ES2303568T3 - Composicion para el control y la estimulacion inmunitarios que comprende fragmentos de adn cromosomico bacteriano y lipopolisacaridos no toxicos. - Google Patents

Abstract

Composición para el control inmunitario que comprende: a) fragmentos de ADN bacteriano en los que los fragmentos de ADN oscilan desde 2,0 hasta 0,5 kb y están libres de endotoxina; y b) lipopolisacáridos de E. coli, en los que el lípido A de los lipopolisacáridos se degrada mediante tratamiento con álcali y el peso molecular de los lipopolisacáridos es de desde 5.000 hasta 10.000 Dalton.

Description

Composición para el control y la estimulación inmunitarios que comprende fragmentos de ADN cromosómico bacteriano y lipopolisacáridos no tóxicos.

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Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición para el control y la estimulación inmunitarios que comprende fragmentos de ADN cromosómico bacteriano y lipopolisacáridos no tóxicos.

Técnica anterior

El tratamiento contra el cáncer desarrollado desde los años 1960 ha implicado en su mayor parte el uso de cirugía, radioterapia y quimioterapia. Estos tratamientos han demostrado el efecto de que la curva ascendente de la tasa de mortalidad por cáncer alcanzada en 1973 en los EE.UU. se vuelve menos pronunciada. Sin embargo, la cirugía y la radioterapia son tratamientos tópicos y por tanto tienen la limitación de que los pacientes sólo se recuperan favorablemente cuando se detiene tempranamente el avance del cáncer como cáncer local. La quimioterapia es satisfactoria sólo si todas las células cancerosas se eliminan completamente y por tanto la quimioterapia puede dañar el tejido normal del huésped tal como el sistema inmunitario de los pacientes y poner en peligro la vida de personas ancianas y débiles. El fin principal de la inmunoterapia es resistir a la cancerización reforzando la vigilancia inmunitaria. Tal como sigue, hay varios ensayos.

1) Prevención inmunológica

Un animal de la misma clase se inoculó con tejido canceroso para prevenir el cáncer homólogo. Por ejemplo, la leucemia viral de un animal puede prevenirse usando el virus que la provoca (Morton et al. 1991, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2: 492:494). Sin embargo, este método nunca se ha aplicado a una persona y es difícil inducir la inmunidad celular.

2) Inmunoterapia \sqbullet Inmunización activa específica

Esta inmunización es para evitar que las células cancerosas activen células supervisoras de cáncer inmunitarias específicas inoculando los pacientes con células autocancerosas o células cancerosas homólogas o células auto o isocancerosas inactivadas reguladas por irradiación de rayos X o mitomicina C. Sin embargo, este método tuvo éxito en un experimento con animales pero no con seres humanos. Recientemente, con el fin de potenciar la expresión de antígenos específicos en el tejido canceroso, diversos métodos han consistido en unir con Con-A o exponer antígenos ocultos tratando con neuraminidasa o en formar hibridomas con células heterólogas. Sin embargo, el uso de células dendríticas (Sprinzl et al, Cancer Treat Rev. agosto de 2001; 27(4): 247-55) o el desarrollo de otros diversos tratamientos con vacunas de ADN (Pantuck et al, Int J Urol. julio de 2001; 8(7): S1-4) todavía están limitados en cuanto a su seguridad y efecto.

\sqbullet Inmunoterapia no específica

Esta inmunización, la más destacada actualmente, se usa sola o con agentes quimioterápicos para tratar casi todos los tipos de tumores. La inmunoterapia no específica significa que no estará restringida por los tipos de cáncer. Aunque se han sugerido diversas teorías sobre su mecanismo, sólo están en estudio y se sugiere que la inmunoterapia no específica estimula específicamente la actividad del sistema reticuloendotelial de linfocitos. Actualmente se usa Corynebacterium como el material principal en pruebas clínicas. Picibanil (OK-432), que ya se ha usado para pacientes en Corea, se ha estudiado y producido principalmente en una empresa farmacéutica japonesa. Se ha comercializado en Japón, Corea o el sureste de Asia. Los materiales formados de Picibanil se habían usado para tratar el cáncer mucho antes. En 1968, Bush Fehleison et al., Alemania, descubrieron que cesaba la progresión del cáncer o que disminuía el cáncer existente previamente. En 1891, Coley, cirujano en Chicago, EE.UU., preparó una toxina mixta formada de materiales extraídos de medio de cultivo de estreptococos, que se usó para muchos pacientes.

\sqbullet BCG (o bacilo tuberculoso) y material asociado del mismo

Microorganismo BCG vivo: En los años 60, Old en los EE.UU. y Mathe en Francia notificaron que podía curarse el cáncer de un animal inoculando BCG. En 1970, Morton en los EE.UU. notificó que también podía curarse un melanoma inoculando BCG. Como resultado, BCG y sus materiales asociados se usaron ampliamente como inmunoterapia no específica. Se requiere una gran cantidad de inoculación de BCG para esperar un aumento de la respuesta inmunitaria. BCG puede inocularse bajo la piel, directamente en la región de tejido canceroso o administrarse por vía oral. Sin embargo, la administración oral de BCG no es eficaz para personas que fueron inoculadas con BCG en sus días neonatales pero entraron en contacto con el bacilo tuberculoso después (el BCG o bacilo tuberculoso no se absorben en personas que tienen resultado positivo para tuberculina). En el tratamiento usando un microorganismo BCG vivo, hay efectos secundarios tales como requerir una gran cantidad de microorganismo BCG vivo y la ulceración alrededor de la inyección, síntomas sistémicos tales como escalofríos, fiebre o trastorno de la función hepática. Sin embargo, en el caso de usar una pequeña cantidad para disminuir los efectos secundarios, se reduce o se debilita la eficacia.

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\sqbullet ADN con CpG no metilado

El ADN de mamíferos es diferente del ADN bacteriano porque tiene muchas inhibiciones de CpG y la citosina del dinucleótido CpG está metilada de manera selectiva. Recientemente, se ha reconocido que los motivos CpG en ADN bacteriano estimulaban rápidamente las células B policlonales y así aumentaban la secreción de IgM, y detenían la evolución del ciclo celular mediante el anticuerpo anti-IgM e inhibían fuertemente la inducción de apoptosis para inhibir la expresión de c-myc y hacían aumentar la expresión de ARNm de myn, blc2 y bcl-XL para proteger la células frente a la apoptosis. En otro estudio, se notificó que los motivos CpG activaban directamente las células B para aumentar la secreción de IL-6 y IL-12 dentro de un tiempo corto. La empresa CPG en América está realizando una prueba clínica sobre adyuvantes inmunitarios y tratamientos asmáticos usando oligonucleótidos de síntesis incluyendo secuencias CpG.

Tal como se describió anteriormente, aunque se han desarrollado tratamientos usando diversos materiales de regulación inmunitaria, de entre estos tratamientos BCG y CpG acaban de aplicarse a personas. A pesar de los amplios efectos de BCG, es difícil aplicar una gran cantidad de BCG o mediante inyección sanguínea debido a su estabilidad. En el caso de CpG, los oligonucleótidos sintéticos son demasiado caros.

Con respecto al trabajo de investigación actual que está llevándose a cabo, esto puede tipificarse mediante el trabajo de Jian Jun Gao, Qiao Xue, Christopher J Papasian y David C Morrison, tal como se detalla en su artículo de 2001 publicado en The American Association of Immunologists y titulado Bacterial DNA and Lipopolysaccharide Induced Synergistic Production of TNF-\alpha Through A Post Transcriptional Mechanism. En este artículo, describen el uso de ADN bacteriano con una concentración inferior a la umbral de LPS para inducir TNF-\alpha en una línea celular de tipo macrófago. Son específicos porque es el efecto sinérgico del LPS y ADN y el efecto que esto tiene sobre la secreción o inducción sobre TNF-\alpha lo que es importante.

Este trabajo es una continuación del trabajo detallado en un artículo de Jian Jun Gao, Eleanor G Zuvanich, Qiao Xue, David L Horn, Richard Silverstein y David C Morrison publicado en The American Association of Immunologists Magazine en 1999 y titulado Cutting Edge: Bacterial DNA y LPS Act in Synergy in Inducing Nitric Oxide Production in RAW 264.7 Macrophages. Este artículo da a conocer la sinergia de LPS y ADN bacteriano en la inducción de óxido nítrico en macrófagos y especula con su uso potencial.

Además, se presta atención a un artículo de Ae-Kyung Yi, Jae-Geun Yoon, Soon-Cheol Hong, Thomas W Redford y Arthur M Krieg publicado en la Japanese Society of Immunology en el volumen 13, nº 11, páginas 1391 a 1404 y titulado Lipopolysaccharide and CpG DNA synergise for tumor necrosis factor-\alpha production through activation of NF-kB. Este artículo describe motivos CPG no metilados en ADN bacteriano (ADN con CpG) que motiva respuestas inmunitarias innatas para el huésped de manera sinérgica con otros productos microbianos, tales como endotoxinas y puede contribuir a la patogénesis de una enfermedad a través de la productividad excesiva de citocinas proinflamatorias. En particular, el factor de necrosis tumoral (TNF)-\alpha derivado de monocitos es un mediador importante de enfermedades y esto se investiga con un efecto sinérgico con lipopolisacárido (LPS) para inducir la biosíntesis de TNF-\alpha. De nuevo es en el efecto sinérgico en lo que se centra principalmente este artículo.

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Descripción detallada de la invención

Por consiguiente, el objeto de la presente invención es proporcionar materiales para inducir una respuesta inmunitaria más estable, económica, eficaz y específica que las convencionales.

Se proporciona una composición para el control inmunitario que comprende a) fragmentos de ADN bacteriano en los que los fragmentos de ADN oscilan desde 2,0 hasta 0,5 kb y están libres de endotoxina, y b) lipopolisacáridos de E. coli, en los que el lípido A de los lipopolisacáridos se degrada mediante tratamiento con álcali y el peso molecular de los lipopolisacáridos es desde 5.000 hasta 10.000 Dalton.

La secuencia de ADN bacteriano incluye no sólo bases no modificadas sino también modificadas como una base metilada (citosina, adenina o guanina).

Es preferible que pueda mezclarse la menor cantidad posible de los fragmentos de ADN cromosómico bacteriano y los lipopolisacáridos para mostrar el efecto de la presente invención. Particularmente, la presente invención muestra el aumento de la eficacia dependiente de la dosis en una razón en masa que oscila desde 500:1 hasta 1:500. En la razón en masa descrita anteriormente, la presente invención es no tóxica y económica.

Es preferible que los fragmentos de ADN cromosómico bacteriano y los lipopolisacáridos se mezclen mediante agitación.

La composición de la presente invención es útil para adyuvantes inmunitarios o tratamientos anticancerígenos. Estos efectos se muestran induciendo la activación inmunitaria de células T cooperadoras de tipo 1.

Es preferible que la bacteria en la presente invención sea Escherichia coli o una micobacteria. Más preferiblemente, la bacteria es Escherichia coli, particularmente, E. coli EG0021 (KCCM-10374).

En la composición de la presente invención, puede esperarse un efecto sinérgico por CIA02 en la estabilidad, inducción inmunitaria celular, puede esperarse un efecto sinérgico por CIA05 en el refuerzo inmunitario, específicamente para el tratamiento contra el cáncer.

La composición dada a conocer para el control y la estimulación inmunitarios que comprende fragmentos de ADN cromosómico bacteriano y lipopolisacáridos no tóxicos se describirá brevemente.

Los presentes inventores tuvieron éxito en la producción eficaz de oligonucleótidos bacterianos como adyuvante anticancerígeno y en el desarrollo de lipopolisacáridos modificados para la activación adecuada como tratamientos anticancerígenos. Se obtiene finalmente un nuevo adyuvante inmunitario, CIA07, combinando los oligonucleótidos bacterianos y los lipopolisacáridos.

Generalmente, la combinación de lipopolisacárido y ADN muestra un efecto sinérgico. El lipopolisacárido muestra diversas respuestas tales como que sirve como antígeno independiente de células de T. En este caso, el efecto sinérgico puede producir resultados cruciales tales como septicemia.

Los presentes inventores obtuvieron una cepa, E. coli EG0021, que tiene el lipopolisacárido de cadena corta de hidratos de carbono de Escherichia coli en intestinos humanos sanos. Depositaron la cepa con el nº KCCM 10374 en el Centro coreano de cultivo de microorganismos, KCCM, ubicado en 361-221 Hongjedong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea, el 2 de mayo de 2002. Establecieron un método de purificación del lipopolisacárido a partir de esta cepa.

Se aisló ADN de E. coli, CIA02, que representa la activación inmunitaria a partir de ADN genómico de E. coli EG0021. Se obtuvo CIA02 tras la fragmentación del ADN aislado y el tratamiento general.

Se obtuvo finalmente CIA07 mediante combinación de CIA02 y CIA05.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una imagen que ilustra ADN cromosómico de E. coli dividido en cada fracción usando ultrasonicación para detectar el tamaño del ADN de E. coli que representa el efecto óptimo, en la que el carril 1 representa el ADN intacto, el carril 2 el ADN superior a 1 kb, el carril 3 el ADN de 2-0,5 kb y el carril 4 el ADN inferior a 0,5 kb.

Las figuras 2a a 2c son gráficas que ilustran el efecto de aumento inmunitario óptimo en ADN de E. coli (CIA02) de aproximadamente 2-0,5 kb.

La figura 3 es una imagen que ilustra el producto de lipopolisacárido aislado a partir de la membrana externa de
E. coli. La imagen ilustra el lipopolisacárido aislado según un lote de 5 veces.

La figura 4 es una imagen que ilustra que el tamaño del lipopolisacárido de E. coli aislado tratado con álcali cambia al degradar el lípido A y pierde toxicidad mediante este tratamiento, en la que el carril 1 representa el producto de lipopolisacárido aislado CIA04 y el carril 2 el lipopolisacárido no tóxico tratado con álcali CIA05.

La figura 5 es una gráfica que ilustra la disminución de la secreción de TNF-\alpha en una línea celular THP-1 tratada con el lipopolisacárido no tóxico (CIA05).

La figura 6a es una gráfica que ilustra los resultados de la prueba de seguridad general sobre el lipopolisacárido no tóxico (CIA05) en ratón.

La figura 6b es una gráfica que ilustra los resultados de la prueba de seguridad general sobre el lipopolisacárido no tóxico (CIA05) en cobaya.

Las figuras 7a a 7c son gráficas que ilustran el efecto de aumento inmunitario según el método de combinación y la concentración de ADN de E. coli (CIA02) y lipopolisacárido no tóxico (CIA05).

Las figuras 8a a 8c son gráficas que ilustran los efectos de aumento inmunitario de CIA07 derivado de E. coli en comparación con otros adyuvantes inmunitarios.

La figura 9 es una gráfica que ilustra la secreción de citocina en sangre completa humana tratada con CIA07 para tratamiento anticancerígeno derivado de E. coli.

Las figuras 10a a 10b son gráficas que ilustran la cantidad de secreción de citocina en sangre completa humana tratada con CIA07 para tratamiento anticancerígeno derivado de E. coli y ADN de Mycobacterium.

Las figuras 11a a 11b son gráficas que ilustran el aumento de la actividad de promotor mediante la activación de NF-kB tras el tratamiento con CIA07 para tratamiento anticancerígeno derivado de E. coli en células sin tratar.

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La figura 12 es una gráfica que ilustra la inhibición del crecimiento cancerígeno cuando se administra CIA07 para tratamiento anticancerígeno derivado de E. coli en un ratón C3H/HeJ al que se le trasplantó línea celular de cáncer de vejiga de ratón (MBT2).

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Realizaciones preferidas de la presente invención

La composición dada a conocer para el control y la estimulación inmunitarios que comprende fragmentos de ADN cromosómico bacteriano y lipopolisacáridos no tóxicos se describirá con más detalle en referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitativos.

Ejemplo 1

Obtención de cepa no tóxica Seleccionar y aislar E. coli mutante que tiene lipopolisacárido de cadena corta de hidratos de carbono

Se aisló E. coli EG0021 que tiene lipopolisacárido de cadena corta de hidratos de carbono a partir de intestinos humanos sanos y se estableció un método de purificación del lipopolisacárido a partir de la cepa.

Se repitió 5 veces un procedimiento de inyectar una colonia individual cultivada en líquido de E. coli aislada a partir de intestinos de machos adultos sanos, en animal experimental, ratón Balb/C.

Se seleccionaron en el mismo 50 tipos de cepas y se obtuvo una colonia en las 50 cepas seleccionadas a partir de una placa. Tras disolver la colonia en 4 ml de solución salina fisiológica al 0,9%, se llevó 1 ml de la disolución a un tubo Eppendorf. Se trató la disolución con 2 \mul de ADNasa I y se hicieron reaccionar en una incubadora a 37ºC durante 1 hora. Tras el tratamiento de ADNasa I, se trató la disolución con 50 \mul de ARNasa (10 mg/ml) y se hizo reaccionar en una incubadora de 37ºC durante 1 hora. Entonces, se colocaron 100 \mul de proteinasa K (20 mg/ml) en la misma y se hicieron reaccionar a 37ºC durante la noche. Se trató una línea celular de linfocitos humanos diferenciada mediante GM-CSF con LPS de cada cepa obtenida a partir de la misma. Se midió la secreción de TNF-\alpha y se seleccionó una cepa que tenía el menor valor (véase la tabla 1) y se confirmó el peso molecular del lipopolisacárido mediante electroforesis. Se demostró que la cepa atenuada no cambiaba morfológicamente ni en sus características. Los lipopolisacáridos que tenían un peso molecular que oscilaba desde 5.000 hasta 10.000 sin marcador de tamaño molecular de lipopolisacárido que tenía un peso molecular que oscilaba desde 50.000 hasta 100.000 se mostraron en electroforesis (véase la figura 1). Esta cepa se denominó EG0021.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Valor de secreción de TNF-\alpha de homogeneizado de E. coli obtenido a partir de intestinos humanos sanos

1

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Ejemplo 2

Método de preparación de ADN de E. coli Purificación del ADN cromosómico de E. coli

Se cultivó E. coli EG0021 mediante agitación en medio de cultivo TSB (caldo de tripticasa y soja; Difco) (30 g/l) a 37ºC durante 10 horas.

Tras 10 l de cultivo, se lavaron 150 g de células obtenidas mediante centrifugación a 8.000 g en disolución tampón TE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 25 mM) (300 ml) y se centrifugaron. Las células (150 g) obtenidas mediante centrifugación se disolvieron en 750 ml de disolución de lisis (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 25 mM, lisozima 100 \mug/ml) y se trataron a 37ºC durante 1 hora.

Después, se añadió proteinasa K (Sigma) a la disolución hasta una concentración final de 100 \mug/ml y se trató a 50ºC durante 12 horas.

Se repitió tres veces el mezclado de la disolución con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) a una razón de 1:1 para obtener una fase acuosa.

Se obtuvo ADN cromosómico de E. coli mediante precipitación con etanol.

Tras diluir ADN de E. coli purificado usando agua destilada estéril, se midió la concentración del ADN de E. coli a 260 nm y 280 nm con un espectrómetro UV.

Se midió la concentración según el siguiente método:

Concentración de ADN bicatenario (\mug/ml) = DO a 260 nm X tasa de dilución X 50

Concentración de ADN monocatenario (\mug/ml) = DO a 260 nm X tasa de dilución X 40

DO a 260 nm/DO a 280 nm = 1,7 - 1,8

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Fragmentación del ADN de E. coli

Se disolvió el ADN cromosómico de E. coli purificado en disolución tampón TE hasta 0,5 mg/ml y se sonicó en un vaso de precipitados de vidrio con un ultrasonicador.

- Se fragmentaron 20 ml de la disolución de una vez usando un equipo VCX500 de sonicación a 500 vatios (Sonics Co.) como ultrasonicador y 630-0220 (diámetro de punta: 1/2'' (13 mm)) como punta.

- En este caso, con el fin de identificar el tamaño del ADN de E. coli que representa el efecto óptimo, se dividió todo el ADN cromosómico de E. coli en 20.000 J según un periodo de tiempo usando un ultrasonicador y entonces se separó por tamaño (véase la figura 1). Se dividió el ADN de E. coli en el ADN completo antes de la sonicación (intacto, más de 10 kb), 2,0\sim0,5 kb, 0,5\sim0,1 kb y menos de 0,1 kb según su tamaño.

- Con el fin de identificar los efectos de aumento inmunitario del ADN de E. coli separado según el tamaño, se midió el efecto como adyuvante inmunitario en ratón (véase la figura 2). Se inyectaron (i.p.) 50 \mug de HEL (Sigma) como antígeno y 50 \mug de cada ADN de E. coli como adyuvante en ratón ICR (un macho de 4 semanas de edad, 20 g) dos veces a un intervalo de una semana. Siete días tras la inyección final, se recogió la sangre completa y se separó el suero. Se midió el valor de anticuerpo en suero con HEL como antígeno usando el método ELISA (véase la figura 2a).

Como resultados del análisis, el tamaño de 2,0\sim0,5 kb mostró el mayor valor de anticuerpo. Después, a partir de experimentos repetidos, se demostró que aproximadamente 1 kb representaba el efecto óptimo.

Se identificaron los efectos de la inmunidad humoral y celular en la subclase de anticuerpo en suero con el mismo método ELISA (véanse las figuras 2b y 2c).

La condición de sonicación durante la obtención de ADN de E. coli de 1 kb determinada según el resultado anterior son 7 minutos en 20.000 J.

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Ejemplo 3

Eliminación de la endotoxina del ADN de E. coli y medición de la pureza de ADN Eliminación de la endotoxina

Tras la sonicación, se hizo reaccionar el ADN con cloroformo a 4ºC durante 12 horas y se trataron tres volúmenes de etanol en el mismo para obtener un precipitado.

Se trató el precipitado con Triton X-114 (Sigma) hasta el 0,5% de concentración final. Se hizo reaccionar el precipitado resultante a 4ºC durante 4 horas, se calentó a 37ºC durante 5 minutos y entonces se mezcló con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) a una razón de 1:1 para obtener una fase acuosa.

El ADN de E. coli obtenido se hizo precipitar con etanol y se disolvió en agua libre de pirógeno.

Se analizó el ADN al que se le había eliminado endotoxina con el kit Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (BioWhittaker QCL-1000) para detectar la endotoxina restante.

La tabla 1 muestra el valor de endotoxina y el rendimiento de ADN de E. coli purificado (CIA02) tras la eliminación de la endotoxina según el método anterior.

TABLA 2 Valor de la endotoxina y rendimiento de ADN de E. coli purificado (CIA02)

2

- Se midió la cantidad de disolvente orgánico restante con CG/DSM (cromatografía de gases/detector selectivo de masas), HP-5890A/HP-5870B. Se midieron el etanol, la acetona, el cloroformo y el fenol con SIM (Monitorización de iones seleccionados) que tenía la columna de 50 m ultra-1 (véase la tabla 2).

TABLA 3 Cantidad de disolvente orgánico restante

3

- Se identificó un grado de pureza superior al 99% midiendo la contaminación de proteínas por mg de ADN de E. coli con el método de Bradford.

Ejemplo 4

Purificación del lipopolisacárido (CIA04) de E. coli mutante Purificación del lipopolisacárido de E. coli mutante

Se preparó E. coli con el mismo método que el método de aislamiento de ADN descrito anteriormente.

Se mezcló la E. coli preparada con 2 volúmenes de etanol del mismo y se centrifugó a 4.000 g para obtener un precipitado. Se añadieron 1,5 volúmenes de acetona del precipitado, se mezclaron y entonces se centrifugaron a

\hbox{4.000 g.}

Se añadió la misma cantidad de etil éter y se mezcló en el precipitado resultante, y entonces se centrifugó a

\hbox{4.000 g.}

El sedimento celular obtenido a partir del mismo se cubrió con papel de aluminio y se perforó el papel y se secó para medir la masa celular. Después, se añadieron 7,5 ml de mezcla de extracción (el 90% de fenol: cloroformo: éter de petróleo = 2:5:8) por 1 g de peso seco celular.

Se dividió la disolución resultante en un tubo de centrífuga de vidrio y se centrifugó a 25ºC, 3.000 rpm

\hbox{(1.200 g)}

durante 20 minutos para obtener un sobrenadante. Se dejó el sobrenadante en una campana extractora durante 12 horas. Entonces, se dividió la disolución en un tubo de centrífuga de vidrio y se disolvieron los lipopolisacáridos en etil éter mediante centrifugación a 25ºC, 3.000 rpm (1.200 g) durante 20 minutos, y después se transfirieron a un tubo Eppendorf. Se secó la disolución en una campana extractora y se midió el peso seco con equilibrio químico. Entonces, se añadió etanol a la misma y se almacenó antes de su uso.

Tras eliminar completamente el etanol en el lipopolisacárido de E. coli purificado almacenado en etanol, se midió la cantidad de KDO (2-ceto-3-desoxioctonato) en lipopolisacárido con patrón de lipopolisacárido (Lsit Biological Lab.). Tras medir la concentración a partir del patrón, se analizaron los lipopolisacáridos con SDS-PAGE según el tamaño y se identificaron mediante tinción con plata (véase la figura 3). El lipopolisacárido tenía un peso molecular que oscilaba desde aproximadamente 5.000 hasta 10.000 y su tamaño era muy pequeño en comparación con el lipopolisacárido de E. coli general.

Ejemplo 5

Eliminación de la toxicidad en el lipopolisacárido purificado a partir de E. coli mutante Eliminación de la toxicidad en el lipopolisacárido mediante degradación del lípido A

Se diluyeron los lipopolisacáridos de E. coli purificados hasta 3 mg/ml de concentración y se mezclaron con NaOH 0,2 N a una razón de 1:1. Se agitó la disolución resultante cada 10 minutos a 60ºC y se desaciló durante 140 minutos.

- Se añadieron aproximadamente 1/5 volúmenes de NaOH 0,2 N inicial de ácido acético 1 N a la disolución resultante para ajustar a pH 7,0.

- Tras el ajuste de pH, se obtuvo lipopolisacárido no tóxico precipitado en etanol.

- Tras medir la concentración de lipopolisacárido no tóxico con el método KDO, se identificó su cambio de tamaño mediante SDS-PAGE y tinción con plata en comparación con el lipopolisacárido antes del tratamiento.

- Como resultado de la tinción, se demostró que el lípido A del lipopolisacárido se degradó mediante tratamiento con álcali y el tamaño del lipopolisacárido se volvía más pequeño (véase la figura 4).

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Confirmación de la eliminación de la toxicidad del lipopolisacárido no tóxico

Con el fin de someter a prueba la estabilidad del lipopolisacárido no tóxico, se realizaron experimentos sobre la secreción, pirogenicidad y toxicidad anómala de las proteínas inflamatorias.

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- Experimento sobre la secreción de proteína inflamatoria

Se trató THP-1 (leucemia monocítica aguda) con lipopolisacárido no tóxico con una concentración de alta a baja para medir la cantidad de TNF-\alpha secretado en comparación con el grupo control de lipopolisacárido purificado.

Mientras se secretaban 5 pg de TNF-\alpha en 1 \mug de lipopolisacárido en el grupo control, se secretaban 0,1 pg de TNF-\alpha en 1 \mug de lipopolisacárido no tóxico. En este caso, se demostró que la reacción inflamatoria inducida por toxicidad disminuía en 50 veces. Adicionalmente, se demostró que la cantidad de TNF-\alpha secretada en el ADN de E. coli era inferior a 100 pg. Como resultado, el lipopolisacárido no tóxico demostró ser un material muy seguro (véase la figura 5).

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- Experimento sobre prueba de seguridad general

Se inyectó la muestra de dosis alta en más de dos tipos de roedores para observar un cambio de peso anómalo.

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A. Experimento en cobaya

Aproximadamente 350 g de una muestra de cobaya no mostraron ninguna anomalía y ganaron peso gradualmente cuando se observaron durante más de 5 días antes de su uso.

Se usaron los 5 ml de muestra por cobaya.

Se inyectó (i.p.) la muestra una vez en más de dos cobayas y se observaron durante más de 5 días.

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B. Experimento en ratón

Un ratón de aproximadamente 5 semanas no mostró ninguna anomalía y ganó peso gradualmente cuando se observó durante más de 5 días antes de su uso.

Se inyectó (i.p.) la muestra una vez en más de dos ratones y se observaron durante más de 7 días.

La muestra demostró ser adecuada en este experimento cuando un animal no mostró ninguna anomalía durante el periodo de observación.

Como resultado experimental, no se observó ningún cambio de peso anómalo tras la inyección de la muestra (véase la figura 6a).

- Experimento de pirogenicidad

Tras inyectar la vacuna en tres conejos, se observó un cambio en la temperatura rectal. Se inyectaron los 0,2 \mug/ml de muestra por 1 kg de conejo en la vena de la oreja del conejo. Entonces, se midió el cambio en la temperatura anómala insertando un termómetro en el recto.

En este caso, el peso de los conejos era superior a 1,5 kg. Volvieron a usarse los conejos más de 3 días tras haber sido usados en los experimentos. Se midió la temperatura corporal con un aparato que medía la temperatura hasta 0,1ºC. Se esterilizaron por calor un inyector y su aguja a 250ºC durante más de 30 minutos. Sólo se alimentó agua desde 16 horas antes de su uso hasta la finalización del experimento. Se fijaron los animales menos fuerte de lo posible.

Se midió la temperatura corporal insertando el termómetro en el recto hasta una profundidad constante que oscilaba desde 60 hasta 90mm durante un tiempo constante. Se definió la temperatura medida antes de la inyección como una temperatura control. Se inyectó la muestra calentada a 37ºC en la vena de la oreja en el plazo de aproximadamente 15 minutos tras medir el control. Se midió la temperatura corporal cada 3 horas, al menos 1 hora, tras la inyección. Se definió la separación entre la temperatura control y la temperatura de muestra como la diferencia en la temperatura. Se definió el valor máximo de la diferencia en la temperatura como la reacción pirógena de los animales experimentales. En este caso, se usaron las muestras de tres animales.

El experimento con material pirogénico era negativo cuando el total de los tres animales estaban por debajo de 1,3ºC mientras que era positivo cuando estaban por encima de 2,5ºC. Se realizaron estos experimentos tres veces, y la reacción negativa era adecuada durante estos experimentos con material pirogénico.

Los resultados se muestran en la tabla 4.

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4

Ejemplo 6

Combinar un fragmento de ADN de E. coli (CIA02) y lipopolisacárido no tóxico (CIA05) e identificar la actividad Combinar un fragmento de ADN de E. coli (CIA02) y lipopolisacárido no tóxico (CIA05)

Se mezclaron el ADN de E. coli (CIA02) y el lipopolisacárido no tóxico (CIA05) preparados según cada método convencional para determinar el método y la dosis de mezclado óptimos.

Con el fin de identificar el cambio en el efecto según el método de mezclado, se trató el antígeno con dos materiales químicos diferentes (MPBH y SPB) durante la unión. Se combinaron CIA02 y CIA05 con el antígeno modificado. De otra manera, se mezclaron y se agitaron CIA02, CIA05 y el antígeno. Adicionalmente, se analizaron los efectos en el aumento inmunitario en cada dosis. Con el fin de identificar el efecto del adyuvante inmunitario en ratón, se inyectaron (i.p.) 0,1 ml de 50 \mug de HEL (Sigma) como antígeno en ratón ICR (un macho de 4 semanas de edad, 20 g) dos veces al intervalo de una semana. Siete días tras la inyección final, se recogió la sangre completa y se separó el suero de la misma. Se analizó el valor de anticuerpo en suero usando HEL como antígeno mediante el método ELISA (véase la figura 7a).

El grupo control era 0,5 y 1 \mug de LPS (CIA04) mientras que el grupo experimental era antígeno, 0,5 \mug de CIA05 y 50 \mug de CIA, consistiendo el grupo de mezclado con agitación en antígeno 1 \mug de CIA05 y 50 \mug de CIA, antígeno modificado, 0,5 \mug de CIA05 y 50 \mug de CIA, consistiendo el grupo de combinación en antígeno modificado, 1 \mug de CIA05 y 50 \mug de CIA, respectivamente.

Como resultado experimental, se demostró que LPS (CIA04) representaba la mayor actividad de anticuerpo pero no era adecuado para un adyuvante anticancerígeno debido a los efectos secundarios de toxicidad (véase la figura 7a). Aunque la combinación de métodos hacía poca diferencia, un método de mezclado con agitación era muy superior a los otros métodos. Particularmente, se demostró que el método de mezclado con agitación era eficaz porque mostraba una diferencia en la IgG2a relacionada con la inmunidad celular entre la subclase de inmunoglobulina (véase la figura 7b). En rendimiento, el método de mezclado con agitación era simple y no tenía ninguna pérdida durante los procedimientos de tratamiento. Como resultado, se seleccionó el método de mezclado con agitación. Se determinó la dosis según la cantidad de CIA05. La dosis de 1 \mug mostró una eficacia muy superior a la de 0,5 \mug. Como resultado, se determinó la dosis de 1 \mug.

Se analizaron los efectos de la inmunidad humoral y celular en la subclase de anticuerpo en suero con el método ELISA.

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Experimento comparado con el adyuvante inmunitario convencional

Con el fin de someter a prueba los efectos de aumento inmunitario de la dosis y del método de preparación determinados, se realizó un experimento en comparación con los del adyuvante inmunitario convencional (véase la
figura 8a).

Se analizó la aplicabilidad para CIA07 como adyuvante inmunitario mediante experimentos en animales. Se inyectó (i.p.) 0,1 ml de 50 \mug de HEL (Sigma L-6876) como antígeno en ratón ICR (un macho de 4 semanas de edad, 20 g) dos veces a los intervalos de una semana. Siete días tras la inyección final, se recogió la sangre completa y se separó el suero de la misma. Se analizó la actividad de anticuerpo en suero con HEL como antígeno usando el método ELISA.

Se demostró que la actividad de anticuerpo de CIA07 representaba el mismo efecto de CFA (adyuvante completo de Freund), el adyuvante inmunitario convencional para un experimento en animales, y Alum (gel de hidróxido de aluminio) sólo autorizado para su uso en seres humanos (véase la figura 8a). Sin embargo, como resultado de analizar el cambio de isotipo, se demostró que los adyuvantes inmunitarios convencionales tales como CFA y Alum activaron las inmunización de las células Th (T cooperadoras) de tipo 2 en la que se producían principalmente anticuerpos de IgG1 mientras que CIA07 inducía la activación inmunitaria de las células Th (T cooperadoras) de tipo 1 en la que se producían específicamente los anticuerpos de IgG2a más que de IgG1 (véanse las figuras 8b y 8c).

Con el fin de identificar la dosis de CIA02, se mezcló 1 \mug de CIA05 en 25 \mug y 50 \mug de CIA02, respectivamente. Como resultado del análisis, se demostró que cambiaba la actividad de anticuerpo según la dosis. Por consiguiente, se determinaron 50 \mug de CIA02 y l \mug de CIA05 para la dosis óptima.

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Experimento de identificación de la actividad de CIA con análisis de sangre completa

Se obtuvo de manera estéril sangre venosa de un macho sano en un tubo de vacío que tenía heparina como anticoagulante. Se mezcló la sangre completa obtenida del mismo con medio de cultivo RPMI 1640 (L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, gentamicina de 80 \mug/ml) a una razón de 1:1. Se añadieron 20 \mul de CIA07, 50 \mug de CIA02 + l \mug o 500 ng, 100 ng de CIA05) o 20 \mul de HBSS en 1 ml de la sangre completa mezclada con el medio de cultivo y entonces se incubaron en medio de cultivo con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 24 horas. Se analizó la cantidad de secreción de IFN-\gamma (sistema R&D, 210-TA-010) e IL-12 p40 (sistema R&D, 219-IL-005) en el líquido sobrenadante en el medio de cultivo con el kit de ELISA. Los resultados se muestran en la figura 9.

De la misma manera, se añadieron 20 \mul de CIA07 (50 \mug de CIA02 + 1 \mug de CIA05), CIA02 (50 \mug), ADN de Mycobacterium (50 \mug) o HBSS (20 \mul) a 1 ml de la sangre completa mezclada con el medio de cultivo. Entonces, se analizó la secreción de citocina.

Como resultado del análisis, se representó el efecto de aumento inmunitario sinérgico en el caso de la adición de CIA02 y CIA05 mezclados más que en el caso de la adición sólo de CIA02 o sólo de CIA05. Se demostró el mejor resultado en la dosis de 50 \mug de CIA02 y 1 \mug de CIA05. En comparación con el ADN de Mycobacterium, CIA07 representó el resultado excelente así como CIA02.

Ensayo de luciferasa

Se sembraron en superficie células sin tratar en placas de 12 pocillos a 5 x 10^{4} células (1 ml de DMEM/FBS al 10%) por pocillo y se cultivaron en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 24 horas. Se añadió plásmido indicador de luciferasa de IL-12 (0,2 \mug/pocillo) mezclado con plásmido PRL-null (20 ng/pocillo) en DMEM libre de suero (50 \mul/pocillo) mezclado con Fugene 6 (1,5 \mul/pocillo, Roche nº de cat. 1 814 443), reactivo de transfección, y entonces se dejó durante de 5 a 10 minutos. Se añadió la mezcla resultante a las células sin tratar a 52 \mul/pocillo, y se incubó en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 24 horas. Después, se trataron las células sin tratar con CIA07 (20 \mug de CIA02 + 400 ng de CIA05 por pocillo) y se incubaron en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 12 horas. Se llevó a cabo la reacción de luciferasa mediante el kit de ensayo de luciferasa (Promega nº. de cat. E1500) para medir la actividad de luciferasa con un luminómetro.

Como resultado de medir la actividad luciferasa para identificar los efectos de CIA07 sobre la actividad promotora de IL-8 y IL-12, el sitio de unión a NF-kB existía en los promotores de IL-8 y IL-12 en común. Se demostró que el NF-kB se activaba en la línea celular RAW264.7 por CIA07 para aumentar la actividad de los promotores (véase la figura 11).

Medición del efecto del tratamiento anticancerígeno usando la actividad de lisis celular de CIA

Se midió la actividad de destrucción de células cancerosas por CIA07 usando la liberación de _{51}Cr.

Se inyectó antígeno solo o con CIA07 bajo la piel de la parte inferior del pie de un ratón C3H/HeN macho de 5-8 semanas de edad.

Se usó RPMI-1640 (HEPES 10 mM, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml, glutamina 300 \mug/ml; Gibco Laboratories, Grand Island, NY) para el medio de cultivo basal para cultivar líneas celulares. Se añadió suero bovino fetal al 10% inactivado (Gibco Laboratories, Grand Island, NY) calentado a 56ºC durante 30 minutos al medio de cultivo basal. Con el fin de medir la actividad de las células LAK y la actividad destructora mediada por células cancerosas, se usaron sarcoma 180 y una línea celular de cáncer de vejiga de ratón (MBT-2) como células diana.

Con el fin de preparar las líneas celulares de reacción, se sacrificó una rata del grupo experimental usando dislocación cervical. Se aisló de manera estéril su bazo y se troceó sobre una malla de alambre de acero inoxidable usando tijeras. Se molieron los fragmentos y se filtraron usando una varilla de vidrio con adición de solución salina tamponada con fosfato. Entonces, se eliminó el residuo tisular haciéndolo pasar a través de la malla de alambre. Tras identificar bajo el microscopio una suspensión celular individual, se lavaron las células usando el medio de cultivo basal una vez. Se suspendieron las células en una disolución al 0,84% de cloruro de amonio a 37ºC durante 5 minutos para disolver los eritrocitos. Se lavaron adicionalmente las células usando el medio de cultivo basal dos veces y se suspendieron en medio de cultivo completo. Se dividió la suspensión celular en frascos de cultivo y se cultivó en una cámara de CO_{2} a temperatura y humedad constantes a 37ºC durante 1 hora. Se obtuvieron a partir de la misma las células que no se adhirieron a los frascos y se midió el número de células supervivientes usando el método de exclusión con el colorante azul trípano. Entonces, se obtuvieron 5 x 10^{6} células usando el medio de cultivo completo y se midió el número de células supervivientes de las mismas usando el método de exclusión con el colorante azul trípano. Entonces, se preparó una suspensión de 5 x 10^{6} células/ml usando el medio de cultivo completo.

Se cultivó la línea celular diana y se contó el número de células. Se obtuvieron 10^{6} células y se centrifugaron las células a 300 g, 3 minutos. Se eliminó el líquido sobrenadante excepto 0,2\sim0,3 ml usando una pipeta Pasteur sin dañar las células precipitadas. Se añadieron 100 Ci de Na_{2} _{51}CrO_{4} (1 ml de Ci/ml, NEZ 030S, NEN, EE.UU.) y se etiquetaron en un termostato con agitación a 37ºC durante 1 hora. Se lavaron las células usando el cultivo basal y se midió el número de células supervivientes de las mismas usando el método de exclusión con el colorante azul trípano. Se resuspendieron las células diana etiquetadas en medio de cultivo completo hasta 5 x 10^{4} células/ml.

Se dividieron las células diana etiquetadas en 0,1 ml para poner 5 x 10^{3} células por pocillo en una placa fina de 96 pocillos que tenía un fondo redondo. Se añadió 0,1 ml de células de reacción a una razón de células de reacción:célula diana = 100:1. Se cultivaron las células en una cámara de CO_{2} al 5% a temperatura y humedad constantes a 37ºC durante 4 horas. Tras preparar más de 3 pocillos por experimento y acabar el cultivo durante 4 horas, se centrifugaron las células a 500 g durante 15 minutos. Se midió la radiactividad en el 0,1 ml de líquido sobrenadante de cada pocillo usando un contador gamma (Packard, EE.UU.). En este caso, con el fin de inducir la emisión máxima, se añadió 0,1 ml de Triton X-100 al 5% (Sigma, EE.UU.) en el grupo de pocillo control. Con el fin de medir la emisión natural, se cultivaron las células etiquetadas en el medio de cultivo completo que tenía la misma dosis. Se calculó la toxicidad celular según la siguiente fórmula:

Citotoxicidad (%) = (ER-SR / MR-SR) X 100

ER: recuento promedio (cpm) del grupo experimental

SR: recuento promedio (cpm) de células diana cultivadas en medio de cultivo

MR: recuento promedio (cpm) de células diana tratadas con Triton X-100 al 5%.

Los resultados experimentales se muestran en la tabla 5. Las células LAK mostraron un aumento en la lisis celular de 8 veces en comparación con las células no inmunitarias y de 1,5 veces en comparación con el grupo de inyección con BCG. La línea celular MBT-2 mostró un aumento de la lisis celular de 5 veces en comparación con las células no inmunitarias. Estos resultados representan la posibilidad de usar CIA para los tratamientos anticancerígenos en lugar de BCG, lo que da como resultado diversos efectos secundarios.

TABLA 5

5

Experimento para identificar actividad anticancerígena en ratones

Se inyectaron por vía subcutánea 5 X 10^{5} células MBT2 (célula de cáncer de vejiga derivada de C3H/He) en dos posiciones (hombro izquierdo, muslo derecho) de un ratón C3H/HeJ macho de 5-8 semanas de edad. En este caso, deben evitarse varios pinchazos durante la inyección con el fin de generar un único tejido canceroso. Los ratones usados eran de 6 a 10 por grupo experimental. Desde el día siguiente tras inyectar las células tumorales, se inyectaron 100 \mul de CIA07 (50 \mug de CIA02 + 500 ng de CIA05) o solución salina fisiológica en la posición inyectada con línea celular una vez cada día durante 1 semana y cada dos días durante las 2 semanas siguientes. Se midió el tamaño del cáncer generado en la hipodermis tres veces por semana usando un compás calibrador. Los resultados se muestran en la figura 12. Se demostró que se inhibía el crecimiento de tejido canceroso en el grupo con inyección de CIA05 en comparación con el grupo con inyección de solución salina fisiológica.

Aplicabilidad industrial

El tratamiento anticancerígeno con CIA07 de mezclar dos materiales derivados de E. coli CIA02 y CIA05 según la presente invención es más seguro que el tratamiento convencional y minimiza el coste de producción debido a la simplicidad del procedimiento de producción. Además, el CIA07 induce una inmunización más eficaz y específica debido al mezclado de los dos materiales. Adicionalmente, la presente invención es más barata que el CpG debido al proceso físico de ADN y más eficaz que el BCG.

Por consiguiente, el tratamiento anticancerígeno derivado de E. coli con CIA07 según la presente invención es más significativo en su aplicación industrial para el tratamiento anticancerígeno y un adyuvante inmunitario.

Claims (9)

1. Composición para el control inmunitario que comprende:

a)

fragmentos de ADN bacteriano en los que los fragmentos de ADN oscilan desde 2,0 hasta 0,5 kb y están libres de endotoxina; y

b)

lipopolisacáridos de E. coli, en los que el lípido A de los lipopolisacáridos se degrada mediante tratamiento con álcali y el peso molecular de los lipopolisacáridos es de desde 5.000 hasta 10.000 Dalton.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que la razón en peso de a) y b) oscila desde 500:1 hasta 1:500.

3. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que a) y b) se mezclan mediante agitación.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la bacteria es Escherichia coli o una micobacteria.

5. Composición según las reivindicaciones 1 ó 4, en la que la bacteria es Escherichia coli.

6. Composición según la reivindicación 4, en la que la cepa de Escherichia coli es E. coli EGOO21 que tiene el número de registro KCCM-10374.

7. Adyuvante inmunitario que comprende la composición según la reivindicación 1.

8. Preparación anticancerígena que comprende la composición según la reivindicación 1.

9. Preparación para la activación inmunitaria de células T cooperadoras de tipo 1 que comprende la composición según la reivindicación 1.