ES2202455T3 - Cristales de fragmentos del ligando cd40 y su uso. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION ESTA RELACIONADA CON CRISTALES DE FRAGMENTOS DEL LIGANDO CD40, ESPECIFICAMENTE UN FRAGMENTO SOLUBLE DEL LIGANDO CD40 (116 MPLEO DE ESTOS CRISTALES Y DE LOS COORDINADOS SIMILARES PARA DISEÑAR, IDENTIFICAR, OPTIMIZAR O CARACTERIZAR ENTIDADES QUIMICAS CON PROPIEDADES DE INTERES.

Description

Cristales de fragmentos de ligando de CD40 y su uso.

La presente invención se refiere a una forma cristalina de un fragmento soluble del dominio extracelular de ligando de CD40 humano, y más particularmente, a un cristal de un fragmento de CD40L que contiene los residuos Gly116 a Leu261 ("sCD40L(116-261)") y a su estructura, obtenida mediante difracción de rayos X.

Además, esta invención se refiere a métodos de uso de una estructura de cristal de CD40L, o de un fragmento suyo, y, específicamente sCD40L(116-261), para diseñar, examinar, y optimizar compuestos que afectan a la actividad de CD40L.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunológico consiste en muchos procesos complejos, que, juntos, protegen el cuerpo frente a agentes tóxicos y/o patógenos. Generalmente, se inicia una respuesta inmune cuando determinadas células dentro del cuerpo reconocen los agentes tóxicos o patogénicos. La respuesta se comunica entonces a través de una serie de medios, tales como el contacto célula-célula o mediadores solubles, a otras células involucradas en la respuesta inmune.

Se ha demostrado que el ligando CD40 ("CD40L") interviene en las interacciones de células funcionales T y B involucradas en la respuesta inmune (EP-A-585943). El término CD40L se refiere a un género de polipéptidos que son capaces de ligar CD40, u homólogos suyos. De hecho, la interacción de CD40L con CD40 expresado por células B es la principal interacción molecular responsable de la inducción dependiente del contacto de célula T del crecimiento y la diferenciación de célula B, para la producción de anticuerpos específicos del antígeno. Ligar CD40L de célula T a su contra-receptor CD40 expresado sobre la superficie de linfocitos B da como resultado actividades pleiotrópicas, incluyendo la activación del cambio del isotipo del anticuerpo, la prevención de apoptosis de célula B, el establecimiento de memoria inmunológica, la formación central germinal de tejidos linfoideos, la modulación de la producción de citoquina en células B activadas y la proliferación y diferenciación de células B.

Se puede fabricar una versión soluble de CD40L a partir de la región extracelular o de sus fragmentos. Como es usado aquí, el término CD40L incluye polipéptidos CD40L solubles que carecen de transmembrana y de regiones intracelulares, homólogos y análogos de CD40L o sus derivados. Estudios previos han demostrado que el CD40L es un miembro de la familia de factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés "tumor necrosis factor") de citoquinas. Otros miembros de esta familia incluyen TNF-\alpha, LT-\alpha (linfotoxina \alpha, también conocida como TNF-\beta), LT-\beta, ligando Fas, CD30L y CD27L. El CD40L es un polipéptido ligado a una membrana con una región extracelular en su extremo C, una región transmembrana, y una región intracelular en su extremo N.

Se sabe que varias mutaciones de CD40L causan una inmunodeficiencia severa ligada al cromosoma X, conocida como síndrome de Hiper-IgM ("HIGMS"). El HIGMS se caracteriza por niveles de IgM normales o elevados, pero por niveles bajos o ausencia de IgG, IgA e IgE en suero. Un gen de murina de CD40L "fuera de combate" también carece de expresión de IgG, IgA e IgE, similar al síndrome de Hiper-IgM en el hombre. Estas observaciones sugieren que se requiere el señalamiento de CD40 para la producción de IgG, IgA e IgE, y que esta función no es redundante con otras rutas de señalamiento/adhesión. Los estudios han demostrado que el CD40L también puede jugar un papel en determinadas enfermedades tales como la artritis, el lupus, la esclerosis múltiple, la enfermedad de hospedante contra injerto, la colitis ulcerante, alergias, transplante de tejidos y la generación de anticuerpos contra fármacos antígenos. Por tanto, es evidente que interferir con la interacción CD40-CD40L tiene aplicaciones terapéuticas y de diagnosis de amplio alcance.

Actualmente hay interés en el diseño, la identificación o la obtención de fármacos potenciales candidatos que podrían interferir con la interacción CD40-CD40L. El surgimiento reciente del diseño de fármacos para identificar candidatos que juegan un papel en una ruta biológica fisiológicamente relevante ha proporcionado un enfoque útil para obtener, o diseñar, compuestos guía para fármacos.

Generalmente, este enfoque requiere seleccionar una molécula de proteína objetivo que juega un papel en una ruta biológica fisiológicamente relevante. Típicamente, una vez que se encuentra un ligando, natural o sintético, para la molécula objetivo, se modifica o s optimiza para producir un candidato con las propiedades deseadas.

Con el objetivo de diseñar o modificar un ligando de forma más eficaz, es útil tener una estructura tridimensional para la conformación bioactiva de un ligando conocido mientras se liga a la molécula de proteína objetivo. Además, es valioso entender las interacciones detalladas del ligando con su proteína objetivo mediante el examen de la estructura tridimensional de la proteína objetivo acomplejada por su ligando conocido. Esto permite al artesano preservar las interacciones críticas con la proteína, mientras que se modifican los ligandos candidatos para interaccionar con la proteína de forma más precisa, dando como resultado una mejor potencia y especificidad.

Sin embargo, la estructura de cristal tridimensional de la proteína objetivo frecuentemente no está disponible debido al significativo esfuerzo requerido para obtener cristales de tamaño y resolución suficiente para proporcionar información precisa con respecto a la estructura. Por ejemplo, consume tiempo y a menudo es difícil expresar, purificar y caracterizar una proteína. Adicionalmente, una vez que se obtiene la proteína con suficiente pureza, debe ser cristalizada hasta un tamaño y claridad que es útil para difracción de rayos X y la consiguiente resolución de la estructura. Por tanto, aunque las estructuras de cristal pueden proporcionar una gran cantidad de información valiosa en el campo del diseño y del descubrimiento de fármacos, cristales de determinados compuestos biológicamente relevantes tales como el CD40L, no están disponibles con facilidad para aquellos con conocimientos en la técnica.

Además, aunque la secuencia de aminoácidos de una proteína objetivo o su ligando, tal como CD40L, sea conocido, esta información de la secuencia no permite una predicción precisa de la estructura del cristal de la proteína/ligando. La información de la secuencia tampoco proporciona un conocimiento de las interacciones estructurales, conformacionales y químicas entre un ligando tal como el CD40L y su proteína objetivo.

De este modo, existe la necesidad de un conocimiento detallado de la estructura cristalina tridimensional del dominio extracelular del CD40L, para diseñar, examinar y optimizar de forma eficaz compuestos capaces de interferir con las interacciones CD40L-CD40. Aunque se ha estudiado la unión de CD40 y sus ligandos, y se han encontrado similitudes entre este sistema y el sistema TNF, las diferencias que existen sugieren que estos dos sistemas ligando-receptor utilizan posiciones espacialmente solapadas, pero no idénticas y no conservadas, de residuos de contacto con diferentes determinantes moleculares de unión.

Cristales de CD40L o fragmentos de CD40L de un tamaño y una calidad tal que permita la realización de estudios de difracción de rayos X permitirán a aquellos con conocimientos en la técnica llevar a cabo estudios relacionados con las propiedades de unión del CD40L, así como con las propiedades de unión de moléculas o complejos moleculares que pueden asociarse con CD40L o con un fragmento suyo.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente invención está dirigida a cristales de CD40L o a cristales de fragmentos de CD40L, de tamaño y calidad suficiente para obtener información útil sobre las propiedades del CD40L y de moléculas o complejos que pueden asociarse con CD40L o CD40. La invención reivindicada proporciona la estructura de cristal tridimensional del fragmento Gly116 al Leu261 de CD40L, que puede ser usado para identificar sitios de unión para resolver la estructura de cristales desconocidos, para proporcionar mutantes que tienen propiedades de unión deseables, y en definitiva, para diseñar, caracterizar o identificar moléculas o entidades químicas capaces de interferir con la interacción entre CD40 y CD40L.

En la descripción que sigue se establecerán características y ventajas adicionales de la invención, y en parte serán evidentes a partir de la descripción, o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los objetivos y otras ventajas de la invención se llevarán a cabo y se alcanzarán mediante las composiciones y los métodos señalados de forma particular en la descripción escrita y en las reivindicaciones, así como en las figuras anexas.

Para alcanzar éstas y otras ventajas, y según el propósito de la invención, como se ha incorporado y descrito de forma amplia aquí, la invención se refiere a un cristal de CD40L. Más particularmente, la invención se refiere a un cristal formado mediante un fragmento funcional del dominio extracelular de sCD40L(116-261), en el que el cristal tiene las constantes celulares a=b=77,17 x 10^{-10} m (\ring{A}), c = 90,46 x 10^{-10} m (\ring{A}), \alpha = \beta = 90º, \gamma = 120º, y un grupo espacial de R3, y equivalentes de aquel cristal. Los cristales de CD40L reivindicados son descritos fundamentalmente por las coordenadas estructurales identificadas en la Tabla 1. Los cristales reivindicados en determinadas realizaciones se caracterizan por un resto de posición de unión que comprende Ile127, ser128, Glu129, Ala130, Ser131, Thr135, Ser136, Ala141, Glu142, Lys143, Gly144, Tyr145, Tyr146, Cys178, Asn180, Ser185, Gln186, Ala187, Pro188, Ile190, Ala191, Ser192, Ser197, Pro198, Gly199, Arg200, Phe201, Glu202, Arg203, Ile204, Arg207, Ala209, Thr211, Pro217, Cys218, Gly219, Gln220, Glu230, Leu231, Gln232, Asn240, Val241, Thr242, Asp243, Ser245, Val247, Ser248, His249, Gly250, Thr251, Gly252 y Phe253.

Adicionalmente, la invención se refiere a cristales de moléculas que tienen una posición de unión que comprende al menos Arg207, y preferiblemente, los aminoácidos Lys143, Arg203, Arg207 y Tyr145. Los cristales reivindicados en determinadas realizaciones, están formados a partir de moléculas que tienen un resto de posición de unión que comprende Arg207 rodeado por al menos dos residuos hidrófobos. También se contemplan aquí mutantes, homólogos, co- complejos y fragmentos de los cristales reivindicados.

La invención reivindicada se refiere en determinadas realizaciones a derivados con átomo pesado de la forma cristalizada de un sCD40L(116-261), y, más específicamente, a los derivados con átomo pesado de la forma cristalizada de CD40L descrita antes. En diversas realizaciones, la invención reivindicada se refiere a métodos para preparar formas cristalinas de CD40L, o de sus fragmentos, proporcionando una disolución acuosa que comprende al menos un fragmento de CD40L, proporcionando una disolución de reserva que comprende un agente precipitante, mezclando un volumen de la disolución de CD40L con un volumen de la disolución de reserva y cristalizando el volumen mixto resultante. En determinadas realizaciones, el cristal se obtiene a partir de una disolución acuosa que comprende sCD40L(116-261). En diversas realizaciones, la concentración de CD40L en la disolución acuosa es aproximadamente de 1 a aproximadamente 50 mg/ml, preferiblemente aproximadamente de 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, y más preferiblemente, aproximadamente 10 mg/ml. Los agentes precipitantes usados en la invención pueden ser cualquier agente precipitante conocido en la técnica, preferiblemente uno seleccionado del grupo que consiste en citrato sódico, sulfato amónico y polietilénglicol. Se puede usar cualquier concentración de agente precipitante en la disolución de reserva, sin embargo se prefiere que la concentración sea de aproximadamente 1,0 M a aproximadamente 1,5 M, más preferiblemente de aproximadamente 1,2 M. De la misma manera, se puede variar el pH de la disolución de reserva, preferiblemente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 10, más preferiblemente aproximadamente 7,5.

Se pueden usar varios métodos de cristalización en la invención reivindicada, que incluyen, pero no se limitan a, difusión de vapor, carga, puente líquido, ó diálisis. Se prefiere la cristalización por difusión de vapor.

Adicionalmente, la invención reivindicada se refiere a métodos para usar el cristal reivindicado, y las coordenadas de la estructura en métodos de examen, diseño, u optimización de moléculas u otras entidades químicas que pueden interferir con la interacción entre CD40 y CD40L. Por tanto, las coordenadas estructurales de CD40L o de sus porciones pueden ser usadas para resolver la estructura de cristal de un mutante,un homólogo o un co-complejo de CD40L o de un fragmento suyo, así como resolver otros cristales desconocidos que se asocian con CD40L o con sus fragmentos.

En algunas realizaciones, las coordenadas estructurales del CD40L pueden ser usadas para evaluar una entidad química para obtener información sobre la unión de la entidad química y el CD40L. La invención reivindicada también se refiere a las coordenadas estructurales descritas en la Tabla 1. Las coordenadas estructurales pueden usarse para caracterizar entidades químicas que interfieren con la relación entre CD40 o CD40L tales como inhibidores o agonistas. Las coordenadas también pueden usarse para optimizar características de unión, para determinar la orientación de ligandos en la posición de unión de CD40L o CD40. Alguien con conocimientos en la técnica apreciará los numerosos usos de la invención reivindicada en las áreas de diseño de fármacos,examen y optimización de fármacos candidatos, así como para determinar estructuras de cristal desconocidas adicionales.

En diversas realizaciones, la invención reivindicada se refiere a un medio de almacenamiento de datos leíbles en máquina que tiene un material de almacenamiento de datos codificado con datos leíbles en máquina, que, cuando son leídos por la máquina apropiada, pueden mostrar una representación tridimensional de un cristal. Los cristales mostrados comprende un fragmento de CD40L tal como el descrito por las coordenadas de la Tabla 1, o un cristal que tiene una posición de unión que comprende los aminoácidos Lys143, Arg203, Arg207 y Tyr145.

En otras realizaciones, la invención reivindicada se refiere a un método para determinar al menos una porción de una estructura tridimensional de una entidad química o un complejo molecular mediante el cálculo de fases a partir de las coordenadas estructurales de un cristal o de un fragmento de ligando de CD40, el cálculo del mapa de densidad electrónica a partir de las fases obtenidas, y a continuación la determinación de al menos una porción de la estructura desconocida en base al mapa de densidad electrónica.

En otras realizaciones, la invención se refiere a métodos para evaluar la capacidad de una entidad química para asociarse con CD40 o CD40L. Los métodos emplean medios computacionales o experimentales para llevar a cabo una operación de ajuste entre la entidad química y el CD40 o el CD40L para obtener datos relacionados con la asociación, y para analizar los datos para determinar las características. La invención reivindicada también abarca las entidades químicas identificadas mediante estos métodos que son capaces de interferir con la asociación in vivo o in vitro entre CD40 y CD40L. Las entidades químicas reivindicadas pueden comprender posiciones de unión similares sustancialmente a las de CD40L, o, alternativamente pueden comprender posiciones de unión capaces de asociarse con las posiciones de unión de CD40L.

Debe entenderse que tanto la anterior descripción general como la descripción detallada a continuación son a modo de ejemplo y de explicación y se pretende que proporcionen una aclaración adicional de la invención tal como se reivindica.

Las figuras anexas se incluyen para proporcionar una mayor comprensión de la invención y constituyen y se incorporan a una parte de esta especificación, ilustran varias realizaciones de la invención, y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación de las regiones representativas de un mapa de densidad electrónica 2F_{o}-F_{c} contorneado en 2,5\sigma que muestra residuos en las cercanías de la posición de unión del CD40.

La Figura 2 es un mapa de densidad electrónica que muestra una visión de un entramado de 3 residuos de tirosina y 3 de histidina formado en las cercanías del centro del trímero de CD40.

La Figura 3 es un estereodibujo de la estructura tridimensional de CD40L humano específicamente, CD40L C\alpha de cadena principal.

La Figura 4 es una representación en lazo y la asignación de estructura secundaria de CD40L.

La Figura 5 es una alineación de secuencia de los dominios tipo TNF de TNF\alpha, Lt\alpha y CD40L en base a consideraciones estructurales.

La Figura 6 es un gráfico de los factores de temperatura de los átomos de la cadena principal en función del número del residuo. Los residuos están numerados con Pro120 como residuo 1.

La Figura 7 es una representación de los residuos que se incluyen en el Hiper-IgM y en mutaciones diseñadas. El tercer monómero ha sido eliminado para simplificar.

La Figura 8 es un compendio de datos cristalográficos y de refinado de sCD40L(116-261).

Descripción detallada de la invención

Con el objetivo de que la invención descrita aquí pueda ser comprendida en mayor medida, se incluye la siguiente descripción detallada.

La presente invención se refiere a un cristal de un fragmento soluble de un dominio extracelular del ligando CD40. Específicamente, se refiere a un cristal de una,proteína que comprende la secuencia a partir de Gly116 hasta Leu261 (sCD40L(116- 261)), la estructura de sCD40L(116-261) determinada por cristalografía de rayos X, y el uso de la estructura de sCD40L(116-261) y la de sus homólogos, mutantes y co-complejos para diseñar, identificar, caracterizar, examinar y/u optimizar candidatos inhibidores o agonistas de la actividad de CD40L.

A. Definiciones

El término ligando de CD40 ("CD40L") como es usado aquí se refiere a un género de polipéptidos que son capaces de unirse a CD40, u homólogos o sus fragmentos.El término como es usado aquí incluye sCD40L(116-261), sus homólogos, mutantes, equivalentes y fragmentos.

El término "co-complejo" se refiere a un CD40L o a un mutante u homólogo de CD40L en asociación covalente o no covalente con una entidad química.

El término "homólogo" se refiere a una proteína que tiene al menos aproximadamente una identidad del 50% de la secuencia de aminoácidos con la proteína con la que se compara.

El término "mutante" se refiere a un CD40L o a un fragmento suyo, caracterizado por la sustitución, eliminación, o inserción de al menos un aminoácido de tipo natural. Dicho mutante puede ser preparado, por ejemplo, mediante la expresión de un CD40L alterado previamente en su secuencia codificadora mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos.

El término "aminoácido cargado positivamente" incluye cualquier aminoácido, natural o no natural, que tiene una cadena lateral cargada positivamente bajo condiciones fisiológicas normales. Ejemplos de aminoácidos cargados positivamente de existencia natural son la arginina, la lisina y la histidina.

El término "aminoácido cargado negativamente" incluye cualquier aminoácido, natural o no natural, que tiene una cadena lateral cargada negativamente bajo condiciones fisiológicas normales. Ejemplos de aminoácidos cargados negativamente de existencia natural son el ácido aspártico y el ácido glutámico.

El término "aminoácido hidrófobo" significa cualquier aminoácido que tiene una cadena lateral sin carga, no polar que es relativamente insoluble en agua. Ejemplos son la alanina, la leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptófano y la metionina.

El término "aminoácido hidrófilo" significa cualquier aminoácido que tiene una cadena lateral sin carga, polar que es relativamente soluble en agua. Ejemplos son la serina, la treonina, la tirosina, la asparagina, la glutamina y la cisteína.

El término "carga superficial alterada" significa un cambio en una o más de las unidades de carga de un polipéptido mutante, a pH fisiológico, en comparación con el ligando de CD40. El cambio en la carga superficial puede determinarse midiendo la punto isoeléctrico (pI) de la molécula de polipéptido que contiene el aminoácido sustituido y comparándolo con el pI de la molécula de tipo natural.

El término "asociado con" se refiere a una condición de proximidad entre dos entidades químicas, o sus porciones, por ejemplo, un ligando de CD40 o sus porciones y una entidad química. La asociación puede ser no covalente, en la que la yuxtaposición está favorecida energéticamente por enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, o interacciones electrostáticas, o puede ser una asociación covalente.

El término "posición de unión" se refiere a cualquiera o a todas las posiciones en las que una entidad química se une o asocia con otra entidad.

El término "coordenadas estructurales" se refiere a coordenadas derivadas de las ecuaciones matemáticas relativas a los espectros obtenidos por difracción de un rayo monocromático de rayos X a través de los átomos (centros de dispersión) de la moléculaen la forma de cristal. Los datos de difracción se usan para calcular un mapa de densidad electrónica de las unidades de repetición del cristal.

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Aquellos con conocimientos en la técnica entenderán que los datos obtenidos dependen del sistema particular usado, y por tanto, en efecto diferentes coordenadas pueden describir el mismo cristal si tales coordenadas definen de forma sustancial la misma relación que aquellas descritas aquí. Los mapas de densidad electrónica se usan para establecer las posiciones de los átomos individuales dentro de la celda unidad del cristal.

Aquellos con conocimientos en la técnica entienden que un conjunto de coordenadas estructurales determinadas mediante cristalografía de rayos X no está sin error estándar. La Tabla 1 son las coordenadas atómicas de sCD40L(116-261). Para el propósito de esta invención, cualquier conjunto de coordenadas estructurales de CD40L(116-261) que tienen una desviación de raíz cuadrada media de átomos de cadena principal de proteína equivalente inferior a aproximadamente 2 x 10^{-10} m (\ring{A}) cuando se superponen, usando átomos de cadena principal, sobre las coordenadas estructurales de la Tabla 1 se considerarán idénticas. Preferiblemente la desviación es inferior a aproximadamente 1 x 10^{-10} m (\ring{A}) y más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,5 x 10^{-10} m (\ring{A}).

El término "derivatización con átomo pesado" se refiere a un método para producir una forma químicamente modificada de un ligando de CD40 cristalizado. En la práctica,se empapa un cristal de una disolución que contiene sales de átomos de metal pesado,o compuestos organometálicos, por ejemplo, cloruro deplomo, tiomalato de oro, timerosal o acetato de uranilo, que pueden difundirse a través del cristal y unirse a la superficie de la proteína. La localización del átomo(s) de metal pesado unido(s) puede determinarse mediante análisis de difracción de rayos X del cristal empapado. Esta información puede usarse para generar la información de fases usada para construir la estructura tridimensional de la molécula.

El término "celda unidad" se refiere a un bloque de forma básica. El volumen total de un cristal puede construirse mediante el montaje regular de dichos bloques. Cada celda unidad comprende una representación completa de la unidad de diseño, cuya repetición conforma el cristal.

El término "grupo espacial" se refiere al conjunto de elementos de simetría de un cristal.

El término "sustitución molecular" se refiere a un método que incluye generar un modelo estructural preliminar de un cristal cuyas coordenadas estructurales son desconocidas, orientando y posicionando una molécula cuyas coordenadas estructurales son conocidas, por ejemplo, las coordenadas del ligando de CD40 de la Tabla 1, dentro de la celda unidad del cristal desconocido para explicar mejor el espectro de difracción observado en el cristal desconocido. Entonces se pueden calcular las fases a partir de este modelo, y se combinan con las amplitudes observadas para proporcionar una síntesis de Fourier aproximada de la estructura cuyas coordenadas se desconocen. Esta a su vez puede ser sometida a cualquiera de las diversas formas de refinado para proporcionar una estructura final precisa del cristal desconocido.(Véase, por ejemplo, Lattman, E., "Use of the Rotation and Translation Functions", Methods in Enzymology, 115, pp. 55-77 (1985); Rossman, ed., "The Molecular Replacement Method", Int. Sci. Rev. Ser. Nº 13, Gordon and Breach, Nueva York (1972). Específicamente incorporado aquí por referencia). Usando las coordenadas estructurales del ligando de CD40 proporcionadas por esta invención, la sustitución molecular puede usarse para determinar las coordenadas estructurales de un co-complejo cristalino, de un ligando desconocido,de un mutante, de un homólogo, o de una forma cristalina diferente del ligando de CD40. Adicionalmente, el cristal reivindicado y sus coordenadas pueden ser usados para determinar las coordenadas estructurales de una entidad química que se asocia con CD40L o con CD40.

El término "entidad química" como es usado aquí significará, por ejemplo, cualquier molécula, complejo molecular, compuesto o fragmento suyo.

Se pueden generar mutantes de CD40L mediante incorporación de posición específica de aminoácidos naturales o no naturales al CD40L usando métodos biosintéticos generales conocidos por aquellos con conocimientos en la técnica. Por ejemplo, el codón que codifica el aminoácido de interés en el CD40L de tipo natural puede ser reemplazado por un codón "blanco" sin sentido, tal como TAG, usando la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. A continuación puede aminoacilarse químicamente un supresor tARN dirigido contra este codón in vitro con el aminoácido deseado. El tARN aminoacilado puede entonces añadirse a un sistema de traducción in vitro para dar lugar un sCD40L mutante con el aminoácido incorporado en la posición específica.

El término fragmento de CD40L soluble y cualquier término equivalente usado aquí, se refiere a un fragmento funcional de CD40L. El término "funcional" como es usado en este contexto se refiere a un fragmento soluble del dominio extracelular que es capaz de unirse a, o de asociarse con, un CD40, una proteína de fusión CD40-Ig o cualesquier fragmentos u homólogos suyos, incluyendo los complejos moleculares que comprenden fragmentos suyos. Tal unión puede demostrarse a través de experimentos de inmunoprecipitación, usando los protocolos estándar conocidos en la técnica.

B. CD40L, su cristal, y sus implicaciones biológicas

Se entenderá que en todas las especificaciones y reivindicaciones, la localización posicional de los aminoácidos descritos no es un valor absoluto, sino más bien, define la relación relativa de los residuos. Por tanto se pretende que la presente invención abarque las secuencias que tienen las mismas o similares posiciones relativas.

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Por primera vez, la presente invención permite el uso de técnicas de diseño molecular para diseñar, examinar y optimizar entidades químicas y compuestos, incluyendo compuestos inhibidores, capaces de unirse en la posición activa o en la posición de unión accesoria de CD40L, por completo o en parte. El ligando de CD40 (CD40L) es una citoquina pleiotrópica unida a membrana de célula T de un interés biomédico considerable debido a su participación en importantes funciones del sistema inmune mediadas por la unión del CD40L a CD40. El CD40 es una molécula expresada sobre la superficie de células B y otros tipos de célula. El CD40L se encuentra en varios organismos, tales como humanos, ratones, ratas, cerdos, etc. La invención reivindicada no pretende limitarse a una especie u organismo particular.

El CD40L es un miembro de la familia de ligandos del factor de necrosis tumoral. La estructura del cristal de otro miembro de esta familia, la linfotoxina \alpha (LT\alpha) acomplejada con su receptor, ha sido descrita y ha sido usada como un modelo para comprender la estructura de cristal del CD40L. Sin embargo, a pesar de ciertas similitudes, las diferencias entre el sistema LT y el sistemaCD40 confirman que los dos sistemas ligando-receptor utilizan posiciones espacialmente solapadas, pero no idénticas y no conservadas, de residuos de contacto con diferentes determinantes moleculares de unión.

Considerando la complejidad y la coincidencia de los diversos procesos del sistema inmune, el hecho de que la señal de CD40 parece no ser redundante sugiere que inhibir la señal de CD40L puede tener importantes aplicaciones terapéuticas. Se espera que la estructura de cristal del CD40L presentada aquí sea útil en el diseño, la identificación, la caracterización y la optimización de tales agentes terapéuticos.

La siguiente descripción detallada de las aplicaciones de la invención abarca (a) la estructura de cristal del CD40L(116-261) y sus coordenadas, (b) las posiciones de unión del CD40L, (c) los métodos de fabricación de un cristal de CD40L, y (d) los métodos de uso del cristal de CD40L y de sus coordenadas estructurales.

(a.) Estructura de cristal del ligando de CD40

La invención reivindicada proporciona cristales de ligando de CD40, así como la estructura del ligando de CD40 determinada a partir de ellos. Específicamente, la invención reivindicada proporciona cristales de un fragmento del ligando de CD40 (116-261) que tiene celdas unidad que son romboédricas, y que tienen las siguientes dimensiones a = b = 77,17 x 10^{-10} m (\ring{A}) y c = 90,46 x 10^{-10} m (\ring{A}), \alpha = \beta = 90 x 10^{-10} m (\ring{A}) y \gamma = 120 x 10^{-10} m (\ring{A}). Casi todos los residuos del fragmento de ligando de CD40, excepto para los residuos de 116 a 119 del extremo N, están bien definidos en el mapa de densidad electrónica final mostrado en la Figura 1. Hay áreas de poca intensidad para los residuos de 182 a 186 y de 210 a 220. El modelo actual consiste en 142 residuos de aminoácido y 95 moléculas de agua con un factor cristalográfico R de 21,8% y un R_{libre} de 29,1% para los datos entre 7,5 x 10^{-10} m (\ring{A}) y 2 x 10^{-10} m (\ring{A}). El diagrama de Ramachandran muestra que 140 de los 142 residuos de aminoácido tienen ángulos (\Psi, \Phi) dentro de las regiones permitidas. Las excepciones son el residuo Cys218, que participa en la formación de un puente de disulfuro, y el Lys143.

El ligando de CD40 se pliega como un sandwich de dos láminas \beta con topología "jelly roll" o con topología de llave griega (Figura 3). Las dimensiones de la molécula son 25 x 10^{-10} m (\ring{A}) x 30 x 10^{-10} m (\ring{A}) x 50 x 10^{-10} m (\ring{A}). El pliegue general es similar al de TNF-\alpha y al de LT-\alpha. La notación usada aquí es la descrita en Eck y col. "The structure of Human Lymphotoxin", J. Biol. Chem., 267, 2119- 2112, para las cadenas \beta y otras características estructurales. Una lámina \beta consiste en cadenas A''AHCF, y la otra consiste en cadenas B´BGDE. Para determinar el grado de similitud estructural entre TNF-\alpha, LT-\alpha y el ligando de CD40, se alinearon las secuencias para maximizar el solapamiento de los residuos equivalentes de cadena \beta. Los átomos C\alpha equivalentes de las cadenas \beta fueron usados para superponer las estructuras moleculares. La desviación posicional de la raíz cuadrada media (rms, del inglés "root mean square") de 86 átomos C\alpha equivalentes de TNF-\alpha y moléculas de CD40L superpuestas es de 1,10 x 10^{-10} m (\ring{A}). En el caso del par LT/CD40L, la desviación de rms para los 100 átomos C\alpha es de 1,03 x 10^{-10} m (\ring{A}). Las posiciones de los residuos se conservan altamente en el núcleo y en las regiones de cadena \beta, pero difieren significativamente en determinados lazos, tales como los lazos AA'', CD y EF. Se realizó un alineamiento de las secuencias de
TNF-\alpha, LT-\alpha y CD40L en base a las mejores superposiciones estructurales. Figura 5. La mayoría de los residuos del núcleo hidrófobo de CD40L mantiene la identidad del carácter encontrado en los residuos equivalentes de TNF y LT. Hay cambios conformacionales, localmente compensatorios para acomodar los cambios en las cadenas laterales, tales como la sustitución de Leu33 de LT-\alpha por Val136 en el CD40L, que da como resultado un desplazamiento de la cadena lateral de Leu161 para llenar el espacio vacío.

Tres moléculas de CD40L forman un trímero similar al observado en las estructuras de cristal de TNF-\alpha y de LT-\alpha. El trímero tiene la forma de una pirámide truncada, el triple eje del trímero es aproximadamente paralelo a las cadenas \beta de cada subunidad. La interfase entre las subunidades está formada principalmente por dos tirosinas, dos histidinas y una leucina. De este modo, el "tejado aromático" observado en la LT no están frecuente en el CD40L. La Tyr170 y la His224 de cada monómero forman un grupo inusual de dos triadas a lo largo del eje triple del trímero.

También se estudió el empaquetamiento cristalino de los trímeros de CD40L. Cada monómero de CD40L forma un contacto cristalino que incluye lazos DE (residuos 198 a 201), FG (232 a 233) y BC (64 a 166) de una molécula y lazos CD (182 a 186), AA'' (131 a 135) y GH (245 a 246) de una molécula colindante. En la formación del contacto participan dieciséis moléculas de agua.

Los lazos CD y EF del CD40L en la parte "superior" de la molécula son más cortos que los de TNF-\alpha y
LT-\alpha. Sin embargo, a pesar de su menor longitud, el lazo CD contiene 1,5 giros de una hélice de forma similar al lazo equivalente en la LT. En estos lazos existen análogos de regiones de LT de poca densidad electrónica lo cual puede indicar desorden. Además, una representación de los factores de temperatura (Figura 6) sugiere que los lazos CD y EF son las partes más móviles de la molécula. Las cadenas C y F están unidas mediante un puente de disulfuro entre Cys178 y Cys218 lo cual puede jugar un papel en la estabilización de la parte superior de la molécula. También hay un puente de disulfuro presente en el TNF pero está localizado en una posición diferente. Aunque el lazo AA'' no difiere mucho entre el TNF y la LT, en el CD40L tiene una estructura muy diferente. En el CD40L el lazo AA'' está desplazado desde la posición de unión en relación con el TNF y la LT. La conformación inusual del lazo AA'' puede estar relacionada con su participación extensiva en el contacto cristalino. Una estructura corta de 10 hélices se encuentra dentro del lazo GH, y existe un bulto en el medio de la cadena E. Los extremos N y C permanecen cerca uno del otro en la base del trímero. Los residuos 116 a 119 del extremo N del constructo están poco definidos en el mapa de densidad electrónica, por tanto, el primer residuo bien ordenado es Pro120. Los residuos 116 a 119 presumiblemente constituyen una parte del tronco que conecta el dominio globular al segmento transmembrana. Este tronco de 65 residuos es inusualmente largo en comparación con los segmentos equivalentes en otros miembros de la familia TNF.

Se predice una única posición de glicosilación a partir del análisis de la secuencia de CD40L. Los experimentos biomédicos revelaron que el residuos Asn240 de la proteína de CD40L usada para la cristalización tiene un carbohidrato unido por N adosado a él. Un mapa 2F-Fc muestra densidad electrónica en las proximidades de la cadena lateral de Asn240 que presumiblemente corresponden al carbohidrato adosado. Sin embargo,debido a que la densidad no está bien definida, el modelo actual no contiene átomos de carbohidrato en esta posición.

(b.) Posición de unión

Por analogía con la estructura de cristal de complejo LT-TNFR la posición de unión del CD40 consiste en una ranura estrecha formada entre dos monómeros. Se espera que el complejo de activación de CD40L-CD40 sea similar al complejo LT-TNFR. Basándose en los diagramas de unión que muestran qué residuo de LT interacciona con qué residuo de TNFR, se dedujeron extensiones de la secuencia de CD40L que probablemente constituyen la posición de unión.

Los solicitantes han determinado que la posición de unión del CD40L comprende Arg207 en proximidad física con al menos dos residuos hidrófobos. Más específicamente, la posición de unión comprende al menos los aminoácidos Lys143, Arg203, Arg207 y Tyr145. Otros muchos residuos pueden incluirse en la posición de unión, incluyendo, pero no limitándose a, Ile127, Ser128, Glu129, Ala130, Ser131, Thr135, Ser136, Ala141, Glu142, Lys143, Gly144, Tyr145, Tyr146, Cys178, Asn180, Ser185, Gln186, Ala187, Pro188, Ile190, Ala191, Ser192, Ser197, Pro198, Gly199, Arg200, Phe201, Glu202, Arg203, Ile204, Arg207, Ala209, Thr211, Pro217, Cys218, Gly219, Gln220, Glu230, Leu231, Gln232, Asn240, Val241, Thr242, Asp243, Ser245, Val247, Ser248, His249, Gly250, Thr251, Gly252 y Phe253.

Una persona con conocimientos en la apreciará que se pueden realizar modificaciones en la posición de unión, tales como sustituciones, injertos o eliminaciones, y la posición de unión mantendrá su actividad. Por tanto, se contempla que una posición de unión que comprende al menos un 50% de homología con la definida antes queda abarcada por la invención. Más específicamente, se prefiere tener aproximadamente un 60% de homología, y aún más se prefiere tener aproximadamente 75-99% de homología. Variaciones en el porcentaje de homología con la posición de unión definida antes pueden alterar las propiedades de unión de la entidad resultante. En una realización preferida, la posición de unión comprende al menos 30 residuos de la lista anterior.

Se esperaba que la posición de unión contuviera residuos en su mayoría de lazos AA'' y DE. Además, se esperaba que los residuos de los lazos CD y GH y de las cadenas B, C, D, G y H participaran en la unión de CD40. Virtualmente no existe una conservación de la secuencia entre el CD40L y la LT-\alpha o el TNF-\alpha en estas regiones. Aunque la Ser131 del lazo AA'' parece conservarse en la alineación de la secuencia, la superposición estructural muestra que está relativamente lejos de la posición equivalente (Ser38) en la LT. La cadena lateral de Tyr45 del lazo AA'' del CD40L está desordenada, pero se encuentra en una posición equivalente en Arg51 de la LT, y, como la Arg51 en el complejo LT-\alpha-TNFR, puede tener una conformación extendida y bien definida en el complejo. En el lazo DE, sólo se conserva la Phe201 (equivalente a la Phe110 de la LT). La Phe110 adopta una conformación diferente. La cadena lateral de Arg200 en el lazo DE participa en un contacto cristalino. La conformación de los lazos DE, AA'' y GH probablemente está afectada por el contacto cristalino, por tanto, se espera que su estructura será diferente en un complejo. Los cambios conformacionales asociados a la formación del complejo en el caso de la LT, aunque menores, pueden ser indicativos de una magnitud de cambios que tienen lugar con la unión de CD40 a CD40L.

La superficie de la posición de unión está formada por una mezcla tanto de residuos hidrófobos como de residuos hidrófilos. La interfase de unión LT-TNFR puede considerarse como dos regiones separadas, inferior y superior. De forma similar a la LT,la región superior en el CD40L tiene residuos polares no cargados más hidrófobos que la región inferior. La Arg207 es un residuo importante, que permanece en el área en la que las regiones superior e inferior conectan. La cadena lateral de Arg207 adopta una conformación extendida que apunta hacia la localización putativa del receptor CD40, y está rodeada por al menos dos residuos hidrófobos expuestos a la superficie y un residuo serina (Ser192). Dos de los residuos hidrófobos (190 y Phe253) pertenecen a la subunidad colindante, mientras que la Ile204 es de la misma subunidad. El CD40L de murina tiene una lisina en la posición equivalente a la de la Arg207 del CD40L humano,y esta lisina también parece estar rodeada por residuos hidrófobos. El entorno hidrófobo de la arginina puede amplificar la fuerza de una posible interacción electrostática entre este residuo y un residuo ácido de CD40.

(c.) Métodos de fabricación de un cristal de CD40L

En diversas realizaciones, la invención reivindicada se refiere a métodos para preparar formas cristalinas de CD40L, o de fragmentos suyos, proporcionando en primer lugar una disolución acuosa que comprende CD40L o un fragmento de CD40L. A continuación se mezcla una disolución de reserva que comprende un agente precipitante con un volumen de la disolución de CD40L y entonces se cristaliza el volumen mixto resultante. En determinadas realizaciones, el cristal se deriva a partir de una disolución acuosa que comprende sCD40L(116-261). La concentración de CCD40L en la disolución acuosa puede variar, y es preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, y aún más preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml. De forma similar, los agentes precipitantes usados en la invención pueden variar, y pueden ser seleccionados entre cualquier agente precipitante conocido en la técnica. Preferiblemente, el agente precipitante se selecciona del grupo que consiste en citrato sódico, sulfato amónico y polietilénglicol. Se puede usar cualquier concentración de agente precipitante en la disolución de reserva, sin embargo se prefiere que la concentración sea de aproximadamente 1,0 M a aproximadamente 1,5 M, más preferiblemente aproximadamente 1,2 M. El pH de la disolución de reserva también puede ser variado, preferiblemente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 10, más preferiblemente aproximadamente 7,5. Alguien con conocimientos en la técnica comprenderá que cada uno de estos parámetros puede ser variado sin una experimentación innecesaria y todavía se obtendrán cristales aceptables. En la práctica, una vez que se determinan adecuadamente los agentes precipitantes, disoluciones tampón u otras variables experimentales para cualquier método de cultivo dado, cualquiera de estos métodos o cualesquier otros métodos pueden ser usados para cultivar los cristales reivindicados. Una persona con conocimientos en la técnica puede determinar las variables dependiendo se sus necesidades particulares.

Se pueden usar varios métodos de cristalización en la invención reivindicada, que incluyen, pero no se limitan a, difusión de vapor, carga, puente líquido, o diálisis. Se prefiere la cristalización por difusión de vapor. Véase, por ejemplo, McPherson y col.,"Preparation and Analysis of Protein Crystals", Glick., Ed., páginas 82 a 159, John Wiley & Co. (1982); Jancarik y col., "Sparse matrix sampling: a screening meted for crystallization of protein", J. Appl. Cryst. 24, páginas 409 a 411 (1991), específicamente incorporado aquí por referencia.

En la cristalización por difusión de vapor, se mezcla un pequeño volumen (es decir, unos pocos mililitros) de la disolución de proteína con una disolución que contiene un agente precipitante. Este volumen mixto se suspende sobre un pocillo que contiene una pequeña cantidad, es decir de aproximadamente 1 ml, de la disolución precipitante. La difusión de vapor desde la gota hasta el pocillo dará como resultado la formación del cristal en la gota.

El método de cristalización por diálisis utiliza una membrana de exclusión de tamaño semipermeable que retiene la proteína pero permite la difusión dentro y fuera de pequeñas moléculas (es decir, disoluciones tampón y agentes precipitantes). En la diálisis, en lugar de concentrar la proteína y el agente precipitante por evaporación, se permite al agente precipitante que se difunda lentamente a través de la membrana y que se reduzca la solubilidad de la proteína mientras se mantiene fija la concentración de proteína.

Los métodos por lotes generalmente incluyen la adición lenta de un agente precipitante a una disolución acuosa de proteína justo hasta que la disolución se vuelve turbia, en este punto el recipiente puede ser sellado y aislado durante un periodo de tiempo hasta que tenga lugar la cristalización.

De este modo, los solicitantes pretenden que la invención reivindicada abarque cualquiera y todos los métodos de cristalización. Alguien con conocimientos en la técnica puede elegir cualquiera de dichos métodos y variar los parámetros de tal forma que el método elegido dé como resultado los cristales deseados.

(d.) Uso del cristal de CD40L y de sus coordenadas

Los cristales reivindicados, y las coordenadas que los describen, permiten el uso de técnicas de diseño molecular para diseñar, seleccionar y sintetizar entidades y compuestos químicos, incluyendo compuestos inhibidores o agonistas capaces de unirse a, o de asociarse con, la posición de unión de CD40L o de CD40 totalmente o en parte.

Un enfoque que permite esta invención es el uso de las coordenadas estructurales del CD40L para diseñar entidades químicas que se unen a, o que se asocian con, CD40L y alteran las propiedades físicas de los compuestos en diferentes formas. Por tanto, propiedades tales como, por ejemplo, la solubilidad, la afinidad, la especificidad, la potencia, las velocidades todo/nada u otras características de unión pueden ser todas alteradas y/u optimizadas.

Uno puede diseñar entidades químicas deseadas probando un cristal de CD40L con una librería de diferentes entidades para determinar las posiciones óptimas para la interacción entre las entidades químicas candidatas y el CD40L. Por ejemplo, los datos de difracción de rayos X de alta resolución obtenidos para cristales saturados con disolvente permiten la determinación de dónde se ancla cada tipo de molécula de disolvente. Las moléculas pequeñas que se unen fuertemente a las posiciones pueden entonces ser diseñadas y sintetizadas y se puede evaluar si tienen la actividad deseada. Una vez que se obtiene la actividad deseada, las moléculas pueden ser optimizadas aún más.

La invención reivindicada también hace posible examinar computacionalmente bases de datos de moléculas pequeñas o diseñar computacionalmente entidades o compuestos químicos que pueden unirse, total o parcialmente, a CD40 o a CD40L. También pueden ser usados para resolver la estructura de cristal de mutantes, co-complejos, o de la forma cristalina de cualquier otra molécula homóloga a, o capaz de asociarse con, al menos una porción de CD40L.

Un método que puede ser empleado para este fin es la sustitución molecular. Se puede determinar una estructura de cristal desconocida, que puede ser cualquier estructura desconocida, tal como, por ejemplo, otra forma cristalina de CD40L, un mutante de CD40L, o un co-complejo con CD40, o cualquier otro cristal desconocido de una entidad química que se asocia con CD40L que sea de interés, usando las coordenadas estructurales de esta invención, fijadas en la Tabla 1. Los co-complejos con CD40L pueden incluir, pero no limitarse a, CD40- CD40L, CD40L-molécula pequeña, y CD40-fragmentos derivados. Este método proporcionará una forma estructural precisa para el cristal desconocido más rápidamente y de forma más eficaz que si se intenta determinar dicha información sin la invención reivindicada.

La información obtenida puede por tanto ser usada para optimizar inhibidores potenciales o agonistas de CD40L, o CD40, y más importante, para diseñar y sintetizar nuevas clases de entidades químicas que afectarán la relación entre CD40L y CD40.

El diseño de compuestos que inhiben o agonizan CD40L según esta invención generalmente incluye la consideración de al menos dos factores. En primer lugar, el compuesto debe ser capaz de asociarse físicamente o estructuralmente con CD40L o con CD40. La asociación puede ser cualquier asociación física, estructural o química, tal como, por ejemplo, enlace covalente o no covalente, interacciones de van der Waals, interacciones hidrofóbicas o electrostáticas.

En segundo lugar, el compuesto debe ser capaz de asumir una conformación que le permita asociarse con CD40 o con CD40L. Aunque no todas las porciones del compuesto participarán necesariamente en la asociación con CD40 o CD40L, aquellas porciones que no participen aún pueden influir en la conformación general de la molécula. Esto a su vez puede tener un impacto significativo en la deseabilidad del compuesto. Tales requerimientos conformacionales incluyen la estructura tridimensional general y la orientación de la entidad o compuesto químico en relación con el total o una parte de la posición de unión.

El potencial efecto inhibidor o de unión de un compuesto químico sobre CD40 o CD40L puede ser analizado antes de su síntesis real y ser evaluado mediante el uso de técnicas de modelización con ordenador. Si la estructura teórica del compuesto dado sugiere una interacción y una asociación insuficiente entre él y CD40 o CD40L, se obvia la necesidad de sintetizar y evaluar el compuesto. Sin embargo, si la modelización con ordenador indica una fuerte interacción, la molécula puede entonces ser sintetizada y se evalúa su capacidad para unirse a CD40 o a CD40L. Por tanto, se pueden evitar síntesis caras y que conllevan mucho tiempo de compuestos inoperantes.

Un compuesto inhibidor u otro compuesto de unión de CD40 o CD40L puede ser evaluado computacionalmente y ser diseñado por medio de una serie de etapas en las que se examinan entidades químicas o fragmentos y se seleccionan por su capacidad para asociarse con las posiciones de unión individuales de CD40L.

De este modo, alguien con conocimientos en la técnica puede usar uno de varios métodos para examinar entidades químicas o fragmentos por su capacidad para asociarse con CD40L y más particularmente, con las posiciones de unión individuales de sCD40L(116-261). Este proceso puede comenzar por una inspección visual de, por ejemplo, la posición de unión en una pantalla de ordenador en base a las coordenadas de CD40L de la Tabla 1. A continuación, los fragmentos seleccionados o las entidades químicas pueden posicionarse en una variedad de orientaciones, o "ser acoplados", en un bolsillo de posición de unión de CD40L. El acoplamiento puede llevarse a cabo usando un software tal como Quanta y Sybyl, seguido de una minimización energética y de una dinámica molecular con campos de fuerza de mecánica molecular estándar, tales como CHARMM y AMBER.

Los programas de ordenador especializados pueden ser útiles para seleccionar fragmentos de interés o entidades químicas. (GRID, disponible en la Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido; MCSS o CATALYST, disponible en Molecular Simulations, Burlington, MA; AUTODOCK, disponible en Scripps Research Institute, La Jolla, CA; DOCK disponible en la Universidad de California, San Francisco, CA; XSITE, University College of London, Reino Unido).

Una vez que se han seleccionado las entidades químicas o los fragmentos adecuados, pueden ensamblarse para formar un inhibidor o un agonista. El ensamblaje puede ser por inspección visual de la relación de los fragmentos entre sí en la imagen tridimensional mostrada en una pantalla de ordenador, en relación con las coordenadas estructurales descritas aquí.

Alternativamente, uno puede diseñar las entidades químicas deseadas "de novo", experimentalmente, usando tanto una posición de unión vacía, como, opcionalmente, incluyendo una porción de una molécula con la actividad deseada. De este modo, por ejemplo, uno puede usar técnicas de examen en fase sólida en las que tanto CD40L como un fragmento suyo, o las entidades químicas candidatas a ser evaluadas, se unen a una fase sólida identificando con ello los aglomerantes potenciales para un estudio adicional o para optimizar.

Básicamente, pueden usarse cualquier técnica de modelización molecular de acuerdo con la invención; estas técnicas son conocidas, o están fácilmente disponibles para aquellos con conocimientos en la técnica. Deberá entenderse que los métodos y las composiciones descritos aquí pueden ser usados para identificar, diseñar o caracterizar no sólo entidades que se asociarán o unirán con CD40L, sino alternativamente para identificar, diseñar o caracterizar entidades que, como el CD40L, se unirán con CD40 interrumpiendo con ello la interacción CD40L CD40. Se pretende que la invención reivindicada abarque estos métodos y composiciones de forma amplia.

Una vez que un compuesto ha sido diseñado o seleccionado mediante los métodos anteriores, puede evaluarse y optimizarse la eficacia con la que el compuesto puede unirse a CD40L usando la evaluación experimental o computacional. Se pueden optimizar varios parámetros dependiendo del resultado deseado. Esto incluye, pero no se limita a, la especificidad, la afinidad, las velocidades todo/nada, la hidrofobicidad, la solubilidad y otras características fácilmente identificables por alguien con conocimientos en la técnica.

De este modo, uno puede opcionalmente hacer sustituciones, eliminaciones o injertos en algunos de los componentes de las entidades químicas con el fin de mejorar o modificar las propiedades de unión. Generalmente, las sustituciones iniciales son conservativas, es decir, el grupo sustituto tendrá aproximadamente el mismo tamaño,forma, hidrofobicidad y carga que el componente original.

La presente invención también permite el diseño de mutantes de CD40L y la resolución de sus estructuras de cristal. Más particularmente, la invención reivindicada permite a alguien con conocimientos en la técnica determinar la localización de la posición de unión y de las interfases, identificando con ello las posiciones deseables para la mutación.

Por ejemplo, la mutación puede ser dirigida a una posición en particular o a una combinación de posiciones en el CD40L, mediante la sustitución o el reemplazo de uno o más residuos de aminoácido. Dichos mutantes pueden ser tener propiedades de unión alteradas que pueden ser deseables o no.

Los mutantes pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como por ejemplo, la mutagénesis dirigida a una posición, la eliminación o la adición, y a continuación se les evalúa cualquier propiedad de interés. Por ejemplo, los mutantes pueden ser examinados por una carga alterada a un pH particular, por una unión más estrecha, por una mejor especificidad, etc.

La estructura de CD40L sugiere que la mayoría de, si no todas, las mutaciones de HIGMS de posición única que se producen de forma natural afectan al pandeo y a la estabilidad de la proteína en lugar de a la posición de unión directamente. De hecho, debería esperarse que mutaciones de HIGMS más severas que incluyan eliminaciones u otros cambios drásticos perturben la estructura mucho más que las mutaciones de posición única. Además, se descubrió que sólo dos de los seis residuos de la posición de unión seleccionados para la mutagénesis son críticos para la unión de CD40.

Se descubrió una baja frecuencia de éxitos similar en un estudio mutacional análogo de LT\alpha. Van Ostade y col. "Structure activity studies of human tumour necrosis factors", Protein Engineering 7: 5-22 (1994). Esta observación eleva el interrogante de si las mutaciones de residuos individuales de posición de unión de CD40L son generalmente suficientes para afectar completamente a la unión CD40L-CD40. Si son insuficientes, continuará el señalamiento celular mediado por CD40 y la mutación será clínicamente indetectable. Este comportamiento es consistente con el hecho de que, en la estructura del complejo LT\alpha-receptor, intervienen hasta 38 residuos de LT\alpha en la interfase de unión. La interfase es bastante extensa (520 x 10^{-10} m^{2} (\ring{A}^{2})) y presumiblemente es de dimensiones similares en el complejo CD40L-CD40. Se espera, por tanto, que cada residuo sólo contribuya a una pequeña fracción de la energía de unión. Sin embargo, la interacción de la hormona humana de crecimiento con su receptor también ha demostrado incluir un gran área superficial, y aún así sólo relativamente unos pocos residuos clave contribuyen a la mayoría de la energía de unión.

Adicionalmente, la invención reivindicada es útil para la optimización de pequeña moléculas candidatas potenciales de fármacos. De este modo, las estructuras de cristal reivindicadas también pueden ser usadas para obtener información sobre las estructuras de cristal de complejos del ligando de CD40 e inhibidores de moléculas pequeñas. Por ejemplo, si el inhibidor de molécula pequeña es cocristalizado con el ligando de CD40,entonces la estructura de cristal del complejo puede ser resuelta mediante sustitución molecular usando las coordenadas conocidas del ligando de CD40 para el cálculo de las fases. Dicha información es útil, por ejemplo, para determinar la naturaleza de la interacción entre el ligando de CD40 y el inhibidor de molécula pequeña, y por tanto, puede sugerir modificaciones que mejorarían características de unión tales como la afinidad, la especificidad y la cinética.

Los efectos perjudiciales de varias mutaciones de HIGMS sobre el CD40L parecen estar causados por la desestabilización de la estructura. Por ejemplo, la Trp140 es un residuo hidrófobo grande enterrado en el interior de la proteína y la eliminación de su cadena lateral en las mutaciones de HIGMS Trp140>Gly y Trp140>Arg obviamente estará dirigida a la desestabilización de la estructura. La valina afectada por la mutación Val126>Ala también participa en la formación de un núcleo hidrófobo. La Leu155 no está completamente enterrada sino que permanece en el medio de la cadena \beta B. La introducción de prolina en esta posición, como en la mutación de HIGMS Leu155>Pro, puede afectar la formación de la cadena. El comportamiento de la mutación de HIGMS Ala235>Pro puede explicarse de forma similar. La sustitución de Gly144 en la mutación de HIGMS Gly144>Glu puede dar como resultado la pérdida de la libertad conformacional necesaria en esa posición para formar la esquina del lazo AA''. Por consiguiente, el posicionamiento de los residuos adyacentes, Lys143 y Tyr145, de los que se sabe que participan en la unión, se ve afectado. Una observación interesante es que todos los residuos mencionados antes parecen ser agrupaciones: Trp140, Leu155 y Val126 participan en la formación de un área del núcleo hidrófobo formado parcialmente por las cadenas A, A'', B´ y B. Lys143, Gly144 y Tyr145 son residuos del área expuesta del lazo AA'' que permanecen muy próximos a los residuos hidrófobos mencionados anteriormente. Esto sugiere que la capacidad de unión del CD40 es muy sensible a perturbaciones en esta área del CD40L.

Las mutaciones de HIGMS Ala123>Glu, Gly227>Val y Thr211>Asp afectan a los residuos que intervienen en la formación de la interfase de subunidad. La Ala123 permanece próxima de la parte inferior del trímero y está dentro de la distancia de vander Waals de los tres residuos hidrófobos (Leu168, Val228 y Leu261) de la subunidad colindante. La Gly227 se aprieta contra la Tyr172 de la subunidad colindante y la Thr211 permanece sobe el lazo EF cerca de la interfase entre subunidades donde parece interaccionar con la Arg181 de la subunidad colindante. Sería de esperar que las mutaciones que introducen cadenas laterales más grandes en estas posiciones (por ejemplo, Thr211>Asp) afectaran al empaquetamiento entre subunidades y posiblemente impidieran la trimerización. Por tanto, parece que la mayoría de las mutaciones de HIGMS de posición única afectan al pandeo y a la estabilidad del CD40L en lugar de jugar un papel directo en la unión de CD40. Además, las mutaciones de sólo dos de los nueve residuos superficiales objetivo parecen afectar a la unión de CD40.

Los estudios de mutagénesis del CD40L han demostrado que los residuos Tyr145 y Lsy143 están directamente implicados en la unión de CD40. La estructura de cristal muestra que ambos residuos están en el lazo AA'' y están expuestos en la superficie. Figura 7. El lazo equivalente en la estructura de cristal de LT- TNFR participa en varios contactos ligando receptor lo que sugiere similitudes en la unión. La Tyr145 está en la esquina del lazo y su cadena lateral no tiene densidad electrónica visible lo que sugiere que está desordenada. El átomo N1 de Lys143 forma un puente de hidrógeno con el O\sigma;1 de Glu129. Figura 2. El mapa de densidad electrónica también muestra que la cadena lateral de Lys143 tiene una conformación adicional. La Ser128 y la Glu129, dos residuos involucrados en la mutación de HIGMS Ser128>Arg, Glu129>Gly están próximos a Lys143 y está bien definidos en el mapa. La Ser128 está enterrada casi por completo, y el grupo hidroxilo de su cadena lateral está dentro de la distancia de enlace de hidrógeno de His249. Se ha demostrado que el sustituto Glu129-Gly encontrado en la mutación de HIGMS afecta a un residuo accesible al disolvente que podría participar en la unión de CD40. Bajorah y col., "Identification of Residues on CD40 and its Ligand which are Critical for the Receptor-ligand interaction", Biochemestry 34, 1833-1844 (1955), incorporado aquí específicamente por referencia. Un posible candidato para ello es el residuo expuesto Lys143, y la pérdida de su enlace de hidrógeno con la Glu129 puede desestabilizar su conformación dando como resultado una unión de CD40 reducida. Todos estos residuos se conservan en la secuencia del CD40L de murina.

Cinco mutaciones adicionales de posición única, en las que los residuos Ser131, Asn180, Phe201, Glu202 y Asn240 (localizados en la posición de unión) fueron sustituidos por alanina, establecieron que estos residuos no son críticos para la unión de CD40. Además, las otras dos mutaciones en las posiciones de residuos fuera de la posición de unión (Thr135 y Asp243) demostraron no afectar a la unión. De acuerdo con la estructura, la Ser131 y la Thr135 están en el lazo AA'' y sus cadenas laterales no están expuestas. La Asn240, la posición de glicosilación, está expuesta al disolvente. Puesto que se esperaría que el azúcar adosado hiciera la Asn240 indisponible para la interacción con CD40, concluimos que probablemente no participa en la unión de CD40, de acuerdo con los resultados de mutagénesis. La Asp243 es un residuo semiexpuesto y se enlaza con la Asn186 a través de un puente de hidrógeno. La Asn180 es un residuo expuesto en la parte superior de la molécula. Su cadena lateral establece puentes de hidrógeno con los residuos 183 y 216. La Phe201 y la Glu202 están ambas en el lazo DE en el área de la posición de unión y están expuestas al disolvente.

C. Ejemplos 1. Determinación de la estructura de cristal de sCD40L(116-261). A. Cristalización

Los reactivos químicos tampón se compraron a Fisher (Boston, MA). La monitorización de las condiciones de cristalización se hizo con el kit Cristal Screen®; de Hampton Research (Riverside, CA). Se produjo, en su forma soluble, un fragmento soluble del dominio extracelular del ligando de CD40 humano que contiene los residuos de aminoácido desde Gly116 hasta el residuo del C terminal Leu261, y se purificó como sigue:

El gen que codifica la secuencia de sCD40L(116-261) de los aminoácidos G116-L261 fue clonado en el vector de expresión Pichia pastoris pWS106 y la proteína sCD40L(116-261) fue expresada usando protocolos estándar. Peitsch y col., "A B-D Model for the CD40 Ligand Predicts That it is a Compact Trimer Similar to the Tumor Necrosis Factors", Int. Immunol. 5, 233-238 (1993). El pWS106 es una variante del vector pPIC9 (Invitrogen) con la posición NcoI en 3634 nt en la región que flanquea el 3'-AOX1 eliminada por mutagénesis dirigida a la posición. Las células fueron eliminadas y el medio fue dializado a lo largo de la noche con Tris-HCl 20mM, a pH 6,8, y cargado en una columna SP (Pharmacia). El sCD40L unido fue eluído con 2xPBS, a pH 7,2 y se le cambió el tampón por 1xPBS.

La reserva de proteína se hizo disponible como una disolución de 8 mg/ml de sCD40L en un tampón de PBS (20,44 g/l de Na_{2}HPO_{4}, 7,73 g/l de Na_{2}HPO_{4}-H_{2}O, 87,66 g/l de NaCl). Los cristales fueron cultivados por el método de difusión de vapor. (véase Jancarik y col.). Con el objetivo de encontrar las condiciones de cristalización, se realizó una monitorización factorial incompleta. En un experimento típico; se mezcló la disolución de proteína con un volumen igual de disolución de reserva y se suspendió una gota de la mezcla bajo una cubierta de vidrio deslizada sobre la disolución de reserva. Se cultivó los cristales en una disolución de reserva 1,4 M de citrato de Na, 50mM de Hepes de Na a pH 7,5. Los cristales tienen la forma de cubos, son fáciles de reproducir y pueden alcanzar las máximas dimensiones de casi 1 mm por cada lado (la concentración óptima del precipitante para dar lugar a los mayores cristales es de 1,2 M de citrato de Na). La variación del pH entre 7 y 8 no afectó a la calidad de los cristales. Las técnicas de macrosembrado también fueron útiles, aunque no necesarias, para conseguir cristales de calidad suficiente para la obtención de datos. La composición del cristal fue determinada tras lavado, disolución en agua y electroforesis SDS. El gel mostró una banda intensa de aproximadamente 20.000 daltons y una banda mucho más tenue de 17.000 daltons. La banda tenue corresponde a proteína no glicosilada mientras que la banda intensa corresponde a la forma glicosilada.

Aquellos con conocimientos en la técnica apreciarán que las condiciones de cristalización antes mencionadas pueden ser variadas. Variando las condiciones de cristalización, se pueden obtener otras formas cristalinas de sCD40L. Tales variaciones pueden usarse por sí solas o en combinación, e incluyen: variar las concentraciones finales de proteína entre 5 mg/ml y 35 mg/ml; variar la relación entre sCD40L y precipitante; variar las concentraciones de citrato entre 1,2 M y 2,0 nM; variar los intervalos de pH entre 5,5 y 9,5; variar las concentraciones de HEPES entre 5 y 395 mM; variar la concentración o el tipo de detergente; variar la temperatura entre -5ºC y 30ºC; y cristalizar el sCD40L con el método de lotes, de puente líquido, o de diálisis usando las condiciones anteriores o variaciones de ellas. Véase McPherson, A. (1982).Preparation and Analysis of Protein Crystals. (Glick, ed.) páginas 82 a 159, John Wiley & Co., Nueva York, incorporado aquí específicamente por referencia.

B. Recolección y procesado de datos

Los cristales fueron colocados dentro de tubos capilares y se les evaluó la capacidad de difracción de un haz de rayos X en un generador Elliot GX-13. Las fotografías de oscilación mostraron fuerte difracción a alta resolución. Una inspección inicial de las fotografías sugirió una estructura casi cúbica.

Se equilibró gradualmente un cristal grande (0,8 x 0,8 x0,8 mm) en una disolución crioprotectora de 20% de glicerol, citrato de Na 1,2 M, Hepes de Na 50 mM a pH 7,5, se colocó en un lazo y se congeló inmediatamente en una corriente gaseosa de nitrógeno líquido a -150ºC

La técnica de congelación de los cristales fundamentalmente los inmortaliza y produce una serie de datos de calidad mucho mayor. Se tomó una serie de datos dem rayos X nativos con una resolución de hasta 1,75 x 10^{-10} m (\ring{A}) usando un detector de área multicable Nicolet/Siemens (Siemens, Inc.). Los datos fueron integrados y reducidos usando BUDA (25) y el paquete de programas CCP4 (The SERC (UK) Collaborative Computing Project Nº 4, Laboratorio de Daresbury, Reino Unido 1979). La obtención de datos precisó aproximadamente 5 días.

El procesado de los datos sugirió una celda unidad romboédrica con unas dimensiones de celda aproximadamente de a = b = c = 55 x 10^{-10} m (\ring{A}) y \alpha = \beta = \gamma = 91. Para ayudar en los cálculos, se define en su lugar una celda unidad hexagonal con dimensiones a = b = 77,17 x 10^{-10} m (\ring{A}), c = 90,46 x 10^{- 10} m (\ring{A}), \gamma = 120 grados. La combinación de los datos sugirió que el grupo espacial es R3. Si se asume un grupo espacial R3, entonces R_{combinación} es 6,7%. Si se asume un grupo espacial R32, R_{combinación} es 16,6%. La Tabla 1 contiene información del conjunto de datos obtenidos.

El cálculo del volumen de Matthews da VM = 533,610 A^{3}/Z*MW = 2,97 asumiendo Z = 9 (número de unidades asimétricas en la celda unidad) y MW = 20.000 daltons. Eck y col., J. Biol. Chem. 267, páginas 2119 a 2112 (1992), específicamente incorporado aquí por referencia. Por tanto, inicialmente no estaba claro si había uno o dos monómeros en la unidad asimétrica.

C. Sustitución molecular

Todas las consiguientes sustituciones moleculares y los cálculos para afinar se realizaron con el paquete de programas XPLOR. Las manipulaciones moleculares gráficas se realizaron con el software QUANTA (Molecular Simulations, Inc.). Tanto el XPLOR como el QUANTA se usaron en un ordenador estación de trabajo Silicon Graphics Indigo2.

Para investigar si había simetría no cristalográfica, la función de autorotación fue calculada con datos de 8-4 x 10^{-10} m (\ring{A}). Se encontró un pico muy intenso para \varphi = 90º, \Psi = 90º, X = 180º, que corresponde al triple eje cristalográfico. Esto coincide con el triple eje del trímero de sCD40L. Además, aparecieron picos menos intensos para \varphi = 0º, \Psi = 30º, X = 180º y \varphi = 0º, \Psi = 90º, X = 180º y \varphi = 0º, \Psi = 150º, X = 180º que corresponden a los ejes dobles perpendiculares al eje triple. Ninguno de estos ejes correspondía a simetría no cristalina.

Se construyó un modelo tridimensional del sCD40L humano usando el modelo de CD40L de murina como estructura, usando el software de modelización de homología de proteínas QUANTA. Se usó el modelo como sonda para los cálculos de sustitución molecular.

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El cálculo de la función de rotación cruzada usando una rejilla de ángulo 2,5º y datos de 8-4 x 10^{-10} m (\ring{A}) dio lugar a una señal intensa 4,5\sigma por encima de la media, a los ángulos de Euler \theta_{1} = 234,5º, \theta2 = 5,0º, \theta3 = 234,5º. La rotación del modelo de acuerdo con esa solución, y la consiguiente generación de moléculas relacionadas con la simetría que corresponden a la triple simetría cristalográfica, produce un trímero con el triple eje paralelo al eje z, como era de esperar. Se determinó la solución de rota exacta con el refinado de la correlación de Patterson. No se observó ningún segundo pico significativo en la función de rotación.

Con el fin de dirigir la investigación de la traslación, el modelo sonda fue rotado de acuerdo con el primer pico de la investigación de la rotación y fue trasladado de tal forma que el centro de masas del trímero se encontraría sobre el eje z. Se asumió que éste estaría próximo a la posición esperada puesto que pareció que el eje triple del trímero se encontraba sobre el eje z de la celda unidad. Los intentos iniciales de encontrar un pico claro en la función de traslación en el plano xy fallaron. Sondas del modelo de tres dimensiones, que contenían la mayoría de los residuos del núcleo cuya estructura se conservaba de forma más probable entre los diferentes miembros de la familia TNF, produjeron las funciones de traslación con un agrupamiento de picos en localizaciones próximas a las esperadas. Uno de los modelos tridimensionales que contienen todos los átomos de la cadena principal así como todos los átomos de las cadenas laterales para los residuos 8 a 12, 53 a 62, 90 a 93, 110 a 114 y 141 a 146, produjo un pico con un coeficiente de correlación de 3,3\sigma por encima de la media en x = 0,053, y = 0,053. Este pico fue el mayor de la lista de picos y estaba cerca de la posición esperada.

Generando moléculas relacionadas con la simetría y mostrándolas con gráficos de ordenador, se descubrió que se empaquetaban de forma satisfactoria en la celda unidad y que no había suficiente espacio para una segunda molécula. Por tanto, concluimos que sólo había una molécula en la unidad asimétrica. La existencia de una simetría de doble eje en la función de autorotación aparentemente es una consecuencia de la simetría interna dentro de la molécula, posiblemente relacionada con el alto contenido en cadenas paralelas. De hecho, la función de autorotación calculada a partir de los factores de estructura derivados del modelo muestra picos que corresponden asimetría de doble eje.

D. Construcción del modelo y refinado cristalográfico

El parámetro estereoquímico param19.pro fijado en el paquete XPLOR fue usado para todos los cálculos de refinado. El modelo parcial que fue usado para encontrar la solución de la función de traslación fue sometido a un refinado de cuerpo rígido usando datos de 7,5-2.5 x 10^{-10} m (\ring{A}). Los factores R y R_{libre} (29) después del refinado inicial de cuerpo rígido fueron 49,9% y 51,4% respectivamente. El conjunto de datos de evaluación usados para el cálculo de R_{libre} contenía el 10% de los datos. El modelo parcial fue sometido a 40 etapas de refinado posicional convencional y a un ciclo de recocido simulado con una temperatura inicial de T = 2500 K. Los factores R y R_{libre} cayeron a 31,2% y 43,1% respectivamente. Para reducir el margen de error del modelo, se usó un modelo parcial para el cálculo del mapa y para el refinado. El intervalo de resolución usado fue 7,5-2.5 x 10^{-10} m (\ring{A}). Los mapas que omiten el recocido simulado (30) calculados consecuentemente omitiendo el 10% del modelo cada vez, mostraron qué partes del modelo podrían ser usadas para el fasado. Por tanto, el modelo fue modificado para incluir sólo los residuos suficientemente bien definidos en los mapas que omiten el recocido. El modelo inicial incluía 815 átomos de un total de 1374 átomos del modelo completo. Se usó mapas 3F_{o} -2F_{c} para los ciclos de construcción y refinado del modelo. Típicamente, los ciclos consistían en la construcción, refinado posicional y refinado de factor B del modelo. Ocasionalmente se llevaba a cabo el recocido simulado. Según iban mejorando las fases, se añadían más átomos al modelo. Inicialmente se asignaron factores B agrupados para cada cadena (uno para la cadena principal y el de los átomos de la cadena lateral). Más tarde, los factores B agrupados y finalmente factores B atómicos fueron refinados para cada residuo. Sólo se aceptaron las modificaciones manuales de la estructura que dieron como resultado un menor R_{libre} después del refinado. Cuando R y R_{libre} alcanzaron 31,1% y 36,4% respectivamente, se extendió la resolución a 2,25 x 10^{-10} m (\ring{A}) y finalmente a 2 x 10^{-10} m (\ring{A}). Se añadieron moléculas de agua usando la utilidad X-solvate de QUANTA 4.1. Tanto las ocupaciones como los factores de temperatura se refinaron para las moléculas de agua. La Figura 8 resume la información referente a los datos cristalográficos y de refinado. La Tabla 1 presenta la lista de las coordenadas atómicas de sCD40L(116-261).

Las coordenadas de la estructura de cristal de un sCD40L pueden ser usadas en el diseño basado en la estructura de inhibidores de molécula pequeña de CD40L, en el diseño computacional de fármacos y en la optimización iterativa de la estructura.

a. Diseño computacional de fármacos

Los inhibidores de molécula pequeña pueden ser diseñados usando técnicas computacionales. Estas técnicas también son conocidas como el diseño de fármacos "de novo". Resumiendo, las coordenadas de la estructura de cristal del sCD40L son los datos de entrada de un programa de ordenador, tal como el DOCK. Los programas como el DOCK generan una lista de estructuras de molécula pequeña de las que se espera que se unan al CD40L. A continuación, a estas moléculas se les puede evaluar la unión al CD40L mediante ensayos bioquímicos.

Típicamente, los ensayos bioquímicos que evalúan moléculas por su capacidad para unirse a CD40L son ensayos de tipo competitivo. En dichos ensayos, la molécula se añade a la disolución ensayo y se mide el grado de inhibición usando una metodología convencional.

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b. Ciclos iterativos de la optimización de la estructura

Las estructuras de cristal de los complejos formados entre el sCD40L y los inhibidores de molécula pequeña pueden resolverse. En resumen, los inhibidores de molécula pequeña típicamente se descubren usando las coordenadas de estructura de cristal de un sCD40L o bien mediante las técnicas computacionales mencionadas antes o mediante el escrutinio de librerías de moléculas pequeñas. A continuación, el inhibidor de molécula pequeña es co-cristalizado con sCD40L y la estructura de cristal del complejo se resuelve mediante sustitución molecular. La sustitución molecular requiere las coordenadas de un sCD40L para el cálculo de las fases. La información obtenida a partir de estos experimentos puede ser usada para optimizar la estructura de inhibidores de molécula pequeña aclarando cómo interaccionan las moléculas pequeñas con la proteína objetivo. Esto sugiere formas de modificar la molécula pequeña para mejorar sus propiedades fisicoquímicas, tales como la afinidad, la especificidad, y la cinética, con respecto al CD40L objetivo.

Además de ser necesarias para el diseño computacional de fármacos y para la optimización de la estructura, las coordenadas de cristal de sCD40L son útiles para analizar la posición de unión del CD40L. A través de dichos análisis, se determinó que una región particularmente atractiva como objetivo de fármaco se encuentra en las proximidades de Arg207. La Arg207 está situada en una región rodeada por tres residuos hidrófobos y por un residuo moderadamente hidrófobo. Este agrupamiento parece delimitar una pared de un surco de unión formado entre dos monómeros de CD40L. Sin desear limitarnos a consideraciones teóricas, parece que la Asp84, o la Glu117 del CD40 probablemente interacciona con el CD40L en esa posición. Los residuos hidrófobos que rodean a la Arg207 pueden dar como resultado una fortaleza incrementada de las interacciones electrostáticas entre la Arg207, la Asp84 y la Glu117 del CD40. Específicamente, parece que la Glu117 y la Asp84 son importantes. Las observaciones e hipótesis anteriores sugieren que esta región puede contribuir significativamente a la energía de unión de las interacciones CD40L/CD40, y por tanto, es un objetivo atractivo para el diseño de inhibidores. Pueden usarse estudios de mutaciones de posición en combinación con los procesos descritos anteriormente para definir aún más la posición de unión.

Para aquellos con conocimientos en la técnica será aparente que se pueden realizar diversas modificaciones y variaciones en los métodos y composiciones de la presente invención sin alejarse del espíritu o del alcance de la invención. Por tanto, se pretende que la presente invención cubra las modificaciones y variaciones de esta invención puesto que entran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y de sus equivalentes.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Coordenadas atómicas REM'RKS de estructura cristalina de CD40L en formato PDB

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Claims (29)

1. Un método para preparar un cristal de ligando de CD40 que comprende las etapas de:

a)

proporcionar una disolución acuosa que comprende un fragmento de ligando de CD40;

b)

proporcionar una disolución de reserva que comprende un agente precipitante;

c)

mezclar un volumen de dicha disolución acuosa con un volumen de dicha disolución de reserva formando con ello un volumen mixto; y

d)

cristalizar al menos una porción de dicho volumen mixto.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la disolución acuosa de ligando de CD40 proporcionada en la etapa a) tiene una concentración de ligando de CD40 de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg por ml.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la disolución acuosa tiene una concentración de ligando de CD40 de aproximadamente 15 mg por ml a aproximadamente 15 mg por ml.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la disolución acuosa tiene una concentración de ligando de CD40 de aproximadamente 10 mg por ml.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente precipitante se selecciona del grupo que consiste en citrato sódico, sulfato amónico y polietilénglicol

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la concentración del agente precipitante en la disolución de reserva es de aproximadamente 1,0 M a aproximadamente 1,5 m.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la concentración del agente precipitante es aproximadamente 1,2 M.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el pH de la disolución de reserva es de aproximadamente 4 a aproximadamente 10.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el pH es aproximadamente 7,5.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa d) es mediante cristalización por difusión de vapor, cristalización por lotes, cristalización de puente líquido o cristalización por diálisis.

11. Un cristal formado por un fragmento funcional de un dominio extracelular de ligando de CD40 que tiene aproximadamente las siguientes constantes de celda: a + b = 77,17 x 10^{-10} m (\ring{A}), c = 90,46 x 10^{-10} m (\ring{A}), \alpha = \beta = 90º, \gamma = 120º, y un grupo espacial de R3.

12. El cristal de ligando de CD40 (116-261) de la reivindicación 11, o un homólogo suyo, en el que dicho cristal comprende una posición de unión, comprendiendo dicha posición de unión los aminoácidos Lys143, Arg203, Arg207 y Tyr145.

13. El cristal de la reivindicación 11 ó 12 ó un homólogo suyo, en el que dicho cristal comprende Arg207 rodeado por al menos dos residuos hidrófobos.

14. El cristal de la reivindicación 12 ó 13 en el que dicho cristal comprende además al menos 30 aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: Ile127, Ser128,Glu129, Ala130, Ser131, Thr135, Ser136, Ala141, Glu142, Gly144, Tyr146, Cys178, Asn180, Ser185, Gln186, Ala187, Pro188, Ile190, Ala191, Ser192, Ser197, Pro198,Gly199, Arg200, Phe201, Glu202, Ile204, Ala209, Thr211, Pro217, Cys218, Gly219, Gln220, Glu230, Leu231, Gln232, Asn240, Val241, Thr242, Asp243, Ser245,Val247, Ser248, His249, Gly250, Thr251, Gly252 y Phe253.

15. Un método para determinar al menos una porción de una estructura tridimensional de un complejo molecular, comprendiendo dicho complejo al menos un fragmento de ligando de CD40, comprendiendo dicho método las etapas de:

a)

determinar las coordenadas estructurales de un cristal del fragmento de ligando de CD40;

b)

calcular las fases a partir de las coordenadas estructurales;

c)

calcular un mapa de densidad electrónica a partir de las fases obtenidas en la etapa b);

d)

determinar la estructura de al menos una porción del complejo en base a dicho mapa de densidad electrónica.

16. El método de la reivindicación 15 en el que las coordenadas estructurales usadas en la etapa a) son las mismas, o se desvían menos de aproximadamente 2\ring{A}, de aquellas descritas en la Tabla 1.

17. Un método para evaluar la capacidad de una entidad química para asociarse con el ligando de CD40 o con CD40, con un fragmento de ligando de CD40 o de CD40, o con un complejo que comprende el ligando de CD40, CD40, ú homólogos suyos,comprendiendo dicho método las etapas de:

a)

emplear medios experimentales o computacionales para llevar a cabo una operación de ajuste entre la entidad química y dicho ligando de CD40 o CD40, sus fragmentos o complejos, obteniendo con ello datos relacionados con dicha asociación; y

b)

analizar los datos obtenidos en la etapa a) para determinar las características de la asociación entre la entidad química y dicho ligando de CD40 o CD40,fragmento o complejo.

18. El método de la reivindicación 17, que comprende además la identificación, la caracterización o el diseño de una entidad química que tiene una asociación deseada con un ligando de CD40, o con un fragmento suyo, mediante el uso de las coordenadas estructurales de un cristal de ligando de CD40 de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

19. El método de la reivindicación 18, que comprende además la etapa de optimizar las características de unión de la entidad química identificada, caracterizada o diseñada.

20. El método de la reivindicación 19, que comprende además la etapa de determinar la orientación de los ligandos en una posición de unión de ligando de CD40.

21. Un derivado con átomo pesado de una forma cristalizada de ligando de CD40.

22. Un derivado con átomo pesado del cristal de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

23. El uso de las coordenadas estructurales de ligando de CD40, o de porciones suyas, para resolver una forma cristalina de un homólogo mutante o de un co-complejo de ligando de CD40 o de un fragmento suyo mediante sustitución molecular.

24. El uso de un cristal de ligando de CD40 de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o de sus coordenadas estructurales para evaluar de forma experimental o computacional una entidad química para obtener información sobre su asociación con la posición de unión del ligando de CD40.

25. El uso de la reivindicación 24, en el que el cristal tiene las coordenadas estructurales descritas en la Tabla 1.

26. El uso de la reivindicación 24, en el que dicho cristal es el mismo que el cristal de ligando de CD40 descrito por las coordenadas de la Tabla 1 o por las coordenadas que se desvían menos de aproximadamente 2\ring{A} de las coordenadas de la Tabla 1.

27. El uso de un cristal de ligando de CD40 de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 para determinar las interacciones de unión entre una entidad química y el ligando de CD40.

28. Un medio de almacenamiento de datos legible por una máquina que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con datos legible por una máquina que, cuando es leído por una máquina adecuada, es capaz de mostrar una representación tridimensional de un cristal de una molécula o complejo molecular que comprende un fragmento de CD40L que tiene una posición de unión que comprende los aminoácidos Lys143, Arg203, Arg207 y Tyr145.

29. Un método para producir una composición farmacéutica que comprende el método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, y además para formular la entidad química identificada en la última etapa del método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 en una forma farmacéuticamente aceptable.