ES2304146T3 - Animales transgenicos que expresan la proteina tau truncada de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
Animales transgenicos que expresan la proteina tau truncada de la enfermedad de alzheimer. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para preparar un (co)polímero final de bloque o gradiente que comprende una etapa de polimerizar por radicales una mezcla de monómeros etilénicamente insaturados para dar un polímero intermedio que contiene átomos de yodo, en el que el polímero intermedio que contiene átomos de yodo comprende al menos el 50% en moles de monómeros de metacrilato, en presencia de c) un precursor de radicales y d) I2 o un agente de transferencia de cadena de yodo, seguido de una etapa de polimerizar por radicales una mezcla de monómeros etilénicamente insaturados en presencia de a) un precursor de radicales y b) el polímero intermedio que contiene átomos de yodo de la primera etapa.
Description
Animales transgénicos que expresan la proteína
tau truncada de la enfermedad de Alzehimer.
Las enfermedades neurodegenerativas representan
un grupo heterogéneo de desórdenes neurológicos genéticos y
adquiridos, que resultan en un deterioro progresivo cognitivo y
motor con inicio a mediados o finales de la vida (1). La causa más
común de demencia es la enfermedad de Alzheimer. En menos de un 5%
de los casos de enfermedad de Alzheimer están involucrados factores
genéticos, el resto de los casos son esporádicos.
La proteína tau es la proteína expresada en el
sistema nervioso central y desempeña un papel crítico en la
arquitectura neuronal estabilizando la red microtubular
intracelular. Un deterioro del papel fisiológico de la proteína
tau, ya sea por truncamiento, hiperfosforilación o por alteraciones
en el balance entre las seis isoformas tau naturales, conlleva a la
formación de ovillos neurofibrilares (NFT), neuritas distróficas e
hilos del neuropilo. Estas estructuras representan las
características distintivas ultraestructurales de la enfermedad de
Alzheimer (AD). La subunidad proteica principal de estas estructuras
es la proteína tau asociada a microtúbulos (2,3). La cantidad de
NFT encontrados en autopsias de pacientes con AD se correlaciona con
los síntomas clínicos, incluyendo el declive intelectual. Por lo
tanto, la proteína tau desempeña un papel crítico en la patología
de AD. El descubrimiento reciente de cosegregación de mutaciones
específicas en el gen tau con la enfermedad de demencia
frontotemporal con Parkinsonismo vinculado al cromosoma 17
(FTDP-17) ha confirmado que ciertas anormalidades
en la proteína tau pueden ser una causa principal de
neurodegeneración y demencia en los individuos afectados (4,5). Sin
embargo, no existe un modelo experimental que se pudiera proponer
directamente los detalles del papel de la proteína tau en la
patogénesis
de AD.
de AD.
Modelos transgénicos recientes de AD están
basados en la expresión de proteínas asociadas con FAD (APP, PS1,
ApoE, etc.), ya sean mutadas o no. Estos incluyen animales
humanizados en uno o en múltiples genes. Sin embargo, ninguno de
estos modelos reúne ambas características distintivas de AD,
usualmente no muestran patología neurofibrilar y ninguno de ellos
incluye la posibilidad de investigación de la función de los
factores de riesgo medioambientales, que desempeñan un papel
importante en el desarrollo de AD.
Los modelos animales disponibles actualmente que
muestran algunos cambios neurofibrilares están basados únicamente
en la expresión transgénica de tau mutada derivada de la demencia
frontotemporal vinculada al cromosoma 17 (FTDP17). Un ejemplo
típico de este grupo es el ratón transgénico JNPL3 (6). Otra prueba
sobre el papel de tau mutada ha sido publicada recientemente por
Goedert y Spillantini (7).
En otro modelo transgénico animal fue
investigada la sobreexpresión de proteína tau con cuatro regiones
repetidas. Se informó de una axonopatía prominente en el cerebro y
médula espinal y se demostró que una sobreexpresión de la isoforma
de la proteína tau con cuatro regiones repetidas es suficiente para
alterar la fisiología de las neuronas. En el modelo, fueron
documentadas dilataciones axonales con acumulación de
neurofilamentos en las neuronas del sistema nervioso central, sin
embargo, sin formación de ovillos neurofibrilares intraneuronales
(8).
El ratón transgénico fue también producido para
examinar la función celular normal de tau y su papel en las
patogénesis. El ratón transgénico sobreexpresa un transgén genómico
de tau y también un transgén de ADNc de tau. La comparación de los
dos modelos muestra que la distribución de tau es similar en ambas
líneas transgénicas. Fueron encontradas inflamaciones axonales
inmunorreactivas con tau en la espina dorsal de los ratones con
ADNc, lo que correlaciona con una anormalidad en las extremidades
posteriores, mientras que en los ratones genómicos no fue observada
ninguna neuropatología (9).
A pesar de la ventaja de la rata como modelo
experimental en neurobiología en comparación con ratones, es
sorprendente que no se haya producido ningún modelo transgénico de
tau para la patología neurofibrilar. En general, es
considerablemente menor la cantidad de modelos de ratas transgénicas
de neurodegeneración producidos hasta ahora. Ninguno de ellos
recapitula la patología tau, que es típica de AD.
Czech C y otros (12) describieron un modelo de
rata transgénica que comprende mutaciones en el gen codificado para
la presenilina 1 (SP1). PS1 es considerada una causa para la mayoría
de los casos de enfermedad de Alzheimer familiar con inicio
temprano, sin embargo, el modelo publicado no muestra suficientes
signos de patología asociada a AD. Echeverria V y Cuello AC. (13)
comentan sobre el papel de la acumulación intracelular de amiloide
beta y el posible papel neuropatológico de la acumulación
intracelular de amiloide beta en la enfermedad de Alzheimer. Ellos
presentan observaciones recientes de un modelo de rata transgénica
con un fenotipo de acumulación intracelular de fragmentos
A-beta en neuronas del hipocampo y de la corteza,
sin embargo, sin formación de placa y NFT. Por lo tanto, para
ratas, que es el segundo animal más utilizado en estudios
transgénicos, se aplica lo mismo que para ratones: no existe una
rata transgénica descrita en la literatura científica que pudiera
expresar la proteína tau truncada y que muestre formación de
NFT.
Hasta ahora no existe un modelo experimental
disponible para la investigación de la etiología de AD en relación
con hipertensión u otros factores de riesgo como diabetes y
dislipidemia, que están asociados a AD. El contexto genético de los
animales transgénicos experimentales desempeña un papel en el
desarrollo de modelos transgénicos adecuados.
Es bien conocido que AD está asociada con
ciertos factores de riesgo medioambientales. Se ha demostrado en
estudios epidemiológicos que los factores de riesgo de enfermedades
vasculares y apoplejía están asociados con el deterioro cognitivo y
la enfermedad de Alzheimer; además, la presencia de enfermedades
cerebrovasculares intensifica la presencia y severidad de los
síntomas clínicos de la enfermedad de Alzheimer (14). Otro vínculo
entre la hipertensión y la demencia del tipo AD se indica en un
Estudio Rótterdam (15).
El documento WO 01/53340 A se refiere a ratones
transgénicos que expresan la proteína tau humana. La proteína tau
humana puede estar en las seis isoformas o varios mutantes de la
misma.
El documento WO 01/65252 A también se refiere a
un modelo de ratones transgénicos que expresan al menos una
isoforma de la proteína tau humana.
El documento WO 01/02552 A se refiere a un
modelo transgénico animal que expresa la proteína tau, aumentando o
inhibiendo la hiperfosforilación de tau.
Lewis y otros (Science 293(2001):
1487-1491) dieron a conocer el cruzamiento de dos
ratones transgénicos diferentes, uno teniendo una proteína tau
mutante (mutante P301L) y un ratón mutante APP resultando en una
progenie mutante doble.
El documento WO 96/307366 A se refiere a una
prueba de identificación de agentes que modulan o inhiben la
asociación tau-tau, por ejemplo, mediante la
determinación de la unión de tau a tubulina.
Novak y otros (EMBO J.12(1)(1993):
365-370) dan a conocer diferentes isoformas de
tau.
El documento WO 01/18546 da a conocer varias
formas truncadas de péptidos de tau.
Por lo tanto, es importante desarrollar un
modelo experimental para AD, que pudiera imitar las principales
características patológicas de la enfermedad y que simultáneamente
permita la expresión de factores medioambientales asociados con la
etiología de AD.
Por lo tanto, es un objetivo de la presente
invención dar a conocer un modelo experimental que refleje lo más
cercano posible las características distintivas de AD y también el
sistema de ensayos para sustancias para el tratamiento, prevención
y diagnóstico de AD.
La presente invención se refiere a un animal
transgénico no humano que expresa ADNc que codifica para la proteína
tau de la enfermedad de Alzheimer en el cerebro de un animal
transgénico. Estos animales muestran una actividad patológica NF en
sus cerebros. La presente invención, además, se refiere a un animal
transgénico, que puede ser utilizado como sistema de ensayo de
selección en el proceso de identificación de sustancias que mejoren
el aprendizaje y la memoria, inhiban la neurodegeneración y
disminuyan la velocidad de formación de los ovillos neurofibrilares
(NFT) y su eliminación del cerebro. Los animales pueden ser
utilizados para la identificación de sustancias para la prevención,
tratamiento y diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas,
preferiblemente tauopatías y AD. Los animales transgénicos también
pueden ser utilizados para investigarla influencia de factores de
riesgo asociados a AD sobre el desarrollo de AD. Otro uso de los
animales se encuentra en el proceso de identificación de fármacos
objetivo.
La presente invención describe la ingeniería de
animales transgénicos produciendo cambios en AD inducidos por el
transgén específico, asemejando la enfermedad de Alzheimer en estos
animales. Esto proporciona una herramienta de investigación para el
descubrimiento y desarrollo de fármacos y para el diagnóstico y para
un estudio in vivo más a fondo del papel de las proteínas
tau normales y durante la enfermedad.
La presente invención se basa en una inducción
de la actividad patológica de NF en el cerebro de animales
únicamente mediante la expresión de la proteína tau de la enfermedad
de Alzheimer en el cerebro de los animales transgénicos. Las
características distintivas de AD son inducidas en animales, los que
son propensos a la inducción de factores de riesgo asociados a la
etiología de AD, lo que representa otra ventaja de la presente
invención.
Todos los términos técnicos y científicos
utilizados en la descripción de las realizaciones preferentes -salvo
que se especifique lo contrario- tienen el mismo significado como
es comúnmente entendido en el campo de la técnica a la que
pertenece la invención. Los métodos preferentes, los procedimientos
de laboratorio en el cultivo celular, genética molecular,
bioquímica y química de ácidos nucleicos y los materiales son
descritos en la invención, pero cualquier método y materiales
similares o equivalentes pueden ser utilizados en los ensayos de la
presente invención. Para los procedimientos como la preparación de
ácidos nucleicos recombinantes, análisis bioquímico, cultivo
celular e incorporación transgénica, como electroporación,
lipofección y microinyección fueron utilizadas técnicas
estándar.
El término "tau de Alzheimer" se refiere al
grupo de isoformas de la proteína tau específicamente truncadas por
ingeniería genética que corresponde a aquellas presentes
exclusivamente en un cerebro enfermo de AD. Tau de Alzheimer es
capaz de inducir actividad NF en el cerebro por sí misma o en
combinación con otras moléculas. Tal como se utiliza en este
documento, el término proteína tau de Alzheimer se refiere al grupo
de formas truncadas de tau presente en el tejido cerebral humano
enfermo de AD.
El término "transgén" es utilizado en este
documento para describir al material genético, que ha sido insertado
artificialmente en el genoma de una célula, particularmente una
célula de mamífero, para su implantación en un animal vivo. Para
países específicos, puede ser necesario excluir específicamente
cierto contenido de este aspecto, tal como las células madres
totipotentes humanas como tales o los procesos que conducen a dichas
células, comprendidos en el Art. 6 (1) y (2) de la Directiva EC
98/44/EC.
Por "enfermedad de Alzheimer" (abreviada en
este documento como "AD") se entiende una condición asociada
con la formación de ovillos neurofibrilares y placas de amiloides
beta, así como al deterioro tanto del aprendizaje como de la
memoria. "AD", tal como se utiliza en este documento, se
entiende que abarca tanto a AD como a las patologías del tipo AD,
es decir, enfermedades del sistema nervioso central con síntomas
similares a AD.
Por "actividad neurofibrilar" (abreviada en
este documento como actividad "NF") se entiende una condición
asociada con la formación de ovillos neurofibrilares en el sistema
nervioso central con síntomas similares a AD.
Por "síntomas similares a AD" y
"fenómenos asociados con AD" se entiende un evento estructural,
molecular o funcional asociado con AD, particularmente un evento
que es fácilmente evaluable en un modelo animal. Dichos eventos
incluyen, sin constituir limitación, patologías neurofibrilares,
déficit de aprendizaje y memoria y otras características asociada a
AD.
Por "animal transgénico" se entiende a un
animal no humano, usualmente un mamífero (por ejemplo, ratón, rata,
conejo, hámster, etc.) que tiene una secuencia de ácido nucleico no
endógeno (es decir, heterólogo) presente como un elemento
extracromosomal en una parte de sus células o integrado de manera
estable en la línea germinal del ADN (es decir, en la secuencia
genómica de la mayoría o de todas sus células). Un ácido nucleico
heterólogo es introducido en la línea germinal de dichos animales
transgénicos mediante manipulación genética, por ejemplo, de
embriones del animal hospedero.
Por "construcción" se entiende una
secuencia de ácido nucleico recombinante, generalmente secuencias de
ADN recombinante, promotor operable unido a un tejido específico o
general, que es generado con el propósito de la expresión de una
secuencia o secuencias de nucleótidos específicos, en células de
mamífero, o que va a ser utilizado en la construcción de otras
secuencias de nucleótidos recombinantes.
La presente invención da a conocer la
estructura, secuencia y método de generación de construcciones de
ADN utilizadas para la preparación de animales transgénicos, que
están caracterizadas por los siguientes aspectos:
Un animal transgénico no humano, cuyas células
germinales y/o somáticas comprenden una construcción de ADN que
contiene una región que codifica que conlleva a la expresión de
moléculas tau truncadas en los terminales N- y C-, en el que
- -
- la región que codifica está truncada al menos 30 nucleótidos río abajo del codón de inicio y truncada al menos 30 nucleótidos río arriba del codón de parada de la longitud total de la secuencia de ADNc tau que codifica para la proteína tau con 4 repeticiones y con 3 repeticiones, respectivamente,
- -
- el núcleo tau truncado de manera mínima abarca un fragmento de proteína que es codificado por SEQ ID No.9,
- -
- dicha construcción de ADN codifica para una proteína, que tiene una actividad que produce una patología neurofibrilar (NF) cuando es expresada en células cerebrales de dicho animal.
Esta actividad que produce una patología NF
puede ser cuantificada mediante el conteo de los ovillos
neurofibrilares por la región seleccionada de cerebro, por ejemplo,
utilizando el análisis estereológico. Alternativamente, pueden ser
utilizadas pruebas de neurocomportamiento para una evaluación
confiable de los resultados cognitivos en el aprendizaje de tareas
dirigidas a la memoria.
Construcciones de ADN tau específicamente
preferibles, según la presente invención comprenden una secuencia
de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID No. 1 a la 14. Las
secuencias son representadas en la Figura 1.
En una realización preferente de la presente
invención, dicha construcción de ADN representa un grupo de ADNc
doblemente truncado en los terminales N- y C-, que comprende las
siguientes secuencias de nucleótidos: (Derivados de tau de 4
repeticiones (tau 43) son identificados como R4 y derivados de tau
de 3 repeticiones (tau 44) son identificados como R3). La
numeración utilizada en este documento se deriva del ADNc tau de
tamaño completo descrito por Goedert y otros (24):
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Las secuencias truncadas de tau pueden estar
adaptadas a la célula hospedera específica a la que se transfiere
la construcción. (uso de codones, preferencias de codones,
adaptaciones homólogas (intercambio de uno o más de los codones
humanos con el codón de la célula hospedero, si presentan
diferencias).
Características preferentes de las
construcciones:
Las secuencias de ADNc anteriores están
vinculadas a secuencias reguladoras con el fin de guiar a una
expresión de la proteína tau truncada en el cerebro. La
modificación del gen Thy-1 (25) se realizó de tal
manera que la secuencia reguladora, que dirige la expresión en las
células T fue eliminada y la secuencia de ADNc truncada fue
introducida entre los sitios de restricción Spe-I y
Xho-. La construcción modificada fue despojada de secuencias
procariotas e introducida en el pronúcleo masculino mediante
microinyección. Cualquiera de los promotores funcionales o
complejos promotor-potenciador puede ser utilizado
para la expresión de los ADNc tau truncados descritos
anteriormente.
La presente invención también da a conocer un
método para la preparación y evaluación de moléculas, según la
presente invención, caracterizado por las siguientes etapas:
- a)
- construcción de plásmidos recombinantes procariotas para la clonación, que portan secuencias de codificación para una molécula tau doblemente truncada con deleciones que cubren al menos los primeros 30 y los últimos 30 nucleótidos de moléculas de ADNc tau de tres o cuatro repeticiones,
- b)
- construcción de plásmidos eucariotas para la expresión y secuencias de ADNc respectivas de moléculas tau y la combinación de las mismas,
- c)
- crecimiento de bacterias que contienen dichos plásmidos y amplificación de los plásmidos y su extracción en altas cantidades,
- d)
- transfección de dicha construcción génica en células COS-7 y su análisis utilizando la técnica de "Western blot",
- e)
- aislamiento y purificación de la construcción génica de tal manera que son excluidas todas las secuencias procariotas y dilución de los transgenes en una solución tampón a una concentración adecuada para la microinyección (ver Ejemplo 1),
- f)
- verificación de la construcción génica destinada para la microinyección.
Esto se realiza mediante análisis de
restricción, secuenciación génica y análisis de proteínas después de
transfecciones transientes en células de mamíferos, después de lo
cuál se evalúa el tamaño correcto de las proteínas y su reactividad
con anticuerpos monoclonales específicos (ver Ejemplo 1, Figura
2.b).
La presente invención, por lo tanto, da a
conocer un animal transgénico no humano cuyas células germinales
y/o somáticas comprenden la construcción de ADN que codifica para la
proteína tau de Alzheimer, que puede ser utilizado como modelo
animal adecuado de la enfermedad de Alzheimer.
Por lo tanto, es un objetivo de la presente
invención dar a conocer un animal transgénico no humano en el que
todas las células germinales y/o somáticas comprenden moléculas de
ADNc de tau humanas truncadas. La secuencia de ADNc de tau de
Alzheimer humano clonada se une a una secuencia promotora, que
dirige la expresión de tau de Alzheimer en tejidos específicos o de
manera ubicua.
Los animales transgénicos de la presente
invención son manipulados utilizando procedimientos habituales bien
conocidos de microinyección en el pronúcleo masculino de embriones
de ratas de un día de fertilizados. Los transgenes pueden ser
introducidos en la células embrionarias también mediante otros
métodos conocidos en el estado de la técnica, que incluyen
transfección, lipofección, electroporación y con la ayuda retrovirus
o mediante otros medios. Los embriones que portan el transgén
entonces pueden ser implantados en animales seudopreñados.
Por lo tanto, es un objetivo de la presente
invención dar a conocer un método para la genotipificación de
animales recién nacidos. El análisis de PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que permiten una amplificación de
secuencias blanco del transgén, por lo tanto, es empleado para este
propósito. Los oligonucleótidos empleados para la genotipificación
fueron diseñados de tal manera que el sitio de iniciación de la
transcripción del transgén, que incluye el codón ATG y la secuencia
Kozak, pudiera ser verificado eventualmente mediante secuenciación
de ADN del producto de PCR (par iniciador A). Además, un iniciador
se alinea con el promotor heterogéneo y otro iniciador se alinea
con la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína tau de
Alzheimer. Un criterio de diseño similar fue aplicado para el codón
de parada (par iniciador B). Por lo tanto, de esta manera se le dar
seguimiento a la integridad del transgén. Por lo tanto, las
secuencias de los oligonucleótidos de diagnóstico son las
siguientes:
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Par iniciador A:
- Sentido:
- 5'-GTGGATCTCAAGCCCTCAAG-3'
- Antisentido:
- 5'-GATCCCCTGATTTTGGAGGT-3'
El tamaño esperado del producto de PCR es de 235
nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Par iniciador B:
- Sentido:
- 5'-AAGGTGACCTCCAAGTGTGG-3'
- Antisentido:
- 5'-GGTATGCATGGAGGGAGAAG-3'
El tamaño esperado del producto de PCR es de 438
nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presencia del fragmento de PCR, por lo tanto,
es específica de los animales con el transgén integrado en el
genoma (ver Ejemplo 2)
Los animales fundadores pueden ser utilizados
para la reproducción con animales de tipo salvaje para producir la
generación de animales F1, que son heterocigóticos para el transgén.
En realizaciones posteriores, estos animales heterocigóticos pueden
entrecruzarse para obtener los embriones transgénicos viables cuyas
células somáticas y germinales son homocigóticas para los genes que
codifican para la proteína tau de Alzheimer.
Otro objetivo de la presente invención es dar a
conocer animales no humanos cuyas células germinales y somáticas
expresan de manera transiente o estable dicha construcción de ADN
que codifica para la proteína tau de Alzheimer y que exhiben una
patología NF en el cerebro. El animal preferente de la presente
invención es una rata, en la que la proteína codificada por dichas
moléculas de ADN es expresada en el cerebro.
La realización más preferible de la presente
invención es un animal transgénico no humano, en el que la proteína
tau de Alzheimer codificada por dichas moléculas de ADN es expresada
en el cerebro del animal. La expresión de tau de Alzheimer fue
detectada por varios anticuerpos monoclonales como se describe en el
Ejemplo 3 y se documenta en la Figura 3. La expresión de la
proteína en diferentes regiones del cerebro del linaje transgénico
es documentada en la Figura 4.
La presente invención, por lo tanto, da a
conocer un animal transgénico no humano, en el que las moléculas de
ADN que codifican para la proteína tau de Alzheimer están integradas
de manera estable en el genoma de dichos animales o de lo contrario
presentes en el núcleo celular para ser transcritas. Dichos animales
están caracterizados por los siguientes atributos:
- -
- los transgenes son transmitidos a las siguientes generaciones de animales según las leyes mendelianas formando un linaje transgénico (ver Ejemplo 4)
- -
- el transgén heredado expresa proteínas truncadas en los cerebros de los animales fundadores y la progenie, como se muestra en el Ejemplo 3, Figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención, por lo tanto, da a
conocer animales transgénicos no humanos que exhiben una patología
neurofibrilar en el sistema nervioso central (CNS). Dichos animales
están caracterizados por los siguientes atributos:
- -
- La expresión de las proteínas tau truncadas provoca la formación de una patología neurofibrilar (Ejemplo 5)
- -
- La PHF1 inmunorreactiva a NFT mostró que la tau endógena normal de rata participa en la formación de NFT (Ejemplo 5)
- -
- Los ovillos neurofibrilares están presentes como inclusiones intracelulares y filamentos en las neuronas del CNS y son homólogos a NFT de cerebros humanos enfermos de AD.
- -
- La inmunofluorescencia reveló la presencia de pequeñas estructuras en forma de varillas similares a las observadas en la enfermedad de Alzheimer preclínica -observada en tejido cerebral humano (ver Ejemplo 5).
En la realización preferente de la presente
invención, los animales transgénicos exhibieron dicha
neuropatología en forma de ovillos neurofibrilares, ovillos
fantasmas e hilos del neuropilo, que son sensibles al ácido
fórmico. Los ovillos neurofibrilares están compuestos de una
acumulación anormal de filamentos intraneuronales. Los componentes
del ovillo están constituidos por tau de Alzheimer, así como por
moléculas tau normales. Dichos animales transgénicos sirven como un
sistema modelo adecuado para el estudio de la enfermedad de
Alzheimer y para el desarrollo de sustancias terapéuticas,
preventivas y de diagnóstico.
La presente invención da a conocer un animal
transgénico que desarrolla una patología NF, y que tiene un contexto
genético que permite la inducción de factores de riesgo asociados
con AD, representando, de esta manera, un modelo de la enfermedad
para humanos.
\newpage
Por lo tanto, la presente invención da a conocer
un animal transgénico no humano, en el que el contexto genético, en
el que las moléculas de ADN están integradas de manera estable en el
genoma del animal espontáneamente hipertenso, o de lo contrario,
presentes en el núcleo celular para ser transcritas dentro del
contexto genético específico.
Otro aspecto de la presente invención es dar a
conocer un modelo animal que comprende la combinación de factores
genéticos y otros factores de riesgo asociados con AD como los
siguientes:
- -
- hipertensión, que es el factor de riesgo más común de AD,
- -
- diabetes, que puede ser inducida mediante dieta (la diabetes es un factor de riesgo importante de AD),
- -
- hipercolesterolemia, que puede ser inducida mediante dieta (otro factor de riesgo importante de AD).
Dichas situaciones patológicas pueden ser
fácilmente inducidas en el modelo animal que se da a conocer.
Ejemplos adecuados fueron reportados previamente en la literatura
(por ejemplo, en 26, 27, 28).
Además, el modelo animal que se da a conocer es
el primer modelo animal que expresa una patología neurofibrilar en
el contexto genético de SHR.
Según otro aspecto, la presente invención da a
conocer un animal que representa un modelo experimental de la
enfermedad de Alzheimer esporádica, dicho modelo permite una
evaluación del papel de los factores de riesgo asociados con el
desarrollo de AD. Los factores de riesgo desempeñan un papel crítico
en la inmensa mayoría de los casos de AD, por lo tanto, el modelo
puede ser considerado como un modelo de AD esporádica, que
representa el 90% de los casos de neurodegeneraciones de AD.
En otra realización preferente, la presente
invención da a conocer un método de identificación y validación de
sustancias para el tratamiento, prevención y diagnóstico de la
enfermedad de Alzheimer, para el tratamiento y la prevención de
tauopatías, preferiblemente AD, para el desarrollo de marcadores de
diagnóstico y sondas para la detección de tauopatías,
preferiblemente AD, y de sustancias para el tratamiento de
hipertensión, diabetes, dislipidemia y hipercolesterolemia en
combinación con tauopatías, preferiblemente AD, que comprende:
- -
- evaluación de sustancias mediante:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
La presente invención, por lo tanto, da a
conocer un ensayo in vivo para evaluar la eficacia de
sustancias o terapias, en particular para la reducción de NFT, o
terapias de prevención. Los animales pueden ser utilizados para la
identificación de sustancias o terapias para las enfermedades
neurodegenerativas, en particular tauopatías, preferiblemente AD y
otras enfermedades neurodegenerativas acompañadas por la formación
de ovillos neurofibrila-
res.
res.
Por lo tanto, la presente invención da a conocer
un sistema modelo que consiste en animales transgénicos, células y
ensayos, que son útiles en el estudio de la etiología y el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Los ensayos son también
útiles para la identificación de sustancias que inhiben la formación
de patologías neurofibrilares y otros efectos terapéuticos de las
sustancias.
En otro aspecto, la presente invención da a
conocer una línea celular totipotente no humana que comprende una
construcción que codifica para tau truncada, como se mencionó
anteriormente.
Los animales transgénicos de la presente
invención y las células animales derivadas de los mismos son usadas
para la identificación de compuestos con un efecto potencial en el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer utilizando metodologías
estándar. El compuesto es administrado a los animales o introducido
en el medio de cultivo durante un período de tiempo y en varias
dosis, después los animales o las líneas celulares son examinados
en cuanto a alteraciones en la histopatología y a la expresión de
tau de Alzheimer respectivamente. Además, la capacidad para
realizar pruebas neurocomportamentales a los animales transgénicos
permite hacer un seguimiento de la función cognitiva seguido de un
tratamiento con agentes terapéuticos potenciales. La identificación
de compuestos permite la selección de agentes específicos para la
prevención o tratamiento o diagnóstico de la enfermedad de
Alzheimer. Muchas variantes de métodos de identificación son
conocidas por un experto en la materia y pueden ser aplicadas
dentro del alcance de la presente invención.
\newpage
El modelo transgénico animal de la presente
invención puede también ser utilizado para desentrañar la cascada
molecular de eventos que conllevan a la neurodegeneración y a la
enfermedad de Alzheimer, de tal manera que pueden ser identificados
blancos terapéuticos.
Otro aspecto de la invención es dar a conocer un
ensayo in vitro basado en líneas celulares derivadas de un
animal transgénico o línea celular derivada de un embrión de rata
transgénica de la presente invención, en el que dicho ensayo se
emplea como herramienta para la identificación y validación para el
descubrimiento y desarrollo del diagnóstico de Alzheimer y
marcadores. Dicho ensayo in vitro está basado en líneas
celulares y puede ser también empleado como herramienta para la
identificación y validación para el descubrimiento de fármacos
terapéuticos y preventivos anti-Alzheimer.
Los siguientes ejemplos son presentados a manera
de ilustración y, debido a que otras realizaciones serán obvias
para un experto en la materia, lo siguiente no puede ser
interpretado como una limitación del alcance de la presente
invención.
Figura
1
Esquema del ADNc de la proteína tau de Alzheimer
empleado para la ingeniería de las construcciones de expresión
génica, que fueron utilizadas en la producción de los animales
transgénicos de la presente invención.
Figura
2
Preparación y verificación de las construcciones
génicas utilizadas en la producción de los animales transgénicos.
La construcción de los animales transgénicos fue realizada mediante
microinyección pronuclear de las construcciones génicas clonadas,
que contienen la secuencia que codifica para la tau de Alzheimer.
Las construcciones génicas fueron verificadas mediante análisis de
restricción y PCR utilizando iniciadores específicos del transgén
(panel A, gel de agarosa del amplificado de PCR y fragmento de ADN)
así como mediante secuenciación de ADN para controlar las
mutaciones potenciales. La verificación fue seguida de la
purificación de las construcciones génicas (panel B, gel de agarosa
del fragmento de transgén puro) y transfecciones transientes en
células de mamíferos (panel C, verificación por "Western blot"
de la expresión de la proteína). Después que los ensayos se
completaron, las construcciones fueron despojadas de secuencias
procariotas e inyectadas en embriones de rata de un día de edad. La
parte inferior del diagrama de flujo muestra un procedimiento
simplificado de producción de los animales transgénicos.
Figura
3
Genotipificación de los animales transgénicos
fundadores y de la generación F1 de los animales transgénicos. El
panel "A" muestra los controles para el experimento de
genotipificación (+C, control positivo; NAC, control negativo de la
amplificación; NTC, control negativo de la plantilla). El panel
"B" muestra los resultados de la genotipificación por PCR. La
muestra número 12 representa un animal positivo al transgén. El
panel "C" esboza los experimentos de reproducción realizados
para confirmar los animales fundadores. Además, el panel muestra la
línea transgénica de la presente invención que ha transmitido el
transgén a las siguientes generaciones según las leyes de
Mendel.
Figura
4
Expresión de la proteína tau de Alzheimer en el
cerebro de ratas transgénicas. El panel izquierdo representa un
análisis "Western blot" y el panel derecho presenta la cantidad
total de proteína aplicadas por carril. La proteína tau de
Alzheimer migra a un tamaño de 35 kD (carril 1, flecha), detectada
por el anticuerpo monoclonal pan-tau DC25. Para el
"Western blot" fue empleada la técnica de ECL, y fue observada
una señal específica después de 1 minuto de exposición. Fueron
aplicados 7,5 \mug de proteínas totales extraídos de lisados de
cerebro de animales transgénicos (carril 1), mientras que fueron
aplicados 25 \mug de proteínas de animales controles tipo
salvajes. M, marcador de peso molecular.
Figura
5
Expresión de la proteína tau de Alzheimer en
diferentes regiones del cerebro de ratas transgénicas. Análisis
"Western blot" de lisados de proteínas totales de regiones del
cerebro de ratas transgénicas. Carril 1, lisado completo de cerebro
de un animal fundador (generación F0) -10 \mug de proteínas;
carril 2, lisado total de cerebro de un animal transgénico de la
generación F2; carriles 3 a 6, lisados de proteínas de animales
transgénicos de la generación F2: 3-hipocampo,
4-área subcortical, 5-corteza cerebral,
6-médula espinal y médula; carriles 7 y 8
representan lisados de cerebro de controles no transgénicos
compañeros de camada de la generación F2.:
7-corteza, 8-cerebelo (la proteína
total aplicada por los carriles 2 a 8 fue de 20 \mug).
Figura
6
Teñido con plata de secciones cerebrales de
animales transgénicos y animales no transgénicos controles tipo
salvajes. Fueron detectadas inclusiones intracelulares y filamentos
neurofibrilares en las neuronas del CNS de ratas transgénicas,
(paneles B y C, animal transgénico). Ratas tipos salvaje no
mostraron estas estructuras en el área homóloga del cerebro (A,
control tipo salvaje). Aumento: 200x (A y B), 400x (C).
Figura
7
Detección de ovillos neurofibrilares utilizando
el anticuerpo monoclonal pan-tau DC25 en el sistema
nervioso central de animales transgénicos. El mAb DC25 reconoce
NFTs en neuronas de pacientes con AD. Las estructuras equivalentes
son reconocidas en el cerebro de ratas transgénicas (paneles B y D).
Ratas del tipo salvaje no mostraron ninguna estructura similar en
el área homóloga del cerebro, (A, C). Aumento: 100x (A, B), 200x (C,
D).
Figura
8
Detección de ovillos neurofibrilares mediante el
anticuerpo monoclonal PHF-1 en el sistema nervioso
central de animales transgénicos. PHF-1 es un
marcador específico para la fosforilación de tau. La
inmunorreactividad con este anticuerpo muestra que la expresión de
tau de Alzheimer involucra tau endógena en el proceso de formación
de NFTs. Además, el teñido por inmunofluorescencia muestra pequeñas
estructuras en forma de varillas similares a aquellas observadas en
tejidos cerebrales de la enfermedad de Alzheimer preclínica.
Aumento: 100x (A), 200x (B), 1000x (C, D).
Figura
9
Cultivo de células neuronales como sistema de
ensayo de identificación para la caracterización de compuestos
terapéuticos y de fármacos candidatos. Cultivos primarios de
neuronas de ratas transgénicas y no transgénicas pueden ser
utilizados con estos propósitos después del cultivo in vitro
y el efecto de los fármacos candidatos sobre el transporte
mitocondrial puede ser evaluado mediante videomicroscopía. Neuronas
corticales (Cx) e hipocámpicas (Hipp) aplicadas con tinte vital
(por ejemplo, Mito-trek) se muestran transcurridos 3
días de cultivo in vitro (3DIV). Son visualizadas las
mitocondrias (MT).
Figura
10
Características histopatológicas de la
enfermedad de Alzheimer, recapituladas en los animales transgénicos
de la presente invención. La patología neurofibrilar mostrada es una
de las principales características distintivas de la enfermedad de
Alzheimer. La figura 10 muestra una comparación de los ovillos
neurofibrilares detectados por la técnica de plata de Gallyas (A,
C) y también mediante inmunohistoquímica (E) en el cerebro humano
enfermo con AD, con las estructuras patológicas equivalentes
observadas en los animales transgénicos de la presente invención.
El teñido inmunohistoquímico fue realizado con el anticuerpo
monoclonal 7.51, que reconoce el epítope genérico de tau en la
región repetida en tándem (29).
Ejemplo
1
La construcción de los vectores de expresión de
tau de Alzheimer consiste en procedimientos que incluyen:
- -
- diseño de la secuencia de codificación, especialmente supresiones y truncamientos, se muestran en 1
- -
- estas porciones del gen tau fueron amplificadas mediante PCR con la ayuda de ADN polimerasa con actividad exonucleasa y los oligonucleótidos fueron dotados con secuencias de restricción adecuadas, de tal manera que estos pueden ser clonados bajo promotores generales o específicos de tejido en un vector de expresión eucariota, el clonaje fue realizado utilizando procedimientos estándar en cepas de bacterias comunes
- -
- la verificación de los genes clonados fue realizada para chequear la direccionalidad de los genes insertados, que fue confirmada mediante digestiones de restricción y/o análisis PCR (Figura 2A). Además, las construcciones fueron parcialmente secuenciadas para excluir las posibles formas mutadas
- -
- purificación de los fragmentos destinados a la microinyección (Figura 2B)
- -
- verificación de la expresión de proteínas utilizando transfecciones del transgén a células de mamífero, principalmente células de glioma de rata COS-7 y C6, y análisis de la expresión de proteínas en células eucariotas mediante el método de "western blot" (Figura 2C).
Todos los métodos están descritos en un manual:
Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (14).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La construcción génica clonada que contiene la
secuencia de codificación de tau de Alzheimer fue inyectada en el
pronúcleo masculino de embriones de un día de edad. Los huevos
fertilizados fueron extraídos de las hembras donantes SHR en
experimentos separados utilizando técnicas de rutina (15). Luego de
la microinyección de ADN, los cigotos fueron cultivados in
vitro en una incubadora de CO_{2} durante alrededor de 12
horas e implantados en el oviducto de madres adoptivas
seudopreñadas. Los fundadores fueron identificados mediante PCR de
la secuencia blanco específica del transgén del ADN genómico. Para
determinar los genotipos de tau, fue purificado ADN genómico tomado
de aproximadamente 0,5 cm de la cola de cada rata. Fue utilizado el
análisis por PCR para identificar la descendencia que contenía el
transgén. Los oligonucleótidos para el diagnóstico de
identificación por PCR fueron diseñados de tal manera que la
integridad del transgén pudiera ser fácilmente determinada. Para la
determinación del número de copias del transgén integradas en el
genoma fue utilizado un análisis de PCR en tiempo real.
Por ejemplo, la línea Tg #318 contenía 4 copias
del transgén, lo que fue determinado por PCR en tiempo real
utilizando el método de Sybre Green y la máquina de PCR de
BioRad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Consejos sobre el ADN extraído de la cola: el
ADN genómico fue extraído mediante el kit de tejido Dneasy,
Qiagen.
Genotipificación: la amplificación específica de
los transgenes que codifican para las formas de tau doble truncadas
fue realizada en DNA genómico derivado de la generación parental de
los animales transgénicos y se muestra en las figuras 3A y 3B.
Análisis posteriores del ADN genómico de la generación F1 revelaron
que los transgenes son heredables ya que también fueron detectados
en la descendencia de la generación parental. Los transgenes que
codifican para tau de Alzheimer, por lo tanto, son fijados en el ADN
cromosomal de los animales. La genotipificación fue realizada con
dos controles positivos (ADN genómico positivo plasmídico y TG) y
dos controles negativos (ADN genómico heterólogo control negativo de
la amplificación; control negativo de la plantilla para el control
de los reactivos químicos), como se muestra en la figura 3A.
Análisis de la expresión de transgenes: la
expresión del ARNm derivado de los transgenes fue evaluada mediante
análisis de RT-PCR, aplicando generalmente métodos
bien conocidos que incluyen el RT-PCR y la
electroforesis en gel de agarosa. El ARN fue extraído de tejido
congelado instantáneamente de animales transgénicos y sometido a
trascripción inversa seguida de amplificación específica del
ADNc.
\vskip1.000000\baselineskip
Las ratas positivas al transgén fueron cruzadas
con ratas SHR tipo salvaje. La transmisión de la línea germinal fue
lograda en varias líneas. En este ejemplo se muestra la línea Tg
#318. Ratas transgénicas hembras y machos, que contenían cada una
cuatro copias del gen de la proteína tau humana truncada, fueron
apareadas entre ellas y con ratas SHR tipo salvaje para expandir la
colonia transgénica. En la descendencia fueron observadas relaciones
de división mendelianas del transgén (Figura 3C).
Los animales transgénicos de la presente
invención pueden ser utilizados para el cruzamiento con animales
transgénicos que sobreexpresan la APP humana que contiene la
mutación de la enfermedad de Alzheimer familiar (FAD) o PS1 (13).
La rata resultante expresará tanto APP como PS1 con o sin mutación
FAD sobre un antecedente genético de hipertensión. El efecto de PS1
y APP sobre la formación de NFT puede ser estudiado tanto in
vivo como in vitro. Específicamente, el comienzo y la
severidad de las patologías relacionadas con AD pueden ser
examinadas por medio de la inmunohistoquímica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La expresión de proteínas fue realizada fue
realizada utilizando el análisis "western blot" empleando
anticuerpos monoclonales específicos para la proteína tau. Fueron
analizados tejidos cerebrales de rata que fueron genéticamente
positivas al transgén y fueron capaces de transmitir el transgén a
las siguientes generaciones. Los experimentos fueron controlados
mediante análisis simultáneo de extractos cerebrales de ratas de la
misma edad negativas al transgén y compañeros de camada negativos
al transgén.
Preparación de la muestra de tejido:
aproximadamente 2 mg de tejido cerebral recién aislado fueron
homogeneizados mecánicamente en 30 \mul de solución tampón de
lisis de Hunt modificada (20 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 0,5% Igepal CA630, 0,5% Triton X-100), que
contenía la mezcla inhibidora de proteasas
Complete-EDTA free (Roche). Fueron añadidos 170
\mul de solución tampón de lisis, el homogenizado fue triturado
con jeringa y aguja (22G) y congelado en nitrógeno líquido. Después
de una descongelación lenta en hielo, los restos de la lisis fueron
sometidos a tratamiento con ultrasonido y centrifugados 15 minutos,
10000 g a +4ºC. El contenido de proteína de las muestras fue
determinado mediante el ensayo Bradford utilizando un
espectrofotómetro Beckman.
PAGE y transferencia Western ("Western
blot"). Las proteínas fueron separadas en un gel desnaturalizante
de poliacrilamida al 12% con 0,1% (p/V) de SDS. La electroforesis
fue realizada en una solución tampón Tris-glicina
(25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS). La separación de las
proteínas fue seguida por una transferencia
semi-seca. Fue utilizado el sistema de solución
tampón Tris-glicina-isopropanol (25
mM Tris, 192 mM glicina, 20% isopropanol). Las proteínas tau fueron
teñidas con anticuerpos monoclonales anti-tau DC25
que reconocen a las proteínas tau igualmente que mAb 7.51 (29) y
también con mAb Tau-1 (21). La señal positiva fue
determinada utilizando un anticuerpo anti-ratón HRP
y el método ECL. La eficiencia del procedimiento de transferencia
fue controlada mediante el método de Ponceau. El análisis de
proteínas reveló la expresión específica de la proteína tau de
Alzheimer en el extracto de proteínas totales de los cerebros de las
ratas transgénicas (figura 4) y también la expresión de la proteína
tau de Alzheimer en diferentes regiones cerebrales de las ratas
transgénicas (figura 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Para realizar el análisis de inmunohistoquímico
de ratas transgénicas se utilizaron varios anticuerpos monoclonales
específicos para la proteína tau y Alzheimer. Una breve descripción
de los anticuerpos monoclonales empleados en estos estudios incluye
PHF 1, que reconoce el epítope fosforilado Ser 396 - Ser 404, mAb DC
25 reconoce el epítope independiente de fosfato Lys 347 - Ile 353;
mAb AT 8 reconoce el epítope fosforilado Ser 198 - Ser 202; mAb Tau
1 reconoce el epítope no fosforilado, mAb Tau 5 reconoce el epítope
independiente de fosfato. (15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22)
Los tejidos fueron preparados y cortados de la
siguiente manera. Los animales transgénicos y controles fueron
anestesiados con éter e inmediatamente perfundidos intracardialmente
con paraformaldehido al 4% tamponado, los cerebros fueron
extraídos, crioprotegidos con sacarosa al 20%, congelados
rápidamente y cortados mediante criostato a un grosor de 50 \mum.
Algunos cortes fueron tratados brevemente con ácido fórmico al 70%
antes del procedimiento de teñido. Los cortes de tejido cerebral de
rata fueron incubados con H_{2}O_{2} al 1% en PBS y los sitios
de enlace no específicos fueron bloqueados con la incubación en un
medio de bloqueo (PBS, Triton 0,1%, suero normal de caballo 5%). El
inmunoteñido se realizó utilizando los anticuerpos mencionados
anteriormente, y después incubados con un anticuerpo de caballo
anti-ratón biotinilado, seguido de un complejo
avidina-biotina y visualizados con una solución de
VIP y DAB. Los cortes de tejido fueron montados en portaobjetos
cubiertos de gelatina, secados, tratados con alcoholes de alta
calidad, xileno y se colocaron los cubreobjetos con Entellan.
El método de teñido con plata de Gallyas que fue
descrito anteriormente (23) fue adaptado para la libre flotación de
los cortes de 50 \mum, con viraje en oro.
Para el marcaje inmunofluorescente indirecto,
los cortes fueron pretratados con NaHBO_{4} al 1% durante 30
minutos para reducir la autofluorescencia del tejido. Posteriormente
fueron teñidos con anticuerpos primarios a 4ºC durante toda la
noche, incubados con un anticuerpo anti-ratón en
caballo biotinilado, seguido de estreptavidina-Alexa
488 conjugada.
La comparación de la patología NF como la vista
en cerebros de pacientes que sufren AD con aquellas observadas en
el cerebro de los animales transgénicos de la presente invención se
representa en la Figura 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Los animales transgénicos de la presente
invención pueden ser utilizados como fuente de células para el
cultivo de células. Tanto los animales como las células pueden ser
utilizados en los ensayos de la presente invención. Por ejemplo,
las células del tejido cerebral que expresan el gen tau truncado
pueden ser cultivadas utilizando técnicas estándares de cultivo.
Los animales y las células cultivadas pueden ser utilizadas tanto en
sistemas in vivo como in vitro para el estudio del
papel de los fármacos candidatos en la arquitectura celular, la
división celular, y la apoptosis, así como en la morfología las
neuronas primarias cultivadas, brotes de neuritas, ramificación de
axones, elongación de los axones en cultivos primarios y también
para la investigación del movimiento de los orgánulos (Figura 9).
También pueden ser empleados como sistema de prueba para los efectos
neurotróficos de sustancias de prueba.
Un estudio puede ser diseñado para examinar los
cambios cuantitativos y cualitativos en la interacción de tau y
tubulina y también en la interacción con el tráfico en los orgánulos
que puede ser modulado mediante sustancias de prueba.
Un estudio también puede ser diseñado para
examinar los compuestos que modulan la expresión o la actividad de
proteínas del citoesqueleto en el proceso de construcción de las
conexiones sinápticas.
Un estudio también puede ser diseñado para
examinar los compuestos que pueden afectar la formación de NFT o la
interacción proteína-proteína, que pudieran
eventualmente conllevar a ralentizar, inhibir o eliminar la
formación de NFT y esto pudiera ser un ensayo útil para la
identificación de sustancias con potencial terapéutico para las
tauopatías u otras enfermedades neurodegenerativas, preferiblemente
AD. El efecto de los compuestos puede ser evaluado en cultivos
celulares y también in vivo en los animales mediante análisis
neuropatológico, neurofisiológico y comportacional. Son conocidas
muchas variaciones de los métodos de identificación por los
expertos en la materia y pueden ser aplicadas dentro del alcance de
la presente invención.
Estos ejemplos describen aspectos particulares y
realizaciones de la presente invención con fines ilustrativos y no
limitan el alcance de la presente invención como se enumeran en las
reivindicaciones más adelante.
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<210> 4
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<400> 15
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Claims (16)
1. Animal transgénico no humano cuyas células
germinales y/o somáticas comprenden una construcción de ADN que
contiene una región que codifica, la que conlleva a la expresión de
una molécula tau truncada en los terminales N- y C-, en el que
- -
- la región que codifica está truncada, al menos, 30 nucleótidos más abajo del codón de inicio y truncada, al menos, 30 nucleótidos río arriba del codón de parada de la longitud total de la secuencia de ADNc tau que codifica para la proteína tau con 4 repeticiones y con 3 repeticiones, respectivamente,
- -
- el núcleo tau truncado de manera mínima abarca un fragmento de proteína que es codificado por SEQ ID No.9,
- -
- dicha construcción de ADN codifica para una proteína, que tiene actividad que produce una patología neurofibrilar (NF) cuando es expresada en células cerebrales de dicho animal.
2. Animal transgénico no humano, según la
reivindicación 1, caracterizado porque sus células somáticas
y germinales expresan de manera transiente o estable dicha
construcción de ADN, exhibiendo de esta manera una patología NF en
el cerebro.
3. Animal transgénico no humano, según la
reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína codificada por dichas
moléculas de ADN es expresada en el cerebro.
4. Animal transgénico no humano, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho animal es
una rata.
5. Método para la genotipificación de animales
transgénicos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, usando
oligonucleótidos específicos para tau truncada transgénica, como se
definió en la reivindicación 1.
6. Animal transgénico, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que desarrollan patologías NF y que tienen
un contexto genético que permite la inducción de factores de riesgo
asociados con AD, representando de esta manera un modelo de la
enfermedad para humanos.
7. Animal transgénico no humano de la
reivindicación 6, que representa un modelo animal de AD y permite la
inducción de hipertensión como un factor de riesgo de AD.
8. Animal transgénico no humano de la
reivindicación 6, que representa un modelo animal de AD y permite la
inducción de diabetes como un factor de riesgo de AD.
9. Animal transgénico no humano de la
reivindicación 6, que representa un modelo animal de AD y permite la
inducción de hipercolesterolemia como un factor de riesgo de
AD.
10. Método de identificación y validación de
sustancias para el tratamiento, prevención y diagnóstico de la
enfermedad de Alzheimer, para el tratamiento y prevención de
tauopatías, preferiblemente AD, para el desarrollo de marcadores de
diagnóstico y sondas para la detección de tauopatías,
preferiblemente AD y para sustancias para el tratamiento de
hipertensión, diabetes, dislipidemia y hipercolesterolemia en
combinación con tauopatías, preferiblemente AD, que comprende:
- -
- evaluación de sustancias mediante:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
11. Método, según la reivindicación 10, de
identificación de nuevos fármacos blanco en tauopatías y procesos
de neurodegeneración relacionados, preferiblemente AD.
12. Uso del animal según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y 6 a 9, como ensayo in vivo para
probar la eficacia de sustancias o terapias, en particular terapias
para reducir la patología neurofibrilar.
13. Uso, según la reivindicación 12, en el que
dichas sustancias o terapias son para enfermedades
neurodegenerativas, en particular tauopatías, preferiblemente AD y
otras enfermedades neurodegenerativas acompañadas de patologías
neurofibrilares.
14. Línea celular, que comprende una
construcción como se definió en la reivindicación 1, cuya línea
celular no es una línea celular totipotente humana.
15. Línea celular, según la reivindicación 14,
caracterizada porque la línea celular es una línea celular
de rata derivada de un embrión de rata transgénico.
16. Ensayo in vitro, que comprende una
línea celular según la reivindicación 14 ó 15, en el que dicho
ensayo es empleado como herramienta para la identificación y
validación para el descubrimiento de compuestos terapéuticos
preventivos y de diagnóstico y marcadores para la enfermedad de
Alzheimer.
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