ES2303358T3 - Vegi, un inhibidor de la angiogenesis y el crecimiento tumoral. - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para ensayar posibles agentes o fármacos con respecto a la actividad inhibidora de la angiogénesis, comprendiendo dicho método medir la capacidad de dicho agente o fármaco para aumentar la actividad anti-angiogénica de un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo consistente en: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 174 de la SEC ID Nº: 2; (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 23 a 174 de la SEC ID NO: 2; (c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 39 a 174 de la SEC ID Nº: 2; (d) un polinucleótido que codifica un fragmento del polipéptido de uno cualquiera de (a) a (c) que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis; (e) un polinucleótido que hibrida con el complemento de la SEC ID Nº: 1 donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis; (f) un polinucleótido que codifica una variante alélica del polinucleótido de una cualquiera de (a) a (e); (g) un polinucleótido de una cualquiera (a) a (f) que codifica un polipéptido que comprende una señal de secreción; y (h) la cadena complementaria de uno cualquiera (a) a (g) anteriores; en un ensayo in vitro.

Description

VEGI, un inhibidor de la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

Antecedentes de la invención

Los seres humanos o animales experimentan angiogénesis, la generación de nuevos vasos sanguíneos en un tejido u órgano, en condiciones fisiológicas normales en situaciones restringidas muy específicas. Por ejemplo, normalmente se observa angiogénesis en la curación de heridas, en el desarrollo embrionario y en la formación del cuerpo lúteo, el endometrio y la placenta. El término "endotelio" significa una capa fina de células epiteliales planas que reviste las cavidades serosas, los vasos linfáticos y los vasos sanguíneos. El término "anti-angiogénico" o "actividad inhibidora de la angiogénesis" significa la capacidad de una molécula de inhibir la angiogénesis en general.

Se cree que tanto la angiogénesis controlada como la incontrolada transcurren de una manera similar. Las células endoteliales y los pericitos, rodeados por una membrana basal, forman vasos sanguíneos capilares. La angiogénesis comienza con la erosión de la membrana basal por enzimas liberadas por células endoteliales y leucocitos. Las células endoteliales, que revisten el lumen de los vasos sanguíneos, entonces sobresalen a través de la membrana basal. Los estimulantes angiogénicos inducen la migración de las células endoteliales a través de la membrana basal erosionada. Las células que migran forman una "ramificación" de los vasos sanguíneos parentales, donde las células endoteliales experimentan mitosis y proliferan. Las ramificaciones endoteliales se fusionan entre sí para formar bucles capilares, creando un nuevo vaso sanguíneo.

En una multiplicidad de patologías, metástasis tumorales y crecimientos anómalos de células endoteliales se produce una angiogénesis no regulada persistente que sustenta las lesiones patológicas observadas en estas afecciones. Las diversas patologías en las que está presente una angiogénesis no regulada se han agrupado como enfermedades dependientes de angiogénesis o asociadas con la angiogénesis.

Durante el crecimiento tumoral, las células endoteliales proliferan, invaden el estroma, migran hacia la fuente del estímulo de angiogénesis tal como células cancerosas, interaccionan con células perivasculares y células estromáticas y finalmente forman vasos capilares que unen el tejido tumoral con la circulación (J. Folkman (1995) Nat. Med. 1: 27-31). Aunque el mecanismo, indudablemente muy complejo, que regula la angiogénesis aún no se comprende, parece ser que el inicio o terminación del proceso es el resultado de un equilibrio entre reguladores positivos y negativos de la angiogénesis. Se han descrito varios factores angiogénicos, a menudo regulados positivamente de forma destacada en tejidos tumorales, incluyendo varios miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos tales como FGF-1 (G. Gimenez-Gallego et al. (1985) Science 230: 1385), FGF-2 (L. Schweigerer et al. (1987) Nature 325:257), y los de la familia de factores de crecimiento de células del endotelio vascular (VEGF) (D. W Leung et al. (1989) Science 246: 1306), así como los receptores de estos factores de crecimiento (L. W. Burrus y B.B. Olwin (1989) J. Biol. Chem. 264: 18647; S. Wennstrom et. al. (1991) Growth Factors 4: 197; B. Terman et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 1579. C. de Vries et al, (1992) Science 255: 989). Todos los documentos citados en este documento anteriormente y más adelante se incorporan en el presente documento en su totalidad como referencia.

También se han publicado varios inhibidores de la angiogénesis, incluyendo la trombospondina (D. J. Good et. al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87:6624), angiostatina (M. S. O'Reilly et al. (1994) Cell 79:315), endostatina (M. S. O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277), y el factor plaquetario-4 (E. Maione et al., (199)] Science 247:77). Es evidente que la angiogénesis normal se activa inmediatamente cuando es necesario y se termina rápidamente cuando ya no se necesita, mientras que la angiogénesis patológica, una vez iniciada, a menudo se prolonga y es difícil de detener. Esto indica que el mecanismo de regulación negativa que funciona en un proceso de angiogénesis normal está ausente o reprimido en un proceso de angiogénesis patológico. Se ha sugerido que las actividades proteolíticas que liberan inhibidores de la angiogénesis a partir de varios precursores pueden explicar parcialmente la regulación negativa de la angiogénesis, como se indica por la activación proteolítica de la angiostatina a partir del plasminógeno y la de la endostatina a partir de colágeno XVIII (M. S. O'Reilly, (1997) Cell 88:277). Muchos de los reguladores de la angiogénesis conocidos son pleiotrópicos y pueden actuar sobre otros tipos celulares así como sobre el que produce los reguladores, aunque es concebible que las células endoteliales pueden producir factores autocrinos para reprimir un proceso de angiogénesis o mantener la quiescencia de un sistema vascular maduro. Previamente no se ha descrito ninguno de estos reguladores autocrinos de la angiogénesis. En esta solicitud se describe un nuevo regulador negativo autocrino de la angiogénesis, denominado inhibidor del crecimiento de células del endotelio vascular (VEGI), expresado específicamente por células endoteliales.

Aunque la proteína descrita en esta solicitud se describió por primera vez en el documento EP95903521.3, presentado el 7 de noviembre de 1994 como TNF-gamma, en dicho documento no se describía la función inhibidora de la angiogénesis de la proteína. La proteína se descubrió por medio de la construcción de ocho bibliotecas de ADNc usando ARN derivado de diversas células endoteliales a partir de las cuales se generaron 30.000 marcadores de secuencia expresada (EST). Los EST únicos para las células endoteliales se caracterizaron adicionalmente por homología de secuencia con familias de proteínas conocidas, particularmente citoquinas. Las secuencias de aminoácidos deducidas de un grupo de EST contenían la secuencia de aminoácidos consenso de los factores de necrosis tumoral (TNF). Para obtener el clon de ADNc de longitud completa, se exploró una biblioteca de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVE) usando una sonda radiomarcada de uno de los clones iniciales. Se aislaron y secuenciaron varios clones positivos. El clon de ADNc más largo contenía un inserto de 4,5 kilobases que codificaba una fase de lectura abierta de 174 aminoácidos y regiones no traducidas largas tanto en el extremo 3' como en el extremo 5'. Un codón de terminación en fase cadena arriba del codón de iniciación previsto indicaba que la traducción no podría iniciarse en un punto anterior. La nueva proteína presentaba una homología de secuencia de 20-30% con el TNF\alpha humano, el TNF\beta y el ligando de Fas.

En un experimento de transcripción y traducción in vitro usando el clon de ADNc como plantilla, se produjo una proteína con un peso molecular de 22 kD, lo cual era coherente con la fase de lectura abierta prevista. El análisis de hidrofobia de la proteína predijo una región hidrófoba de 12 aminoácidos inmediatamente después del segmento N-terminal de 14 aminoácidos no hidrófobos. Esto es coherente con la estructura de una proteína transmembrana de tipo II, similar a los TNF (B. B. Aggarwal y K. Natarajan (1996) Eur. Cytokine News. 7:93).

Un análisis de Northern reciente de preparaciones de ARN total de 22 tipos diferentes de células cultivadas de diversos linajes indicó que sólo pueden detectarse transcritos para esta proteína en dos líneas de células endoteliales: células HUVE y células endoteliales de vena humana de un pase anterior. El ARNm no se detectó en células endoteliales de vena humana de un pase posterior, ni se vio en células de arteria humana. Por el contrario, los miembros de la familia del TNF se expresan principalmente en células inmunes (B. B. Aggarwal y K. Natarajan (1996), supra). Por ejemplo, el TNF\alpha se produce por macrófagos, monocitos, neutrófilos y células T, mientras que el TNF\beta se produce predominantemente por linfocitos T estimulados por mitógeno y leucocitos. De forma similar, los ligandos para Fas y otros miembros de la familia del TNF, CD27, CD30, CD40, OX40 y 4-1 BB se expresan en tipos celulares del sistema inmune. Usando múltiples transferencias de Northern tisulares, se descubrió que el transcrito de VEGI se expresaba en placenta, pulmón, riñón, músculo esquelético, cerebro, hígado, timo, testículos, ovario y linfocitos de sangre periférica.

La presente invención identifica y describe la nueva función de esta proteína. Se ha descubierto que una forma truncada de la proteína descrita anteriormente inhibe el crecimiento de las células endoteliales. Por lo tanto, la proteína se denomina inhibidor del crecimiento de células del endotelio vascular (VEGI). Una versión truncada de VEGI consistente en los restos 39-174 que corresponde al supuesto dominio extracelular se expresó en E. coli, se aisló y se examinó en una diversidad de ensayos celulares. Se descubrió que la forma truncada de VEGI inhibía específicamente la proliferación de células endoteliales, inhibía la formación de tubos de tipo capilar en un modelo in vitro, e inhibía el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de mama humano en glándulas mamarias de ratones desnudos atímicos hembra.

Compendio de la invención

La presente invención describe un inhibidor de la proliferación de células endoteliales en general y un inhibidor de la angiogénesis en particular, y métodos de uso. La secuencia de nucleótidos completa de VEGI se muestra en la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 26, y la secuencia de aminoácidos codificada se muestra en la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 27, respectivamente. Se descubrió que una forma truncada de la proteína consistente en los restos 39-174 (SEC ID Nº: 3) que correspondía al supuesto dominio extracelular inhibía específicamente la proliferación de células endoteliales. Se descubrió que VEGI inhibía la formación de tubos de tipo capilar en un modelo de angiogénesis in vitro. Finalmente, se descubrió que VEGI inhibía el crecimiento de tumores de xenoinjerto en ratones desnudos atímicos.

De esta manera, la presente invención describe un inhibidor de la angiogénesis, comprendiendo dicho inhibidor polinucleótidos de VEGI, un polipéptido como se describe en este documento o una forma modificada de VEGI en un diluyente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también describe un acelerador de la angiogénesis, comprendiendo dicho acelerador un anticuerpo, un oligonucleótido antisentido, un antagonista, una ribozima, un fármaco o un agente que reduce o elimina la función de VEGI en un diluyente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también describe un método para inhibir la angiogénesis, que comprende administrar a un ser humano o a un animal una composición que comprende un polinucleótido de VEGI sustancialmente purificado, un polipéptido como se describe en este documento o una forma modificada de VEGI, en una dosificación suficiente para inhibir la angiogénesis.

La presente invención también describe un método para acelerar la angiogénesis, que comprende administrar a un ser humano o a un animal una composición que comprende un anticuerpo, un oligonucleótido antisentido, un antagonista, una ribozima, un fármaco o un agente que reduce o elimina la función de VEGI.

En otra realización, la presente invención describe un método para el diagnóstico de una angiogénesis patológica, que comprende detectar la presencia o ausencia de polipéptidos VEGI en una muestra, comprendido dicho método las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra de un individuo que se sospecha que tiene una angiogénesis patológica con anticuerpos que son específicos para polipéptidos VEGI como se describen en este documento; y

(ii) detectar la presencia o ausencia de un complejo formado entre VEGI y los anticuerpos.

En otra realización, la presente invención describe un método para el diagnóstico de una angiogénesis patológica, que comprende detectar la presencia o ausencia de polinucleótidos de VEGI (preferiblemente ARN) en una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra de un individuo que se sospecha que tiene angiogénesis patológica con oligonucleótidos que se unen específicamente a polinucleótidos de VEGI (por ejemplo ARN); y

(ii) detectar la presencia o ausencia de un duplex formado entre polinucleótidos de VEGI y oligonucleótidos específicos para ellos.

En otra realización, la presente invención describe un método para el diagnóstico de una angiogénesis patológica usando la reacción en cadena de la polimerasa, comprendiendo dicho método el diseño de cebadores usando la secuencia de nucleótidos de VEGI como se muestra en la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 26, que amplifican específicamente una región de VEGI. Los cebadores pueden usarse para amplificar el ADN de VEGI o el ARN de VEGI, este último después de convertir el ARN en ADN complementario (ADNc) por transcripción inversa del ARN. El ensayo de PCR puede hacerse cuantitativo comparando el producto amplificado con un patrón que puede generarse usando métodos conocidos en la técnica.

En otra realización, la presente invención describe un método para la detección de polinucleótidos de VEGI en una muestra, que comprende ensayar la presencia o ausencia de ARN o de ADN de VEGI en una muestra por medio de ensayos de hibridación.

En otra realización, la presente invención describe un kit de diagnóstico o pronóstico que comprende anticuerpos que se unen de forma respectiva contra polinucleótidos o polipéptidos VEGI como se describen en este documento, oligonucleótidos que hibridan con ADN o ARN de VEGI y/o cebadores de PCR para amplificación del ADN o ARN de VEGI, y reactivos auxiliares adecuados para uso en la detección de la presencia de VEGI en una muestra. Como VEGI puede funcionar como una proteína de membrana, una forma soluble que existe de forma natural de VEGI unido a la membrana puede funcionar como su antagonista y en otra realización de la presente invención se incluyen métodos para detectar dicha forma soluble.

En otra realización, la presente invención describe un ensayo de diagnóstico que comprende detectar la presencia de una mutación en polinucleótidos de VEGI que tiene como resultado la reducción o aumento de la expresión o función de VEGI. Dicho ensayo incluiría ensayos de hibridación, ensayos de polimorfismos en mapas de restricción y secuenciación de genes, por nombrar algunos.

En otra realización, la presente invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo consistente en:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 23 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 39 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(d) un polinucleótido que codifica un fragmento del polipéptido de una cualquiera de (a) a (c) que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis;

(e) un polinucleótido que hibrida con el complemento de la SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis;

(f) un polinucleótido que codifica una variante alélica del polinucleótido de una cualquiera de (a) a (e);

(g) un polinucléotido de una cualquiera (a) a (f) que codifica un polipéptido que comprende una señal de secreción; y

(h) la cadena complementaria de uno cualquiera (a) a (g) anterior, de un polipéptido

que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende dicho polinucleótido o un vector recombinante que comprende dicho polinucléotido, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o mejoría de enfermedades que están mediadas por una angiogénesis incontrolada, donde dicha enfermedad es un miembro del grupo consistente en telangiectasia, psoriasis, esclerodermia, angiogénesis miocárdica, neovascularización de placas, angiogénesis en miembros isquémicos, rubeosis, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental y neovascularización diabética.

En otra realización, la presente invención se refiere al uso de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, polipéptidos o vectores para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o mejoría de enfermedades tales como la degeneración macular.

En otra realización, la presente invención describe un represor o inhibidor del crecimiento de cánceres, comprendiendo dicha composición polinucleótidos o polipéptidos VEGI sustancialmente purificados como se describen en este documento.

La presente invención también describe un método para la detección y pronóstico de cánceres por medio de la detección de la presencia o ausencia de polinucleótidos o polipéptidos VEGI como se describen en este documento en una muestra, o la detección de una mutación en polinucleótidos de VEGI que altera la expresión o función de VEGI.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para ensayar posibles agentes o fármacos con respecto a la actividad inhibidora de la angiogénesis por medio del ensayo de si el fármaco o agente puede o no regular positivamente la expresión de VEGI. Como VEGI, al igual que otros inhibidores de la angiogénesis, probablemente se activa por proteasas que liberan la proteína a partir de la membrana celular, las proteasas, así como otros agentes que facilitan esta activación tales como iones metálicos, serían útiles como agentes para aumentar la expresión
de VEGI.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para ensayar posibles agentes antitumorales o fármacos por medio del ensayo de si el fármaco o agente puede o no inhibir la angiogénesis por medio de la regulación positiva de la expresión de VEGI.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para ensayar posibles fármacos o agentes que promueven la angiogénesis por medio del ensayo de si el agente o fármaco puede o no bloquear la función de VEGI (por ejemplo, la inhibición de la angiogénesis). En este caso, puede usarse la inhibición de proteasas que activan VEGI como se ha descrito anteriormente o agentes necesarios o agentes que facilitan dicha activación, tales como iones metálicos, para regular negativamente VEGI y regular positivamente de esta manera la angiogénesis.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa un análisis de transferencia de Northern de transcritos de VEGI. Panel A, expresión de VEGI en células humanas: Jurkat, célula de leucemia de células T humana; L923, célula de riñón embrionario humano; HL60, leucemia promielocítica humana; V.E. célula endotelial de vena humana (10º pase); A431, carcinoma epidermoide humano; V.E-2, Célula endotelial de vena humana (20º pase); Raji, linfoma de Burkitt humano; A.E: célula endotelial de arteria humana; THP-1, leucemia monocítica humana; CCD-29Lu, enfisema pulmonar humano; CAMA1, cáncer de mama; AN3CA, cáncer uterino; SK.UT. 1, cáncer uterino; MG63, osteoblastoma; HOS, osteoblastoma; MCF7, cáncer de mama; OVCAR-3, cáncer de ovario; CAOV-3, cáncer de ovario; HUVEC, célula endotelial de vena umbilical humana; AOSMIC, músculo liso. El tamaño estimado del mensajero es de 6,5 kb. Panel B, expresión de VEGI en diversos tipos de tejidos humanos. Se realizaron tres transferencias distintas. Se muestran los resultados positivos de cualquiera de los tres experimentos.

La figura 2 demuestra el efecto de VEGI sobre la proliferación de células endoteliales y células de cáncer de mama. Se representa el número de células frente a la concentración de VEGI como se indica. Se muestra la inhibición del crecimiento de células ABAE (círculos blancos), pero no la de MDA-MB231 (triángulos) o MDA-MB-425 (cuadrados).

La figura 3 demuestra la capacidad de VEGI de inhibir la formación de tubos de tipo capilar por células ABAE sobre geles de colágeno. Los valores de p (ensayo t) indicados encima de las columnas se obtienen comparando el grado de la formación de tubos de tipo capilar por células ABAE en presencia de diversas concentraciones de VEGI, como se indica, con el que se obtiene cuando está ausente VEGI en el medio de cultivo. La abundancia de estructuras de tipo capilar se mide como el porcentaje de áreas blancas con respecto a las áreas totales medidas.

La figura 4 demuestra la inhibición del crecimiento de tumores de xenoinjerto de cáncer de mama humano en ratones desnudos atímicos por VEGI. Panel A: gráfico de los tamaños de los tumores de xenoinjerto de MDA-MB-231 (mm^{2}) en función del tiempo después de la inoculación (días). Panel B: gráfico de los tamaños de los tumores de xenoinjerto de MDA-MB-435 (mm^{2}) en función del tiempo después de la inoculación (días). Círculos blancos, co-inoculado con células CHO transfectadas con vector. Círculos negros, co-inoculado con células CHO transfectadas con VEGI secretado.

Las figuras 5A, 5B y 5C ilustran el ADNc (SEC ID Nº: 8) y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente (SEC ID Nº: 9) del polipéptido de VEGI-alfa de la presente invención. Los 27 aminoácidos iniciales (subrayados) son la supuesta secuencia líder. Se usan las abreviaturas de una letra convencionales para aminoácidos. En las figuras 5A, 5B y 5C están marcados los posibles sitios de glicosilación unidos a asparagina con un símbolo asparagina en negrita (N) en la secuencia de aminoácidos de VEGI-alfa y con un signo almohadilla (#) encima del primer nucleótido que codifica ese resto de asparagina en la secuencia de nucleótidos de VEGI-alfa. Se encuentran posibles secuencias de N-glicosilación en las siguientes localizaciones en la secuencia de aminoácidos de VEGI-alfa: N-29 a N-32 (N-29, Y-30, T-31, N-32) y N125 a D-128 (N-125, V-126, S-127, D-128). En las figuras 5A, 5B y 5C también se marcan los posibles sitios de fosforilación de proteína quinasa C (PKC) con el símbolo de treonina en negrita (T) en la secuencia de aminoácidos de VEGI-alfa y un asterisco (*) encima del primer nucleótido que codifica ese resto de treonina en la secuencia de nucleótidos de VEGI-alfa. Se encuentran posibles secuencias de fosforilación por PKC en las siguientes localizaciones en la secuencia de aminoácidos de VEGI-alfa: T-32 a K-34 (T-32, N-33, K-34) y T-50 a R-52 (T-50, F-51, R-52). En las figuras 5A, 5B y 5C también están marcados los posibles sitios de fosforilación por caseína quinasa II (CK2) con el símbolo de serina o treonina en negrita (S o T) en la secuencia de aminoácidos de VEGI-alfa y un asterisco (*) encima del primer nucleótido que codifica el resto de serina o treonina apropiado en la secuencia de nucleótidos de VEGI-alfa. Se encuentran posibles secuencias de fosforilación por CK2 en las siguientes localizaciones en la secuencia de aminoácidos de VEGI-alfa: S-83 a E-86 (S-83, Y-84, P-85, E-86); S-96 a E-99 (S-96, V-97, C-98, E-99); S-115 a E-118 (S-115, L-116, Q-117, E-118); S-130 a D-133 (S-130, L-131, V-132, D-133); y T-135 a D-138 (T-135, K-136, E-137, D-138). En las figuras 5A, 5B y 5C también están marcados posibles sitios de miristilación con un doble subrayado en la secuencia de aminoácidos de VEGI-alfa. Se encuentran posibles secuencias de miristilación en las siguientes localizaciones en la secuencia de aminoácidos de VEGI-alfa: G-20 a K-25 (G-20, L-21, A-22, F-23, T-24, K-25) y G-111 a L-116 (G-111, A-112, M-113, F-114, S-11 S, L-116).

Las figuras 6A y 6B ilustran el ADNc (SEC ID Nº: 26) y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente (SEC ID Nº: 27) del polipéptido de VEGI-beta de la presente invención. Se usan las abreviaturas de una letra convencionales para aminoácidos. El dominio intracelular previsto son los aminoácidos metionina-1 a triptófano-35. La supuesta secuencia transmembrana son los restos aminoacídicos alanina-36 a alanina-61 (subrayado). La supuesta secuencia transmembrana son los restos aminoacídicos glutamina-62 a leucina-251 (subrayado). En las figuras 6A y 6B están marcados los posibles sitios de glicosilación unidos a asparagina con un símbolo de asparagina en negrita (N) en la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta y con un signo almohadilla (#) encima del primer nucleótido que codifica ese resto de asparagina en la secuencia de nucleótidos de VEGI-beta. Se encuentran posibles secuencias de N-glicosilación en las siguientes localizaciones en la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta: N-133 a N-136 (N-133, Y-134, T-135, N-136) y N-229 a D-232 (N-229, V-230, S-231, D-232). También están marcados en las figuras 6A y 6B los posibles sitios de fosforilación por proteína quinasa C (PKC) con un símbolo de serina o treonina en negrita (S o T) en la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta y un asterisco (*) encima del primer nucleótido que codifica ese resto de treonina en la secuencia de nucleótidos de VEGI-beta. Se encuentran posibles secuencias de fosforilación por PKC en las siguientes localizaciones en la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta: S-23 a R-25 (S-23, C-24, R-25); S-32 a R-34 (S-32, A-33, R-34); T-135 a K-137 (T-135, N-136, K-137); y T-154 a R-156 (T-154, F-155, R-156). En las figuras 6A y 6B también están marcados los posibles sitios de fosforilación por caseína quinasa II (CK2) con un símbolo de serina o treonina negrita (S o T) en la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta y con un asterisco (*) encima del primer nucleótido que codifica el resto de serina o treonina apropiado en la secuencia de nucleótidos de VEGI-beta. Se encuentran posibles secuencias de fosforilación por CK2 en las siguientes localizaciones de la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta: S-8 a E-11 (S-8, F-9, G-10, E-11); S-187 a E-190 (S-187, Y-188, P-189, E-190); S-200 a E-203 (S-200, V-201, C-202, E-203); S-219 a E-222 (S-219, L-220, Q-221, E-222); S-234 a D-237 (S-234, L-235, V-236, D-237); y T-239 a D-242 (T-239, K-240, E-241, D-242). En las figuras 6A y 6B también están marcados los posibles sitios de miristilación con un doble subrayado en la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta. Se encuentran posibles secuencias de miristilación en las siguientes localizaciones en la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta: G-6 a E-11 (G-6, L-7, S-8, F-9, G-10, E-11); G-124 a G-129 (G-124, L-125, A-126, F-127, T-128, K-129); y G-215 a L-220 (G-215, A-216, M-217, F-218, S-219, L-220).

La figura 7 muestra un análisis de la secuencia de aminoácidos de VEGI-alfa (SEC ID Nº: 9). Se muestran las regiones alfa, beta, de giro y de espiral; hidrofilia e hidrofobia; regiones anfipáticas; regiones flexibles; índice antigénico y probabilidad de superficie, previstas usando los parámetros por defecto de los programas informáticos indicados. En el "índice antigénico" o el gráfico de Jamenson-Wolf, los picos positivos indican localizaciones de las regiones de alta antigenicidad del polipéptido VEGI, es decir, regiones a partir de las cuales pueden obtenerse péptidos de la invención que llevan epítopos.

Descripción detallada

Aunque en el documento EP95903521.3 se describió la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos de la proteína VEGI descrita en este documento como TNF-gamma, no se describió la nueva actividad anti-angiogénica y la nueva actividad inhibidora de células endoteliales de esta molécula.

La presente invención describe polinucleótidos y polipéptidos VEGI, que inhiben el crecimiento de células del endotelio vascular y métodos para el tratamiento de enfermedades y procesos que están mediados o asociados con la angiogénesis, por medio de la administración de estos polinucleótidos y polipéptidos. Los polinucleótidos o polipéptidos VEGI descritos pueden aislarse a partir de fluidos corporales incluyendo, pero sin limitación, suero, orina y líquido ascítico, o sintetizarse por métodos químicos o biológicos (por ejemplo, cultivo celular o expresión de genes recombinantes). Las técnicas recombinantes incluyen amplificación de genes a partir de fuentes de ADN usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y la amplificación de genes a partir de fuentes de ARN usando transcriptasa inversa/PCR. El VEGI inhibe el crecimiento de vasos sanguíneos en tejidos tales como tumores vascularizados o no vascularizados. La presente invención describe una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 22 kD y cualquier forma modificada de la proteína, incluyendo pero sin limitación un truncamiento o modificación postraduccional, tal como una forma glicosilada de la proteína que puede resolver la actividad angiogénica de factores de crecimiento endógenos. La secuencia de nucleótidos para VEGI se muestra en las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 26 y la secuencia de aminoácidos para VEGI se muestra en las SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 27, respectivamente. Una forma activa de VEGI incluye los aminoácidos 39-174 de la proteína mostrada en la SEC ID Nº: 2. No se ha determinado la forma natural de VEGI. Es posible que la forma biológicamente activa sea dimérica, trimérica o polimérica. La presente invención también describe cualquier variación alélica de la secuencia y los epítopos o dominios específicos contenidos dentro de los polinucleótidos o polipéptidos VEGI descritos en este documento que tienen como resultado la inhibición de la angiogénesis. Estas secuencias pueden usarse para diseñar agentes anti-VEGI tales como oligonucleótidos antisentido o para producir anticuerpos que inhiban la función de VEGI, siendo estas secuencias y agentes útiles para mejorar o prevenir enfermedades asociadas con la angiogénesis.

Aunque se muestra y describe la secuencia de VEGI humano, se entiende que como el VEGI humano puede inhibir el crecimiento de células endoteliales bovinas y de ratón, el VEGI está bien conservado entre especies. La secuencia de VEGI de otras especies puede clonarse usando la información de secuencia y de función descrita en esta solicitud. Por lo tanto, también se prevén para uso en los métodos y usos de esta solicitud secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de VEGI de especies distintas del ser humano.

La presente invención además describe moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden polinucleótidos que codifican polipéptidos VEGI que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en las figuras 5A, 5B y 5C (SEC ID Nº: 9), que se determinó por secuenciación de un ADNc clonado (HUVE091). Los polipéptidos VEGI descritos en la presente invención comparten homología de secuencia con VEGI humano (SEC ID Nº: 10), VEGI-beta (SEC ID Nº: 11), linfotoxina-beta humana (SEC ID Nº: 12) y ligando de FAS (SEC ID Nº: 13). Las funciones de los polinucleótidos o polipéptidos VEGI incluyen, pero sin limitación, la inhibición de la angiogénesis, como una molécula de tipo citoquina antitumoral, como tratamiento de la artritis por medio de la inhibición de la angiogénesis y/o de la proliferación de células endoteliales asociada con el pannus invasor en hueso y cartílago, como un inductor de NF-xB y la quinasa c-Jun (JNK), como un inductor de la adhesión celular y como un inductor de la apoptosis. La secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 8 se obtuvo por secuenciación de un clon de ADNc (HUVE091), que se depositó el 26 de octubre de 1994 en la American Type Culture Collection 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, y que recibió el número de acceso 75927. El plásmido depositado está contenido en el plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA).

La presente invención también describe moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido (SEC ID Nº: 26) que codifica un polipéptido VEGI-beta que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las figuras 6A, 6B (SEC ID Nº: 27), que se determinó por secuenciación de un ADNc clonado (HEMCZ56). El polipéptido VEGI-beta es una variante de corte y empalme del polipéptido VEGI descrito en este documento. La secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 26 se obtuvo por secuenciación de un clon de ADNc (HEMCZ56) que se depositó el 9 de julio de 1998 en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, y recibió el número de acceso 203055. El plásmido depositado está contenido en el plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA).

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Moléculas de ácido nucleico

Por "secuencia de nucleótidos" de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido se entiende, en el caso de una molécula de ADN o polinucleótido, una secuencia de desoxirribonucleótidos, y en el caso de una molécula de ARN o polinucleótido, la secuencia correspondiente de ribonucleótidos (A, G, C y U), donde cada desoxirribonucleótido de timidina (T) en la secuencia de desoxirribonucleótidos especificada se ha reemplazado por el ribonucleótido uridina (U).

Usando la información proporcionada en este documento, tal como la secuencia de nucleótidos de las figuras 5A, 5B y 5C (SEC ID Nº: 8) o la secuencia de nucleótidos de las figuras 6A y 6B (SEC ID Nº: 26), puede obtenerse una molécula de ácido nucleico (es decir, polinucleótido) que codifica un polipéptido VEGI o VEGI-beta usando procedimientos convencionales de clonación y exploración, tales como, por ejemplo, los de clonación de ADNc usando ARNm como material de partida. Por ejemplo, pueden obtenerse rutinariamente polinucleótidos que codifican polipéptidos VEGI a partir de cualquier fuente celular o tisular que exprese VEGI, tal como, por ejemplo, riñón humano y células endoteliales de vena umbilical. Como ilustración de la invención, la molécula de ácido nucleico descrita en las figuras 5A, 5B y 5C (SEC ID Nº: 8) se descubrió en una biblioteca de ADNc derivada de células endoteliales de vena umbilical humana. El clon de ADNc correspondiente a VEGI (clon HUVE091) contiene una fase de lectura abierta que codifica una proteína de 174 restos aminoacídicos, de los cuales aproximadamente los primeros 27 restos aminoacídicos son la supuesta secuencia líder, de tal forma que la proteína madura comprende 147 aminoácidos. La proteína presenta el máximo grado de homología en el extremo C con el TNF-\alpha de conejo (Ito, H., et al., DNA 5:157-165 (1986); Nº de acceso del GenBank M12846; SEC ID Nº: 14) con una identidad de 38% y una similitud de 58% en un tramo de 111 aminoácidos. Las secuencias conservadas entre los miembros de la familia del TNF también están conservadas en VEGI.

Además, se pueden obtener de modo rutinario polinucleótidos que codifican un polipéptido VEGI-beta a partir de células endoteliales inducidas en reposo, vena umbilical, amígdalas y otros diversos tipos de células y tejidos. Como ilustración de la invención, las moléculas de ácido nucleico descritas en las figuras 6A y 6B (SEC ID Nº: 26) se descubrieron en una biblioteca de ADNc derivada de células endoteliales inducidas. El clon de ADNc correspondiente a VEGI-beta (HEMCZ56) contiene una fase de lectura abierta que codifica una proteína de 251 restos aminoacídicos de los cuales aproximadamente los primeros 35 restos aminoacídicos son el supuesto dominio intracelular, los aminoácidos 36-61 son un supuesto dominio transmembrana y los restos aminoacídicos 62-251 son un supuesto dominio extracelular.

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Los restos aminoacídicos que constituyen el dominio extracelular, transmembrana e intracelular se han previsto por análisis informático. De esta manera, como apreciará un especialista habitual, los restos aminoacídicos que constituyen estos dominios pueden variar ligeramente (por ejemplo, en aproximadamente 1 a aproximadamente 15 restos aminoacídicos) dependiendo de los criterios usados para definir cada dominio.

La presente invención describe un ácido nucleico (polinucleótido) aislado que codifica el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de las figuras 5A, 5B y 5C (SEC ID Nº: 9), o el polipéptido maduro codificado por el ADNc del clon denominado HUVE091 depositado como depósito ATCC Nº 75927 el 26 de octubre de 1994.

Además, la presente invención describe un ácido nucleico (polinucleótido) aislado que codifica el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de las figuras 6A y 6B (SEC ID Nº: 27) o el polipéptido maduro codificado por el ADNc del clon denominado HEMCZ56 depositado como depósito ATTC Nº 203055 el 9 de julio de 1998.

Por molécula o moléculas de ácido nucleico o polinucleótido "aisladas" se entiende una molécula, ADN o ARN que se ha retirado de su entorno nativo. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante (polinucleótidos) contenidas en un vector se consideran aisladas para los fines de la presente invención. Otros ejemplos de moléculas de ADN (polinucleótidos) aisladas incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en células hospedadoras heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN (polinucleótidos) aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN (polinucleótidos) de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos aislados como se describen en la presente invención incluyen además estas moléculas producidas sintéticamente.

El polinucleótido descrito en la presente invención puede estar en forma de ARN o en forma de ADN, incluyendo dicho ADN ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido).

Las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente invención incluyen la secuencia polinucleotídica descrita en la SEC ID Nº: 8 y que codifica el polipéptido VEGI maduro, la secuencia polinucleotídica representada en la SEC ID Nº: 26 que codifica el polipéptido VEGI-beta maduro, las secuencias polinucleotídicas contenidas en el clon depositado (HUVE091) depositado como depósito ATTC Nº 75927 que codifica el polipéptido VEGI-beta maduro, las secuencias polinucleotídicas contenidas en el clon depositado (HEMCZ56) depositado como depósito ATTC Nº 203055 que codifica el polipéptido VEGI-beta maduro, y secuencias polinucleotídicas que comprenden una secuencia diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido maduro que el ADN de la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 26, o el ADNc depositado. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. De esta manera, sería rutinario para un especialista en la técnica generar dichas variantes degeneradas.

La presente invención describe moléculas de ácido nucleico que codifican una forma madura de la proteína correspondiente al polipéptido VEGI. La secuencia de aminoácidos del polipéptido VEGI completo incluye una secuencia líder y una proteína madura, como se muestra en las figuras 5A, 5B y 5C (SEC ID Nº: 9) y en la SEC ID Nº: 2. De acuerdo con la hipótesis de señal, una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena proteica en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso, las proteínas secretadas por las células de mamífero tienen una secuencia señal o líder de secreción que se escinde del polipéptido completo para producir una forma "madura" secretada de la proteína. La mayoría de las células de mamífero e incluso las células de insecto escinden proteínas secretadas con la misma especificidad. Sin embargo, en algunos casos, la escisión de la proteína secretada no es totalmente uniforme, lo cual produce dos o más especies maduras de la proteína. Además, desde hace mucho tiempo se sabe que la especificidad de escisión de una proteína secretada finalmente se determina por la estructura primaria de la proteína completa, es decir, es intrínseca a la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por lo tanto, la presente invención describe una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC con el Nº de depósito 75927. Por "polipéptido VEGI maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc en el depósito ATTC Nº 75927" se entiende la forma o formas maduras del polipéptido VEGI producido por expresión en una célula de mamífero (por ejemplo, células COS, como se describe más adelante) de la fase de lectura abierta completa codificada por la secuencia de ADN humana del clon depositado.

El polinucleótido que codifica el polipéptido maduro de las figuras 6A y 6B (SEC ID Nº: 26) o el polipéptido maduro codificado por el ADNc depositado (HEMCZ56) puede incluir, pero sin limitación: sólo la secuencia codificante del polipéptido maduro; la secuencia codificante del polipéptido maduro y una secuencia codificante adicional tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia transmembrana o una secuencia de pro-proteína; la secuencia codificante del polipéptido maduro (y opcionalmente otra secuencia codificante adicional) y secuencias no codificantes, tales como intrones o la secuencia no codificante 5' y/o 3' de la secuencia codificante del polipéptido maduro.

La presente invención también describe polinucleótidos, donde la secuencia codificante del polipéptido maduro puede fusionarse en la misma fase de lectura a una secuencia polinucleotídica que ayuda en la expresión y secreción de un polipéptido desde una célula hospedadora, por ejemplo, una secuencia líder que funciona como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula hospedadora para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una proproteína que es la proteína madura más restos aminoacídicos 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se ha escindido la prosecuencia, se obtiene una proteína madura.

De esta manera, por ejemplo, el polinucleótido como se describe en la presente invención puede codificar una proteína madura, una proteína que tiene una prosecuencia o una proteína que tiene tanto una prosecuencia como una presecuencia (secuencia líder).

Los polinucleótidos descritos en la presente invención también puede tener la secuencia codificante fusionada en fase a una secuencia marcadora que permite la purificación del polipéptido descrito. La secuencia marcadora puede ser una señal de hexa-histidina suministrada por un vector pQE-9 para permitir la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un hospedador bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una señal de hemaglutinina (HA) cuando se usa un hospedador de mamífero, por ejemplo, células COS-7. La señal HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe (Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)).

De esta manera, la expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" incluye un polinucleótido que contiene sólo la secuencia codificante para el polipéptido así como un polinucleótido que incluye otra secuencia codificante y/o no codificante.

La presente invención también describe variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente que codifican fragmentos (es decir, partes), análogos y derivados del polipéptido que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de las figuras 5A, 5B, 5C, 6A y 6B (SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 27) y el polipéptido codificado por el ADNc de los clones depositados. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica natural del polinucleótido o una variante no natural del polinucleótido.

De esta manera, la presente invención también describe polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro mostrado en las SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 9 o el polipéptido maduro codificado por el ADNc del clon depositado HUVE091, así como variantes de estos polinucleótidos, codificando dichas variantes un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de las figuras 1A y B, o el polipéptido codificado por el ADNc del clon depositado HUVE091. Estas variantes de nucleótidos incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción.

Además, la presente invención describe polinucleótidos que codifican el polipéptido maduro mostrado en la SEC ID Nº: 27, o el polipéptido maduro codificado por el ADNc del clon depositado HEMCZ56, así como variantes de dichos polinucleótidos, codificando dichas variantes un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la SEC ID Nº: 203055, o el polipéptido codificado por el ADNc del clon depositado HEMCZ56. Estas variantes de nucleótidos incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción.

Como se ha indicado anteriormente en este documento, el polinucleótido puede tener una secuencia codificante que es una variante alélica natural de la secuencia codificante mostrada en la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 8 o de la secuencia codificante del clon depositado HUVE091. Como alternativa, el polinucleótido puede tener una secuencia codificante que es una variante alélica natural de la secuencia codificante mostrada en la SEC ID Nº: 26 o de la secuencia codificante del clon depositado HEMCZ56. Como se conoce la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia polinucleotídica que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado.

La presente invención también describe fragmentos de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en este documento. Por fragmento de una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia de nucleótidos de los ADNc depositados (HUVE091 y HEMCZ56), o la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 5A, 5B y 5C (SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 8) y las figuras 6A y 6B (SEC ID Nº: 26), o su cadena complementaria, se entienden fragmentos de al menos 15 nt, y más preferiblemente de al menos 20 nt, o más preferiblemente de al menos 30 nt e incluso más preferiblemente de al menos 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, ó 500 nt de longitud. Estos fragmentos tienen numerosos usos que incluyen, pero sin limitación, sondas de diagnóstico y cebadores como se describe en este documento. Por supuesto, también son útiles de acuerdo con la presente invención fragmentos de mayor tamaño, de 50-1500 nt de longitud, así como fragmentos que corresponden a la mayor parte, si no toda la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc depositado HUVE091, el clon de ADNc depositado HEMCZ56, la secuencia de nucleótidos descrita en la SEC ID Nº: 8 o la secuencia de nucleótidos descrita en la SEC ID Nº: 27. Por fragmento de al menos 20 nt de longitud, por ejemplo, se entienden fragmentos que incluyen 20 o más bases contiguas de la secuencia de nucleótidos de los clones de ADNc depositados (HUVE091 y HEMCZ56), la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 26.

En realizaciones específicas, los fragmentos polinucleotídicos de la invención codifican un polipéptido que demuestra una actividad funcional. Por polipéptido que demuestra "actividad funcional" se entiende un polipéptido que puede presentar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con un polipéptido VEGI completo o maduro. Estas actividades funcionales incluyen, pero sin limitación, la actividad biológica (por ejemplo, inhibición de la angiogénesis, inhibición de la proliferación de células endoteliales, inducción de la adhesión celular, antigenicidad [capacidad de unirse (o competir con un polipéptido VEGI y/o VEGI-beta por la unión) a un anticuerpo anti-VEGI y/o anti-VEGI-beta], inmunogenicidad (capacidad de generar anticuerpos que se unen a un polipéptido VEGI y/o VEGI-beta)), la capacidad de formar polímeros con otros polipéptidos VEGI y la capacidad de unirse a un receptor o ligando para un polipéptido VEGI (por ejemplo, DR3).

La invención también describe moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de nucleótidos relacionadas con fragmentos extensivos de la SEC ID Nº: 8 que se han determinado a partir de los siguientes clones de ADNc relacionados: HUVE091 (SEC ID Nº: 15), HMPAP05 (SEC ID Nº: 16), HSXCA44 (SEC ID Nº: 17), HEMFG66 (SEC ID Nº: 18) y HELAM93 (SEC ID Nº: 19).

Le invención también describe moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de nucleótidos relacionadas con fragmentos extensivos de la SEC ID Nº: 26 que se han determinado a partir de los siguientes clones ADNc relacionados: HUVE091 P01 (SEC ID Nº: 28), HMPTI24R (SEC ID Nº: 29), HELAM93R (SEC ID Nº: 30) y HEMFG66R (SEC ID Nº: 31).

En realizaciones específicas, los fragmentos polinucleotídicos descritos comprenden, o como alternativamente consisten en, un polinucleótido que comprende cualquier parte de al menos 30 nucleótidos, preferiblemente de al menos 50 nucleótidos, de la SEC ID Nº: 8 desde el resto nucleotídico 1 a 2422, preferiblemente excluyendo las secuencias de nucleótidos determinadas a partir de los clones de ADNc indicados anteriormente. Los ejemplos representativos de los fragmentos de polinucleótidos de VEGI descritos incluyen fragmentos que comprenden, o como alternativa que consisten en los nucleótidos: 783-1304, 800-1300, 850-1300, 900-1300, 950-1300, 1000-1300, 1050-1300, 1100-1300, 1150-1300, 1200-1300, 1250-1300, 783-1250, 800-1250, 850-1250, 900-1250, 950-1250, 1000-1250, 1050-1250, 1100-1250, 1150-1250, 1200-1250, 783-1200, 800-1200, 850-1200, 900-1200, 950-1200, 1000-1200, 1050-1200, 1100-1200, 1150-1200, 783-1150, 900-1150, 850-1150, 900-1150, 950-1150, 1000-1150, 1050-1150, 1100-1150, 783-1100, 800-1100, 850-1100, 900-1100, 950-1100, 1000-1100, 1050-1100, 783-1050, 800-1050, 850-1050, 900-1050, 950-1050, 1000-1050, 783-1000, 800-1000, 850-1000, 900-1000, 950-1000, 783-950, 800-950, 850-950, 900-950, 783-900, 800-900 y 850-900 de la SEC ID Nº: 1, o la cadena polinucleotídica complementaria, o el ADNc contenido en el clon depositado HUVE091.

En otras realizaciones específicas, los fragmentos de polinucleótidos descritos comprenden, o como alternativa consisten en un polinucleótido que comprende cualquier parte de al menos 30 nucleótidos, preferiblemente de al menos 50 nucleótidos de la SEC ID Nº: 26 desde el resto nucleotídico 1 al 1116, preferiblemente excluyendo las secuencias de nucleótidos determinadas a partir de los clones de ADNc indicados anteriormente.

La invención también describe polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden, o como alternativa que consisten en la secuencia de aminoácidos de los restos -1-147 (es decir, -1 a 147), 1-147 (es decir, +1 a 147), 2-147, 3-147, 4-147, 5-147, 6-147, 7-147, 8-147, 9-147, 10-147, 11-147, 12-147 y 13-147 de la SEC ID Nº: 2. También se describen polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

Los ejemplos representativos de los fragmentos de polinucleótidos de VEGI-beta descritos incluyen fragmentos que comprenden, o como alternativa que consisten en los nucleótidos 1-1116, 50-1116, 100-1116, 150-1116, 200-1116, 250-1116, 300-1116, 350-1116, 400-1116, 450-1116, 500-1116, 550-1116, 600-1116, 650-1116, 700-1116, 750-1116, 800-1116, 850-1116, 900-1116, 950-1116, 1000-1116, 1050-1116, 1-1100, 50-1100, 100-1100, 150-1100, 200-1100, 250-1100, 300-1100, 350-1100, 400-1100, 450-1100, 500-1100, 550-1100, 600-1100, 650-1100, 700-1100, 750-1100, 800-1100, 850-1100, 900-1100, 950-1100, 1000-1100, 1050-1100, 1-1050, 50-1050, 100-1050, 150-1050, 200-1050, 250-1050, 300-1050, 350-1050, 400-1050, 450-1050, 500-1050, 550-1050, 600-1050, 650-1050, 700-1050, 750-1050, 800-1050, 850-1050, 900-1050, 950-1050, 1000-1050, 1-1000, 50-1000, 100-1000, 150-1000, 200-1000, 250-1000, 300-1000, 350-1000, 400-1000, 450-1000, 500-1000, 550-1000, 600-1000, 650-1000, 700-1000, 750-1000, 800-1000, 850-1000, 900-1000, 950-1000, 1-950, 50-950, 100-950, 150-950, 200-950, 250-950, 300-950, 350-950, 400-950, 450-950, 500-950, 550-950, 600-950, 650-950, 700-950, 750-950, 800-950, 850-950, 900-950, 1-900, 50-900, 100-900, 150-900, 200-900, 250-900, 300-900, 350-900, 400-900, 450-900, 500-900, 550-900, 600-900, 650-900, 700-900, 750-900, 800-900, 850-900, 1-850, 50-850, 100-850, 150-850, 200-850, 250-850, 300-850, 350-850, 400-850, 450-850, 500-850, 550-850, 600-850, 650-850, 700-850, 750-850, 800-850, 1-800, 50-800, 100-800, 150-800, 200-800, 250-800, 300-800, 350-800, 400-800, 450-800, 500-800, 550-800, 600-800, 650-800, 700-800, 750-800, 1-750, 50-750, 100-750, 150-750, 200-750, 250-750, 300-750, 350-750, 400-750, 450-750, 500-750, 550-750, 600-750, 650-750, 700-750, 1-700, 50-700, 100-700, 150-700, 200-700, 250-700, 300-700, 350-700, 400-700, 450-700, 500-700, 550-700, 600-700, 650-700, 1-650, 50-650, 100-650, 150-650, 200-650, 250-650, 300-650, 350-650, 400-650, 450-650, 500-650, 550-650, 600-650, 1-600, 50-600, 100-600, 150-600, 200-600, 250-600, 300-600, 350-600, 400-600, 450-600, 500-600, 550-600, 1-550, 50-550, 100-550, 150-550, 200-550, 250-550, 300-550, 350-550, 400-550, 450-550, 500-550, 1-500, 50-500, 100-500, 150-500, 200-500, 250-500, 300-500, 350-500, 400-500, 450-500, 1-450, 50-450, 100-450, 150-450, 200-450, 250-450, 300-450, 350-450, 400-450, 1-400, 50-400, 100-450, 150-400, 200-400, 250-400, 300-400, 350-400, 1-350, 50-350, 100-350, 150-350, 200-350, 250-350, 300-350, 1-300, 50-300, 100-300, 150-300, 200-300, 250-300, 1-250, 50-250, 100-250, 150-250, 200-250, 1-200, 50-200, 100-200, 150-200, 1-150, 50-150, 100-150, 1-100, 50-100 y 1-50 de la SEC ID Nº: 19 o la cadena polinucleotídica complementaria, o el ADNc contenido en el clon depositado HEMCZ56.

Los fragmentos de ácido nucleico preferidos descritos en este documento también incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más de los siguientes dominios de los posibles sitios de glicosilación unida a asparagina de VEGI N-29 a N-32 (N-29, Y-30, T-31, N-32) y N-125 a D-128 (N-125, V-126, S-127, D-128); posibles sitios de fosforilación por Proteína Quinasa C (PKC) T-32 a K-34 (T-32, N-33, K-34) y T-50 a R-52 (T-50, F-51, R-52); posibles sitios de fosforilación por Caseína Quinasa II (CK2) S-83 a E-86 (S-83, Y-84, P-85, E-86); S-96 a E-99 (S-96, V-97, C-98, E-99); S-115 a E-118 (S-115, L-116, Q-117, E-118); S-130 a D-133 (S-130, L-131, V-132, D-133); y T-135 a D-138 (T-135, K-136, E-137, D-138); y posibles de sitios de miristilación G-20 a K-25 (G-20, L-21, A-22, F-23, T-24, K-25) y G-111 a L-116 (G-111, A-112, M-113, F-114, S-115, L-116) de la SEC ID Nº: 2.

Entre los polinucleótidos descritos se encuentran los caracterizados porque codifican atributos estructurales o funcionales de VEGI. Estos polinucleótidos codifican restos aminoacídicos que comprenden hélices alfa y regiones que forman hélices alfa (regiones alfa), láminas beta y regiones que forman láminas beta ("regiones beta"), giros y regiones que forman giros ("regiones de giro"), espirales y regiones que forman espirales ("regiones de espirales"), regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones anfipáticas alfa, regiones anfipáticas beta, regiones que forman superficies y regiones de alto índice antigénico (es decir, que tienen una región antigénica de tres o más restos aminoacídicos contiguos teniendo cada uno un índice antigénico mayor o igual a 1,5) de VEGI. Ciertas regiones preferidas son las indicadas en la figura 7, e incluyen pero sin limitación regiones de los tipos mencionados anteriormente identificadas por análisis de la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 9 usando los parámetros por defecto de los programas informáticos identificados; estas regiones preferidas incluyen: regiones alfa, regiones beta, regiones de giro y regiones de espiral de Garnier-Robson, regiones alfa, regiones beta y regiones de espiral de Chou-Fasman, regiones hidrófobas y regiones hidrófilas de Kyte-Doolittle, regiones anfipáticas alfa y beta de Eisenberg, regiones flexibles de Karplus-Schulz, regiones formadoras de superficie de Emini y regiones de alto índice antigénico de Jameson-Wolf.

Los datos que representan VEGI-beta de la forma descrita anteriormente en relación con VEGI pueden prepararse fácilmente usando la secuencia de aminoácidos descrita la SEC ID Nº: 27. Así pues, cada uno de los atributos estructurales o funcionales anteriores de los VEGI indicados anteriormente (es decir, regiones alfa, regiones beta, regiones de giro y regiones de espiral de Garnier-Robson, regiones alfa, regiones beta y regiones de espiral de Chou-Fasman, regiones hidrófilas y regiones hidrófobas de Kyte-Doolittle, regiones anfipáticas alfa y beta de Eisenberg, regiones flexibles de Karplus-Schulz, regiones formadoras de superficie de Emini y regiones de alto índice antigénico de Jameson-Wolf, etc.) se aplican de la misma manera a VEGI y a VEGI-beta.

En la figura 7 se presentan ciertas regiones preferidas en relación con esto, pero también pueden representarse o identificarse usando una representación en tabla de los datos presentados en la figura 7. El algoritmo informático DNA*STAR usado para generar la figura 7 (preparada con los parámetros por defecto originales) presentará fácilmente los datos de la figura 7 en dicho formato de tabla. Puede usarse un formato de tabla de los datos de la figura 7 para determinar fácilmente los límites específicos de una región preferida.

Las regiones preferidas mencionadas anteriormente indicadas en la figura 7 incluyen, pero sin limitación, regiones de los tipos mencionados anteriormente identificadas por análisis de la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 27. Como se indica la figura 7, estas regiones preferidas incluyen regiones alfa, regiones beta, regiones de giro y regiones de espiral de Garnier-Robson, regiones alfa, regiones beta y regiones de espiral de Chou-Fasman, regiones hidrófilas y regiones hidrófobas de Kyte-Doolittle, regiones anfipáticas alfa y beta de Eisenberg, regiones flexibles de Karplus-Schulz, regiones formadoras de superficie de Emini y regiones de alto índice antigénico de Jameson-Wolf.

Entre los fragmentos muy preferidos a este respecto se encuentran los que comprenden regiones de VEGI y/o VEGI-beta que combinan varias características estructurales, tales como varias (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) de las características indicadas anteriormente.

Otros fragmentos de ácido nucleico preferidos incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican una o más partes que llevan epítopos del polipéptido VEGI. En particular, estos fragmentos de ácido nucleico incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican: un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Thr-24 a aproximadamente Asn-32 de la SEC ID Nº: 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Ile-76 a aproximadamente Ile-45 de la SEC ID Nº: 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Met-54 a aproximadamente Arg-62 de la SEC ID Nº: 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Glu-57 a aproximadamente Gly-65 de la SEC Nº 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Val-80 a aproximadamente Thr-88 de la SEC ID Nº: 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Leu-116 a aproximadamente Val-124 de la SEC ID Nº: 9; y un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Asp-133 a aproximadamente Phe-141 de la SEC ID Nº: 9. Estos fragmentos de polipéptidos, según se ha determinado, llevan epítopos antigénicos del polipéptido VEGI por análisis del índice antigénico de Jameson-Wolf como se muestra en la figura 7, mencionado anteriormente. Más adelante se describen con detalle métodos para determinar otras partes que llevan epítopos de VEGI.

Los fragmentos de polipéptidos que llevan epítopos antigénicos de la proteína VEGI-beta pueden determinarse fácilmente por un especialista en la técnica usando el análisis descrito anteriormente del índice antigénico de Jameson-Wolf como se muestra la figura 7. Más adelante se describen con detalle métodos para determinar otras de estas partes que llevan epítopos de VEGI-beta.

La invención también describe polinucleótidos que hibridan, preferiblemente en condiciones de hibridación rigurosas, con una parte de la secuencia polinucleotídica de un polinucleótido que codifica VEGI como se ha descrito anteriormente tal como, por ejemplo, el clon de ADNc contenido en la ATCC con el Nº de depósito 75927, el clon de ADNc contenido en el depósito ATTC 203055 o un fragmento de polinucleótido VEGI como se describe en este documento. Por "condiciones de hibridación rigurosas" se entiende incubación durante una noche a 42ºC en una solución que comprende: 50% de formamida, SSC 5x (NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6) solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10% y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en SSC 0,1x a aproximadamente 65ºC. Por polinucleótido que hibrida con una "parte" de un polinucleótido se entiende un polinucleótido (ADN o ARN) que hibrida con al menos 15 nucleótidos (nt) y más preferiblemente al menos 20 nt, aún más preferiblemente al menos 30 nt, e incluso más preferiblemente 30-70 u 80-150 nt, o la longitud entera del polinucleótido de referencia. Éstos son útiles como sondas de diagnóstico y cebadores como se ha descrito anteriormente y como se describe con más detalle más adelante. Por supuesto, un polinucleótido que hibrida únicamente con una secuencia de poli A (tal como el tracto poli 3' terminal del ADNc de VEGI mostrado en la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 8 o la SEC ID Nº: 26), o con un tramo complementario de restos de T o (U), no se incluiría en un polinucleótido usado para hibridar con una parte de un ácido nucleico como se describe en este documento, ya que este polinucleótido hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contuviera un tramo de poli (A) o su complemento (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario generado usando oligo dT como cebador).

En realizaciones preferidas, los polinucleótidos que hibridan con los polinucleótidos de referencia descritos en este documento codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función biológica o actividad que el polipéptido maduro codificado por las secuencias polinucleotídicas descritas en la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 8 y/o SEC ID Nº: 26, o los ADNc contenidos en el depósito.

La presente invención describe además variantes de las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento, que codifican partes, análogos o derivados del polipéptido VEGI. Las variantes se pueden producir de forma natural, tal como una variante alélica natural. Por "variante alélica" se entiende una de varias formas alternas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo ((Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Pueden producirse variantes no naturales usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica.

Estas variantes incluyen las producidas por sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos de las secuencias polinucleotídicas descritas en este documento (incluyendo fragmentos). En las sustituciones, deleciones o adiciones pueden estar implicados uno o más nucleótidos. Las variantes pueden alterarse en regiones codificantes, regiones no codificantes o ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. Son especialmente preferidas entre éstas las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido VEGI o partes del mismo. También se prefieren especialmente a este respecto las sustituciones conservativas.

También se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia polinucleotídica con una identidad de al menos 70% o de al menos 80%, más preferiblemente con una identidad de al menos 90% y aún más preferiblemente con una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo consistente en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 9 (es decir, posiciones -27 a 147 de la SEC ID Nº: 9); (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido VEGI que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 9 excepto la metionina N-terminal (es decir, las posiciones -26 a 147 de la SEC ID Nº: 9; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI maduro que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9 mostrada como posiciones 1 a 147 de la SEC ID Nº: 9; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular del polipéptido VEGI que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 9 mostrada como posiciones 1 a 147 de la SEC ID Nº: 9; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de ADNc HUVE091 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 7597; (f) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI que tiene la secuencia de aminoácidos completa exceptuando la metionina N-terminal codificada por el clon de ADNc HUVE091 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 75927; (g) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc HUVE091 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 75927; (h) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular del polipéptido VEGI que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc HUVE091 contenido en el depósito ATTC 75927; (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de polipéptido descrito en este documento; y (j) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a), (b), (c), (d), (e), (g), (h), o (i) anteriores. Los polipéptidos descritos en este documento también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% y aún más preferiblemente de 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con las descritas en (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) o (j) anteriores, así como polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con una similitud de al menos 90%, y más preferiblemente con una similitud de al menos 95% con las anteriores.

La invención también describe moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia polinucleotídica con una identidad de al menos 70% o al menos 80%, más preferiblemente con una identidad de al menos 90%, y aún más preferiblemente con una identidad de al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo consistente en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la SEC ID Nº: 27 (es decir posiciones 1 a 251 de la SEC ID Nº: 27); (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la SEC ID Nº: 27 exceptuando la metionina N-terminal (es decir, posiciones 2 a 251 de la SEC ID Nº: 27); (c) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI-beta maduro que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 27 mostrada como posiciones 62 a 251 de la SEC ID Nº: 27; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio intracelular del polipéptido VEGI-beta que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 27 mostrada como posiciones 1 a 35 de la SEC ID Nº: 27; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular del polipéptido VEGI-beta que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 27 mostrada como posiciones 62 a 251 de la SEC ID Nº: 27; (f) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de ADNc HEMCZ56 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055; (g) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa exceptuando la metionina N-terminal codificada por el clon de ADNc HEMCZ56 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055; (h) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido VEGI-beta maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc HEMCZ56 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055; (i) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio intracelular del polipéptido VEGI-beta que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc HEMCZ56 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055; (j) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular del polipéptido VEGI-beta que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc HEMCZ56 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055; y (k) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) o (j) indicados anteriormente. Los polipéptidos descritos en este documento también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 80%, más preferiblemente con una identidad de al menos 90% y aún más preferiblemente con una identidad de 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con las descritas en (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) o (k) anteriormente, así como polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con una similitud de al menos 90%, y más preferiblemente con una similitud al menos 95%,
con las anteriores.

Por polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos con una "identidad" de al menos, por ejemplo, 95% con una secuencia de nucleótidos de referencia como se describe en este documento, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia con la excepción de que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido VEGI. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 95% con una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta 5% de los nucleótidos totales de la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. La secuencia de referencia (problema) puede ser la secuencia de nucleótidos entera descrita en la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 8 y la SEC ID Nº: 26 o cualquier fragmento descrito en este documento.

En la práctica, si cualquier molécula de ácido nucleico particular tiene una identidad de al menos 70%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, por ejemplo, con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº: 26 o con la secuencia de nucleótidos de los clones de ADNc depositados, puede determinarse convencionalmente usando programas informáticos conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular tiene una identidad, por ejemplo, de 95% con una secuencia de referencia como se describe en este documento, los parámetros se establecen, por supuesto, de tal forma que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y se permiten huecos en homología de hasta 5% del número total de nucleótidos de la secuencia de referencia.

En una realización específica, la identidad entre la secuencia de referencia (problema) (una secuencia como se describe en este documento) y una secuencia objeto, que también se conoce como alineamiento de secuencia global, se determina usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). Los parámetros preferidos usados en un alineamiento FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz = unitaria, k-tuple = 4, Penalización de Desacoplamiento = 1, Penalización de Unión = 30, Longitud de Grupo de Aleatorización = 0, Puntuación Límite = 1, Penalización de Huecos = 5, Penalización de Tamaño de Hueco = 0,05, Tamaño de la Ventana = 500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos objeto, lo que sea más corto. De acuerdo con esta realización, si la secuencia objeto es más corta que la secuencia problema a causa de deleciones 5' o 3', no debido a deleciones internas, se realiza una corrección manual en los resultados para tener en cuenta el hecho de que el programa FASTDB no considera los truncamientos 5' y 3' de la secuencia objeto cuando calcula el porcentaje de identidad. Para secuencias objeto truncadas en los extremos 5' o 3', con respecto a la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia problema que están en posición 5' y 3' de la secuencia objeto, que no se emparejan/alinean, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. La determinación de si un nucleótido está emparejado/alineado se realiza por medio de los resultados del alineamiento de secuencias FASTDB. Este porcentaje después se resta del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación corregida es la que se usa para los fines de esta realización. Sólo se calculan las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia objeto, representada por el alineamiento FASTDB, que no se emparejan/alinean con la secuencia problema para ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad. Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 bases se alinea con una secuencia problema de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones se realizan en el extremo 5' de la secuencia objeto y, por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un emparejamiento/alineamiento de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases no emparejadas representan 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no emparejadas/número total de bases en la secuencia problema) de forma que de la puntuación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB se resta 10%. Si las 90 bases restantes se emparejaran perfectamente, el porcentaje de identidad final sería de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia objeto de 90 bases con una secuencia problema de 100 bases. Esta vez las deleciones son deleciones internas de forma que no hay bases en el extremo 5' ó 3' de la secuencia objeto que no estén emparejadas/alineadas con el problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. De nuevo, sólo se realizan correcciones para las bases 5' y 3' de la secuencia objeto que no se emparejan/alinean con la secuencia problema. Para los fines de esta realización no se realiza ninguna otra corrección manual.

La presente invención también describe polinucleótidos que tienen una identidad de al menos 70%, preferiblemente de al menos 90% y aún más preferiblemente de al menos 95% con un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, así como fragmentos de los mismos, teniendo dichos fragmentos al menos 30 bases y preferiblemente al menos 50 bases, y con polipéptidos codificados por dichos nucleótidos.

La presente invención también describe polinucleótidos que tienen una identidad de al menos 70%, preferiblemente de al menos 90% y más preferiblemente una identidad de al menos 95% con un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 27, así como fragmentos de los mismos, teniendo dichos fragmentos al menos 30 bases y preferiblemente al menos 50 bases, y con polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos.

La presente solicitud describe moléculas de ácido nucleico con una identidad de al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con la secuencia polinucleotídica mostrada en la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 8 o la SEC ID Nº: 26, o con la secuencia de ácido nucleico de los clones de ADNc depositados, o fragmentos de las mismas, independientemente de si codifican un polipéptido que tiene actividad funcional de VEGI. Sin embargo, se prefiere que las moléculas de ácido nucleico descritas codifiquen un polipéptido que tiene actividad funcional de VEGI. Por "polipéptido tiene actividad funcional de VEGI" se entiende polipéptidos que presentan una actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad del polipéptido VEGI y/o VEGI-beta como se describe en este documento (la proteína de longitud completa o, preferiblemente, la proteína madura), medida en un inmunoensayo y/o ensayo biológico particular. Por ejemplo, la actividad de VEGI puede medirse determinando la capacidad relativa de VEGI de inhibir la formación inducida por FGF-2 de la formación de estructuras tubulares de tipo capilar en cultivos de células ABAE como se describe con detalle en el ejemplo 6 o en un ensayo de angiogénesis de membrana corioalantoica (CAM) como se describe en el ejemplo 10, y de varias formas adicionales descritas en los demás ejemplos y en la técnica.

Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, un especialista habitual en la técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia con una identidad de al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con la secuencia de ácido nucleico del ADNc depositado o con la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 26, o fragmentos de las mismas, codificarán un polipéptido "con actividad de VEGI". De hecho, como todas las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codificarán el mismo polipéptido, en muchos casos, esto será evidente para el especialista en la técnica incluso sin realizar el ensayo descrito anteriormente. También se reconocerá en la técnica que, para estas moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido con actividad de VEGI. Esto se debe a que el especialista en la técnica será totalmente consciente de las sustituciones de aminoácidos que tienen poca o ninguna probabilidad de afectar significativamente a la función proteica (por ejemplo, reemplazando un aminoácido alifático por un segundo aminoácido alifático). Por ejemplo, se proporcionan directrices en relación a cómo realizar sustituciones de aminoácidos silenciosas genotípicamente en J. U. Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990), donde los autores indican que las proteínas son sorprendentemente tolerantes de sustituciones de aminoácidos.

La invención describe moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido VEGI (por ejemplo, un fragmento de polipéptido VEGI descrito en este documento) que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una sustitución de aminoácidos conservativa, pero no más de 50 sustituciones de aminoácidos conservativas, incluso más preferiblemente no más de 40 sustituciones de aminoácidos conservativas, aún más preferiblemente no más de 30 sustituciones de aminoácidos conservativas, y aún más preferiblemente no más de 20 sustituciones de aminoácidos conservativas, 10-20 sustituciones de aminoácidos conservativas, 5-10 sustituciones de aminoácidos conservativas, 1-5 sustituciones de aminoácidos conservativas, 3-5 sustituciones de aminoácidos conservativas o 1-3 sustituciones de aminoácidos conservativas. Por supuesto, en orden de preferencia creciente, es muy preferible que un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido VEGI tenga una secuencia de aminoácidos que no contiene más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustitución de aminoácidos conservativa.

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Vectores y células hospedadoras

La presente invención también describe vectores que incluyen los polinucleótidos descritos, células hospedadoras que están modificadas por ingeniería genética con los vectores recombinantes o que están modificadas por ingeniería genética de otra manera para producir los polipéptidos descritos en este documento, y la producción de polipéptidos como se describe este documento por técnicas recombinantes.

Las células hospedadoras se modifican por ingeniería genética (se transducen, transforman o transfectan) con los vectores descritos que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc.. Las células hospedadoras modificadas por ingeniería genética pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados cuando sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de VEGI. Las condiciones de cultivo tales como la temperatura, el pH y similares, son las usadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el especialista habitual en la técnica.

Los polinucleótidos descritos en este documento pueden emplearse para producir polipéptidos por técnicas recombinantes. De esta manera, por ejemplo, el polinucleótido puede incluirse en una cualquiera de una diversidad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Estos vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fagos; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y pseudorrabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre que se pueda replicar y sea viable en el hospedador.

La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector por una diversidad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasas de restricción apropiados por procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos y otros se consideran dentro del alcance del especialista en la técnica.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está asociada operativamente con una o más secuencias de control de la expresión apropiadas (promotores) para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de estos promotores pueden mencionarse: el promotor de LTR o SV40, el lac o trp de E. coli, el promotor P del fago lambda y otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión a ribosomas para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Además, los vectores de expresión preferiblemente contienen uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina en el caso de los cultivos de células eucariotas, o tales como resistencia a tetraciclina o ampicilina en el caso de E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se describe en este documento, así como un promotor o secuencia de control apropiada, puede emplearse para transformar un hospedador apropiado y permitir que el hospedador exprese la proteína.

Como ejemplos representativos de hospedadores apropiados pueden mencionarse: células bacterianas tales E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas tales como levadura; células de insecto tales como Drosophila S2 y Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes, adenovirus, células vegetales, etc. La selección de un hospedador apropiado se considera dentro del alcance de los especialistas en la técnica por las enseñanzas de este documento.

La presente invención también describe construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias descritas en líneas generales anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o un vector viral, dentro del cual se ha insertado una secuencia como se ha descrito anteriormente en este documento, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras incluyendo, por ejemplo, un promotor, asociado de forma operativa con la secuencia. Los especialistas en la técnica conocen grandes números de vectores y promotores adecuados, y están disponibles en el mercado. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo; bacterianos: pHE4-5 (Nº de Acceso ATCC 209311; y variaciones del mismo), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); y eucariotas: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre que pueda replicarse y sea viable en el hospedador.

Las regiones promotoras pueden seleccionarse a partir de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores de selección. Dos vectores apropiados son PKK232-8 y PCM7. Los promotores bacterianos nombrados particulares incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P, P y trp. Los promotores eucariotas incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, timidina quinasa de HSV, promotor temprano y tardío de SV40, LTR de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y el promotor adecuado está dentro del nivel de experiencia habitual en la técnica.

La presente invención describe células hospedadoras que contienen las construcciones descritas anteriormente. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota superior tal como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior tal como una célula de levadura, o la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedadora puede realizarse por transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano o electroporación. (Davis, L, Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Además, para describir células hospedadores que contienen las construcciones de vectores descritas en este documento, la invención también describe células hospedadas primarias, secundarias e inmortalizadas procedentes de vertebrados, particularmente procedentes de mamífero, que se han modificado por ingeniería genética para delecionar o reemplazar material genético endógeno (por ejemplo, secuencia codificante de VEGI) y/o para incluir material genético (por ejemplo, secuencias polinucleotídicas heterólogas) que está asociado de forma operativa con polinucleótidos de VEGI descritos en este documento, y que activa, altera y/o amplifica polinucleótidos de VEGI endógenos. Por ejemplo, pueden usarse métodos conocidos en la técnica para asociar de forma operativa regiones de control heterólogas (por ejemplo, promotor y/o potenciador) y secuencias polinucleotídicas de VEGI endógenas por medio de recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 5.641.670, expedida el 24 de junio de 1997; la publicación internacional Nº WO 96/29411, publicada el 26 de septiembre de 1996; la publicación internacional Nº WO 94/12650 publicada el 4 de agosto de 1994; Koller et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989), incorporándose como referencia en su totalidad las descripciones de cada uno de estos documentos.

Las construcciones en las células hospedadores pueden usarse de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa, los polipéptidos descritos en este documento pueden producirse de forma sintética por sintetizadores de péptidos convencionales.

Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levadura, bacteria u otras células bajo el control de promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas de traducción sin células para producir estas proteínas usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para uso con hospedadores procariotas y eucariotas por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), cuya descripción se incorpora en el presente documento como referencia.

La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos descritos en este documento por eucariotas superiores se aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN de actuación en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación pb 100 a 270, un potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores de selección que permiten la transformación de la célula hospedadora, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y S. cerevisiae, el gen TRPI, y un promotor derivado de un gen de alta expresión para dirigir la transcripción de una secuencia estructural cadena abajo. Estos promotores pueden proceder de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como la 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), el factor a, fosfatasa ácida, o proteínas de choque térmico, entre otros. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de la traducción y, preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que imparte las características deseadas, por ejemplo, la estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de inicio y terminación de la traducción adecuadas en una fase de lectura operativa con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores de selección fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si es deseable, proporcionar amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros.

Como ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador de selección y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles en el mercado que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Estos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, USA). Estas secciones de "esqueleto" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que se desea expresar.

Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y del desarrollo de la cepa hospedadora hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce por medios apropiados (por ejemplo, un cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células típicamente se recogen por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto bruto resultante se conserva para una purificación adicional.

Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o uso de agentes de lisis celular, siendo estos métodos bien conocidos para los especialistas en la técnica.

También pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar proteínas recombinantes. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23: 175 (1981)), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuado, y también cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, sitios de poliadenilación, sitios donador y aceptor de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcritas flanqueantes 5'. Pueden usarse secuencias de ADN derivadas del sitio de corte y empalme de SV40 y sitios de poliadenilación para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios.

Los polipéptidos VEGI pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía en lectina. Pueden usarse etapas de replegamiento de proteínas, cuando sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas de purificación finales.

Los polipéptidos descritos en la presente invención pueden ser un producto purificado naturalmente o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o pueden producirse por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o eucariota (por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamífero, en cultivos). Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos descritos en la presente invención pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Los polipéptidos descritos en la invención también pueden incluir un resto aminoacídico de metionina inicial.

Los inventores de la presente invención han obtenido por ingeniería genética al menos 15 construcciones de expresión de VEGI para facilitar la producción de polipéptidos VEGI de varios tamaños y en diversos sistemas. De éstos, se han construido cuatro que codifican un polipéptido VEGI de longitud completa. Las construcciones de longitud completa son: (i) pQE9TNFg-27/147, (ii) pQE70TNFg, (iii) pC1TNFg, y pcDNA3TNFg. En el caso de la primera construcción de expresión indicada (pQE9TNFg-27/147), la construcción se usó para producir un polipéptido VEGI de longitud completa con una señal N-terminal de seis aminoácidos histidina de acuerdo con el método del ejemplo 1. Se produjo un polipéptido VEGI de longitud completa que carecía de la señal de histidina en bacterias usando la construcción pQE70TNFg esencialmente como se hizo en el ejemplo 1. Además, se produjo un polipéptido VEGI de longitud completa que carecía de una señal de histidina en células de mamífero usando las construcciones pC1TNFg o pcDNA3TNFg de acuerdo con el método del ejemplo 3. Además, el polipéptido VEGI maduro se produjo y secretó a partir de células de mamífero, bajo la dirección del péptido señal de interleuquina (IL)-6 a partir de una construcción denominada pcDNA3/IL6TNFg-1/149.

Las demás construcciones de expresión de VEGI se usaron para expresar diversas muteínas de VEGI a partir de sistemas bacterianos, baculovirales y de mamífero. Se han generado cuatro mutaciones de deleción de N-terminales usando el vector de expresión bacteriano pQE60. Estas construcciones de mutación de deleción N-terminales son: (i) pQE60TNFg-3/147 (que representa un posible polipéptido VEGI maduro; el polipéptido expresado por esta construcción es idéntico a los restos aminoacídicos 107-251 de VEGI-beta de la SEC ID Nº: 27), (ii) pQE60TNFg12/147 (que representa los restos aminoacídicos 12-147 de la SEC ID Nº: 9 y los restos 116-251 de la SEC ID NO:27), (iii) pQE60TNFg22/147 (que representa los restos aminoacídicos 22-147) y los restos 126 y 251 de la SEC ID Nº: 27, y (iv) pQE60TNFg28/147 (que representa los restos aminoacídicos 28-147 y los restos 132-251 de la SEC ID Nº: 27). Cada una de estas construcciones de expresión puede usarse para producir un polipéptido VEGI en un sistema bacteriano que presenta una deleción N-terminal de 25, 39, 49 y 55 aminoácidos, respectivamente, con respecto al polipéptido VEGI de longitud completa o una deleción N-terminal de 106, 115, 125 y 131 aminoácidos, respectivamente, con respecto al polipéptido VEGI-beta de longitud completa.

Se han generado más construcciones de expresión bacterianas de mutación por deleción N-terminal. Se ha generado una construcción denominada pHE4 VEGI T30-L174 usando el vector de expresión bacteriano pHE4 para expresar los aminoácidos treonina-30 a leucina-174 de la secuencia de VEGI descrita como restos de treonina-3 a leucina-147 de la SEC ID Nº: 9 que corresponden exactamente a los restos aminoacídicos treonina-107 a leucina-251 de la secuencia de VEGI-beta y los restos treonina-107 a leucina 251 del SEC ID Nº: 27. Otras construcciones de expresión bacterianas generadas incluyen pQE9.VE-Gl.his.T28-L174, pHE4.VEGI.T28-L174, pHE4.VEGLT51-L174 y pHE4.VEGLT58-L174. Estas construcciones se basan en vectores de expresión bacteriana pQE9 o pHE4. Las denominaciones de las construcciones indican el vector de expresión, el nombre del gen y los restos aminoacídicos expresados por la construcción (por ejemplo pQE9.VEGI.T28-L 174 indica que el vector de expresión bacteriano pQE9 se usa para expresar los aminoácidos treonina (T)-28 a leucina (L)-174 de VEGI.

Se ha generado una construcción de expresión de VEGI que puede usarse para producir un polipéptido VEGI maduro secretado a partir de un sistema de mamífero. La construcción se ha denominado pC1/IL6TNFg-3/147. Codifica el péptido señal del gen de IL-6 humano fusionado a la secuencia de VEGI madura. Se ha generado una construcción similar que contiene el péptido señal de Ck-b8 (aminoácidos -21 a -1 de la secuencia de CK-b8 descrita en la publicación de la solicitud PCT PCT/US95/09058 presentada con fecha 23/6/95) fusionado con el extremo amino de los aminoácidos 12-149 de VEGI (SEC ID Nº: 9; es decir los aminoácidos 116-251 de VEGI-beta (SEC ID Nº: 27)) en el contexto del vector de expresión de mamífero pC4. Esta construcción se ha denominado pC4/CK-b8TNFg12/147. Se ha generado una variante de esta construcción que puede usarse para expresar los aminoácidos 12-147 de VEGI fusionados a la región Fc de IgG humana en el extremo carboxi de VEGI. Esta proteína de fusión también se secreta bajo la dirección del péptido señal de CK-\beta8 y se ha denominado pC4/CK-\beta8TNFg12/147/Fc. La secuencia de la porción Fc humana de la molécula de fusión se muestra en la SEC ID Nº: 25. Podrían usarse otras secuencias conocidas por los especialistas en la técnica.

Los aminoácidos -3 a 147 de VEGI (SEC ID Nº:9; que corresponden a los restos aminoacídicos 102 a 251 de VEGI-beta (SEC ID Nº: 27)) pueden expresarse y secretarse a partir de un sistema de baculovirus usando una construcción denominada pA2GPTNFg-3/147. Esta construcción de expresión codifica la secuencia codificante de VEGI madura fusionada por su extremo amino al péptido señal GP de baculovirus.

También se han generado dos construcciones de expresión de VEGI retrovirales. La primera de éstas se ha denominado pG1 SamEN/TNFg-3/149. Esta construcción de expresión puede usarse para producir el polipéptido VEGI de longitud completa a partir de un sistema de mamífero. Se ha generado una construcción rotada, pG1SamEN/CK-\beta8TNFg12/149, que puede usarse para producir y secretar el polipéptido VEGI maduro a partir de un sistema de mamífero bajo la dirección del péptido señal CK-\beta8.

Otros polipéptidos descritos en el presente documento incluyen polipéptidos que tienen una similitud de al menos 90%, más preferiblemente una similitud de al menos 95% y aún más preferiblemente una similitud de al menos 96%, 97%, 98% ó 99% con los descritos anteriormente. Los polipéptidos descritos en la invención también comprenden los que tienen una identidad de al menos 80%, más preferiblemente una identidad de al menos 90% ó 95%, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 96%, 97%, 98% o 99% con el polipéptido codificado por el ADNc depositado o con el polipéptido de la SEC ID Nº: 9, y también incluyen partes de dichos polipéptidos con al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente con al menos 50 aminoácidos.

En la técnica se conocen métodos para producir la proteína recombinante o de fusión descrita anteriormente (véase, por ejemplo, Maniatis, Fitsch and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) o DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N Glover ed. (1985) en relación con los métodos de clonación generales) e incluyen el cultivo de células hospedadoras transformadas de manera estable con un vector de expresión que contiene un fragmento de ADN que codifica un polipéptido como se describe en la presente invención en tales condiciones que se exprese el fragmento de ADN y se produzca la proteína de fusión o recombinante. Además, la proteína o polinucleótido puede fusionarse a otro polipéptido que aumenta su función, o especifica su localización en la célula, tal como una secuencia de secreción como se presenta en los ejemplos 1-3. La proteína recombinante o de fusión puede aislarse por métodos conocidos en la técnica. Las células hospedadoras transformadas pueden usarse para analizar la eficacia de fármacos y agentes que inhiben o activan la función de VEGI, tales como proteínas hospedadoras o agentes obtenidos químicamente u otras proteínas que pueden interaccionar con polinucleótidos VEGI para regular negativamente o alterar la expresión de polipéptidos VEGI o afectar a su capacidad de inhibir la angiogénesis. Un método para ensayar la eficacia de un fármaco o agente anti-VEGI o anti-angiogénesis puede ser, por ejemplo, el bloqueo de la actividad inhibidora del crecimiento de las células endoteliales de VEGI. Es decir, la presencia de dicho agente anti-VEGI conduciría a una menor capacidad de VEGI de inhibir el crecimiento de células endoteliales. Como resultado, se necesitará más VEGI para conseguir una inhibición comparable a la observada en ausencia del agente anti-VEGI. Por otra parte, la presencia de un agente anti-angiogénico puede aumentar o sinergizar la capacidad de VEGI para inhibir el crecimiento de las células endoteliales. Por consiguiente, se necesitarán menores concentraciones de VEGI para conseguir una inhibición similar a la observada en ausencia del agente.

Polipéptidos y fragmentos

La presente invención describe además un polipéptido VEGI aislado que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº: 2 o de la SEC ID Nº: 9 o que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado HUVE091, así como fragmentos, análogos y derivados de dicho polipéptido.

La presente invención también describe un polipéptido VEGI-beta que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº: 27 o que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de HMCZ56 depositado, así como fragmentos, análogos y derivados de dicho polipéptido.

Los polipéptidos y polinucleótidos descritos preferiblemente se proporcionan en una forma aislada, y preferiblemente se purifican hasta un punto dentro del intervalo de una homogeneidad casi completa (por ejemplo, pureza >90%) a completa (por ejemplo, pureza >99%). El término "aislado" significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural está aislado. También se entiende como un "polipéptido aislado" polipéptidos que se han purificado parcialmente o sustancialmente a partir de una célula hospedadora recombinante. Por ejemplo, una versión producida de forma recombinante de un polipéptido VEGI puede purificarse sustancialmente por el método de una etapa descrito por Smith y Johnson (Gene 67:31-40 (1988)). Estos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o estos polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición y estar aislados, ya que dicho vector o composición no forma parte de su entorno natural. Los polipéptidos y polinucleótidos aislados descritos en la presente invención también incluyen estas moléculas producidas de forma natural o sintética. También pueden purificarse polipéptidos y polinucleótidos como se describen en la invención a partir de fuentes naturales o recombinantes usando anticuerpos anti-VEGI como se describe en la invención en métodos que son bien conocidos en la técnica de la purificación de proteínas.

Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo", cuando hacen referencia a los polipéptidos de la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 27, y los polipéptidos codificados por los ADNc depositados, significan un polipéptido que retiene una actividad funcional de VEGI, es decir, representa una o más actividades funcionales asociadas con un polipéptido VEGI de longitud completa y/o maduro descrito en la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 27, y/o codificado por uno o los dos clones depositados (HUVE091 y HEMCZ56). Como ejemplo, estos fragmentos, derivados o análogos que tienen la inmunogenicidad o antigenicidad deseada pueden usarse, por ejemplo, en inmunoensayos, para inmunización, para inhibición de la actividad de VEGI, etc. De esta manera, se describe en particular un fragmento de VEGI que puede unirse a un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia polipeptídica de VEGI descrita en la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 27, y/o que se codifica por uno o los dos clones depositados (HUVE091 y HEMCZ56).

Como otro ejemplo, se describen fragmentos, derivados o análogos de VEGI que tienen la actividad biológica de VEGI (por ejemplo, un polipéptido VEGI maduro o el dominio extracelular de un polipéptido VEGI-beta). Los fragmentos, derivados y análogos de VEGI que retienen, o como alternativa que carecen de una propiedad de VEGI deseada de interés (por ejemplo, la inhibición de la proliferación celular, inhibición tumoral, inhibición de la angiogénesis, efecto antiartritis por la inhibición de la angiogénesis y/o la proliferación de células endoteliales asociada con el pannus invasor en hueso y cartílago, un inductor de NF-\kappaB y la quinasa c-Jun (JNK), un inductor de la adhesión celular y como un inductor de la apoptosis), pueden usarse como inductores o inhibidores, respectivamente, de estas propiedades y sus correlaciones fisiológicas.

El polipéptido descrito en la invención puede existir como un receptor unido a la membrana que tiene una región transmembrana y una región intra- y extracelular, o puede existir en forma soluble en la que está ausente el dominio transmembrana. Un ejemplo de esta forma de VEGI es la secuencia del polipéptido VEGI-beta mostrada en la SEC ID Nº: 27 que contiene un dominio transmembrana, intracelular y extracelular.

Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos del polipéptido VEGI pueden variar sin un efecto significativo sobre la estructura o función de la proteína. Si se contemplan estas diferencias de secuencia, debe recordarse que habrá áreas críticas en la proteína que determinan la actividad. De esta manera, la invención además contempla el uso de variaciones del polipéptido VEGI que muestran una actividad sustancial del polipéptido VEGI o que incluyen regiones de VEGI tales como los fragmentos polipeptídicos descritos en este documento. Estas variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo seleccionadas de acuerdo con las reglas generales conocidas en la técnica de forma que tengan poco efecto sobre la actividad. Por ejemplo, se proporcionan pautas en relación a cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas donde los autores indican que hay dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio (Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990)). El primer método se basa en el proceso de evolución, en el que las mutaciones se aceptan o se rechazan por selección natural. La segunda estrategia usa ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y selecciones o exploraciones para identificar secuencias que mantienen la funcionalidad. Como indican los autores, estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Los autores además indican qué cambios de aminoácidos tienen probabilidad de ser permisivos en una cierta posición de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los restos aminoacídicos ocultos requieren cadenas laterales no polares, mientras que generalmente se conservan pocas características de cadenas laterales superficiales. Se describen otras sustituciones fenotípicamente silenciosas por Bowie y colaboradores (supra) y las referencias citadas en este documento. Típicamente se observan como sustituciones conservativas reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; intercambio de los restos hidroxilo Ser y Thr, intercambio de los restos ácidos Asp y Glu, sustitución entre los restos amina Asn y Gln, intercambio de los restos básicos Lys y Arg y reemplazos entre los restos aromáticos Phe y Tyr.

De esta manera, el fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la SEC ID Nº: 9 o de la SEC ID Nº: 27, o los codificados por los ADNc depositados pueden ser (i) uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos se sustituyen por un resto aminoacídico conservado o no conservado (preferiblemente un resto aminoacídico conservado) y dicho resto aminoacídico sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que la forma madura del polipéptido VEGI se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales se fusionan a la forma anterior del polipéptido, tal como una región de fusión Fc de IgG o una secuencia peptídica, líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación de la forma anterior del polipéptido o una secuencia de proproteína. Estos fragmentos, derivados y análogos se consideran dentro del alcance de los especialistas en la técnica por las enseñanzas del presente documento.

De esta manera, el VEGI descrito en la presencia invención puede incluir una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, debidas a mutaciones naturales o a la manipulación humana. Como se indica, preferiblemente los cambios son de una naturaleza minoritaria, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan significativamente al plegamiento o actividad de la proteína (véase la Tabla 1).

TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos conservativas

100

La invención también contempla el uso de polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de un polipéptido VEGI descrito en este documento, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una sustitución de aminoácido conservativa, pero no más de 50 sustituciones de aminoácidos conservativas, incluso más preferiblemente no más de 40 sustituciones de aminoácidos conservativas, aún más preferiblemente no más de 30 sustituciones de aminoácidos conservativas e incluso más preferiblemente no más de 20 sustituciones de aminoácidos conservativas, en comparación con la secuencia polinucleotídica de VEGI descrita en este documento. Por supuesto, en orden de preferencia creciente es muy preferible que el péptido o polipéptido tenga una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido VEGI, que contiene al menos uno, pero no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 sustitución de aminoácidos conservativa.

En realizaciones específicas adicionales, el número de sustituciones, ediciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 27, una secuencia polipeptídica codificada por los clones depositados y/o cualquiera de los fragmentos polipeptídicos descritos en este documento (por ejemplo, el dominio extracelular o el dominio intracelular ) es 75, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ó 150-50, 100-50, 50-20, 30-20, 20-15, 20-10, 15-10, 10-1, 5-10, 1-5, 1-3 ó 1-2.

Para mejorar o alterar las características de los polipéptidos VEGI, puede emplearse ingeniería genética de proteínas. Puede usarse tecnología de ADN recombinante conocida por los especialistas en la técnica para crear nuevas proteínas mutantes o muteínas que incluyan sustituciones, deleciones, adiciones de uno solo o múltiples aminoácidos o proteínas de fusión. Estos polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, una mayor actividad o una mayor estabilidad. Además, pueden purificarse en mayores rendimientos y mostrar mejor solubilidad que el polipéptido natural correspondiente, al menos en ciertas condiciones de purificación y almacenamiento.

De esta manera, la invención también contempla derivados y análogos de VEGI que tienen uno o más restos aminoacídicos delecionados, añadidos o sustituidos para generar polipéptidos VEGI que sean más adecuados para la expresión, aumento a escala, etc., en las células hospedadoras elegidas. Por ejemplo, los restos de cisteína pueden delecionarse o sustituirse por otro resto aminoacídico para eliminar puentes disulfuro; los sitios de N-glicosilación pueden alterarse o eliminarse para conseguir, por ejemplo, la expresión de un producto homogéneo que se pueda recuperar más fácilmente y purificar a partir de hospedadores de levadura que se sabe que hiperglicosilan sitios unidos a N. Para este fin, una diversidad de sustituciones de aminoácidos en la primera o tercera posiciones de aminoácidos, o en ambas, en una cualquiera o más de las secuencias de reconocimiento de glicosilación en los polipéptidos VEGI descritos en la invención, y/o una deleción de aminoácidos en la segunda posición en una cualquiera o más de dichas secuencias de reconocimiento impedirá la glicosilación del polipéptido VEGI en la secuencia tripeptídica modificada (véase, por ejemplo, Miyajimo et al., EMBO J 5(6):1193-1197).

Los aminoácidos de los polipéptidos VEGI descritos en la presente invención que son esenciales para la función pueden identificarse por métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis mediante alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Este último procedimiento introduce una sola mutación de alanina en cada resto de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes después se ensayan con respecto a la actividad biológica tal como la unión al receptor o la actividad proliferativa in vitro.

Tienen un especial interés las sustituciones de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutros que pueden producir proteínas con características mejoradas muy deseables, tales como una menor agregación. La agregación no sólo puede reducir la actividad, sino que también puede ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas porque los agregados pueden ser inmunogénicos (Pinckard, et al., Clin Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins, et al, Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland, et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)).

Como VEGI es un miembro de la familia de proteínas relacionadas al TNF, para modular en lugar de eliminar completamente las actividades biológicas de VEGI preferiblemente se realizan adiciones, sustituciones o deleciones en secuencias que codifican aminoácidos del dominio de tipo TNF conservado, es decir, en las posiciones 17-147 la SEC ID Nº: 9 o en las posiciones 121- 251 de la SEC ID Nº: 27, más preferiblemente en restos dentro de esta región que no están conservados en todos los miembros de la familia de polipéptidos relacionados con VEGI. La presente invención también contempla polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican las variantes de VEGI anteriores.

Varios aminoácidos del polipéptido VEGI están muy conservados entre los miembros conocidos de la familia de proteínas relacionadas con el TNF. Realizando una mutación específica en VEGI en residuos tales como tirosina-15 (como se numera en la SEC ID Nº: 9), leucina-35, glicina-41, tirosina-43, tirosina-46, glutamina-48, leucina-90, leucina-16, glicina-119, ácido aspártico-120, fenilalanina-141, fenilalanina-142 y leucina-147, es probable observar un efecto notable sobre la actividad biológica. Por supuesto, estos restos aminoacídicos idénticos están presentes en las posiciones correspondientes de VEGI-beta mostrado en la SEC ID Nº: 27.

La presente invención también contempla fragmentos de los polipéptidos VEGI descritos anteriormente. Los fragmentos polipeptídicos descritos en la presente invención incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos contenida en la SEC ID Nº: 2 y en la SEC ID Nº: 9, codificada por el ADNc contenido en el clon depositado (HUVE091), o codificada por ácidos nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas) con la secuencia de nucleótidos contenida en los clones depositados, que se describen en la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 8 y/o la SEC ID Nº: 26, o la cadena complementaria a la misma.

Los fragmentos polipeptídicos pueden ser "independientes" o estar incluidos dentro de un polipéptido mayor del cual el fragmento forma una parte o región, más preferiblemente como una sola región continua. Los ejemplos representativos de fragmentos polipeptídicos contemplados en el contexto de la invención incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden o, como alternativa, que consisten en aproximadamente los restos aminoacídicos 1 a 20, 21 a 40, 41 a 60, 61 a 83, 84 a 100, 101 a 120, 121 a 140, 141 a 160, 160 a 167, 161 a 174, 161 a 180, 181 a 200, 201 a 220, 221 a 240 y 241 a 251 de la SEC ID Nº: 9 y/o la SEC ID Nº: 27. Además, los fragmentos polipeptídicos pueden tener una longitud de al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 aminoácidos. En este contexto, "aproximadamente" incluye los intervalos indicados particularmente, mayores o menores en varios aminoácidos (es decir, 5, 4, 3, 2 ó 1), en cualquier extremo o en los dos extremos.

En otras realizaciones, los fragmentos o polipéptidos contemplados en el contexto de la invención (es decir, los descritos en este documento) no tienen más de 250, 225, 200, 185, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 90, 80, 75, 60, 50, 40, 30 ó 25 restos aminoacídicos de longitud.

Los fragmentos polipéptidos a usar en el contexto de la presente invención preferiblemente comprenden o, como alternativa, consisten en el dominio maduro de VEGI (restos aminoacídicos 1-147 de la SEC ID Nº: 9), el dominio intracelular de VEGI-beta (restos aminoacídicos 1-35 de la SEC ID Nº: 27), el dominio transmembrana de VEGI-beta (restos aminoacídicos 36-61 de la SEC ID Nº: 27) y/o el dominio extracelular de VEGI-beta (restos aminoacídicos 62-251 de la SEC ID Nº: 27).

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En realizaciones específicas, los fragmentos polipeptídicas contemplados en el contexto de la invención comprenden o, como alternativa, consisten en los restos aminoacídicos leucina-35 a valina-49, triptófano-104 a leucina-116, glicina-119 a serina-127, y lisina-139 a leucina-147 de la SEC ID Nº: 9). Estos dominios son regiones de alta identidad identificadas por comparación de los polipéptidos miembros de la familia VEGI.

Entre los fragmentos que se prefieren especialmente en el contexto de la invención se encuentran fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales de VEGI. Estos fragmentos incluyen restos aminoacídicos que comprenden alfa hélices y regiones formadoras de alfa hélice ("regiones alfa"), láminas beta y regiones formadoras de lámina beta, ("regiones beta"), giros y regiones formadores de giros ("regiones de giro"), espirales y regiones formadoras de espirales ("regiones de espiral"), regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones anfipáticas alfa, regiones anfipáticas beta, regiones formadores de superficie y regiones de alto índice antigénico (es decir, regiones de polipéptidos consistentes en restos aminoacídicos que tienen un índice antigénico igual o mayor que 1,5, identificadas usando los parámetros por defecto del programa de Jamenson-Wolf) de VEGI. Ciertas regiones preferidas son las descritas en la figura 7 e incluyen, pero sin limitación, regiones de los tipos mencionados anteriormente identificadas por análisis de la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 5A, 5B y 5C y en la SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 9, incluyendo dichas regiones preferidas: regiones alfa, regiones beta, regiones de giro y regiones de espiral previstas por Garnier-Robson; regiones alfa, regiones beta, regiones de giro y regiones de espiral previstas por Chou-Fasman; regiones hidrófilas y regiones hidrófobas previstas por Kyte-Doolittle; regiones anfipáticas alfa y beta de Eisenberg; regiones formadoras de superficie de Emini; y regiones de alto índice antigénico de Jameson-Wolf, previstas usando los parámetros por efecto de estos programas informáticos. También se contempla el uso en el contexto de la invención de polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

Además, los análogos de la proteína descrita incluyen una proproteína que puede activarse por escisión de la parte de la proproteína para producir un polipéptido maduro activo.

La invención también contempla un polipéptido VEGI (por ejemplo, un fragmento) que comprende o, como alternativa, que consiste en una parte que lleva el epítopo de un polipéptido como se describe la invención. El epítopo de esta parte de polipéptido es un epítopo inmunogénico o antigénico de un polipéptido como se describe en la invención. Un "epítopo inmunogénico" se define como una parte de una proteína que induce una respuesta de anticuerpos cuando la proteína entera es el inmunógeno. Por otra parte, una región de una molécula proteica a la que se puede unir un anticuerpo se define como un "epítopo antigénico". El número de epítopos inmunogénicos de una proteína generalmente es menor que el número de epítopos antigénicos (véase, por ejemplo, Geysen, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81:3998-4002 (1983)).

En cuanto a la selección de péptidos o polipéptidos que llevan un epítopo antigénico (es decir, que contienen una región de una molécula de proteína a la que puede unirse un anticuerpo), es bien sabido en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que imitan a parte de una secuencia proteica normalmente son capaces de inducir un antisuero que reacciona con la proteína parcialmente imitada (véase, por ejemplo, Sutcliffe, J. G., et al., Science 219:660-666 (1983)). Los péptidos capaces de inducir sueros reactivos con proteínas a menudo se representan en la secuencia primaria de una proteína, y pueden caracterizarse por una serie de reglas químicas sencillas y no se limitan ni a regiones inmunodominantes de proteínas intactas (es decir, epítopos inmunogénicos) ni a los extremos amino o carboxi. Por lo tanto, los péptidos y polipéptidos que llevan epítopos antigénicos polipéptidos descritos en la invención son útiles para inducir anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente al polipéptido descrito (véase, por ejemplo, Wilson, et al., Cell 37:767-778 (1984)).

Los péptidos y polipéptidos que llevan epítopos antigénicos descritos en la invención preferiblemente contienen una secuencia de al menos 7, más preferiblemente al menos 9 y aún más preferiblemente entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido como se describe en la invención. Los ejemplos no limitantes de polipéptidos o péptidos antigénicos que pueden usarse para generar anticuerpos específicos para VEGI incluyen: un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Thr-24 a aproximadamente Asn-32 de la SEC ID Nº: 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Ile-37 a aproximadamente He-45 de la SEC ID Nº: 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Met--54 a aproximadamente Arg-62 de la SEC ID Nº: 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Gln-63 a aproximadamente Asp-71 de la SEC ID Nº: 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Glu-57 a aproximadamente Gly-65 de la SEC ID Nº: 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Val-80 a aproximadamente Thr-88 de la SEC ID Nº: 9; un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Leu-116 a aproximadamente Val-124 de la SEC ID Nº: 9; y un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos de aproximadamente Asp-133 a aproximadamente Phe-141 en la SEC ID Nº: 9. Se ha determinado que estos fragmentos polipeptídicos llevan epítopos antigénicos del polipéptido VEGI por el análisis del índice antigénico de Jameson-Wolf, como se muestra en la figura 7 mencionada anteriormente.

Un especialista habitual en la técnica puede determinar fácilmente regiones antigénicas para VEGI-beta usando datos preparados por medio de un análisis DNA*STAR de la secuencia del polipéptido VEGI-beta (SEC ID Nº: 27) usando los parámetros por defecto y seleccionando regiones con un alto índice antigénico como se ha descrito anteriormente.

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Los péptidos y polipéptidos que llevan epítopos se pueden producir por cualquier medio convencional (véase, por ejemplo, Houghten, R. A., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:5131-5135 (1985); y Patente de Estados Unidos Nº 4.631.211 de Houghten, et. al. (1986)).

Los péptidos y polipéptidos que llevan epítopos descritos en la invención tienen usos que incluyen, pero sin limitación, la inducción de anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sutcliffe, et al., supra; Wilson, et al., supra; Chow, M., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F. J., et al., J Gen. Virol 66: 2347-2354 (1985)). Los péptidos que llevan epítopos inmunogénicos descritos en la invención, es decir, las partes de una proteína que inducen una respuesta de anticuerpos cuando la proteína entera es el inmunógeno, se identifican de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Geysen, et al., supra). Además, la Patente de Estados Unidos Nº 5.194.392, expedida a Geysen, describe un método general para detectar o determinar la secuencia de monómeros (aminoácidos u otros compuestos) que es un equivalente topológico del epítopo (es decir, un "mimótopo") que es complementaria a un parátopo particular (sitio de unión a antígeno) de un anticuerpo de interés. Más generalmente, la Patente de Estados Unidos Nº 4.433.092, expedida a Geysen, describe un método para detectar o determinar una secuencia de monómeros que es topográficamente equivalente de un ligando que es complementaria al sitio de unión al ligando de un receptor particular de interés (por ejemplo, DR3). De manera similar, la Patente de Estados Unidos Nº 5.480.971, expedida a Houghten y colaboradores, en Peralkylated Oligopeptide Mixtures, describe oligopéptidos alquil C1-C7 peralquilados lineales y series y bibliotecas de estos péptidos, así como métodos para usar dichas series de oligopéptidos y bibliotecas para determinar la secuencia de un oligopéptido peralquilado que se une preferentemente a una molécula aceptora de interés. De esta manera, también pueden obtenerse de forma rutinaria análogos no peptídicos de los péptidos que llevan epítopos descritos en la invención por estos métodos.

Como apreciará un especialista en la técnica, los polipéptidos VEGI y/o VEGI-beta y los fragmentos que llevan epítopo de los mismos descritos anteriormente pueden combinarse con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), dando como resultado polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una mayor vida media in vivo. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas consistentes en los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de mamífero (documento EP A 394.827; Traunecker, et al., Nature 331:84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica unida por enlaces disulfuro debido a la parte de IgG también pueden ser más eficaces en la unión y neutralización de otras moléculas distintas del polipéptido VEGI monomérico o un fragmento de la proteína solo (Fountoulakis, et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). Como ejemplo, en la presente invención se ha producido una de estas fusiones VEGI-Fc como se ha descrito anteriormente.

Los fragmentos (es decir, porciones) de los polipéptidos VEGI descritos anteriormente tienen usos que incluyen, pero sin limitación, intermedios para producir polipéptidos de longitud completa.

En el caso de muchas proteínas, incluyendo el dominio extracelular de una proteína asociada a la membrana o la forma o formas maduras de una proteína secretada, en la técnica se sabe que uno o más aminoácidos pueden delecionarse del extremo N o del extremo C sin una pérdida sustancial de función biológica. Por ejemplo, Ron y colaboradores (J. Biol. Chem., 268:2984-2988 (1993)) presentaron proteínas KGF modificadas que tenían actividad unión a heparina incluso si estaban ausentes 3, 8 o 27 restos aminoacídicos N-terminales. Además, varios investigadores han presentado muteínas de NTF-\alpha en las que se han eliminado 2, 4 ó 7 aminoácidos N-terminales, que mostraban un aumento de dos a tres veces en la actividad funcional en comparación con el polipéptido TNF-\alpha natural (Creasey, A. A., et al., Cancer Res. 47:145-149 (1987); Sidhu, R. S. y Bollon, A. P. Anticancer Res. 9:1569-1576 (1989); Kamijo, R., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 160:820-827 (1989)). Además, aunque la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C de una proteína produzca una modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, pueden conservarse otras actividades funcionales de VEGI.

En el presente caso, como las proteínas descritas en la invención son miembros de la familia de polipéptidos TNF, deleciones de aminoácidos N-terminales hasta el resto de leucina en la posición 35 de la SEC ID Nº: 9 (que corresponde exactamente al resto de leucina en la posición 134 de la SEC ID Nº: 27) pueden retener alguna actividad biológica tal como la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales. No sería de esperar que polipéptidos que tienen deleciones N-terminales adicionales incluyendo el resto de leucina-36 en la SEC ID Nº: 9 (correspondiente a la leucina-13 en la SEC ID Nº: 27) conservaran estas actividades biológicas, porque se sabe que este resto en polipéptidos relacionados a 1'NF está en el principio del dominio conservado necesario para las actividades biológicas.

Sin embargo, aunque la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N de un polipéptido VEGI de longitud completa produce una modificación o pérdida de una o más funciones biológicas del polipéptido, pueden conservarse otras actividades biológicas. De esta manera, generalmente se conservará la capacidad del polipéptido acortado de inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen la forma de longitud completa o madura del polipéptido cuando se retiren menos de la mayoría de los restos del polipéptido de longitud completa o maduro del extremo N. Puede determinarse fácilmente si un polipéptido particular que carece de restos N-terminales de un polipéptido completo retiene dichas actividades inmunológicas, por métodos rutinarios descritos en este documento y conocidos de otra manera en la técnica.

Por consiguiente, la presente invención contempla además el uso de polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo amino de la secuencia de aminoácidos del VEGI descrito en la SEC ID Nº: 9, hasta el resto de leucina en la posición número 35, y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, la presente invención contempla el uso de polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos n^{1} -149 de la SEC ID Nº: 9, donde n^{1} es un número entero en el intervalo de -27 a 35, y 35 es la posición del primer resto desde el extremo N del polipéptido VEGI completo (mostrado en la SEC ID Nº: 9) que se cree que es necesario para la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales.

En realizaciones específicas, la invención contempla el uso de polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o, como alternativa, consistentes en la secuencia de aminoácidos de los restos: -27 a 147, -26 a 147, -25 a 147, -24 a 147, -23 a 147, -22 a 147, -21 a 147, -20 a 147, -19 a 147, -18 a 147, -17 a 147, -16 a 147, -15 a 147, -14 a 147, -13 a 147, -12 a 147, -11 a 147, -10 a 147, -9 a 147, -8 a 147, -7 a 147, -6 a 147, -5 a 147, -4 a 147, -3 a 147, -2 a 147, -1 a 147, 1 a 147, 2 a 147, 3 a 147, 4 a 147, 5 a 147, 6 a 147, 7 a 147, 8 a 147, 9 a 147, 10 a 147, 11 a 147, 12 a 147, 13 a 147, 14 a 147, 15 a 147, 16 a 147, 17 a 147, 18 a 147, 19 a 147, 20 a 147, 21 a 147, 22 a 147, 23 a 147, 24 a 147, 27 a 147, 26 a 147, 27 a 147, 28 a 147, 29 a 147, 30 a 147, 31 a 147, 32 a 147, 33 a 147, 34 a 147 y 35 a 147 de la SEC ID Nº:9. También se contempla el uso en el contexto de la invención de polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

Por consiguiente, la presente invención describe además polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo amino de la secuencia de aminoácidos del VEGI-beta mostrado en la SEC ID Nº: 27, hasta el resto de leucina en la posición número 134, y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, la presente invención describe polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos n^{2}-251 de la SEC ID Nº: 27, donde n^{2} es un número entero en el intervalo de 1 a 134, y 135 es la posición del primer resto desde el extremo N del polipéptido VEGI-beta completo (mostrado en la SEC ID Nº: 27) que se considera necesario para la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de actividades de células hematopoyéticas y endoteliales del polipéptido VEGI-beta.

En realizaciones específicas, la invención describe polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o, como alternativa, consistentes en la secuencia de aminoácidos de los restos: 1 a 251, 2 a 251, 3 a 251, 4 a 251, 5 a 251, 6 a 251, 7 a 251, 8 a 251, 9 a 251, 10 a 251, 11 a 251, 12 a 251, 13 a 251, 14 a 251, 15 a 251, 16 a 251, 17 a 251, 18 a 251, 19 a 251, 20 a 251, 21 a 251, 22 a 251, 23 a 251, 24 a 251, 25 a 251, 26 a 251, 27 a 251, 28 a 251, 29 a 251, 30 a 251, 31 a 251, 32 a 251, 33 a 251, 34 a 251, 35 a 251, 36 a 251, 37 a 251, 38 a 251, 39 a 251, 40 a 251, 41 a 251, 41 a 251, 42 a 251, 43 a 251, 44 a 251, 45 a 251, 46 a 251, 47 a 251, 48 a 251, 49 a 251, 50 a 251, 51 a 251, 52 a 251, 53 a 251, 54 a 251, 55 a 251, 56 a 251, 57 a 251, 58 a 251, 59 a 251, 60 a 251, 61 a 251, 62 a 251, 63 a 251, 64 a 251, 65 a 251, 66 a 251, 67 a 251, 68 a 251, 69 a 251, 70 a 251, 71 a 251, 72 a 251, 73 a 251, 74 a 251, 75 a 251, 76 a 251, 77 a 251, 78 a 251, 79 a 251, 80 a 251, 81 a 251, 82 a 251, 83 a 251, 84 a 251, 85 a 251, 86 a 251, 87 a 251, 88 a 251, 89 a 251, 90 a 251, 91 a 251, 92 a 251, 93 a 251, 94 a 251, 95 a 251, 96 a 251, 97 a 251, 98 a 251, 99 a 251, 100 a 251, 101 a 251, 102 a 251, 103 a 251, 104 a 251, 105 a 251, 106 a 251, 107 a 251, 108 a 251, 109 a 251, 110 a 251, 111 a 251, 112 a 251, 113 a 251, 114 a 251, 115 a 251, 116 a 251, 117 a 251, 118 a 251, 119 a 251, 120 a 251, 121 a 251, 122 a 251, 123 a 251, 124 a 251, 125 a 251, 126 a 251, 127 a 251, 128 a 251, 129 a 251, 130 a 251, 131 a 251, 133 a 251, 134 a 251 y 134 a 251 de la SEC ID Nº: 27. También se contempla que son útiles en el contexto de la invención polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

Como se ha mencionado anteriormente, aunque la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N de un polipéptido tenga como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas del polipéptido, pueden conservarse otras actividades biológicas. De esta manera, generalmente se conservará la capacidad de la muteína de VEGI acortada de inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen la forma de longitud completa o madura del polipéptido cuando se retiren del extremo N menos de la mayoría de los restos del polipéptido de longitud completa o maduro. Puede determinarse fácilmente si un polipéptido particular que carece de los restos N-terminales de una proteína completa retiene estas actividades inmunológicas por métodos rutinarios descritos en este documento y conocidos de otra manera en la técnica. No es probable que una muteína de VEGI con un gran número de restos aminoacídicos N-terminales delecionados conserve alguna actividad biológica o inmunogénica. De hecho, los péptidos compuestos de sólo 6 restos aminoacídicos de VEGI a menudo pueden inducir una respuesta inmune.

Por consiguiente, la presente invención describe además polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo amino de la secuencia de aminoácidos madura prevista del VEGI descrito en la SEC ID Nº: 9, hasta el resto de fenilalanina en la posición número 142 de la SEC ID Nº: 9 y polinucleótidos que codifican estos polipéptidos. En particular, la presente invención describe polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos n^{3}-147 de la SEC ID Nº: 9, donde n^{3} es un número entero en el intervalo de 1 a 169, y 170 es la posición del primer resto desde el extremo N del polipéptido VEGI completo que se cree que se requiere para al menos la actividad inmunogénica del polipéptido VEGI.

Más particularmente, la invención describe polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o, como alternativa, que consisten en la secuencia de aminoácidos de los restos R-2 a L-174; R-3 a L-174; F-4 a L-174; L-5 a L-174; S-6 a L-174; K-7 a L-174; V-8 a L-174; Y-9 a L-174; S-10 a L-174; F-11 a L-174; P-12 a L-174; M-13 a L-174; R-14 a L-174; K-15 a L-174; L-16 a L-174; 1-17 a L-174; L-18 a L-174; F-19 a L-174; L-20 a L-174; V-21 a L-174; F-22 a L-174; P-23 a L-174; V-24 a L-174; V-25 a L-174; R-26 a L-174; Q-27 a L-174; T-28 a L-174; P-29 a L-174; T-30 a L-174; Q-31 a L-174; H-32 a L-174; F-33 a L-174; K-34 a L-174; N-35 a L-174; Q-36 a L-174; F-37 a L-174; P-38 a L-174; A-39 a L-174; L-40 a L-174; H-41 a L-174; W-42 a L-174; E-43 a L-174; H-44 a L-174; E-45 a L-174; L-46 a L-174; G-47 a L-174; L-48 a L-174; A-49 a L-174; F-50 a L-174; T-51 a L-174; K-52 a L-174; N-53 a L-174; R-54 a L-174; M-55 a L-174; N-56 a L-174; Y-57 a L-174; T-58 a L-174; N-59 a L-174; K-60 a L-174; F-61 a L-174; L-62 a L-174; L-63 a L-174; 1-64 a L-174; P-65 a L-174; E-66 a L-174; S-67 a L-174; G-68 a L-174; D-69 a L-174; Y-70 a L-174; F-71 a L-174; 1-72 a L-174; Y-73 a L-174; S-74 a L-174; Q-75 a L-174; V-76 a L-174; T-77 a L-174; F-78 a L-174; R-79 a L-174; G-80 a L-174; M-81 a L-174; T-82 a L-174; S-83 a L-174; E-84 a L-174; C-85 a L-174; S-86 a L-174; E-87 a L-174; 1-88 a L-174; R-89 a L-174; Q-90 a L-174; A-91 a L-174; G-92 a L-174; R-93 a L-174; P-94 a L-174; N-95 a L-174; K-96 a L-174; P-97 a L-174; D-98 a L-174; S-99 a L-174; 1-100 a L-174; T-101 a L-174; V-102 a L-174; V-103 a L-174; I-104 a L-174; T-105 a L-174; K-106 a L-174; V-107 a L-174; T-108 a L-174; D-109 a L-174; S-110 a L-174; Y-111 a L-174; P-112 a L-174; E-113 a L-174; P-114 a L-174; T-115a L-174; Q-116 a L-174; L-117 a L-174; L-118 a L-174; M-119 a L-174; G-120 a L-174; T-121 a L-174; K-122 a L-174; S-123 a L-174; V-124 a L-174; C-125 a L-174; E-126 a L-174; V-127 a L-174; G-128 a L-174; S-129 a L-174; N-130 a L-174; W-131 a L-174; F-132 a L-174; Q-133 a L-174; P-134 a L-174; 1-135 a L-174; Y-136 a L-174; L-137 a L-174; G-138 a L-174; A-139 a L-174; M-140 a L-174; F-141 a L-174; S-142 a L-174; L-143 a L-174; Q-144 a L-174; E-145 a L-174; G-146 a L-174; D-147 a L-174; K-148 a L-174; L-149 a L-174; M-150 a L-174; V-151 a L-174; N-152 a L-174; V-153 a L-174; S-154 a L-174; D-155 a L-174; 1-156 a L-174; S-157 a L-174; L-158 a L-174; V-159 a L-174; D-160 a L-174; Y-161 a L-174; T-162 a L-174; K-163 a L-174; E-164 a L-174; D-165 a L-174; K-166 a L-174; T-167 a L-174; F-168 a L-174; y F-169 a L-174 de la secuencia de VEGI mostrada en las figuras 5A, 5B, 5C (la secuencia de aminoácidos de VEGI mostrada en las figuras 5A, 5B, 5C es idéntica a la de la SEC ID Nº: 9, sin embargo, el esquema de numeración difiere entre las dos; la numeración de los restos aminoacídicos anteriores en este caso refleja la de las figuras 5A, 5B y 5C). También se contempla el uso de polinucleótidos que codifican estos polipéptidos en el contexto de la invención.

Por consiguiente, la presente invención describe además polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo amino de la secuencia de aminoácidos madura prevista del VEGI-beta mostrado en la SEC ID Nº: 27, hasta el resto de fenilalanina en la posición número 249 y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, la presente invención describe polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos n^{4}-251 de la SEC ID Nº: 27, donde n^{4} es un número entero en el intervalo de 2 a 246, y 247 es la posición del primer resto desde el extremo N del polipéptido VEGI-beta completo que se cree que es necesario para al menos la actividad inmunogénica de la proteína VEGI-beta.

Más particularmente, la invención describe polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o, como alternativa, que consiste en la secuencia de aminoácidos de los restos A-2 a L-251; E-3 a L-251; D-4 a L-251; L-5 a L-251; G-6 a L-251; L-7 a L-251; S-8 a L-251; F-9 a L-251; G-10 a L-251; E-11 a L-251; T-12 a L-251; A-13 a L-251; S-14 a L-251; V-15 a L-251; E-16 a L-251; M-17 a L-251; L-18 a L-251; P-19 a L-251; E-20 a L-251; H-21 a L-251; G-22 a L-251; S-23 a L-251; C-24 a L-251; R-25 a L-251; P-26 a L-251; K-27 a L-251; A-28 a L-251; R-29 a L-251; S-30 a L-251; S-31 a L-251; S-32 a L-251; A-33 a L-251; R-34 a L-251; W-35 a L-251; A-36 a L-251; L-37 a L-251; T-38 a L-251; C-39 a L-251; C-40 a L-251; L-41 a L-251; V-42 a L-251: L-43 a L-251; L-44 a L-251; P-45 a L-251; F-46 a L-251; L-47 a L-251; A-48 a L-251; G-49 a L-251; L-50 a L-251; T-51 a L-251; T-52 a L-251; Y-53 a L-251; L-54 a L-251; L-55 a L-251; V-56 a L-25 1; S-57 a L-251; Q-58 a L-251; L-59 a L-251; R-60 a L-251; A-61 a L-251; Q-62 a L-251; G-63 a L-251; E-64 a L-251; A-65 a L-251; C-66 a L-251; V-67 a L-251; Q-68 a L-251; F-69 a L-251; Q-70 a L-251; A-71 a L-251; L-72 a L-251; K-73 a L-251; G-74 a L-251; Q-75 a L-251; E-76 a L-251; F-77 a L-251; A-78 a L-251; P-79 a L-251; S-80 a L-251; H-81 a L-251; Q-82 a L-251; Q-83 a L-251; V-84 a L-251; Y-85 a L-251; A-86 a L-251; P-87 a L-251; L-88 a L-251; R-89 a L-251; A-90 a L-251; D-91 a L-251; G-92 a L-251; D-93 a L-251; K-94 a L-251; P-95 a L-251; R-96 a L-251; A-97 a L-251; H-98 a L-251; L-99 a L-251; T-100 a L-251; V-101 a L-251; V-102 a L-251; R-103 a L-251; Q-104 a L-251; T-105 a L-251; P-106 a L-251; T-107 a L-251; Q-108 a L-251; H-109 a L-251; F-110a L-251; K-111 a L-251; N-112 a L-251; Q-113 a L-251; F-114a L-251; P-115 a L-251; A-116 a L-251; L-117 a L-251; H-118 a L-251 ; W-119 a L-251; E-120 a L-251; H-121 a L-251; E-122 a L-251; L-123 a L-251; G-124 a L-251; L-125 a L-251; A-126 a L-251; F-127 a L-251; T-128 a L-251; K-129 a L-251; N-130 a L-251; R-131 a L-251; M-132 a L-251; N-133 a L-251; Y-134 a L-251; T-135 a L-251; N-136 a L-251; K-137 a L-251; F-138 a L-251; L-139 a L-251; L-140 a L-251; 1-141 a L-251; P-142 a L-251; E-143 a L-251; S-144 a L-251; G-145 a L-251; D-146 a L-251; Y-147 a L-251; F-148 a L-251; 1-149 a L-251; Y-150 a L-251; S-151 a L-251; Q-152 a L-251; V-153 a L-251; T-154 a L-251; F-155 a L-251; R-156 a L-251; G-157 a L-251; M-158 a L-251; T-159 a L-251; S-160 a L-251; E-161 a L-251; C-162 a L-251; S-163 a L-251; E-164 a L-251; 1-165 a L-251; R-166 a L-251; Q-167 a L-251; A-168 a L-251; G-169 a L-251; R-170 a L-251; P-171 a L-251; N-172 a L-251; K-173 a L-251; P-174 a L-251; D-175 a L-251; S-176 a L-251; 1-177 a L-251; T-178 a L-251; V-179 a L-251; V-180 a L-251; I-181 a L-251; T-182 a L-251; K-183 a L-251; V-184 a L-251; T-185 a L-251; D-186 a L-251; S-187 a L-251; Y-188 a L-251; P-189 a L-251; E-190 a L-251; P-191 a L-251; T-192 a L-251; Q-193 a L-251; L-194 a L-251; L-195 a L-251; M-196 a L-251; G-197 a L-251; T-198 a L-251; K-199 a L-251; S-200 a L-251; V-201 a L-251; C-202 a L-251; E-203 a L-251; V-204 a L-251; G-205 a L-251; S-206 a L-251; N-207 a L-251; W-208 a L-251; F-209 a L-251; Q-210 a L-251; P-211 a L-251; I-212 a L-251; Y-213 a L-251; L-214 a L-251; G-215 a L-251; A-216 a L-251; M-217 a L-251; F-218 a L-251; S-219 a L-251; L-220 a L-251; Q-221 a L-251; E-222 a L-251; G-223 a L-251; D-224 a L-251; K-225 a L-251; L-226 a L-251; M-227 a L-251; V-228 a L-251; N-229 a L-251; V-230 a L-251; S-231 a L-251; D-232 a L-251; I-233 a L-251; S-234 a L-251; L-235 a L-251; V-236 a L-251; D-237 a L-251; Y-238 a L-251; T-239 a L-251; K-240 a L-251; E-241 a L-251; D-242 a L-251; K-243 a L-251; T-244 a L-251; F-245 a L-251; y F-246 a L-251 de la de la secuencia de VEGI-beta mostrada en la SEC ID Nº: 27. También se contempla el uso en el contexto de la invención de polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

De forma similar, se conocen muchos ejemplos de muteínas de deleción C-terminal biológicamente funcionales. Por ejemplo, el interferón gamma muestra actividades hasta 10 veces mayores por deleción de 8 a 10 restos aminoacídicos del extremo carboxi de la proteína (Dobeli, et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)). Además, varios investigadores han presentado muteínas de TNF-\alpha biológicamente inactivas en las que se han retirado únicamente dos aminoácidos del extremo C (Carlino, J. A., et al., J. Biol Chem. 262:958-961 (1987); Creasey, A. A., et al., Cancer Res. 47:145-149 (1987); Sidhu, R. S. y Bollon, A. P. Anticancer Res. 9:1569-1576(1989); Gase, K., et al., immunology 71:368-371 (1990)).

En el presente caso, como las proteínas VEGI descritas anteriormente son miembros de la familia de polipéptidos del TNF, las deleciones de aminoácidos C-terminales hasta la leucina en posición 146 de la SEC ID Nº: 9 (que corresponde a la leucina en la posición 250 de la SEC ID Nº: 27) pueden conservar alguna actividad biológica tal como la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales. No sería de esperar que polipéptidos que tuvieran deleciones C-terminales adicionales incluyendo el resto de leucina en la posición 146 de la SEC ID Nº: 9 (o el resto de leucina en la posición 250 de la SEC ID Nº: 27) conservaran dichas actividades biológicas, porque se sabe que este resto en polipéptidos relacionados con TNF es el comienzo del dominio conservado necesario para las actividades biológicas.

Sin embargo, aunque la deleción de uno más aminoácidos del extremo C de una proteína tiene como resultado una modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, pueden conservarse otras actividades biológicas. De esta manera, generalmente se conservará la capacidad de la proteína acortada de inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen la forma completa o madura de la proteína cuando se retiren menos de la mayoría de los restos de la proteína completa o madura del extremo C. Puede determinarse fácilmente si un polipéptido particular que carece de restos C-terminales de una proteína completa conserva estas actividades inmunológicas por métodos rutinarios descritos en este documento y conocidos de otra manera en la técnica.

En otras realizaciones, la presente invención describe además polipéptidos en los que se han retirado uno o más restos del extremo carboxi de la secuencia de aminoácidos del polipéptido VEGI mostrado en la SEC ID Nº: 9, hasta el resto de leucina en la posición 146 de la SEC ID Nº: 9, y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, la presente invención describe polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los restos -27-m^{1} de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9, donde m^{1} es cualquier número entero en el intervalo de 146 a 147, y el resto 146 es la posición del primer resto desde el extremo C del polipéptido VEGI completo (mostrado en la SEC ID Nº: 9) que se cree que se necesita para la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales por el polipéptido VEGI.

Más particularmente, la invención describe polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los restos -27-146 y -27-147 de la SEC ID Nº: 9.

La presente invención también describe polipéptidos en los que se han retirado uno o más restos del extremo carboxi de la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta mostrado en la SEC ID Nº: 27, hasta el resto de leucina en la posición 250 de la SEC ID Nº: 27, y polinucleótidos que codifican estos polipéptidos. En particular, la presente invención describe polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los restos 1-m^{2} de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 27, donde m^{2} es cualquier número entero en el intervalo de 250 a 251 y el resto 249 es la posición del primer resto desde el extremo C del polipéptido VEGI-beta completo (mostrado en la SEC ID Nº: 17) que se cree es necesario para regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales.

Más particularmente, se describen polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los restos 1-250 y 1-251 de la SEC ID Nº: 27.

Además, se describen fragmentos de polipéptidos que comprenden o, como alternativa, que consisten en uno o más aminoácidos delecionados del extremo amino y del extremo carboxi de VEGI-alfa, que pueden describirse en general como fragmentos que tienen restos n^{1}-m^{1} de la SEC ID Nº: 9, donde n y m son números enteros como se ha descrito anteriormente. La invención además describe polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos delecionados tanto del extremo amino como del extremo carboxi de VEGI-beta, que pueden describirse en general como polipéptidos que tienen restos n^{2}-m^{2} de la SEC ID Nº: 27, donde n^{2} y m^{2} son números enteros como se ha descrito anteriormente.

Como se ha mencionado anteriormente, aunque la deleción de uno o más aminoácidos del extremo C de un polipéptido tenga como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas del polipéptido, pueden conservarse otras actividades biológicas. De esta manera, generalmente se conservará la capacidad de la muteína de VEGI acortada de inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen la forma de longitud completa o madura del polipéptido cuando se retiren del extremo C menos de la mayoría de los restos del polipéptido completo o maduro. Puede determinarse fácilmente si un polipéptido particular que carece de restos C-terminales de un polipéptido de longitud completa retiene dichas actividades inmunológicas por métodos rutinarios descritos en este documento y conocidos de otra manera en la técnica. No es probable en que una muteína de VEGI con un gran número de aminoácidos C-terminales delecionados pueda conservar algunas actividades biológicas o inmunogénicas. De hecho, péptidos compuestos únicamente de 6 restos aminoacídicos de VEGI a menudo pueden inducir una respuesta inmune.

Además, se describen polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo carboxi de la secuencia de aminoácidos del VEGI mostrado en las figuras 5A, 5B y 5C (o en la SEC ID Nº: 9), hasta el resto de serina en la posición número 6 en las figuras 5A, 5B y 5C (o -22 en la SEC ID Nº: 9) y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, se describen polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos 1-m^{3} de la SEC ID Nº: 9, donde m^{3} es un número entero en el intervalo de 6 a 174 y 6 es la posición del primer resto desde el extremo C del polipéptido VEGI completo que se cree que es necesario para al menos la actividad inmunogénica de VEGI-alfa.

Más particularmente se describen polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o, como alternativa, que consisten en la secuencia de aminoácidos de los restos M-1 a L-173; M-1 a P-172; M-1 a A-171; M-1 a G-170; M-1 a F-169; M-1 a F-168; M-1 a T-167; M-1 a K-166; M-1 a D-165; M-1 a E-164; M-1 a K-163; M-1 a T-162; M-1 a Y-161; M-1 a D-160; M-1 a V-159; M-1 a L-158; M-1 a S-157; M-1 a I-156; M-1 a D-155; M-1 a S-154; M-1 a V-153; M-1 a N-152; M-1 a V-151; M-1 a M-150; M-1 a L-149; M-1 a K-148; M-1 a D-147; M-1 a G-146; M-1 a E-145; M-1 a G-144; M-1 a L-143; M-1 a S-142; M-1 a F-141; M-1 a M-140; M-1 a A-139; M-1 a G-138; M-1 a L-137; M-1 a Y-136; M-1 a 1-135; M-1 a P-134; M-1 a Q-133; M-1 a F-132; M-1 a W-131; M-1 a N-130; M-1 a S-129; M-1 a G-128; M-1 a V-127; M-1 a E-126; M-1 a C-125; M-1 a V-124; M-1 a S-123; M-1 a K-122; M-1 a T-121; M-1 a G-120; M-1 a M-119; M-1 a L-118; M-1 a L-117;M-1 a Q-116; M-1 a T-115; M-1 a P-114; M-1 a E-113; M-1 a P-112; M-1 a Y-111; M-1 a S-110; M-1 a D-109; M-1 a T-108; M-1 a V-107; M-1 a K-106; M-1 a T-105; M-1 a I-104; M-1 a V-103; M-1 a V-102; M-1 a T-101; M-1 a I-100; M-1 a S-99; M-1 a D-98; M-1 a P-97; M-1 a K-96; M-1 a N-95; M1 a P94; M1 a R-93; M-1 a G-92; M-1 a A-91; M-1 a Q-90; M-1 a R-89; M-1 a 1-88; M-1 a E-87; M-1 a S-86, M-1 a C-85; M1 a E-84; M-1 a S-83; M-1 a T-82; M-1 a M-81; M-1 a G-80; M-1 a R-79; M-1 a F-78; M-1 a T-77; M-1 a V-76; M-1 a Q-75; M-1 a S-74; M-1 a Y-73; M-1 a I-72; M-1 a F-71; M-1 a Y-70; M-1 a D-69; M-1 a G-68, M-1 a S-67; M-1 a E-66; M-1 a P65; M-1 a 1-64; M-1 a L-63; M-1 a L-62; M-1 a F-61; M-1 a K-60; M-1 a N-59; M-1 a T-58; M-1 a Y-57; M-1 a N-56; M-1 a M-55; M-1 a R-54; M-1 a N-53; M-1 a K-52; M-1 a T-51; M-1 a F-50; M-1 a A-49; M-1 a L48; M-1 a G-47; M-1 a L-46; M-1 a E-45; M-1 a H-44; M-1 a E-43; M-1 a W-42; M-1 a H-41; M-1 a L-40; M-1 a A39; M-1 a P-38; M-1 a F-37; M-1 a Q-36; M-1 a N-35; M-1 a K-34; M-1 a F-33; M-1 a H-32; M-1 a Q-31; M-1 a T30; M-1 a P-29; M-1 a T-28; M-1 a Q-27; M-1 a R-26; M-1 a V-25; M-1 a V-24; M-1 a P-23; M-1 a F-22; M-1 a V21; M1 a L-20; M-1 a F-19; M-1 a L-18; M-1 a 1-17; M-1 a L-16; M-1 a K-15; M-1 a R-14; M-1 a M-13; M-1 a P-12; M-1 a F-11; M-1 a S-10; M-1 a Y-9; M-1 a V-8; M-1 a K-7; y M-1 a S-6 de la secuencia de VEGI mostrada en las figuras 5A, 5B y 5C (la secuencia de aminoácidos de VEGI mostrada en las figuras 5A, 5B y 5C es idéntica a la de la SEC ID Nº: 9, sin embargo, el esquema de numeración difiere entre las dos; la numeración de los restos aminoacídicos anteriores en este caso refleja la de las figuras 5A, 5B y 5C).

Además se describen polipéptidos en los que se han delecionado uno o más aminoácidos del extremo amino y carboxilo de un polipéptido VEGI, que pueden describirse generalmente como polipéptidos que tienen restos n^{3}-m^{3} de la SEC ID Nº: 9, donde n^{3} ym^{3} son números enteros como se ha descrito anteriormente. También se describen polinucleótidos que codifican los polipéptidos.

Además, se describen polipéptidos en los que se han delecionado uno o más restos del extremo carboxi de la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta mostrada en la SEC ID Nº: 27, hasta el resto de glicina en la posición número 6, y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, se describen polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos 1-m^{4} de la SEC ID Nº: 27, donde m^{4} es un número entero en el intervalo de 6 a 250, y 6 es la posición del primer resto del extremo C del polipéptido VEGI-beta completo que se cree que es necesario para al menos la actividad inmunogénica de la proteína VEGI-beta.

Más particularmente, se describen polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o, como alternativa, que consisten en la secuencia de aminoácidos de los restos M-1 a L-250; M-1 a F-249; M-1 a A-248; M-1 a G-247; M-1 a F-246; M-1 a F-245; M-1 a T-244; M-1 a K-243; M-1 a D-242; M-1 a E-241; M-1 a K-240; M-1 a T-239; M-1 a Y-238; M-1 a D-237; M-1 a V-236; M-1 a L-235; M-1 a S-234; M-1 a 1-233; M-1 a D-232; M-1 a S-231; M-1 a V-230; M-1 a N-229; M-1 a V-228; M-1 a M-227; M-1 a L-226; M-1 a K-225; M-1 a D-224; M-1 a G-223; M-1 a E-222; M-1 a Q-221; M-1 a L-220; M-1 a S-219; M-1 a F-218; M-1 a M-217; M-1 a A-216; M-1 a G-215; M-1 a L-214; M-1 a Y-213; M-1 a 1-212; M-1 a P-211; M-1 a Q-210; M-1 a F-209; M-1 a W-208; M-1 a N-207; M-1 a S-206; M-1 a G-205; M-1 a V-204; M-1 a E-203; M-1 a C-202; M-1 a V-201; M-1 a S-200; M- 1 a K-199; M-1 a T-198; M-1 a G-197; M-1 a M-196; M-1 a L-195; M-1 a L-194; M-1 a Q-193; M-1 a T-192; M-1 a P-191; M-1 a E-190; M-1 a P-189; M-1 a Y-188; M-1 a S-187; M-1 a D-186; M-1 a T-185; M-1 a V-184; M-1 a K-183; M-1 a T-182; M-1 a 1-181; M-1 a V-180; M-1 a V-179; M-1 a T-178; M-1 a 1-177; M-1 a S-176; M-1 a D-175; M-1 a P-174; M-1 a K-173; M-1 a N-172; M-1 a P-171; M-1 a R-170; M-1 a G-169; M-1 a A-168; M-1 a G-167; M-1 a R-166; M-1 a I-165; M-1 a E-164; M-1 a S-163; M-1 a C-162; M-1 a E-161; M-1 a S-160; M-1 a T-159; M-1 a M-158; M-1 a G-157; M-1 a R-156; M-1 a F-155; M-1 a T-154; M-1 a V-153; M-1 a Q-152; M-1 a S-151; M-1 a Y-150; M-1 a 1-149; M-1 a F-148; M-1 a Y-147; M-1 a D-146; M-1 a G-145; M-1 a S-144; M-1 a E-143; M-1 a P-142; M-1 a 1-141; M-1 a L-140; M-1 a L-139; M-1 a F-138; M-1 a K-137; M-1 a N-136; M-1 a T-135; M-1 a Y-134; M-1 a N-133; M-1 a M-132; M-1 a R-131; M-1 a N-130; M-1 a K-129; M-1 a T-128; M-1 a F-127; M-1 a A-126; M-1 a L-125; M-1 a G-124; M-1 a L-123; M-1 a E-122; M-1 a H-121; M-1 a E-120; M-1 a W-119; M-1 a H-118; M-1 a L-117; M-1 a A-116; M-1 a P-115; M-1 a F-114; M-1 a Q-113; M-1 a N-112; M-1 a K-111; M-1 a F-110; M-1 a H-109; M-1 a Q-108; M-1 a T-107; M-1 a P-106; M-1 a T-105; M-1 a Q-104; M-1 a R-103; M-1 a V-102; M-1 a V-101; M-1 a T-100; M-1 a L-99; M-1 a H-98; M-1 a A-97; M-1 a R-96; M-1 a P-95; M-1 a K-94; M-1 a D-93; M-1 a G-92; M-1 a D-91; M-1 a A-90; M-1 a R-89; M-1 a L-88; M-1 a P-87; M-1 a A-86; M-1 a Y-85; M-1 a V-84; M-1 a Q-83; M-1 a Q-82; M-1 a H-81; M-1 a S-80; M-1 a P-79; M-1 a A-78; M-1 a F-77; M-1 a E-76; M-1 a Q-75; M-1 a G-74; M-1 a K-73; M-1 a L-72; M-1 a A-71; M-1 a Q-70; M-1 a F-69; M-1 a Q-68; M-1 a V-67; M-1 a C-66; M-1 a A-65; M-1 a E-64; M-1 a G-63; M-1 a Q-62; M-1 a A-61; M-1 a R-60; M-1 a L-59; M-1 a Q-58; M-1 a S-57; M-1 a V-56; M-1 a L-55; M-1 a L-54; M-1 a Y-53; M-1 a T-52; M-1 a T-51; M-1 a L-50; M-1 a G-49; M-1 a A-48; M-1 a L-47; M-1 a F-46; M-1 a P-45; M-1 a L-44; M-1 a L-43; M-1 a V-42; M-1 a L-41; M-1 a C-40; M-1 a C-39; M-1 a T-38; M-1 a L-37; M-1 a A-36; M-1 a W-35; M-1 a R-34; M-1 a A-33; M-1 a S-32; M-1 a S-31; M-1 a S-30; M-1 a R-29; M-1 a A2-28; M-1 a K-27; M-1 a P-26; M-1 a R-25; M-1 a C-24; M-1 a S-23; M-1 a G-22; M-1 a H-21; M-1 a E-20; M-1 a P-19; M-1 a L-18; M-1 a L-18; M-1 a M-17; M-1 a E-16; M-1 a V-15; M-1 a S-14; M-1 a A-13; M-1 a T-12; M-1 a E-11; M-1 a G-10; M-1 a F-9; M-1 a S-8; M-1 a L-7 y M-1 a G-6 de la secuencia de VEGI-beta mostrada en la SEC ID Nº: 27. También se contemplan polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

Además, se describen polipéptidos en los se han delecionado uno o más aminoácidos tanto del extremo amino como del extremo carboxilo de un polipéptido VEGI-beta, que pueden describirse generalmente como polipéptidos que tienen restos en n^{4}-m^{4} de la SEC ID Nº: 27, donde n^{4} ym^{4} son números enteros como se ha descrito anteriormente. También se contemplan polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

Además, se describen fragmentos de polipéptidos que comprenden o, como alternativa, que consisten en los aminoácidos descritos por la fórmula general m^{x} a n^{x}, donde m y n corresponden a uno cualquiera de los restos aminoacídicos especificados anteriormente para estos símbolos, respectivamente, y x representa cualquier número entero. También se contemplan polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

Se describen secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido consistente en una parte de la secuencia de aminoácidos de VEGI completa codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC con el Nº de depósito 75927, donde esta parte excluye de 1 a aproximadamente 62 aminoácidos del extremo amino de la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC con el Nº de depósito 75927, o aproximadamente 1 aminoácido del extremo carboxi, o cualquier combinación de las deleciones amino terminales y carboxi terminales anteriores, de la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC con el Nº de depósito 75927. De esta manera, también se describen polinucleótidos que codifican todas las formas de polipéptidos mutantes de deleción anteriores.

Se describe una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido consistente en una parte de la secuencia de aminoácidos de VEGI-beta codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055, donde esta parte excluye de 1 a aproximadamente 134 aminoácidos del extremo amino de la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055, o excluye un número de aminoácidos del extremo amino de la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055 (donde el número se selecciona entre cualquier número entero de 1 a 134), o aproximadamente 1 aminoácido del extremo carboxi, o cualquier combinación de las deleciones amino terminales y carboxi terminales anteriores de la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055. De esta manera, también se contemplan polinucleótidos que codifican todos los polipéptidos anteriores.

Se describe un polipéptido VEGI aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido VEGI de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEC ID Nº: 9 (es decir, posiciones de -27 a 147 de la SEC ID Nº: 9); (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido VEGI de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEC ID Nº: 9 exceptuando la metionina N-terminal (es decir, las posiciones de -26 a 147 de la SEC ID Nº: 9); (c) la secuencia de aminoácidos del polipéptido VEGI maduro previsto que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 1-147 en la SEC ID Nº: 9; (d) la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de ADNc HUVE091 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 75927; (e) la secuencia de aminoácidos completa exceptuando la metionina N-terminal codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC con el Nº de depósito 75927; y (f) la secuencia de aminoácidos completa del polipéptido VEGI maduro previsto codificado por el clon de ADNc HUVE091 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 75927. Los polipéptidos descritos también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70%, una identidad de al menos 80%, más preferiblemente una identidad de al menos 90%, y aún más preferiblemente una identidad de 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con
los descritos en (a), (b), (c), (d), (e) o (f), anteriores, o fragmentos de los mismos, como se describe este documento.

Se describe un polipéptido VEGI aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido VEGI-beta de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEC ID Nº: 27 (es decir, las posiciones 1 a 251 de la SEC ID Nº: 27); (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido VEGI-beta de longitud completa que tiene la secuencia aminoácidos completa mostrada en la SEC ID Nº: 27 exceptuando la metionina N-terminal (es decir, las posiciones 2 a 251 de la SEC ID Nº: 27); (c) la secuencia de aminoácidos del polipéptido VEGI-beta maduro previsto que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 62-251 de la SEC ID Nº: 27; (d) la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de ADNc HEMCZ56 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055; (e) la secuencia de aminoácidos completa exceptuando la metionina N-terminal codificada por el clon de ADNc HEMCZ56 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055; y (f) la secuencia de aminoácidos completa del polipéptido VEGI maduro previsto codificado por el clon de ADNc HEMCZ56 contenido en la ATCC con el Nº de depósito 203055. Los polipéptidos descritos también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70%, una identidad de al menos 80%, más preferiblemente una identidad de al menos 90% y aún más preferiblemente una identidad de 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con los descritos en (a), (b), (c), (d), (e) o (f), anteriores, o fragmentos de los mismos, como se describen este documento. En realizaciones específicas, estos polipéptidos tienen al menos 10 aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una "identidad" de al menos, por ejemplo, 95% con una secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido VEGI se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia con la excepción de que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia del polipéptido VEGI. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95% con una secuencia de aminoácidos de referencia, pueden delecionarse o sustituirse por otro aminoácido hasta 5% de los restos aminoacídicos de la secuencia de referencia, o puede insertarse en la secuencia de referencia un número de aminoácidos hasta 5% de los restos aminoacídicos totales de la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden tener lugar en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre restos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

En la práctica, puede determinarse de manera convencional si cualquier polipéptido particular tiene una identidad de al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, por ejemplo, con la secuencia de aminoácidos mostrada en las figuras 5A, 5B y 5C (SEC ID Nº: 9), la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc HUVE091 depositado, o fragmentos de la misma, usando programas informáticos conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). Cuando se usa el programa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular tiene una identidad, por ejemplo, de 95% con una secuencia de referencia descrita en este documento, los parámetros se establecen, por supuesto, de tal manera que el porcentaje de identidad se calcule en toda la longitud de la secuencia aminoácidos de referencia y se permitan huecos en la homología de hasta 5% del número total de restos aminoacídicos de la secuencia de referencia.

En una realización específica, la identidad entre una secuencia de referencia (problema) (una secuencia como se describe en este documento) y una secuencia objeto, también denominada alineamiento de secuencias global, se determina usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). Los parámetros preferidos usados en el alineamiento de aminoácidos FASTDB son: Matriz = PAM0, k-tuple = 2, Penalización de Desacoplamiento = 1, Penalización de Unión = 20, Longitud de Grupo de Aleatorización = 0, Puntuación Límite = 1, Tamaño de la Ventana = longitud de la secuencia, Penalización de Hueco = 5, Penalización por Tamaño de Hueco = 0,05, Tamaño de la Ventana = 500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos objeto, lo que sea más corto. De acuerdo con esta realización, si la secuencia objeto es más corta que la secuencia problema debido a deleciones N o C-terminales, no debido a deleciones internas, se realiza una corrección manual en los resultados para tener en cuenta el hecho de que el programa FASTDB no considera los truncamientos N y C-terminales de la secuencia objeto cuando se calcula el porcentaje de identidad global. Para secuencias objeto truncadas en los extremos N y C con respecto a la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de restos de la secuencia problema que están en posición N y C-terminal con respecto a la secuencia objeto, que no están emparejados/alineados con un resto objeto correspondiente, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. La determinación de si un resto está emparejado/alineado se realiza por los resultados del alineamiento de secuencias FASTDB. Este porcentaje después se resta del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior, usando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación de porcentaje de identidad final es la que se usa para los fines de esta realización. Sólo se consideran los restos del extremo N y C de la secuencia objeto que no están emparejados/alineados con la secuencia problema para ajustar manualmente el porcentaje de identidad. Es decir, sólo posiciones de restos problema fuera de los restos N y C-terminales más lejanos de la secuencia objeto. Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos aminoacídicos se alinea con una secuencia problema de 100 restos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se produce en el extremo N de la secuencia objeto y, por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un emparejamiento/alineamiento de los primeros 10 restos en el extremo N. Los 10 restos no emparejados representan 10% de la secuencia (número de restos en el extremo N y C no emparejados/número total de restos en la secuencia problema) de forma que se resta 10% de la puntuación del porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. Si los 90 restos restantes se acoplaran perfectamente, el porcentaje de identidad final sería 90%. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos se compara con una secuencia problema de 100 restos. Esta vez las deleciones son deleciones internas, de forma que no hay restos en el extremo N o C de la secuencia objeto que no estén emparejados/alineados con la secuencia problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. De nuevo, sólo se realizan correcciones para las posiciones de restos fuera de los extremos N y C de la secuencia objeto, representada en el alineamiento FASTDB, que no se emparejan/alinean con la secuencia problema. No se realiza ninguna otra corrección manual para los fines de esta realización.

Los polipéptidos descritos incluyen el polipéptido de la SEC ID Nº: 9 (en particular, el polipéptido maduro), así como polipéptidos que tienen una similitud de al menos 70% (preferiblemente una identidad de al menos 70%) con el polipéptido de SEC ID Nº: 9 y aún más preferiblemente una similitud de al menos 90% (más preferiblemente una identidad de al menos 90%) con el polipéptido de la SEC ID Nº: 9 y aún más preferiblemente una similitud de al menos 95% (aún más preferiblemente una identidad de al menos 95%) con el polipéptido de la SEC ID Nº: 9, y también incluye partes de dichos polipéptidos, conteniendo dichas partes del polipéptido en general al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Los polipéptidos descritos también incluyen el polipéptido de la SEC ID Nº: 27 (en particular, el dominio extracelular del polipéptido) así como polipéptidos que tienen una similitud de al menos 70% (preferiblemente una identidad de al menos 70%) con el polipéptido de la SEC ID Nº: 27, más preferiblemente de una similitud de al menos 90% (más preferiblemente una identidad de al menos 90%) con el polipéptido de la SEC ID Nº: 27, y aún más preferiblemente una similitud de al menos 95% (aún más preferiblemente una identidad de al menos 95%) con el polipéptido de la SEC ID Nº: 27, y también incluyen partes de estos polipéptidos, teniendo dichas partes del polipéptido generalmente al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Además, los polipéptidos descritos incluyen polipéptidos que tienen una similitud de al menos 70%, una similitud de al menos 90%, más preferiblemente una similitud de al menos 95%, y aún más preferiblemente una similitud de al menos 96%, 97%, 98% ó 99% con los polipéptidos descritos en este documento. Los polipéptidos descritos también comprenden los que tienen una identidad de al menos 70%, una identidad de al menos 80%, más preferiblemente una identidad de al menos 90% ó 95%, aún más preferiblemente una identidad de al menos 96%, 97%, 98% ó 99% con los polipéptidos descritos en este documento. En realizaciones específicas, estos polipéptidos comprenden al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Como se conoce la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando las secuencias de aminoácidos y sus sustitutos aminoacídicos conservados de un polipéptido con la secuencia del segundo polipéptido. Por "% de similitud" para dos polipéptidos se entiende una puntuación de similitud producida comparando las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos usando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711) y los parámetros por defecto para determinar similitud. Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos
secuencias.

Como se usa en este documento, un polipéptido o secuencia de aminoácidos "procedente de" la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 9 y la SEC ID Nº: 27 se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipéptido codificado en la secuencia, o una parte del mismo donde la parte consiste en al menos 2-5 aminoácidos y más preferiblemente al menos 8-10 aminoácidos, e incluso más preferiblemente al menos 11-15 aminoácidos, o que es inmunológicamente identificable con un polipéptido codificado en la secuencia.

También se describen proteínas de fusión en las que el polipéptido o fragmento de VEGI de longitud completa, variante, derivado, o análogo del mismo se fusiona a una proteína no relacionada. Estas proteínas de fusión pueden diseñarse de forma rutinaria basándose en las secuencias de nucleótidos y polipeptídica de VEGI descritas en este documento. Por ejemplo, como apreciará un especialista en la técnica, pueden combinarse polipéptidos VEGI y/o VEGI-beta y fragmentos (incluyendo fragmentos que llevan epítopos) de los mismos descritos en este documento con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), dando como resultado polipéptidos quiméricos (de fusión). Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una mayor vida media in vivo. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas consistentes en los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de mamífero (documento EP A 394.827; Traunecker, et al., Nature 331:84-86 (1988)). También pueden ser más eficaces en la unión y neutralización de otras moléculas proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica unida por enlaces disulfuro debido a la parte de IgG, con respecto a la proteína VEGI monomérica o un fragmento proteico solo (Fountoulakis, et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). Como ejemplo, en la presente invención se ha producido una de estas fusiones VEGI-Fc como se ha descrito anteriormente. Otros ejemplos de proteínas de fusión de VEGI son, sin limitación, la fusión de la secuencia del polipéptido VEGI con cualquier secuencia de aminoácidos que permita que la proteína de fusión se presente en la superficie celular; o fusiones con una enzima, proteína fluorescente o proteína luminiscente que proporcione una función marcadora.

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Actividades Funcionales

La actividad funcional de los polipéptidos VEGI, y fragmentos, variantes, derivados y análogos de los mismos, puede ensayarse por diversos métodos.

Por ejemplo, en una realización en la que se está ensayando la capacidad de unir o competir con el polipéptido VEGI de longitud completa por la unión a un anticuerpo anti-VEGI, pueden usarse diversos inmunoensayos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitación sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, enzimas o marcadores radioisotópicos, por ejemplo), transferencias de Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En otra realización, se detecta la unión a anticuerpos detectando un marcador en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta detectando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo con el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo secundario está marcado. En la técnica se conocen muchos medios para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención.

En otra realización, cuando se identifica un TNF-ligando, la unión puede ensayarse, por ejemplo, por medios bien conocidos en la técnica. En otra realización, pueden ensayarse las correlaciones fisiológicas de la unión de VEGI a sus sustratos (transducción de señales).

Además, pueden aplicarse rutinariamente ensayos descritos en este documento (véanse los ejemplos 5-8 y 10) y otros conocidos en la técnica para medir la capacidad de polipéptidos VEGI y fragmentos, variantes, derivados y análogos de los mismos para inducir una actividad biológica relacionada con VEGI (por ejemplo, para inhibir o como alternativa promover la proliferación celular, la angiogénesis y la adhesión celular in vitro o in vivo).

El especialista en la técnica conocerá otros métodos y se contemplan dentro del alcance de la invención.

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Anticuerpos

También pueden usarse en el contexto de la invención anticuerpos que reconocen específicamente uno o más epítopos de VEGI o epítopos de variantes conservadas de VEGI, o fragmentos polipeptídicos de VEGI. De esta manera, los polipéptidos descritos, sus fragmentos u otros derivados o análogos de los mismos, o células que los expresan, pueden usarse como inmunógeno para producir anticuerpos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. También incluyen anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados, así como fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), los productos de una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. Para la producción de estos anticuerpos y fragmentos pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos correspondientes a una secuencia como se describe en este documento pueden obtenerse por inyección directa de los polipéptidos en un animal o por medio de la administración de los polipéptidos a un animal, preferiblemente un animal no humano. El anticuerpo obtenido de esta forma después se unirá a los propios polipéptidos. De esta manera, puede usarse incluso una secuencia que codifique sólo un fragmento de los polipéptidos para generar anticuerpos que se unan a los polipéptidos nativos enteros. Estos anticuerpos tienen usos que incluyen, pero sin limitación, el aislamiento del polipéptido de un tejido que expresa ese polipéptido y la detección de VEGI en una muestra biológica, y pueden usarse como parte de una técnica de diagnóstico o pronóstico con lo que en los pacientes se pueden ensayar cantidades anómalas de VEGI. Estos anticuerpos también pueden usarse en un método de inhibición de la actividad biológica de VEGI.

Para la producción de anticuerpos, diversos animales hospedadores pueden inmunizarse por inyección con el polipéptido VEGI (por ejemplo, uno que corresponde a un dominio funcional del polipéptido, tal como el dominio extracelular). Estos animales hospedadores pueden incluir, pero sin limitación, conejos, ratones y ratas, por nombrar algunos. Pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especia hospedadora, incluyendo pero sin limitación adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de los animales inmunizados.

Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos contra un antígeno particular, pueden obtenerse por cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridoma de Kohler y Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)); y la Patente de Estados Unidos Nº 4.376.110), la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor, et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 80:2026-2030 (1983) y la técnica de EBV-hibridoma (Cole, et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96 (1985)). Estos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el mAb descrito puede cultivarse in vitro o in vivo. La producción de altos títulos de mAb in vivo hace que éste sea el método preferido de producción en la presente invención.

Además, pueden usarse técnicas creadas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison, et al., Proc. Natl. Acad Sci., 81:6851-6855 (1984); Neuberger, et al. Nature 312:604-608 (1984); Takeda, et al., Nature 314:452-454 (1985)) por corte y empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón con una especificidad antigénica apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano con una actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes proceden de diferentes especies animales, tales como las que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana.

Para el uso in vivo de anti-VEGI en seres humanos, puede ser preferible usar anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados". Estos anticuerpos pueden producirse usando construcciones genéticas derivadas de células de hibridoma productoras de los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente. En la técnica se conocen métodos para producir anticuerpos quiméricos (Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi, et al, BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly, et al, Patente de Estados Unidos. 4.816.567; Taniguchi, et al, documento EP 171496; Morrison, et al., documento EP 173494; Neuberger, et al., documento WO 8601533; Robinson, et al., documento WO 8702671; Boulianne, et al, Nature 312:643 (1984); Neuberger, et al, Nature 314:268 (1985).

Como alternativa, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (Patente de Estados Unidos 4.946.778; Bird, Science 242:423-426 (1988); Huston, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883 (1988); y Ward, et al., Nature 334:544546 (1989)) para producir anticuerpos monocatenarios contra polipéptidos VEGI. Los anticuerpos monocatenarios se forman por unión de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región FV a través de un enlace de aminoácidos, dando como resultado un polipéptido monocatenario.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconozcan epítopos específicos por técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen pero sin limitación: los fragmentos F(ab')2 que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los enlaces disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Como alternativa, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab (Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.

Los anticuerpos contra el polipéptido VEGI, a su vez, pueden utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotipo que "imitan" al ObR, usando técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica. (Véase, por ejemplo, Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5):437-444; (1989) y Nissinoff, J. Immunol 147(8):2429-2438 (1991)). Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos que se unen al dominio extracelular de VEGI e inhiben competitivamente la unión del ligando al VEGI para generar anti-idiotipos que "imitan" al dominio extracelular de VEGI y, por lo tanto, se unen y neutralizan el ligando VEGI. Estos anti-idiotipos de neutralización o fragmentos Fab de estos anti-idiotipos pueden usarse en regímenes terapéuticos para neutralizar el ligando VEGI.

De esta manera, como se ha descrito anteriormente, personas con experiencia habitual en la técnica y usando la metodología convencional pueden inducir la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales contra la proteína (o polipéptido) VEGI como se describe en este documento. En la técnica son bien conocidos materiales y métodos para producir anticuerpos (véase, por ejemplo, Goding, en, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Capítulo 4, 1986). Además, el polipéptido puede fusionarse a otras proteínas o polipéptidos que aumentan su antigenicidad, produciendo de esta manera mayores títulos de anticuerpos. Los ejemplos de estas proteínas o polipéptidos incluyen cualquier adyuvante o vehículo, tal como hidróxido de aluminio. Estos anticuerpos pueden usarse en una terapia de anticuerpos pasiva donde pueden emplearse anticuerpos que se unen específicamente a VEGI para modular procesos dependientes de angiogénesis tales como reproducción, desarrollo, curación de heridas y reparación de tejidos, por nombrar algunos.

Trastornos Relacionados con el Sistema Inmune y Circulatorio y Otros Trastornos Médicos

La presente invención demuestra la utilidad de las moléculas descritas en este documento en un método para reducir los síntomas de una enfermedad asociada con la angiogénesis en un paciente animal o humano por medio de la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de VEGI. En particular, la presente invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo consistente en:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 23 a 174 de la SEC ID NO: 2;

(c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 39 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(d) un polinucleótido que codifica un fragmento del polipéptido de uno cualquiera de (a) a (c) que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis;

(e) un polinucleótido que hibrida con el complemento de la SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis;

(f) un polinucleótido que codifica una variante alélica del polinucleótido de una cualquiera de (a) a (e);

(g) un polinucleótido de una cualquiera (a) a (f) que codifica un polipéptido que comprende una señal de secreción; y

(h) la cadena complementaria de uno cualquiera (a) a (g) anteriores, de un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende dicho polinucleótido o un vector recombinante que comprende dicho polinucleótido para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis.

Como la angiogénesis es necesaria para la supervivencia de un tumor, la inhibición o inversión de la angiogénesis puede reducir o eliminar el tumor. Cuando se proporciona VEGI a un paciente, la dosificación del agente administrado variará dependiendo de factores tales como la edad, el peso, la altura, el sexo, el estado médico general, la historia médica previa del paciente, etc. En general, es deseable proporcionar al receptor una dosificación de los compuestos anteriores que esté en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (de peso corporal del paciente), aunque puede administrarse una dosificación inferior o superior. El uso de la presente invención contempla la administración individual así como la administración múltiple, administradas de forma simultánea o durante un periodo de tiempo prolongado.

Los polinucleótidos de VEGI pueden proporcionarse usando plásmidos o vectores virales tales como adenovirus o retrovirus que contienen polinucleótidos VEGI descritos en la SEC ID Nº:1 o una parte de los mismos, o una forma alélica de los mismos. Los vectores usados preferiblemente pueden proporcionar polinucleótidos de VEGI a una célula de tal forma que los polinucleótidos se transcriban y traduzcan, y se produzcan polipéptidos VEGI. Los polinucleótidos descritos también pueden administrarse como ADN, como ADN encapsulado en liposomas o como ADN atrapado en proteoliposomas que contienen proteínas receptoras de la envuelta viral (Kanoda, Y. et al. (1989) Science 243:375). Como alternativa, los polinucleótidos descritos pueden inyectarse junto con un vehículo. Un vehículo puede ser una proteína tal como una citoquina, por ejemplo, la interleuquina 2, o un soporte de glicoproteína de polilisina. Estas proteínas de soporte y los vectores y métodos para usarlas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Ascadi G. et al. Nature 1991,352:815). Además, los polinucleótidos descritos pueden recubrir a pequeñas perlas de oro y dichas perlas pueden introducirse en la piel, por ejemplo, con una pistola génica (Ulmer, J.B. et al. Science 1993, 259: 1745).

Como alternativa, pueden proporcionarse polipéptidos VEGI como se describen en este documento en formulaciones farmacéuticamente aceptables usando métodos de formulación conocidos por los especialistas en la técnica. Estas formulaciones pueden administrarse por vías convencionales. En general, las combinaciones pueden administrarse por vía tópica, transdérmica, intraperitoneal, oral, rectal o parenteral (por ejemplo intravenosa, subcutánea o intramuscular). Además, los polipéptidos VEGI descritos pueden incorporarse en polímeros biodegradables que se implantan en las proximidades del sitio en el que se desea liberar el fármaco o se implantan de forma que el polipéptido VEGI se libere lentamente de manera sistémica. Los polímeros biodegradables y su uso se describen con detalle, por ejemplo, en Brem et al., J. Neurosurg. 74:441-446 (1991).

Las formulaciones del polipéptido VEGI incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, oftálmica (incluyendo intravítrea o intracameral), nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal y epidural). Las formulaciones de polipéptido VEGI pueden presentarse de manera conveniente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por técnicas farmacéuticas convencionales. Estas técnicas incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo y el vehículo o vehículos o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos y después, si es necesario, dando forma al producto.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con respecto a la sangre del receptor para el que está destinada; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de una sola dosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales cerrados herméticamente, y pueden almacenarse en estado secado por congelación (liofilizado) que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas a partir de polvos estériles, granulados y comprimidos del tipo descrito previamente.

Son formulaciones de dosificación unitaria preferidas las que contienen una dosis diaria o unidad, una subdosis diaria, como se ha mencionado anteriormente en este documento, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente administrado. Debe entenderse que además de los ingredientes mencionados de forma particular anteriormente, las formulaciones para uso en el contexto de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión.

En otra realización, la presente invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo consistente en:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 23 a 174 de la SEC ID NO: 2;

(c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 39 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(d) un polinucleótido que codifica un fragmento del polipéptido de uno cualquiera de (a) a (c) que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis;

(e) un polinucleótido que hibrida con el complemento de la SEC ID Nº: 1 donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis;

(f) un polinucleótido que codifica una variante alélica del polinucleótido de una cualquiera de (a) a (e);

(g) un polinucleótido de una cualquiera (a) a (f) que codifica un polipéptido que comprende una señal de secreción; y

(h) la cadena complementaria de uno cualquiera (a) a (g) anteriores, de un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende dicho polinucleótido o un vector recombinante que comprende dicho polinucleótido, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o mejorar una enfermedad mediada por una angiogénesis patológica incontrolada. Las enfermedades contempladas son telangiectasia, psoriasis, esclerodermia, angiogénesis del miocardio, neovascularización de placas, angiogénesis de miembros isquémicos, rubeosis, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental y neovascularización diabética. Las enfermedades y patologías descritas en este documento no incluyen cáncer o tumores de ningún tipo.

En una realización específica, un polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta descrito se combina con una cantidad terapéuticamente eficaz de otro molécula que regula negativamente la angiogénesis que puede ser, pero sin limitación, el factor plaquetario 4, trombospondina-1, inhibidores de metaloproteasas tisulares (TIMP1 y TIMP2), prolactina (fragmento de 16 kDa), angiostatina (fragmento de 38 kDa de plasminógeno); receptor soluble de bFGF, factor de crecimiento de transformación \beta, interferón alfa y proteína relacionada con la proliferina placentaria.

Otros trastornos asociados con la neovascularización que pueden tratarse con los polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta descritos incluyen, pero sin limitación, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental, uveítis, retinopatía del prematuro, degeneración macular y neovascularización de injertos de córnea. (Véanse, por ejemplo, las revisiones de Waltman, et al., 1978 Am. J. Ophthal. 85:704-710 y Gartner, et al., 1978, Surv. Ophthal. 22:291-312.)

En otra realización, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de un polipéptido VEGI codificado por un polinucleótido como se ha mencionado anteriormente en este documento, que es un oligonucleótido anti-sentido o una ribozima específica para el ARN que codifica dicho polipéptido VEGI o un anticuerpo que se une a dicho polipéptido VEGI e inhibe o elimina su actividad, en un diluyente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad farmacéuticamente aceptable para la preparación de una composición farmacéutica para promover la angiogénesis. La modificación por ingeniería genética y la administración de ribozimas y oligonucleótidos anti-sentido son conocidas en la técnica (véase, Usman N., et al. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 527-533 y Ho y Parkinson, (1997) Semin Oncol. 24; 187-202) y estas moléculas pueden administrarse al interior de células de mamífero, por ejemplo, por medio de la mezcla con lípidos o usando un vector viral o plasmídico. Las enfermedades y afecciones contempladas incluyen, pero sin limitación, curación de heridas, úlceras pépticas, fracturas, queloides, vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación, menstruación y formación de la placenta.

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Realizaciones Ilustrativas Adicionales

Además, se describe un método para detectar la presencia de polipéptidos VEGI en una muestra para el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad asociada con la angiogénesis. Usando la metodología convencional bien conocida en la técnica, puede construirse un ensayo de diagnóstico aplicando sobre una superficie (es decir, un soporte sólido), por ejemplo una placa de microtitulación o una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa), anticuerpos específicos para polipéptidos VEGI, y poniendo en contacto la superficie recubierta con una muestra de suero, tejido u otra muestra biológica o química obtenida a partir de una persona que se sospecha que padece una enfermedad asociada con la angiogénesis. La presencia del complejo resultante formado entre el polipéptido VEGI en la muestra y anticuerpos específicos para el mismo puede detectarse por cualquiera de los métodos comunes conocidos en la técnica, tales como colorimetría o espectroscopia de anticuerpos con fluorescencia. Este método de detección puede usarse, por ejemplo, para el diagnóstico o pronóstico de cánceres.

También se describe un kit de diagnóstico que contiene anticuerpos específicos para polipéptidos VEGI y reactivos auxiliares bien conocidos en la técnica y que son adecuados para usarse en la detección de la presencia de polipéptidos VEGI en una muestra de suero, de tejido u otra muestra. Las muestras de tejidos contempladas pueden obtenerse a partir de mono, ser humano u otros mamíferos.

Se describen secuencias de ARN, ADN u otras secuencias de nucleótidos para uso en la detección de la presencia o ausencia de polinucleótidos VEGI usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o PCR con transcripción inversa (RT-PCR). La secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº:1, en la SEC ID Nº:8 o en la SEC ID Nº:26 puede usarse para diseñar cebadores que se unan específicamente a la secuencia polinucleotídica de VEGI en caso de PCR, o a un ADNc de VEGI producido a partir de la transcripción inversa de un ARN que codifica un polipéptido VEGI, para detectar la presencia o ausencia o para cuantificar la cantidad de polinucleótido de VEGI por comparación con un valor estándar. Los cebadores pueden ser de cualquier longitud que varíe de 7 a 40 nucleótidos, preferiblemente de 10 a 15 nucleótidos y aún más preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos. En la técnica son bien conocidos los reactivos y controles necesarios para las reacciones PCR o RT-PCR. Los productos amplificados después pueden analizarse con respecto a la presencia o ausencia de secuencias polinucleotídicas de VEGI, por ejemplo, por fraccionamiento en gel, con o sin hibridación, por radioquímica y por técnicas inmunoquímicas. Este método es ventajoso ya que sólo se requiere un pequeño tamaño de muestra para generar una cantidad suficiente de ADN plantilla con la que realizar la PCR o RT-PCR.

Además, se describe un kit de diagnóstico que contiene cebadores de PCR o RT-PCR específicos para polinucleótidos de VEGI, y reactivos auxiliares que son bien conocidos en la técnica y que son adecuados para uso en la detección de la presencia o ausencia de polinucleótidos de VEGI, o en la cuantificación de la cantidad de un ARN que codifica un polipéptido VEGI en una muestra usando PCR o RT-PCR. Las muestras contempladas pueden obtenerse a partir de seres humanos u otros mamíferos.

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VEGI se expresa en células endoteliales de vena umbilical humana, en células endoteliales inducidas, en macrófagos y en el tejido de la sustancia negra. En el caso de varios trastornos relacionados con el sistema inmune y con el sistema circulatorio, pueden detectarse niveles sustancialmente alterados (aumentados o disminuidos) de expresión del gen de VEGI-alfa y/o VEGI-beta en tejidos del sistema inmune o del sistema circulatorio o en otras células o fluidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o fluido espinal) extraídos de un individuo que tiene dicho trastorno, con respecto al nivel de expresión del gen de VEGI-alfa y/o VEGI-beta "estándar", es decir, el nivel de expresión de VEGI-alfa y/o VEGI-beta en tejidos del sistema inmune y del sistema circulatorio o en fluidos corporales de un individuo que no tiene el trastorno del sistema inmune ni del sistema circulatorio. De esta manera, se describe un método de diagnóstico que es útil durante el diagnóstico de un trastorno del sistema inmune y del sistema circulatorio, que implica medir el nivel de expresión del gen que codifica la proteína VEGI-alfa y/o VEGI-beta en tejidos del sistema inmune y circulatorio o en otras células o fluidos corporales de un individuo y comparar el nivel de expresión génica medido con un nivel de expresión génica de VEGI-alfa y/o VEGI-beta estándar, con lo que un aumento o reducción en el nivel de expresión génica en comparación con el valor estándar indica un trastorno del sistema inmune y circulatorio.

De esta manera, se describe un método de diagnóstico que es útil durante el diagnóstico de un trastorno del sistema inmune y circulatorio que implica medir el nivel de expresión del gen que codifica la proteína VEGI-alfa y/o VEGI-beta en tejidos del sistema inmune y circulatorio o en otras células o fluidos corporales de un individuo y comparar el nivel de expresión génica medido con un nivel de expresión génica de VEGI-alfa y/o VEGI-beta estándar, con lo que un aumento o reducción en el nivel de expresión génica en comparación con el valor estándar indica un trastorno del sistema inmune y circulatorio.

Cuando ya se ha realizado un diagnóstico de un trastorno en el sistema inmune y circulatorio de acuerdo con métodos convencionales, el método descrito en el presente documento es útil como indicador de pronóstico, con lo que los pacientes que presenten una expresión génica de VEGI-alfa y/o VEGI-beta reducida experimentarán un peor resultado clínico con respecto a los pacientes que expresan el gen a un nivel próximo al nivel estándar.

Por la expresión "ensayo del nivel de expresión del gen que codifica la proteína VEGI-alfa y/o VEGI-beta" se entiende la medición o estimación cualitativa o cuantitativa del nivel del polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta o el nivel del ARNm que codifica el polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta en una primera muestra biológica directamente (por ejemplo, determinando o estimando el nivel absoluto del polipéptido o el nivel de ARNm) o de manera relativa (por ejemplo, por comparación con el nivel de polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta o el nivel de ARNm en una segunda muestra biológica). Preferiblemente, el nivel de polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta o el nivel de ARNm en la primera muestra biológica se mide o estima y se compara con un nivel de polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta o un nivel de ARNm estándar, obteniéndose el nivel estándar a partir de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el trastorno o determinándose calculando el promedio de los niveles de una población de individuos que no tienen un trastorno del sistema inmune y circulatorio. Como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce el nivel de polipéptido o el nivel de ARNm de VEGI-alfa y/o VEGI-beta estándar, puede usarse de manera repetida como valor estándar para la comparación.

Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida a partir de un individuo, fluido corporal, línea celular, cultivo de tejidos u otra fuente que contiene ARNm o polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta. Como se ha indicado, las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como suero, plasma, orina, líquido sinovial y fluido espinal) que contiene polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta libre, tejido de los sistemas inmune y circulatorio y otras fuentes tisulares que se ha descubierto que expresan polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta completos o maduros o un receptor de VEGI-alfa y/o VEGI-beta. Los métodos para obtener biopsias de tejidos y fluidos corporales a partir de mamíferos son bien conocidos en la técnica. Cuando la muestra biológica incluye el ARNm, la fuente preferida es una biopsia tejidos.

El ARN celular total puede aislarse a partir de una muestra biológica usando cualquier técnica adecuada tal como el método de tiocianato de guanidinio-fenolcloroformo de una sola etapa descrito por Chomczynski y Sacchi (Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)). Después se ensayan los niveles de ARNm que codifica el polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta usando cualquier método apropiado. Éstos métodos incluyen análisis de transferencia de Northern, mapeo con nucleasa SI, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcripción inversa en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y transcripción inversa en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR).

El ensayo de los niveles de polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta en una muestra biológica puede realizarse usando técnicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, puede estudiarse la expresión del polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta en tejidos con métodos inmunohistológicos clásicos (Jalkanen, M. et al., J. Cell Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión de genes de polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). En la técnica se conocen marcadores de ensayo de anticuerpos adecuados e incluyen marcadores enzimáticos tales como glucosa oxidasa, y radioisótopos tales como yodo (^{125}I, ^{121}I), carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In) y tecnecio (^{99m}Tc) y marcadores fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.

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Además de ensayar los niveles de polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta en una muestra biológica obtenida a partir de un individuo, el polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta también puede detectarse in vivo por la formación de imágenes. Los marcadores de anticuerpos o marcadores para la formación de imágenes in vivo del polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta incluyen los detectables por radiografía de rayos X, RMN o ESR. En el caso de la radiografía de rayos X, los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable pero no abiertamente perjudicial para el sujeto. Los marcadores adecuados para RMN y ESR incluyen los que tienen un espín característico detectable, tal como deuterio, que puede incorporarse en el anticuerpo por marcaje de los nutrientes para el hibridoma relevante.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para el polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta que se ha marcado con un resto de formación de imágenes detectable apropiado, tal como un radioisótopo (por ejemplo, ^{131}l, ^{112}ln, ^{99m}Tc), una sustancia radio-opaca, o un material detectable por resonancia magnética nuclear, se introduce (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) en el mamífero en el que se desea examinar el trastorno del sistema inmune. En la técnica se entenderá que las dimensiones del sujeto y el sistema de formación de imágenes usado determinarán la cantidad de resto de formación de imágenes necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de un resto con radioisótopos, para un ser humano, la cantidad de radioactividad inyectada normalmente variará de aproximadamente 5 a 20 milicuries de ^{99m}Tc. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado después se acumulará de forma preferente en la localización de células que contienen polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta. Burchiel y colaboradores (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, S. W. y Rhodes, B. A., eds., Masson Publishing Inc. (1982)) describen la formación de imágenes de tumores
in vivo.

Como se ha indicado anteriormente, los polinucleótidos y polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta son útiles para el diagnóstico de patologías que implican una expresión anormalmente elevada o baja de actividades de VEGI-alfa y/o VEGI-beta. Dadas las células y tejidos en los que se expresa VEGI-alfa y/o VEGI-beta así como las actividades moduladas por VEGI-alfa y/o VEGI-beta, es evidente que un nivel de expresión sustancialmente alterado (aumentado o reducido) de VEGI-alfa y/o VEGI-beta en un individuo en comparación con un nivel estándar o "normal" produce estados patológicos relacionados con el o los sistemas corporales en los que se expresa y/o es activo VEGI-alfa y/o VEGI-beta.

Las moléculas, métodos y kits descritos en este documento también son útiles para el diagnóstico o tratamiento de diversos trastornos relacionados con el sistema inmune y circulatorio en mamíferos, preferiblemente en seres humanos. Estos trastornos incluyen infecciones por bacterias, virus y otros parásitos, inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias, linfadenopatías, enfermedades autoinmunes, enfermedad de injerto contra hospedador y cualquier desregulación de la función celular de los sistemas inmunes y circulatorio, incluyendo pero sin limitación autoinmunidad, leucemias, linfomas, inmunosupresión, inmunidad, inmunidad humoral, enfermedad inflamatoria del intestino, mielosupresión y similares.

Como los polipéptidos VEGI pueden inducir la activación de NF-\kappaB celular y la quinasa N-terminal c-jun (JNK), también son útiles para regular terapéuticamente trastornos sistémicos inmunes y celulares tales como infecciones por bacterias, virus y otros parásitos, inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias, linfadenopatía, enfermedades autoinmunes, enfermedad de injerto contra hospedador, autoinmunidad, inmunosupresión, enfermedad inflamatoria del intestino, mielosupresión y secuelas relacionadas.

Como el VEGI-alfa y VEGI-beta pertenecen a la superfamilia del TNF, también modulan la angiogénesis. Además, como los polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta inhiben funciones de células inmunes, tendrán una amplia serie de actividades antiinflamatorias. Los polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta pueden emplearse como agente anti-neovascularización para estimular la invasión y activación de las células de defensa del hospedador, por ejemplo, las células T citotóxicas y los macrófagos. Los especialistas en la técnica reconocerán muchas indicaciones que no son cánceres en las que no se desea la proliferación de vasos sanguíneos. Los polipéptidos VEGI-alfa y VEGI-beta también pueden emplearse para mejorar las defensas del hospedador contra infecciones crónicas y agudas resistentes, por ejemplo, infecciones por micobacterias, por medio de la atracción y activación de leucocitos microbicidas. Los polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta también pueden emplearse para inhibir la proliferación de células T por medio de la inhibición de la biosíntesis de IL-2 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes mediadas por células T. Los polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta también pueden emplearse para estimular la curación de heridas, tanto a través del reclutamiento de células que eliminan los desechos como de células inflamatorias promotoras del tejido conectivo. De esta misma manera, los polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta también pueden emplearse para tratar otros trastornos fibróticos, incluyendo cirrosis hepática, osteoartritis y fibrosis pulmonar. Los polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta también aumentan la presencia de eosinófilos que tienen la función característica de destruir las larvas de parásitos que invaden tejidos, tal como ocurre en la esquistosomiasis, triquinosis y ascariasis. También pueden emplearse polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta para regular la hematopoyesis, regulando la activación y diferenciación de diversas células progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, para liberar leucocitos maduros de la médula ósea después de una quimioterapia, es decir, en la movilización de células madre. También pueden emplearse polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta para tratar la sepsis.

Un especialista habitual en la técnica también apreciará que, como los polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta descritos son miembros de la familia del TNF, la forma madura secretada de la proteína puede liberarse en forma soluble a partir de las células que expresan VEGI por escisión proteolítica. Por lo tanto, cuando la forma madura o el dominio extracelular soluble de VEGI-alfa y/o VEGI-beta se añade desde una fuente exógena a las células, a tejidos o al cuerpo de un individuo, el polipéptido ejercerá sus actividades fisiológicas sobre sus células diana de ese individuo. Además, las células que expresan este polipéptido transmembrana de tipo 11 pueden añadirse a células, a tejidos o al cuerpo de un individuo y estas células añadidas se unirán a las células que expresan el receptor para VEGI-alfa y/o VEGI-beta, con lo que las células que expresan los polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta pueden producir acciones (por ejemplo, la regulación del crecimiento y la regulación de las células endoteliales) sobre las células diana que llevan el receptor.

Por lo tanto, se apreciará que las patologías producidas por una reducción en el nivel estándar o normal de actividades de VEGI-alfa y/o VEGI-beta en un individuo, particularmente trastornos de los sistemas inmune y circulatorio, pueden tratarse por medio de la administración de polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta (en forma del dominio maduro o extracelular del polipéptido). De esta manera, la invención también ilustra la utilidad de VEGI-alfa y/o VEGI-beta en un método de tratamiento de un individuo que necesita un mayor nivel de actividad VEGI-alfa y/o VEGI-beta que comprende administrar a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta aislado de la invención, particularmente una forma madura del polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta de la invención, eficaz para aumentar el nivel de actividad de VEGI-alfa y/o VEGI-beta en dicho individuo.

La actividad de adhesión celular de VEGI puede emplearse para la curación de heridas. VEGI tiene un fuerte efecto de proliferación de células endoteliales, lo cual es una indicación de que VEGI interviene en la curación de heridas. Los efectos de adhesividad celular de VEGI también pueden participar en la curación de heridas.

El polipéptido VEGI, por medio de su capacidad de estimular la activación de células T, es un mediador importante de la respuesta inmune. Por consiguiente, este polipéptido puede usarse para estimular una respuesta inmune contra una diversidad de infecciones parasitarias, bacterianas y víricas. Los polipéptidos VEGI pueden lisar células infectadas por virus y, por lo tanto, pueden emplearse para detener las células infectadas por VIH.

El polipéptido VEGI también puede emplearse para tratar enfermedades autoinmunes tales como diabetes de Tipo I aumentando la respuesta proliferativa de las células T.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Resumen de actividades de VEGI

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VEGI puede usarse para inhibir la proliferación de células endoteliales, por ejemplo, células endoteliales aórticas. A concentraciones de hasta 10 \mug/ml, VEGI puede inhibir casi completamente el crecimiento de células endoteliales mientras que no tiene ningún efecto aparente sobre el crecimiento de células de cáncer de mama humano. Como resultado, VEGI puede usarse para tratar enfermedades y trastornos en los que es ventajosa la inhibición del crecimiento de las células endoteliales.

Se han usado polipéptidos VEGI como se describen en este documento para reducir la formación de estructuras tubulares de tipo capilar formadas por células endoteliales in vitro. Los polipéptidos VEGI descritos en este documento pueden usarse para inhibir la formación de células endoteliales organizadas en estructuras tubulares de tipo capilar en respuesta a factores angiogénicos tales como FGF-2. Además, el VEGI aislado como se describe en este documento también puede usarse para inhibir el crecimiento y organización de células endoteliales en vasos capilares en una membrana corioalantoica de embrión de pollo (CAM) modificada. Como resultado, el VEGI como se describe en este documento puede usarse para inhibir la formación de capilares o estructuras de tipo capilar a partir de células endoteliales in vitro.

Los polinucleótidos y polipéptidos descritos en este documento pueden emplearse como reactivos de investigación y materiales para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos para enfermedades humanas.

También se contempla un método para la identificación del receptor para VEGI. El gen que codifica el receptor puede identificarse por numerosos métodos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, reconocimiento y selección de ligandos y clasificación FACS (Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Capítulo 5, (1991)). Preferiblemente, se emplea clonación de expresión donde se prepara ARN poliadenilado a partir de una célula que responde a VEGI, y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en grupos y se usa para transfectar células COS u otras células que no responden a VEGI. Las células transfectadas que se cultivan en portaobjetos de vidrio se exponen a VEGI marcado. El VEGI puede marcarse por una diversidad de medios que incluyen yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa con especificidad de sitio. Después de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a un análisis autorradiográfico. Se identifican grupos positivos, se preparan subgrupos y se vuelven a transfectar usando un proceso repetitivo de subdivisión y re-exploración, que produce finalmente un solo clon que codifica el supuesto receptor.

Como estrategia alternativa para la identificación de receptores, el VEGI marcado puede unirse por fotoafinidad con una membrana celular o con preparaciones de extractos que expresan la molécula receptora. El material entrecruzado se resuelve por PAGE y se expone a una película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor de VEGI puede escindirse, resolverse en fragmentos peptídicos y someterse a microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la microsecuenciación se usaría para diseñar una serie de sondas oligonucleotídicas degeneradas para explorar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica el supuesto receptor.

La composición de polipéptido VEGI de acuerdo con los usos de la presente invención se formulará y dosificará de una manera coherente con la buena práctica médica, teniendo en cuenta el estado clínico del paciente individual (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con el polipéptido VEGI solo), el sitio de administración de la composición del polipéptido VEGI, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los especialistas en la técnica. La "cantidad eficaz" de polipéptido VEGI para los fines de la presente invención se determina de esta manera teniendo en cuenta dichas consideraciones.

Los antagonistas pueden emplearse en una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se describe más adelante en este documento.

Los polipéptidos VEGI y los agonistas y antagonistas descritos en este documento pueden emplearse en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Estas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo incluye, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

También se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas preparadas de acuerdo con la invención. Asociado con dicho recipiente o recipientes puede haber una nota en la forma prescrita por la agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicha nota la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración en seres humanos. Además, las composiciones farmacéuticas preparadas de acuerdo con los usos de la presente invención pueden emplearse junto con otros compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas generalmente están diseñadas de tal manera que pueden administrarse de una forma conveniente tal como por vía tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas preferiblemente se diseñan de forma que sean adecuadas para administrarse en una cantidad eficaz para tratar y/o para la profilaxis de la indicación específica. En general, son adecuadas para administrase en una cantidad de al menos aproximadamente 10 g/kg de peso corporal y en la mayoría de los casos se administrarán en una cantidad no superior a aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal al día. En la mayoría de los casos, la dosificación es de aproximadamente 10 g/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal diariamente, teniendo en cuenta las vías de administración, síntomas, etc.

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar polipéptidos VEGI-alfa y/o VEGI-beta descritos en este documento, por ejemplo, encapsulación en liposomas; micropartículas, microcápsulas, endocitosis mediada por receptores (véase, por ejemplo, Wu y Wu 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, la vía tópica, intradérmica, intramuscular intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, oftálmica y oral. Los compuestos pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través del revestimiento epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, a través de la mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos.

En una realización específica, puede ser deseable diseñar las composiciones farmacéuticas para administración localmente en el área que necesita tratamiento. Esto puede conseguirse, por ejemplo, y no de forma limitante, por infusión local durante una operación quirúrgica, aplicación tópica, por ejemplo, junto con una venda para heridas, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas tales como membranas silásticas o fibras.

Una aplicación tópica de un polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta descrito en este documento para el tratamiento de al menos algunos de los trastornos oftálmicos descritos en el presente documento consiste en una cantidad eficaz del polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta descrito en un excipiente oftalmológicamente aceptable tal como solución salina tamponada, aceite mineral, aceites vegetales (tales como, por ejemplo, aceite de maíz o aceite de cacahuete), vaselina, Miglyol 182, soluciones alcohólicas, liposomas o productos similares a liposomas. Cualquiera de estas composiciones también puede incluir conservantes, antioxidantes, antibióticos, inmunosupresores y otros agentes biológica o farmacéuticamente eficaces que no ejercen un efecto perjudicial sobre el polipéptido VEGI-alfa y/o VEGI-beta descrito.

Los polipéptidos VEGI y los agonistas y antagonistas que son polipéptidos también pueden emplearse en los usos de la presente invención por expresión de dichos polipéptidos in vivo, lo cual a menudo se denomina "terapia génica".

De esta manera, por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería genética células de un paciente con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica un polipéptido ex vivo, proporcionándose las células modificadas por ingeniería genética a un paciente que se desea tratar con el polipéptido. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y son evidentes a partir de las enseñanzas del presente documento. Por ejemplo, las células pueden modificarse por ingeniería genética por medio del uso de una partícula retroviral que contiene ARN que codifica un polipéptido como se describe en este documento.

De forma similar, pueden modificarse por ingeniería genética células in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo, por ejemplo, por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una célula productora para producir una partícula retroviral que contiene ARN que codifica un polipéptido como se describe en este documento puede administrarse a un paciente para modificar células por ingeniería génica in vivo y para expresar el polipéptido in vivo. Estos y otros métodos para la administración de un polipéptido como se describen en este documento por medio de dicho método serían evidentes para el especialista en la técnica tras las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para modificar por ingeniería genética las células puede ser un vehículo distinto de un retrovirus, por ejemplo un adenovirus que puede usarse para modificar las células por ingeniería genética in vivo después de la combinación con un vehículo de administración adecuado.

Los retrovirus a partir de los cuales pueden obtenerse los vectores plasmídicos retrovirales mencionados anteriormente incluyen, pero sin limitación, el virus de la leucemia murina de Moloney, el virus de la necrosis esplénica, retrovirus tales como el virus del sarcoma de Rous, el virus del sarcoma de Harvey, el virus de la leucosis aviar, el virus de la leucemia de gibón, el virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, el virus del sarcoma mieloproliferativo y virus de tumor mamario. En una realización, el vector plasmídico retroviral procede del virus de la leucemia murina de Moloney.

El vector incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero sin limitación, el LTR retroviral; el promotor de SV40 y el promotor de citomegalovirus humano (CMV) descrito por Miller y colaboradores (Biotechniques 7:980-990 (1989)), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos, incluyendo, pero sin limitación, los promotores de histona, pol III y b-actina). Otros promotores virales que pueden emplearse incluyen, pero sin limitación, promotores de adenovirus, promotores de timidina quinasa (TK) y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para los especialistas en la técnica tras las enseñanzas contenidas en el presente documento.

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido como se describe en este documento está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero sin limitación, promotores adenovirales tales como el promotor tardío principal adenoviral, o promotores heterólogos tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV); promotores inducibles tales como el promotor de MMT, el promotor de metalotioneína; promotores del choque térmico; el promotor de albúmina, el promotor de ApoAI; promotores de globina humana; promotores de la timidina quinasa viral, tales como el promotor de la timidina quinasa de Herpes Simplex; LTR retrovirales (incluyendo los LTR retrovirales modificados descritos anteriormente en este documento); el promotor de b-actina; y promotores de hormonas del crecimiento humanas. El promotor también puede ser el promotor nativo que controla el gen que codifica el polipéptido.

Se emplea un vector plasmídico retroviral para transducir líneas celulares de empaquetamiento para formar líneas celulares productoras. Los ejemplos de células de empaquetamiento que pueden transfectarse incluyen, pero sin limitación, las líneas celulares PE501, PA317, b-2, b-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, CRE, \beta-CRIP, GP+E-86, GP+envAm12 y líneas celulares DAN como se describe por Miller (Human Gene Therapy 1: 5-14 (1990)), que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células de empaquetamiento a través de cualquier medio conocido en la técnica. Estos medios incluyen, pero sin limitación, electroporación, el uso de liposomas y precipitación con CaPO_{4}. En una alternativa, el vector plasmídico retroviral puede encapsularse en un liposoma o acoplarse con un lípido y después administrarse a un hospedador.

La línea celular productora genera partículas de vectores retrovirales infecciosas que incluyen la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos. Estas partículas de vectores retrovirales después pueden emplearse para transducir células eucarióticas, in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden transducirse incluyen, pero sin limitación, células madre embrionarias, células de carcinoma embrionario así como células madre hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales y células epiteliales bronquiales.

Esta invención también describe un método para explorar compuestos para identificar los que imitan a VEGI (agonistas) o previenen el efecto de VEGI (antagonistas). En particular, la presente invención se refiere a un método in vitro para ensayar posibles agentes o fármacos con respecto a una actividad inhibidora de la angiogénesis, comprendiendo dicho método medir la capacidad de dicho agente o fármaco para aumentar la actividad antiangiogénica de un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo consistente en:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 23 a 174 de la SEC ID NO: 2;

(c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 39 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(d) un polinucleótido que codifica un fragmento del polipéptido de uno cualquiera de (a) a (c) que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis;

(e) un polinucleótido que hibrida con el complemento de la SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis;

(f) un polinucleótido que codifica una variante alélica del polinucleótido de uno cualquiera de (a) a (e);

(g) un polinucleótido de uno cualquiera (a) a (f) que codifica un polipéptido que comprende una señal de secreción; y

(h) la cadena complementaria de uno cualquiera (a) a (g) anteriores,

en un ensayo in vitro.

Además, la presente invención se refiere a un método in vitro para ensayar la capacidad de un fármaco o agente para promover la angiogénesis, comprendiendo dicho método medir la capacidad de dicho fármaco o agente para reducir o eliminar la función de un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido como se ha mencionado anteriormente en este documento en un ensayo in vitro.

Un ejemplo de este método aprovecha la capacidad de polipéptidos VEGI para estimular significativamente la proliferación de células endoteliales humanas en presencia del comitógeno Con A. Se obtienen células endoteliales y se cultivan en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos (Costar, Cambridge, MA) en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10% (Hyclone Labs, Logan, UT), L-glutamina al 1%, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, gentamicina al 0,1% (Gibco Life Technologies, Grand island, NY) en presencia de 2 g/ml de Con-A (Calbiochem, La Jolla, CA). Con-A y el compuesto a explorar se añaden a un volumen final de 0,2 ml. Después de 60 horas a 37ºC, los cultivos se someten a pulsos con un Ci de [^{3}H]timidina (5 Ci/mmol; 1 Ci = 37 BGq; NEN) durante 12-18 horas y se recogen en filtros de fibra de vidrio (PhD; Cambridge Technology, Watertown, MA). La incorporación media de [^{3}H]timidina (cpm) de cultivos por triplicado se determina usando un contador de centelleo de líquidos (Beckman Instruments, Irvine, CA). Una incorporación significativa de [^{3}H]-timidina indica estimulación de la proliferación de células endoteliales.

Como alternativa, podría medirse la respuesta de un sistema de segundo mensajero conocido después de la interacción de polipéptidos VEGI y el receptor, y compararse en presencia o ausencia del compuesto. Estos sistemas de segundo mensajero incluyen, pero sin limitación, AMPc, guanilato ciclasa, canales iónicos o hidrólisis de fosfoinosítidos.

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Para ensayar antagonistas, se realiza en ensayo descrito anteriormente aunque en este ensayo se añade VEGI junto con el compuesto a explorar y la capacidad del compuesto para inhibir la incorporación de [^{3}H]timidina en presencia de polipéptidos VEGI indica que el compuesto es un antagonista de VEGI. Como alternativa, pueden detectarse antagonistas de VEGI combinando VEGI y un antagonista potencial con receptores de VEGI unidos a la membrana o receptores recombinantes en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. VEGI puede marcarse, tal como por radiactividad, de tal forma que el número de moléculas de VEGI unidas al receptor pueda determinar la eficacia del antagonista potencial.

Como alternativa, una célula de mamífero o preparación de membrana que expresa el receptor de VEGI se incuba con VEGI marcado en presencia del compuesto. Entonces podría medirse la capacidad del compuesto para mejorar o bloquear esta interacción.

La invención también ilustra un método para identificar una proteína receptora u otra proteína de unión a ligandos que se une específicamente a un polipéptido VEGI (por ejemplo DR3). Por ejemplo, puede prepararse un compartimento celular, tal como una membrana o una preparación de la misma, a partir de una célula que expresa una molécula que se une a polipéptidos VEGI. La preparación se incuba con polipéptidos VEGI marcados y los complejos del polipéptido VEGI unido al receptor o a otra proteína de unión se aíslan y se caracterizan de acuerdo con métodos rutinarios conocidos en la técnica. Como alternativa, el polipéptido VEGI puede unirse a un soporte sólido de forma que las moléculas de unión solubilizadas a partir de las células se unan a la columna y después se eluyan y se caractericen de acuerdo con métodos rutinarios.

En el ensayo de la invención de agonistas o antagonistas, puede prepararse un compartimento celular tal como una membrana o una preparación de la misma a partir de una célula que exprese una molécula que se une a VEGI, tal como una molécula de la ruta de señalización o regulación modulada por VEGI. La preparación se incuba con el polipéptido VEGI marcado en ausencia o presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de VEGI. La capacidad de la molécula candidata para unirse a la molécula de unión se refleja en la reducción de la unión del ligando marcado. Las moléculas que se unen de forma gratuita, es decir, sin inducir los efectos de VEGI sobre la unión de la molécula de unión a VEGI, tienen más probabilidad de ser buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien inducen efectos que son iguales o están muy relacionados con VEGI son agonistas.

Los efectos de tipo VEGI de los agonistas y antagonistas potenciales pueden medirse, por ejemplo, determinando la actividad de un sistema de segundo mensajero después de la interacción de la molécula candidata con una célula o una preparación celular apropiada, y comparando el efecto con el de VEGI o moléculas que inducen los mismos efectos que VEGI. Los sistemas de segundo mensajero que pueden ser útiles a este respecto incluyen, pero sin limitación, AMP guanilato ciclasa, canales iónicos o hidrólisis de fosfoinosítidos como sistemas de segundo mensajero.

Otro ejemplo de un ensayo de antagonistas de VEGI es un ensayo competitivo que combina el polipéptido VEGI y un posible antagonista con moléculas receptoras de VEGI unidas a la membrana o moléculas receptoras de VEGI recombinantes en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido VEGI puede marcarse, tal como por radiactividad, de tal forma que el número de moléculas VEGI unidas a una molécula receptora puede determinarse de forma precisa para evaluar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas orgánicas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polipéptido como se describe en este documento y de esta manera inhiben o extinguen su actividad. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína muy relacionada o un anticuerpo que se une a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula receptora, sin inducir actividades inducidas por VEGI, previniendo de esta manera la acción de VEGI al excluir la unión de VEGI.

Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido. Puede usarse tecnología antisentido para controlar la expresión génica a través de un ADN o ARN antisentido o a través de la formación de una triple hélice. Se describen técnicas antisentido en varios estudios (por ejemplo, Okano, J. Neurochem. 56: 560(1991); "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression". CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). La formación de triples hélices se describe en varios estudios, además de, por ejemplo, Lee, et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney, et al., Science 241: 456 (1988); Dervan, et al., Science 251: 1360 (1991). Los métodos se basan en la unión de un polinucleótido a un ADN o ARN complementario. Por ejemplo, la parte codificante 5' de un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro como se describe en este documento puede usarse para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción, previniendo de esta manera la transcripción y la producción e VEGI. El oligonucleótido de ARN antisentido hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido VEGI. Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden administrase a células de tal forma que el ARN o ADN antisentido pueda expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido VEGI.

Pueden usarse anticuerpos específicos contra polipéptidos VEGI como antagonistas por unión a VEGI y prevenir su unión a su receptor. Los anticuerpos monoclonales son particularmente eficaces a este respecto. Sin embargo, los anticuerpos específicos para el receptor de VEGI pueden mediar distintas respuestas celulares que tienden a agonizar los efectos de VEGI tras la interacción con su receptor.

Los posibles antagonistas de VEGI también incluyen mutantes de VEGI que se unen al receptor de VEGI y no inducen una respuesta de segundos mensajeros para bloquear eficazmente el receptor de su ligando natural. También se pueden unir oligonucleótidos y moléculas pequeñas diseñados específicamente al receptor de VEGI (por ejemplo, DR3) y bloquear su unión a VEGI. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitación, péptidos pequeños o moléculas de tipo peptídico pequeñas.

Otro posible antagonista de VEGI es una forma soluble del receptor de VEGI que se une a VEGI e impide su interacción con receptores de VEGI unidos a la membrana. De esta manera, los receptores no se estimulan por VEGI.

Otro posible antagonista de VEGI es un construcción antisentido preparada usando la tecnología antisentido. La tecnología antisentido puede usarse para controlar la expresión génica a través de la formación de triples hélices o ADN o ARN antisentido, basándose ambos métodos en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la parte codificante 5' de la secuencia polinucleotídica, que codifica los polipéptidos maduros de la presente invención, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al, Science, 241: 456 (1988); y Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), impidiendo de esta manera la transcripción y la producción de VEGI. El oligonucleótido de ARN antisentido hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido VEGI (Antisense - Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden administrarse a células de tal forma que el ARN o ADN antisentido pueda expresarse in vivo para inhibir la producción de VEGI.

La presente solicitud también se refiere al uso de un polipéptido VEGI como se ha descrito anteriormente en este documento, que es un oligonucleótido antisentido o una ribozima específica para ARN que codifica dicho polipéptido VEGI o un anticuerpo que se une a dicho polipéptido VEGI e inhibe o elimina su actividad, en un diluyente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad farmacéuticamente aceptable para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o mejorar enfermedades que están mediadas por una angiogénesis inhibida.

Se contempla que los antagonistas de VEGI son útiles para tratar la caquexia, que es un defecto de la eliminación de lípidos debido a una deficiencia sistémica de lipoproteína lipasa que se suprime por VEGI. También se contempla que los antagonistas de VEGI son útiles para tratar la malaria cerebral en la que VEGI parece jugar un papel patogénico.

Los antagonistas de VEGI también se consideran útiles para prevenir el rechazo de injertos por medio de la prevención de la estimulación del sistema inmune en presencia de un injerto por VEGI.

Los antagonistas de VEGI también se consideran útiles para tratar la osteoporosis, ya que VEGI puede inducir la resorción ósea.

Los antagonistas de VEGI también se consideran útiles como agentes anti-inflamatorios ya que VEGI media una respuesta inflamatoria aumentada.

Los antagonistas también se consideran útiles para tratar el choque endotóxico, también denominado choque séptico. Esta afección crítica se debe a una respuesta exagerada a bacterias u otros tipos de infección. Esta respuesta conduce a niveles elevados de VEGI que producen choque y lesiones tisulares.

También se describe un ensayo de diagnóstico con fines ilustrativos que es útil para detectar niveles alterados de polipéptido VEGI en diversos tejidos, ya que una sobreexpresión de las proteínas en comparación con muestras normales de tejido de control puede detectar la presencia de una enfermedad o la susceptibilidad a una enfermedad, por ejemplo, la malaria cerebral. Los ensayos usados para detectar niveles de polipéptido VEGI en una muestra derivada de un hospedador son bien conocidos para los especialistas en la técnica e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de Western, ensayos ELISA y ensayo de tipo "sándwich". Un ensayo ELISA (Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), capítulo 6, (1991)) comprende inicialmente preparar un anticuerpo específico para el antígeno VEGI, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además, se prepara un anticuerpo indicador contra el anticuerpo monoclonal. Al anticuerpo indicador se le une un reactivo detectable tal como radiactividad, fluorescencia o, en este ejemplo, una enzima peroxidasa de rábano picante. Se retira una muestra de un hospedador y se incuba en un soporte sólido, por ejemplo, una placa de poliestireno, que se une a las proteínas presentes en la muestra. Después se cubren todos los sitios de unión a proteínas libres presentes en la placa por incubación con una proteína no específica tal como BSA. A continuación, el anticuerpo monoclonal se incuba en la placa y durante este periodo de tiempo los anticuerpos monoclonales se unen a cualquier polipéptido VEGI unido a la placa de poliestireno. Todos los anticuerpos monoclonales no unidos se retiran por lavado con tampón. El anticuerpo indicador unido a peroxidasa de rábano picante se pone posteriormente en la placa dando como resultado la unión del anticuerpo indicador a cualquier anticuerpo monoclonal unido a VEGI. Después se retira por lavado el anticuerpo indicador no unido. A continuación se añaden sustratos de peroxidasa a la placa y se mide la cantidad de color desarrollado en un periodo de tiempo dado como una medición de la cantidad de polipéptido VEGI presente en un volumen dado de muestra del paciente en comparación con una curva patrón.

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Puede emplearse un ensayo competitivo en el que anticuerpos específicos contra polipéptidos VEGI se unen a un soporte sólido y el VEGI marcado y una muestra procedente del hospedador se pasan sobre el soporte sólido y se detecta la cantidad de marcador, por ejemplo, por cromatografía de centelleo de líquidos, pudiendo correlacionarse esta cantidad con la cantidad de VEGI en la muestra.

Un ensayo de tipo "sándwich" es similar a un ensayo ELISA. En un ensayo de tipo "sándwich" se hace pasar VEGI sobre un soporte sólido y se une a anticuerpos unidos al soporte sólido. Después se une un segundo anticuerpo al VEGI. Posteriormente se pasa un tercer anticuerpo que está marcado y es específico para el segundo anticuerpo sobre el soporte sólido y se une al segundo anticuerpo, después de lo cual puede cuantificarse la cantidad.

Las secuencias descritas en este documento también son valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia esta dirigida específicamente y puede hibridar con una localización particular en un cromosoma humano individual. Además, actualmente existe la necesidad de identificar sitios particulares en el cromosoma. Actualmente se dispone de algunos reactivos para marcar cromosomas basados en datos de secuencia real (polimorfismos de repetición) para marcar la localización de los cromosomas. El mapeo de ADN en cromosomas es una primera etapa importante para correlacionar esas secuencias con genes asociados con enfermedades.

En resumen, pueden mapearse secuencias en cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb) a partir del ADNc. El análisis informático de la región no traducida 3' de la secuencia se usa para seleccionar rápidamente cebadores que no incluyan más de un exón del ADN genómico, complicando de esta manera el proceso de amplificación. Estos cebadores después se usan para la exploración por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo los híbridos que contienen el gen humano correspondiente al cebador producirán un fragmento amplificado.

El mapeo por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con algunos cebadores oligonucleotídicos, puede conseguirse una sublocalización con paneles de fragmentos a partir de cromosomas específicos o conjuntos de clones genómicos grandes de una manera análoga. Otras estrategias de mapeo que pueden usarse de manera similar para el mapeo en su cromosoma incluyen hibridación in situ, preexploración con cromosomas sometidos a citometría de flujo marcados y preselección por hibridación con bibliotecas de ADNc específicas de cromosomas de construcción.

La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) de un clon de ADNc en una extensión cromosómica en metafase puede usarse para proporcionar una localización cromosómica precisa en una etapa. Esta técnica puede usarse con un ADNc de únicamente 50 ó 60 bases. Si se desea una revisión de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).

Una vez que se ha mapeado una secuencia en una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con los datos del mapa genético. Estos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en la red por medio de Johns Hopkins University Welch Medical Library). Después se identifica la relación entre genes y enfermedades que se han mapeado en la misma región cromosómica por medio de un análisis de asociación (herencia conjunta de genes físicamente adyacentes).

A continuación, es necesario determinar las diferencias en el ADNc o la secuencia genómica entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no se observa en ningún individuo normal, entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad.

Con la resolución actual del mapeo físico y las técnicas de mapeo genético, un ADNc localizado de forma precisa en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno entre 50 y 500 agentes causantes potenciales. (Esto supone una resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb).

Utilizando las técnicas descritas anteriormente, se determinó que la localización cromosómica de VEGI, con una confianza muy elevada, era 9q32. Ciertos estudios de mapeo cromosómico previos han asociado varios defectos del desarrollo a loci en esta área del cromosoma 9.

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Ejemplos

A continuación se describen ejemplos de la presente invención que se proporcionan sólo con fines ilustrativos y no limitan el alcance de la presente invención. A la luz de la presente descripción, serán evidentes para los especialistas habituales en la técnica numerosas realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones.

La presente invención se describirá adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, debe entenderse que la presente invención no se limita a estos ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique otra cosa, son en peso.

Para facilitar la compresión de los siguientes ejemplos se describirán ciertos métodos y/o términos que aparecen con frecuencia.

Los "plásmidos" se denominan por una p minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida de la presente invención están disponibles en el mercado, están disponibles para el público de manera no restringida o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados, a menos que se indique otra cosa. Además, en la técnica se conocen plásmidos equivalentes a los descritos y serán evidentes para el especialista habitual en la técnica.

"Digestión" de ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa sólo en ciertas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de restricción usadas en esta invención están disponibles en el mercado y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se usaron como conocen los especialistas habituales en la técnica. Con fines analíticos, típicamente se usa 1 \mug de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Para aislar los fragmentos de ADN para la construcción de plásmidos, típicamente se digieren de 5 a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Los tampones apropiados y las cantidades de sustrato para las enzimas de restricción particulares se especifican por el fabricante. Normalmente se usan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión, la reacción se somete a electroforesis directamente en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

La separación por tamaños de los fragmentos escindidos se realiza usando un gel de poliacrilamida al 8 por ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).

"Oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido monocatenario o dos cadenas polidesoxinucleotídicas complementarias que pueden sintetizarse químicamente. Estos oligonucleótidos sintéticos no tienen el grupo 5' fosfato y por lo tanto no se unirán a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se unirá a un fragmento que no se ha desfosforilado.

"Ligamiento" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico bicatenarios (Maniatis,T., et al., Id., p. 146). A menos que se indique otra cosa, el ligamiento puede realizarse usando tampones conocidos y condiciones con 10 unidades de ADN ligasa de T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ligar.

A menos que se indique otra cosa, la transformación se realizó como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1973).

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Ejemplo 1 Expresión Bacteriana y Purificación de Polipéptidos VEGI

Se construyó un vector de expresión que contenía un inserto polinucleotídico que codifica una deleción de 38 aminoácidos desde la secuencia N-terminal del polipéptido VEGI-alfa de longitud completa previsto. La secuencia de ADN que codificaba el polinucleótido VEGI-alfa delecionado en el extremo N-terminal se amplificó usando cebadores oligonucleotídicos de PCR específicos para la secuencia codificante de VEGI-alfa. Se añadieron nucleótidos adicionales que generaban sitios de restricción para facilitar la clonación a las secuencias 5' y 3', respectivamente. Los cebadores oligonucleotídicos 5' tenían la secuencia 5'-GCG CCA TGG CTC TGC ACT GGG AAC AT-3' (SEC ID Nº: 3) que contenía un sitio de restricción Nco I, seguido de 18 nucleótidos de secuencia codificante. El cebador 3' tiene la secuencia 5'-CGC AAG CTT CTA TAG TAA GAA GGC TCC-3' (SEC ID Nº: 4) y contiene un sitio de restricción HindIll seguido de 18 nucleótidos complementarios a los últimos 15 nucleótidos de la secuencia codificante y el codón de terminación. El producto de ADN de VEGI-alfa amplificado se clonó en el vector pQE60 (Qiagen) después de la digestión con las enzimas de restricción apropiadas y el posterior ligamiento. La mezcla de ligamiento se introdujo por transformación en células E. coli competentes (cepa M15/rep4). Los clones que contenían las construcciones deseadas se desarrollaron hasta una densidad óptica a 600 nm comprendida entre 0,4 y 0,6. Después se añadió isopropil-B-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM para inducir la expresión de proteínas. Después de 3 horas, se recogieron las células y se purificaron cuerpos de inclusión a partir de las células rotas, y se solubilizó la proteína a partir de los cuerpos de inclusión en urea 8 M. La proteína solubilizada se pasó sobre una columna PD-10 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 2x, retirando de esta manera la urea, intercambiando el tampón y replegando la proteína. La proteína se purificó por una etapa adicional de cromatografía para retirar la endotoxina. La preparación de polipéptido VEGI-alfa resultante, según se observó por SDS-PAGE, tenía una pureza mayor de 90% y contenía <10 EU de endotoxina/mg.

Además, la secuencia de ADN que codifica la ORF de VEGI-alfa de longitud completa, Nº de Depósito ATCC 75927, se amplificó inicialmente usando cebadores oligonucleotídicos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' de la proteína VEGI-alfa. Se añadieron nucleótidos adicionales correspondientes a VEGI-alfa en las secuencias 5' y 3' respectivamente. El cebador oligonucleótido 5' se muestra como SEC ID Nº: 13 y tiene la secuencia 5'-GCG CGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAG CAA AGT C-3' que contiene un sitio de enzima de restricción Bam HI seguido de los primeros 24 nucleótidos de la secuencia codificante de VEGI-alfa empezando desde el codón de iniciación metionina. La secuencia 3' 5'-CGC GTC TAG ACT ATA GTA AGA AGG CTC CAA AGA AGG-3' (SEC ID Nº:14) contiene secuencias complementarias a un sitio Xba I y 22 nucleótidos de VEGI-alpha. Los sitios de las enzimas de restricción corresponden a los sitios de las enzimas de restricción en el vector de expresión bacteriano pGE-9 (Qiagen). pQE-9 después se digirió con Bam HI y Xba I. Las secuencias amplificadas se unieron a pQE-9 y se insertaron en fase con la secuencia codificante de la señal de histidina y el RBS. La mezcla de ligamiento después se usó para transformar una cepa de E. coli disponible en Qiagen con el nombre comercial M 15/rep 4 por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989). M15/rep4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacI y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Los transformantes se identificaron por su capacidad de crecer en placas LB y se seleccionaron colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aisló el ADN plasmídico y se confirmó por análisis de restricción. Se cultivaron durante una noche clones que contenían las construcciones deseadas (OIN) en cultivo líquido en medio LB suplementado con Amp (100 \mug/ml) y Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usó para inocular un cultivo grande con una relación de 1:100 a 1:250. Las células se cultivaron hasta una densidad óptica a 600 nm (D.O._{600}) comprendida entre 0,4 y 0,6. Después se añadió IPTG ("lsopropil-B-D-tiogalactopiranósido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce por inactivación del represor lacI, eliminando el P/O y conduciendo a un aumento de la expresión génica. Las células se cultivaron durante un periodo adicional de 3 a 4 horas. Después las células se recogieron por centrifugación. El sedimento celular se solubilizó en el agente caotrópico guanidina HCl 6 M (concentraciones de guanidina HCl mayores o iguales a 2,5 M que según se había descubierto empíricamente daban como resultado un mayor nivel de pureza de proteína recombinante recuperada). Después de la clarificación, se purificó el polipéptido VEGI-alfa solubilizado a partir de esta solución por cromatografía en una columna de quelato de níquel en condiciones que permiten una fuerte unión por proteínas que contienen la señal 6-His (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177-184 (1984)). El polipéptido VEGI-alfa se purificó adicionalmente por una segunda vuelta de la columna de quelato de níquel. El polipéptido VEGI-alfa (pureza de 90%) se eluyó de la columna en guanidina HCl 6 M, pH 5,0, y para la renaturalización se dializó en tampón PBS. El producto de expresión se sometió a electroforesis por SDS-PAGE.

Un especialista habitual en la técnica reconocerá que también pueden usarse vectores de expresión bacteriana distintos de pQE-9 para expresar polipéptidos VEGI. Uno de estos vectores de expresión bacteriana preferidos es pHE4-5. pHE4-5 puede obtenerse como ADN plasmídico de pHE4-5/MPIFD23 (esta construcción contiene un inserto no relacionado que codifica una ORF no relacionada). El plásmido pHE4-5/MPIFD23 se depositó en la American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, el 30 de septiembre de 1997 (Nº de Acceso 209311). Usando los sitios de restricción Nde I y Asp 718 que flanquean el inserto ORF de MPIF no relacionado, un especialista habitual en la técnica podría usar fácilmente técnicas de biológica molecular actuales para reemplazar la ORF no relacionada en el plásmido pHE4-S/MPIFD23 por la ORF de VEGI, o variaciones de la misma, de la presente invención.

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Ejemplo 2 Clonación y expresión de polipéptidos VEGI usando el sistema de expresión de baculovirus

La secuencia de ADN que codifica el polipéptido VEGI-alfa de longitud completa, ATCC Nº 75927, se amplificó usando cebadores oligonucleotídicos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen: el cebador 5' tiene la secuencia 5'-GCG CGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAG CAA AGT C-3' (SEC ID Nº:15) y contiene un sitio de enzima de restricción Bam HI (en negrita) seguido de 24 nucleótidos de la secuencia codificante de VEGI-alfa (el codón de iniciación para la traducción "ATG" está subrayado). El cebador 3' tiene la secuencia 5'-CGC GTC TAG ACT ATA GTA AGA AGG CTC CAA AGA AGG-3' (SEC ID Nº:16) y contiene el sitio de escisión para la endonucleasa de restricción Xba I y 22 nucleótidos complementarios a la secuencia 3' no traducida de la secuencia codificante de VEGI-alfa. Las secuencias amplificadas se aislaron a partir de un gel de agarosa al 1% usando un kit disponible en el mercado ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento después se digirió con las endonucleasas Bam HI y Xba I y después se purificó de nuevo en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se denominó F2.

El vector pA2 (modificación del vector pVL941, descrito más adelante) se usó para la expresión del polipéptido VEGI-alfa usando el sistema de expresión de baculovirus (como revisión: véase Summers, M.D. y Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555). Este vector de expresión contiene el promotor fuerte de la polihedrina del virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV) seguido de los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción Bam HI y Xba I. Se usa el sitio de poliadenilación del virus de simio SV40 para una poliadenilación eficaz. Para facilitar la selección de los virus recombinantes, se insertó el gen de la beta-galactosidasa de E. coli en la misma orientación que el promotor de polihedrina seguido de la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. La secuencia de polihedrina estaba flanqueada por ambos lados por secuencias virales para la recombinación homóloga mediada por células del ADN viral de tipo silvestre cotransfectado. En lugar de pA2 podrían haberse usado muchos otros vectores de baculovirus tales como pRG1, pAc373, pVL941 y pAclMI (Luckow, V.A. y Summers, M.D., Virology, 170:31-39).

El plásmido se digirió con la enzimas de restricción Bam HI y Xba I y después se desfosforiló usando fosfatasa intestinal de ternero por procedimientos conocidos en la técnica. El ADN se después se aisló partir de un gel de agarosa al 1% usando el kit disponible en el merado ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Este ADN se denominó V2.

El fragmento F2 y el plásmido V2 desfosforilado se unieron con ADN ligasa de T4. Después se transformaron células E. coli XL1 blue. La secuencia del fragmento clonado se confirmó por secuenciación del ADN.

Se contransfectaron 5 \mug del plásmido pBac VEGI-alfa con 1,0 \mug de un baculovirus linealizado disponible en el mercado ("BaculoGold baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA.) usando el método de lipofección (Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)).

Se mezclaron 1 \mug de ADN de virus BaculoGold y 5 \mug del plásmido pBac VEGI-alfa en un pocillo estéril de una placa de microtitulación que contenía 50 \mul de medio de Grace sin suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Posteriormente, se añadieron 10 \mul de Lipofectin más 90 \mul de medio deGrace, se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadió la mezcla de transfección gota a gota las células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se agitó hacia atrás y hacia delante para mezclar la solución recién añadida. La placa después se incubó durante 5 horas a 27ºC. Después de 5 horas, la solución de transfección se retiró de la placa y se añadió 1 ml de medio de insecto de Grace suplementado con suero bovino fetal al 10%. La placa se puso de nuevo en un incubador y se continuó el cultivo a 27ºC durante cuatro días.

Después de cuatro días, se recogió el sobrenadante y se realizó un ensayo de placas esencialmente como se describe por Summers y Smith (supra). Como modificación, se usó un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) que permite un fácil aislamiento de placas teñidas de azul. (También pueden encontrarse una descripción detallada de un "ensayo de placas" en la guía del usuario para el cultivo de células de insecto y baculovirología distribuido por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).

Cuatro días después de la dilución seriada, el virus se añadió a las células y se picaron placas teñidas de azul con la punta de una pipeta Eppendorf. Después, el agar que contenía los virus recombinantes se resuspendió en un tubo Eppendorf que contenía 200 \mul de medio de Grace. El agar se retiró por una breve centrifugación y se usó el sobrenadante que contenía el baculovirus recombinante para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días después, se recogieron los sobrenadantes de estas placas de cultivo y después se almacenaron a 4ºC.

Se cultivaron células Sf9 en medio de Grace suplementado con FBS inactivada térmicamente al 10%. Las células se infectaron con el baculovirus recombinante V-VEGI-alfa a una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Seis horas después, el medio se retiró y se reemplazo por medio SF900II menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). Cuarenta y dos horas después, se añadieron 5 \muCi de [^{35}S]-metionina y 5 \muCi de [^{35}S]-cisteína (Amersham). Las células se incubaron adicionalmente durante 16 horas de recogerse por centrifugación y las proteínas marcadas se visualizaron por SDS-PAGE y autorradiografía.

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Ejemplo 3 Expresión de VEGI-alfa Recombinante en Células de Mamífero

La línea celular de ovario de hámster chino (CHO) negativa para dihidrofolato reductasa (DHFR-) se adquirió en la American Type Culture Collection. La clonación del ADNc de VEGI-alfa en el vector de expresión de célula de ovario de hámster chino pCl se realizó esencialmente como se indica a continuación. La secuencia de ADNc humana que codificaba el polipéptido VEGI-alfa de longitud completa se amplificó usando cebadores específicos para el extremo 5'- y 3'- de la secuencia codificante de VEGI-alfa (cebador 5': GCG gga tcc GCC ACC ATG AAC TCC TTC TCC ACA AGC GCC TTC GGT CCA GTT GCC TTC TCC CTG GGG CTG CTC CTG GTG TTG CCT GCT GCC TTC CCT GCC CCA GTT GTG AGA C (SEC ID Nº:5), que contiene un sitio de restricción Bam HI seguido de una secuencia "Kozak" (letras minúsculas anteriores) y las primeras 84 bases de la secuencia codificante de IL6 y 13 bases de la secuencia codificante de VEGI-alfa; cebador 3'-: CGC gga tcc GAT ATT TGC TCT CCT CCT CA (SEC ID Nº:6), que contiene un sitio de restricción Bam HI) seguido de 17 nucleótidos del área no traducida y un codón de terminación. El fragmento amplificado se purificó en gel y se digirió con Bam HI. El vector de expresión de células CHO (pCl) se digirió con Bam HI seguido de purificación en gel de agarosa. La secuencia codificante de VEGI-alfa amplificada se unió al vector pCl purificado usando ADN ligasa de T4. Posteriormente se transformaron células HB101. Se identificó un clon positivo (pCl VEGI) por exploración por PCR/digestión enzimática y la secuencia de ADN del inserto se confirmó usando secuenciación de ADN automática. La selección y amplificación de clones de células CHO estables se realizó como se ha descrito previamente por R. Gentz, et al, Eur. LT. Biochemistry 210. 545 (1992). Se mantuvieron transfectantes estables para CHO, CHO-VEGI-alfa y CHO-Vector en medio MEM-a que contenía FCS al 10% (dializado).

La expresión del plásmido VEGI-alfa-HA deriva de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) el origen de replicación de SV40, 2) un gen de resistencia a ampicilina, 3) el origen de replicación de E. coli, 4) el promotor de CMV seguido de una región polienlazadora, un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. En la región polienlazadora del vector se clonó un fragmento de ADN que codificaba el precursor de VEGI-alfa entero y una señal de antígeno de hemaglutinina (HA) fusionada en fase a su extremo 3'. Por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante está bajo la dirección de promotor de CMV. La señal de HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe como se ha descrito previamente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly y R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). La fusión de la señal HA a la proteína diana de la presente invención facilita la detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epítopo de HA.

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La estrategia de construcción del plásmido se describe como se indica a continuación: la secuencia de ADN que codifica VEGI-alfa, ATCC Nº 75927, se construyó por PCR en el EST original clonado usando dos cebadores: el cebador 5' (SEC ID Nº:15) contiene un sitio Bam HI seguido de 24 nucleótidos de la secuencia codificante de VEGI-alfa partiendo desde el codón de iniciación; la secuencia 3' 5'-CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG ATA GTA AGA AGG CTC CAA AG-3' (SEC ID Nº:17) contiene secuencias complementarias al sitio Xba I, un codón de terminación de la traducción, señal HA y los últimos 18 nucleótidos de la secuencia codificante de VEGI-alfa (sin incluir el codón de terminación). Por lo tanto, el producto de PCR contenía un sitio Bam HI, una secuencia codificante de VEGI-alfa seguida de una señal HA fusionada en fase, un codón de terminación de la traducción próximo a la señal HA, y un sitio Xba I. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digirieron con las enzimas de restricción Bam HI y Xba I y se unieron entre sí. La mezcla de ligamiento se utilizó para transformar la cepa de E. coli SURE (disponible en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037). El cultivo transformado se cultivó en placas con medio de ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. Se aisló el ADN plasmídico a partir de los transformantes y se examinó por análisis de restricción con respecto a la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de los polipéptidos VEGI-alfa recombinantes, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el método de DEAE-DEXTRANO. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína VEGI-alfa-HA se detectó por el método de radiomarcaje e inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con [^{35}S]-S-cisteína dos días después de la transfección. Después se recogieron los medios de cultivo y las células se lisaron con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM , NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 0,1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5; Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como el medio de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal con especificidad por HA. Después se analizaron las proteínas precipitadas en geles de SDS-PAGE al 15%.

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Ejemplo 4 Patrón de Expresión de VEGI en una Diversidad de Células y Tipos Celulares

Se realizó análisis de transferencia de ARN para examinar los niveles de expresión de VEGI en tejidos humanos. Se aislaron muestras de ARN celular total con el sistema RNAzol^{TM} B (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033). Se separaron aproximadamente 2 \mug de ARN total aislado a partir de cada tejido humano especificado en gel de agarosa-formaldehído al 1% y se transfirieron sobre un filtro de nylon (Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)). La reacción de marcaje se realizó de acuerdo con el kit Stratagene Prime-It con 50 ng de ADNc de VEGI-alfa para producir ADNc de VEGI-alfa marcado con [^{32}P]. El ADN marcado se purificó con una columna Select-G-50 (cebador 5 - cebador 3, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303). El filtro después se hibridó con una sonda VEGI-alfa de longitud completa con un marcador radioactivo a 1.000.000 cpm/ml en NaPO_{4} 0,5 M, pH 7,4 y SDS al 7% durante una noche a 65ºC. Después de lavarse dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 60ºC con 0,5 x SSC y SDS al 0,1%, la película de rayos X se expuso a la mancha de transferencia a -70ºC durante una noche con una pantalla de intensificación. El ARN mensajero para VEGI-alfa es abundante en riñón.

El VEGI se expresa específicamente en células endoteliales, como se confirma por análisis de transferencia de Northern de preparaciones de ARN total de 22 tipos diferentes de células cultivadas de diversos linajes (Figura IA). Sólo se detectó mensajero de VEGI en cultivos primarios de dos tipos de células endoteliales: células HUVE y células endoteliales venosas humanas de un pase temprano. El ARNm no se detectó en células endoteliales venosas humanas de un pase posterior, ni se observó en células de arteria humana. Por el contrario, los miembros de la familia del TNF se expresan principalmente en células inmunes (B.B. Aggarwal y K. Natarajan, supra). Por ejemplo, el TNF-\alpha se produce por macrófagos, monocitos, neutrófilos y células T, mientras que el TNF-\beta se produce predominantemente por linfocitos T estimulados por mitógeno y leucocitos. De manera similar, los ligandos para Fas, CD27, CD30, CD40, OX40 y 4-1 BB se expresan en tipos celulares del sistema inmune.

Usando múltiples transferencias de Northern tisulares, se expresó el transcrito de VEGI en placenta, pulmón, riñón, músculo esquelético, páncreas, bazo, próstata, intestino delgado y colon. Se detectaron cantidades mínimas de señal de VEGI en corazón, cerebro, hígado, timo, testículo, ovario y linfocitos de sangre periférica (Figura 1B). La expresión de VEGI en la mayoría de los órganos principales sugiere que el producto génico puede jugar un papel en la función del sistema vascular normal.

También se realizaron análisis de transferencia de Northern para determinar el nivel de expresión relativa del ARN de VEGI con respecto al estado de proliferación de cultivos de células HUVEC. En estos experimentos, se separaron electroforéticamente cantidades idénticas de ARN total aislado a partir de células HUVEC (15 \mug) y se sometieron a transferencia como se ha descrito anteriormente. Se aisló el ARN a partir de cultivos 1, 2, 3, 4, 6 y 7 días después de la siembra. Sólo se observo ADN de VEGI a bajos niveles en cultivos recién sembrados (días 1, 2 y 3). Sin embargo, la expresión de ARN de VEGI fue evidente, ya que las células HUVEC en los cultivos empezaron a alcanzar la confluencia (días 4, 6 y 7). Estos experimentos indican que la expresión de VEGI aumenta cuando las células de un cultivo o tejido empiezan a alcanzar el estado quiescente de no proliferación o reducción de la proliferación.

Ejemplo 5 Inhibición Mediada por VEGI de la Proliferación de Células ABAE

Se sembraron células a las densidades apropiadas (células ABAE, 8.000 células/pocillo: MDA-MB-231, 2.000 células/pocillo; MDA-MB-435, 2.000 células/pocillo por triplicado en placas de 24 pocillos. El medio de cultivo contenía IMEM (Gibco) y FCS al 10%. En el medio de cultivo de las células ABAE estaba presente FGF-2 (1 ng/ml). Los cultivos se mantuvieron se mantuvieron a 37ºC, con 5% de CO_{2}, durante 6 días. Las células se tripsinizaron y el número de células se determinó usando un contador Coulter. Se usó un quinto del número total de células ABAE recuperadas para normalizar la composición con las células cancerosas.

Se expresó una versión truncada de VEGI-alfa correspondiente a un supuesto dominio extracelular que consistía en los restos 38-174 en E. coli, como se ha descrito anteriormente, se purificó y se examinó en una diversidad de ensayos celulares. Se descubrió que el polipéptido truncado inhibía específicamente la proliferación de células endoteliales (Figura 2). Se consiguió una inhibición casi completa del crecimiento de células endoteliales aórticas bovinas adultas (ABAE) a 10 mg/ml, con un valor de concentración de inhibición semimáxima (CI 50) de aproximadamente 1 mg/ml (aproximadamente 70 nM). La actividad del polipéptido recombinante es comparable con la de la angiostatina, la endostatina y el factor plaquetario 4. Por el contrario, el polipéptido no inhibía el crecimiento de células cancerosas de mama humana (MDA-MB-231 o MDA-MB-435) en condiciones experimentales similares. También se descubrió que el mutante de deleción de VEGI-alfa tenía poco efecto sobre la proliferación de células de leucemia de células T humanas (jurkat), células de linfoma de Burkitt humano (Raji), células de leucemia monocítica humana (THP-1), o células de leucemia promielocítica humana (HL60). El mutante parece unirse a un receptor distinto, ya que no se detectó interacción con ningún miembro de la superfamilia del receptor de TNF examinada, incluyendo TNFR1, TNFR2, Fas, DR3 y DR4 (G.J. Mazzei et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 7205). Se ha demostrado que varios miembros de la familia del TNF, incluyendo el TNF-\alpha y el ligando de Fas, se activan por metaloproteasas a partir de precursores unidos a la membrana (M. Tanaka et al. (1996) Nat. Med. 2:317; R. A. Black et. al. [1997] Nature 385:729).

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Ejemplo 6 Inhibición Mediada por VEGI de Formación de Tubos de Tipo Capilar

Este ensayo se usó para determinar la capacidad relativa del polipéptido VEGI-alfa truncado de inhibir la formación inducida por FGF-2 de estructuras tubulares de tipo capilar en cultivos de células endoteliales aórticas bovinas adultas (ABAE). Se prepararon placas de gel de colágeno tridimensionales (24 pocillos) por adición de 0,5 ml de solución enfriada de 0,7 mg/ml de colágeno de tipo I de cola de rata (Becton Dickinson Labwares, Bedford, MA) a cada pocillo que contenía DMEM 1x y ajustando hasta un pH neutro con NaHCO_{3}. Después de la formación del gel de colágeno (con un espesor de aproximadamente 1-2 mm), se sembraron células ABAE a 5 x 10^{4} células/pocillo. Los cultivos se mantuvieron en un incubador con 5% de CO_{2} humidificado a 37ºC en DMEM que contenía suero bovino al 10% (HyClone, Logan, UT) suplementado con L-glutamina (2 mM) hasta que los cultivos alcanzaron la confluencia. Después, el medio se reemplazó por medio nuevo que contenía 20 ng/ml de FGF-2. El efecto de VEGl-alfa_{12-147} como inhibidor de FGF-2 indujo la formación de estructuras tubulares de tipo capilar en cultivos ABAE y se analizó suplementando el medio de cultivo con 0,1, 0,3, 1, 3, ó 10 \mug/ml de VEGI-alfa_{12-147}. Todos los cultivos se mantuvieron a 37ºC durante 48 horas más y después se interrumpieron por fijación con metanol frío (-20ºC).

La abundancia de estructuras de tipo capilar formadas por células ABAE se analizó usando un Kotron IBAS Image Analyzer asistido con una videocámara Hamamatsu C2400 y un microscopio Zeiss Axioshop. La abundancia de las estructuras de tipo capilar se midió como porcentajes de las áreas blancas con respecto a las áreas totales medidas. Como control, el valor de CE_{50} para el factor angiogénico FGF-2 para estimular la angiogénesis in vitro fue de
aproximadamente 5 ng/ml. Como control adicional, se observó un efecto estimulador máximo a 10 ng/ml de FGF-2.

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Ejemplo 7 Inhibición Mediada por VEGI del Crecimiento Tumoral

Se realizó un análisis in vivo del efecto potencial de polipéptidos VEGl sobre la angiogénesis usando un modelo de tumor de xenoinjerto. En esta estrategia experimental, se inyectaron un millón de células de carcinoma de mama humano (MDA-MB-231 o MDA-MB-435) en la glándula mamaria de ratones desnudos hembra solas o mezcladas con células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con un vector de expresión de mamífero que expresaba VEGI-alfa o con células CHO transfectadas únicamente con el vector CHO (5 x 10^{6} células por ratón). El polipéptido VEGl expresado en estos experimentos consistía en el polipéptido mostrado como SEC ID Nº:2 excluyendo los 22 aminoácidos N-terminales. Los 22 aminoácidos N-terminales de esta muteína de VEGl se reemplazaron por el péptido señal secretor de la interleuquina-6 humana (Hirano, T., et al., Nature 324:73-76 (1986)).

La actividad anti-angiogénica del polipéptido VEGl observada en este ejemplo indica que los polipéptidos VEGI pueden presentar una inhibición del crecimiento tumoral. La posible actividad anticancerosa de VEGI se examinó usando el modelo de tumor de xenoinjerto descrito anteriormente, usando células de cáncer de mama que son muy tumorigénicas cuando se implantan en las capas grasas mamarias de ratones desnudos atímicos hembra. La transcripción de la construcción en los transfectantes se confirmó por análisis de transferencia de Northern. El medio acondicionado de las células CHO que sobreexpresaban la forma secretada de VEGI-alfa se concentró y se purificó parcialmente, y se descubrió que podía inhibir el crecimiento de células ABAE, mientras que el de las células CHO transfectadas con el vector o las células CHO transfectadas con VEGI de longitud completa no tenía ningún efecto (datos no mostrados). La posible actividad anticancerosa de VEGI-alfa se examinó en un modelo se xenoinjerto de cáncer de mama humano. Las células CHO transfectadas con VEGI-alfa soluble y las células de cáncer de mama humano (MDA-MB-231 o MDA-MB-435) se co-inyectaron en las capas grasas mamarias y se controló el crecimiento de tumores de xenoinjertos después de la inyección.

Las células CHO que sobreexpresaban la muteína de VEGI-alfa soluble ejercieron un notable efecto inhibidor sobre el crecimiento de tumores de xenoinjerto de cáncer de mama humano formados por células MDA-MB-231 (Figura 4A), mientras que las células CHO transfectadas con el vector no mostraron ningún efecto sobre el crecimiento tumoral. De forma similar, se observó una supresión significativa del crecimiento tumoral MDA-MB-435 en ratones desnudos (Figura 4B). En cualquier caso, las células CHO que sobreexpresaban VEGI-alfa de longitud completa no tenían ningún efecto sobre el crecimiento de los tumores de xenoinjerto en condiciones experimentales similares. El efecto antitumoral del VEGI soluble observado en el modelo de xenoinjerto puede atribuirse a un efecto anti-angiogénico en las células endoteliales de la vasculatura tumoral.

Los ratones en los que se co-inyectaron células de carcinoma de mama humano y células CHO que expresaban VEGI-alfa o células CHO transfectadas con vector después se aleatorizaron y los tumores se midieron dos veces por semana. El tamaño del tumor se evaluó midiendo diámetros perpendiculares con un calibre y se calculó multiplicando las mediciones de los diámetros en dos dimensiones. Los tumores se midieron empezando el día cero y aproximadamente a intervalos de cinco días a lo largo de aproximadamente los veintiocho días. En cualquier caso, los tumores que se obtuvieron a partir de las células de carcinoma de mama co-inyectadas con células CHO que expresaban VEGI-alfa permanecieron con un tamaño significativamente más pequeño que los que se obtuvieron a partir de células de carcinoma de mama co-inyectadas con células CHO sólo con vector.

Basándose en estos descubrimientos, los presentes inventores sugieren que VEGI es un regulador negativo de la angiogénesis específico para las células endoteliales que puede funcionar en el mantenimiento de la vasculatura madura o la terminación de un proceso de angiogénesis. El endotelio en condiciones fisiológicas es un tejido quiescente, experimentando aproximadamente 1% de las células endoteliales proliferación (J. Denekamp [1990] Cancer Metas. Rev. 9:287). El mecanismo subyacente al mantenimiento de la quiescencia del endotelio aún no está claro. Es concebible que exista un mecanismo de auto-restricción en el que las células endoteliales producen un inhibidor del crecimiento que actúa sobre las propias células endoteliales a través de un ruta autocrina. VEGI puede jugar un papel en este mecanismo importante.

Ejemplo 8 Capacidad de VEGI-alfa Recombinante para Inhibir el Crecimiento de Células WEH1164, ABAE y L929 e Inducir la Adhesión Celular en Células HL-60

Las células diana adherentes se prepararon a partir de cultivos confluentes por tripsinización en PBS, y se recogieron las células diana no adherentes a partir de cultivos estacionarios y se lavaron una vez con medio. Las células diana se suspendieron a 3 x 10^{5} células/ml en medio que contenía FCS al 10%. Se distribuyeron alícuotas de 0,1 ml en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos que contenían 0,1 ml de muestras de ensayo diluidas en serie de células (WEHI 164 y L929). La incubación se continúo durante 70 horas. Se añadieron TNF-\alpha, TNF-\beta y VEGI-alfa producido por bacterias a una concentración de 0,5 \mug/ml. La citotoxicidad y la actividad de proliferación se cuantificaron usando un ensayo MTS realizado por la adición de 20 \mul de MTS y solución de fenazina metosulfato (PMS) a cada pocillo. Después de una incubación de 3 horas, se midió la DO a 492 nm por un lector de placas ELISA. La DO_{492} es proporcional al número de células viables en los pocillos. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como se indica a continuación: % de citotoxicidad = (100 - DO_{experimental}/DO_{control}) X 100. VEGI-alfa indujo un cambio de morfología que aparecía como células redondas oscuras (que indicaba células muertas).

También se usó una forma truncada del polipéptido VEGI-alfa consistente en los aminoácidos 12-147 de la secuencia de aminoácidos de VEGI-alfa completa mostrada como SEC ID Nº:2 (que se denomina VEGI-alfa_{12-147}) para examinar el efecto de VEGI-alfa sobre el crecimiento de células endoteliales. El tratamiento de células endoteliales aórticas bovinas adultas (ABAE) con VEGI-alfa_{12-147} produjo una inhibición casi completa del crecimiento de las células en el cultivo de ABAE, pero no de células en las líneas de células de cáncer de mama MDA-MB-435 o MDA-MB-231. Se consiguió una inhibición casi completa del crecimiento de las células endoteliales a 10 \mug/ml de VEGI-alfa_{39-174}, con un valor de concentración inhibidora semimáxima (CI_{50}) de aproximadamente 1 \mug/ml (aproximadamente 70 nM).

Para ensayar la capacidad de adhesión de VEGI-alfa, se usaron células HL-60 y se midieron la adhesión celular y el contacto célula-célula por observación bajo el microscopio y se puntuaron subjetivamente por dos investigadores independientes. En estos experimentos, VEGI-alfa parecía inducir la adhesión celular. Los cultivos que no se trataron con VEGI-alfa contenían células que se habían extendido a lo largo de toda la placa de cultivo. Sin embargo, los cultivos que se trataron con VEGI-alfa, contenían células que se agregaban claramente entre sí.

Ejemplo 9 Expresión a través de Terapia Génica

Se obtienen fibroblastos a partir de un sujeto por biopsia de piel. El tejido resultante se pone en medio de cultivo de tejidos y se separa en pequeñas piezas. Se ponen pequeños trozos del tejido en una superficie húmeda de un matraz de cultivo de tejidos, y se ponen aproximadamente 10 piezas en cada matraz. El matraz se gira y se pone con el lado superior abajo, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante una noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz se invierte y los trozos de tejido permanecen fijados al fondo del matraz. En este momento se añade medio nuevo (por ejemplo, medio F12 de Ham, suplementado con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina). El cultivo después se incuba a 37ºC durante aproximadamente una semana. En este momento, se añade medio nuevo y posteriormente se cambia cada 2-3 días. Después de dos semanas más en cultivo, se habrá producido una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsiniza y se aumenta a escala en matraces de mayor tamaño.

pMV-7 (Kirschmeier, PX et al, DNA, 7:219-25 (1988)), que está flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma murino de Moloney, se digiere con Eco Rl y Hind III y posteriormente se trata con fosfatasa intestinal de ternero. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica usando perlas de vidrio.

El ADNc que codifica un polipéptido de la presente invención se amplifica usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias terminales 5' y 3' respectivamente. El cebador 5' contiene un sitio Eco Rl y el cebador 3' incluye un sitio HindIII. Se añaden conjuntamente cantidades iguales del esqueleto lineal del virus del sarcoma murino de Moloney y el fragmento Eco Rl e Hind III amplificado, en presencia de ADN ligasa de T4. La mezcla resultante se mantiene en condiciones apropiadas para el ligamiento de los fragmentos. La mezcla de unión se usa para transformar bacterias HB101, que después se cultivan en agar que contiene kanamicina para confirmar que el vector tenía el gen de interés insertado de manera apropiada.

Las células de empaquetamiento anfotrópicas pA317 o GP+am 12 se cultivan en cultivo tisular hasta una densidad confluente en medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino al 10% (CS), penicilina y estreptomicina. Después se añade el vector MSV que contienen el gen al medio y las células de empaquetamiento se transducen con el vector. Las células de empaquetamiento ahora producen partículas virales infecciosas que contienen el gen (las células de empaquetamiento ahora se denominan células productoras).

Se añade medio nuevo a las células productoras transducidas y, posteriormente, el medio se recoge a partir de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio gastado, que contiene las partículas virales infecciosas, se filtra a través de un filtro Millipore para retirar las células productoras separadas. Este medio después se usa para infectar fibroblastos. El medio se retira de la placa de fibroblastos subconfluente y se reemplaza rápidamente por el medio de las células productoras. Este medio se retira y se reemplaza por medio nuevo. Si el título del virus es elevado, entonces prácticamente todos los fibroblastos se infectaran y no se requerirá selección. Si el título es muy bajo, entonces puede ser necesario usar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his.

Los fibroblastos modificados por ingeniería genética después se inyectan en el hospedador, solos o después de haberse cultivado hasta la confluencia en perlas de microsoporte cytodex 3. Los fibroblastos ahora producen el producto proteico.

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Ejemplo 10 Ensayo de Angiogénesis en Membrana Corioalantoica (CAM) de Embrión de Pollo

El ensayo CAM se realizó esencialmente como se describe por Nguyen y colaboradores (Microvasc. Res. 47:31 -40 (1994)) e Iruela-Arispe y Dvorak (Thromb. Haemost. 78:672-677 (1997)). El método se basa en el crecimiento de nuevos vasos capilares en un granulado de gel de colágeno colocado directamente sobre la membrana corioalantoica (CAM). Los factores angiogénicos FGF-2 (100 ng) o VEGF (250 ng) se incluyeron en granulados de gel de colágeno y se pusieron en contacto con la CAM. La cuantificación de la angiogénesis en los geles se realizó 24 horas después de la colocación de los granulados de gel usando un microscopio de fluorescencia Nikon. Las imágenes se transfirieron a un Power PC 100 AV, usando una cámara CCD Sony. La intensidad de la fluorescencia se evaluó con un software NH Image 1.61. La intensidad de fluorescencia para los controles positivos (que contenían el factor angiogénico solo) se consideró la respuesta angiogénica máxima y se estableció arbitrariamente a 100. Debido a la variabilidad del ensayo, se considero significativa una inhibición mayor de 20%.

Como determinación experimental del efecto de VEGI-alfa sobre la angiogénesis inducida por FGF-2 o VEGF, se mezcló VEGI-alfa (250 ng) producido a partir de bacterias con FGF-2 (100 ng) o VEGF (250 ng) y se incluyó en granulados del gel de colágeno. Los granulados después se pusieron en contacto con la CAM como se ha descrito anteriormente. VEGI-alfa inhibía notablemente el crecimiento de nuevos capilares en los geles de colágeno.

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<110> Human Genome Sciences. Inc.

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<120> VEGI, Un Inhibidor de Angiogénesis y Crecimiento Tumoral

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> PF141PCT2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> No asignado

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1998-11-02

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 08/963,272

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1997-11-03

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2683

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia codificante

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1022)..(1543)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1022)..(1096)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1097)..(1543)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgccatggc tctgcactgg gaacat

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcaagcttc tatagtaaga aggctcc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatccg atatttgctc tcctcctca

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2442

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia codificante

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (783)..(1304)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (783).. (863)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (864)..(1304)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2265)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2273)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2307)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2336)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2341)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2379),

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

9

10

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

12

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

17

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 434

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t. g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (133)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (388)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (424)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 493

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (288)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (296)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (309)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (314)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (340)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (343)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (348)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (369)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (385)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (410)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (417)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (423)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (431)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (434)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (437)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (444)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (459)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (486)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (53)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (258)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (316)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (346)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (367)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (378)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 458

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (119)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (303)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (311)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (387)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (409)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (425)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (427)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (453)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 388

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (46)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (50)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (81)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (138)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (155)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (182)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a. t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (188)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (269)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (317)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (358)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a. t. g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (363)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (375)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, c, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcggatcc accatgagac gctttttaag caaagtc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgtctaga ctatagtaag aaggctccaa agaagg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcggatcc accatgagac gctttttaag caaagtc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgtctaga ctatagtaag aaggctccaa agaagg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgctctagat caagcgtagt ctgggacgtc gtatggatag taagaaggct ccaaag

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 733

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia codificante

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(756)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 434

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a. t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (133)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (388)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (424)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (41)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (43)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (46)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (50)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (53)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (55)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (61)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (63)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (66)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (202)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Diferencia variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (209)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (282)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (306)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (321)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (344)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (346)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (380)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (395)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (405)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 388

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (46)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (50)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (81)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (138)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (155)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (182)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (188)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (269)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (317)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t. g o c

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (322)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (358)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (363)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (375)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 458

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (119)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (303)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (311)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (387)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (409)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (425)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (427)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica variada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (453)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n equivale a, t, g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

32

Claims (7)

1. Un método in vitro para ensayar posibles agentes o fármacos con respecto a la actividad inhibidora de la angiogénesis, comprendiendo dicho método medir la capacidad de dicho agente o fármaco para aumentar la actividad anti-angiogénica de un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo consistente en:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 23 a 174 de la SEC ID NO: 2;

(c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 39 a 174 de la SEC ID Nº: 2;

(d) un polinucleótido que codifica un fragmento del polipéptido de uno cualquiera de (a) a (c) que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis;

(e) un polinucleótido que hibrida con el complemento de la SEC ID Nº: 1 donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis;

(f) un polinucleótido que codifica una variante alélica del polinucleótido de una cualquiera de (a) a (e);

(g) un polinucleótido de una cualquiera (a) a (f) que codifica un polipéptido que comprende una señal de secreción; y

(h) la cadena complementaria de uno cualquiera (a) a (g) anteriores;

en un ensayo in vitro.

2. Un método in vitro para ensayar la capacidad de un fármaco o agente para promover la angiogénesis, comprendiendo dicho método medir la capacidad de dicho fármaco o agente para reducir o eliminar la función de un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (h) de la reivindicación 1 en un ensayo in vitro.

3. Uso de una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (h) de la reivindicación 1, un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (h) de la reivindicación 1 o un vector recombinante que comprende un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (h) de la reivindicación 1, para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis.

4. El uso de reivindicación 3, donde la inhibición de la angiogénesis comprende la inhibición de la angiogénesis en enfermedades distintas de cánceres o tumores.

5. Uso de un antagonista de un polipéptido VEGI codificado por un polinucleótido como se define en la reivindicación 1, que es un oligonucleótido antisentido o una ribozima específica para ARN que codifica dicho polipéptido VEGI o un anticuerpo que se une a dicho polipéptido VEGI e inhibe o elimina su actividad, en un diluyente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad farmacéuticamente aceptable para la preparación de una composición farmacéutica para promover la angiogénesis.

6. Uso de una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (h) de la reivindicación 1, un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido como se define en una cualquiera de (a) a (h) de la reivindicación 1 o un vector de recombinante que comprende un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (h) de la reivindicación 1, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o mejorar una enfermedad que está mediada por una angiogénesis incontrolada, donde dicha enfermedad es un miembro del grupo consistente en:

(a) telangiectasia;

(b) psoriasis;

(c) esclerodermia;

(d) angiogénesis miocárdica;

(e) neovascularización de placas;

(f) angiogénesis de miembros isquémicos;

(g) rubeosis;

(h) glaucoma neovascular;

(i) retinopatía diabética;

(j) fibroplasia retrolental;

(k) neovascularización diabética;

(l) uveítis;

(m) retinopatía del prematuro;

(n) degeneración macular;

(o) neovascularización de injerto de córnea;

(p) enfermedad de injerto contra hospedador;

(q) enfermedad inflamatoria del intestino; y

(r) mielosupresión.

7. Uso de un antagonista de un polipéptido VEGI codificado por un polinucleótido como se define en la reivindicación 1, que es un oligonucleótido antisentido o una ribozima específica para ARN que codifica que dicho polipéptido VEGI o un anticuerpo que se une a dicho polipéptido VEGI e inhibe o elimina su actividad, en un diluyente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad farmacéuticamente aceptable para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o mejorar enfermedades que están mediadas por una angiogénesis inhibida.