ES2303395A1 - Sondas y metodos para la deteccion e identificacion simultanea de multiples virus causantes de infecciones respiratorias en humanos. - Google Patents
Sondas y metodos para la deteccion e identificacion simultanea de multiples virus causantes de infecciones respiratorias en humanos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2303395A1 ES2303395A1 ES200403083A ES200403083A ES2303395A1 ES 2303395 A1 ES2303395 A1 ES 2303395A1 ES 200403083 A ES200403083 A ES 200403083A ES 200403083 A ES200403083 A ES 200403083A ES 2303395 A1 ES2303395 A1 ES 2303395A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- human
- type
- virus type
- hybridization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 379
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 189
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 100
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 140
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 86
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 claims abstract description 50
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 claims abstract description 47
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims abstract description 47
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims abstract description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 38
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 31
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims abstract description 30
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims abstract description 29
- 241000712003 Human respirovirus 3 Species 0.000 claims abstract description 28
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 claims abstract description 24
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 claims abstract description 23
- 241000726041 Human respirovirus 1 Species 0.000 claims abstract description 23
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 claims abstract description 22
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 claims abstract description 21
- 241001559187 Human rubulavirus 2 Species 0.000 claims abstract description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 183
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 95
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 71
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 71
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 61
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 50
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 49
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 43
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 42
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 25
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 18
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 18
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 18
- 241001514767 Respiratory syncytial virus type A Species 0.000 claims description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 12
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000712041 Human parainfluenza virus 4a Species 0.000 claims description 7
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 5
- 241000712036 Human parainfluenza virus 4b Species 0.000 claims description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 4
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 241000165108 Respiratory syncytial virus type B Species 0.000 claims 5
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims 1
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 48
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 38
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 38
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 38
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 36
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 23
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 20
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 19
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 16
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 11
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 10
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 9
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 7
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 7
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 7
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 7
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 7
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 6
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 5
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 4
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 4
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 4
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 4
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 125000001245 hexylamino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 3
- 101710094396 Hexon protein Proteins 0.000 description 3
- 241000351643 Metapneumovirus Species 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 2
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- -1 sheets Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000789014 Hexaplex Species 0.000 description 1
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 1
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 206010034839 Pharyngitis streptococcal Diseases 0.000 description 1
- 206010062106 Respiratory tract infection viral Diseases 0.000 description 1
- 101150084279 TM gene Proteins 0.000 description 1
- 208000028857 Tropical infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047473 Viral pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000003500 gene array Methods 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000037799 influenza C Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Sondas y métodos para la detección e
identificación simultánea de múltiples virus causantes de
infecciones respiratorias en humanos.
Se describen sondas y ensayos útiles para
detectar simultáneamente, en una única muestra de ensayo, una
pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos de virus causantes de
infecciones respiratorias en humanos seleccionados entre virus
influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C,
virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio
sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza
humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus
parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y
4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E,
coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome
respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y
combinaciones de los mismos.
Description
Sondas y métodos para la detección e
identificación simultánea de múltiples virus causantes de
infecciones respiratorias en humanos.
La invención se relaciona, en general, con la
detección de secuencias de ácidos nucleicos, y, en particular, con
sondas y ensayos útiles para detectar simultáneamente una
pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos en una única muestra de
ensayo. Más específicamente, la invención se relaciona con sondas y
métodos para la detección, mediante hibridación, de una pluralidad
de secuencias de ácidos nucleicos de virus causantes de infecciones
respiratorias en humanos, eventualmente presentes en una única
muestra de ensayo, seleccionados entre virus influenza tipo A, virus
influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio
sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo
B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1, virus
parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3,
virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus,
rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo
OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo
(SARS), metapneumovirus humano y combinaciones de los mismos.
Los signos y síntomas que causa la infección del
tracto respiratorio por diferentes virus e incluso algunas
bacterias, son generalmente indistinguibles desde un punto de vista
clínico. Por ello, es preciso disponer de una herramienta
diagnóstica que permita no sólo identificar al agente causante de
la infección, sino que esta identificación se realice en un corto
periodo de tiempo para que el resultado obtenido contribuya a
instaurar rápidamente las medidas curativas o paliativas adecuadas
y, en el caso de que esté producida por un virus, se evite la
innecesaria administración de antibióticos, con la posible aparición
de resistencias bacterianas. Además, el hecho de disponer de un
método diagnóstico rápido y fiable de la infección viral es de
importancia vital para aquellas enfermedades virales que pueden ser
tratadas mediante la administración de fármacos antivirales, como es
el caso de los virus de la gripe. Ello contribuiría
significativamente a disminuir la morbi-mortalidad
causada por estos virus en colectivos de riesgo, tales como
ancianos, lactantes y pacientes inmunodeprimidos. Considerando que
en un futuro próximo se podrá disponer de nuevos fármacos
antivirales, habrá también una creciente demanda de métodos
diagnósticos sensibles que se incluyan de forma rutinaria en los
laboratorios de microbiología que permitan identificar rápidamente
los diferentes virus causantes de las infecciones
respiratorias.
El diagnóstico de laboratorio es, por tanto,
imprescindible para la detección e identificación de los virus
causantes de infecciones del tracto respiratorio que causan
enfermedades con signos y síntomas clínicamente indistinguibles.
Erróneamente, se cree, por ejemplo, que una faringitis
estreptocócica puede ser diferenciada de manera fiable de una
faringitis vírica en un paciente individual. Se puede incluso
realizar una estimación probabilística de ello (por ejemplo, los
síntomas de un resfriado común tienen un 80% de valor predictivo
negativo para el diagnóstico de una faringitis bacteriana), pero la
confirmación debe realizarse mediante un análisis de
laboratorio.
En general, el diagnóstico etiológico de las
infecciones respiratorias víricas en humanos ha sido realizado,
hasta el momento, utilizando métodos tradicionales, tales como el
aislamiento en cultivos celulares o la técnica de
inmunofluorescencia (IF) indirecta, que, aunque presentan una
elevada sensibilidad, no permiten más que, salvo contadas ocasiones,
distinguir la presencia de más de un virus coinfectando la muestra,
lo que puede ser debido a varios factores, por ejemplo: (i) la
destrucción de la monocapa de células por el virus que presente una
mayor actividad citopática, lo que enmascararia el crecimiento de
otros virus eventualmente presentes en la muestra a ensayar que
crecieran más lentamente o que produjeran un efecto citopático
menos evidente, y (ii) la no disponibilidad de anticuerpos
monoclonales específicos que permitieran la identificación de los
virus que están coinfectando la muestra. Por ello, el diagnóstico
de las coinfecciones está infravalorado, debido a la ausencia de
técnicas lo suficientemente sensibles y específicas como para
detectarlas.
Actualmente se están introduciendo cada vez más
en el diagnóstico clínico rutinario ensayos basados en la detección
del genoma viral en una muestra clínica o en un cultivo celular de
la misma. Los tipos de ensayos que permiten detectar genomas virales
se basan, en general, en métodos de hibridación o en métodos de
amplificación.
En el primer caso (métodos de hibridación), los
genomas virales pueden ser detectados mediante el uso de sondas u
oligonucleótidos con una secuencia homóloga a la del virus
eventualmente presente en la muestra a analizar. Estas técnicas
suelen ser sencillas y de revelado no radiactivo, por ejemplo,
mediante fluorescencia o quimioluminiscencia. Los métodos basados en
técnicas de hibridación presentan, además de las ventajas de
especificidad y sensibilidad, la posibilidad de poder cuantificar la
cantidad de ácidos nucleicos virales presentes en la muestra (carga
viral), lo que puede emplearse para monitorizar la respuesta del
paciente frente a la terapia antiviral.
Los métodos de amplificación genómica permiten
amplificar varios millones de veces determinadas secuencias de
genomas virales, de modo que puedan ser detectadas fácilmente. La
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tanto en formato simple
como múltiple, ha demostrado ser un método de amplificación
genómica extremadamente sensible y específico en el diagnóstico de
las infecciones respiratorias causadas por virus. La amplificación
genómica es relativamente habitual en ensayos para el diagnóstico de
infecciones respiratorias en humanos debido a que, en general, la
cantidad de virus presente en una muestra respiratoria convencional
(lavado o aspirado nasofaringeo, frotis faringeo, gargarismo, etc.)
suele ser escasa. Por ello, para obtener el máximo de sensibilidad
suele ser necesario realizar, a continuación de la primera reacción
de amplificación, una segunda amplificación sobre el fragmento
obtenido mediante, por ejemplo, una PCR anidada
(nested-PCR). Generalmente, la primera reacción de
amplificación es una RT-PCR (RT: retrotranscripción
o transcripción reversa) puesto que la mayoría de los virus
causantes de infecciones respiratorias en humanos poseen un genoma
constituido por RNA. Aunque la realización de una PCR anidada es
sencilla y fácil de introducir en la rutina de un laboratorio de
diagnóstico, también supone una posible fuente de falsos positivos
debido a que la enorme amplificación del fragmento génico viral
puede dar lugar a contaminaciones por productos de amplificación de
muestras adyacentes. Por ello, para llevar a cabo de manera
rutinaria técnicas de PCR anidada es necesario tomar precauciones
especiales, entre las que se encuentran, por ejemplo, el hecho de
que los pasos necesarios para la realización del proceso de
amplificación deben realizarse en laboratorios físicamente
separados, en cabinas de flujo laminar distintas, cada una de ellas
dotada de reactivos, juegos de micropipetas, tubos estériles y
puntas con filtro estériles, todo ello completamente independiente.
En el caso de laboratorios pequeños o dotados de escaso material y/o
equipos de laboratorio, esto suele ser poco factible.
Por otra parte, los métodos basados en
reacciones de amplificación permiten la detección de uno o varios
agentes virales simultáneamente, pero no de todos los posibles
virus causantes de infecciones respiratorias, ya que, como es bien
conocido, existen dificultades técnicas para realizar PCRs
múltiples que permitan la detección simultánea de varios virus,
tales como la pérdida de sensibilidad al aumentar el número de
iniciadores en la mezcla de la reacción o la necesidad de ajustar
la situación de los iniciadores en el gen a amplificar con objeto
de obtener fragmentos fácilmente diferenciables por su tamaño al
analizarlos mediante electroforesis en gel de agarosa.
A pesar de todo, se ha descrito una
RT-PCR múltiple para la detección y tipado
simultáneo de algunos virus causantes de infecciones respiratorias
en humanos, concretamente, de virus influenza A, B y C, virus
respiratorio sincitial A y B y adenovirus (Coiras et al.,
2003, J Med Virol 69:132-144).
Una aproximación alternativa interesante al
diagnóstico de infecciones respiratorias de origen viral se basa en
la aplicación combinada de técnicas de amplificación genómica e
hibridación con sondas específicas. Esta aproximación es la seguida
en el ensayo "Hexaplex", el cual se basa en una amplificación
mediante RT-PCR múltiple en un sistema de
hibridación con sondas y detección enzimática. Mediante esta técnica
es posible detectar los siguientes virus: virus respiratorio
sincitial tipos A y B, virus influenza tipos A y B y virus
parainfluenza tipos 1, 2 y 3. No obstante, ese método no permite
detectar otros virus causantes de infecciones respiratorias en
humanos importantes tales como: adenovirus, un grupo importante de
patógenos del tracto respiratorio; el virus parainfluenza tipo 4,
causante de infecciones generalmente en niños menores de 2 años no
tan leves como se había descrito anteriormente; enterovirus,
rhinovirus, ni coronavirus, siendo estos dos últimos grupos los
patógenos del tracto respiratorio superior más comunes y posibles
causantes de serias complicaciones en el paciente. Además, esos
tres últimos grupos de virus se encuentran repetidamente en
muestras clínicas de pacientes con infección respiratoria, pero su
papel como agentes causantes de infecciones respiratorias está poco
definido, así como su epidemiología, debido a la dificultad de su
detección mediante los métodos habituales.
Por tanto, los métodos actuales utilizados en el
diagnóstico rutinario de laboratorio de los virus causantes de
infección respiratoria en humanos presentan varias desventajas:
- -
- escasa sensibilidad y/o especificidad;
- -
- aparición de falsos negativos cuando se utilizan técnicas basadas en IF;
- -
- aparición de falsos positivos cuando se utilizan técnicas basadas en la PCR anidada;
- -
- pueden pasar días o incluso semanas antes de la obtención de resultados, sobre todo en el caso del aislamiento viral en cultivos celulares;
- -
- dependencia de algunas técnicas del estado de la muestra clínica, resultado del proceso de toma, conservación y transporte de la misma. Esto es especialmente importante en el caso del aislamiento viral en cultivos celulares y de las técnicas de inmunofluorescencia, donde puede dar lugar a falsos negativos;
- -
- la contaminación de la muestra con bacterias procedentes de la flora normal de la región donde se ha realizado la toma de la misma, puede dificultar su análisis mediante métodos como el aislamiento viral en cultivos celulares, lo que puede originar falsos negativos; y.
- -
- la necesidad, en algunos casos, de personal cualificado o experimentado en la técnica en cuestión.
Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar
métodos efectivos que permitan detectar e identificar
simultáneamente los principales agentes virales causantes de
infecciones respiratorias en humanos, que subsanen la totalidad o
parte de los problemas existentes con los métodos actualmente
utilizados en el diagnóstico rutinario de laboratorio de los virus
causantes de infección respiratoria en humanos. Dichos métodos
deberían proporcionar, de forma rápida, específica y sensible,
resultados que pudieran ser utilizados por el clínico en la toma de
decisiones terapéuticas, profilácticas o paliativas. A modo
ilustrativo, un método diagnóstico adecuado seria aquel que
permitiera diferenciar virus causantes de infecciones respiratorias
que requirieran la inmediata hospitalización o aislamiento del
paciente, de otras causas más leves de infección del tracto
respiratorio. Ventajosamente, dichos métodos deberían poder ser
realizados en laboratorios cercanos a donde se encuentre el
paciente, con instalaciones y equipos económicos, y, sin que fuera
necesaria la participación de personal altamente cualificado.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención proporciona una solución a la
necesidad existente consistente en unas sondas y métodos que
permiten detectar e identificar simultáneamente, de forma rápida,
específica y sensible, los principales virus causantes de
infecciones respiratorias humanas eventualmente presentes en una
única muestra de ensayo. Para ello, la invención se basa en el
desarrollo de un sistema de hibridación en el que se inmovilizan
sobre un soporte sólido diferentes oligonucleótidos con secuencias
específicas (sondas). Estas sondas han sido diseñadas para hibridar
específicamente con secuencias diana presentes en el genoma de
dichos virus, lo que permite no solo la detección e identificación
del virus causante de la enfermedad respiratoria sino que, además,
posibilita su tipado simultáneamente. Este sistema puede ser
adaptado al desarrollo de kits de fácil manejo destinados a
laboratorios de microbiología que requieran establecer un
diagnóstico etiólogico de enfermedades infecciosas respiratorias
humanas.
Los virus causantes de infecciones respiratorias
en humanos que pueden ser identificados mediante el método
proporcionado por esta invención incluyen virus influenza tipo A,
virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio
sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo
B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1, virus
parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3,
virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus,
rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo
OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo
(SARS), metapneumovirus humano, y combinaciones de los mismos.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con una sonda útil para identificar virus causantes de
infecciones respiratorias en humanos seleccionados entre virus
influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C,
virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio
sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza
humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus
parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y
4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E,
coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome
respiratorio agudo severo (SARS) y metapneumovirus humano.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una plataforma de hibridación que comprende un soporte sólido y, al
menos, una de dichas sondas inmovilizada sobre dicho soporte
sólido.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para identificar virus causantes de infecciones
respiratorias en humanos seleccionados entre virus influenza tipo
A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus
respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial
humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo
1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano
tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus,
rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo
OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo
(SARS), metapneumovirus humano y combinaciones de los mismos,
eventualmente presentes en una única muestra de ensayo, basado en la
hibridación de secuencias diana presentes en el genoma de dichos
virus, opcionalmente amplificadas mediante una reacción de
amplificación, con dichas sondas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit para identificar virus causantes de infecciones
respiratorias en humanos seleccionados entre virus influenza tipo A,
virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio
sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo
B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1, virus
parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3,
virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus,
rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo
OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo
(SARS), metapneumovirus humano y combinaciones de los mismos,
mediante dicho método que comprende, al menos, una de dichas
sondas, o, al menos, una de dichas plataformas de hibridación.
La Figura 1 muestra la detección de cepas de
referencia de virus causantes de infecciones respiratorias en
humanos crecidas en cultivos celulares mediante hibridación en
membrana de nylon y visualización mediante quimioluminiscencia. Los
virus ensayados fueron virus influenza tipo A (VIA), virus
influenza tipo B (VIB), virus respiratorio sincitial humano tipo A
(RSVA), virus respiratorio sincitial humano tipo B (RSVB),
adenovirus humano (ADV1), coronavirus humano tipo 229E (HCV229E),
virus parainfluenza humano tipo 1 (PIV1), virus parainfluenza
humano tipo 2 (PIV2), virus parainfluenza humano tipo 3 (PIV3),
virus parainfluenza humano tipo 4 A (PIV4A), coronavirus humano tipo
OC43 (HCVOC43), echovirus (Echo30), rhinovirus (Rhino14),
metapneumovirus humano (metapneumovirus) y virus influenza tipo C
(VIC). Para más información véase el Ejemplo 1.
La Figura 2 muestra la detección mediante
hibridación en membrana de nylon y visualización mediante
quimioluminiscencia de virus causantes de infecciones respiratorias
en humanos, aislados de muestras clínicas del tracto respiratorio
inoculadas en cultivos celulares. Los virus detectados fueron virus
influenza tipo A (Influenza A), virus influenza tipo B (Influenza
B), virus respiratorio sincitial tipo A (RSVA), virus respiratorio
sincitial tipo B (RSVB), adenovirus humano (ADV1) y virus
parainfluenza humano tipo 3 (Parainfluenza tipo 3). Se utilizaron
sondas con diferentes concentraciones con el fin de observar la
sensibilidad en función de la concentración de las sondas. Para más
información véase el Ejemplo 2.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La Figura 3 muestra la detección de virus
influenza tipo A presente en muestras clínicas mediante hibridación
en membrana de nylon (Figura 3A) y mediante PCR anidada (Figura
3B). Para una descripción del ensayo véase el Ejemplo 3. La Figura
3A muestra los resultados de la hibridación de ácidos nucleicos
procedentes de las muestras clínicas ensayadas para detectar virus
influenza tipo A con las sondas (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2)
inmovilizadas en la membrana (Carriles 1-12). No se
detectó virus influenza A en las muestras 2, 7 y 8. En la Figura 3B
se muestran los resultados de una PCR anidada llevada a cabo para
comprobar la sensibilidad y especificidad de la técnica anterior
(hibridación). Los carriles 1-12 corresponden a los
carriles 1-12 observados en la Figura 3A. El carril
M corresponde al marcador XIV de pesos moleculares, suministrado por
Roche Diagnostics (marcador de 100 pb). En todos los carriles
(excepto 2, 7 y 8) se observa una banda de 721 pares de bases (pb),
correspondiente al fragmento amplificado del gen de la
nucleoproteína del virus influenza humano de tipo A y una banda de
837 pb correspondiente al control interno utilizado como control
del proceso de extracción del material genético a partir de la
muestra, así como de la reacción de PCR (véase el Ejemplo 3). Se
observa que los resultados obtenidos con ambas técnicas son
concordantes.
La Figura 4 muestra la detección de coronavirus
causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) presente en
muestras clínicas mediante hibridación en membrana de nylon y
visualización por quimioluminiscencia. Se ensayaron diversas
concentraciones de la sonda utilizada (SEQ ID NO: 18). Para una
descripción del ensayo véase el Ejemplo 4.
La Figura 5 muestra la detección de adenovirus
humano en muestras clínicas (secreciones respiratorias) procedentes
de pacientes con cuadros respiratorios mediante hibridación en
soporte de cristal (portaobjetos) y visualización por fluorescencia.
Se observa la fluorescencia emitida por las moléculas de Cy3
presentes en el producto de amplificación obtenido mediante
oligonucleótidos iniciadores específicos para adenovirus humanos. Se
han utilizado para la amplificación y el marcaje mediante PCR,
diluciones de adenovirus causantes de infección respiratoria en
humanos pertenecientes a los serotipos 1 (imagen 1), 2 (imagen 2),
4 (imagen 3), 5 (imagen 4) y 7 (imagen 5), equivalentes estas
diluciones a 10^{3} copias de un plásmido que contiene el
fragmento del gen de la proteína del hexón de adenovirus humano
amplificado en las condiciones descritas en el Ejemplo 5. Se incluye
un control negativo.
La invención proporciona sondas y métodos para
identificar simultáneamente una pluralidad de secuencias de ácidos
nucleicos de los principales virus causantes de infecciones
respiratorias en humanos eventualmente presentes en una única
muestra de ensayo.
En un aspecto, la invención se relaciona con
unas sondas, en adelante sondas de la invención, que permiten la
identificación, mediante hibridación específica, de los principales
virus causantes de infecciones respiratorias en humanos, entre los
que se encuentran virus influenza tipo A, virus influenza tipo B,
virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A,
virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano,
virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo
2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano
tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo
229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del
síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y metapneumovirus
humano.
El término "sonda", tal como aquí se
utiliza, se refiere a un oligonucleótido de secuencia definida
capaz de hibridar con una secuencia complementaria de un ácido
nucleico, por lo que puede utilizarse para detectar e identificar
secuencias complementarias, o sustancialmente complementarias, en
ácidos nucleicos mediante hibridación específica. Asimismo, el
término "hibridación", tal como aquí se utiliza, se refiere a
la formación de una estructura de tipo dúplex por dos ácidos
nucleicos debido al apareamiento de bases complementarias. La
hibridación puede ocurrir entre cadenas de ácidos nucleicos
totalmente complementarias o entre cadenas de ácidos nucleicos
"sustancialmente complementarias" que contienen pequeñas
regiones desapareadas. Las condiciones en las que hibridan cadenas
de ácidos nucleicos totalmente complementarias se denominan
"condiciones estrictas de hibridación" o "condiciones de
hibridación específicas de secuencia". No obstante, se pueden
obtener cadenas dobles estables de ácidos nucleicos sustancialmente
complementarias bajo condiciones de hibridación menos estrictas, en
cuyo caso, el grado de desapareamiento tolerado puede ajustarse
mediante ajuste apropiado de las condiciones de hibridación. El
experto en la materia puede determinar empíricamente la estabilidad
de un dúplex teniendo en cuenta diversas variables, tales como, la
longitud y concentración de pares de bases de las sondas, la fuerza
fónica y la incidencia de los pares de bases desapareados,
siguiendo las directrices del estado de la técnica (véase, por
ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.
(1989); y Wetmur, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Biol. 26
(3/4):227-259 (1991)).
Las sondas de la invención son complementarias o
sustancialmente complementarias a secuencias diana específicas
contenidas en los genomas de dichos virus causantes de infecciones
respiratorias en humanos (virus influenza tipo A, virus influenza
tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano
tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus
humano, virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza
humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus
parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus,
coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43,
coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y
metapneumovirus humano) de manera que permitan la detección
genérica de los mismos.
La longitud de las sondas de la invención puede
variar dentro de un amplio intervalo aunque, por razones prácticas,
se prefieren sondas de longitud pequeña, típicamente comprendida
entre 15 bases y 30 bases, preferentemente, entre 19 bases y 23
bases. El empleo de sondas de mayor o menor longitud no afectaría a
la sensibilidad o especificidad de la técnica, pero podría precisar
de la realización de una serie de modificaciones sobre las
condiciones en las que se realiza la misma al variar la temperatura
de fusión de las mismas y su contenido en GC, lo cual afectaría a
la temperatura y tiempo de hibridación, fundamentalmente.
En una realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de virus
influenza tipo A mediante hibridación específica que incluyen
polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo
condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico localizada en el gen de la nucleoproteína o su cadena
complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen los
polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
Dichas sondas se pueden emplear por separado o juntas para aumentar
la sensibilidad de la detección.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de virus
influenza tipo B mediante hibridación específica que incluyen
polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo
condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico localizada en el gen de la nucleoproteína o su cadena
complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen los
polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
Dichas sondas se pueden emplear por separado o juntas para aumentar
la sensibilidad de la detección.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de virus
influenza tipo C mediante hibridación específica que incluyen
polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo
condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico localizada en el gen de la nucleoproteína o su cadena
complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluye el
polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 5.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de virus
respiratorio sincitial humano tipo A mediante hibridación específica
que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar
bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de
ácido nucleico localizada en el gen de la proteína de fusión
(proteína F) o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de
dichas sondas incluyen los polinucleótidos identificados como SEQ
ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7. Dichas sondas se pueden emplear por
separado o juntas para aumentar la sensibilidad de la
detección.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de virus
respiratorio sincitial humano tipo B mediante hibridación específica
que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar
bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de
ácido nucleico localizada en el gen de la proteína de fusión
(proteína F) o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de
dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID
NO: 8.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de adenovirus
humano mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos
de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de
hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen
de la proteína hexón o su cadena complementaria. Ejemplos
ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido
identificado como SEQ ID NO: 9.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de virus
parainfluenza humano tipo 1 mediante hibridación específica que
incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo
condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico localizada en el gen de la proteína hemaglutinina o su
cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas
incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 10.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de virus
parainfluenza humano tipo 2 mediante hibridación específica que
incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo
condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico localizada en el gen de la proteína hemaglutinina o su
cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas
incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 11.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de virus
parainfluenza humano tipo 3 mediante hibridación específica que
incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo
condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico localizada en el gen de la proteína hemaglutinina o su
cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas
incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 12.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de virus
parainfluenza humano tipos 4A y 4B mediante hibridación específica
que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar
bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de
ácido nucleico localizada en el gen de la proteína hemaglutinina o
su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas
incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 13 que
permite detectar la presencia de los virus parainfluenza humanos
tipos 4A ó 4B pero no permite su distinción.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de
enterovirus mediante hibridación específica que incluyen
polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo
condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico localizada en la región 5' no codificante o su cadena
complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el
polinucleótido identificado como SEQ ID
NO: 14.
NO: 14.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de rhinovirus
mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15
a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de
hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en la
región 5' no codificante o su cadena complementaria. Ejemplos
ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido
identificado como SEQ ID
NO: 15.
NO: 15.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de
coronavirus humano tipo 229E mediante hibridación específica que
incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo
condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico localizada en el gen de la proteína espicular o su cadena
complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el
polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 16.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de
coronavirus humano tipo OC43 mediante hibridación específica que
incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo
condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico localizada en el gen de la proteína espicular o su cadena
complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el
polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 17.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de
coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS)
mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a
30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de
hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el
gen de la proteína espicular o su cadena complementaria. Ejemplos
ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido
identificado como SEQ ID NO: 18.
En otra realización particular, la invención
proporciona sondas para la detección e identificación de
metapneumovirus humano mediante hibridación específica que incluyen
polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo
condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico localizada en el gen de la proteína polimerasa o su cadena
complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el
polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 19.
Las sondas proporcionadas por esta invención
permiten llevar a cabo la detección e identificación simultánea de
los principales virus causantes de infección respiratoria en
humanos e incluso su tipado y/o subtipado simultáneo.
Las sondas de la invención, en particular, las
sondas cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en las SEQ ID
NO: 1-SEQ ID NO: 19, presentan varias ventajas ya
que su corta longitud (23 bases como máximo) hace que su síntesis
sea muy económica y, además, permiten la detección genérica de los
principales virus causantes de infecciones respiratorias en
humanos, incluyendo serotipos de los mismos, tales como virus
influenza de todos los subtipos del tipo A, todas las variantes de
virus influenza tipo B, virus variantes de influenza tipo C, virus
respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial
humano tipo B, todos los tipos de adenovirus humano, virus
parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2,
virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos
4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, variantes del coronavirus humano
tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del
síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y cepas variantes del
metapneumovirus humano. De este modo, el empleo de dichas sondas
permite detectar e identificar cientos de virus causantes de
infección respiratoria con un bajo coste, por lo que constituyen un
paso importante para producir una herramienta diagnóstica que reúna
todas las ventajas de las técnicas de hibridación para la detección
e identificación simultánea de los principales virus causantes de
infección en el tracto respiratorio humano.
Otras ventajas asociadas con el empleo de sondas
oligonucleotídicas para la detección e identificación de virus
causantes de infecciones respiratorias en humanos, tales como las
sondas de la invención, incluyen:
- -
- la posibilidad no sólo de identificar y caracterizar los virus causantes de las infecciones respiratorias sino, además, de conocer si son sensibles o resistentes a los antivirales disponibles;
- -
- los ensayos de hibridación mediante sondas oligonucleotídicas permiten, también, cuantificar la carga viral en la muestra a analizar con el fin de monitorizar en tiempo real la eficacia de la terapia antiviral en el paciente; y
- -
- se pueden emplear para estudios epidemiológicos en tiempo real por su rapidez en detección y tipado simultáneo de múltiples virus al mismo tiempo.
Para llevar a cabo la detección e identificación
simultánea de los principales virus causantes de infección
respiratoria en humanos e incluso su tipado y/o subtipado
simultáneo, las sondas de la invención, ventajosamente, están
inmovilizadas en un soporte sólido, tal como se describirá más
adelante. Dichos soportes sólidos en los que se han inmovilizado
las sondas de la invención, que constituyen unas plataformas de
hibridación, representan un aspecto adicional de esta
invención.
Con el fin de facilitar la inmovilización de las
sondas al soporte sólido, las sondas pueden incorporar
características adicionales que permitan la inmovilización al
soporte pero que no alteren su característica principal (hibridar
con secuencias complementarias de ácido nucleico). A modo
ilustrativo, dichas sondas pueden contener un grupo amino en el
extremo 5' para facilitar la inmovilización de la sonda y orientar
espacialmente la sonda sobre la membrana o en caso de soporte de
cristal, el tratamiento de la superficie con
poli-L-lisina permite la
inmovilización de las sondas sin orientación espacial.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una plataforma de hibridación que comprende un soporte sólido y, al
menos, una sonda de la invención inmovilizada sobre dicho soporte
sólido.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "soporte sólido" se refiere a un material insoluble, o
que puede convertirse en insoluble mediante una reacción posterior.
Dicho soporte sólido puede elegirse en función de su capacidad
intrínseca para inmovilizar una sonda oligonucleotídica, o bien
puede incorporar un receptor adicional con capacidad para
inmovilizar la sonda oligonucleotídica de modo que permita una unión
indirecta de la sonda al soporte sólido a través de dicho receptor.
Dicho receptor adicional puede ser una sustancia cargada con una
carga opuesta a la de la sonda o bien puede ser un miembro de unión
específica inmovilizado sobre (o unido a) el soporte sólido con
capacidad para inmovilizar la sonda a través de una reacción de
unión específica, por ejemplo, avidina o estreptavidina que permite
la inmovilización de sondas de oligonucleótidos biotinilados. El
soporte sólido puede estar constituido por cualquier material
apropiado que permita la inmovilización, directa o indirecta, de la
sonda a dicho soporte sólido, por ejemplo, plásticos, plásticos
derivatizados, polímeros, látex, fibra óptica, superficies de vidrio
o silicio, superficies cerámicas, superficies metálicas, etc.
Dichos materiales pueden utilizarse en cualquier configuración
apropiada conocida por los expertos en la materia, por ejemplo, en
forma de membranas, láminas, films, placas, chips, etc., o bien
pueden estar recubriendo, total o parcialmente, o unidos a,
portadores inertes tales como papel, nylon, vidrio, films
plásticos, tejidos, etc. Adicionalmente, si se desea, el soporte
sólido puede estar recubierto para facilitar la inmovilización de
las sondas a su superficie. En una realización particular, dicho
soporte sólido es una membrana de nylon o una superficie de vidrio o
cristal, por ejemplo, un portaobjetos, opcionalmente recubiertos,
por ejemplo, con membranas, soportes de silicona, soportes
poliméricos, etc.
En una realización particular, la sonda de la
invención inmovilizada sobre dicho soporte sólido se selecciona del
grupo formado por los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID
NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ
ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:
15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y
sus mezclas. Aunque la plataforma de hibridación puede contener un
número variable de sondas de la invención inmovilizadas sobre el
soporte sólido, en una realización particular, la plataforma de
hibridación de la invención comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19 de dichas sondas (SEQ ID
NO: 1 - SEQ ID NO: 19). Ventajosamente, la plataforma de hibridación
de la invención comprende dichas 19 sondas de la invención (SEQ ID
NO: 1 - SEQ ID NO: 19).
Las sondas de la invención pueden estar
dispuestas sobre el soporte sólido en una disposición orientada
(conocida) o no orientada. Tal como aquí se utiliza, el término
"disposición orientada" significa que la sonda está
inmovilizada sobre el soporte en una localización definida
(posición conocida). Por tanto, en una realización particular, la
plataforma de hibridación de la invención comprende dos o más sondas
de la invención inmovilizadas sobre dicho soporte sólido en una
disposición no orientada. Alternativamente, en otra realización
particular, la plataforma de hibridación de la invención comprende
dos o más sondas de la invención inmovilizadas sobre dicho soporte
sólido en una disposición orientada. Ventajosamente, las sondas de
la invención están inmovilizadas sobre el soporte sólido en una
disposición orientada, constituyendo una matriz o chip.
Los biochips o arrays de DNA implican la
disposición en zonas puntuales de un soporte de un conjunto de
sondas específicas. Puesto que la deposición de las sondas se
realiza en puntos microscópicos, se puede aplicar en un solo biochip
una cantidad muy elevada de sondas distintas, del orden de
10.000-500.000 sondas distintas por biochip, lo que
permite detectar simultáneamente diversos patógenos virales
causantes de infecciones respiratorias en humanos eventualmente
presentes en una única muestra clínica. Además de detectar e
identificar el virus causante de la infección, el biochip también
permitiría cuantificar la carga viral e incluso identificar el
fármaco antiviral frente al cual es sensible o resistente, con
objeto de facilitar el tratamiento del paciente.
Prácticamente cualquier método conocido por los
técnicos en la materia puede ser utilizado para inmovilizar las
sondas de la invención al soporte sólido. Un método habitualmente
utilizado consiste en el recubrimiento no covalente del soporte
sólido con un miembro de un par de unión específica, por ejemplo,
estreptavidina, y la inmovilización de sondas de oligonucleótidos
biotiniladas. Alternativamente, las sondas oligonucleotídicas se
pueden unir directamente al soporte sólido mediante reacciones de
acoplamiento de tipo epóxido/amina.
En una realización particular, el soporte sólido
es una membrana que posee una superficie de carga negativa, tal
como una membrana de nylon. En este caso, antes de la unión de las
sondas, la membrana se trata con
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDAC) para activar los grupos carboxilo presentes en la superficie
de la membrana. Las sondas, en este caso, están diseñadas para
contener un grupo amino en el extremo 5' con el fin de orientar
espacialmente la sonda sobre la membrana.
En otra realización particular, el soporte
sólido es un portaobjetos de cristal (vidrio), tal como un
portaobjetos, opcionalmente sometido a un tratamiento con
poli-L-lisina con el fin de
disponer sobre la superficie de cristal grupos amino que se van a
unir por interacciones electroestáticas a los grupos fosfato de las
sondas, que no quedan orientadas espacialmente sobre la
superficie.
La concentración de las sondas en el soporte
sólido puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de
numerosos factores, entre los que se encuentran la naturaleza y
tipo de soporte sólido, la naturaleza de la sonda, etc.; no
obstante, en una realización particular, cuando el soporte sólido
es una membrana de nylon, las sondas se pueden utilizar a una
concentración comprendida entre aproximadamente 60 y aproximadamente
400 pmoles por carril, preferentemente, entre 0,8 y 1
pmoles/\mul. Alternativamente, cuando el soporte sólido es un
portaobjetos de cristal, la concentración de las sondas puede estar
comprendida entre aproximadamente 1 y aproximadamente 40
pmol/\mul, preferentemente, 20 pmol/\mul aproximadamente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para identificar virus causantes de infecciones
respiratorias en humanos, en adelante método de la invención,
seleccionados entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B,
virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A,
virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano,
virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo
2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano
tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo
229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del
síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y
combinaciones de los mismos, eventualmente presentes en una muestra
de ensayo, que comprende:
- a)
- poner en contacto ácidos nucleicos procedentes de dicha muestra de ensayo con una plataforma de hibridación de la invención que comprende un soporte sólido y, al menos, una sonda de la invención inmovilizada sobre dicho soporte sólido, en donde cada una de dichas sondas es sustancialmente complementaria a una secuencia diana específica de cada uno de dichos virus causantes de infección respiratoria; y
- b)
- detectar la posible hibridación de dichas secuencias diana con dichas sondas.
Tal como aquí se utiliza, el término "muestra
de ensayo" se refiere a cualquier muestra biológica sospechosa
de contener uno o más virus causantes de infección respiratoria en
humanos, tales como virus influenza tipo A, virus influenza tipo B,
virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A,
virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano,
virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo
2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano
tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo
229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del
síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y metapneumovirus humano.
El genoma de dichos virus contiene secuencias diana que permiten su
detección e identificación mediante hibridación de dichas
secuencias diana con las sondas apropiadas, posibilitando además,
en ocasiones, su tipado simultáneo. La muestra de ensayo puede
proceder de cualquier fuente biológica, por ejemplo, muestras de
origen humano de fluidos o tejidos biológicos, tales como sangre,
esputo, gargarismo, frotis (faríngeo o nasofaringeo), aspirados
(nasofaringeo, bronquial, traqueal o pleural), etc., así como de
productos de la sangre (plasma, suero, leucocitos). Asimismo, la
muestra de ensayo puede proceder de cultivos celulares de virus. La
muestra de ensayo puede ser utilizada bien directamente, tal como
se obtiene de la fuente, o bien después de ser sometida a un
tratamiento previo a su uso con el fin de modificar sus
características, por ejemplo, diluyendo fluidos viscosos,
inactivando agentes interferentes, convirtiendo ácidos nucleicos de
cadena doble en ácidos nucleicos monocatenarios, acumulando,
purificando o amplificando secuencias diana, etc.
Aunque la plataforma de hibridación puede
contener una única sonda de la invención, en la práctica se
prefiere que dicha plataforma de hibridación contenga dos o más
sondas de la invención, preferentemente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19 de las sondas de la invención
cuyas secuencias de nucleótidos se seleccionan entre las secuencias
identificadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ
ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:
13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ
ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. Ventajosamente, la plataforma de
hibridación de la invención comprende dichas 19 sondas de la
invención (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 19).
Prácticamente cualquier sonda de la invención,
cuya secuencia de nucleótidos sea complementaria o sustancialmente
complementaria a una secuencia diana específica de cada uno de
dichos virus causantes de infección respiratoria puede ser utilizada
en la puesta en práctica del método de la invención ya que la
hibridación de las sondas con las secuencias diana es indicativa de
la presencia del virus correspondiente en la muestra analizada. No
obstante, en una realización particular del método de la invención,
las sondas de la invención inmovilizadas sobre dicho soporte sólido
se seleccionan del grupo formado por los polinucleótidos
identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ
ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:
13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ
ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. En este caso:
- la hibridación de una secuencia diana con una sonda seleccionada entre los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o sus mezclas es indicativa de la presencia de virus influenza tipo A en la muestra;
- la hibridación de una secuencia diana con una sonda seleccionada entre los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y/o sus mezclas es indicativa de la presencia de virus influenza tipo B en la muestra;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 5 es indicativa de la presencia de virus influenza tipo C en la muestra;
- la hibridación de una secuencia diana con una sonda seleccionada entre los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y/o sus mezclas es indicativa de la presencia de virus respiratorio sincitial humano tipo A;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 8 es indicativa de la presencia de virus respiratorio sincitial humano tipo B;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 9 es indicativa de la presencia de adenovirus humano;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 10 es indicativa de la presencia de virus parainfluenza humano tipo 1;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 11 es indicativa de la presencia de virus parainfluenza humano tipo 2;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 12 es indicativa de la presencia de virus parainfluenza humano tipo 3;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 13 es indicativa de la presencia de virus parainfluenza humano tipo 4A y 4B;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 14 es indicativa de la presencia de enterovirus;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 15 es indicativa de la presencia de rhinovirus;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 16 es indicativa de la presencia de coronavirus humano tipo 229E;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 17 es indicativa de la presencia de coronavirus humano tipo OC43;
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 18 es indicativa de la presencia de coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS); y
- la hibridación de una secuencia diana con la sonda identificada como SEQ ID NO: 19 es indicativa de la presencia de metapneumovirus humano.
La detección de la hibridación de las secuencias
diana con las sondas de la invención puede llevarse a cabo mediante
cualquier método apropiado conocido por los expertos en la materia.
El marcaje del material genético (ácidos nucleicos) a hibridar será
diferente en función del método de detección seleccionado. El
marcador puede estar incorporado bien en la secuencia diana a
hibridar con la sonda o bien en la propia sonda. En una realización
particular, la detección de la hibridación [etapa b)] se realiza
mediante un método radiactivo, mientras que, en otra realización
particular, la detección de la hibridación [etapa b)] se realiza
mediante un método no radiactivo, por ejemplo, mediante un método
fluorescente, colorimétrico o luminiscente (bioluminiscente o
quimioluminiscente). A modo ilustrativo, puede efectuarse un
marcaje con fluoresceína o biotina para detección
quimioluminiscente, o bien un marcaje con digoxigenina para
detección quimioluminiscente o quimiofluorescente, etc.
Para la puesta en práctica del método de la
invención, los ácidos nucleicos virales pueden ser detectados e
identificados sin necesidad de aislar las partículas virales.
En una realización particular, el método de la
invención comprende la realización de una reacción de amplificación
de ácidos nucleicos virales antes de efectuar la etapa de
hibridación [etapa a)]. Esta alternativa resulta particularmente
interesante cuando la concentración de los virus causantes de
infecciones respiratorias humanas a detectar presente en las
secreciones respiratorias es baja (lo que sucede habitualmente) ya
que entonces la cantidad de material genético (ácido nucleico) de
virus que contiene la secuencia diana para la hibridación con la
sonda de la invención es también baja. Para aumentar su
concentración, se puede llevar a cabo una reacción de amplificación
de ácidos nucleicos antes de efectuar la etapa de hibridación
[etapa a)].
Por tanto, en una realización particular, la
invención proporciona un método para identificar virus causantes de
infecciones respiratorias en humanos, en donde dichos virus se
seleccionan entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B,
virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A,
virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano,
virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo
2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano
tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo
229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del
síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y
combinaciones de los mismos, eventualmente presentes en una muestra
de ensayo, que comprende:
- (i)
- poner en contacto ácido nucleico procedente de dicha muestra de ensayo con iniciadores que flanquean secuencias diana específicas de dichos virus causantes de infección respiratoria;
- (ii)
- someter la mezcla resultante de la etapa (i) a una reacción de amplificación enzimática para amplificar secuencias diana de dichos virus causantes de infección respiratoria eventualmente presentes en dicha muestra de ensayo;
- (iii)
- poner en contacto los productos de amplificación resultantes de la etapa (ii) con una plataforma de hibridación de la invención que comprende un soporte sólido y, al menos, una sonda de la invención, orientada o no, inmovilizada sobre dicho soporte sólido, en donde cada una de dichas sondas es sustancialmente complementaria a una secuencia diana específica de cada uno de dichos virus causantes de infección respiratoria eventualmente presente en la muestra de ensayo; y
- (iv)
- detectar la posible hibridación de dichas secuencias diana con dichas sondas.
La amplificación de una región de ácido nucleico
que contiene la secuencia diana puede llevarse a cabo mediante
prácticamente cualquier método de amplificación de secuencias
diana, tal como, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación
por desplazamiento de banda [véase, en general, G. Walker et
al., (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:392-396; G. Walker et al., (1992).
Nucleic Acid Res. 20:1691-1696], la amplificación
basada en la transcripción [D. Kwoh et al., (1989). Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177], la replicación
de secuencia auto-sostenida (3SR) [J. Guatelli et
al., (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:1874-1878], el sistema de la replicasa QB [P.
Lizardi et al., (1988). BioTechnology
6:1197-1202], la amplificación basada en la
secuencia de ácido nucleico (NASBA) [R. Lewis, (1992). Genetic
Engineering News 12(9):1], la reacción de reparación en
cadena (RCR) [R. Lewis, (1992). Genetic Engineering News
12(9):1] y la amplificación por la polimerasa del fago phi29
[L. Blanco et al., (1989) J Biol Chem.
264:8935-8940]. Con carácter previo a la
amplificación puede ser necesario llevar a cabo una reacción de
transcripción reversa o retrotranscripción (RT) para obtener el
cDNA, ya que la mayoría de los virus causantes de infección
respiratoria en humanos poseen un genoma constituido por RNA.
Aunque la reacción de amplificación puede
llevarse a cabo sin extraer los ácidos nucleicos contenidos en la
muestra de ensayo, ventajosamente, se extraen dichos ácidos
nucleicos presentes en la muestra antes de llevar a cabo la reacción
de amplificación. Prácticamente cualquier método apropiado para
extraer ácidos nucleicos puede ser utilizado; no obstante, en una
realización preferida los ácidos nucleicos contenidos en la muestra
de ensayo se extraen mediante el empleo de un protocolo de
extracción de ácidos nucleicos en un solo paso. A partir de
cualquiera de ellos se realiza una extracción del material genético
de la muestra, tanto RNA como DNA, puesto que aunque prácticamente
todos los virus respiratorios presentan un genoma de RNA, los
adenovirus poseen un genoma de DNA. Se pueden emplear métodos
comerciales como RNeasy (Qiagen) aunque también pueden utilizarse
otros métodos, por ejemplo, métodos basados en la extracción con un
tampón de lisis con base de tiocianato de guanidinio [Casas et
al., 1995, J Virol Methods 53:25-36].
En una realización particular, la amplificación
de las regiones de los ácidos nucleicos virales que contienen las
secuencias dianas (regiones destinadas a ser amplificadas,
detectadas o analizadas), se lleva a cabo mediante
RT-PCR múltiple. Para ello, se utilizarán los
iniciadores apropiados que flanqueen la secuencia diana a
amplificar.
Ejemplos ilustrativos de iniciadores útiles en
la reacción de RT y en la PCR múltiple para amplificar la secuencia
diana del genoma de virus influenza tipos A, B y C, virus
respiratorio sincitial humano tipos A y B y adenovirus respiratorios
se mencionan en Coiras y cols., 2003, Journal of Medical Virology
69:132-144.
Ejemplos ilustrativos de iniciadores útiles en
la reacción de RT y en la PCR múltiple para amplificar la secuencia
diana del genoma de virus parainfluenza humano tipos 1, 2, 3, 4A y
4B, coronavirus humanos tipos 229E y OC43, rhinovirus y enterovirus
se mencionan en Coiras y cols., 2004, Journal of Medical Virology
72(3):484-495.
Ejemplos ilustrativos de iniciadores útiles para
amplificar la secuencia diana del genoma del coronavirus causante
del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) se mencionan en
Drosten y cols., 2003, N Engl Med
348(20):1967-1976.
Ejemplos ilustrativos de iniciadores útiles para
amplificar la secuencia diana del genoma de metapneumovirus humanos
se mencionan en Van Den Hoogen y cols., J Infect Dis. 2003 Nov 15;
188(10):1571-7.
Una RT-PCR múltiple para la
detección y tipado simultáneo de los virus influenza tipos A, B y
C, los virus respiratorio sincitial humano tipos A y B y una
detección genérica de adenovirus humanos se describe en Coiras
et al., 2003, J Med Virol 69:132-144.
Las características de la muestra de ensayo y de
la plataforma de hibridación de la invención ya han sido
mencionadas previamente en relación con el método de la invención
(general). Prácticamente cualquier sonda de la invención, cuya
secuencia de nucleótidos sea complementaria o sustancialmente
complementaria a una secuencia diana específica de cada uno de
dichos virus causantes de infección respiratoria puede ser utilizada
en la puesta en práctica del método de la invención ya que la
hibridación de las sondas con las secuencias diana es indicativa de
la presencia del virus correspondiente en la muestra analizada.
Aunque la plataforma de hibridación puede contener una única sonda
de la invención, en la práctica se prefiere que dicha plataforma de
hibridación contenga dos o más sondas de la invención,
preferentemente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18 ó 19 de las sondas de la invención cuyas secuencias de
nucleótidos se seleccionan entre las secuencias identificadas como
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:
5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID
NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID
NO: 19. Ventajosamente, la plataforma de hibridación de la
invención comprende dichas 19 sondas de la invención (SEQ ID NO: 1
- SEQ ID NO: 19). Dichas sondas permiten la identificación de los
virus causantes de infecciones respiratorias en humanos previamente
mencionados.
La detección de la hibridación entre las
secuencias diana del genoma viral presente en los productos
resultantes de la reacción de amplificación (amplicones) con las
sondas de la invención puede llevarse a cabo mediante cualquiera de
los métodos previamente mencionados en relación con la detección de
la hibridación entre las secuencias diana del genoma viral (sin
amplificar) con las sondas de la invención. En una realización
particular, la detección de la hibridación se realiza mediante un
método radiactivo, mientras que, en otra realización particular, se
realiza mediante un método no radiactivo, por ejemplo, mediante un
método fluorescente, colorimétrico o luminiscente (bioluminiscente o
quimioluminiscente). A modo ilustrativo, puede efectuarse un
marcaje con fluoresceína o biotina para detección
quimioluminiscente, o bien un marcaje con digoxigenina para
detección quimioluminiscente o quimiofluorescente, etc. En este
caso, el marcaje se puede realizar durante el proceso de
amplificación o de manera posterior, por ejemplo mediante el uso de
la polimerasa Klenow en presencia de aminoalil-dUTP
(Wang et al., 2002, Proc Natl Acad Sci U S A.
99(24):15687-15692) o bien utilizando kits
comerciales de marcaje como los kits CyScribe de Amersham Life
Sciences.
En una realización particular, cuando el soporte
sólido sobre el que se inmovilizan las sondas de la invención es
una membrana de nylon, es conveniente marcar el material genético
de la muestra durante el proceso de amplificación con biotina unida
a un dNTP (ya sea dATP, dUTP, dCGP o dCTP), posterior tratamiento
con estreptavidina-peroxidasa y revelado
quimioluminiscente con luminol. En otra realización particular,
cuando el soporte sólido al que están unidas las sondas es una
superficie de cristal, se recomienda emplear un marcador
fluorescente, tal como Cy3 o Cy5 (Amersham Life Sciences) unido a un
dNTP (ya sea dATP, dUTP, dCGP o dCTP), lo que posibilita su
posterior detección con un scanner.
Aunque los sistemas de detección pueden ser
variados (métodos radiactivos o no radiactivos) se prefiere
efectuar una detección quimioluminiscente cuando el soporte sea una
membrana de nylon o un portaobjetos con una membrana adherida a su
superficie (por ejemplo, Vivid^{TM} Gene Array Slides, Pall Life
Sciences). Para ello, como ya se ha comentado anteriormente, se
añade a la reacción de PCR empleada para amplificar el material
genético viral de partida uno de los nucleótidos marcado con
biotina, por ejemplo dCTP (Perkin Elmer Life Sciences) o dUTP
(Roche Diagnostics) para obtener productos de PCR marcados con
biotina. Tras la reacción de hibridación entre las sondas fijadas al
soporte y las cadenas desnaturalizadas del producto de PCR se añade
estreptavidina-peroxidasa en una concentración
recomendada de 1:4000, que permitirá el revelado quimioluminiscente
mediante el empleo de luminol en presencia de agua oxigenada (por
ejemplo, ECL Detection System, Amersham Biosciences), según
instrucciones del fabricante.
En el caso de utilizar un soporte de cristal
funcionalizado con, por ejemplo,
poli-L-lisina, se recomienda
realizar el marcaje de las muestras utilizando un fluorocromo, por
ejemplo los fluorocromos CyDye de Amersham Biosciences: Cy3 o Cy5.
Para realizar el marcaje con este fluorocromo existen kits
comercializados por Amersham Biosciences para la obtención de cDNA
o RNA marcados. No obstante, con estas sondas se han empleado los
fluorocromos mencionados unidos a un nucleótido como dUTP o dCTP,
realizando un marcaje del producto de PCR semejante al mencionado
anteriormente para el caso del marcaje del producto de PCR con
biotina. La lectura de los resultados se realiza utilizando un
scanner apropiado.
Los límites de detección han sido muy similares
en todos los soportes utilizados. La cuantificación de los límites
de detección se ha realizado mediante plásmidos que contienen el
fragmento resultado de la amplificación por PCR. El límite de
detección ha sido de 10- 100 copias de plásmido en todos los
casos.
El método de la invención presenta numerosas
ventajas frente a otros métodos utilizados para la detección e
identificación de virus, entre las que pueden citarse las
siguientes:
- -
- sensibilidad superior a la de las técnicas convencionales: aislamiento en cultivos celulares, inmunofluorescencia indirecta;
- -
- especificidad elevada;
- -
- escasa dependencia del tipo de muestra o de sus condiciones de conservación y transporte;
- -
- escasa dependencia de contaminación bacteriana de la muestra;
- -
- menor contaminación ambiental de amplicones que las técnicas de amplificación genómica (por lo que no es necesario tener dependencias separadas para los distintos pasos de la técnica);
- -
- posibilidad de detectar e identificar (tipado) simultáneamente los principales virus causantes de infección respiratoria en humanos;
- -
- fácil rutinización de la técnica;
- -
- posibilidad de adaptación a distintos formatos en función de las necesidades del laboratorio (es decir, posibilidad de adaptar a distintos formatos para producir un kit diagnóstico comercializable); y
- -
- además, al permitir la posibilidad de detectar co-infecciones causadas por dos o más virus distintos en la misma muestra e identificarlos, se pueden realizar estudios epidemiológicos precisos, lo que ayudaría a determinar la contribución de estas co- infecciones a la gravedad de la infección en el paciente, así como al pronóstico de la enfermedad.
Además, el empleo de sondas oligonucleotídicas
para la detección e identificación de virus causantes de
infecciones respiratorias en humanos, tales como las sondas de la
invención, presenta ventajas adicionales sobre técnicas
convencionales basadas en el aislamiento en cultivos celulares o IF,
entre las que pueden citarse las siguientes: (i) respecto al
aislamiento en cultivos celulares, las técnicas basadas en
hibridación son más rápidas y sensibles (sobre todo en el caso de
virus de crecimiento lento o con especiales requerimientos para
ello); y (ii) respecto a las técnicas basadas en IF, son más
específicas.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit, en adelante kit de la invención, para la identificación de
un virus causante de infección respiratoria seleccionado entre virus
influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C,
virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio
sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza
humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus
parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y
4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E,
coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome
respiratorio agudo severo (SARS) y metapneumovirus humano, en una
muestra biológica, mediante el método de la invención, que
comprende, al menos, una sonda de la invención, opcionalmente
inmovilizada sobre un soporte sólido (plataforma de hibridación de
la invención). Ventajosamente, el kit de la invención comprende una
plataforma de hibridación de la invención constituido por un
soporte sólido en el que están inmovilizadas una o más sondas de la
invención. En una realización particular, el kit de la invención
comprende una plataforma de hibridación que comprende un soporte
sólido sobre el que se han inmovilizado sondas de la invención
seleccionadas del grupo formado por los polinucleótidos
identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ
ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:
13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ
ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y sus mezclas. Dichas sondas pueden estar
dispuestas en disposiciones orientadas o no orientadas.
El kit de la invención incluye los reactivos
necesarios para llevar a cabo el método de la invención, así como
instrucciones para ello. Adicionalmente puede contener, si se
desea, iniciadores específicos para la amplificación de secuencias
diana (en caso de que antes de la hibridación se proceda a realizar
una reacción de amplificación) así como controles positivos y
negativos.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados en sentido limitativo del alcance de la
misma.
\newpage
La detección de cepas de referencia de patógenos
virales causantes de infecciones respiratorias en muestras
procedentes de cultivos celulares inoculados con dichas cepas
virales, se llevó a cabo mediante un ensayo basado en la hibridación
de fragmentos de material genético amplificados y marcados, con
sondas inmovilizadas en membrana de nylon, siguiendo un protocolo
adaptado a partir del previamente descrito por Kaufhold y cols.
(Kaufhold y cols., 1994, FEMS Microbiology Letters
119:19-25).
Las muestras utilizadas para la realización de
este ensayo fueron muestras procedentes de cepas de referencia de
virus respiratorios causantes de infecciones respiratorias crecidas
en cultivos celulares. Dichas cepas de referencia fueron
suministradas por laboratorios de reconocido prestigio y están
aceptadas como cepas de referencia por la comunidad científica
internacional, según se enumeran a continuación:
Las concentraciones de virus utilizadas fueron
calculadas en cada caso: 100 TCID_{50} en los virus influenza
tipos A y B; una dilución 10^{-3} de una preparación de virus
influenza tipo C con un título 2048 por inhibición de la
hemaglutinación; una dilución 10^{-3} de RSVA y RSVB, equivalente
a detectar una célula infectada por inmunofluorescencia indirecta;
diluciones 10^{-3} de ADV1, virus parainfluenza humano tipos 1, 2,
3 y 4B, coronavirus humano 229E, coronavirus humano OC43, y
metapneumovirus humano, todas ellas equivalentes a 10^{5} copias
de plásmido; así como diluciones 10^{-4} de Echo30 y Rhinol4,
equivalentes a 0,1 TCID_{50}.
Se han utilizado en cada caso sondas homólogas a
la cadena molde de cada virus, así como a la cadena complementaria,
independiente y/o conjuntamente, con el fin de comprobar el mejor
resultado de sensibilidad. Las concentraciones de cada sonda son las
anteriormente descritas. La localización de las sondas se
especifica en cada caso (Figura 1). Las sondas utilizadas en este
ensayo se indican en la Tabla 1.
Dichas sondas poseen un grupo hexilamino en el
extremo 5', según describieron Kaufhold y cols. (FEMS Microbiol.
Lett. 1994 Jun
1;119(1-2):19-25). La
presencia del grupo amino facilita la inmovilización de la sonda y
permite orientar espacialmente la sonda sobre la membrana. Para su
inmovilización sobre la membrana, las sondas se diluyeron en una
solución recién preparada de NaHCO{3} 500 mM, pH 8,4, siguiendo un
protocolo descrito previamente [Vinjé Jy Koopmans MPG. J Clin
Microbiol 2000, 38:2595-2601]. En este caso, todas
las sondas se utilizaron a una concentración de 0,8 \muM.
La membrana utilizada en este ensayo fue una
membrana con superficie de carga negativa (Biodyne C, Pall Life
Sciences) de un tamaño aproximado de 14,5 cm x 14,5 cm. Dicha
membrana fue preparada siguiendo un protocolo descrito previamente
[Vinjé & Koopmans citado supra]. Brevemente, antes de la
unión de las sondas a la membrana, ésta se trató con una solución
recién preparada de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida (EDAC) al 16% en agua, durante, al menos, 15 minutos,
y, a continuación, se enjuagó con agua. La membrana así preparada
se usó inmediatamente o bien se almacenó a 4ºC en papel de filtro
hasta su uso durante un máximo de 1 semana.
A partir de las muestras (apartado 1.1.1) se
llevó a cabo la extracción del material genético, tanto RNA como
DNA, mediante métodos convencionales. En este caso se empleó un
método de extracción basado en el uso de tiocianato de guanidinio,
descrito previamente por Casas y cols (Casas y cols., 1995, J Virol
Methods 53:25-36).
El material genético extraído se sometió a una
reacción de amplificación enzimática con el fin de amplificar
fragmentos que contenían las secuencias homólogas a las sondas
utilizadas (Tabla 1) para la detección de los distintos patógenos
virales (virus influenza tipos A, B y C, RSVA, RSVB, ADV1, PIV1,
PIV2, PIV3, PIV4, coronavirus, echovirus, rhinovirus y
metapneumovirus) inmovilizadas sobre una membrana de nylon.
Las reacciones de amplificación enzimática de
los distintos fragmentos se llevaron a cabo utilizando los
iniciadores descritos por Coiras y cols. (Coiras y cols., Journal of
Medical Virology 69:132-144 (2003); y Coiras y
cols., Journal of Medical Virology
72(3):484-495 (2004)). La amplificación se
llevó a cabo en presencia de dATP, dGTP y dCTP 200 \muM, dTTP 130
\muM y biotina-16-dUTP 70 \muM,
por reacción con el fin de marcar el material genético (productos
de amplificación o amplicones) a hibridar.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmovilización de las sondas utilizadas en
este ensayo (Tabla 1) a la membrana de nylon se llevó a cabo
siguiendo sustancialmente un protocolo descrito previamente [Vinjé
J, Koopmans MPG.J Clin Microbiol 2000,
38:2595-2601].
Para su inmovilización sobre la membrana, las
sondas se diluyeron en una solución recién preparada de NaHCO_{3}
500 mM, pH 8,4, siguiendo el protocolo descrito previamente.
Asimismo, antes de la unión de las sondas a la membrana de nylon,
ésta se trató con una solución recién preparada de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida (EDAC) al 16% en agua, durante, al menos, 15 minutos,
y, a continuación, se enjuagó con agua. La membrana así preparada
se usó inmediatamente o bien se almacenó a 4ºC en papel de filtro
hasta su uso durante un máximo de 1 semana.
Las sondas sometidas al tratamiento previamente
indicado se inmovilizaron sobre la membrana de nylon previamente
preparada por métodos convencionales [Vinjé & Koopmans citado
supra] basándose en el hecho de que el grupo amino presente
en las sondas se une covalentemente a los grupos carboxilo
activados procedentes del tratamiento de la membrana con EDAC. Para
ello, brevemente, la membrana de nylon se introdujo en un
miniblotter de 45 canales (Biometra). Los canales que no iban a
contener sonda se rellenaron con una solución recién preparada de
NaHCO_{3} 500 mM, pH 8,4, mientras que los canales que iban a
contener las sondas se rellenaron con diluciones de las sondas
preparadas en el momento tal como se ha indicado previamente. Las
sondas se incubaron en contacto con la membrana a temperatura
ambiente (18-22ºC) durante 10 minutos. A
continuación, el líquido fue aspirado de los canales con una bomba
de vacío. Los grupos ésteres que permanecían activados en la
membrana se hidrolizaron mediante incubación a temperatura ambiente
con una solución de NaOH 100 mM durante un periodo de tiempo no
superior a 10 minutos. Finalmente, la membrana con las sondas se
enjuagó con agua destilada ultrapura varias veces. La concentración
de las sondas en la membrana de nylon era de, aproximadamente,
0,8-5 pmoles/\mul (ó 120-750
pmoles por carril) en un volumen final de 150 \mul, que llenaba
completamente el carril del miniblotter (Biometra). Las sondas se
dispusieron sobre la membrana siguiendo siempre el mismo orden en
los carriles. El análisis de los resultados se hizo mediante una
plantilla que permitía identificar rápidamente los virus que habían
sido detectados en la(s) muestra(s).
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de proceder a hibridar el material
genético (producto de amplificación) marcado, la membrana con las
sondas se sometió a un tratamiento de prehibridación. Para ello, la
membrana con las sondas se lavó con una solución de SSPE 2X (NaCl
360 mM, NaH_{2}PO_{4} 20 mM, EDTA 2 mM, pH 7,2) en presencia de
dodecil sulfato sódico (SDS) al 0,1% durante 10 minutos a 56ºC.
Para la hibridación del material genético con
las sondas inmovilizadas, la membrana con las sondas se colocó en
un miniblotter girada 90º con respecto a la posición anterior. Diez
microlitros del material genético marcado se diluyeron en 150 \mul
de tampón de hibridación (SSPE 2x, 0,5% SDS). Dado que el producto
a hibridar es DNA de doble cadena, se sometió durante 10 minutos a
un calentamiento a 99ºC y posteriormente se enfrió rápidamente
durante 1 minuto a 4ºC. Después de mantener a temperatura ambiente
durante 1 minuto se procedió a efectuar la hibridación. El proceso
de hibridación se llevó a cabo durante 2 horas aproximadamente, a
48ºC aproximadamente, con agitación suave.
A continuación, la membrana se lavó a través de
los colectores de filtración o "manifolds" (Biometra) con 150
ml de una solución de SSPE 2x con 0,5% de SDS (dodecilsulfato
sódico). La membrana se sacó del miniblotter y se lavó dos veces más
con 50 ml de la solución anterior, en agitación, durante 10 minutos
cada vez, a 40ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La membrana de nylon con las sondas y los
productos de amplificación marcados, que eventualmente habían
hibridado con las sondas, se incubó con
estreptavidina-peroxidasa (1:4000), durante un
periodo de tiempo de 45 minutos, a 37ºC. A continuación, se
realizaron tres lavados de 10 minutos cada uno utilizando en los
dos primeros solución de SSPE2x 0,5% SDS y SSPE2x 0,1% SDS,
respectivamente, a 37ºC y con agitación, y el tercero con una
solución de SSPE2x sólo, a temperatura ambiente, con agitación.
Finalmente se procedió a efectuar el revelado quimioluminiscente
con luminol en presencia de agua oxigenada utilizando un kit
comercial (ECL Detection System, Amersham Biosciences), siguiendo
las instrucciones del fabricante. La visualización de los resultados
se realizó mediante impresión de películas de rayos X (Kodak)
durante 5 minutos, 30 minutos y 4 horas.
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 1 y ponen de manifiesto la especificidad y sensibilidad de
la técnica ensayada que permite identificar simultáneamente las
cepas prototipo de diferentes patógenos virales causantes de
infecciones respiratorias. Cada producto de amplificación marcado
con biotina interacciona de manera específica solamente con su
sonda complementaria, y, en ningún caso, se observan hibridaciones
inespecíficas, a pesar de que la cantidad de molde utilizado para la
reacción de amplificación era elevado. Mediante la aplicación de
una plantilla sobre la película impresionada es posible identificar
rápida y claramente el(los) virus que ha(n) sido
detectado(s) por la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección de diversos virus respiratorios
causantes de infecciones respiratorias en muestras procedentes de
cultivos celulares se llevó a cabo mediante un ensayo basado en la
hibridación a las sondas inmovilizadas en una membrana de nylon, de
los fragmentos de material genético amplificados y marcados con
biotina.
Las muestras utilizadas para la realización de
este ensayo fueron muestras procedentes de los virus respiratorios
causantes de infecciones respiratorias, aislados de muestras
clínicas del tracto respiratorio inoculadas en cultivos celulares.
Dichos virus fueron los siguientes: virus influenza tipo A, virus
influenza tipo B, virus respiratorio sincitial humano tipo A
(RSVA), virus respiratorio sincitial humano tipo B (RSVB),
adenovirus humano (ADV) (varios serotipos) y virus parainfluenza
humano tipo 3 (PIV3).
Con el fin de comprobar la sensibilidad de la
técnica se emplearon diluciones seriadas en base diez, de virus
aislados en cultivos celulares a partir de muestras respiratorias
de pacientes. Las diluciones empleadas para cada virus fueron las
siguientes: las diluciones iniciales, marcadas como -1 (Figura 2),
fueron de 100 TCID_{50} en los virus influenza tipos A (carriles
1-4) y B (carriles 5-8), una
dilución 10^{-3} de RSVA (carriles 9-12) y RSVB
(carriles 13-16), ADV (carriles
17-20), equivalentes a detectar una célula infectada
por inmunofluorescencia indirecta, y una dilución 10^{-3} de
virus parainfluenza humano tipo 3 (carriles 21-24),
equivalente a detectar 10^{5} copias de un plásmido que contiene
el fragmento amplificado por la RT-PCR.
Se han utilizado en cada caso sondas homólogas a
la cadena molde de cada virus, así como a la cadena complementaria,
independiente y/o conjuntamente, con el fin de comprobar el mejor
resultado de sensibilidad. Las sondas utilizadas en este ensayo se
indican en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas diseñadas para la detección de los
virus influenza tipos A y B y RSVA se utilizaron conjunta o
separadamente, a una concentración final de 0,8 \muM. Las demás
sondas se utilizaron a concentraciones de 5, 1 y 0,8 \muM con
objeto de observar la diferente sensibilidad en función de la
variación de la concentración.
Dichas sondas poseen un grupo hexilamino en el
extremo 5', según describieron Kaufhold y cols. (FEMS Microbiol
Lett. 1994 Jun 1;
119(1-2):19-25). La presencia
del grupo amino facilita la inmovilización de la sonda y permite
orientar espacialmente la sonda sobre la membrana. Para su
inmovilización sobre la membrana, las sondas se diluyeron en una
solución recién preparada de NaHCO_{3} 500 mM, pH 8,4, siguiendo
un protocolo descrito previamente [Vinjé Jy Koopmans MPG.. J Clin
Microbiol 2000, 38:2595-2601].
\vskip1.000000\baselineskip
La membrana utilizada en este ensayo fue una
membrana con superficie de carga negativa (Biodyne C, Pall Life
Sciences), de un tamaño aproximado de 14,5 cm x 14,5 cm. Dicha
membrana fue preparada siguiendo un protocolo descrito previamente
[Vinjé & Koopmans citado supra]. Brevemente, antes de la
unión de las sondas a la membrana, ésta se trató con una solución
recién preparada de EDAC al 16% en agua, durante, al menos, 15
minutos, y, a continuación, se enjuagó con agua. La membrana así
preparada se usó inmediatamente o bien se almacenó a 4ºC en papel
de filtro hasta su uso durante un máximo de 1 semana.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de las muestras (apartado 2.1.1.) se
llevó a cabo la extracción del material genético, tanto RNA como
DNA, mediante métodos convencionales. En este caso se empleó un
método de extracción basado en el uso de tiocianato de guanidinio,
descrito previamente por Casas y cols (J Virol Methods, 1995,
53:25-36).
\vskip1.000000\baselineskip
El material genético extraído se sometió a una
reacción de amplificación enzimática con el fin de amplificar
fragmentos que contenían las secuencias homólogas a las sondas
utilizadas (Tabla 2) para la detección de los distintos patógenos
virales (virus influenza tipos A y B, RSVA, RSVB, ADV y virus
parainfluenza humano tipo 3), inmovilizadas sobre una membrana de
nylon.
Las reacciones de amplificación enzimática de
los distintos fragmentos específicos de los patógenos virales virus
influenza tipos A y B, RSVA, RSVB, ADV y virus parainfluenza humano
tipo 3 se llevaron a cabo utilizando los iniciadores descritos por
Coiras y cols. (Coiras y cols., Journal of Medical Virology
69:132-144 (2003); y Coiras y cols., Journal of
Medical Virology 72(3):484-495 (2004)). En
todos los casos, la amplificación se llevó a cabo en presencia de
dATP, dGTP, y dCTP 200 \muM, dTTP 130 \muM y
biotina-16-dUTP 70 \muM, por
reacción con el fin de marcar el material genético (productos de
amplificación o amplicones) a hibridar.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmovilización de las sondas utilizadas en
este ensayo (Tabla 2) a la membrana de nylon se llevó a cabo de
forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo
1.2.3.
\vskip1.000000\baselineskip
La hibridación del material genético amplificado
con las sondas inmovilizadas en la membrana de nylon se llevó a
cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el
Ejemplo 1.2.4.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección e identificación de los patógenos
virales se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se
menciona en el Ejemplo 1.2.5.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 2 y ponen de manifiesto la especificidad y sensibilidad de
la técnica ensayada que permite identificar diferentes patógenos
virales causantes de infecciones respiratorias, aislados de muestras
clínicas del tracto respiratorio inoculadas en cultivos celulares.
Se aprecia la variación en la sensibilidad de la detección en
función de la dilución del virus y de la distinta concentración de
la sonda utilizada, así como de si las sondas para la detección de
virus influenza tipos A y B y del RSV tipo A se utilizan juntas o
por separado. La especificidad es, en todos los casos, muy
elevada.
La detección directa de virus influenza tipo A
presente en la muestra clínica ensayada se llevó a cabo mediante un
ensayo basado en la hibridación de fragmentos de material genético
amplificados y marcados con sondas inmovilizadas en membrana de
nylon.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras utilizadas para la realización de
este ensayo fueron frotis faringeos tomados a pacientes que
presentaban síntomas indicativos de cuadro gripal, con objeto de
intentar identificar el virus productor de dicho cuadro clínico.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas utilizadas en este ensayo (SEQ ID NO:
1 y SEQ ID NO: 2) se diseñaron con un grupo hexilamino en el
extremo 5', según describieron Kaufhold y cols. (FEMS Microbiol
Lett. 1994 Jun
1;119(1-2):19-25). La
presencia del grupo amino facilita la inmovilización de la sonda y
permite orientar espacialmente la sonda sobre la membrana. Para su
inmovilización sobre la membrana, las sondas se diluyeron en una
solución recién preparada de NaHCO_{3} 500 mM, pH 8,4, siguiendo
un protocolo descrito previamente [Vinjé Jy Koopmans MPG.. J Clin
Microbiol 2000, 38:2595-2601]. En este caso, todas
las sondas se utilizaron a una concentración de 0,8 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
La membrana utilizada en este ensayo fue una
membrana con superficie de carga negativa (Biodyne C, Pall Life
Sciences) de un tamaño aproximado de 14,5 cm x 14,5 cm. Dicha
membrana fue preparada siguiendo un protocolo descrito previamente
[Vinjé & Koopmans citado supra]. Brevemente, antes de la
unión de las sondas a la membrana, ésta se trató con una solución
recién preparada de EDAC al 16% en agua, durante, al menos, 15
minutos, y, a continuación, se enjuagó con agua. La membrana así
preparada se usó inmediatamente o bien se almacenó a 4ºC en papel de
filtro hasta su uso durante un máximo de 1 semana.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de las muestras (apartado 3.1.1) se
llevó a cabo la extracción del material genético, tanto RNA como
DNA, mediante métodos convencionales En este caso se empleó un
método de extracción basado en el uso de tiocianato de guanidinio,
descrito previamente por Casas y cols. (Casas y cols., 1995, J
Virol Methods 53:25-36).
\vskip1.000000\baselineskip
El material genético extraído se sometió a una
reacción de amplificación enzimática con el fin de amplificar
fragmentos que contenían las secuencias homólogas a las sondas
utilizadas (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) para la detección del
patógeno viral (virus influenza tipo A) fijadas a una membrana de
nylon. La reacción de amplificación enzimática
(RT-PCR) de los distintos fragmentos se llevó a cabo
utilizando los iniciadores y las condiciones descritos por Coiras y
cols. (Coiras y cols., Journal of Medical Virology
69:132-144 (2003)). En todos los casos, la
amplificación se llevó a cabo en presencia de dATP, dGTP, y dCTP
200 \muM, dTTP 130 \muM y
biotina-16-dUTP 70 \muM por
reacción, con el fin de marcar el material genético (productos de
amplificación o amplicones) a hibridar.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmovilización de las sondas utilizadas en
este ensayo (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) a la membrana de nylon se
llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona
en el Ejemplo 1.2.3.
\vskip1.000000\baselineskip
La hibridación del material genético amplificado
con las sondas inmovilizadas en la membrana de nylon se llevó a
cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el
Ejemplo 1.2.4.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección e identificación del patógeno viral
se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se
menciona en el Ejemplo 1.2.5.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de comprobar la sensibilidad de la
técnica utilizada previamente basada en la hibridación de productos
amplificados y marcados, con sondas inmovilizadas en una membrana
de nylon, se procedió a realizar una PCR anidada siguiendo una
metodología descrita previamente (Coiras y cols., Journal of
Medical Virology, 2003, 69:132-144). Los
iniciadores utilizados tanto para la amplificación de los fragmentos
que contenían secuencias homólogas a las sondas, como los
utilizados para realizar la PCR anidada, así como las condiciones
de realización de la PCR anidada se describen en dicha publicación
(Coiras y cols., 2003, citado supra).
\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 3A se observan los resultados de la
hibridación del material genético procedente de los virus de la
muestra clínica, con las sondas inmovilizadas en la membrana
(Carriles 1-12). No se detectó virus influenza A en
las muestras 2, 7 y 8. Estos resultados ponen de manifiesto la
especificidad y sensibilidad de la técnica ensayada que permite
identificar el virus influenza tipo A en muestras clínicas.
Con objeto de analizar esta sensibilidad y
especificidad utilizando una técnica referenciada, se realizó
simultáneamente al proceso de hibridación una PCR anidada, cuyos
resultados se muestran en la Figura 3B, donde los carriles
1-12 corresponden a los carriles
1-12 observados en la Figura 3A. El carril M de la
Figura 3B corresponde con el marcador XIV de pesos moleculares,
suministrado por Roche Diagnostics (marcador de 100 pb). En todos
los carriles (excepto 2, 7 y 8) se observa una banda de 721 pares de
bases (pb), correspondiente al fragmento amplificado del gen de la
nucleoproteína del virus influenza tipo A, y una banda de 837 pb,
correspondiente al control interno utilizado como control del
proceso de extracción del material genético a partir de la muestra,
así como de la reacción de PCR (el plásmido del control interno y
los iniciadores para su amplificación se describen en Coiras y
cols., (2003) citado supra, donde se describen asimismo los
iniciadores y las condiciones para realizar la PCR anidada).
\vskip1.000000\baselineskip
La detección del coronavirus causante del
síndrome respiratorio agudo severo (SARS) se llevó a cabo mediante
un ensayo basado en la hibridación de fragmentos de material
genético amplificados y marcados, con sondas inmovilizadas en
membrana de nylon.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras utilizadas para la realización de
este ensayo fueron material genético procedente de virus inactivado
y de un plásmido que incluye un fragmento de la polimerasa de
coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS),
amablemente cedidos por el Dr. Christian Drosten (Bernhard Nocht
Institute for Tropical Medicine, National Reference Center for
Tropical Infectious Diseases, Hamburgo, Alemania). Se han empleado
diluciones seriadas del virus inactivado a partir de la dilución
10^{-3}, equivalentes a diluciones seriadas realizadas a partir
de una dilución 10^{5} de plásmido que incluye el fragmento del
gen de la polimerasa amplificado a partir del genoma del
CoV-SARS.
\vskip1.000000\baselineskip
La sonda utilizada en este ensayo (SEQ ID NO:
18) se diseñó con un grupo hexilamino en el extremo 5', según
describieron Kaufhold y cols. (FEMS Microbiol Lett. 1994 Jun 1;
119(1-2):19-25). La presencia
del grupo amino facilita la inmovilización de la sonda y permite
orientar espacialmente la sonda sobre la membrana. Se ensayaron dos
concentraciones de dicha sonda (0,8 gM y 5 \muM) tal como se
recoge en la Figura 4. Para su inmovilización sobre la membrana,
las sondas se diluyeron en una solución recién preparada de
NaHCO_{3} 500 mM, pH 8,4, siguiendo un protocolo descrito
previamente [Vinjé Jy Koopmans MPG. J Clin Microbiol 2000,
38:2595-2601].
\vskip1.000000\baselineskip
La membrana utilizada en este ensayo fue una
membrana con superficie de carga negativa (Biodyne C, Pall Life
Sciences) de un tamaño aproximado de 14,5 cm x 14,5 cm. Dicha
membrana fue preparada siguiendo un protocolo descrito previamente
[Vinjé & Koopmans citado supra]. Brevemente, antes de la
unión de las sondas a la membrana, ésta se trató con una solución
recién preparada de EDAC al 16% en agua, durante, al menos, 15
minutos, y, a continuación, se enjuagó con agua. La membrana así
preparada se usó inmediatamente o bien se almacenó a 4ºC en papel
de filtro hasta su uso durante un máximo de 1 semana.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de las muestras (apartado 4.1.1) se
llevó a cabo la extracción del material genético, tanto RNA como
DNA, mediante métodos convencionales En este caso se empleó un
método de extracción basado en el uso de tiocianato de guanidinio,
descrito previamente por Casas y cols (1995, J Virol Methods
53:25-36).
\vskip1.000000\baselineskip
El material genético extraído se sometió a una
reacción de amplificación enzimática con el fin de amplificar
fragmentos que contenían las secuencias homólogas a las sondas
utilizadas (SEQ ID NO: 18) para la detección del patógeno viral
(coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo
(SARS)) fijadas a una membrana de nylon. La reacción de
amplificación enzimática de los distintos fragmentos se llevó a cabo
utilizando los iniciadores y las condiciones descritas por Drosten
C y cols. (Drosten C y cols., 2003, N Engl J Med. May
15;348(20):1967-76). La amplificación se
llevó a cabo en presencia de dATP, dGTP, y dCTP 200 \muM, dTTP
130 \muM y biotina-16-dUTP 70
\muM, por reacción con el fin de marcar el material genético
(productos de amplificación o amplicones) a hibridar.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmovilización de la sonda utilizada en este
ensayo (SEQ ID NO: 18) a la membrana de nylon se llevó a cabo de
forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo
1.2.3.
\vskip1.000000\baselineskip
La hibridación del material genético amplificado
con la sonda inmovilizada en la membrana de nylon se llevó a cabo
de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo
1.2.4.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección e identificación del patógeno viral
se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se
menciona en el Ejemplo 1.2.5.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 4 y ponen de manifiesto la validez de la sonda utilizada
para la detección del material genético procedente del coronavirus
causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y la
sensibilidad del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección genérica de adenovirus humanos
presentes en muestras clínicas se llevó a cabo mediante un ensayo
basado en la hibridación de fragmentos de material genético
amplificados y marcados, con sondas inmovilizadas, no orientadas, en
portaobjetos de cristal.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras utilizadas para la realización de
este ensayo fueron secreciones respiratorias procedentes de
pacientes con cuadros respiratorios. El material genético se
extrajo directamente de las muestras clínicas y se analizó el
posible virus presente en las mismas mediante dos
RT-PCR múltiples seguidas de PCRs anidadas descritas
previamente por Coiras y cols. (Coiras y cols., Journal of Medical
Virology, 2003, 69:132-144; y Coiras y cols.,
Journal of Medical Virology, 2004,
72(3):484-495). Una vez conocida la presencia
de adenovirus humanos en dichas muestras clínicas, el mismo
material genético fue utilizado para ser hibridado con la sonda SEQ
ID NO: 9, diseñada para poder hibridarse a cualquier adenovirus de
origen humano, independientemente de su serotipo.
\vskip1.000000\baselineskip
La sonda utilizada en este ensayo (SEQ ID NO: 9)
se inmovilizó directamente sobre una superficie de cristal
(portaobjetos), en disposición no orientada en el espacio, a una
concentración de 20 \muM. Las sondas se preparan a la
concentración recomendada en un volumen aproximado de 40 \mul
diluidas en SSC 3x, dispuestas en pocillos de una placa de 96,
preferiblemente de fondo en U o en V para facilitar el acceso de las
agujas de impresión.
A diferencia del método de hibridación en
membrana de nylon, estas sondas no presentan modificaciones en el
extremo 5'.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han empleado portaobjetos comunes a los que
se somete a un tratamiento con
poli-L-lisina con objeto de disponer
sobre la superficie de cristal grupos amino que se van a unir
covalentemente a los grupos fosfato de las sondas. Las sondas no
quedan orientadas espacialmente sobre la superficie del
portaonjetos funcionalizado con
poli-L-lisina, sino que quedan
adheridas a ella en toda su longitud. Este tratamiento fue descrito
por (Schena y cols., 1995, Science
270(5235):467-470.).
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de las muestras (apartado 5.1.1) se
llevó a cabo la extracción del material genético, tanto RNA como
DNA, mediante métodos convencionales En este caso se empleó un
método de extracción basado en el uso de tiocianato de guanidinio,
descrito previamente por Casas y cols (J Virol Methods, 1995,
53:25-36).
\vskip1.000000\baselineskip
El material genético extraído se sometió a una
reacción de amplificación enzimática con el fin de amplificar
fragmentos de la secuencia del gen de la proteína del hexón,
homólogas a la sonda utilizada (SEQ ID NO: 9) para la detección de
adenovirus, fijada a una membrana de nylon. La reacción de
amplificación enzimática se llevó a cabo utilizando los iniciadores
y las condiciones descritas en Coiras y cols. (Journal of Medical
Virology, 2003, 69:132-144). La amplificación se
llevó a cabo en presencia de dATP, dGTP, y dTTP 200 \muM, dCTP
180 \muM y Cy3-dCTP 20 \muM por reacción, con el
fin de marcar el material genético (productos de amplificación o
amplicones) a
hibridar.
hibridar.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmovilización de la sonda utilizada en este
ensayo (SEQ ID NO: 9) a la superficie de cristal se realizó
disponiendo dicha sonda por triplicado sobre el portaobjetos
mediante un sistema de Pin&Ring con un Arrayer GMS 417
(Affymetrix Inc.). Los grupos amino que han quedado libres en la
superficie del portaobjetos funcionalizado e impreso, se bloquean
con anhídrido succínico disuelto, en un disolvente polar
(n-metil-pirrolidinona), según
describen Eisen y Brown, 1999, Methods Enzymol
303:179-205. A continuación los portaobjetos se
sumergen en agua a 90ºC durante 2 minutos y luego en etanol absoluto
momentáneamente con objeto de facilitar su secado, que se completa
mediante centrifugación a temperatura ambiente. Una vez bloqueados,
los portaobjetos se almacenan en desecador, protegidos de la luz, a
temperatura ambiente, al menos 24 horas antes de realizar la
hibridación con las
muestras.
muestras.
\newpage
La hibridación del material genético amplificado
y marcado, con la sonda inmovilizada en el soporte de cristal, se
llevó a cabo mediante el protocolo siguiente. Brevemente, 10 \mul
del material genético marcado se diluyeron en 15-20
\mul de tampón de hibridación (SSC 2x, 0,2% SDS), se calentaron a
95ºC durante 10 minutos y posteriormente se enfriaron rápidamente 1
minuto a 4ºC. La muestra se depositó sobre la región del
portaobjetos donde estaban impresas las sondas y se tapó con un
cubreobjetos. A continuación se introdujo en una cámara de
hibridación donde se mantuvo en condiciones de humedad y saturación
de sales, y la hibridación se realizó durante 2 horas a 42ºC en
agitación suave.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección e identificación del patógeno viral
se llevó a cabo después de realizar lavados de los portaobjetos con
SSC 1x-SDS 0,2%, SSC 0,1x-SDS 0,2%,
y por último con SSC 0,1x, durante 10 minutos cada uno, en
agitación, a temperatura ambiente y protegidos de la luz. Después
de secarlos en una centrifuga de portaobjetos se procedió a la
lectura inmediata de los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
La lectura de los resultados se realizó
utilizando un Scanner GMS 418 (Affymetrix Inc.). Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 5 y ponen de manifiesto la
validez de la sonda utilizada para la detección del material
genético procedente de muestras clínicas infectadas con cualquier
adenovirus de origen humano. En la Figura 5 se observa la
fluorescencia emitida por las moléculas de Cy3 presentes en el
producto de amplificación obtenido mediante los oligonucleótidos
iniciadores específicos para adenovirus humano. Se han utilizado
para la amplificación y el marcaje mediante PCR (condiciones y
oligonucleótidos en Coiras y cols., Journal of Medical Virology
69:132-144 (2003)), diluciones de adenovirus
humanos causantes de infección respiratoria y pertenecientes a los
serotipos 1 (imagen 1), 2 (imagen 2), 4 (imagen 3), 5 (imagen 4) y 7
(imagen 5), equivalentes estas diluciones a 10^{3} copias de un
plásmido que contiene el fragmento del gen de la proteína del hexón
amplificado en las condiciones descritas.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> INSTITUTO DE SALUD CARLOS III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SONDAS Y MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN E
IDENTIFICACIÓN SIMULTÁNEA DE MÚLTIPLES VIRUS CAUSANTES DE
INFECCIONES RESPIRATORIAS EN HUMANOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus influenza tipo A mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagratgt gctctctgat gca
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus influenza tipo A mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgccatcc ayaccarytg rc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus influenza tipo B mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagatgatgg tcaaagctgg act
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus influenza tipo B mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcwatgt ctgcaatccc tgg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda utilizada para detectar la
presencia de virus influenza tipo C mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatgatgaa attgaatcaa tag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus respiratorio sincitial humano tipo A mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcaaaacat cactgaagaa ttt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus respiratorio sincitial humano tipo A mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttacattggt wtttttggya ttg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus respiratorio sincitial humano tipo B mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaggtgagg tacaatgcat taa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
adenovirus humano mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccmgcrttrc ggtgrtggtt raa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus parainfluenza humano tipo 1 mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaattcaga tatgtatcct gat
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus parainfluenza humano tipo 2 mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacctaagtg atggaatcaa tcg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus parainfluenza humano tipo 3 mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagatgtat atcaactgtg ttc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
virus parainfluenza humano tipos 4A y 4B mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggtgaaaa gaacatggag att
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
enterovirus mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggctgctta tggtgacaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
rhinovirus mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggaygggac cractacttt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
coronavirus humano tipo 229E mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacttggca ctgtggacgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
coronavirus humano tipo OC43 mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcagatcag tggatacact
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS)
mediante hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggattggct ttgatgtaga gggctgt
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para detectar la presencia de
metapneumovirus humano mediante hibridación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgttaatat cccacacca
\hfill19
Claims (37)
1. Una plataforma de hibridación para
identificar virus causantes de infecciones respiratorias en humanos
seleccionados entre el virus influenza tipo A, el virus influenza
tipo B, el virus influenza tipo C, el virus respiratorio sincitial
humano tipo A (RSVA), el virus respiratorio sincitial humano tipo B
(RSVB), adenovirus humano, el virus parainfluenza humano tipo 1
(PIV1), el virus parainfluenza humano tipo 2 (PIV2), el virus
parainfluenza humano tipo 3 (PIV3), los virus parainfluenza humano
tipo 4A y 4B (PIV4A14B), enterovirus, rhinovirus, coronavirus
humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante
de SARS y metapneumovirus humano eventualmente presentes en una
muestra de ensayo que comprende un soporte sólido,
caracterizada por un conjunto de sondas inmovilizadas sobre
dicho soporte sólido, constituido por las secuencias SEQ ID No 1,
SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6,
SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11,
SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No15, SEQ ID No16,
SEQ ID No 17, SEQ ID No 18 y SEQ ID No 19.
2. Plataforma de hibridación según la
reivindicación 1, en la que dichas sondas están inmovilizadas sobre
dicho soporte sólido en una disposición orientada.
3. Plataforma de hibridación según la
reivindicación 1, en la que dichas sondas están inmovilizadas sobre
dicha soporte sólido en una disposición no orientada.
4. Un método para identificar virus causantes de
infecciones respiratorias en humanos seleccionados entre el virus
influenza tipo A, el virus influenza tipo B, el virus influenza tipo
C, el virus respiratorio sincitial humano tipo A (RSVA), el virus
respiratorio sincitial humano tipo B (RSVB), adenovirus humano, el
virus parainfluenza humano tipo 1 (PIV1), el virus parainfluenza
humano tipo 2 (PIV2), el virus parainfluenza humano tipo 3 (PIV3),
los virus parainfluenza humano tipo 4A y 4B (PIV4A/4B),
enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus
humano tipo OC43, coronavirus causante de SARS y metapneumovirus
humano eventualmente presentes en una muestra de ensayo
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- Poner en contacto ácidos nucleicos diana procedentes de dicha muestra de ensayo con una plataforma de hibridación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
- b)
- Detectar la posible hibridación de dichas secuencias diana con las sondas constitutivas de dicha plataforma de hibridación.
5. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con una sonda seleccionada entre las
secuencias SEQ ID No 1 y/o SEQ ID No 2 identifica la presencia del
virus influenza tipo A.
6. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con una sonda seleccionada entre las
secuencias SEQ ID No 3 y/o SEQ ID No 4 identifica la presencia del
virus influenza tipo B.
7. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 5 identifica la presencia del virus influenza
tipo C.
tipo C.
8. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con una sonda seleccionada entre las
secuencias SEQ ID No 6 y/o SEQ ID No 7 identifica la presencia del
virus respiratorio sincitial humano tipo A (RSVA).
9. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 8 identifica la presencia del virus respiratorio
sincitial humano tipo B (RSVB).
10. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 9 identifica la presencia del adenovirus humano.
11. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 10 identifica la presencia del virus parainfluenza humano
tipo 1 (PIV1).
12. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 11 identifica la presencia del virus parainfluenza humano
tipo 2 (PIV2).
\newpage
13. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 12 identifica la presencia del virus parainfluenza humano
tipo 3 (PIV3).
14. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 13 identifica la presencia de los virus parainfluenza
humano tipo 4A y 4B (PIV4A/4B).
15. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 14 identifica 1 a presencia de enterovirus.
16. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 15 identifica la presencia del rhinovirus.
17. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 16 identifica la presencia del coronavirus humano tipo
229E.
18. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 17 identifica la presencia del coronavirus humano tipo
OC43.
19. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 18 identifica la presencia del coronavirus causante de
SARS.
20. Un método según la reivindicación 4
caracterizado porque la hibridación de una secuencia diana
de una muestra de ensayo con la sonda correspondiente a la secuencia
SEQ ID No 19 identifica la presencia del metapneumovirus
humano.
21. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 20, en el que dicha muestra de ensayo es una
muestra sospechosa de contener uno o más virus causantes de
infección respiratoria en humanos seleccionados entre virus
influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C,
virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio
sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza
humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus
parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y
4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E,
coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome
respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y sus
mezclas.
22. Método según la reivindicación 21, en el que
dicha muestra de ensayo es una muestra biológica de origen humano o
una muestra procedente de un cultivo celular de virus.
23. Método según la reivindicación 22, en el que
dicha muestra biológica de origen humano es una muestra de un
fluido biológico o una muestra de un tejido biológico.
24. Método según la reivindicación 23, en el que
dicha muestra biológica de origen humano se selecciona entre
sangre, esputo, gargarismo, frotis faríngeo, frotis nasofaringeo y
aspirado nasofaríngeo, bronquial, traqueal o pleural.
25. Método según la cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 20, en el que dicho soporte sólido es una
membrana de nylon o una superficie de vidrio o cristal.
26. Método según la cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 20, en el que dichas sondas están dispuestas
sobre el soporte sólido en una disposición orientada.
27. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 20, en el que dichas sondas están dispuestas
sobre el soporte sólido en una disposición no orientada.
28. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 20, en el que dichas sondas están dispuestas
sobre el soporte sólido constituyendo un array.
29. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 20, en el que dicho soporte sólido es un
biochip en el que las sondas inmovilizadas están dispuestas en una
disposición orientada constituyendo un array.
30. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 20, en el que la detección de la hibridación
[etapa b)] se realiza mediante un método radiactivo.
31. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 20, en el que la detección de la hibridación
[etapa b)] se realiza mediante un método no radiactivo.
32. Método según la reivindicación 31, en el que
dicho método no radiactivo es un método fluorescente,
colorimétrico, luminiscente, bioluminiscente o
quimioluminiscente.
33. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 20, en el que, antes de realizar la etapa a),
se lleva a cabo una reacción de amplificación de los ácidos
nucleicos de dichos virus causantes de infección respiratoria en
humanos eventualmente presentes en la muestra de ensayo, utilizando
iniciadores que flanquean secuencias diana específicas de cada uno
de dichos virus causantes de infección respiratoria.
34. Método según la reivindicación 33, en el que
dicha reacción de amplificación comprende una reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) multiplex o una reacción de transcripción
inversa (RT) - PCR multiplex.
35. Un Kit para identificar virus causantes de
infecciones respiratorias en humanos seleccionados entre el virus
influenza tipo A, el virus influenza tipo B, el virus influenza tipo
C, el virus respiratorio sincitial humano tipo A (RSVA), el virus
respiratorio sincitial humano tipo B (RSVB), adenovirus humano, el
virus parainfluenza humano tipo 1 (PIV1), el virus parainfluenza
humano tipo 2 (PIV2), el virus parainfluenza humano tipo 3 (PIV3),
los virus parainfluenza humano tipo 4A y 4B (PIV4A/4B),
enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus
humano tipo OC43, coronavirus causante de SARS y metapneumovirus
humano eventualmente presentes en una muestra de ensayo
caracterizado porque comprende una plataforma de hibridación
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
36. Un Kit según la reivindicación 35
caracterizado porque comprende un conjunto de sondas
constituido por las secuencias SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No
3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8,
SEQ ID No 9, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No
13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID
No 18 y SEQ ID No 19.
37. Una sonda para identificar virus causantes
de infecciones respiratorias en humanos seleccionados entre el
virus influenza tipo A, el virus influenza tipo B, el virus
influenza tipo C, el virus respiratorio sincitial humano tipo A
(RSVA), el virus respiratorio sincitial humano tipo B (RSVB),
adenovirus humano, el virus parainfluenza humano tipo 1 (PIV1), el
virus parainfluenza humano tipo 2 (PIV2), el virus parainfluenza
humano tipo 3 (PIV3), los virus parainfluenza humano tipo 4A y 4B
(PIV4A/4B), enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E,
coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante de SARS y
metapneumovirus humano eventualmente presentes en una muestra de
ensayo caracterizada porque tiene una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID No 1, SEO
ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6, SEO ID
No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11, SEQ ID
No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ
ID No 17, SEQ ID No 18 y SEQ ID No 19.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200403083A ES2303395B1 (es) | 2004-12-24 | 2004-12-24 | Sondas y metodos para la deteccion e identificacion simultanea de multiples virus causantes de infecciones respiratorias en humanos. |
| EP09008066A EP2175038A1 (en) | 2004-12-24 | 2005-12-23 | Probes and methods for the simultaneous detection and identification of multiple viruses that cause respiratory infections in humans |
| PCT/ES2005/000704 WO2006070034A2 (es) | 2004-12-24 | 2005-12-23 | Sondas de oligonucleótidos y método para la detección e identificación del virus influenza tipo a causante de infección respiratoria en humanos |
| EP05850035A EP1837403A2 (en) | 2004-12-24 | 2005-12-23 | Probes and methods for the simultaneous detection and identification of multiple viruses that cause respiratory infections in humans |
| CNA2005800470684A CN101107366A (zh) | 2004-12-24 | 2005-12-23 | 同时检测和鉴定引起人体呼吸感染多种病毒的探针和方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200403083A ES2303395B1 (es) | 2004-12-24 | 2004-12-24 | Sondas y metodos para la deteccion e identificacion simultanea de multiples virus causantes de infecciones respiratorias en humanos. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2303395A1 true ES2303395A1 (es) | 2008-08-01 |
| ES2303395B1 ES2303395B1 (es) | 2009-05-29 |
Family
ID=36615285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200403083A Expired - Fee Related ES2303395B1 (es) | 2004-12-24 | 2004-12-24 | Sondas y metodos para la deteccion e identificacion simultanea de multiples virus causantes de infecciones respiratorias en humanos. |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1837403A2 (es) |
| CN (1) | CN101107366A (es) |
| ES (1) | ES2303395B1 (es) |
| WO (1) | WO2006070034A2 (es) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101801993A (zh) * | 2007-07-17 | 2010-08-11 | 拉瓦勒大学 | 用于扩增和检测呼吸道病毒的核酸序列 |
| CN101538618B (zh) * | 2009-04-15 | 2012-03-28 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒 |
| KR101939336B1 (ko) | 2011-02-18 | 2019-01-16 | 주식회사 엘지화학 | 호흡기 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 호흡기 바이러스 검출용 키트 |
| GB201121210D0 (en) | 2011-12-09 | 2012-01-18 | Health Prot Agency | Respiratory infection assay |
| CN103725800B (zh) * | 2014-01-15 | 2015-03-11 | 湖南圣维尔医学检验所有限公司 | 一种人腺病毒检测试剂盒 |
| CN104017901B (zh) * | 2014-03-07 | 2016-01-13 | 邓瑛 | 一种同时检测人a型、b型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的方法及试剂盒 |
| CN104059996A (zh) * | 2014-06-06 | 2014-09-24 | 深圳市疾病预防控制中心 | 同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229e和鼻病毒的试剂盒及病原体检测方法 |
| CN105018648B (zh) * | 2015-08-03 | 2018-02-13 | 博奥生物集团有限公司 | 一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用 |
| CN106053441A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-10-26 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 副流感病毒1、2、3型化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 |
| CN110408614A (zh) * | 2019-07-22 | 2019-11-05 | 深圳市人民医院 | 用于五种呼吸道病毒检测的试剂盒及其应用 |
| CN110964853B (zh) * | 2019-12-19 | 2023-06-02 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用 |
| CN111321253A (zh) * | 2020-04-26 | 2020-06-23 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法 |
| CN111575405A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-25 | 南京实践医学检验有限公司 | 一种ngs靶向探针捕获法检测呼吸道25种rna病毒的试剂盒及方法 |
| CN111808997A (zh) * | 2020-08-27 | 2020-10-23 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测10种呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法 |
| CN112662540A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-04-16 | 王安刚 | 一种医学检验新冠病毒标本检测装置 |
| CN113092414B (zh) * | 2021-04-06 | 2023-03-10 | 中国人民大学 | 一种SARS-CoV-2抗体的检测方法 |
| CN113512611B (zh) * | 2021-06-10 | 2024-06-07 | 四川华汉三创生物科技有限公司 | 一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法 |
| CN113388701A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-09-14 | 首都儿科研究所 | 引物探针组合物及其在制备副流感病毒分型检测试剂盒中的应用 |
| CN113817870B (zh) * | 2021-09-10 | 2023-12-22 | 宁波海尔施基因科技股份有限公司 | 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用 |
| CN118737290B (zh) * | 2024-06-13 | 2025-05-02 | 德诺杰亿（北京）生物科技有限公司 | 基因分析仪检测光谱的内标匹配方法、系统及设备 |
| CN120666121A (zh) * | 2025-07-25 | 2025-09-19 | 巨吉众合(北京)生物科技有限公司 | 一种引物及试剂盒、对副流感病毒i型进行分子溯源和变异分析的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997016570A1 (en) * | 1995-11-03 | 1997-05-09 | Henrickson Kelly J | Virus assay method |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6881835B2 (en) * | 2002-01-04 | 2005-04-19 | Dr. Chip Biotechnology Inc. | Detection of respiratory viruses |
-
2004
- 2004-12-24 ES ES200403083A patent/ES2303395B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-12-23 WO PCT/ES2005/000704 patent/WO2006070034A2/es not_active Ceased
- 2005-12-23 EP EP05850035A patent/EP1837403A2/en not_active Withdrawn
- 2005-12-23 EP EP09008066A patent/EP2175038A1/en not_active Withdrawn
- 2005-12-23 CN CNA2005800470684A patent/CN101107366A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997016570A1 (en) * | 1995-11-03 | 1997-05-09 | Henrickson Kelly J | Virus assay method |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| COIRAS, M.T. et al., "Simultaneous detection of fourteen respiratory viruses in clinical specimens by two multiplex reverse transcription nested-PCR assays.", J. MED. VIROL., 2004 Mar, Vol. 72, No. 3, páginas 484-495. Todo el documento. * |
| COIRAS, M.T. et al., "Simultaneous detection of influenza A, B, and C viruses, respiratory syncytial virus, and adenoviruses in clinical samples by multiplex reverse transcription nested-PCR assay.", J. MED. VIROL., 2003, Vol 69, No. 1, páginas 132-144. Todo el documento. * |
| OSIOWY, C., "Direct detection of respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, and adenovirus in clinical respiratory specimens by a multiplex reverse transcription-PCR assay.", J. CLIN. MICROBIOL., 1998, Vol. 36, No. 11, páginas 3149-54. Todo el documento. * |
| WANG, D. et al., "Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 2002, Vol. 99, No. 24, páginas 15687-92. Todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2006070034A2 (es) | 2006-07-06 |
| EP1837403A2 (en) | 2007-09-26 |
| EP2175038A1 (en) | 2010-04-14 |
| ES2303395B1 (es) | 2009-05-29 |
| WO2006070034A3 (es) | 2006-09-14 |
| CN101107366A (zh) | 2008-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2303395B1 (es) | Sondas y metodos para la deteccion e identificacion simultanea de multiples virus causantes de infecciones respiratorias en humanos. | |
| TWI410491B (zh) | 眼睛與中樞神經系統之細菌、黴菌、寄生蟲及病毒感染之新穎同步檢測及鑑別方法 | |
| US6881835B2 (en) | Detection of respiratory viruses | |
| ES2970603T3 (es) | Métodos para la detección específica y sensible del SARS-CoV-2 | |
| US20100279273A1 (en) | Nucleic acid sequences for the amplification and detection of respiratory viruses | |
| CN111378789A (zh) | 一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒 | |
| US20070042350A1 (en) | Methods and compositions for detecting sars virus and other infectious agents | |
| ES2271617T3 (es) | Metodo de hibridacion-amplificacion para detectar y tipificar virus papiloma humano. | |
| BRPI0809958B1 (pt) | conjunto de esferas para a detecção de uma cepa de hpv e/ou para diferenciação entre duas ou mais cepas de hpv, método para a preparação do referido conjunto de esferas, método para o diagnóstico de infecção por hpv, método para determinação do risco de um indivíduo humano desenvolver 5 uma doença associada a uma ou mais cepas de hpv e par de iniciadores para amplificação de oligonucleotídeo direcionado ao hpv oncogênico | |
| JP2003529376A (ja) | Ｐｎａプローブを使用するヒトパピローマウイルスの検出およびタイピング | |
| CN113508182A (zh) | 用于检测人乳头状瘤病毒(hpv)的测定 | |
| CA2567793A1 (en) | Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1 | |
| JP5156726B2 (ja) | ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および区別 | |
| US10669591B2 (en) | Selective detection of Haemophilus influenzae | |
| JP2020533974A (ja) | 呼吸器合胞体ウイルス種のニッキング及び伸長増幅反応（ｎｅａｒ） | |
| Li et al. | Highly sensitive and specific diagnosis of coronavirus disease 19 (COVID-19) by reverse transcription multiple cross displacement amplification-labelled nanoparticles biosensor | |
| US20070037140A1 (en) | Methods and compositions for detecting sars virus | |
| US20220333215A1 (en) | Methods and compositions for detecting co-infection with sars-cov-2 and influenza a virus and/or influenza b virus | |
| Wang et al. | Development of a gold nanoparticle-based oligonucleotide microarray for simultaneous detection of seven swine viruses | |
| KR102435209B1 (ko) | 인플루엔자 a형 및 b형 바이러스와 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스를 구별하여 동시에 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| JP2000511777A (ja) | クラミジア・ニューモニエ検出用核酸プライマーおよびプローブ | |
| CN100412207C (zh) | 一种动物源细菌磺胺类药物耐药基因多重pcr检测技术 | |
| JP5501220B2 (ja) | 特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のためのペプチド核酸プローブ | |
| US20030219757A1 (en) | IS6110 based molecular detection of Mycobacterium tuberculosis | |
| US20040009574A1 (en) | Compositions and methods for detecting streptococcus agalactiae capsular polysaccharide synthesis genes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20080801 Kind code of ref document: A1 |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20180809 |