Se utilizaron dos ensayos in-vitro, anti Virus de la Leucemia Murina Ecotrópica (anti-EMuLV) y anti-VIH para ensayar las actividades antiretrovirales de las composiciones inventivas.

El ensayo anti-EMuLV utiliza un gran, envuelto, retrovirus conteniendo ARN, EMuLV, que pertenece a la misma familia de virus que el VIH y que tiene muchas características que son similares al VIH.

1. Ensayo del Virus de la Leucemia de Murino Anti-Ecotrópica

El ensayo tuvo dos partes, un ensayo de citotoxicidad y un ensayo de supresión del virus. Ver el Informe Final del Protocolo QBI 39014 y el Informe Final del Protocolo QBI 39016, Quality Biotech, Carden, NJ, USA, 1992. Cada muestra fue ensayada inicialmente para determinar su citotoxicidad para las células indicadoras SC-1 que se utilizaron para la valoración de infecciones de EMuLV en un ensayo de plaga de XC. Tal como se describe en la presente invención, la citotoxicidad se expresa en términos de porcentaje de la proliferación control. El porcentaje más alto significa que la sustancia a ensayar no es tóxica para las células. Esto es muy importante ya que los compuestos que son altamente tóxicos interferirían la interpretación de los resultados del ensayo. Por ejemplo, una elevada actividad en un ensayo de VIH y una elevada citotoxicidad (bajo % de proliferación de control) significaría que el compuesto del ensayo está inhibiendo el crecimiento de las células huésped y por tanto limitando el crecimiento del virus. De este modo, se podría interpretar un falso positivo en la actividad anti-viral. Ver el protocolo QBI C30015, Quality Biotech, Canden, NJ, USA. Cada muestra se dispersó en un tampón de resuspensión del virus (50 mM de Tris, pH 7,8, 10 mM de KCl, 0,1 mM de EDTA) sin el virus. A continuación se sometió la solución al ensayo de la plaga XC bajo las mismas condiciones que las utilizadas para la determinación de la valoración del EMuLV. Se consideró una muestra citotóxica si las células indicadoras para el ensayo tenían menos del 50% de confluencia. Se seleccionó una muestra no citotóxica para el ensayo de supresión del virus.

En el ensayo de supresión del virus, cada muestra se incubó con EMuLV (cepa AKV623, valoración 2,2 - 4,2 x 10^{5} PFU/mL) en un tampón de resuspensión del virus a 23-25 mg/mL (por ej., 100 mg/4,0 mL) durante 12-32 minutos. Se ajustó el pH de la suspensión del virus tratado, en el caso en que fuera necesario, hasta entre 6,8-7,2 y a continuación se ensayó para su valoración en el ensayo de plaga de XC.

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Se diluyó una alícuota (1,5 mL) en el medio de cultivo de la célula hasta el punto final (diluciones de 10^{0}, 10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4}, 10^{-5}, 10^{-6}, 10^{-7}, y 10^{-8}, o las que fueran apropiadas). Cada dilución se agitó para re-suspender cualquier partícula que pudiera estar presente y se ensayó por duplicado para determinar las partículas virales infecciosas por el ensayo de placa de XC. También se analizaron un control positivo (suspensión del virus sin tratamiento) y un control negativo (medio de cultivo celular, ningún virus) de forma concurrente para validar el ensayo.

Se expresó la actividad anti-EMuLV de la muestra en una reducción log_{10} de la valoración de EMuLV cuando se comparó con el control positivo. Se consideró activa una muestra con un log_{10} de la reducción de la valoración mayor que 0,5.

La HHT888-4 y la HHT888-5 se ensayaron inicialmente "tal cual" y mostraron actividades antivirales buenas (una reducción log_{10} de entre 1,0 y 1,4 en la valoración viral) a 25 mg/mL y 12 minutos de incubación con el virus a temperatura ambiente. A continuación fueron ensayados de nuevo con un mayor tiempo de incubación (32 minutos) con el virus a la misma concentración). Cada muestra también fue ensayada para determinar sus fracciones solubles e insolubles en el anterior tampón de resuspensión para ver si algún componente activo era soluble en agua. Se separó la parte soluble de la insoluble por centrifugación a temperatura ambiente y 10.000 x g durante 10 minutos. Se dividió la fracción soluble en dos alícuotas, una de 0,45 \mum filtrada y una no filtrada, y se ensayó para ver si partículas residuales tenían algún efecto en la actividad.

La Tabla 2 resume los resultados del ensayo de actividad anti-EMuLV. Los resultados confirmaron que tanto la HHT888-4 como la HHT888-5 y sus fracciones solubles e insolubles tenían actividades anti-EMuLV. Las muestras causaron una reducción log_{10} de entre 1,0 y 2,6 en la valoración viral cuando fueron incubadas con el virus a 23-25 mg/mL durante 32 minutos. La microfiltración no afectó de forma significativa la actividad de cualquier fracción soluble.

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TABLA 2 Actividad Anti-Ecotrópica del Virus de la Leucemia Murino

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Los datos contenidos en la tabla 2 demuestran que la HHT888-4 y la HHT888-5 son efectivas como agentes anti-EMuLV.

2. Ensayo del Virus de la Inmunodeficiencia Anti-Humana

Este ensayo también contuvo dos partes, un ensayo de toxicidad y un ensayo de supresión de VIH. La muestra se mezcló en un medio de cultivo celular, por ej., 50 mg en 1,00 mL. La mezcla se agitó y se centrifugó para separar el soluble del insoluble. Se filtró el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 \mum y a continuación se diluyó con un medio de cultivo celular hasta concentraciones adecuadas para el ensayo. El medio de cultivo celular utilizado en el ensayo fue el RPMI 1640 (pH 7,3 \pm 0,3) suplementado con suero de vaca fetal al 10%, glutamina 2 mM y 50 U/mL de penicilina y 50 \mug/mL de estreptomicina.

Se ensayó la muestra para determinar su citotoxicidad y/o actividad citostática frente a las células objetivo, los linfocitos de sangre periférica (PBLs). Se utilizó un ensayo de proliferación de linfocitos para el ensayo de toxicidad, en el cual se incubó una muestra de 100 \muL con 100 \muL de una suspensión de células de PBLs no infectado (3 x 10^{5} células) bajo las mismas condiciones que el ensayo de supresión de VIH. Se midió la proliferación de linfocitos mediante un ensayo colorimétrico (Ensayo MTT). Ver T. Mosmann, J. Immunological Methods, 65, 55-63 (1983). Se consideró que una concentración de la muestra que dio lugar a resultados \geq 70% de control en la proliferación de linfocitos era aceptable para el ensayo de supresión del VIH.

En el ensayo de supresión del VIH, se cultivaron los PBLs infectados con VIH-1 en presencia de la muestra durante cuatro (4) días como en el ensayo de toxicidad. Ver H. Ruebsamen-Waigmann, y otros, J. Med. Virology, 19, 335-344 (1986). Se determina la proteína del núcleo viral segregada p24 y/o el ARN viral como indicadores del estado de proliferación del virus en el día 3 y el día 4 mediante una técnica ELISA de captación de VIH-1 p24 y una técnica de hibridación de manchas de puntos de ARN de VIH respectivamente. Se determinó la concentración de p24 sintetizado por las células infectadas de VIH por Sándwich ELISA. Para la calibración del ELISA se utilizó una preparación estándar de p24 recombinante (MicroGeneSys, USA). Ver Ch. Mueller, y otros, Z. Fresenius, Anal. Chem., 330, 352-353 (1988).

Se determinó el VIH-ARN sintetizado en las células infectadas mediante una técnica de hibridación de ácido nucleico. Se preparó el ARN celular a partir de las células infectadas y se analizó por una técnica de hibridación de manchas de puntos. La solución de hibridación contuvo la sonda de ADN marcada con P^{32} que comprendió un fragmento de ADN de 5,5 kilobases del aislado D_{31} de VIH. Ver H. v. Briesen, y otros, J. Med. Virology, 23, 51-66 (1987). Este fragmento que cubre la región obstruida/agrupada del virus está marcado con alfa-d CTP marcado con P^{32} mediante el marcaje de oligonucleótidos. Se utilizaron los transcritos de ARN de hebra plus derivados de la región obstruida/agrupada de aislado D_{31} viral como el estándar externo para la hibridación. Se generaron estos transcritos "run-off" ("de desagüe") por medio de la reacción de la polimerasa T7 a partir de ADN de VIH polarizado de forma negativa bajo el control del promotor T7. Se determinó la concentración de transcritos de ARN de forma espectroscópica. Se detectó la sonda hibridaza por autoradiografía y se evaluaron los autoradiogramas procesados de forma densitométrica.

Se llevó a cabo un control positivo, un control negativo, y un control de AZT para asegurar la validez del ensayo de supresión del VIH. Todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado, y se utilizó para todos los ensayos un micro-valorador de placas de 96 pocillos de fondo redondo.

Un control positivo fueros los linfocitos infectados con VIH-1 cultivados en presencia del medio de cultivo de células sin la muestra. Un control negativo fueron los linfocitos infectados con un inóculo de virus inactivado por calor incapaz de replicación. Se cultivaron estos linfocitos "infectados de forma simulada" y se ensayaron del mismo modo que las células infectadas. Se determinó de este modo la cantidad de proteína viral, presente en los cultivos, debida únicamente al inóculo restante como un nivel de base. A continuación se determinó la cantidad de proteína viral p24 en la muestra del ensayo y el control positivo debido a la replicación viral mediante los respectivos niveles de p24 menos el nivel de base.

Se comparó la cantidad de proteína viral presente en los cultivos conteniendo la muestra debida a la proliferación viral en comparación con la del control positivo, es decir, el cultivo sin la muestra. Se determinó el % de supresión de la proliferación de VIH mediante la diferencia en los niveles de p24 entre el control positivo y la muestra, dividido por el nivel p24 del control positivo, y regulado al 100%.

El control del AZT se llevó a cabo a través de los linfocitos infectados por VIH-1 que se cultivaron en presencia de azidotimidina (AZT) a concentraciones de 100, 10, 1 y 0,1 ng/mL, respectivamente. Esto proporcionó un estimado de la sensibilidad de los linfocitos respecto al AZT, un inhibidor conocido de la replicación del VIH-1. La supresión de la proliferación del VIH-1 causada por el AZT en una concentración de 10 ng/mL debe ser mayor que el 50% en comparación con el control positivo no tratado.

La Tabla 3 resume los resultados de la citotoxicidad y del ensayo de supresión del VIH de las HHT888-4 y la HHT888-5, así como de los controles de AZT. Ambas mezclas de hierbas fueron activas en la supresión de la proliferación del VIH en linfocitos humanos infectados a 2,5-5,0 mg/mL, pero no a 50 \mug/mL (diluido de 50 a 100 veces). Los controles de AZT a partir de todas las posiciones mostraron las actividades esperadas y aseguró de este modo la validez de los ensayos.

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TABLA 3 Actividades Anti-VIH de la HHT888-4 y HHT888-5

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A 2,5 - 5,0 mg/mL de HHT888-4 y HHT888-5, la proliferación de VIH en linfocitos de humano infectados fue suprimida de forma esencialmente completa: 97 - 100% de supresión basada en la proteína viral p24 y 99 - 100% de supresión basada en el ARN viral determinado tanto en el día 3 como en el día 4 después del tratamiento. La actividad anti-VIH a 50 \mug/mL fue insignificante, entre el 0 - 12% de supresión para ambas mezclas de hierbas. Las actividades pueden no estar atribuidas a partículas insolubles ya que se filtraron a través de un filtro de 0,45 \mum antes del ensayo y las actividades no fueron debidas a la citotoxicidad. Los ensayos repetidos en tres lotes de HHT888-4 mostraron un 100% de supresión a 2,5 mg/mL tanto para el día 3 como para el día 4 con una citotoxicidad aceptable (71 - 100% de la proliferación de control). Los ensayos repetidos en tres lotes de HHT888-5 a 2,5 mg/mL mostraron una supresión de entre el 93 - 98% en el día 3 y entre el 89 - 99% de supresión en el día 4 con una citotoxicidad aceptable (85 - 91% de proliferación de control). Los resultados de los experimentos repetidos se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Actividades Anti-VIH de la HHT888-4 y la HHT888-5 y de sus Extractos Acuosos

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Debe señalarse que el Lote 3 de HHT888-4 o el HHT888-5 se prepararon por mezcla de los respectivos componentes de hierba única a igual proporción en peso. El Lote 3 de HHT888-5 estuvo compuesto de nueve (9) componentes de hierba única, excluyendo la No. 5(10) y la No. 5(11).

Los extractos en agua del HHT888-4 y del HHT888-5 (E a E2) de uno a dos lotes fueron ensayados de forma adicional para ver si los componentes activos eran extraíbles en agua. Los extractos en agua de la HHT888-4 y 5 se prepararon por extracción de 5 g del polvo con 25 mL de agua purificada a través de MilliQ dos veces. Se agitó cada suspensión en agua durante 1 minuto, se dejó en reposo durante 5 minutos, y se agitó de nuevo durante 1 minuto para facilitar la extracción. Se separó el extracto del insoluble por centrífuga a 1.000 - 2.000 rpm durante 20 minutos. Se transfirió el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio, pre-pesado, de 50 mL, se liofilizó, se pesó, y se ensayó para determinar la actividad anti-VIH.

El porcentaje en peso del material extraído fue de 17,3% para los primeros 25 mL del extracto y del 10,8% para los segundos 25 mL del extracto de HHT888-4 (Lote 2). Estos pesos fueron del 14,2% para los primeros 25 mL de extracto y de 4,6% para los segundos 25 mL del extracto de HHT888-5 (Lote 2). El primer extracto (E1), el segundo extracto (E2) y los extractos combinados (E) de la HHT888-4 (Lote 2) se ensayaron para determinar la actividad anti-VIH. Todos los demás extractos se ensayaron con el primero y el segundo extractos combinados. Los resultados también se han representado en la Tabla 4.

Los tres lotes de cada una de las mezclas de hierbas fueron muy activos, 100% de supresión a 2,5 mg/mL para la HHT888-4 y 89-100% de supresión a 2,5-5,0 mg/mL para la HHT888-5. El IC_{50} fue de entre 0,05 - 2,5 mg/mL para la HHT888-4 y de entre 0,5 - 2,5 mg/mL para la HHT888-5. La IC_{50} es la concentración de la sustancia ensayada a la que se causaría un 50% de supresión de la proliferación viral.

El extracto en agua de la HHT888-4 mostró una muy buena actividad: entre el 93 - 100% de supresión a 0,5 - 1,0 mg/mL. El primer extracto en agua (E1) y el segundo extracto en agua (E2) del Lote 2 mostraron actividades comparables: 100% de supresión en el día 3 y entre el 87 - 96% de supresión en el día 4 a 1,0 mg/mL. La IC_{50} del extracto de agua de la HHT888-4 fue de entre 0,1 - 0,5 mg/mL.

El extracto en agua de la HHT888-5 (Lote 2) mostró una actividad sustancialmente menor: un 71% de supresión en el día 3 cayó hasta un 26% de supresión en el día 4 a 1,0 mg/mL. El principal componente activo aparentemente se quedó en la fracción insoluble y no fue fácilmente extraído por el agua al igual que la HHT888-4 bajo las condiciones anteriormente mencionadas. Es de señalar que el extracto en agua de la HHT888-5 (Lote 2) constituyó el 19% en peso de la mezcla de hierbas. La concentración de ensayo del extracto en agua de la HHT888-5 (o de la HHT888-5-E) a 1,0 mg/mL es equivalente a 5,3 mg/mL de la propia HHT888-5. Se ensayó la HHT888-5 muy activa tanto a 2,5 mg/mL (entre el 93 y el 98% de supresión en el día 3 y entre el 89 y el 99% en el día 4) y 5,0 mg/mL (100% de supresión en el día 3 y 97% en el día 4).

Los anteriores resultados demuestran claramente que tanto la HHT888-4 como la HHT888-5 y sus extractos en agua tienen actividades antiretrovirales in vitro, de forma más específica actividades anti-EMuLV y anti-VIH. También se ha encontrado que la HHT888-5 demuestra ser eficaz en el tratamiento de los portadores del virus de la hepatitis
B.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 5

Valoración Antiretroviral de Medicinas Herbales de Hierba Única

En este experimento, se ensayaron los componentes individuales de hierba única de la HHT888-4 y de la HHT888-5 para determinar su actividad anti-VIH. La Tabla 5 muestra los resultados del ensayo.

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TABLA 5 Actividades Anti-VIH de los Componentes de Hierba Única de la HHT888-4 y HHT888-5

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Los cinco (5) componentes de hierba única de la HHT888-4 mostraron actividades anti-VIH con varios grados: 73-100% de supresión en el día 3 y 50-100% de supresión en el día 4 a 2,5 mg/mL. Las No. 4(3) y No. 4(4) mostraron la mejor actividad: 100% de supresión a 2,5 mg/mL tanto en el día 3 como en el día 4. La No. 4(2) y la No. 4(5) fueron los siguientes: 92-98% de supresión en el día 3 y 92-94% de supresión en el día 4 a 2,5 mg/mL. La No. 4(1) mostró una actividad moderada: 73% de supresión en el día 3 y 50% de supresión en el día 4 a 2,5 mg/mL. La No. 4(5) mostró una ligera citotoxicidad (41 - 79% de proliferación del control) que probablemente contribuyó a la actividad observada con la DE DIÁMETRO INTERIOR_{50} entre 0,5 y 2,5 mg/mL.

Tres (3) de los once (11) componentes de hierba única de la HHT888-5: No. 5(4), No. 5(5), y No. 5(8) mostraron muy buenas actividades, un 93-100% de supresión de la proliferación del VIH tanto en el día 3 como en el día 4 a 2,5 mg/mL. La No. 5(11) fue el próximo: 92% de supresión en el día 3 y 74% de supresión en el día 4 a 2,5 mg/mL. De nuevo, la No. 5(1), que fue el mismo que la No. 4(1), tuvo una actividad moderada: 73% de supresión en el día 3 y 50% de supresión en el día 4 a 2,5 mg/mL. La No. 5(2) y la No. 5(7) mostraron sólo actividades marginales: entre el 18-50% de supresión en el día 3 y entre el 29-38% de supresión en el día 4 a 2,5 mg/mL. La No. 5(10) mostró una actividad muy ligera: 65% de supresión en el día 3 que cayó hasta el 0% en el día 4 a 2,5 mg/mL. Los restantes tres (3) componentes de hierba única, No. 5(3), No. 5(6), y No. 5(9) no mostraron actividad a 0,5 - 2,5 mg/mL. La No. 5(9) no se ensayó al nivel de 2,5 mg/mL debido a su citotoxicidad: entre un 24 - 78% de proliferación de control ya a 0,5 mg/mL.

Aunque la No. 5(4) y la No. 5(8) parecieron ser ligeramente más activos que la No. 5(5) (100% respecto a 93% de supresión a 2,5 mg/mL), sus actividades pueden ser debidas parcialmente a la citotoxicidad (32 - 64% de proliferación de control a 2,5 mg/ml). Esto fue soportado por la pérdida de actividad (0% de supresión) cuando se ensayó a niveles más bajos, 0,5 - 1,0 mg/mL, cuando la citotoxicidad fue menor y más aceptable al ensayo.

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Ejemplo 6 Ensayo Anti-VIH de Planta Medicinal

Se obtuvo la planta origen de la medicina herbal de hierba única No. 5(5), Aeginetia indica, de una tienda de hierbas local en Taiwán y se ensayó para determinar su actividad anti-VIH. Esto fue para ver si la actividad puede ser reproducida en la medicina herbal preparada directamente a partir de su planta origen, en lugar de ser obtenida de la fuente comercial.

Se lavó la planta entera con agua fría, se secó, se rompió en pequeñas porciones, y se extrajo con agua hirviendo tal como se describió en el Ejemplo 2. Se separó la solución acuosa del material de la planta por filtración. A continuación se redujo la solución acuosa en volumen por calentamiento. El concentrado se secó por pulverización y se absorbió en un material en forma de polvo del mismo material de la planta y de este modo se preparó la medicina herbal en forma de polvo, designada de aquí en adelante como material No. 5(5).

La medicina herbal en forma de polvo preparada a partir de la Aeginetia indica, o el material No. 5(5), fue extraída con agua a temperatura ambiente. Dos (2) muestras de 5,00 g fueron extraídas cada una de ellas dos veces con aproximadamente 40 mL de agua cada vez en un tubo de centrífuga de plástico de 50 mL por agitación durante un (1) minuto, dejando en reposo durante diez (10) minutos, y agitando de nuevo durante un (1) minuto. Se centrifugaron los tubos a 1500 rpm durante veinte (20) minutos para separar los extractos de los residuos insolubles. Los extractos se filtraron a través de un papel de filtro Whatman del No. 4, se liofilizaron o se secaron bajo nitrógeno, y se pesaron.

La extracción anterior del material No. 5(5) con agua (pH \sim 5,1) se repitió y el pH del primer extracto se determinó que era 5,7. El primero y el segundo extractos fueron respectivamente separados del residuo, secados al aire, y pesados. El porcentaje en peso de la parte extraída se determinó que era del 18,7 \pm 2,8% (n = 2).

Se ensayó el primer extracto de agua del material No. 5(5) para determinar la actividad anti-VIH y se encontró que era activo, con un 91% de supresión en el día 3 y un 97% de supresión en el día 4 a 1,0 mg/mL. El ensayo de citotoxicidad demostró que el extracto no era citotóxico a este nivel, con un 99% de proliferación de control.

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Ejemplo 7

Tratamiento de Pacientes con hepatitis C

La HHT888-5 ha demostrado ser efectiva y segura en el tratamiento de infecciones de HBV en humanos. Esto significa, que el principio activo o los principios de la HHT888-5 deben ser biodisponibles en humanos a través de la administración oral para provocar una disminución del HBV en aquellos pacientes tratados, tal como se indicó por la disminución de su antígeno de superficie del HBV (HBsAg) mostrado en el Ejemplo 3. Además, Hozumi y otros proporcionaron ejemplos en la patente US No. 5.411.733 para apoyar la creencia de que las sustancias que muestran actividad antiviral in vitro también poseen actividad antiviral in vivo tal como se ha descrito en la sección del Estado de la Técnica. Por consiguiente es lógico creer que la HHT888-4 o la HHT888-5 y sus extractos acuosos o principios activos también deben ser efectivos para el tratamiento de las infecciones de VIH en humanos.

Para probar esta creencia, se seleccionaron seis (6) de los componentes de hierba única más activos como anti-VIH de la HHT888-4 y la HHT888-5 para tratar los pacientes con hepatitis C causada por infecciones de HCV. Lo lógico es que tanto el HCV como el VIH sean retrovirus. La hepatitis C viral tiende a transformarse en una enfermedad crónica y por consiguiente es más adecuada para ensayar el tratamiento. Si el tratamiento funciona para los pacientes infectados con HCV, también funcionará para pacientes infectados con VIH. El Ejemplo 7 demuestra claramente la validez de esta creencia.

Se seleccionaron seis (6) de los componentes de hierba única más activos anti-VIH de la HHT888-4 y la HHT888-5 y se mezclaron para tratar los pacientes con hepatitis C causada por las infecciones de HCV. Las seis (6) medicinas herbales de hierba única seleccionadas fueron las No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 5(4), No. 5(5), y No. 5(8). La No. 4(5) no estuvo incluida aunque mostró una muy buena actividad, debido al conocimiento de que la hierba podía tener una cierta toxicidad no confirmada.

Las seis (6) medicinas herbales de hierba única se obtuvieron de una fuente comercial y se fabricaron siguiendo las normas de buena práctica de fabricación (GMP). Se mezclaron de acuerdo con la proporción deseada en varias combinaciones y de este modo se preparó la mezcla herbal HHT888-45 tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se obtuvieron los consentimientos de los pacientes antes del inicio del tratamiento.

Se instruyó a los pacientes para que tomaran la mezcla de hierbas tres (3) veces al día, entre 2,7 y 5,7 g cada vez. Se prepararon las dosis unitarias de la mezcla de hierbas HHT888-45 en paquetes individuales. Cada paquete de dosis unitaria (de entre 2,7 y 5,7 g) de la mezcla de hierbas se mezcló con agua caliente y se tomó de forma oral. Todos los pacientes fueron tratados con HHT888-45 conteniendo la No. 4(3), No. 4(4), No. 5(4), y No. 5(5). Se añadieron las No. 5(8) o No. 4(2) o ambas en la HHT888-45 para el tratamiento de algunos pacientes al inicio o durante el curso del tratamiento para incrementar la efectividad del tratamiento.

Durante el curso del tratamiento, las dosis diarias de las No. 4(3), No. 4(4), No. 5(4), y No. 5(5) variaron entre 2 (2) y tres (3) gramos cada vez. La dosis diaria de la No. 5(8) también varió entre dos (2) y tres (3) gramos cuando se utilizó. La dosis diaria de la No. 4(2) varió entre 1,5 y dos (2) gramos cuando se utilizó. La dosis varió de acuerdo con el progreso de la enfermedad.

Se trataron siete (7) pacientes con hepatitis C viral. Se determinaron sus enzimas de hígado en suero, SGOT y SGPT, de vez en cuando por un laboratorio clínico local durante el curso del tratamiento para monitorizar el progreso de la enfermedad. Se determinaron el SGOT y el SGPT utilizando un ensayo de enzima. Ver (1) Instruction of Kyokuto TA-E Transaminase Assay Reagents, Permiso No. (62AM) 0885, Kyokuto Pharmaceutical Industry Co. Ltd., Tokio, Japón, 1994; (2) Instruction of Yatrozyme TA-Lq Transaminase-assay Reagent Solution (Ensayo de Enzimas), Artículo No. 817245 (RM163-K), Yatron Co., Ltd., Diayatron Co., Ltd., Tokio, Japón; y (3) U. Lippi & G. Guidi, Clin. Chem. Acta., 28, 431-437 (1970).

Los niveles de GOT y de GPT en suero se correlacionan estrechamente con el grado de daño celular en el hígado. Estos ensayos son ampliamente utilizados en la diagnosis de las enfermedades del hígado y como un indicador del funcionamiento del hígado. El intervalo normal para el SGOT está comprendido entre 8 - 40 unidades/mL y para el SGPT entre 5 y 35 unidades/mL. Los niveles de SGOT y SGPT indican normalmente las funciones del hígado comprometidas.

Los resultados del tratamiento con la HHT888-45 se muestran en la Tabla 6. Los siete (7) pacientes tratados tuvieron los niveles de sus enzimas de hígado en suero cambiadas de los niveles elevados (SGOT entre 48 y 166 unidades/mL y SGPT de entre 41 y 291 unidades/mL) a un intervalo esencialmente normal (SGOT entre 8 y 40 unidades/mL y SGPT de entre 5 y 35 unidades/mL) después de 17 a 178 días de tratamiento. De este modo, las funciones del hígado de los pacientes volvieron a la situación normal después del consumo de la composición de la invención.

TABLA 6 Efecto Clínico de la HHT888-45* en los Pacientes con Hepatitis del Tipo C

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Los resultados demuestran claramente que la mezcla de hierbas de la HHT888-45 es efectiva en el tratamiento de los pacientes de hepatitis C. para conseguirlo, el HCV que lo causa precisa ser erradicado o reducido hasta un nivel tolerable. Debido a que los componentes de la HHT888-45 han demostrado una actividad anti-VIH in vitro muy fuerte y varios de los componentes han demostrado eficacia en la reducción del HBV en portadores, la mezcla de hierbas será, por consiguiente, efectiva en el tratamiento de pacientes infectados con VIH y HBV.

Por consiguiente, constituye un aspecto de esta invención las medicinas herbales antivirales incluyendo las mezclas de hierbas de acuerdo con esta invención y sus componentes de hierba única a diferentes proporciones y las dosis efectivas que son efectivas en el tratamiento de la hepatitis C, la hepatitis B, y otras enfermedades retrovirales, tales como el SIDA.

Debido a que todavía no ha sido elucidado un mecanismo de identificación químico y farmacológico preciso de las composiciones de esta invención, es posible que la actividad antiviral pueda ser debida a un componente herbal único, una combinación de componentes o el metabolito biológico o un derivado del mismo. Los siguientes Ejemplos investigan la identificación química de los componentes activos que se establecen en esta solicitud.

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Ejemplo 8

Fraccionamiento de los Componentes Activos de Hierba Única

Los tres componentes de la HHT888-5 de hierba única más activos anti-VIH: No. 5(4), No. 5(5) y No. 5(8) se fraccionaron por extracción en agua, cromatografía líquida de columna (C18-SPE-LC) por extracción en fase sólida de C18 (SPE) y cromatografía líquida de alta resolución (C18-HPLC). La mezcla de hierbas de la HHT888-4 también se fraccionó de forma concurrente a efectos de comparación. El objetivo fue identificar el componente activo o los componentes de cada una de las medicinas herbales anti-VIH o de las hierbas medicinales.

1. Extracción en Agua

Las medicinas herbales de hierba única No. 5(4), No. 5(5) y No. 5(8) y la mezcla de hierbas HHT888-4 se extrajeron dos veces con agua a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC) con 8 a 10 mL de agua por gramo de muestra (por ej., 5 g de polvo con 40 mL de agua y 50 g de polvo con 500 mL de agua) cada vez. Se agitó la suspensión en agua durante quince (15) minutos o se sonicó durante un (1) minuto, dejándose diez (10) minutos en reposo y sonicándose de nuevo durante un (1) minuto. Se separó el extracto de agua de los insolubles por centrífuga a 1.500 rpm durante veinte (20) minutos y se filtró a través de un papel de filtro Whatman del No. 4.

2. C18-SPE-LC

Se fraccionó cada extracto de agua por cromatografía líquida de columna C18-SPE. Se cargó una alícuota de diez (10) mL del extracto en una columna de 10 g ISOLUTE C18(EC)-SPE (de internacional Sorbent Technology, Ltd., Hengoed, Mid-Glamorgan, UK o Jones Chromatography, Lakewood, Colorado, USA) que se preacondicionaron con 50 mL de etanol y 100 mL de agua. Se empaquetó la columna de SPE (2,6 cm de diámetro interior por 2,7 cm de longitud, más 60 mL de reserva) con 10 g de partículas del sorbente de C18 de terminación cerrada con un diámetro de partícula promedio de 61 \mum y una carga de carbón del 19%.

Se eluyó la columna cargada en secuencia y por gravedad con 90 mL de agua, 100 mL de etanol, 100 mL de HCl en etanol al 1%, y 50 mL de HCl al 0,1% en etanol/agua a 10/90, v/v. Se recogió el eluido en muestras de 50 mL. Los eluidos en agua se liofilizaron en un frasco de cristal o en placas de pesada de plástico secadas al aire. Los eluidos de etanol, etanol ácido, y etanol/agua ácido se secaron al aire respectivamente en placas de pesada de plástico. Los eluidos de etanol ácido secado al aire (1% de HCl en etanol) y de etanol/agua ácido (0,1% de HCl en etanol/agua a 10/90, v/v) se redisolvieron en HCl/etanol al 1% y agua respectivamente; a continuación se transfirieron a viales WISP de 4 mL y se secaron de nuevo bajo nitrógeno. Las fracciones secadas de los primeros 50 mL de eluido de agua (A), los primeros 50 mL de etanol eluido (B), los primeros 50 mL de HCl/etanol eluido al 1% (C), y los 50 mL de HCl al 0,1%/etanol al 10%/agua al 90% eluido (D) se ensayaron para determinar las actividades anti-VIH tal como se han descrito previamente. Los resultados se muestran en la tabla 7.

TABLA 7 Actividades Anti-VIH de las Fracciones de HHT888-4E, No. 5(4)E, No. 5(5)E y No. 5(8)E de C18-SPE-LC

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La Tabla 7 establece la citotoxicidad y los resultados del ensayo de actividad anti-VIH de las fracciones A, B, C y D de la HHT888-4E, No 5(4)E, No. 5(5)E y No. 5(8)E, de C18-SPE-LC.

El porcentaje en peso % y la desviación estándar de cada fracción de la C18-SPE-LC para el extracto de agua (E) cada muestra determinado a partir de entre tres (3) y cinco (5) pasadas también se muestra en la tabla 7. La muestra cargada por columna por pasada fue de 199 a 205 mg para el HHT888-4E, de 94 a 95 mg para la No. 5(4)E, de 124 a 130 mg para la No. 5(5)E, y de 165 a 178 mg para la No. 5(8)E en base de peso seco.

Los resultados muestran que las fracciones del eluido de agua (A) y del eluido de HCl al 1%/etanol (C) de la No. 5(5)E y la fracción de eluido de HCl al 1%/etanol (C) de la HHT888-4E son las más activas (91 a 96% de supresión de la proliferación del VIH en el día 3 y del 85 al 96% de supresión en el día 4 a 0,1 mg/mL) y no citotóxicas (85 al 99% de control). El secado al aire no afectó la actividad de la fracción eluida en agua (A) de la No. 5(5)E. Un No. 5(5)E-A secado al aire mostró una actividad de supresión del 99% tanto en el día 3 como en el día 4 a 0,3 mg/mL y un 91% de supresión en el día 3 y un 86% de supresión en el día 4 a 0,1 mg/mL. Como comparación, un No. 5(5)E-A liofilizado mostró una actividad de supresión del 100% tanto en el día 3 como en el día 4 a 1,0 mg/mL y una supresión del 100% en el día 3 y una supresión del 94% en el día 4 a 0,3 mg/mL.

Las fracciones eluidas en etanol (B) de la HHT999-4E, No. 5(5)E, y No. 5(8)E también mostraron buenas actividades anti-VIH: una supresión del 100% en el día 3 y 87% de supresión en el día 4 a 0,2 mg/mL para la HHT888-4E, un 98% de supresión en el día 3 y un 90% de supresión en el día 4 a 0,1 mg/mL para la No. 5(5)E, y 100% de supresión tanto para el día 3 como para el día 4 a 0,3 mg/mL para la No. 5(8)E. Sin embargo, las actividades observadas pueden ser atribuidas parcialmente a la citotoxicidad: 21 a 95% de proliferación de control para la HHT888-4, 48% para la No. 5(5)E, y entre el 24 y el 68% para la No. 5(8)E. Esta hipótesis fue soportada por la disminución significativa de la actividad cuando se disminuyó la concentración de la muestra a un nivel citotóxico menor. Por ejemplo, la actividad disminuyó de una inhibición del 90% al 41% en el día 4 para la No. 5(5)E-B cuando la concentración disminuyó de 0,1 a 0,07 mg/mL. La actividad disminuyó de una inhibición del 100% al 30% en el día 4 para la No. 5(8)E-B cuando su concentración disminuyó de 0,3 a 0,1 mg/mL.

Las fracciones eluidas en agua (A) de la HHT888-4E y la No. 5(8)E mostraron una moderada actividad anti-VIH: 98% de supresión en el día 3 y 61% de supresión en el día 4 a 0,7 mg/mL para la HHT888-4E y 93% de supresión en el día 3 y 54% de supresión en el día 4 a 0,5 mg/mL para la No. 5(8)E. Sin embargo, la actividad puede ser parcialmente atribuida a la citotoxicidad, que fue de entre el 50 y el 73% para la HHT888-4E y del 70% para la No. 5(8)E. La actividad de la No. 5(8)E-A disminuyó del 54% al 5% en el día 4 cuando la concentración disminuyó de 0,5 a 0,3 mg/mL cuando el nivel de citotoxicidad (70-100% del control) fue más aceptable.

La fracción de eluido en agua (A) de la No. 5(4)E fue marginalmente activa: 90 al 99% de supresión en el día 3 y del 14 al 20% de supresión en el día 4 a entre 0,2 y 1,0 mg/mL, respectivamente. La fracción eluida en etanol (B) de la No. 5(4)E, fracciones eluidas en etanol/HCl al 1% (C), fracciones eluidas al 0,1% de HCl/10% de etanol/90% de agua (D) de las cuatro muestras fueron esencialmente no activas a los niveles ensayados: 14 a 80% de supresión en el día 3 y 0 al 2% de supresión en el día 4 a entre 0,05 y 0,1 mg/mL.

Se llevaron a cabo pasadas adicionales del fraccionamiento de la No. 5(5)E de la C18-SPE-LC para producir más No. 5(5)E-A y fracciones C para evaluación adicional. El extracto de agua (E) de la No. 5(5) fue o bien cargado directamente (10 mL por columna), o bien liofilizado o secado en primer lugar, redisuelto en agua (de 20 a 80 mg/mL), y a continuación cargado (5 mL por columna) para el fraccionamiento. La distribución global de peso en % de cada fracción a partir de estas pasadas de No. 5(5)E fue : A = 74,2 \pm 6,0%, B = 12,2 \pm 4,0%, C = 8,2 \pm 2,1%, y D = 2,1 \pm 0,9%. Estos valores están de acuerdo con los que se muestran en la tabla 7.

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3. HPLC-C18

El anterior No. 5(5)E-A secado al aire se fraccionó de forma adicional por C18-HPLC. Se disolvió una muestra de 500,9 mg en 5,00 mL de agua y se centrifugó a 1500 rpm durante veinte (20) minutos para separar la solución de los insolubles. Se filtró el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 \mum para eliminar cualquier residuo insoluble y se designó la fracción soluble en agua (WS). Se extrajo el precipitado con 5,00 mL de agua tres veces más y se secó bajo nitrógeno como la fracción insoluble en agua (WI). Se fraccionó la fracción soluble en agua (WS) mediante un gradiente de HPLC utilizando una columna preparatoria de Rainin Dynamax de C18 (21,4 x 250 mm, partículas de 5 \mum) y las condiciones siguientes:

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Se recogieron las fracciones a intervalos de 2,5 min. Se recogieron un total de 28 fracciones a 22,5 mL para cada fracción. La tabla 8 indica que ciertas fracciones se agruparon antes de llevar a cabo el ensayo.

Se ensayó cada una de las fracciones de HPLC en C18 secadas con nitrógeno para determinar la actividad anti-VIH a una concentración equivalente a 0,33 mg/mL del material de partida, es decir, la fracción soluble en agua (WS) de la No. 5(5)E-A secada al aire. El objetivo fue identificar la fracción activa o las fracciones secadas al aire de la No. 5(5)E-A que demostraron ser muy activas: supresión del 99% de la proliferación de VIH a 0,3 mg/mL (ver Tabla 7). A la concentración equivalente a 0,33 mg/mL del producto de partida, se esperó que cualquier fracción activa tuviera también una muy buena actividad de supresión del 99%. También se ensayaron de forma concurrente el primer extracto de agua (WS) y el precipitado (WI) de la No. 5(5)E-A secado al aire a 0,33 mg/mL. La Tabla 8 muestra los resultados. Se incluye el % en peso de cada fracción y la Fracción 3 contiene el pico
principal.

TABLA 8 Actividades Anti-VIH de las Fracciones Solubles e Insolubles en Agua de la No. 5(5)E-A Secadas al Aire y las fracciones de HPLC de la Fracción Soluble en Agua

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La Tabla 8 muestra que la fracción WS-HPLC-F3 contuvo la mayor parte del material, aunque, esencialmente no fue activa en el ensayo anti-VIH.

Estos resultados son muy sorprendentes. Todas las fracciones de HPLC de C18 ensayadas fueron esencialmente inactivas, con entre el 0 - 46% de inhibición en el día 3 y entre el 0 - 4% de inhibición en el día 4. La fracción soluble en agua (WS) también mostró una actividad significativamente menor (86% de supresión en el día 3 y 63% de supresión en el día 4 a 0,33 mg/mL) a la esperada. Este tipo de pérdida de actividad durante la separación y purificación de los componentes activos a partir de plantas medicinales ha sido ampliamente experimentada por otros, se atribuyen mayoritariamente a la pérdida a efectos sinérgicos cuando los compuestos se separan de su matriz.

Nuestros resultados indican que el componente activo fue sorprendentemente dejado atrás en la fracción insoluble de agua (WI), en lugar de en la fracción soluble de agua (WS) como originalmente se esperaba. La fracción soluble se resultó muy activa, 100% de supresión tanto en el día 3 como en el día 4 a 0,33 mg/mL. Esto significa que el principal componente activo de la No. 5(5)E-A secado al aire está en la fracción insoluble en agua (WI), en lugar de en la fracción soluble (WS).

El componente activo de la No. 5(5)E-A fue originalmente soluble en agua ya que estaba en la fracción eluida en agua de C18-SPE-LC. Se volvió insoluble en agua durante el secado al aire permaneciendo de este modo en la fracción insoluble en agua. La fracción insoluble en agua debe hacerse entonces soluble en el medio de cultivo de células neutro para que sea ensayado como activo. Este debe ser el caso ya que se centrifugó el medio de cultivo de células en la solución de la muestra y se filtró a través de 0,45 \mum para eliminar las sustancias insolubles antes del ensayo anti-VIH.

Ejemplo 9 Identificación de los Componentes Activos 1. No. 5(5)E-A

El pH del medio de cultivo de células utilizado para disolver la muestra para el ensayo anti-VIH fue de 7,3 \pm 0,3. Por consiguiente se ha hacho la hipótesis de que el componente activo de la No. 5(5)E-A fue soluble en solución acuosa neutra, al igual que el medio de cultivo de células, pero se acidificó y se volvió insoluble con la exposición a la atmósfera conteniendo vapor de HCl durante el secado al aire con una cubierta junto con otras fracciones de C18-SPE-LC que contuvieron HCl. Esto significa que la forma ácida del componente activo de la No. 5(5)E-A será insoluble en agua y precipitará cuando se acidifica. La No. 5(5)E-A es la fracción eluida en agua del C18-SPE-LC del extracto en agua de la No. 5(5).

Para ensayar esta hipótesis, ensayamos la solubilidad del precipitado activo anterior (WI) a partir de la No. 5(5)E-A en varios disolventes. El precipitado fue ligeramente soluble en agua y ácido en soluciones de etanol, tales como HCl en etanol al 1% y HCl en etanol al 1%/agua (10/90, v/v), y formó soluciones de color entre amarillo muy ligero y amarillo ligero con precipitados de color marrón oscuro. No fue soluble en metanol, acetona, y en ácido clorhídrico al 1%. Fue soluble pero lentamente en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) que se volvió en una solución de color marrón oscuro a lo largo de la noche. Fue rápidamente y completamente solubilizado en una solución de hidróxido amónico al 1% (pH de 10,4) que rápidamente se volvió una solución de color marrón oscura. Esto confirmó la hipótesis anterior de que el componente activo fue soluble en soluciones neutras o alcalinas, pero insoluble en una solución ácida.

En base al ensayo de solubilidad, el precipitado activo (WI) de la No. 5(5)E-A debe ser un ácido o ácidos. El hecho de que no fuera soluble en alcoholes (metanol, etanol, isopropanol), acetona, y otros disolventes orgánicos comunes (acetonitrilo, cloroformo, y hexano) sugiere que es improbable que sea un ácido orgánico simple, tal como el ácido benzoico. El hecho de que sea progresivamente más soluble en soluciones acuosas con un incremento del pH indicó una transición de su forma ácida a una forma de sal más soluble.

Para identificar de forma más definitiva el componente activo de la No. 5(5)E-A, se extrajeron con agua tres fracciones de eluido en agua de No. 5(5)E, que se secaron de modo diferente, del mismo modo que la de la No. 5(5)E-A secada al aire utilizada para el fraccionamiento por HPLC anterior. Se liofilizó una fracción (FD) y dos se secaron al aire (AD1 & AD2). Las fracciones AD1 y FD se prepararon a partir del mismo eluido en agua. La AD2 fue aquella cuya actividad fue sorprendentemente encontrada en la fracción insoluble en agua (WI).

Se disolvió cada muestra en agua a 100 mg/mL y se centrifugó (1.500 rpm durante 20 min) para separar el soluble del insoluble. Para la FD y la AD1, se disolvieron 1,20 g de la muestra en 12,0 mL de agua. Para la AD2, se disolvieron 0,567 g en 5,67 mL de agua. Se extrajo cada precipitado de nuevo con la misma cantidad de agua tres veces más. Se secó bajo nitrógeno una alícuota de 0,40 mL de cada extracto y se pesó. Los extractos restantes fueron cada uno de ellos filtrado a través de 0,45 \mum, acidificado con HCl al 1% (4 mL de ácido para 10 mL de extracto), y se centrifugó (2.000 rpm durante 20 min). El sobrenadante ácido (AS) fue filtrado a través de 0,45 \mum. Se lavó el precipitado en ácido (AP) con 10 mL de HCl 0,01% (pH 2,82) dos veces y 10 mL de agua dos veces, se secó bajo nitrógeno y se pesó.

La Tabla 9 muestra el pH de cada extracto de agua del liofilizado (FD) y secado al aire (AD1, AD2) No. 5(5)E-A's, la distribución del porcentaje en peso (%) de cada extracto y el precipitado, la formación del precipitado en ácido de cada extracto, y el % en peso del precipitado en ácido combinado para cada No. 5(5)E-A.

TABLA 9 Extractos de Agua, Precipitados en Agua y Precipitados en Ácido del liofilizado (FD) y del Secado al Aire (AD1, AD2) de la No. 5(5)E-A's

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Se mostró claramente que los extractos en agua de AD2 fueron más ácidos (pH 3,2 - 3,9) que los de AD1 (pH's 4,8 -
5,5) y FD (pH's 5,8 - 6,1). La muestra de AD2 contuvo más sustancia insoluble en agua (9,4%) que la AD1 (3,1%) y la FD (0,9%). Cuanto más ácidos eran los extractos mayor la cantidad de la sustancia insoluble aislada.

Cuando los extractos de agua se acidificaron, el primero y segundo extractos de FD y de AD1 formaron precipitado, mientras que los de AD2 no lo formaron. En su lugar, se formó algún precipitado en el 3º y 4º extracto del AD2 cuyo pH original fue de 3,9. Se observó una traza de precipitado en el 3^{er} extracto acidificado de FD, mientras que no se observó ningún precipitado en el 4º extracto de la FD y en el 3º y 4º extractos de la AD1.

Esto indicó que el precipitado activo fue insoluble en agua a pH 3,2 - 3,5, ligeramente soluble a pH 3,9, y se volvió soluble a pH de 4,8 y superior. La mayor parte del FD fue soluble en agua cuyo pH de la solución fue de 5,8-6,1. Sólo el 0,9% permaneció insoluble. La AD1, cuyo pH de la solución fue de 4,8-5,5, contuvo un poco más de material insoluble o de precipitado, 3,1%. La AD2, cuyo pH de la solución fue de 3,2 - 3,9, contuvo incluso más material insoluble o precipitado, 9,4%. Cuando los extractos de agua de la FD y la AD1 se acidificaron, se formó precipitado (8,3 - 8,5%). El precipitado total de FD (9,4%) o de AD1 (11,4%) fue comparable al de la AD2 (9,7%). El % en peso del sobrenadante ácido a partir del primer extracto de liofilizado No. 5(5)E-A o la FD fue del 78,4%, que contabilizó el balance del material.

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El primer extracto de agua y el precipitado de FD, y el sobrenadante del ácido y el precipitado del ácido del primer extracto de agua de FD fueron ensayados para determinar la actividad anti-VIH. Los resultados se muestran en la tabla 10, que indicó claramente que el componente activo de FD o el liofilizado No. 5(5)E-A fueron originalmente solubles en agua y precipitables por ácido. La principal actividad del FD fue en el extracto de agua (supresión del 89% en el día 3 y supresión del 96% en el día 4 a 0,3 mg/mL) y no en el precipitado (13% de supresión tanto en el día 3 como en el día 4 a 0,3 mg/mL). La principal actividad del extracto de agua, estuvo, en cambio, en el precipitado de ácido (supresión del 97% en el día 3 y supresión del 98% en el día 4 a 0,3 mg/mL) y no en el sobrenadante de ácido (4% de supresión en el día 3 y 22% de supresión en el día 4 a 0,3 mg/mL). El factor citotóxico del extracto de agua (citotoxicidad: 75% del control a 0,3 mg/mL) permaneció aparentemente soluble en ácido (citotoxicidad: 60% del control a 0,3 mg/mL) y fue separable del activo precipitado en ácido (citotoxicidad: 90% del control a
0,3 mg/mL).

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TABLA 10 Actividades Anti-VIH de las Fracciones Liofilizadas (FD) de la No. 5(5)E-A

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Por consiguiente se ha planteado la hipótesis de que el componente activo de la No. 5(5)E-A liofilizado fue esencialmente el mismo que la No. 5(5)E-A secado al aire, y ambos fueron insolubles en ácido. Cuando se liofilizó la No. 5(5)E-A, el componente activo permaneció soluble en agua y se hizo insoluble cuando se acidificó la solución. Cuando la No. 5(5)E-A se secó al aire, parte de todo el componente activo se acidificó y se hizo insoluble, al igual que en el caso de AD1 y AD2. La fuente de ácido fue el vapor de HCl de las fracciones de etanol ácidas/agua, ya que los eluidos de agua/etanol (A y B9 se secaron al aire junto con los eluidos de etanol ácido/agua (C y D) bajo la misma campana.

Para verificar la hipótesis, se re-disolvió el precipitado activo de AD2 en agua, en una solución neutra y en una solución básica y re-precipitó con ácido. De este modo, se disolvieron dos muestras de 50 mg de cada precipitado en 40 mL de tampón de PBS (pH 7,2) o una solución básica de NH_{4}OH al 1% (pH 10,4). La disolución de la muestra fue lenta en el tampón de PBS y rápida en la solución de hidróxido amónico al 1%. Ambas muestras no fueron completamente solubilizadas incluso después de ser almacenadas durante toda la noche en el refrigerador. A continuación se centrifugaron las soluciones a entre 1.500 y 2.000 rpm durante 40 minutos para separar el soluble del insoluble. Cada sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. Se lavó cada precipitado marrón con 10 mL de su disolvente respectivo y a continuación con 10 mL de agua. Se separaron los lavados por centrífuga a 2.000 rpm durante 20 minutos y se separaron. Se secaron bajo nitrógeno y se pesaron cada precipitado lavado y una alícuota de 4,00 mL de cada sobrenadante filtrado. También se secó de forma concurrente 4,00 mL del tampón de PBS para corrección del blanco de disolvente del sobrenadante de PBS.

Se pipetearon dos alícuotas de 17,0 mL de cada uno de los sobrenadantes en tubos de centrífuga de 50 mL separados. Se acidificó una alícuota por valoración con HCl al 1% hasta que se formó un precipitado. El otro se acidificó primero por valoración con ácido acético al 1% y después con HCl al 1% hasta que se formó un precipitado. La valoración con sólo ácido acético al 1% fue insuficiente para llevar la solución a un pH suficientemente bajo para formar un precipitado. El pH de la solución valorado con ácido acético al 1% se dirigió a un pH de aproximadamente entre 3,4 y 3,8 sin que fuera visible ningún precipitado. Se precisó la adición de HCl al 1% para llevar el pH de la solución por debajo de aproximadamente 1,5 a 1,8 para formar el precipitado. El precipitado visible empezó a formarse a un pH de la solución de aproximadamente entre 2,2 y 2,5. Cuando se valoraron los sobrenadantes con HCl al 1%, los pH's de la solución disminuyeron de 1,4 a 1,5 y se formaron precipitados. El precipitado empezó a formarse a pH de aproximadamente 2,3 para el sobrenadante de PBS y de aproximadamente 3,3 para el sobrenadante de NH_{4}OH valorado con HCl.

Se separó el sobrenadante del ácido del precipitado en ácido por centrífuga a 2.000 rpm durante 20 minutos. Se filtró cada sobrenadante de ácido (AS) a través de un filtro de 0,45 \mum y se secó bajo nitrógeno. Se lavó cada precipitado de ácido (AP) con 5 mL de HCl al 1% una vez y se secó bajo nitrógeno. El sobrenadante de PBS y el precipitado, el sobrenadante del ácido (HCl) y el precipitado del sobrenadante de PBS, y el precipitado del ácido (HCl) del sobrenadante de NH_{4}OH se ensayaron para determinar las actividades anti-VIH. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

TABLA 11 Actividades Anti-VIH de la Fracción Insoluble en Agua (AD2-WI) de las Fracciones Activas de la No. 5(5)E-A Secadas al Aire

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Los resultados evidencian claramente que el componente activo del AD2-WI es soluble en PBS a pH de 7,2 y en solución de NH_{4}OH al 1% a pH 10,4 y es precipitable en ácido. El sobrenadante del PBS del AD2-WI es muy activo (94% de supresión en el día 3 y 98% de supresión en el día 4 a 0,3 mg/mL) mientras que el precipitado de PBS es marginalmente activo (26% de supresión en el día 3 y 34% de supresión en el día 4 a 0,3 mg/mL). Esto es consistente con la actividad observada del AD2-WI cuyo componente activo tiene que ser solubilizado en el medio de cultivo de células neutras para el ensayo anti-VIH.

El componente activo del AD2-WI se reprecipitó con HCl. El precipitado de HCl del sobrenadante de PBS del AD2-WI fue bastante activo (83% de supresión en el día 3 y 92% de supresión en el día 4 a 0,3 mg/mL) mientras que el sobrenadante de HCl fue moderadamente activo (60% de supresión en el día 3 y 65% de supresión en el día 4 a 0,3 mg/mL). La moderada actividad del sobrenadante de HCL puede ser debida parcialmente a la citotoxicidad (50% de proliferación de control). La capacidad de precipitar en medio ácido del componente activo del AD2-WI se confirmó de forma adicional por el precipitado de HCl del sobrenadante de NH_{4}OH del AD2-WI que fue muy activo (93% de supresión en el día 3 y 97% de supresión en el día 4 a 0,3 mg/mL).

A partir de esta información, puede concluirse que el componente activo de la No. 5(5)E-A es soluble en soluciones neutras o básicas y precipitable por ácidos tales como el HCl. El ácido acético, que es sólo capaz de llevar la solución a un menor pH, alrededor de 3,4 a 3,8, no es suficientemente fuerte como para causar precipitación del componente activo. Esto significa que el componente activo en su forma ácida es más fuerte que el ácido acético y más débil que el ácido clorhídrico. Cuando se neutralizó con una base, tal como NH_{4}OH, el ácido activo insoluble se transforma en una sal soluble en agua, que también es activa frente al VIH.

Se preparó más componente activo mediante la precipitación en ácido a partir del eluido de agua No. 5(5)E-A "tal cual" o los extractos de agua del liofilizado No. 5(5)E-A por valoración con HCl al 1%. Se lavó el precipitado en ácido con agua y se liofilizó. El precipitado en ácido liofilizado se purificó de forma adicional por disolución en bicarbonato amónico 0,1 N (NH_{4}HCO_{3}) y se reprecipitó con un volumen 1,5 veces de HCl al 1% en agua. Por ejemplo, se solubilizó completamente una muestra de 520,8 mg en 20 mL de NH_{4}HCO_{3}. La solución se centrifugó a 2.000 rpm durante 22 min y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. Una alícuota de la solución se diluyó con NH_{4}HCO_{3} 0,1 N hasta 20,0 mL a 18,7 mg/mL, que a continuación se acidificó con 30,0 mL de HCl al 1% en agua y se formó una suspensión esponjosa de color marrón oscuro y precipitó. Se centrifugó la solución acidificada a 2.000 rpm durante 22 minutos. Se decantó el ácido sobrenadante y se separó. Se lavó el precipitado en ácido con entre 30 y 45 mL de HCl al 1% en agua seis veces. Se separó cada uno de los lavados con ácido del precipitado por centrífuga a 2.000 rpm durante 22 minutos y se separó. El precipitado en ácido purificado (AP1X) se liofilizó y se ensayó para determinar la actividad anti-VIH. El resultado mostró que el AP1X de la No. 5(5)E-A permaneció activo: 75% de supresión en el día 3 y 87% de supresión en el día 4 a 0,31 mg/mL. Es decir, la actividad anti-VIH sobrevivió al procedimiento de purificación.

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2. No. 5(5)E-C

Ya que el componente activo de la No. 5(5)E-A fue identificado como el componente soluble en soluciones neutras y básicas y precipitables por HCl. Fue lógico ver si el componente activo de la No. 5(5)E-C poseyó características similares.

La No. 5(5)E-C secado al aire contuvo dos sólidos coloreados diferentes, uno marrón y uno de color marrón oscuro hasta casi negro. Se llevó a cabo el ensayo de solubilidad por mezcla de entre 1,1 y 1,2 mg de la muestra en un (1) mL de cada uno de los disolventes ensayados. La No. 5(5)E-C secado al aire fue insoluble en etanol, isopropanol, acetona, acetonitrilo, cloroformo, y hexano. Fue ligeramente soluble en metanol y parcialmente soluble en agua, HCl al 1% en agua, HCl al 1% en etanol, y HCl al 0,1% en etanol al 10%/agua al 90%. Fue en su mayor parte solubilizado en PBS, NH_{4}HCO_{3} 0,1 N, NH_{4}OH al 1%, y en NaOH al 1% en agua con una pequeña cantidad de suspensión o precipitado de color crudo. La solubilidad pareció incrementar de forma progresiva con el pH de la solución desde pH ácido a neutro hasta ligeramente básico, y a continuación disminuyó en una base fuerte del tipo NaOH al 1% en agua.

Las soluciones de un mL en agua de la No. 5(5)E-C secado al aire, PBS, NH_{4}HCO_{3} 0,1 N, NH_{4}OH al 1%, y NaOH al 1% fueron cada una de ellas filtrada a través de 0,45 \mum y acidificadas con 1,5 mL de HCl al 1% en agua. Todas las soluciones acidificadas se volvieron de color amarillo marrón a soluciones marrón y formaron precipitados esponjosos de color marrón, excepto la solución de agua acidificada en la que no se observó ningún precipitado.

Además, las soluciones de un mL de la No. 5(5)E-C secado al aire en HCl al 1%/agua y HCl al 1%/etanol fueron cada una de ellas filtrada a través de 0,45 \mum y mezclada con 1,5 mL de NaOH al 1% para hacer que la solución sea alcalina. El objetivo fue ver si estas soluciones contenían bases insolubles. La solución de HCl al 1%/agua alcalinizada se volvió una solución amarillo claro y la solución de HCl al 1%/etanol alcalinizada se volvió de color entre marrón amarillento y marrón. Ambas soluciones formaron algún precipitado esponjoso marrón dorado después de dejar en reposo toda la noche en el refrigerador. El un mL de la solución marrón de No. 5(5)E-C en HCl al 0,1%/etanol al 10%/agua al 90% también se alcalinizó del mismo modo pero con 1,5 mL de NH_{4}OH al 1%. La solución marrón se transformó en una solución clara de ligero color amarillo con la alcalinización. No se formó precipitado después de permanecer toda la noche en reposo en el refrigerador. Los resultados indican que las sustancias ácidas y básicas pueden ser separadas de la No. 5(5)E-C por precipitación con un ácido fuerte y una base fuerte, respectivamente.

Se disolvió una muestra secada al aire de 100,4 mg de No. 5(5)E-C en 20,0 mL de NH_{4}HCO_{3} o,1 N. Se centrifugó la solución a 2.000 rpm durante 20 min y se transfirió el sobrenadante a un tubo de centrífuga separado de 50 mL. Se extrajo el precipitado con 15,0 mL de NH_{4}HCO_{3} 0,1 N dos veces más. Se agruparon los sobrenadantes (total 50 mL). Se lavó el precipitado una vez más con 15 mL de NH_{4}HCO_{3} 0,1 N. Se separó el lavado por centrífuga a 2.000 rpm durante 30 min y se separó. Se transfirió el precipitado a un vial de vidrio WISP con entre 1 y 2 mL de agua, se secó bajo nitrógeno, y se pesaron 0,5 mg después del secado, o 0,5% del material de partida No. 5(5)E-C secado al aire.

Se filtró el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 \mum. Se pipetearon dos alícuotas de 20,0 mL de sobrenadante en dos tubos de centrífuga de 50 mL. Se acidificó la primera alícuota de 20 mL con 30 mL de HCl al 1% en agua y se formó un precipitado esponjoso. Se hizo alcalina la segunda alícuota de 20 mL con 30 mL de NaOH al 1%. La solución alcalinizada permaneció clara y sin que fuera visible ninguna suspensión o precipitado después de permanecer en reposo toda la noche en el refrigerador. La solución de alcalinización también permaneció clara después de ser centrifugada a 2.000 rpm durante 30 minutos o concentrada desde 50 mL hasta 14 mL y centrifugada a continuación. La adición de 20 mL adicionales de NaOH 1N, para asegurar que la solución era alcalina (pH 13,23 a 22,5ºC), no produjo ningún precipitado visible.

Se centrifugó la solución acidificada a 2.000 rpm durante 30 minutos para separar el precipitado en ácido esponjoso. Se lavó el precipitado en ácido con 20 mL de HCl al 1% en agua tres veces. Se separó cada lavado por centrífuga a 2.000 rpm durante 30 minutos y se separó. Se liofilizó el precipitado en ácido lavado, se ensayó para determinar la actividad anti-VIH, y se encontró que era activo: supresión del 76% tanto en el día 3 como en el día 4 a 0,3 mg/mL.

Se fraccionó de nuevo la No. 5(5)E-C secado al aire por disolución directa del mismo en HCl al 1% en agua para preparar el componente activo precipitable en ácido. El sobrenadante en ácido se volvió alcalino para preparar el componente precipitable en base. Se disolvieron 203,8 mg de una muestra de la No. 5(5)E-C secada al aire en 20 mL de HCl al 1% en agua por sonicación de la suspensión durante un (1) minuto tres veces. Se separó la parte soluble en ácido del insoluble en ácido por centrífuga a 2.000 rpm durante 30 min. Se filtró el sobrenadante en ácido (solución de color marrón rojizo) a través de un filtro de 0,22 \mum. Se secó con nitrógeno una alícuota de 2,00 mL del sobrenadante en ácido y se pesaron 12,2 mg, o un 59,9% del material de partida de la No. 5(5)E-C secado al aire. Los restantes 18 mL del sobrenadante de ácido se alcalinizaron con 7,5 mL de NaOH 1 N. Se formó precipitado después de enfriar en un refrigerador durante aproximadamente 5 minutos. Se separó el precipitado en base a partir del sobrenadante en base por centrífuga a 2.000 rpm durante 60 minutos. Se filtró el sobrenadante en base a través de un filtro de 0,22 \mum y se neutralizó con 5,0 mL de HCl al 1% en agua a pH 3,7 (solución de color marrón claro). Se secó con nitrógeno una alícuota de 3,00 mL del sobrenadante de base neutralizado y peso 54,5 mg.

La fracción insoluble en ácido de la No. 5(5)E-C secado al aire se lavó dos veces con 20 mL de HCl al 1% en agua. Se lavó el precipitado en base con 20 mL de NaOH al 1% una vez. Se liofilizaron la fracción insoluble en ácido lavada y el precipitado en base y pesaron 66,6 mg y 18,6 mg, respectivamente, o 32,7% y 10,1% de la No. 5(5)E-C secada al aire.

Se ensayaron la fracción secada insoluble en ácido, la fracción soluble en ácido, el precipitado en base, y el sobrenadante de la base neutralizada para determinar las actividades anti-VIH junto con el material de partida, la No. 5(5)E-C secada al aire. Los resultados se muestran en la Tabla 12, que también muestran el % en peso de cada fracción de la No. 5(5)E-C.

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TABLA 12 Actividades Anti-VIH de las Fracciones de la No. 5(5)E-C Secadas al Aire

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Los resultados demostraron claramente que la fracción insoluble en ácido contuvo el componente activo principal de la No. 5(5)E-C secado al aire. La fracción insoluble en ácido fue bastante activa: supresión del 84% en el día 3 y supresión del 85% en el día 4 a 0,30 mg/mL. La fracción soluble en ácido fue sólo marginalmente activa: supresión del 12% en el día 3 y supresión del 19% en el día 4 a 0,31 mg/mL. Tanto el precipitado de la base como el sobrenadante de la base de la fracción soluble en ácido de la No. 5(5)E-C fueron también marginalmente activos: entre el 12 y el 16% en el día 3 y entre el 10 y el 20% en el día 4 a entre 0,30 y 0,31 mg/mL.

Por consiguiente se concluyó que el componente activo de la No. 5(5)E-C, al igual que el de la No. 5(5)E-A, es también soluble en soluciones entre neutras y ligeramente básicas pero insoluble en soluciones de ácido fuerte.

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3. No. 5(5)E

Ya que los componentes activos de las dos fracciones principalmente activas A y C de la C18-SPE-LC de la No. 5(5)E (Tabla 7) tuvieron propiedades de solubilidad similares (solubles en soluciones entre neutras y básicas y precipitables en un ácido fuerte), los componentes activos principales de la No. 5(5)E pueden prepararse de este modo por precipitación directa en ácido a partir del extracto de agua de la No. 5(5). El precipitado en ácido puede ser purificado de forma adicional a partir del extracto de agua de la No. 5(5). El precipitado de ácido puede ser purificado de forma adicional por redisolución en NH_{4}HCO_{3} 0,1 N y re-precipitación con ácido clorhídrico una o más veces. La solución de NH_{4}HCO_{3} del precipitado en ácido fue filtrada a través de un filtro de entre 0,22 \mum y 0,45 \mum una vez durante uno de los ciclos de purificación para eliminar las partículas insolubles resi-
duales.

Se ensayó el precipitado en ácido purificado seis (6) veces de la No. 5(5)E, o de la No. 5(5)E-AP6X, para determinar la actividad anti-VIH y se encontró que permanecía muy activo, con un 99% de supresión en el día 3 y un 97% de supresión en el día 4 a 0,25 mg/mL, tal como se muestra en la tabla 13. En dicha tabla se muestran las actividades anti-VIH de la No. 5(5) y del crudo de la No. 5(5)E a efectos de comparación. También se listó el rendimiento en tanto por cien (%) de la No. 5(5)E-AP6X de dos determinaciones.

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TABLA 13 Actividades Anti-VIH de las Fracciones Extraíbles en Agua (E), Precipitables en Ácido (AP), y Solubles en Ácido (AS) de la No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(4), No. 5(5), No. 5(8), No. 5(11), G, H

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4. GE

Se ensayó la planta de origen G de la No. 5(5) para ver si el mismo componente activo anti-VIH precipitable en ácido podía ser aislado directamente de la planta. Se obtuvo la planta G secada de un almacén de hierbal local en Taiwán. Se extrajo una muestra de 100,8 g "tal cual" con agua, dos veces, por ebullición de la planta entera seca en 2.900 mL de agua durante 75-76 minutos cada vez. Se separaron el primero (\sim 500 mL después de evaporación) y el segundo (\sim 120 mL después de evaporación) respectivamente del residuo por decantación y se filtraron a través de un papel de filtro Whatman del No. 4. Se acidificó el primer extracto con 400 mL de HCl al 1% en agua y se acidificó el segundo extracto con 145 mL de HCl al 1% en agua. Se formó precipitado en ambos extractos acidificados (pH 1,5 para el primero y de 1,4 para el segundo). Se separó el precipitado en ácido (sólido entre negro y casi negro) del sobrenadante en ácido (solución de color marrón-rojizo oscuro) por centrífuga a 2.000 rpm durante 30 minutos.

Se lavó parte del precipitado en ácido del primer extracto con aproximadamente 30 mL de HCl al 1% en agua; a continuación se enjuagó la pared interior del tubo de centrífuga de 50 mL con aproximadamente 15 mL de agua. Se separaron el lavado ácido y el enjuague de agua del precipitado en ácido por centrífuga a 2.000 rpm durante 30 minutos y se eliminaron. El precipitado en ácido se secó bajo nitrógeno (GE-AP), se ensayó para determinar la actividad anti-VIH y se encontró que era muy activo: 100% de supresión tanto en el día 3 como en el día 4 a 0,30 mg/mL (Tabla 13). Sin embargo, el GE-AP es citotóxico a este nivel, 33% de control, y precisa ser purificado de forma adicional para reducir la citotoxicidad.

Se llevaron a cabo extracciones adicionales con agua hirviendo con láminas de plantas secadas que se cortaron a aproximadamente \leq 1 cm de longitud. Se determinó el porcentaje (%) de extraíbles a partir de las láminas de la planta de dos lotes de la planta siendo de entre el 21 y el 27%. Los extractos de agua de las muestras laminadas se acidificaron con HCl para producir precipitados en ácido que se purificaron a continuación hasta seis ciclos de disolución y de precipitación tal como se ha descrito anteriormente para la No. 5(5)E-AP6X. Se ensayó el GE-AP6X purificado seis (6) veces para determinar la actividad anti-VIH y se encontró que era tan activo como la No. 5(5)E-AP6X, tal como se muestra en la tabla 13. El GE-AP6X mostró un 100% de supresión de la proliferación del VIH en el día 3 y un 99% de supresión en el día 4 a 0,25 mg/mL, mientras que la No. 5(5)E-AP6X mostró un 99% de supresión en el día 3 y un 97% de supresión en el día 4 al mismo nivel. El ensayo de citotoxicidad mostró una semejanza cercana entre los dos componentes activos, entre el 66-93% de proliferación de control para el GE-AP6X y entre el 63-98% para la No. 5(5)E-AP6X a la misma concentración de 0,25 mg/mL.

5. HE

Originalmente se pensó que la Planta H (Dichondra micrantha) era la planta origen de la medicina herbal de hierba única No. 5(5), ya que la planta tenía un nombre trivial chino igual que el de la medicina herbal No. 5(5). Ver H. C. Chang, Medicinal Herbs II, Holiday Publishing Co., Taipei, Taiwan, R.O.C., 27 (1991). De este modo la planta H fue sometida a la misma extracción en agua y precipitación en ácido que la planta G descrita anteriormente.

Se extrajeron las plantas enteras secadas de Dichondra micrantha (H) con agua hirviendo tal como se ha descrito anteriormente para la extracción de la planta G. Se filtró el extracto de agua y se acidificó con HCl y se formó un precipitado. Se ensayó el precipitado en ácido (HE-AP) y el sobrenadante en ácido (HE-AS) para determinar las actividades anti-VIH. Los resultados demuestran claramente que el precipitado en ácido HE-AP es el componente activo del extracto en agua de la planta H, la misma situación que para la planta G y la No. 5(5), tal como se muestra en la Tabla 13.

El precipitado en ácido HE-AP mostró una buena actividad anti-VIH: 85% de supresión en el día 3 y 88% de supresión en el día 4 a 0,30 mg/mL. El sobrenadante en ácido HE-AS no fue activo: 24% de supresión en el día 3 y 0% de supresión en el día 4 a 0,25 mg/mL. Un precipitado en ácido de HE-AP1X purificado una (1) vez de un segundo lote también mostró ser activo: 95% de supresión en el día 3 y un 90% de supresión en el día 4 a 0,25 mg/mL (Tabla 13). Las muestras no fueron tóxicas a los niveles ensayados, con un 83% de proliferación de control para el HE-AP, entre un 93 y un 100% de control para el HE-AP1X, y entre un 87 y 91% de control para el HE-AS.

6. No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(4) y No. 5(8)

Debido a que los componentes activos de No. 5(5) y de las plantas G y H fueron todos ellos extraíbles con agua y precipitables con ácido, es lógico ver si los componentes activos de otras medicinas herbales de hierba única activos anti-VIH tienen propiedades similares. Por consiguiente, se ensayó si las medicinas herbales activas contenían componentes precipitables en ácido, y si así era, si estos componentes eran activos.

Se extrajo una muestra de 5,0 g de cada medicina herbal de hierba única No. 4(2), No. 4/3), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(4) y No. 5(8) con aproximadamente 40 mL de agua dos veces en un tubo de centrífuga de plástico de 50 mL. Se separó cada extracto del material insoluble por centrífuga a 2.000 rpm durante entre 40 y 120 minutos. Se combinaron el primero y el segundo extractos de cada muestra y a continuación se filtraron a través de un filtro de 0,22 \mum. Se secó con nitrógeno una alícuota de 2,00 mL de cada extracto y se pesó. El extracto restante de cada muestra se acidificó con 10 mL de HCl al 1% en agua. Se formaron precipitados en todos los extractos acidificados, excepto en las No. 4(3) y No. 5(4). No se formó ningún precipitado en el extracto acidificado de la No. 4(3), incluso después de un reposo prolongado (9 horas) en un refrigerador y adición de 10 mL más de HCl al 1% en agua. El extracto acidificado de la No. 5(4) mostró sólo turbidez y formó una traza de precipitado después de centrifugación a 2.000 rpm durante 20 minutos.

Se separó cada precipitado en ácido de su sobrenadante por centrifugación a 2.000 rpm durante 20 minutos. Se lavó cada precipitado en ácido con 5 mL de HCl al 1% en agua. Se separó el lavado ácido por centrífuga a 2.000 rpm durante 20 minutos y se eliminó. Cada precipitado en ácido se secó con nitrógeno y se pesó.

Se combinó cada sobrenadante del ácido con 10 mL más de HCl al 1 5 en agua. Después de permanecer durante cuatro (4) días a temperatura ambiente, se formaron de nuevo precipitados en diferentes grados en todos los sobrenadantes acidificados de forma adicional, excepto en la No. 4(3). Se separó cada sobrenadante del ácido del precipitado por centrifugación a 2.000 rpm durante 80 minutos, se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum, y se secó al aire. Se disolvió de nuevo cada sobrenadante de ácido en NH_{4}HCO_{3} 0,1 N, se transfirió a un vial de vidrio WISP, y se liofilizó.

Se ensayaron los extractos de agua (E), los precipitados en ácido (AP), y los sobrenadantes de ácido (AS), secados, de la No. 4(2), No. 4(4) y No. 4(5) para determinar sus actividades anti-VIH. También se ensayaron los extractos de agua (E) y los precipitados de ácido (AP) de la No. 5(1) y de la No. 5(8). Debido a que la No. 4(3) no tuvo precipitado en ácido y la No. 5(4) tuvo sólo una cantidad de precipitado en ácido durante un minuto (0,3 mg), sólo se ensayaron sus extractos en agua (E) para determinar sus actividades anti-VIH. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

Los resultados muestran que los extractos de agua (E) de la No. 4(3) y No. 4(4) permanecieron muy activos: 97% de supresión en el día 3 y 89% de supresión en el día 4 para la No. 4(3)E y un 100% de supresión tanto en el día 3 como en el día 4 para la No. 4(4)E a 0,5 mg/mL. Sin embargo, las actividades de los extractos de agua (E) de la No. 4(2), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(4) y No. 5(8) fueron sorprendentemente bajas: entre el 2 y el 62% de supresión en el día 3 y entre el 0 y el 24% de supresión en el día 4 al mismo nivel de ensayo de 0,5 mg/mL. En comparación, los polvos de la medicina herbal original tuvieron actividades entre moderadas y muy buenas: entre el 73 y el 100% de supresión en el día 3 y entre el 50 y el 100% de supresión en el día 4 a 2,5 mg/mL.

Incluso de forma más sorprendente, todos los precipitados en ácido (AP) mostraron actividades anti-VIH entre moderadas y buenas: 83% de supresión tanto el día 3 como en el día 4 para la No. 4(2)E-AP, 85% de supresión en el día 3 y 95% de supresión en el día 4 para la No. 4(4)E-AP, 86% de supresión en el día 3 y 80% de supresión en el día 4 para la No. 4(5)E-AP, 62 5 de supresión en el día 3 y 74% de supresión en el día 4 para la No. 5(1)E-AP, y 45% de supresión en el día 3 y 61% de supresión en el día 4 para la No. 5(8)E-AP a entre 0,1 y 0,3 mg/mL. El sobrenadante en ácido (AS) de la No. 4(4)E fue bastante activo, con un 91% de supresión en el día 3 y un 82% de supresión en el día 4 a 0,25 mg/mL. Los sobrenadantes en ácido (AS) de la No. 4(2)E y No. 4(5)E fueron prácticamente inactivos: entre el 0 y el 4% de supresión en el día 3 y entre el 0 y el 1% en el día 4 a 0,25 mg/mL.

Debido a que los extractos en agua (E) de la No. 4(2), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(4) y No. 5(8) son mucho menos activos que sus polvos originales y los precipitados de ácido (AP) de la No. 4(2), No. 4(5), No. 5(1) y No. 5(8) son bastante activos, se ha planteado la hipótesis de que la mayoría de componentes activos de estos polvos pueden no haber sido extraídos de forma efectiva en agua (pH entre 4,0 y 5,1). Se espera que el ajuste del pH de la solución a neutro o ligeramente alcalino ayude a mejorar la extracción.

Se concluyó que los componentes activos de la No. 4(2) y de la No. 4(5) son precipitables por ácido. El componente activo de la No. 4(3) es insoluble tanto en agua como en ácido. La No. 4(4) contiene los dos componentes activos, uno soluble en ácido y uno precipitable en ácido. La No. 5(1) y la No. 5(8) contienen componentes activos precipitables en ácido.

7. No. 5(11)

Los componentes de hierba única No. 5(10) y No. 5(11) se incluyeron en la mezcla de hierbas HHT888-5 para el tratamiento de portadores de HBV (Ver Ejemplo 3). Tanto la No. 5(10) como la No. 5(11) no se incluyeron en los primeros ensayos de valoración anti-EMuLV y anti-VIH para prevenir su potencial interferencia con los ensayos antivirales.

Los anteriores descubrimientos muestran que todos los componentes precipitables en ácido o precipitados en ácido aislados de las medicinas herbales de hierba única y las plantas medicinales No. 4(2), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(5), No. 5(8) y H son activos anti-VIH. Por consiguiente, es pronosticable que los componentes precipitables en ácido
o los precipitados en ácido, si los hay, aislados de otras medicinas herbales o plantas también serán activos anti-VIH.

Para ensayar la hipótesis, se extrajeron las medicinas herbales de hierba única No. 5(10) y No. 5(11) con agua y sus extractos acuosos se acidificaron con HCl para ver si se formaban precipitados en ácido. Se extrajeron 90,4 g de muestra de No. 5(10) con veinte (20) veces de agua (1804 a 1808 mL) a temperatura ambiente dos veces, seguido por extracción con 900 mL de NH_{4}HCO_{3} 0,1 N una vez. Se extrajeron 90,8 g de muestra de No. 5(11) con diez (10) veces agua (908 mL) a temperatura ambiente dos veces, seguido por extracción con 870 mL de NH_{4}HCO_{3} 0,1 N una vez. La extracción se llevó a cabo en un frasco Erlenmeyer de 2000 mL de vidrio y se sometió a agitación magnética durante un tiempo comprendido entre (1) hora y toda la noche. Se separó el extracto del insoluble por centrífuga a 8.000 rpm durante 40 minutos.

Cuando se acidificó 1,0 mL del extracto con 1,5 mL de HCl al 1% en agua, los dos extractos de agua y el extracto de NH_{4}HCO_{3} de la No. 5(10) no mostraron precipitados visibles incluso después de permanecer toda la noche en el refrigerador. El primer extracto de agua de la No. 5 (11) se volvió de color marrón y se formó un precipitado casi inmediatamente. El segundo extracto de agua de la No. 5(11) se volvió de color ligeramente amarillo y ligeramente opaco, y formó una pequeña cantidad de precipitado después de ser mantenido toda la noche a temperatura ambiente. El extracto de NH_{4}HCO_{3} de la No. 5(11) se volvió casi incoloro y con un precipitado coloidal de color blanco. Se predijo que la No. 5(11) y su precipitado en ácido fue previsiblemente activo anti-VIH.

Se liofilizó y se pesó una alícuota de 10,0 mL de cada extracto. El total extraíble de la No. 5(10) fue de 66,3%. El de la No. 5(11) fue del 53,8%. La mayor parte del extraíble de la No. 5 (10) se extrajo con dos extracciones de agua que constituyó el 97,9% del total extraíble. La mayor parte del extraíble de la No. 5(11) se extrajo en la primera extracción con agua (93,5%). La segunda extracción en agua fue necesaria para la No. 5(10), que constituyó el 31,2% del total extraíble. Para la No. 5(11), la segunda extracción con agua y la extracción con NH_{4}HCO_{3} constituyeron sólo el 5,4% y el 1,1% respectivamente.

Los restantes 868 mL del primer extracto con agua, los 898 mL del segundo extracto con agua y los 828 mL del extracto de NH_{4}HCO_{3} de la No. 5(11) fueron acidificados con 14,6, 14,6 y 13,4 mL de HCl concentrado (37%), respectivamente. El primer extracto de agua formó un precipitado casi inmediatamente. El segundo extracto acidificado y el extracto de NH_{4}HCO_{3} se volvieron turbios y formaron un precipitado después de toda la noche en reposo en el refrigerador. Se separó el precipitado en ácido (AP) de cada extracto acidificado de su sobrenadante de ácido (AS) por centrífuga a 2.000 rpm durante 40 minutos. Los sobrenadantes de ácido del primero y segundo extractos de agua se agruparon en un frasco Erlenmeyer de vidrio de 2000 mL. Se extrajo una muestra de 200 mL de cada uno de los sobrenadantes en ácido de los extractos en agua acidificados y el extracto de NH_{4}HCO_{3} se centrifugó a 8.000 rpm durante 40 minutos y se filtró a través de un filtro de 0,22 mm. Se secaron bajo nitrógeno 20,0 mL cada sobrenadante de ácido micro-filtrado, se redisolvieron en agua, y se liofilizaron.

Se enjuagaron los precipitados en ácido de la No. 5(11)E del primero y segundo extractos en agua acidificados y el extracto de NH_{4}HCO_{3} acidificado con aproximadamente entre 20 y 40 mL de agua dos veces. Los enjuagues de agua se separaron por centrífuga a 2.000 rpm durante 40 minutos y se eliminaron. Los precipitados en ácido se liofilizaron y se pesaron. El rendimiento en tanto por ciento (%) del precipitado en ácido fue del 4,36% de la No. 5(11). Se aisló la mayor parte (96,3%) del precipitado en ácido del polvo original por la primera extracción con agua.

Se ensayaron para determinar las actividades anti-VIH la No. 5(10), No. 5(11), el extracto de agua de la No. 5(10) o la No. 5(10)E, el primer extracto de agua de la No. 5(11) o la No. 5(11)E, el precipitado en ácido del primer extracto de agua acidificado de la No. 5(11) o la No. 5(11)E-AP, y el sobrenadante en ácido del primer y el segundo extracto de agua agrupados y acidificados de la No. 5(11) o de la No. 5(11)E-AS. Los resultados (Tabla 13) muestran que la No. 5(10) y su extracto en agua No. 5(10)E son esencialmente no activos: 65% de supresión en el día 3 y 0% de supresión en el día 4 para la No. 5(10) a 2,5 mg/mL y 0% de supresión tanto en el día 3 como en el 4 para la No.5(10)E a 2,0 mg/mL. La No. 5(11), su extracto en agua No. 5(11)E, y el sobrenadante en ácido No. 5(11)E-AS fueron moderadamente activos: 92% de supresión en el día 3 y 74% de supresión en el día 4 para la No. 5(11) a 2,5 mg/mL; 87% de supresión en el día 3 y 73% de supresión en el día 4 para la No. 5(11)E a 2,0 mg/mL; y 84% de supresión en el día 3 y 65% de supresión en el día 4 para la No. 5(11)E-AS a 0,5 mg/mL. El precipitado en ácido No. 5(11)E-AP es de nuevo bastante activo: 91% de supresión en el día 3 y 87% de supresión en el día 4 a 0,3 mg/mL.

Los resultados muestran que la No. 5(11) contiene dos componentes activos, uno es soluble en ácido y otro es precipitable por ácido. Ambos componentes activos son extraíbles a partir de la No. 5(11) por agua. Esto apoya un aspecto adicional de la invención, que es que todos los componentes precipitables en ácido o los precipitados en ácido de las plantas seleccionadas tal como se relacionan en esta solicitud, y posiblemente cualquier planta, son agentes farmacéuticos efectivos.

Ejemplo 10 Aislamiento de Componentes Activos

Se han aislado componentes activos tanto de polvos de extractos comerciales como de plantas por extracción con agua. Preferiblemente, la cantidad de agua para el material de planta secado puede oscilar entre 5 y 10 veces (peso/volumen) y al menos se llevaron a cabo dos extracciones. El pH de la solución de la extracción se ajusta de forma preferible con una solución alcalina, tal como una solución de NaOH, hasta pH neutro o ligeramente alcalino, (7 a 8) para facilitar la extracción. La extracción puede llevarse a cabo tanto a temperatura ambiente (polvos comerciales) o por ebullición (plantas laminadas o pulverizadas) durante una hora o más).

El extracto soluble puede separarse a partir del material de la planta insoluble por filtración (es decir., película de nylon y papel de filtro) o por centrifuga (2.000 a 8.000 rpm durante 40 minutos o más tiempo). A continuación se acidificó el extracto con cualquier ácido fuerte, tal como HCl (aproximadamente 0,6% de la concentración final o solución de pH \leq 2) para producir el precipitado de ácido activo. El precipitado de ácido puede ser separado por centrífuga tal como a 8.000 rpm durante 40 minutos o más tiempo. El precipitado puede ser purificado por ciclos repetitivos de disolución en solución neutra o alcalina tal como NH_{4}HCO_{3} 0,1 N y precipitación subsiguiente en ácido. Los insolubles pueden ser separados por centrífuga (tal como a 8.000 rpm durante 40 minutos o más) o por microfiltración (tal como a través de un filtro de 0,2 a 0,45 \mum).

El precipitado de ácido purificado puede ser liofilizado, secado bajo nitrógeno, o secado al aire. Puede también ser convertido en la sal amónica por disolución del ácido en una solución amónica tal como una solución de bicarbonato amónico o de hidróxido amónico que a continuación es liofilizada o secada por pulverización. El precipitado en ácido purificado también puede ser convertido en otras sales, tal como las sales de sodio, por disolución del ácido en una solución adecuada, tal como NaHCO_{3}. El precipitado en ácido también puede ser separado de la matriz por cromatografía de columna de C18.

Se aislaron los componentes activos anti-VIH extraíbles en agua y precipitables en ácido químicamente relacionados de siete (7) medicinas herbales de hierba única activa anti-VIH: No. 4(2), No. 4(3), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(5), No. 5(8), No. 5(11) y dos (2) plantas medicinales Aeginetia indica (G) y Dichondra micrantha (H) identificadas en los Ejemplos 5 y 6 por el procedimiento de extracción con agua y de precipitación con agua descrito anteriormente.

Como un ejemplo específico, las No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(4), No. 5(5), No. 5(8) y No. 5(11) se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 2 siendo extraídos dos veces con agua a temperatura ambiente (aproximadamente a 25ºC) con dos veces de entre 8 y 10 mL de agua por gramo de muestra (por ej., 5 g de polvo con 40 mL de agua o 50 g de polvo con 500 mL de agua o 100 g de polvo con 1000 mL de agua). Se mezcló la suspensión de agua para extraer tanto por sonicación durante un (1) minuto, reposo de diez (10) minutos y sonicación durante un (1) minuto; o por agitación magnética durante quince (15) minutos o más tiempo dependiendo del tamaño de la muestra y del volumen de la suspensión. Por ejemplo, la suspensión conteniendo 5 g de polvo en 40 mL de agua se sonicó durante un (1) minuto, se mantuvo en reposo durante diez (10) minutos y se sonicó de nuevo durante un (1) minuto durante la extracción. Se agitó magnéticamente la suspensión conteniendo entre 50 y 100 g de polvo en 500 a 1000 mL de agua durante quince (15) minutos o más tiempo durante la extracción. Se separó el extracto de agua de los materiales insolubles por centrífuga a entre 1.500 y 8.000 rpm durante entre veinte (20) y cuarenta (40) minutos y filtración a través de un filtro tal como un papel de filtro Whatman del No. 4.

Se lavaron las plantas medicinales Aeginetia indica (G) y Dichondra micrantha (H), o las plantas originales de las medicinas herbales No. 5(5) y H, con agua fría, se secaron, se rompieron en pequeños trozos, y se extrajeron con agua hirviendo tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Se enfriaron los extractos de agua hasta temperatura ambiente y se separaron de los materiales de la planta insolubles por decantación y filtración a través de una película de nylon (con aperturas de entre 1,3 y 1,5 mm), se centrifugó a entre 1.500 y 8.000 rpm durante entre veinte (20) y cuarenta (40) minutos, y se filtró de nuevo a través de un papel de filtro Whatman del No. 4.

A continuación se acidificaron los extractos de agua para formar precipitados mediante la adición de ácido clorhídrico hasta un pH de \leq 2. Se separó cada precipitado de ácido de la solución de ácido por centrífuga en tubos o botellas de centrífuga de plástico. Se lavó cada precipitado de ácido al menos tres veces con agua o ácido clorhídrico de entre 0,1 y 1%.Las muestras del extracto de agua, del precipitado de ácido (componentes insolubles en ácido) y del sobrenadante del ácido (componente soluble en ácido) de cada una de las muestras se secó bajo nitrógeno, se secó al aire o se liofilizó. Estas muestras fueron sometidas a continuación a un a valoración y caracterización adicionales.

Los precipitados en ácido purificados No. 5(5)E-AP1X, No. 5(5)E-AP6X, GE-AP1X, GE-AP2X, GE-AP6X, HE-AP1X, HE-AP6X, No. 4(2)E-AP1X, No. 5(8)E-AP1X, No 5(11)E-AP1X, y sus sales de amonio No. 5(5)E-AP1X-NH_{4}, GE-AP2X-NH_{4}, HE-AP1X-NH_{4}, No. 5(8)E-AP1X-NH_{4}, No. 5(11)E-AP1X-NH_{4} y No. 4(2)E-AP1X-NH_{4} fueron preparados de este modo tal como se ha descrito anteriormente. La nomenclatura utilizada en la presente invención y en las reivindicaciones puede ser ilustrada del modo siguiente: No. 5(5)E-AP1X significa la medicina de hierba única No. 5(5) derivada de la Aeginetia indica que fue extraída en agua (E), precipitada en ácido (AP) y purificada una vez (1X) por re-disolución en una solución neutra o alcalina y por re-precipitación con ácido para dar lugar a la entidad química final designada como No. 5(5)E-AP1X.

Por ejemplo, la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4} se preparó por lavado en primer lugar de entre 4,0 y 4,9 g de No. 5(%)E-AP1X en tubos de centrífuga de 50 mL, respectivamente, con aproximadamente cuatro veces de 40 mL de agua. Se separaron los lavados de agua por centrífuga a 2.000 rpm durante 40 minutos y se eliminaron. Se liofilizaron los AP1X's lavados con agua (total de 11,4 g) y a continuación se disolvieron en aproximadamente 600 mL de NH_{4}HCO_{3} entre 0,1 y 0,2 N. Se centrifugó la solución a 2.000 rpm durante 40 minutos y se filtró el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 \mum a vacío. Se liofilizó el filtrado y de este modo se preparó la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4}.

Se preparó el GE-AP2X-NH_{4} por disolución de 690,8 mg de GE-AP2X en 20,0 mL de NH_{4}HCO_{3} 0,2 N. se centrifugó la solución a 8.000 rpm durante 40 minutos. No se observó ningún precipitado. Se filtró el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 \mum. Se liofilizó el sobrenadante y de este modo se preparó el GE-AP2X-NH_{4}.

Las otras muestras se prepararon de modo similar.

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Ejemplo 11 Caracterización de los Componentes Activos 1. Componentes Activos de la No. 5(5)

La No. 5(5)E-A-AP y la No. 5(5)E-C-AP, fueron previamente identificados como el componente activo de la No. 5(5). Parece que estos componentes son homólogos poliméricos de ácidos orgánicos en base a sus solubilidades, a la HPSEC, a la C18-SPE-LC, y al análisis elemental. Ambos ácidos tienen propiedades similares, excepto la distribución de peso molecular y la retención en la columna de C18. Ambos ácidos son insolubles en soluciones acuosas ácidas pero se hacen solubles como sales en soluciones acuosas neutras y básicas. Son estables al aire, al calor, al ácido, al medio alcalino débil, y a los disolventes orgánicos comunes.

El análisis elemental del precipitado en ácido purificado seis veces No. 5(5)E-AP6X tal como se muestra en la Tabla 14 muestra un elevado contenido de carbono (50,98%) y un bajo contenido de cenizas (2,35%). Esto indica que la No. 5(5)E-AP6X es un ácido orgánico. El análisis elemental de la superficie de rayos X por SEM (Microscopía de Barrido de Electrones) de la No. 5(5)E-AP6X indicó la presencia de carbono, oxígeno, fósforo, cloro, y azufre. No se detectó ni arsénico, ni plomo, ni mercurio ni hierro. Sin embargo, la No. 5(5)E-AP6X y sus componentes No. 5(5)E-A-AP y la No. 5(5)E-C-AP, fueron todos ellos solubles en disolventes orgánicos comunes, incluyendo etanol, isopropanol, acetona, acetonitrilo, cloroformo, y hexano. La No. 5(5)E-A-AP también es insoluble en metanol. Esto indica que estos precipitados en ácido activos no son ácidos orgánicos simples.

TABLA 14 Análisis Elemental y Contenidos de Cenizas de Precipitados en Ácido Purificados Seis Veces (AP6X) de No. 5(5)E, GE y HE

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Todos los precipitados en ácido (AP) investigados son ligeramente solubles en agua a una velocidad de disolución lenta. Todos se hicieron más solubles y a una mayor velocidad en una mezcla de agua y etanol, tal como agua y etanol en una relación de 40 a 60 en volumen. Esto indica que los precipitados en ácido son de naturaleza polimérica tal como se ha soportado por el análisis de HPSEC.

La Figura 1 muestra el perfil de HPSEC al perfil de UV a 214 nm de la No. 5(5)E-A-AP1X, y la Figura 2 muestra la de la No. 5(5)E-C-AP. La columna utilizada para el análisis del HPSEC fue una columna Varian MicroPak TSKgel-G3000 PW_{XL} (7,8 mm de diámetro interior x 30 cm de largo) con una columna de protección TSK PW_{XL} (6,0 mm de diámetro interno x 4,0 cm de largo). La fase móvil fue NH_{4}HCO_{3} 0,1 N a una velocidad de flujo de 0,80 mL/min. Se prepararon las muestras en la fase móvil a entre 0,92 y 0,93 mg/mL. El volumen de inyección fue de 100 \muL. Los resultados muestran que la No. 5(5)E-A-AP1X contiene dos picos de absorción de UV, uno es menor a un tiempo de retención de 7,55 minutos y otro es mayor y más ancho con un tiempo de retención de 9,55 minutos. El pico menor se eluyó al extremo principal del pico ancho y contiene las moléculas más grandes. También hay unos pocos picos menores superpuestos en el extremo de la cola del pico ancho principal. La No. 5(5)E-C-AP contuvo un pico de absorción de UV ancho a un tiempo de retención de 9,93 minutos, que es similar al pico principal de la No. 5(5)E-A-AP1X. Sin embargo, la No. 5(5)E-C-AP no tiene el pico conteniendo mayores moléculas que la punta del pico principal de No. 5(5)E-A-AP1X.

La No. 5(5)E-A-AP1X y la No. 5(5)E-C-AP se fraccionaron por HPSEC (cromatografía de exclusión de tamaño de alta presión) bajo las condiciones descritas anteriormente utilizando NH_{4}HCO_{3} 0,1 N como fase móvil a una velocidad de flujo de 0,80 mL/min. Se preparó cada ejemplo en la fase móvil a 6,1 y 6,2 mg/mL y se inyectó a entre 100 y
200 \muL por inyección. Se recogieron veinticuatro fracciones a 1,25 min o a intervalos de 1,00 mL para cada ciclo de 30 min. La Figura 3A muestra el perfil de HPSEC de UV a 214 nm y la Figura 3B muestra el perfil de RI de la No. 5(5)E-A-AP1X. La Figura 4 muestra el perfil de HPSEC de UV a 214 nm y la Figura 4B muestra el perfil de RI de la No. 5(5)E-C-AP.

Las fracciones de HPSEC de la No. 5(5)E-A-AP1X contiene fracciones marrón con pico a la Fracción 8 y coincide con el pico ancho principal de tiempo de retención 9,55 min en el perfil de UV (Figura 1) o de 9,66 min en el perfil de RI (Figura 3B). Las fracciones de HPSEC de la No. 5(5)E-C-AP también contuvieron fracciones marrones con pico a las Fracciones 8 y 9 y coincide con el pico principal de tiempo de retención de 9,93 min. En el perfil de UV (Figura 2) o de 10,08 min. En el perfil de RI (Figura 4B). Se analizó una alícuota de un (1) mL de cada una de las Fracciones 6 y 14 por HPSEC por el mismo sistema de HPSEC a un volumen de inyección de 100 \muL. Los resultados muestran que cada fracción tiene un tiempo de retención del pico diferente y el pico extendido a No. 5(5)E-A-AP1X y No. 5(5)E-C-AP fue real. Por consiguiente la No. 5(5)E-A-AP1X y la No. 5(5)E-C-AP estuvieron compuestos de polímeros o oligómeros con una relativamente amplia distribución de pesos moleculares.

Una alícuota de 1,30 mL de las fracciones 6 a 16 de HPSEC de la No. 5(5)E-A-AP1X se secaron individualmente bajo nitrógeno o se agruparon en un vial de WISP. También se secó con nitrógeno, de la misma manera, una alícuota de 1,31 mL de cada una de las Fracciones 7 a 16 de la HPSEC de la No. 5(5)E-C-AP. Se ensayaron las muestras secadas para determinar la actividad anti-VIH a un nivel equivalente a 0,30 mg/mL de sus respectivos materiales de partida. También se ensayó de modo concurrente la No. 5(5)E-A-AP1X a 0,31 mg/mL. La Tabla 15 muestra las actividades anti-VIH de las fracciones de HPESEC de la No. 5(5)E-A-AP1X y la No. 5(5)E-C-AP junto con su porcentaje de distribución en peso (%).

TABLA 15 Actividades Anti-VIH y Distribución en % en Peso de las fracciones de la HPSEC de la No. 5(5)E-A-AP1X y No. 5(5)E-C-AP

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Los resultados indican claramente que la actividad principal de la No. 5(5)E-A-AP1X se extiende por las tres fracciones, las fracciones 7 a 9, y aparece un pico al pico de masa de la fracción 8 (supresión del 80% en el día 3 y supresión del 83% en el día 4 a 0,1 mg/mL). La principal actividad de la No. 5(5)E-C-AP también se extiende por encima de las tres fracciones, las fracciones 8 a 10, y aparece el pico a las fracciones 8 y 9 (95 al 98% de supresión en el día 3 y 85 a 92% de supresión en el día 4 a 0,05 mg/mL. Debe señalarse que la masa de No. 5(5)E-C-AP tuvo pico a la fracción 10 que, sin embargo, fue sólo marginalmente activa, supresión del 80% en el día 3 y supresión del 35% en el día 4 a 0,08 mg/mL.

Por ultrafiltración, se encontró que una fracción de la HPSEC, la fracción 8, de la No. 5(5)E-C-AP, contenía moléculas oligoméricas de peso molecular comprendido entre 1.000 y 3.000 daltons. Se encontró que otra fracción de la HPSEC, la fracción 9, contenía moléculas poliméricas de peso molecular mayor que 3.000 daltons. La fracción 9 fue más lipofílica que la fracción 8, debido a que la Fracción 9 contuvo mayores moléculas pero eluidas más tarde que la fracción 8 en la HPSEC utilizando NH_{4}HCO_{3} 0,1 N como fase móvil. Ambos fueron ensayadas resultando comparablemente activas: 95% de supresión en el día 3 hasta un 85% de supresión en el día 4 para la Fracción 8 y entre el 91 y el 98% de supresión en el día 3 y entre el 87 y el 92% de supresión en el día 4 para la Fracción 9 a entre 0,05 y 0,25 mg/mL. Además, una fracción 8 de la HPSEC purificada cromatográficamente de la No. 5(5)E-C-AP mostró una respuesta a la dosis frente a la proliferación de VIH y tuvo una IC_{50} (inhibición de la concentración del 50%) de 6 \mug/mL en el día 3 y de 17 \mug/mL en el día 4. Los resultados se muestran en la tabla 16. Como comparación, la IC_{50} del AZT fue de 3 ng/mL en el día 3 y de 21 ng/mL en el día 4, y la del d4T fue de 32 nM en el día 3 y de 540 nM en el día 4, cuando se ensayaron de forma concurrente.

TABLA 16 Actividades Anti-VIH de las Fracciones 8 y 9 de la HPSEC de la No. 5(5)E-C-AP a Diferentes Concentraciones

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La Figura 5A muestra el perfil de UV de la HPSEC a 214 nm y la Figura 5B muestra el perfil de RI de la fracción 8 de la HPSEC purificada cromatográficamente de la No. 5(5)E-C-AP. La Fracción 9 de la HPSEC de la No. 5(5)E-C-AP se eluyó ligeramente más tarde que la Fracción 8 y tiene una distribución similar pero más ancha y pico de cola debido a la interacción no específica con el empaquetado de la columna causado por su lipofilicidad. Cada fracción fue analizada además por HPLC.

La Figura 6A muestra el perfil de UV de la C18-HPLC a 214 nm de la Fracción 8 purificada de la HPSEC de la No. 5(5)E-C-AP y la Figura 6B muestra la Fracción 9 de la HPSEC, utilizando NH_{4}HCO_{3} 0,1 N conteniendo un 30% de etanol como fase móvil a una velocidad de flujo de 0,80 mK/min. La columna de HPLC fue una columna de C18 Rainin Microsorb-MV (partículas de 5 \mum, tamaño de poro de 100 \ring{A}, 4,6 mm de diámetro interno x 25 cm de longitud), las muestras fueron preparadas en la fase móvil a 1,0 mg/mL, y el volumen de inyección fue de 5 \muL.

Los resultados muestran que la fracción 8 purificada (Fig. 6A) contiene un pico principal a un tiempo de retención de 2,48 minutos y un pico menos lipofílico con un tiempo de retención de 2,24 minutos. La Fracción 9 (Fig. 6B) contiene principalmente un pico a un tiempo de retención de 2,56 minutos. Los picos principales tanto de la fracción 8 como de la Fracción 9 fueron muy similares.

Los puntos de fusión, en el caso en que los hubiera, de la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4} y de su Fracción 8 purificada por HPSEC se determinaron superiores a 400ºC. Esto es altamente inusual ya que la mayoría de los compuestos orgánicos tienen puntos de fusión de menos de 300ºC.

La Figura 11 muestra los espectros de IR del componente activo extraíble en agua y precipitable en ácido de la No. 5(5) en su forma ácida (No. 5(5)E-AP6X) y la Figura 12 es la sal amónica del (No. 5(5)E-AP6X-NH_{4}). Las muestras se prepararon en pastillas de KBr y para las determinaciones se utilizó un espectrómetro Perkin Elmer FT-IR. Las absorciones de la forma ácida a 1636, 1452 y 1402 cm^{-1}indican enlaces C=C. la absorción a 2362 cm^{-1} indica
CO (gas) que puede ser un contaminante. Las bandas de absorción entre 2850-2975 cm^{-1} indican H-C-H (doblamiento). La no absorción por debajo de 600-700 cm^{-1} indica la ausencia de grupos aromáticos y el pico agudo a 698 cm^{-1}proviene del estándar de calibración.

La constatación de que el componente extraíble en agua y el precipitable en ácido de la No. 5(5) contienen sustancias lipofílicas está apoyado además por el análisis de HPSEC de la No. 5(5)E-AP tal como se describe a continuación.

2. Componentes Activos G y H

Los componentes activos de las plantas G y H se comportan de modo similar al de la No. 5(5). Ambos son ácidos orgánicos poliméricos que son solubles en soluciones acuosas neutras y ligeramente básicas y son precipitables por ácido. El análisis elemental (Tabla 14) de los precipitados en ácido purificados seis veces del GE y del HE muestran que ambos contienen contenidos de carbono elevados (46,47 a 54,69%) y bajos contenidos de cenizas (0,60 a 1,99%).

Las Figuras 7, 13 y 17 muestran los perfiles de UV de la HPSEC a 214 nm de los componentes activos extraíbles en agua y precipitables en ácido de la No. 5(5), G y H, respectivamente, utilizando NH_{4}HCO_{3} 0,3 N conteniendo un 30% de acetonitrilo como fase móvil a una velocidad de flujo de 0,80 mL/min. La columna fue una columna Varian MicroPak TSKgel-G3000 PW_{XL} (7,8 mm de diámetro interno x 30 cm de longitud) con una columna de protección TSK PW_{XL} (6,0 mm de diámetro interno x 4,0 cm de longitud). Las muestras se prepararon en NH_{4}HCO_{3} 0,3 N a entre 0,65 y 1,4 mg/mL. El volumen de inyección es de 100 \muL.

La Figura 8 muestra el perfil de UV de la HPSEC del componente activo extraíble en agua y precipitable en ácido de la No. 5(5) en forma de la sal de amonio, o la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4}. La Figura 14 muestra el G en forma de una sal de amonio, o GE-AP2X-NH_{4}. La Figura 18 muestra al H también en la forma de la sal de amonio, o el HE-AP1X-NH_{4}. La fase móvil fue NH_{4}HCO_{3} 0,1 N a una velocidad de flujo de 0,80 mL/min. La columna fue una columna Varian MicroPak TSKgel-G3000 PW_{WL} (7,8 mm de diámetro interno x 30 cm de longitud) con una columna de protección TSK PW_{XL} (6,0 mm de diámetro interno x 4,0 cm de longitud). Las muestras son las sales de amonio de los componentes activos, No. 5(5)E-AP1X-NH_{4} (Fig. 8), GE-AP2X-NH_{4} (Fig. 14) y HE-AP1X-NH_{4} (Fig. 18) que se prepararon en NH_{4}HCO_{3} 0,1 N a 1,0 mg/mL. El volumen de inyección fue de 50 \muL.

Los pesos moleculares de los componentes activos extraíbles en agua y precipitables en ácido de la No. 5(5), G y H se estimaron por análisis de HPSEC siendo principalmente entre 1.000 y 12.000 daltons, aunque sin embargo, algunos fueron menores de 1.000 daltons.

La Figura 9 muestra el perfil de UV del gradiente de RP-HPLC de la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4}, la Figura 15 muestra el del GE-AP1X-NH_{4} y la Figura 19 muestra el del HE-AP1X-NH_{4}. La columna fue una columna POROS R2/H de PerSeptive Biosystems' (4,6 mm de diámetro interno x 10 cm de longitud). La fase móvil fue bicarbonato amónico 0,1 N conteniendo entre un 2% y un 60% de etanol de acuerdo con el gradiente descrito en la tabla 17 a una velocidad de flujo de 2,00 mL/min. El volumen de inyección es de 20 \muL

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TABLA 17 Gradiente de RP-HPLC

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La Figura 10 muestra los espectros de UV de la No. 5(5)E-AP6X/Fig. 10A), GE-AP6X (Fig. 10B) y HE-AP6X (Fig. 10C) en solución de bicarbonato amónico con ningún disolvente como blanco para corrección. Los tres espectros son similares y todos ellos tienen un máximo de absorción entre 204 y 206 nm.

La Figura 16 muestra el espectro de IR del componente extraíble en agua y precipitable en ácido de G en forma de sal amónica (GE-AP2X-NH_{4}), la Figura 20 muestra el del HE-AP1X-NH_{4}. Las muestras se prepararon en pastillas de KBr y se utilizó un espectrómetro Perkin Elmer FT-IR para la determinación.

3. Componentes Activos de la No. 4(2), No. 4(3), No. 4(4), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(8) y No. 5(11)

Los componentes activos de todas las muestras que mostraron ser activas fueron solubles en el medio de cultivo de células neutro. Los componentes activos de la No. 4(2), No. 4(5), No. 5(1), No. 5(8) y No. 5(11) son precipitables por ácido, mientras que la No. 4(3) no lo es. El componente activo de la No. 4(3) es soluble tanto en agua como en solución ácida. El componente activo de la No. 4(4) también es soluble en agua. Sin embargo parte del componente activo de la No. 4(4) es precipitable por ácido y parte no lo es.

La Figura 21 muestra los perfiles de UV de HPSEC del componente activo extraíble en agua y precipitable en ácido de la No. 5(8) en forma de sal de amonio, No 5(8)E-AP1X-NH_{4}. La Figura 24 muestra el de la No. 5(11)E-AP1X-NH_{4} y la Figura 27 muestra la de la No. 4(2)E-AP1X-NH_{4}. la fase móvil fue NH_{4}HCO_{3} 0,1 N como fase móvil a una velocidad de flujo de 0,80 mL/min. La columna fue una columna Varian MicroPak TSKgel-G3000 PW_{XL} (7,8 mm de diámetro interno x 30 cm de longitud) con una columna de protección TSK PW_{XL} (6,0 mm de diámetro interno x 4,0 cm de longitud). Las muestras se prepararon en NH_{4}HCO_{3} 0,1 N a 1,0 mg/mL. El volumen de inyección fue de 50 \muL.

La Figura 22 muestra el perfil de UV del gradiente de RP-HPLC de la No. 5(8)E-AP1X-NH_{4}, la Figura 25 muestra el de la No. 5(11)E-AP1X-NH_{4}, y la Figura 28 muestra el de la No. 4(2)E-AP1X-NH_{4}. la columna fue una columna POROS R2/H de PerSeptive Biosystems' (4,6 mm de diámetro interior x 10 cm de longitud). La fase móvil fue bicarbonato amónico 0,1 N conteniendo etanol de entre el 2% y el 60% de acuerdo con el gradiente descrito en la tabla 17 y a una velocidad de flujo de 2,00 mL/min. El volumen de inyección fue de 20 \muL.

La Figura 23 muestra el espectro de IR de la No. 5(8)E-AP1X-NH_{4} y la Figura 26 muestra el de la No. 5(11)E-AP1X-NH_{4}. La Figura 29 muestra el espectro de IR de la No. 4(2)E-AP1X-NH_{4}. Las muestras se prepararon en pastillas de KBr y se utilizó un espectrómetro Perkin Elmer FT-IR para la determinación.

El punto de fusión, en el caso en que lo hubiera, de la No. 5(8)E-AP1X-NH_{4} es mayor de 400ºC.

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4. Respuesta a la Dosis de la Actividad Anti-VIH y Toxicidad

Tal como se ha descrito anteriormente, una Fracción 8 de la HPSEC purificada cromatográficamente dos veces de la No. 5(5)E-C-AP (tal como también se ha especificado por los perfiles de HPSEC en las Figuras 5A y B y el perfil de C18-HPLC en la Figura 6ª) muestran un actividad de respuesta a la dosis frente a la proliferación del VIH tal como se muestra en la tabla 16 y tiene una IC_{50} de 6 \mug/mL en el día 3 y de 17 \mug/mL en el día 4. la tabla 18 también muestra la respuesta a la dosis de la actividad anti-VIH de los componentes activos extraíbles en agua y precipitables en ácido de la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4}, GE-AP2X-NH_{4}, HE-AP1X-NH_{4}, No. 5(8)E-AP1X-NH_{4}, No. 5(11)E-AP1X-NH_{4} y No. 4(2)E-AP1X-NH_{4} en sus formas de sal amónica. Las respuestas a la dosis del AZT a partir de dos ciclos diferentes se lista a efectos de comparación.

El GE-AP2X-NH_{4} no se ensayó a 0,5 mg/mL debido a su elevada citotoxicidad (35% de proliferación de control) a esta concentración. Su citotoxicidad persistió a niveles más bajos: 34% de proliferación de control a 0,25 mg/mL y 41% a 0,13 mg/mL. La No. 4(2)E-AP1X-NH_{4} también mostró una alta citotoxicidad (44% de proliferación de control) a 0,5 mg/mL, pero se hizo mucho menos tóxico a niveles menores: 72% de proliferación de control a 0,25 mg/mL y 100% (no citotóxico) a 0,13 mg/mL.

El No. 5(5)E-AP1X-NH_{4} es citotóxico frente a PBLs de humano in vitro a 1 mg/mL o superior: 55% de proliferación de control a 1 mg/mL, 46% a 2 mg/mL, 11% a 5 mg/mL, y 0% a entre 10 y 20 mg/mL. La No. 5(5)E-AP6X muestra una ligera citotoxicidad (63% de proliferación de control) a 0,5 mg/mL y no es tóxico a 0,1 mg/mL y niveles menores (98% de proliferación de control a 0,1 mg/mL y 100% a 0,02 mg/mL). Una fracción del componente activo de la No. 5(5)E-AP, es decir, la fracción 8 de la HPSEC cromatográficamente purificada de la No. 5(5)E-C-AP ha mostrado que no es citotóxica: 100% de proliferación de control incluso a 1,0 mg/mL (ver Tabla 16).

Se investigó la toxicidad aguda de la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4}. Se utilizaron ratones para determinar la toxicidad aguda y se encontró que el compuesto no era tóxico incluso a 5.000 mg de la sustancia ensayada por kilogramo de peso corporal (alimentación oral - administración en bolo). Se utilizaron cuatro grupos de diez (10) ratones ICR macho (con un peso comprendido entre 18 y 21 gramos cada uno) por grupo para el ensayo de toxicidad aguda. Ninguno de los cuarenta ratones murió en el plazo de setenta y dos (72) horas después de la administración oral. La LD_{50} de la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4} es, por consiguiente, mayor que 5.000 mg/kg (ratones, 72 horas). Además, los ensayos para determinar los efectos de la No. 5(5)E-AP1X-NH_{4} a 5.000 mg/kg en el sistema nervioso central tales como depresión refleja, depresión del comportamiento, relajación muscular, estimulación motora y sistema nervioso autonómico de los animales de ensayo fueron todos ellos negativos cuando se observaron una (1) hora y tres (3) horas después de la administración oral.

TABLA 18 Respuestas de la Dosis de la Actividad Anti-VIH de los Componentes Activos Extraíbles en Agua y Precipitables en Ácido de la No. 5(5), No. 5(8), No. 5(11), No. 4(2), G y H en sus Formas de Sal de Amonio

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5. Estabilidad de los Componentes Activos

Los componentes activos extraíbles en agua y precipitables en ácido de la No. 5(5), No. 5(8), No. 5(11), No. 4(2), G y H son estables al calor, al aire, a los ácidos fuertes y a las bases débiles tales como el HCl y el bicarbonato amónico, el hidróxido amónico o el bicarbonato sódico, y a los alcoholes tales como etanol. Son activos tanto en sus formas ácido como en sus formas de sal tal como las sales de amonio o de sodio.

La No. 5(5)E-AP1X-NH_{4} permanece muy activo (94% de supresión en el día 3 y 87% de supresión en el día 4 a 0,1 mg/mL) cuando se ensayaron después de 15,6 meses de almacenamiento a temperatura ambiente. El GE-AP2X-NH_{4} y el HE-AP1X-NH_{4} retuvieron sus actividades (100% de supresión tanto en el día 3 como en el día 4 para el GE-AP2X-NH_{4} y 83% de supresión en el día 3 y 81% de supresión en el día 4 para el HE-AP1X-NH_{4} a 0,1 mg/mL) cuando se ensayaron después de 13 meses de almacenamiento a temperatura ambiente. La No. 5(8)E-AP1X-NH_{4} y la No. 4(2)E-AP1X-NH_{4} permanecieron bastante activos (85% de supresión en el día 3 y 81% de supresión en el día 4 para la No. 5(8)E-AP1X-NH_{4} y 92% de supresión en el día 3 y 88% de supresión en el día 4 para la No. 4(2)E-AP1X-NH_{4} a 0,1 mg/mL) cuando se ensayaron después de 12,5 meses de almacenamiento a temperatura ambiente. La No. 5(11)E-AP1X-NH_{4} también permanece bastante activo (84% de supresión en el día 3 y 78% de supresión en el día 4 a 0,1 mg/mL) cuando se ensayó después de 12 meses de almacenamiento a temperatura ambiente.

Aplicabilidad industrial

La presente invención está dirigida, en parte, al descubrimiento de que plantas medicinales específicas o medicinas herbales o sus mezclas poseen actividades antivirales sorprendentes sin causar daño a las células huésped. Además, la invención está dirigida a métodos de tratamiento de humanos y de mamíferos infectados con virus tales como el HBV, HCV, o el VIH. Los datos presentados en esta solicitud demuestran claramente que las composiciones identificadas poseen actividad antiviral sin toxicidad para las células huésped.

De los precedentes experimentos puede concluirse que la mezcla de hierbas designada como HHT888-4, que no cae dentro del alcance de la presente invención, es efectiva en el tratamiento de portadores de HBV y de este modo puede ser utilizada para el tratamiento de humanos infectados con HBV. La reducción de la carga viral en pacientes y portadores de HBV dará lugar, de este modo, a la prevención de la enfermedad de HBV en el humano y también será efectiva en el tratamiento de humanos que muestren la enfermedad de HBV. Los ensayos clínicos también han demostrado que la mezcla de hierbas HHT888-45 es efectiva en el tratamiento de pacientes de hepatitis C, y de este modo se espera que sea efectiva en el tratamiento de pacientes de hepatitis B cuando se administra sola o en combinación con la HHT888-5 o sus componentes antivirales de hierba única.

Además, las HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54 y los componentes individuales de hierba única activos anti-VIH han demostrado eficacia en la supresión de la proliferación de VIH en células humanas nativas. Además, las HHT888-5, HHT888-45 y HHT888-54 han mostrado eficacia en el tratamiento de pacientes infectados con HBV y HCV. La HHT888-4, la HHT888-5, la HHT888-45, la HHT888-54, los extractos de agua y los principios activos también son efectivos en el tratamiento de humanos infectados con VIH, incluyendo portadores de VIH y pacientes de SIDA.

Los efectos terapéuticos descritos en la presente invención pueden ser conseguidos mediante la administración de las medicinas herbales "tal cual", o en forma de tés, decocciones, bebidas, caramelos o otros preparados, productos nutricionales líquidos enterales tales como fórmulas para niños y productos nutricionales para adultos, alimentos médicos, suplementos nutricionales o neutracéuticos conteniendo una o más de las medicinas herbales antivíricas o de sus extractos o de los principios activos. Para las preparaciones farmacéuticas, pueden administrarse una o más de las medicinas herbales o de sus extractos o principio activos descritos anteriormente en formas de dosis unitarias tales como cápsulas, pastillas o comprimidos, con o sin recubrimiento(s) de liberación controlada.

La comunidad médica está constantemente a la búsqueda de métodos y productos que traten de forma efectiva las infecciones virales, especialmente los métodos y los productos para el tratamiento de humanos infectados con HBV, HCV, y VIH. Las mezclas de hierbas HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, los componentes de hierba única, sus extractos, los principios activos y los productos que contienen estas composiciones herbales serán fácilmente aceptadas por la comunidad médica como una herramienta adicional en la prevención y el tratamiento de estas enfermedades devastadoras.

Claims

1. Una composición para uso en el tratamiento de infecciones virales, de modo que dicha composición comprende:

a) AEGINETIAE HERBA, preparada a partir de la planta completa de al menos una planta seleccionada entre el grupo que consiste en Aeginetia indica, Dichondra micrantha y Dichondra repens; y

b) al menos una medicina herbal seleccionada entre el grupo que consiste en:

i): SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA, preparada a partir de la planta completa de al menos una planta seleccionada entre el grupo que consiste en la Scutellaria barbata, Scutellaria rivularis y Scutellaria dependens;

ii): FORSYTHIAE FRUCTUS, preparada a partir del fruto maduro de al menos una planta seleccionada entre el grupo que consiste en la Forsythia suspensa, la Forsythia viridissima y la Forsythia coreana;

iii): LONICERAE FLOS, preparada a partir del capullo de la flor de al menos una planta seleccionada entre el grupo que consiste en la Lonicera japonica y la Lonicera confusa;

iv): PRUNELLAE SPICA, preparada a partir de la spica o la planta completa de al menos una planta seleccionada entre el grupo que consiste en la Prunella vulgaris y la Prunella vulgaris subsp. Asiatica;

v): POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMA, preparada a partir del rizoma de al menos una planta seleccionada entre el grupo que consiste en el Polygonum cuspidatum, el Polygonum runcinatum y el Polygonum reynoutria

vi): BLECHNI RHIZOMA, preparada a partir de al menos una planta seleccionada entre el grupo que consiste en el Blechnum orientale, la Osmunda japonica, la Woodwardia orientales, la Woodwardia unigemmata, el Athyrium acrostichoides, la Sphaeropteris lepifera, el Cyrtomium falcatum y el Cyrtomium fortunei;

vii): DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE RHIZOMA, preparado a partir de la planta de la Dryopteris crassirhizoma;

viii): LIGUSTRI FRUCTUS, preparada a partir de al menos una planta seleccionada entre el grupo que consiste en el Ligustrum lucidum y el Ligustrum japonicum;

ix): SOLANI HERBA, preparada a partir de la planta completa del Solanum nigrum; y

x): LESPEDEZAE HERBA, preparada a partir de al menos una planta seleccionada entre el grupo que consiste en la Lespedeza cuneata y el Senecio scanden,

en donde la relación en pesos de a) a b) está comprendida entre 1:10 y 10:1.

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2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

a) AEGINETIAE HERBA;

b) BLECHNI RHIZOMA;

c) LESPEDEZAE HERBA;

d) POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMA;

e) FORSYTHIAE FRUCTUS; y

f) LIGUSTRI FRUCTUS.

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3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2 que comprende de forma adicional al menos un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en:

a) CIRSII RHIZOMA ET RADIX, preparado a partir del rizoma seco o la raíz o la planta entera de al menos una planta seleccionada entre el Cirsium japonicum; Cirsium albescens y el Cirsium japonicum var. Australe;

b) BREEAE RADIX, preparado a partir de la raíz seca de al menos una planta seleccionada entre el Breea segetum y el Breea setosum;

c) BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX, preparada a partir del rizoma secado y la raíz de al menos una planta seleccionada entre el Baphicacanthes cusia, el Strobilanthes cusia, la Isatis tinctoria, la Isatis indigotica y el Polygonum tictorium;

d) PHELLODENDRI CORTEX, preparado a partir de la corteza de al menos una planta seleccionada entre el grupo que consiste en el Phellodendron amurense, el Phellodendron chinense; el Phellodendron amurense var. Sachalinense y el Phellodendron wilsonii; y

e) BLETILLAE TUBER, preparado a partir del tubérculo de la Bletilla striata.

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4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

a) AEGINETIAE HERBA;

b) LONICERAE FLOS;

c) PRUNELLAE SPICA; y

d) LESPEDEZAE HERBA.

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5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende de forma adicional al menos un miembro seleccionado entre el grupo que comprende:

a) SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA; y

b) FORSYTHIAE FRUCTUS.

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6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5 en donde dicha composición está en la forma de un bebible, cápsula, comprimido, polvo, caramelo, gel, producto nutricional o producto farmacéutico.