ES2303727T3 - Candidatos de vacuna de vibrio cholerae y procedimientos para su construccion. - Google Patents
Candidatos de vacuna de vibrio cholerae y procedimientos para su construccion. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2303727T3 ES2303727T3 ES98964347T ES98964347T ES2303727T3 ES 2303727 T3 ES2303727 T3 ES 2303727T3 ES 98964347 T ES98964347 T ES 98964347T ES 98964347 T ES98964347 T ES 98964347T ES 2303727 T3 ES2303727 T3 ES 2303727T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- vibrio cholerae
- strain
- strains
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/107—Vibrio
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
En la presente invención se describen nuevas cepas vacunales de Vibrio cholerae en las cuales se ha eliminado la actividad mucinasa codificada por el gen de la hemaglutinina proteasa. Dicho gen ha sido interrumpido con la inserción de un gen marcador. Se describe otro mutante de Vibrio cholerae con mejores atributos de bioseguridad.
Description
Candidatos de vacuna de Vibrio Cholerae y
procedimientos para su construcción.
El campo de la invención es el de la
biotecnología y, más específicamente, la generación de vacunas de
Vibrio cholerae y los procedimientos de construcción de las
mismas usando herramientas de ingeniería genética.
A continuación, se enumera una breve explicación
de la terminología utilizada en el texto de la invención.
Por virus ctx\Phi quiere decirse la partícula
de ADN recubierto con proteína, producida por ciertas cepas de
Vibrio cholerae, que puede transducir su ADN, que comprende
genes de la toxina colérica, a otras cepas de Vibrio
cholerae.
Por toxina colérica, quiere decirse la proteína
responsable de los síntomas clínicos de los tipos de cólera que
están producidos por las bacterias.
Por genes de toxina codificados por ctx\Phi
quiere decirse, además de los genes de la toxina colérica, genes
zot y ace, que codifican para la "toxina de zónula
occludens" y para la "enterotoxina colérica accesoria",
respectivamente.
Para cepas no toxinógenas de Vibrio
cholerae, ha de entenderse cualquier cepa que carece de los
genes que codifican para las toxinas anteriores, que son también,
útiles como vacunas pero que todavía producen un síndrome
reactogénico no deseado.
La expresión vacuna segura o cepa segura se
refiere a una cepa de este tipo que carece de la reactogenicidad
residual de las cepas no toxinógenas de Vibrio cholerae.
Por hemaglutinina/proteasa, quiere decirse la
proteína que manifiesta una doble función, siendo una de ellas la
capacidad para aglutinar eritrocitos de ciertas especies y la otra,
la propiedad para degradar proteínas tales como mucina.
El término celA se refiere a la secuencia
de nucleótidos que codifica para la proteína endoglucanasa A. Esta
proteína se produce de manera natural en cepas de Clostridium
thermocellum y presenta una actividad hidrolítica de
\beta(1-4)glucan-glucano
que puede degradar la celulosa y sus derivados.
Por timidilato sintasa, quiere decirse la
proteína que puede catalizar la metilación reductora de
desoxiuracilo monofosfato (dUMP) mediante
N^{5}-N10-metilen-tetrahidrofolato
para proporcionar 2,5-desoxitimidina fosfato (dTMP)
y dihidrofolato.
ADN sustancialmente puro es ADN que está libre
de ambas secuencias codificantes inmediatamente contiguas al
extremo 5' o el extremo 3' de la secuencia codificante de
thyA, en el genoma que se produce de manera natural del
microorganismo a partir del que se deriva el ADN de la invención. El
término del mismo incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se
incorpora en vector, cepa, línea celular o plásmido, o que existe
como una molécula separada (por ejemplo, fragmento de PCR,
restricción o ADNc). También incluye moléculas de ADN recombinante
que son parte de un gen híbrido que codifica para secuencias
adicionales.
Secuencias homólogas se refiere a secuencias de
proteína o ADN que comparten residuos similares o idénticos que son
nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, en posiciones idénticas
de dos o más cadenas dadas. Cuanto mayor es el número de residuos
idénticos/similares en cierta posición, mayor es el porcentaje de
identidad/similitud entre dos de ellas.
El cólera clínico es una enfermedad diarreica
aguda que resulta de una infección oral con la bacteria Vibrio
cholerae. Después de más de 100 años de investigación sobre el
cólera, sigue existiendo la necesidad de una vacuna eficaz y
segura. La humanidad ha sido testigo de siete pandemias de cólera;
las seis primeras estuvieron producidas por cepas del biotipo
clásico y la séptima pandemia actual se caracteriza por el
predominio de vibriones que pertenecen al biotipo El Tor.
Recientemente, comenzando en enero de 1991, esta pandemia se ha
extendido hasta Sudamérica, produciendo un número superior a 25.000
casos y más de 2.000 muertes en Perú, Ecuador, Colombia y Chile.
Hacia noviembre de 1992, surgió un nuevo grupo serológico en India y
Bangladesh, el O139, que mostraba un gran potencial epidémico que
llegó a ser una nueva causa de preocupación en todo el mundo en
vías de desarrollo. Estas experiencias recientes reafirman la
necesidad de vacunas contra el cólera eficaces contra la enfermedad
producida por V. cholerae de grupos serológicos O1 (El Tor) y
O139.
Debido a que la convalecencia del cólera va
seguida por un estado de inmunidad que dura al menos 3 años, gran
parte de los esfuerzos en la vacunología contra Vibrio
cholerae se han realizado para producir vacunas contra el
cólera vivas, atenuadas que imitan estrechamente las propiedades de
inmunización de la enfermedad tras la administración oral, pero que
no resultan reactogénicas para los individuos que las ingieren. Las
vacunas de este tipo implican mutaciones por deleción de todos los
genes de toxina codificados por el fago ctx\varphi de
Vibrio. Véanse las patentes de Kaper, J. et al.; el
documento WO 91.18979 y Mekalanos, J., documento WO 95.18633).
La primera vacuna que se sometió a ensayo contra
el cólera data de 1885-1892. Era una vacuna
tradicional que comprendía la administración por vía parenteral de
vibriones "atenuados". Resultó tener una eficacia limitada y
ser inaceptablemente reactogénica (Finkelstein R. A., International
Symposium on Cholera on the America Continent. Sao Paulo, SP
Brasil, 1992). La vacunación oral se intentó por primera vez en
1892, usando cepas de Vibrio cholerae atenuadas. Los
resultados de este intento se malinterpretaron y se abandonó
inmediatamente la estrategia. La vacunación oral se rescató más
tarde en 1970-1980 en el Centro para el Desarrollo
de Vacunas de Maryland, EE.UU. usando vibriones mutagenizados
químicamente como agentes de inmunización. La reversión a la
virulencia de estos mutantes impidió una difusión adicional de la
estrategia (Levine et al., Infect and Imm, Nº2, 1984;
Finkelstein et al., patente US 4.328.209) e indujo a los
investigadores a generar mutantes no toxinógenos genéticamente
definidos que no podían revertir. Aunque se ha demostrado que estos
mutantes confieren una sólida protección inmunológica frente a la
enfermedad (Kaper J. B. y Levine M. patentes US 06.472.276 y
581.406), el inconveniente esencial para su utilización es el alto
nivel de reacciones adversas que producen en las personas vacunadas
(Levine et al., Infect. and Imm. Vol 56, Nº1, 1988). Según
estos datos, la principal cuestión que ha de superarse cuando se
produce una vacuna eficaz contra el cólera es la seguridad.
Adicionalmente, los investigadores de todo el mundo están
preocupados actualmente con respecto a la transferencia horizontal
de información genética entre bacterias, por tanto es necesario
prestar atención a este aspecto cuando se diseñan vacunas de
bacterias vivas, con el objetivo de mejorar el impacto ambiental
durante la vacunación. También es necesario conseguir buenos niveles
de estabilidad e inmunogenicidad.
Está disponible una vacuna contra el cólera
inactivada que consiste en células completas complementadas con la
subunidad B de la toxina colérica (Holmgren et al., Current
topics in Microbiology and Immunology, Vol. 146, 1989). Una vacuna
de este tipo es segura y eficaz pero requiere múltiples dosis para
generar una respuesta inmunitaria equivalente a la de una infección
de cólera y, por consiguiente, es muy cara.
Otra alternativa para la vacunación contra el
cólera es la CVD103-HgR recientemente autorizada,
una vacuna contra el cólera viva que pertenece al biotipo clásico.
Es segura, eficaz y barata; sin embargo su eficacia de protección
frente a los vibriones El Tor y O139 circulantes actualmente no es
tan buena como frente a los vibriones clásicos (véase la patente
USA, 5399494).
Se han descrito otros candidatos de vacuna viva
en la patente WO 95/18633. Tales mutantes representan todos los
serotipos de la pandemia actual, incluyendo el O139. Son seguras, su
producción es barata y se ha demostrado que son eficaces de forma
preliminar; sin embargo no se han sometido a prueba de manera tan
extensa como CVD103-HgR. Todos estos candidatos son
bacterias protótrofas que pueden sobrevivir a las condiciones
naturales del entorno. Adicionalmente, aunque en el documento se
describe un procedimiento para obtener mutantes definidos, los
candidatos propuestos constituyen mutantes espontáneos inmóviles.
Los inventores han propuesto que la naturaleza inmóvil de estos
candidatos de vacuna limita su capacidad para alcanzar la superficie
de los enterocitos e impide la provocación de la respuesta
reactogénica característica de sus cepas originales.
Robert et al., Vaccine, Vol, 14, Nº16,
1517-22, 1996, demostraron la viabilidad de usar el
locus de la hemaglutinina/proteasa para la inserción de etiquetas
heterólogas, sin perjudicar la capacidad de colonización de los
vibriones. La colonización del intestino delgado humano por
Vibrio cholerae es esencial para inducir una fuerte
respuesta inmunitaria localizada de IgA secretada en la mucosa
intestinal y para producir una inmunidad de larga duración frente
al cólera (Taylor et al., The Journal of Infectious Diseases,
1994, 170: 1518-23).
El Dr. Mekalanos ha sostenido prudentemente que
la captación de bacterias por las placas de Peyer es una
consecuencia del proceso de colonización que no conduce a
reactogenicidad y se considera una etapa esencial en la ruta de
respuesta inmunitaria localizada. Por el contrario, la interacción
de las bacterias con los enterocitos da como resultado reacciones
adversas inaceptables para fines de vacuna (Mekalanos J. et
al., Bull. Inst, Pasteur, 93: 255-262, 1995).
Según estos criterios, las mutaciones que interfieren con la
capacidad de los vibriones para alcanzar los enterocitos son
características deseadas de las vacunas contra el cólera.
Esta invención se refiere a un procedimiento de
producción de una cepa de vacuna adecuada para la administración
oral a seres humanos para inducir protección inmunológica frente al
cólera, caracterizado porque la reactogenicidad residual se elimina
o se reduce hasta un nivel aceptable a partir de un mutante no
toxinógeno de Vibrio cholerae mediante la interrupción del
gen de la hemaglutinina/proteasa (hap) con el gen marcador
ceiA, y caracterizado además porque se introduce una
mutación definida e irreversible en su gen thyA mostrado en
la SEC. ID nº:1 que codifica para timidilato sintasa de Vibrio
cholerae, mediante lo cual se limita la proliferación en
ecosistemas naturales. Se dan a conocer la cepa de vacuna que
pertenece a cualquiera de los dos serotipos del biotipo El Tor o al
serotipo O139 de Vibrio cholerae. Preferiblemente, esta cepa
se deriva de un mutante no toxinógeno de Vibrio cholerae,
obtenido por medio de herramientas de ingeniería genética y se
marca con el gen marcador celA dentro del locus de
hap. Del modo más preferido, la cepa es 638, 1333 o
L911.
Puede manipularse cualquier cepa de vacuna de
Vibrio cholerae que pertenece a biotipos y serotipos
existentes o cualquier serotipo emergente contra el que las vacunas
actuales no son eficaces, mediante ingeniería genética en los genes
que codifican para HA/P y timidilato sintasa, para proporcionarle a
un mutante doble características de bioseguridad ambiental
mejoradas. Más preferiblemente, el mutante es un derivado de 81, 413
o SG251a, y del modo más preferible la cepa, es 638T o los
derivados de thyA^{-} de 1333 y L911. También esta versión
contenida de cepas de vacuna es útil como entidad para el suministro
de antígenos al sistema inmunitario de la mucosa.
Se ha descubierto que los mutantes de este tipo
son poco reactogénicos en pruebas clínicas y/o de laboratorio,
aunque aún pueden provocar fuertes respuestas inmunitarias cuando se
administran por vía oral. Como resultado, estos mutantes
defectuosos con respecto a hemaglutinina/proteasa y sus derivados
adicionales comparten las propiedades deseables para una vacuna
contra el cólera en seres humanos.
Adicionalmente, se da a conocer ADN
sustancialmente puro que codifica para el gen thyA para
timidilato sintasa de Vibrio cholerae. Por ADN de
thyA, quiere decirse la secuencia de ADN mostrada en la
figura 1, SEC. ID. No 1.
La construcción de cepas de vacuna descrita en
la presente memoria supone la sustitución del gen cromosómico que
codifica para la hemaglutinina/proteasa de tipo natural por un alelo
interrumpido con celA en mutantes no toxinógenos de
Vibrio cholerae a los que se les ha delecionado todos los
genes que engloban el profago ctx\varphi. Estos mutantes están
bien definidos genéticamente y son muy estables en su defecto
proteolítico, sin mostrar una reversión detectable en 10^{9}
células. Los mutantes de este tipo son igualmente estables en su
actividad celulolítica conferida por el marcador cromosómico
celA, incluso tras el paso por el intestino de ratones o
seres humanos, y supone además introducir una deleción genética en
el gen thyA mostrado en la SEC ID No 1 del mutante, para
obtener un derivado auxótrofo de timina/timidina. El triple mutante
resultante está bien definido genéticamente y es estable. Como
consecuencia de esta mutación, se proporciona a la cepa un marcador
de resistencia al antibiótico trimetoprima, que está condicionado a
la presencia de timina/timidina. Es improbable que un marcador de
este tipo transforme otras bacterias mediante transferencia
horizontal debido a su naturaleza recesiva.
Se dan a conocer mutantes no toxinógenos,
genéticamente definidos, estables y seguros de Vibrio
cholerae que son útiles como vacunas orales vivas para inducir
protección inmunológica frente al cólera en seres humanos. Cuando
se diseñaron estos candidatos de vacuna contra el cólera no
reactogénica, se ha estado ciñéndose a la idea de reactogenicidad
como consecuencia de la interacción entre Vibrio cholerae y
los enterocitos. Se ha razonado que la inactivación de la principal
proteasa secretada, responsable de la degradación de mucina,
produciría una cepa de Vibrio cholerae ineficaz en la
penetración de la gruesa capa mucosa de los enterocitos, pero
inalterada en la capacidad para alcanzar la superficie de las
células M y provocar una fuerte respuesta inmunitaria. Se descubrió
que la principal proteasa que degrada mucina secretada en las cepas
C7258, C6706 y SG25-1 era la hemaglutinina/proteasa
soluble, un supuesto factor de virulencia descrito por Finkelstein,
et al. Journal of Bacteriology, Vol. 173, Nº 11, págs.
3311-3317, 1991. En paralelo a la inactivación del
gen de la hemaglutinina/proteasa, se insertó un fragmento de ADN que
codifica para la endoglucanasa A de Clostridium thermocellum
en el cromosoma de Vibrio cholerae. Esta mutación combinada
con la deleción de genes de toxina colérica del genoma de
ctx\varphi dio como resultado candidatos de vacuna marcados con
excelentes propiedades como agentes de inmunización para vacunar
seres humanos contra el cólera.
Como ejemplo, en lugar de como interés de ser
limitante; los mutantes no toxinógenos de Vibrio cholerae
útiles para construir mutantes seguros defectuosos en la expresión
de hemaglutinina/proteasa para fines de vacuna, se describen en la
tabla 1 a. Los mutantes no toxinógenos se caracterizan
específicamente por la ausencia de las secuencias codificantes de
ctx\phi en su cromosoma y por la presencia de un solo elemento
RS1, cuya secuencia de nucleótidos se confirmó mediante
secuenciación del ADN. Los procedimientos de producción de los
mutantes no toxinógenos de Vibrio cholerae se describen bien
en otra parte (Archives of Medical Research, 27, Nº 3, págs.
275-283).
De modo similar, la tabla 1b proporciona los
mutantes de hemaglutinina/proteasa útiles para construir los
derivados defectuosos con respecto a thyA con mejores
características de bioseguridad.
Tras introducirse cualquier nueva mutación en
las cepas de vacuna descritas en la presente memoria, se demostró
que el derivado conservaba el serotipo esperado. Se recogieron
células de una placa, suspendidas en solución salina y se
sometieron a prueba inmediatamente con suero de tipificación de
Difco específico para Inaba, Ogawa u O139.
La principal respuesta inmunitaria provocada por
las vacunas se dirige contra el LPS de la bacteria. Todas las cepas
que se hacen públicas en la presente invención conservaron la
expresión del O-antígeno esperado, tal como se
confirmó mediante pruebas serológicas. Adicionalmente, los perfiles
de LPS permanecieron inalterados en electroforesis en gel de
poliacrilamida e inmunotransferencia de tipo Western.
Se utilizó el ensayo de colonización en ratón
recién nacido (Herrington et al, J. Exper. Med.
168:1487:1492, 1988) para evaluar las propiedades de colonización
de cada mutante. Se administró por vía intragástrica un inóculo de
10^{5}-10^{6} vibriones en un volumen final de
50 \mul a grupos de al menos cinco ratones. Tras
18-24 horas a 30ºC, se sacrificaron los ratones, se
diseccionó el intestino, se homogeneizó y se sembró en placa sobre
medios bacteriológicos que contenían complementos apropiados para
soportar el crecimiento de mutantes. Se sometieron a prueba las
colonias que crecieron tras la incubación durante la noche, para
determinar marcadores adicionales.
En la tabla 2, puede observarse la capacidad de
las cepas doble y triplemente mutadas (\Deltactx\phi,
HA/P)/(thyA^{-}) de Vibrio cholerae para colonizar
el intestino de ratones lactantes. Las cepas 638, 1333 y 638T son
buenos colonizadores del intestino delgado de los ratones. Se acepta
ampliamente que la colonización del tracto gastrointestinal de
ratones recién nacidos se correlaciona bien con la colonización del
intestino humano, lo que es necesario para sensibilizar el sistema
inmunitario de la mucosa e inducir una fuerte respuesta secretora
de IgA. Aunque L911 lo coloniza de manera menos eficaz que el resto,
todavía puede colonizarlo.
Debe observarse que 638T es un mutante
thyA^{-} de 638. La mutación introducida en esta cepa
produce una dependencia de timina o timidina que reduce la
capacidad de esta cepa para multiplicarse en entornos naturales en
los que normalmente están ausentes las pirimidinas libres.
Se utilizaron placas de leche-LB
para detectar las actividades proteolíticas en sobrenadantes de
vibriones hechos crecer en TSB. Para la cuantificación de la
actividad proteasa, se adaptó el método de azocaseína a partir de
Ginther CL., Antimicrob. Agents Chemother. 15,
522-526, 1979. Brevemente, se mezclaron 1,1 ml de
tampón (CaCl_{2} 1 mM; Tris 0,2 M, pH 7,2; azocaseína al 1%) con
200 \mul de sobrenadante de cultivo y se incubaron durante 1 h a
37ºC. Se precipitó el sustrato sin reaccionar con 83 \mul de TCA
al 40% durante 10 min. seguido por centrifugación durante 10 min. a
12000 rpm. Se neutralizó el producto coloreado que permaneció en
disolución con NaOH y se hizo una lectura a 450 nm. Se definió una
unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que
producía un aumento neto de uno en la densidad óptica de la muestra
en una hora de reacción.
La mutación introducida en el gen de la
hemaglutinina/proteasa de las cepas dadas a conocer en la presente
memoria, representa una reducción del 60-80% de la
actividad proteolítica, tal como se observó en los mutantes en
comparación con las cepas originales no toxinógenas.
Para la detección de la actividad de CelA, se
hicieron crecer vibriones en placas de LB durante 24 horas,
recubiertos con agar indicador-CMC y se incubaron
durante 4 horas a 60ºC. Se visualizaron las colonias positivas para
la endoglucanasa A tras tinción con rojo Congo y lavado, como
colonias rojas rodeadas por un halo transparente en el fondo rojo
de la placa. El agar indicador-CMC se componía de un
0,7% de agarosa, un 0,5% de CM-celulosa en tampón
fosfato-citrato, pH 6,3 y la disolución de tinción
era un 1% de rojo Congo en agua.
El marcador celA usado para distinguir de
manera inequívoca la vacuna se expresa de manera estable y se
hereda en Vibrio cholerae. En la figura 2, puede observarse
el aspecto de los vibriones marcados.
Se usaron sales M9 complementadas con glucosa
como fuente de carbono y timina/timidina (200 \mug/ml) para
detectar el crecimiento de mutantes defectuosos con respecto a
thyA afectados en el crecimiento en medio de sales
M9-glucosa. Se utilizaron placas de LB
complementadas con 200 \mug/ml de timidina para comprobar la
resistencia a trimetoprima en los mutantes de thyA generados.
Se analizó la estabilidad de la auxotrofía de timidina mediante
replicación en placas de colonias de
M9-glucosa-timidina en placas de
M9-glucosa.
Las cepas 638, 1333 y L911 son bacterias
protótrofas que pueden crecer en sales minerales empleando glucosa
como la única fuente de carbono. La cepa 638T requiere la adición de
timidina o timina para el crecimiento en medio mínimo. Cuando está
presente uno de estos complementos, 638T es resistente hasta 200
\mug/ml de trimetoprima.
Se cogieron células de colonias individuales
bien aisladas de una placa maestra con la ayuda de la punta de una
aguja de platino y se inocularon mediante inserción
(2-3 mm) en una placa de agar de movilidad (LB; agar
al 0,4%). Se registró el diámetro en el que se extendió cada
colonia a través del agar blando a las 24 horas de incubación a
30ºC. Los criterios para la movilidad fueron los siguientes. Una
extensión de la cepa bacteriana de 3 mm o menos desde el punto de
aplicación se consideró inmóvil. Una extensión de la cepa bacteriana
> 3 mm más allá del punto de inoculación se consideró móvil.
Se encontró que todas las cepas bajo el alcance
de esta patente, menos L911 eran móviles. L911 es un derivado de
SG251, que en estos ensayos, resultó inmóvil cuando se sometió a
ensayo en agar de movilidad.
Se sometieron a ensayo bacterias móviles e
inmóviles para determinar la presencia de flagelos mediante
microscopía electrónica. Brevemente, se hizo crecer Vibrio
cholerae durante 4 horas a 37ºC sobre agar con antígeno del
factor de colonización (CFA, casaminoácidos, 1%; extracto de
levaduras, 0,15%; sulfato de magnesio, 0,05%; cloruro de magnesio,
0,005%), se recogieron y se lavaron con solución salina (NaCl,
0,9%). Se tiñeron negativamente las bacterias con 1% de acetato de
uranilo durante 3 min. y se analizaron mediante microscopía
electrónica de transmisión.
También se demostró la naturaleza flagelada de
las bacterias para todas las cepas de vacuna como anteriormente,
con mayor énfasis sobre la cepa de O139 inmóvil, L911 (figura 3).
Todas las cepas descritas en la presente memoria mostraron que eran
flageladas, incluyendo la L911 inmóvil.
Se examinaron las cepas mutantes para determinar
la presencia de pilosidades correguladas con toxina sobre la
superficie bacteriana mediante microscopía electrónica con marcaje
inmunológico con oro. Se cultivaron las células como para el ensayo
de los flagelos. Se depositaron suspensiones recién recogidas de
vibriones (10 \mul) sobre una rejilla de níquel recubierta con
carbono, se fijaron durante 1 min. exponiendo la rejilla a una
lámpara de 60 vatios y se eliminó el exceso de líquido sobre una
almohadilla filtrante. Se invirtió la rejilla en una gota de sueros
específicos de TCP diluidos en solución salina, un 1% de BSA, un
0,05% de tween-80, se incubó durante 15 min. para
la reacción y se lavó con solución
salina-BSA-Tween. Se incubaron las
rejillas lavadas con el conjugado marcado con oro diluido con el
mismo tampón, se dejaron en reposo durante 15 min. y se lavaron 3
veces con solución salina-BSA-Tween.
Tras el lavado, se tiñeron las muestras durante 1 min. con una
disolución de molibdato de amonio al 1%.
Las características más importantes de las
vacunas contra el cólera son la seguridad y la antigenicidad.
Mediante manipulación genética, se hacen seguras las cepas de V.
cholerae, pero debe tenerse cuidado para que conserven su
antigenicidad inalterada. Se evaluaron las cepas de Vibrio
cholerae dadas a conocer en la presente solicitud de patente
para determinar la expresión de los antígenos más destacados en la
bacteria. Se visualizó TCP sobre la superficie bacteriana mediante
microscopía electrónica con marcaje inmunológico con oro.
Alternativamente, se detectó la expresión de este factor de
colonización clave mediante análisis de inmunotransferencia de tipo
Western. Todas las cepas analizadas (por ejemplo, 638, 1333, L911 y
638T) produjeron niveles normales de proteína TCP y se ensamblaron
en grandes apéndices sobre la superficie bacteriana (figura 4).
Pueden utilizarse las cepas 638, 1333, L911 y
638T descritas en la presente memoria, para lograr una protección
inmunológica adecuada frente al cólera en seres humanos, siempre que
provoquen altas tasas de seroconversión y produzcan bajos niveles
de reacciones adversas cuando se administran por vía oral a
voluntarios humanos. Dependiendo de la epidemiología local
relevante, podría utilizarse una única cepa o combinaciones de ellas
para la inmunización.
Se cultivaron las cepas de vacuna en medio de
laboratorio habitual. Se añadieron complementos de timidina (200
\mug/ml) cuando fue necesario para el crecimiento, pero no se
incluyeron complementos en el inóculo.
Se administró una dosis oral única de la vacuna
viva a personas en tampón bicarbonato (2%) tras recoger las
bacterias de una placa nueva en solución salina aséptica (NaCl al
0,9%). Un inóculo útil son 10^{7}-10^{9}
células por dosis de inmunización. Alternativamente, pueden
administrarse más de una dosis, separadas 7-28
días, a cada sujeto. Preferiblemente, los vibriones pueden
liofilizarse en una formulación que conserve la viabilidad y
mezclarse con bicarbonato antes de la inoculación.
Se ha sometido a prueba la cepa 638 en ensayos
con seres humanos en los que participaron 42 voluntarios con edades
comprendidas entre 18-40 años. En la tabla 3, se
muestra un resumen de los hallazgos clínicos tras la ingestión de
la cepa 638 y placebo. Todas las manifestaciones clínicas observadas
fueron leves y de corta duración. No pudo demostrarse significación
estadística entre los grupos inoculados y de placebo con los
presentes datos. Los dolores abdominales y el ruido de gorgoteo
fueron las reacciones notificadas más frecuentemente por los
voluntarios, independientemente de la dosis. Cuatro voluntarios
desarrollaron diarrea leve (grado 3). Tres de estos voluntarios
recibieron la dosis alta y uno la dosis media. Un voluntario que
recibió la dosis alta, defecó 5 veces heces blandas (72 h tras la
inoculación) y una cantidad total de 680 g. Dos voluntarios
defecaron 2 veces heces blandas 28 y 72 h tras la inoculación con
cantidades totales de 220 y 500 g, respectivamente. El otro
voluntario defecó una única vez una cantidad de diarrea de 300 g 73
h tras la inoculación.
Tal como se indica en la tabla 4, se recuperó la
cepa 638 en 37 de 42 voluntarios inoculados (88%). Para la dosis
superior, la excreción de la cepa de vacuna tendía a ser máxima a
las 72 h tras la inoculación. Tres de los 4 casos de diarrea se
produjeron en este momento. De los 37 voluntarios que excretaron
vibriones, 12 los excretaron al menos en 4 días, 19 al menos en 3
días y 28 en 2 días. El número de voluntarios que excretaron la
cepa 638 y el número medio de vibriones/g de heces disminuyeron en
la dosis inferior. Los vibriones aislados de las heces de los
voluntarios produjeron endoglucanasa A, lo que indica que el gen
indicador celA se mantuvo de manera estable durante el
crecimiento en el intestino humano. Se concluye que la cepa 638 es
un buen colonizador del intestino delgado humano.
La cepa 638 provocó una respuesta inmunitaria
sistemática y significativa en cuanto a los anticuerpos vibriocidas
séricos, IgG o IgA anti-LPS de Ogawa séricos y ASC
de IgA específica de LPS de Ogawa (tablas 5 y 6). Aunque la inversa
de la MGT tuvo un máximo a los 14 días tras la inoculación, se
obtuvo seroconversión en el día 7 y los títulos siguieron siendo
altos hasta el día 28. Las tasas de seroconversión, inversa de la
MGT máxima y los títulos de ELISA fueron dependientes de la dosis.
Sin embargo, incluso con la dosis menor, la cepa 638 provocó una
respuesta de anticuerpos vibiocidas significativa en comparación con
el placebo. Una proporción significativa de los voluntarios que
experimentaron seroconversión desarrollaron títulos vibriocidas
relativamente altos (\geq 1024) (tabla 6). El alto porcentaje de
sujetos que respondieron en la evaluación de las ASC (tabla 5)
refleja una estimulación eficaz de la inmunidad de la mucosa,
principalmente de sIgA, por la cepa 638 en correspondencia con los
títulos elevados de IgA anti-LPS encontrados 14 días
tras la inoculación. Un voluntario que ingirió placebo experimentó
seroconversión para IgG anti-LPS. Este voluntario
tenía un valor de IgG sérica anti-LPS antes de la
inoculación muy bajo, que aumentó hasta el valor de corte en el día
7 y permaneció constante posteriormente. Otro voluntario que
ingirió placebo alcanzó el valor de corte de las ASC. De manera
similar, este voluntario tuvo un número antes de la inoculación muy
bajo de ASC específicas de LPS. Se concluye que la cepa 638 provoca
una respuesta inmunitaria significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos descritos en la presente memoria se
concibieron para ilustrar en vez de limitar la invención.
Para construir derivados defectuosos con
respecto a hemaglutinina/proteasa a partir de los mutantes no
toxinógenos descritos en la tabla 1 a, se procesó de igual manera
cada cepa original. En primer lugar, se transfirió el vector
suicida pGPH6 (figura 5) que contenía el gen de la HA/P
(hap), inactivado mediante la inserción del gen indicador
celA, de E. coli SM10\lambdapir al mutante no
toxinógeno para producir un vector cointegrado resistente a la
ampicilina. En segundo lugar, la hibridación de tipo Southern
demostró que el vector cointegrado contenía el gen hap
inactivado por inserción (hap::celA) y su alelo de
tipo natural (hap) separado por ADN de vector. En tercer
lugar, se permitió que el vector cointegrado resistente a la
ampicilina anterior se segregara en un medio sin antibióticos y se
seleccionaron las colonias sensibles a la ampicilina. Las colonias
sensibles a la ampicilina designadas como 638, 1333 y L911, se
caracterizaron mediante análisis de tipo Southern y demostraron que
contenía el alelo mutante hap::celA.
Para construir mutantes de Vibrio
cholerae que eran defectuosos en la expresión de la timidilato
sintasa, se clonó en primer lugar su gen codificante thyA y
se secuenció. Se clonó el primer lugar el gen thyA de
Vibrio cholerae complementando un mutante espontáneo que
requiere timidina, resistente a trimetoprima de la cepa 81, con una
biblioteca genómica de la cepa C7258 construida en pBR322. Se
seleccionó un clon, se purificó y se llevó el inserto a pUC19 que
sirvió como molde para facilitar la secuenciación con cebadores
universales. En la figura 1, SEC ID No 1, se muestran la secuencia
de nucleótidos del gen thyA y su polipéptido previsto de la
proteína ThyA.
Para construir una cepa de vacuna defectuosa con
respecto a timidilato sintasa, se delecionó "in vitro"
un fragmento de restricción interno del marco de lectura abierto de
thyA. La deleción comprendía los nucleótidos entre los
sitios de restricción Mlul y BglII y eliminó las
secuencia de ADN que codifican para el aminoácido 7 al aminoácido
105 de la proteína ThyA. El constructo génico resultante estaba
alterado en su capacidad para complementar el defecto de
thyA del mutante espontáneo de Vibrio cholerae
815.
Se clonó este fragmento en el sitio de
restricción Sacl único de pCVD442 para obtener pEST (figura
6). Se transfirió este plásmido de E. coli SM10\lambdapir
Vibrio cholerae cepa 638 y se seleccionó un vector
cointegrado resistente a la ampicilina. El análisis de tipo Southern
del vector cointegrado demostró que pEST estaba integrado
específicamente dentro del gen thyA. Se permitió que se
segregara el vector cointegrado resistente a la ampicilina en medio
sin antibioticos complementado con timidina. Se seleccionaron las
colonias resistentes a la sacarosa en presencia de timidina. Se
caracterizó una colonia sensible a la ampicilina, que requería
timidina designada como 638T, mediante análisis de tipo Southern y
demostró que contenía el alelo de thyA disfuncional. Se
utilizó pEST para construir 638T y también será útil para construir
1333T y L911 T o cualquier otra cepa de V. cholerae con
derivado defectuoso de thyA definido adicional.
Sigue una breve descripción de los dibujos.
Figura 1. Secuencia de nucleótidos del gen
thyA y secuencia de aminoácidos prevista del polipéptido
codificado.
Figura 2. Detección de vibriones del cólera
marcados con celA en ensayos en placa que emplean agar
indicador-CMC.
Figura 3. Detección de flagelos en el mutante
L911 de Vibrio cholerae del serogrupo O139.
Figura 4. Detección de TCP sobre la superficie
bacteriana de 638T.
Figura 5. Representación esquemática del vector
suicida pGPH6 utilizado para construir mutantes
hap::celA de V. cholerae.
Figura 6. Representación esquemática del vector
suicida de pEST utilizado para construir mutantes de
thyA.
Esta invención proporciona un enfoque para
producir mutantes más seguros de Vibrio cholerae mediante
inactivación del gen de la hemaglutinina/proteasa de los mutantes
no toxinógenos. Tales derivados son útiles como vacunas.
La seguridad e inmunogenicidad de las cepas 638,
1333 y L911 son similares a las presentadas en la patente WO
95/18633. Adicionalmente, son representativas de todas las cepas de
Vibrio cholerae circulantes durante la pandemia actual y del
nuevo serogrupo O139. Dichas cepas también se marcan con un marcador
distinguible para facilitar la toma de muestras ambiental de la
vacuna. Todas las mutaciones introducidas para construir las
vacunas descritas en la presente memoria están bien definidas como
deleciones génicas o como inserciones génicas de naturaleza
conocida. Esta invención también da a conocer un procedimiento para
mejorar la bioseguridad ambiental de las cepas de cólera vivas que
van a utilizarse como vacunas orales. Se logra esta mejora
produciendo una mutación definida en el gen thyA que también
se describe en la presente memoria.
La cepa de vacuna 638T se caracteriza por su
bioseguridad ambiental mejorada. Presenta una auxotrofía de timidina
que limita su proliferación en ecosistemas naturales, en los que
son escasas las pirimidinas libres, si acaso existen.
Es improbable que la resistencia a trimetoprima
conferida al candidato de vacuna de Vibrio cholerae 638T por
su gen thyA mutante se transmita a otras bacterias debido a
su naturaleza recesiva. Adicionalmente, la resistencia a
trimetoprima está condicionada a la presencia de timina o timidina
en un cultivo.
La readquisición de los genes de toxina colérica
u otro ADN por medio de transferencia génica horizontal es
superflua en estas cepas, puesto que no proliferan fuera del
laboratorio.
INFORMACIÓN GENERAL
\vskip1.000000\baselineskip
| SOLICITANTE |
\vskip1.000000\baselineskip
| NOMBRE: Centro Nacional de Investigaciones Científicas. | |
| CALLE: Avenida 25, esquina a 158. | |
| CIUDAD: Ciudad de La Habana. | |
| PROVINCIA: Ciudad de La Habana. | |
| PAÍS: Cuba. | |
| CÓDIGO POSTAL: 12 100. | |
| TELÉFONO: 218066, extensión 248. | |
| FAX: 537 330497 | |
| E-MAIL: "Rafael Fando" <Fando@biocnic.cneuro.edu.cu> |
\vskip1.000000\baselineskip
| TÍTULO: Candidatos de vacuna de Vibrio cholerae novedosos y procedimientos para su construcción. |
| NÚMERO DE SECUENCIAS: 1 |
| DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA |
\vskip1.000000\baselineskip
| DESTINATARIO: Consultores de Marcas y Patentes "CLAIMS". | |
| CALLE: 14 #308 e/ 3ra y 5ta Ave. Miramar, Playa. | |
| CIUDAD: Ciudad Habana. | |
| PROVINCIA: Ciudad de La Habana. | |
| PAÍS: Cuba. | |
| CÓDIGO POSTAL: 11 300. |
\vskip1.000000\baselineskip
| DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL |
\vskip1.000000\baselineskip
| NÚMERO DE SOLICITUD: 142/97 | |
| FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de diciembre de 1997. |
\vskip1.000000\baselineskip
| INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: |
\vskip1.000000\baselineskip
| NOMBRE: Maria Lourdes Ruiz Sotolongo. | |
| NÚMERO DE REGISTRO: 5 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
| CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: |
\vskip1.000000\baselineskip
| LONGITUD: 852 pares de bases. | |
| TIPO: Ácido nucleico. | |
| TIPO DE CADENA: Sencilla. | |
| TOPOLOGÍA: lineal. |
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico. |
| FUENTE: |
\vskip1.000000\baselineskip
| MICROORGANISMO: Vibrio cholerae. | |
| CEPA: C7258 |
\newpage
| CARACTERÍSTICA: |
\vskip1.000000\baselineskip
| NOMBRE: secuencia codificante del gen thyA. | |
| UBICACIÓN: 1-852 |
\vskip1.000000\baselineskip
| CARACTERÍSTICA: |
\vskip1.000000\baselineskip
| NOMBRE: Polipéptido deducido a partir de la secuencia codificante de thyA. | |
| UBICACIÓN: 1-284. | |
| DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1 |
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Centro Nacional de Investigaciones
Científicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Candidatos de vacuna de Vibrio
cholerae novedosos y procedimientos para su construcción.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> incierto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Documento PCT/CU 98/00008
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
30-12-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento CU 142/97
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-12-1997
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 852
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vibrio cholerae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).(852)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos de
thyA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 284
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vibrio cholerae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (5)
1. Procedimiento de producción de una cepa de
vacuna adecuada para la administración oral a seres humanos para
inducir una protección inmunológica frente al cólera,
caracterizado porque la reactogenicidad residual se elimina
o se reduce hasta un nivel aceptable a partir de un mutante no
toxinógeno de Vibrio cholerae mediante la interrupción del
gen de la hemaglutinina/proteasa (hap) con el gen marcador
celA, y caracterizado además porque se introduce una
mutación definida e irreversible en su gen thyA mostrado en
la SEC ID nº:1 que codifica para timidilato sintasa de Vibrio
cholerae, mediante lo cual se limita la proliferación en
ecosistemas naturales.
2. Utilización de una o más cepas de vacuna de
Vibrio cholerae derivadas de cepas originales no toxinógenas
en las que el nivel de reactogenicidad residual se ha eliminado o
reducido hasta un nivel aceptable mediante la interrupción del gen
de hemaglutinina/proteasa (hap) con el gen marcador
celA, en la fabricación de una preparación farmacéutica
adecuada para la administración oral a seres humanos para inducir
una protección inmunológica frente al cólera y en la que dicha cepa
o dichas cepas de vacuna de Vibrio cholerae están
caracterizadas además porque presentan una mutación definida
e irreversible introducida en su gen thyA mostrado en la SEC
ID nº:1 que codifica para timidilato sintasa, mediante lo cual se
limita la proliferación en ecosistemas naturales.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicha(s) cepa o cepas de vacuna de Vibrio cholerae
se mezcla(n) con un 2% de tampón bicarbonato.
4. Utilización según la reivindicación 2 ó 3, de
una formulación liofilizada.
5. Preparación farmacéutica con bioseguridad
ambiental mejorada adecuada para la administración a seres humanos
para inducir protección inmunológica frente al cólera que comprende
como componente esencial una o más cepas de vacuna de Vibrio
cholerae derivada(s) de una cepa original no toxinógena,
estando la cepa o cepas caracterizadas porque presentan un
nivel aceptable de reactogenicidad residual debido a la presencia de
un gen de hemaglutinina/proteasa (hap) disfuncional que
resulta de la interrupción del gen hap con el gen marcador
celA y porque presenta además una mutación definida e
irreversible introducida en el gen thyA mostrado en la SEC ID
nº:1 que codifica para timidilato sintasa, mediante lo cual se
limita la proliferación en ecosistemas naturales.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU1997142A CU22661A1 (es) | 1997-12-30 | 1997-12-30 | Nuevos candidatos vacunales de vibrio cholerae y método de obtención |
| CU142/97 | 1997-12-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2303727T3 true ES2303727T3 (es) | 2008-08-16 |
Family
ID=5459446
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98964347T Expired - Lifetime ES2303727T3 (es) | 1997-12-30 | 1998-12-30 | Candidatos de vacuna de vibrio cholerae y procedimientos para su construccion. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6723323B1 (es) |
| EP (1) | EP1099759B1 (es) |
| JP (1) | JP2002500047A (es) |
| CN (1) | CN100372936C (es) |
| AT (1) | ATE386797T1 (es) |
| AU (1) | AU1959199A (es) |
| BR (1) | BR9814600A (es) |
| CU (1) | CU22661A1 (es) |
| DE (1) | DE69839161T2 (es) |
| DK (1) | DK1099759T3 (es) |
| ES (1) | ES2303727T3 (es) |
| WO (1) | WO1999035271A2 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9801852D0 (sv) | 1998-05-26 | 1998-05-26 | Sbl Vaccin Ab | Method of producing thy A-strains of Vibro cholerae, suck strains and their use |
| US7527797B1 (en) | 2000-09-01 | 2009-05-05 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Vibrio cholerae 0139 conjugate vaccines |
| GB0325494D0 (en) * | 2003-10-31 | 2003-12-03 | Sbl Vaccin Ab | Expression system |
| US20060003454A1 (en) * | 2004-07-02 | 2006-01-05 | Conjugon, Inc. | Non-dividing donor cells for gene transfer |
| US20060270040A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Conjugon, Inc. | Compositions and methods for treating tissue |
| MY190074A (en) * | 2018-01-09 | 2022-03-24 | Aimst Univ | A monovalent vaccine formulation and a method for preparation thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1017726A1 (ru) * | 1981-09-07 | 1983-05-15 | Ростовский-На-Дону Государственный Научно-Исследовательский Противочумный Институт | Штамм @ @ @ 673/67 @ используемый в качестве тест-культуры дл определени тимидина в питательных средах |
| EP0251579A3 (en) * | 1986-06-24 | 1989-03-22 | Enterovax Research Pty. Ltd. | Non-antibiotic marker system |
| GB9007194D0 (en) * | 1990-03-30 | 1990-05-30 | Wellcome Found | Live vaccines |
| JPH0630766A (ja) * | 1992-07-15 | 1994-02-08 | Res Dev Corp Of Japan | 弱毒化された安全性の高い赤痢生ワクチン |
| JPH08506963A (ja) * | 1993-02-22 | 1996-07-30 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | 生ワクチン菌株における異種抗原 |
| US5434065A (en) * | 1993-05-06 | 1995-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | In vivo selection of microbial virulence genes |
| WO1995018633A1 (en) * | 1994-01-06 | 1995-07-13 | President And Fellows Of Harvard College | Soft agar penetration-defective mutants |
| EP0881884A4 (en) * | 1995-09-06 | 2004-07-14 | Dept Of The Army Us Government | BACTERIA ADMINISTRATION SYSTEM |
| SE9801852D0 (sv) * | 1998-05-26 | 1998-05-26 | Sbl Vaccin Ab | Method of producing thy A-strains of Vibro cholerae, suck strains and their use |
-
1997
- 1997-12-30 CU CU1997142A patent/CU22661A1/es unknown
-
1998
- 1998-12-30 CN CNB98813442XA patent/CN100372936C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-30 DE DE69839161T patent/DE69839161T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-30 EP EP98964347A patent/EP1099759B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-30 JP JP2000527655A patent/JP2002500047A/ja active Pending
- 1998-12-30 AT AT98964347T patent/ATE386797T1/de active
- 1998-12-30 BR BR9814600-9A patent/BR9814600A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-12-30 WO PCT/CU1998/000008 patent/WO1999035271A2/es not_active Ceased
- 1998-12-30 ES ES98964347T patent/ES2303727T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-30 AU AU19591/99A patent/AU1959199A/en not_active Abandoned
- 1998-12-30 DK DK98964347T patent/DK1099759T3/da active
- 1998-12-30 US US09/582,772 patent/US6723323B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1099759B1 (en) | 2008-02-20 |
| BR9814600A (pt) | 2002-02-19 |
| WO1999035271A2 (es) | 1999-07-15 |
| EP1099759A2 (en) | 2001-05-16 |
| DE69839161T2 (de) | 2009-03-26 |
| WO1999035271A3 (es) | 1999-11-25 |
| CN1301301A (zh) | 2001-06-27 |
| ATE386797T1 (de) | 2008-03-15 |
| US6723323B1 (en) | 2004-04-20 |
| DE69839161D1 (de) | 2008-04-03 |
| JP2002500047A (ja) | 2002-01-08 |
| CU22661A1 (es) | 2001-04-27 |
| DK1099759T3 (da) | 2008-06-23 |
| CN100372936C (zh) | 2008-03-05 |
| AU1959199A (en) | 1999-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DiPetrillo et al. | Safety and immunogenicity of phoP/phoQ-deleted Salmonella typhi expressing Helicobacter pylori urease in adult volunteers | |
| Noriega et al. | Engineered deltaguaB-A deltavirG Shigella flexneri 2a strain CVD 1205: construction, safety, immunogenicity, and potential efficacy as a mucosal vaccine | |
| JP3054440B2 (ja) | 生ワクチン | |
| ES2199944T3 (es) | Procedimiento para la elaboracion de una cepa mutante geneticamente estable de vibrio cholerae. | |
| ES2237094T3 (es) | Lactobacillus que albergan genes de agregacion celular y de fijacion de mucina, como vehiculos de aporte de vacunas. | |
| JP2000506386A (ja) | ウェルシュ菌ワクチン | |
| Hosseini et al. | Biological containment of genetically modified Bacillus subtilis | |
| CN102630166A (zh) | 抗霍乱和肠产毒性大肠杆菌（etec）腹泻的疫苗 | |
| Baker et al. | CfaE tip mutations in enterotoxigenic Escherichia coli CFA/I fimbriae define critical human intestinal binding sites | |
| CZ20003470A3 (cs) | Zeslabená bakterie nevratnou mutací, vakcina, která ji obsahuje a její použití | |
| EP1099759B1 (en) | Vibrio cholerae vaccine candidates and methods of their constructing | |
| JP4495143B2 (ja) | 生物学的安全性が向上した経口ワクチン接種用凍結乾燥形態のコレラ菌弱毒化株 | |
| Chiang et al. | Construction of a Vibrio cholerae vaccine candidate using transposon delivery and FLP recombinase-mediated excision | |
| JPH08503136A (ja) | Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによるパスツレラ症に対する感染防御剤 | |
| EP3704243B1 (en) | Modified bacterial spores | |
| AU2003208135B2 (en) | Novel vibrio cholerae vaccine candidates and the methods of constructing | |
| ES2272086T5 (es) | Vacuna multicomponente que comprende por lo menos dos antigenos de haemophilus influenzae. | |
| Silva et al. | Gomez et al. 45 Date of Patent: A r. 20 2004 | |
| CN108671227A (zh) | 一种预防猪链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗 | |
| KR100544594B1 (ko) | 스트렙토콕커스 뉴모니애로부터의 사람 보체 ｃ3-분해 프로테이나아제 | |
| CN1864746B (zh) | 幽门螺杆菌AhpC-NapA融合基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法 | |
| US20060233837A1 (en) | Vibrio cholerae vaccine candidates, the methods of their constructing and medicinal preparations derived thereof | |
| RU2455024C1 (ru) | Аттенуированные бактерии bordetella pertussis, вакцина против возбудителя коклюша | |
| ES2221766B1 (es) | Procedimiento de identificacion y utilizacion como vacuna de la proteina yrp1 de yersinia ruckeri. | |
| ZA200507021B (en) | Attenuated strains of Vibrio cholerae and lyophilised vaccines containing same |