ES2303899T3 - Estructura cristalina de la il-18 humana. - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende una IL-18 humana en forma cristalina, en la que dicha proteína tiene una sustitución de cisteína por serina en el residuo 38 de SEC ID Nº:1, y en la que el cristal proteico es un cristal hexagonal primitivo (P6,) con dimensiones de la celda unidad a = 71,4 A, b = 71,4 A, c = 88,7 A, alfa = beta = 90º y gamma = 120º.
Description
Estructura cristalina de la
IL-18 humana.
La invención se refiere a la identificación de
una estructura cristalina de la citoquina IL-18
humana (hIL-18), a su modo de unión a su receptor y
a procedimientos que permiten un diseño y selección adicionales de
moléculas con actividad similar a la de la
hIL-18.
La IL-18 es un tipo de citoquina
o sustancia que media la transducción de señales en el sistema
inmunitario. Tal como se observa en las publicaciones "kokai"
de patente japonesa números 27.189/96 y 193.098/96 y Okamura et
al., Nature, Vol. 378, Nº 6.552, págs. 88-91
(1995), la IL-18 se designó provisionalmente como un
"factor inductor de interferón-gamma"
inmediatamente tras su descubrimiento. Ésta designación se cambió
más tarde a "IL-18" según la propuesta en
Ushio, et al., Journal of Immunology, Vol. 156, págs.
4.274-4.279 (1996). La IL-18, en su
forma madura, consiste en 157 aminoácidos. Induce a células
inmunocompetentes a producir interferón gamma (a continuación en el
presente documento abreviado como
"IFN-gamma."), que es una proteína
biológicamente activa útil que puede inducir y aumentar la
generación y citotoxicidad de células citolíticas. Actualmente está
en marcha una investigación extensiva para desarrollar y explorar la
diversa utilidad de la IL-18 en productos
farmacéuticos. Estas aplicaciones muy esperadas incluyen el uso de
la IL-18 como agente antiviral, antimicrobiano,
antitumoral y antiimmunopático.
En la naturaleza, las citoquinas, incluyendo la
IL-18, se producen y se secretan como substancias
responsables de la transducción de señales en el sistema
inmunitario. Por lo tanto, cuando se administran citoquinas al
organismo de mamíferos, alteran el equilibrio que existe de manera
natural en el sistema inmunitario de los mamíferos. Las superficies
de las células de los mamíferos tienen sitios o "receptores"
que son responsables del reconocimiento de citoquinas y las
citoquinas secretadas no transducen señal en las células hasta que
están unidas a los receptores. En un sistema inmunitario normal,
existe un equilibrio definido entre las respectivas citoquinas y
sus receptores. Existen actualmente necesidades no cumplidas en el
descubrimiento y aprendizaje de las propiedades biológicas y
estructurales de la IL-18 y sus receptores y el uso
de tal conocimiento en el diseño de fármacos para el tratamiento y
mejora de enfermedades y trastornos tales como infecciones virales
y microbianas, cáncer, inflamación, etc.
La publicación de patente internacional WO
01/58956 da a conocer la estructura de la IL-18
humana en cuando a su secuencia y también da a conocer un
procedimiento para identificar anticuerpos que tienen una alta
afinidad por la IL-18 humana y que pueden
neutralizar su actividad.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a una molécula de la proteína IL-18 humana que tiene
las coordenadas de la tabla I en una forma nativa esencialmente
pura.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una forma cristalina novedosa de la molécula
IL-18 humana.
Aún en otro aspecto, la presente invención
proporciona información directa sobre el papel específico
desempeñado por los residuos responsables de la unión de la
IL-18 humana a su receptor.
La presente invención proporciona una estructura
cristalina de la IL-18 humana de la proteína nativa,
en la que dicha proteína tiene una sustitución de cisteína por
serina en la posición 38 de SEC ID Nº:1. Basándose en esta
estructura y en modelos moleculares construidos usando proteínas
relacionadas, proporciona medios de determinación de los lugares
más probables para modificar la molécula de hIL-18
sin comprometer su actividad biológica y procedimientos para usar
esta forma cristalina en la identificación, mejora o antagonización
de la actividad biológica de la hIL-18.
Se ha determinado la estructura cristalina de la
IL-18 humana en su forma nativa mediante sustitución
molecular y refinado a una resolución de 2,06 \ring{A}. La
IL-18 humana novedosa, como la IL1\beta, está
plegada en un barril-\beta central, cerrado con
un plegamiento \beta-trifolio global. Los
siguientes residuos forman las tres partes de la hoja de trébol:
(i) 10-47 y 150-156, (ii)
103-149 y (iii) 47-102 y
1-9. Se espera que la estructura de la
IL-18 humana sea similar a la de la
IL-18 murina ya que las secuencias de estas
IL-18 son altamente homólogas (identidad del 65%).
La información derivada de la estructura de la IL-18
humana arroja luz sobre cómo pueden formarse complejos con agentes
farmacológicos que alterarían las propiedades de la
IL-18 humana, tales como la semivida e
inmunogenicidad, mientras que mantienen su actividad biológica. En
ausencia de información estructural del complejo
hIL-18-receptor, se usan la
estructura de la hIL-18 y la del complejo
IL1\beta-receptor de IL1\beta como modelos para
interacciones entre la hIL-18 y su receptor y
proporcionan una orientación racional sobre dónde situar agentes
potenciales en la molécula de hIL18. La IL1\beta y la
hIL-18 tienen estructuras y plegamiento global
similares, pero son evidentes grandes diferencias en las dos
estructuras cerca y en las posiciones de los bucles. En el complejo
IL1\beta-receptor, los residuos en los bucles de
IL1\beta establecen interacciones importantes con el receptor,
principalmente a través de dos superficies. Para identificar los
residuos de IL-18 que pueden interaccionar con el
receptor de IL-18, se mapearon residuos de
IL-18 sobre la estructura de IL1\beta
superponiendo 153 átomos de C\alpha de IL1\beta con
IL-18 para conseguir una media cuadrática global,
r.m.s. y una desviación de 9 \ring{A}. Basándose en esta
superposición, se predice que la hIL-18 interacciona
con su receptor por medio de varias superficies. En una de las
superficies de interacción propuestas, la superficie de contacto
receptor-IL-18 está revestida por
los residuos de IL-18: 4-18,
30-37, 107-112,
128-135 y 145-148. En otra
superficie propuesta ubicada en el otro lado de la molécula, la
superficie de contacto está revestida por los residuos:
1-8, 50-55, 89-93,
103-105 y 155-156. Esto deja a los
residuos 103-149 en la hIL-18 libres
de cualquier interacción con el receptor, y estos residuos están
expuestos en su mayor al disolvente. Entonces, se propone que éste
es el mejor sitio para fijar un agente de derivatización (por
ejemplo, una molécula de polietilenglicol) que no comprometiera la
actividad de unión al receptor de la hIL-18. Esta
propuesta está respaldada por las observaciones de Kim, et
al., en las que se encuentra que la Glu42 y Lys89 son críticas
para la interacción de la IL-18 humana con su
receptor. J. Biol Chem 277(13): 10998-1003
(2002). La Glu42 y Lys89 están colocadas de la misma forma para la
interacción con el receptor de IL-18 en el modelo,
validando además el uso del modelado por cristalografía para
predecir las superficies que interaccionan y las interacciones entre
la citoquina y su receptor.
La tabla I proporciona las coordenadas atómicas
de la IL-18 humana nativa (C38S). Estas coordenadas
se obtuvieron usando un modelo que abarca a los residuos 1 a 156 en
la unidad asimétrica cristalográfica. La secuencia de aminoácidos
de la IL-18 humana nativa se proporciona en SEC ID
Nº: 1. Sin embargo, para los estudios descritos en el presente
documento, se usó C38S mutante.
Se espera que las coordenadas atómicas mostradas
en la tabla I cambien tras el refinamiento de la estructura
cristalina, pero no se espera que la desviación que sufriría como
resultado con respecto a los átomos de C\alpha supere
substancialmente una r.m.s. de 1,0-1,5 \ring{A}.
De manera similar, los ángulos de enlace y las longitudes de enlace
variarán significativamente tal como se observa rutinariamente con
otras proteínas. Engh, et al. (1991) Acta Crystallogr. A47,
392-400. Las interacciones
inter-atómicas permanecerán sin cambios, dentro del
error experimental. La conformación y orientación relativas o la
colocación de residuos en el sitio de unión al receptor estarán
asimismo sin afectar.
La figura 1 proporciona un diagrama de cintas de
la IL-18 humana nativa (C38S) de esta invención con
la vista tomada por abajo del eje del barril \beta y los
segmentos helicoidales representados como cintas y las láminas
\beta representadas como flechas. La cadena de polipéptido es
multicolor, con el color azul en el extremo
N-terminal y el color rojo en el
C-terminal.
La figura 2 proporciona un diagrama de cintas de
los elementos de la estructura secundaria de la
IL-18 humana. Estos elementos estructurales
secundarios de la hIL-18 son:
\beta12-14, \beta2 19-22,
\beta3 28-31, \alpha1 38-41,
hélice 3_{10} 42-44, \beta4
47-54, \beta5 60-67, \beta6
71-75, hélice 3_{10} 77-79,
\beta7 82-84, \beta8 91-92,
\beta9 101-106, \beta10 109-117,
\beta11 123-130, \beta12
133-140, hélice 3_{10} 147-149,
\beta13 151-154.
La figura 3 proporciona diagramas de estructuras
de la IL-18 murina, IL-1\beta
humana e IL-18 humana. La comparación conjunta de
estas estructuras muestra las similitudes conformacionales entre
estas citoquinas estructuralmente relacionadas.
La figura 4 proporciona un diagrama en el que el
modelo de hIL-18 se superpone sobre el complejo
IL1\beta-receptor de IL1. La
IL-18 humana está dibujada con una línea amarilla
delgada y el IL1\beta-IL1 está dibujado con una
línea verde delgada como la citoquina y una línea roja delgada como
el receptor. El diagrama arroja luz sobre la manera en la que la
hIL-18 se une a su receptor, así como la
participación de residuos de aminoácido en interacciones con el
receptor y su actividad biológica.
La invención describe además homólogos,
complejos conjuntos, mutantes y derivados de la estructura
cristalina de la IL-18 humana de la invención.
El término "citoquina", tal como se usa en
el presente documento, significa a proteína que modula el
crecimiento y las actividades funcionales de las células
inmunitarias.
El término "homólogo", tal como se usa en
el presente documento, significa una proteína que presenta al menos
una identidad en la secuencia de aminoácidos del 30% con un dominio
funcional de IL-18 humana. Preferiblemente la
identidad en porcentaje será del 40%, ó el 50%, más preferiblemente
el 60% ó el 70% y más preferiblemente el 80% ó el 90%. Una
identidad del 95% es la más particularmente preferida.
La expresión "complejo conjunto", tal como
se usa en el presente documento, significa la IL-18
humana o un mutante u homólogo de la IL-18 humana
en asociación covalente o no-covalente con un
compuesto o entidad química.
El término "mutante", tal como se usa en el
presente documento, significa el polipéptido de la
IL-18 humana, es decir, un polipéptido que presenta
la actividad biológica de la actividad de la IL-18
humana de tipo natural, caracterizado por la sustitución de al
menos un aminoácido de la secuencia de la IL-18 de
tipo natural. Tal mutante puede prepararse, por ejemplo, mediante
la expresión del ADNc de la IL-18 humana alterado
previamente en su secuencia codificante mediante mutagénesis
dirigida por oligonucleótidos.
El término "r.m.s.", tal como se usa en el
presente documento, significa media cuadrática. Representa la
desviación estándar de la recogida de datos.
El término "pro-IL18", tal
como se usa en el presente documento, significa la forma inactiva,
precursora de la IL18 madura. La IL18 madura no contiene el
"profragmento" y es biológicamente activa.
La expresión "sustitución molecular", tal
como se usa en el presente documento, significa un procedimiento de
resolución de la estructura cristalina usando las coordenadas
atómicas de una molécula estructuralmente relacionada.
También pueden generarse mutantes de la
IL-18 humana mediante la incorporación específica de
sitio de aminoácidos no naturales en la proteína
IL-18 humana usando el procedimiento biosintético
general de Noren, et al., Science,
244:182-188 (1989). En éste procedimiento, se
sustituyen los nucleótidos que codifican los aminoácidos de interés
en la IL-18 humana de tipo natural por un codón sin
sentido "en blanco", TAG, usando mutagénesis dirigida por
oligonucleótidos. Entonces, un supresor dirigido contra este codón
se aminoacila químicamente in vitro con los aminoácidos no
naturales deseados. Entonces, se añade el residuo aminoacilado a un
sistema de traducción in vitro produciendo una enzima
IL-18 humana mutante con el aminoácido no natural
incorporado específico de sitio.
Pueden incorporarse selenocisteína o
selenometionina en citoquina de tipo natural o mutante mediante la
expresión de los ADNc que codifican la IL-18 humana
en cepas auxotróficas de E. coli. Hendrickson, et al.,
EMBO J., 9(5):1665-1672 (1990). El ADNc de
citoquina mutada o de tipo natural puede expresarse en un organismo
huésped en un medio de crecimiento pobre en cisteína o bien
metionina naturales o ambas, pero enriquecido con selenocisteína o
selenometionina o ambas.
La expresión "derivado de un átomo pesado"
se refiere a derivados de la IL-18 humana producidos
modificando químicamente un cristal de IL-18
humana. En la práctica, se sumerge un cristal en una disolución que
contiene la sal metálica deseada, o el compuesto organometálico,
por ejemplo, cloruro de plomo, tiomalato de oro, timerosal o
acetato de uranilo, que tras la difusión en el cristal de la
proteína puede unirse a la proteína. La ubicación del/de los
sitio(s) del/de los átomo(s) de metal pesado
unido(s) puede determinarse mediante análisis de difracción
de rayos X del cristal empapado. Esta información, a su vez, se usa
para generar la información del ángulo de fase necesaria para
construir un mapa de densidad electrónica tridimensional del que se
deriva un modelo de la estructura atómica de la enzima, Blundell,
et al., PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY, Academic Press (1976).
Otro aspecto de esta invención implica un
procedimiento para identificar agonistas o antagonistas de la
IL-18 humana a través de la estructura cristalina
descrita en el presente documento. La estructura cristalina de la
IL-18 humana de la invención permite la
identificación de agonistas o antagonistas de su actividad
citoquina. Tales agonistas/antagonistas pueden ser competitivos,
uniéndose a todo o una parte del receptor de la
IL-18 humana; o no competitivos y unirse a e
inhibir la actividad de la IL-18 ya esté unida o no
al receptor.
Una realización prueba que el cristal de
IL-18 humana de la invención con una variedad de
diferentes moléculas químicas para determinar sitios óptimos para
interacciones entre tales moléculas agonistas/antagonistas
candidatas y hIL-18, o bien como alternativa para
determinar actividades celulares. Por ejemplo, los datos de
difracción de rayos X de alta resolución recogidos de cristales
saturados con disolvente permiten la determinación de posiciones de
unión para la molécula de disolvente. Entonces, pueden diseñarse,
sintetizarse y someterse a prueba moléculas pequeñas que se unirían
fuertemente a esos sitios para determinar sus actividades de
agonista/antagonista de la IL-18 humana.
Otra realización explora informáticamente bases
de datos de moléculas pequeñas para detectar identidades o
compuestos químicos que pueden unirse por completo, o en parte, a la
IL-18 humana o el receptor de la
IL-18 humana, o ambos. Este procedimiento de
exploración y su utilidad se conocen bien en la técnica. Por
ejemplo, tales técnicas de modelado con ordenador se describieron
en una aplicación PCT WO 97/16177, publicada el 9 de Mayo de
1997.
Una vez identificado mediante modelado, entonces
puede someterse a prueba el agonista/antagonista para determinar su
actividad biológica. Por ejemplo, las moléculas identificadas pueden
introducirse mediante formatos de exploración habituales en ensayos
de actividad enzimática para determinar la actividad inhibidora de
los compuestos, o como alternativa, ensayos de unión para
determinar la unión. Un formato de ensayo particularmente preferido
es el ensayo immunosorbente unido a enzima (ELISA). Éste y otros
formatos de ensayo se conocen bien en la técnica y por lo tanto no
son limitaciones para la presente invención.
Los siguientes ejemplos ilustran diversos
aspectos de esta invención.
Ejemplo
1
Se expresó la proIL-18 humana en
E. coli como una proteína soluble con una etiqueta de
hexa-His N-terminal. Se purificó la
proIL-18 con una columna de agarosa
Ni-NTA y se obtuvo la IL-18 madura
rompiendo el prodominio con Caspasa 5. Se modificó por ingeniería
genética la C38S mutante de IL-18 para impedir la
aparición habitual de un enlace intradisulfuro entre el C38 y el
C68 en la IL-18 de tipo natural a pH neutro.
Se suspendieron células de E. coli (10
ml/g) en Tris 50 mM (pH 8), NaCl 500 mM, Glicerol al 5%,
2-mercaptoetanol 10 mM (tampón A) que contenía
pepstatina A 1 \mug/ml y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,4 mM.
Se homogeneizaron las células y entonces se lisaron mediante dos
pases a través de un microfluidizador (M110-Y,
Microfludics) a 82737087,3 Pa (12.000 psi). El residuo de células
se eliminó mediante centrifugación a 30.000 g durante 30 min. El
sobrenadante se aplicó a una columna de agarosa
Ni-NTA y se lavó con 3 volúmenes de columna de
tampón A. Entonces se lavó la columna con 3 volúmenes de columna de
imidazol 30 mM en el tampón A y se eluyó la
proIL-18 con imidazol 300 mM en del tampón A, que se
dializó entonces en HEPES 25 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM,
2-mercaptoetanol 10 mM. Se eliminó el "pro"
dominio etiquetado con hexa-His mediante rotura con
Caspasa 5 etiquetada con hexa-His a una proporción
de proIL-18:Caspasa 5 de 50:1 en peso durante 2
horas a temperatura ambiente. Se ajustó la concentración salina de
la mezcla de proteína hasta NaCl 0,5 M y entonces se aplicó la
mezcla a una columna de agarosa Ni-NTA. La
IL-18 madura fluyó a través de la columna, mientras
que se unieron cantidades traza de proIL-18
intacta, el "pro" dominio, la Caspasa 5 y otros contaminantes
menores a la columna Ni-NTA. Se diluyó 1:10 la
hIL-18 madura en la fracción no retenida de
Ni-NTA con Tris 25 mM (pH 7,5),
2-mercaptoetanol 5 mM (tampón B). Entonces se
aplicó la disolución de proteína a una columna MonoQ y se llevó a
cabo la elución con un gradiente lineal de NaCl
0-0,3 M en tampón B, preferiblemente en 20 volúmenes
de columna. Se combinaron las fracciones recogidas después de la
columna que contienen IL-18 basándose en la
absorbancia a una longitud de onda de 280 nm y los resultados de la
SDS-PAGE. Entonces se aplicó la combinación a una
columna de calidad prep. HiLoad 26/60 Superdex 75, que se equilibró
previamente con Tris 25 mM (pH 8), NaCl 50 mM,
2-mercaptoetanol 5 mM, EDTA 0,1 mM y se llevó a
cabo la elución de la proteína deseada a un caudal de 2,5 ml/min. Se
eluyó la IL-18 como un único pico simétrico. Se
combinaron las fracciones correspondientes a este pico y entonces
se concentró la proteína en la combinación hasta 10,2 mg/ml para la
cristalización. Este producto resultante tenía una pureza superior
al 95% mediante SDS-PAGE y tiene la actividad
deseada. Se usó el análisis de aminoácidos
N-terminales para confirmar su identidad.
La invención descrita en el presente documento
proporciona un método para definir interacciones de ligando con
IL-18 y su receptor:
1.A. Efectos de la unión del ligando sobre la
fluorescencia intrínseca enzimática generada por residuos de
triptófano. La unión de un ligando natural o bien una molécula
derivatizada puede dar como resultado cambios conformacionales que
alteran la fluorescencia intrínseca de la proteína. Usando
tecnología de fluorescencia de flujo interrumpido, se puede usar
este cambio en la fluorescencia intrínseca para definir las
constantes microscópidas de velocidad que están asociadas con la
unión del ligando. Como alternativa, pueden usarse procedimientos
de valoración de la fluorescencia en estado estacionario para
generar la constante de disociación global para la unión. Se
aplican procedimientos habituales para calcular los parámetros
adquiridos.
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Ejemplo
2
Los cristales de IL-18 humana
C38S crecieron como varillas hexagonales a partir de gotas en reposo
equilibradas a través de la fase de vapor a temperatura ambiente
contra un depósito de disolución de 500 \mul que contenía
polietilenglicol (PEG) el 20%, citrato de sodio 0,07 mM a pH 5,6 y
acetato de amonio 0,133 M durante 2-3 semanas en
placas Cryschem. Las gotas contenían 2 \mul de proteína a 10 mg/ml
en NaCl 50 mM, tris 25 mM a pH 8, EDTA 0,1 mM y
\beta-mercaptoetanol 5 mM. Los cristales
pertenecen al grupo espacial P6(1) con dimensiones de la
celda unidad a = 71,4 \ring{A}, b = 71,4 \ring{A}, c = 88,7
\ring{A}, \alpha = \beta = 90º, \gamma = 120º y una copia
de la IL-18 humana en la unidad asimétrica.
Se recogieron los datos de difracción de rayos X
a través de un único cristal de IL-18 humana (C38S)
suspendido mediante un bucle de nailon y se congeló
instantáneamente bajo la corriente fría de gas de nitrógeno. Se
generaron los parámetros de difracción mediante un dispositivo de
carga acoplada ADSC Quantum 210 en la línea del haz 17ID en la
Fuente Avanzada de Fotones ("Advanced Photon Source"), Argonne
National Laboratory, Illinois. Se fijó la longitud de onda del haz
de rayos-x monocromático a 1000 \ring{A}. Se
muestreó el espacio recíproco a etapas de oscilación de 1,0º
alrededor del eje del goniostat \phi. Los datos se procesaron con
HKL2000. Otwinowski, Z. en Proceedings of the CCP4 Study Weekend:
"Data Collection and Processing", 29-30 enero,
SERC Daresbury Laboratory, Inglaterra (1993).
Se determinó la estructura cristalina de la
IL-18 humana mediante sustitución molecular con el
paquete de programas AMoRe [Navaza, J. Acta Cryst. A50,
157-163 (1994)] usando la estructura cristalina de
la IL-18 murina despojada de moléculas de
disolvente como el modelo de búsqueda ya que las proteínas
IL-18 humana y murina del modelo de búsqueda
comparten una identidad en la secuencia de aminoácidos del 65%. Se
colocó la molécula de búsqueda en una celda ortogonal de
dimensiones 100 \ring{A} x 100 \ring{A} x 100 \ring{A}. Se
llevaron a cabo las búsquedas de rotación y traslación cruzadas
usando datos de resoluciones de 20\ring{A} a 4\ring{A} y un
radio de integración de 25\ring{A}. La disolución superior de la
función de rotación cruzada correspondió a la molécula de
IL-18 en la unidad asimétrica y se discriminó
inequívocamente de los picos de ruido. La búsqueda de una
traslación correcta produjo una disolución con un
R-factor de 0,45 y un coeficiente de correlación de
0,47 tras el refinamiento de cuerpo rígido en AMoRe.
Se construyó la estructura de la
hIL-18 nativa a partir de las operaciones de
rotación y traslación encontradas mediante sustitución molecular
usando la estructura de la IL-18 murina. Se
construyó la estructura de la IL-18 humana
siguiendo los mapas de densidad electrónica 2Fo-Fc y
Fo-Fc. Según estos mapas, se puede establecer el
modelo tosco de la IL-18 humana sustituyendo los
aminoácidos presentes en la estructura murina con los de la
proteína humana, así como añadiendo o delecionando residuos. Se usó
el programa gráfico informático interactivo XTALVIEW para realizar
estas manipulaciones. McRee J. Structural Biology 125,
156-165 (1999). Entonces, se sometió este modelo
tosco a series de reasociación simulada, refinamiento posicional y
del factor B usando CNX [Brunger, et al., Science, 235,
458-460 (1987)] y REFMAC [Murshudov, et al.
Acta Crystallographica D5, 240-255 (1997)] seguido
por intervención manual. El refinamiento y reconstrucción manual se
monitorizó mediante la calidad de los mapas de densidad electrónica
2Fo-Fc y Fo-Fc, así como el valor de
la R y R_{libre} cristalográficas. Durante todo el refinamiento,
se usaron datos de reflexión desde infinito a 2,06\ring{A},
cuando fue necesario, explicando el disolvente a granel dentro del
cristal, que puede contribuir a la intensidad de difracción. El
modelo final de la IL-18 humana (C38S) engloba los
residuos 1 a 156 [SEC ID Nº: 1] y 208 moléculas de agua. El factor
R del modelo es de 0,16 y la R_{libre} es de 0,19 para 15.011
reflexiones. Las desviaciones r.m.s. respecto a la geometría
habitual [Engh, et al., Acta Cryst. A47,
392-400 (1991)] son de 0,013 \ring{A} para las
longitudes de enlace y de 1,5º para los ángulos de enlace.
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<110> JANSON, CHERYL A.
\hskip1cmCONCHA, NESTOR O.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ESTRUCTURA CRISTALINA DE LA
IL-18 HUMANA
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> P51336
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> POR ASIGNAR
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
16-04-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/373.293
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-04-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (3)
1. Una composición que comprende una
IL-18 humana en forma cristalina, en la que dicha
proteína tiene una sustitución de cisteína por serina en el residuo
38 de SEC ID Nº:1, y en la que el cristal proteico es un cristal
hexagonal primitivo (P6,) con dimensiones de la celda unidad a =
71,4 \ring{A}, b = 71,4 \ring{A}, c = 88,7 \ring{A}, \alpha
= \beta = 90º y \gamma = 120º.
2. La composición según la reivindicación 1, en
la que dicha IL-18 humana se caracteriza por
un plegamiento \beta-trifolio.
3. Un procedimiento de identificación de un
agonista o un antagonista de la IL-18 humana
seleccionado del grupo constituido por: un péptido, un no péptido y
una molécula pequeña en el que dicho agonista o antagonista puede
aumentar, provocar o bloquear la interacción entre la
IL-18 humana y su receptor, en el que dicho
procedimiento comprende:
- a)
- cristalizar las composiciones según la reivindicación 1 y determinar las coordenadas de la estructura tridimensional definidas en la tabla 1,
- b)
- introducir en un programa informático adecuado dichas coordenadas de estructurales tridimensionales y hacer que el programa muestre dichas coordenadas,
- c)
- crear un modelo tridimensional de un compuesto de prueba en dicho programa informático,
- d)
- mostrar y superponer el modelo de dicho compuesto de prueba sobre las coordenadas estructurales tridimensionales de la proteína IL-18,
- e)
- valorar si el modelo de dicho compuesto de prueba puede afectar a la interacción entre la IL-18 y su receptor; y
- f)
- incorporar dicho compuesto de prueba en un ensayo de actividad de la IL-18; y determinar si dicho compuesto de prueba inhibe o aumenta la actividad biológica de la IL-18 humana, en el que dichos compuestos se identifican como agonistas o antagonistas.
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