BRPI0619249A2 - anticorpos anti-globulÈmeros-aß, frações que se ligam a antìgeno destes, hibridomas correspondentes, ácidos nucléicos, vetores, células hospedeiras, métodos de produzir os ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos de usar os ditos anticorpos - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-GLOBULÈMEROS-A<225>, FRAçõES QUE SE LIGAM A ANTìGENO DESTES, HIBRIDOMAS CORRESPONDENTES, áCIDOS NUCLéICOS, VETORES, CéLULAS HOSPEDEIRAS, MéTODOS DE PRODUZIR OS DITOS ANTICORPOS, COMPOSIçõES COMPREENDENDO OS DITOS ANTICORPOS, USOS DOS DITOS ANTICORPOS E MéTODOS DE USAR OS DITOS ANTICORPOS. São descritos anticorpos anti-globulómeros-A<225>, frações que se ligam a antígeno destes, hibridomas correspondentes, ácidos nucléicos, vetores, células hospedeiras, métodos de produzir os ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos de usar os ditos anticorpos. A presente invenção diz respeito a anticorpos anti-globulómeros-A<225> tendo uma afinidade de ligação com globulómero A<225>(2O-42) que é maior que a afinidade de ligação do anticorpo com globulómero A<225>(1-42), frações que se ligam a antígenos destes, hibridomas que produzem os ditos anticorpos, ácidos nucléicos que codificam os ditos anticorpos, vetores compreendendo os ditos ácidos nucléicos, células hospedeiras compreendendo os ditos vetores, métodos de produzir os ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos terapêuticos e de diagnóstico dos ditos anticorpos e métodos correspondentes relacionados a doença de Alzheimer e outras amiloidoses.

Description

"ANTICORPOS ANTI-GLOBULÔMEROS-Αβ, FRAÇÕES QUE SE LIGAM A ANTÍGENO DESTES, HIBRIDOMAS CORRESPONDENTES, ÁCI- DOS NUCLÉICOS, VETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS, MÉTODOS DE PRODUZIR OS DITOS ANTICORPOS, COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO OS DITOS ANTICORPOS, USOS DOS DITOS ANTICORPOS E MÉTODOS DE USAR OS DITOS ANTICORPOS"

A presente invenção diz respeito a anticorpos anti-globulômeros-Αβ, frações que se ligam a antigeno destes, hibridomas que produzem os ditos anticorpos, áci- dos nucléicos que codificam os ditos anticorpos, vetores compreendendo os ditos ácidos nucléicos, células hospe- deiras compreendendo os ditos vetores, métodos de produ- zir os ditos anticorpos, composições compreendendo os di- tos anticorpos, uso terapêutico e diagnóstico dos ditos anticorpos e métodos correspondentes relacionados a doença de Alzheimer e outras amiloidoses.

Em 1907, o médico Alois Alzheimer foi o primeiro a descrever as características neuropatológicas de uma forma de demência subseqüentemente nomeada em sua honra (Alzheimer 1907) . Doença de Alzheimer (AD) é a causa mais freqüente de demência entre os idosos, com uma incidência de cerca de 10 % da população acima de 65 anos. Com o au- mento da idade, o probabilidade de doença também aumenta. Globalmente, existem cerca de 15 milhões pessoas afetadas e espera-se que o aumento ainda maior de expectativa de vida aumente o número de pessoas doentes em cerca de três vezes em relação nas próximas décadas.

De um ponto de vista molecular, doença de Al- zheimer (AD) é caracterizada por um depósito de proteínas agregadas de maneira anormal. No caso de placas de amilói- de extra celulares, estes depósitos consistem na maioria das vezes em filamentos de amilóide-p-peptídeo, no caso dos emaranhados neurofibrilares intracelulares (NFTs) da proteína tau. O peptídeo β amilóide (Αβ) surge da proteína precursora do β-amilóide por clivagem proteolítica. Esta clivagem é realizada pela atividade cooperativa de diver- sas proteases nomeadas secretase α, β e γ. Clivagem leva a inúmeros fragmentos específicos de diferentes comprimen- tos. As placas de amilóide consistem na maioria das vezes em peptídeos com um comprimento de 40 ou 42 aminoácidos (Αβ40, Αβ42) . 0 produto de clivagem dominante é Αβ40; en- tretanto, Αβ42 tem um efeito tóxico muito mais forte.

Depósitos de amilóide cerebral e deficiências cognitivas muito similares às observadas na doença de Al- zheimer também são características distintivas de síndrome de Down (trisomy 21), que ocorre a uma freqüência de cerca de 1 em 800 nascimentos. A hipótese de cascata de amilóide de Hardy e Hig- gins postulou que maior produção de Αβ(1-42) levaria à formação de protofibrilas e fibrilas, os componentes principais de placas Αβ, estas fibrilas sendo responsáveis pelos sintomas de doença de Alzheimer. A despeito da fraca correlação entre a gravidade da demência e carga da placa Αβ, a responsabilidade atribuída a esta hipótese foi pre- ferida até recentemente. A descoberta de formas Αβ solú- veis em cérebros AD, que se correlacionam melhor com sin- tomas AD do que a carga da placa levou a uma revisão na - hipótese de cascata de amilóide.

Imunização ativa com peptideos Αβ leva a uma re- dução na formação de placas existentes, bem como a disso- lução parcial das mesmas. Ao mesmo tempo, ela leva ao ali- vio de defeitos cognitivos em modelos de camundongo transgênico APP.

Para imunização passiva com anticorpos direciona- dos aos peptideos Αβ, foi também encontrada uma redução de uma carga de placa Αβ.

Os resultados de uma fase experimental IIa (ELAN Corporation Plc, South San Francisco, CA, USA e Dublin, UK) de imunização ativa com AN-1792 peptideo (Αβ(1-42) em condição fibrilar de agregação) sugere que imunoterapia direcionada ao peptideo Αβ foi bem sucedida. Em um sub- grupo de 30 pacientes, o progresso de doença foi signifi- cativamente reduzido em pacientes com titulador do anti- corpo anti-Αβ positivo, medido por índice MMSE e DAD. Portanto, este estudo foi interrompido em virtude de sé- rios efeitos colaterais em forma de uma meningoencefalite (Bennett e Holtz-man, 2005, Neurology, 64, 10-12).

Meningoencefalite foi caracterizada por neuroin- flamação e infiltração de células T no cérebro. Presumida- mente, isto foi por causa de uma resposta imune de célula T induzida por injeção de Αβ(1-42) como antígeno. Não é de se esperar uma resposta imune como esta após imunização passiva. Até hoje, não existe ainda nenhum dado clínico disponível com referência a isto. Portanto, com referência a uma abordagem passiva como esta para imunização, as preocupações acerca do perfil do efeito colateral foram proclamadas em virtude de estudos pré-clinicos em camun- dongos ΔΡΡ23 muito velhos que receberam um anticorpo di- recionado contra um epitopo N-terminal de Αβ(1-42) uma vez por semana durante 5 meses. Estes camundongos mostraram um aumento no número e gravidade de micro-hemorragias, com- parados aos animais de controle tratados com salina (Pfeifer et al., 2002, Science, 298, 1379). Um aumento comparável em micro-hemorragias foi também descrito em camundongos Tg2576 e PDAPP muito velhos (> 24 meses) (Racke et al. , 2005, J Neurosci, 25, 629-636; Wilcock et al. 2004, J. Neuroinflammation, 1(1) :24; De Mattes et al., 2004, Neurobiol. Aging 25(S2):577). Em ambas cepas de camundongo, injeção do anticorpo levou a um aumento signi- ficativo em micro-hemorragias. Ao contrário, um anticorpo direcionado contra o região central do peptideo Αβ(1-42) não induziu micro-hemorragias (de Mattos et al., supra). A falta de indução de micro-hemorragias foi associada com um tratamento do anticorpo que não se liga a peptideo Αβ agregados na forma de CAA (Racke et al., J Neurosci, 25, 629-636). Mas, o mecanismo exato que leva a micro- hemorragias em camundongos transgênicos para APP não foi entendido. Presumidamente, angiopatia de amilóide cerebral (CAA) induz ou pelo menos agrava hemorragias cerebrais. CAA está presente em quase todo cérebro de doença de Al- zheimer e cerca de 20 % dos casos são considerados "CAA severo". Portanto, imunização passiva deveria evitar mi- cro-hemorragias pela seleção de um anticorpo que reconhece a região central ou do terminal carbóxi do peptideo Αβ.

W020041067561 descreve oligômeros Αβ(1-42) está- veis descritos (globulômeros Αβ(1-42)) e anticorpos dire- cionados especificamente contra os globulômeros. Digestão com proteases nãò especificas mostra que o globulômero Αβ pode ser digerido começando com o N-término hidrofilico que se salienta da estrutura do núcleo globular (Barghorn et al., 2005, J Neurochem, 95, 834-847). Tais globulômeros Αβ truncados N-terminal (globulômeros (Αβ(12-42) e Αβ (20- 42)) representam a unidade estrutural básica destes Αβ oli- goméricos. Eles são um antigeno muito potente para imuni- zação ativa de coelhos e camundongos, levando a altos ti- tuladores do anticorpo (W02004/067561). O suposto papel patológico de formas Αβ truncadas N-terminalmente in vivo foi sugerido por diversos trabalhos recentes de sua exis- tência em cérebros AD (Sergeant et al. , 2003, J Neurochem, 85, 1581-1591; Thal et al., 1999, J Neuropathol. Exp Neu- ral, 58, 210-216). Durante digestão in vivo, certas prote- ases encontradas no cérebro, por exemplo, enzima de degra- dação de neprilisina (NEP 24.11) ou insulina (IDE), podem estar envolvidas(Selkoe, 2001, Neuron, 32, 177-180).

Foi um objetivo da presente invenção fornecer an- ticorpos direcionados contra globulômeros Αβ que melhoram o desempenho cognitivo de um paciente em imunoterapia, ao mesmo tempo reagindo apenas com uma pequena porção da quantidade total de peptideo Αβ no cérebro. Espera-se que isto previna um distúrbio substancial do equilíbrio Αβ ce- rebral e leve a menores efeitos colaterais. (Por exemplo, uma redução terapeuticamente questionável de volume cere- bral foi observada no estudo de imunização ativa com pep- tideos Αβ em condição fibrilar de agregação (experiência de ELAN com AN1792). Além disso, nesta experiência, foram observados efeitos colaterais severos em forma de uma me- ningoencefalite.

A presente invenção resolve este problema, forne- cendo anticorpos específicos de globulômero que possuem alta afinidade para formas truncadas de globulômeros Αβ. Estes anticorpos são capazes de discriminar não apenas ou- tras formas de peptídeos Αβ, particularmente monômeros e fibrilas, mas também formas não truncadas de globulômeros Αβ.

Assim, a presente invenção diz respeito a um an- ticorpo tendo uma afinidade de ligação com um globulômero Αβ (20-42) que é maior que a afinidade de ligação deste an- ticorpo com um globulômero Αβ(1-42).

Adicionalmente, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo uma afinidade de ligação com um glo- bulômero Αβ(20-42) que é maior que a afinidade de ligação deste anticorpo com um globulômero Αβ(12-42).

De acordo com uma modalidade particular, a inven- ção diz respeito assim a anticorpos tendo uma afinidade de ligação com o globulômero Αβ(20-42) que é maior que a afi- nidade de ligação do anticorpo tanto com o globulômero Αβ (1-42) quanto com o globulômero Αβ(12-42).

O termo "Αβ(X-Y)" refere-se aqui à seqüência de aminoácidos da posição X do aminoácido com a posição Y do aminoácido da proteína β amilóide humana, incluindo tanto X quanto Y, em particular, à seqüência de aminoácidos da posição X do aminoácido com a posição Y do aminoácido da seqüência de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IAT (correspondente às posições do aminoácido 1 a 43) ou qualquer de suas variantes de ocorrência natural, em particular aquelas com pelo menos uma mutação selecio- nada do grupo que consiste em A2T, H6R, D7N, A21 G ("Fla- mengo"), E22G ("Ártico"), E22Q ("Holandês"), E22K ("Ita- liano"), D23N ("Iowa"), A42T e A42V, em que os números são relativos ao início do peptídeo Αβ, incluindo tanto a po- sição X quanto a posição Y, ou uma seqüência com até três substituições de aminoácido adicionais, nenhuma das quais pode prevenir a formação de globulômero, preferivelmente sem nenhuma substituição de aminoácido adicional na por- ção de aminoácido 12 ou X, qualquer dos números que seja maior, até o aminoácido 42 ou Y, qualquer dos números que seja menor, mais preferivelmente sem nenhuma substituição de aminoácido adicional na porção de aminoácido 20 ou X, qualquer dos números que seja maior, para aminoácido 42 ou Y, qualquer dos números que seja menor, e ainda mais preferivelmente sem nenhuma substituição de aminoácido adicional na porção de aminoácido 20 ou X, qualquer dos números que seja maior, até o aminoácido 40 ou Y, qual- quer dos números que seja menor, uma substituição de ami- noácido "adicional"sendo dessa maneira qualquer desvio da seqüência canônica que não é encontrada na natureza. Mais especificamente, o termo "Αβ(1-42)" refere- se aqui à seqüência de aminoácidos de posição de aminoáci- do 1 até a posição de aminoácido 42 da proteína β amilóide humana, incluindo tanto 1 quanto 42, em particular, à se- qüência de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGW IA, ou qualquer de suas variantes de ocorrência natural, em particular aquelas com pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em A2T, H6R, D7N, A21G ("Flamengo"), E22G ("Ártico"), E22Q ("Holandês"), E22K ("Italiano"), D23N ("Iowa"), A42T e A42V, em que os núme- ros são relativos ao início do peptídeo Αβ, incluindo tanto 1 e 42 quanto uma seqüência com até três substitui- ções de aminoácido adicionais, nenhuma das quais pode prevenir a formação de globulômero, preferivelmente sem nenhuma substituição de aminoácido adicional na porção de aminoácido 20 até o aminoácido 42. De outra forma, o ter- mo "Αβ(1-40)" refere-se aqui à seqüência de aminoácidos da posição de aminoácido 1 até a posição de aminoácido 40 da proteína β amilóide humana, incluindo tanto 1 quanto 40, em particular, à seqüência de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGW ou qualquer de suas vari- antes de ocorrência natural, em particular aquelas com pe- lo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em A2T, H6R, D7N, A21G ("Flamengo"), E22G ("Ártico"), E22Q ("Holandês"), E22K ("Italiano"), e D23N ("Iowa"), em que os números são relativos ao início do peptídeo Αβ, inclu- indo tanto 1 quanto 40 ou uma seqüência com até três substituições de aminoácido adicionais, nenhuma das quais pode prevenir a formação de globulômero, preferivelmente sem nenhuma substituição de aminoácido adicional na porção de aminoácido 20 até o aminoácido 40.

Mais especificamente, o termo "Αβ(12-42)" refe- re-se aqui à seqüência de aminoácidos da posição de ami- noácido 12 até a posição de aminoácido 42 da proteína β amilóide humana, incluindo tanto 12 quanto 42, em particu- lar, à seqüência de aminoácidos VHHQKLVFF AEDVGSNKGA II- GLMVGGVVIA ou qualquer de suas variantes de ocorrência natural, em particular aquelas com pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em A21 G ("Flamengo"), E22G ("Ártico"), E22Q ("Holandês"), E22K ("Italiano"), D23N ("Iowa") , A42T e A42V, em que os números são relati- vos ao início do peptídeo Αβ, incluindo tanto 12 quanto 42 ou uma seqüência com até três substituições de aminoácido adicionais, nenhuma das quais pode prevenir a formação de globulômero, preferivelmente sem nenhuma substituição de aminoácido adicional na porção de aminoácido 20 até o ami- noácido 42 .

Mais especificamente, o termo "Αβ(20-42)" refe- re-se aqui à seqüência de aminoácidos da posição de ami- noácido 20 até a posição de aminoácido 42 da proteína β amilóide humana, incluindo tanto 20 quanto 42, em parti- cular, à seqüência de aminoácidos F AEDVGSNKGA IIGLMVGGW IA ou qualquer de suas variantes de ocorrência natural, em particular aquelas com pelo menos uma mutação selecio- nada do grupo que consiste em A21G ("Flamengo"), E22G ("Ártico"), E22Q ("Holandês"), E22K ("Italiano"), D23N ("Iowa"), A42T e A42V, em que os números são relativos ao inicio do peptideo Αβ, incluindo tanto 20 quanto 42 ou uma seqüência com até três substituições de aminoácido adicio- nais, nenhuma das quais pode prevenir a formação de globu- lômero, preferivelmente sem nenhuma substituição de ami- noácido adicionais.

O termo "globulômero Αβ(X-Y)"(Αβ(X-Y) oligômero globular) refere-se aqui a uma associação solúvel, globu- lar, não covalente de peptideos Αβ(X-Y) da maneira defini- da anteriormente, possuindo homogeneidade e característi- cas físicas distintas. De acordo com um aspecto, globulô- meros Αβ(X-Y) são conjuntos estáveis, não fibrilares, o- ligoméricas de peptideos Αβ(X-Y) que são obteníveis por incubação com detergentes aniônicos. Ao contrário dos mo- nômero e fibrilas, estes globulômeros são caracterizados pelos número de subunidades do conjunto definido (por e- xemplo, formas de conjuntos anteriores, n=4-6, "oligôme- ros A", e formas de conjuntos posteriores, n=12-14, "oli- gômeros B", da maneira descrita em W02004/067561). Os globulômeros têm uma estrutura tipo globular tridimensio- nal ("glóbulo fundido", ver Barghorn et al., 2005, J Neu- rochem, 95, 834-847). Eles podem ser adicionalmente carac- terizados por um ou mais das seguintes características:

clivabilidade de aminoácidos X-23 N-terminal com proteases promíscuas (tais como termolisina ou endo- proteinase GluC) produzindo formas truncadas de globulô- meros;

não acessibilidade de aminoácidos 24-Y C- terminal com proteases promiscuas e anticorpos;

- formas truncadas desses globulômeros mantêm a estrutura do núcleo tridimensional dos ditos globulômeros com uma melhor acessibilidade do núcleo epitopo Αβ(20-Υ) em sua conformação de globulômero.

De acordo com a invenção e, em particular, com o propósito de avaliar as afinidades de ligação dos anticor- pos da presente invenção, o termo globulômero "Αβ(X-Y) " refere-se aqui em particular a um produto que é obtenivel por um processo descrito em WO 2004/067561, que está in- corporada aqui pela referência.

O dito processo compreende desdobrar um peptideo Αβ(X-Y) natural, recombinante ou sintético, ou um deriva- do deste; expor o peptideo Αβ(X-Y) pelo menos parcialmente desdobrado ou derivado deste a um detergente, reduzir a ação do detergente e continuar a incubação.

Com o propósito de desdobrar o peptideo, agentes de quebra de ligação de hidrogênio tal como, por exemplo, hexafluorisopropanol (HFIP), podem agir naturalmente na proteína. Tempos de ação de poucos minutos, por exemplo, cerca de 10 a 60 minutos, são suficientes, quando à tempe- ratura de ação é cerca de 20 a 50°C e, em particular, cerca de 35 a 40°C. Dissolução subseqüente do resíduo evaporado até a secura, preferivelmente na forma concen- trada, em solventes orgânicos adequados miscíveis com tampões aquosos, tal como,' por exemplo, sulfóxido de di- metila (DMSO), resulta em uma suspensão do peptideo pelo menos parcialmente desdobrado ou derivado deste, que pode ser usado subseqüentemente. Se exigido, a suspensão de es- toque pode ser armazenada a baixa temperatura, por exem- plo, a cerca de -20 °C, por um período temporário.

Alternativamente, o peptídeo ou o derivado deste pode ser tomado em solução ligeiramente ácida, preferivel- mente aquosa, por exemplo, uma solução de HCl aquosa cerca de 10 mM. Após um tempo de incubação geralmente de poucos minutos, componentes insolúveis são removidos por centri- fugação. Poucos minutos a 10.000 g é conveniente. Estas etapas do método são preferivelmente realizadas à tempe- ratura ambiente, isto é, uma temperatura na faixa de 20 a 30 °C. O sobrenadante obtido após centrifugação contém o peptídeo Αβ(X-Y) ou o derivado deste e pode ser armazenado a baixa temperatura, por exemplo, a cerca de -20 °C, por um período temporário.

A exposição seguinte a um detergente diz respei- to a oligomerização do peptídeo ou o derivado deste para dar um tipo de intermediário de oligômeros (em WO 20041067561 referidos como oligômeros A). Com este propó- sito, um detergente age naturalmente no peptídeo pelo me- nos parcialmente desdobrado ou derivado deste até que o- ligômero intermediário suficiente seja produzido.

É dada preferência ao uso de detergentes iôni- cos, em particular detergentes aniônicos.

De acordo com uma modalidade particular, um de- tergente da fórmula (1) :

R-X,

é usado, em que o radical R é alquila não ramificado ou ramifica- do tendo de 6 a 20 e preferivelmente 10 a 14 átomos de carbono ou alquenila não ramificado ou ramificado tendo de 6 a 20 e preferivelmente 10 a 14 átomos de carbono,

o radical X é um grupo acidico ou sal deste, com X sendo preferivelmente selecionado entre

-COO-M+, -S03 -M+, e especialmente

-0S03-M+ e M+ é um cátion de hidrogênio ou um cá- tion inorgânico ou orgânico preferivelmente selecionado de cátions de metal alcalino e metal alcalino terroso e cá- tions de amônio.

Detergentes da fórmula (1) são vantajosos, em que R é alquila não ramificado do qual radicais alquil-1 devem ser mencionados em particular. Particular preferência é dada a dodecil sulfato de sódio (SDS). Ácido láurico e á- cido oléico podem também ser usados vantajosamente. 0 sal de sódio do detergente lauroilsarcosina (também conhecido como sarcosila NL-30 ou Gardol®) é também particularmente vantajoso.

O tempo de ação do detergente em particular de- pende se - e, caso dependa, até que ponto - o peptideo ou o derivado deste submetido a oligomerização foi desdobra- do. Se, de acordo com a etapa de desdobramento, o pepti- deo ou derivado deste foi tratado de antemão com um agen- te quebra de ligação de hidrogênio, isto é, em particular com hexafluorisopropanol, tempos de ação na faixa de pou- cas horas, vantajosamente de cerca de 1 a 20 e em particu- lar de cerca de 2 a 10 horas, são suficientes, quando à temperatura de ação é cerca de 20 a 50 0C e em particular cerca de 35 a 40 °C. Se um peptídeo menos desdobrado ou um essencialmente não desdobrado ou derivado deste é o ponto de partida, tempos de ação correspondentemente maiores são convenientes. Se o peptideo ou o derivado deste tiver sido pré-tratado, por exemplo, de acordo com o procedimento indicado anteriormente como uma alternativa para o trata- mento de HFIP, ou o dito peptideo ou derivado deste é di- retamente submetido a oligomerização, tempos de ação na faixa de cerca de 5 a 30 horas e em particular cerca de 10 a 20 horas são suficientes, quando à temperatura de a- ção é cerca de 20 a 50 °C e em particular cerca de 35 a 40 °C. Após incubação, componentes insolúveis são vantajosa- mente removidos por centrifugação. Poucos minutos a 10.000 g são convenientes.

A concentração de detergente a ser escolhida de- pende do detergente usado. Se for usado SDS, uma concen- tração na faixa de 0,01 a 1% em peso, preferivelmente de 0,05 a 0,5 % em peso, por exemplo, de cerca de 0,2 % em peso, mostra-se conveniente. Se for usado ácido laurilico ou ácido oléico, concentrações ligeiramente maiores são convenientes, por exemplo, em uma faixa de 0,05 a 2 % em peso, preferivelmente de 0,1 a 0,5 % em peso, por exem- plo, de cerca de 0,5 % em peso.

A ação do detergente deveria ocorrer em uma con- centração de sal aproximadamente na faixa fisiológica. As- sim, em particular concentrações de NaCl na faixa de 50 a 500 mM, preferivelmente de 100 a 200 mM e particularmente a cerca de 140 mM são convenientes.

A redução subseqüente da ação do detergente e continuidade de incubação diz respeito a uma oligomeriza- ção adicional para dar o globulômero Αβ(X-Y) da invenção (em WO 2004/067561 referido como oligômeros B) . Uma vez que a composição obtida da etapa precedente contém regu- larmente detergente e uma concentração de sal na faixa fisiológica, é então conveniente reduzir a ação do deter- gente e, preferivelmente, também a concentração de sal. Isto pode ser realizado reduzindo a concentração de deter- gente e sal, por exemplo, diluindo apropriadamente com á- gua ou um tampão de baixa concentração de sal, por exem- plo, Tris-HCl, pH 7,3. Fatores de diluição na faixa de cerca de 2 a 10, vantajosamente na faixa de cerca de 3 a 8 e em particular de cerca de 4 têm se mostrado adequados. A redução na ação do detergente também pode ser obtida adi- cionando substâncias que podem neutralizar a dita ação do detergente. Exemplos desses incluem substâncias capazes de complexar os detergentes, substâncias similares capa- zes de estabilizar células no curso de medidas de purifi- cação e extração, por exemplo, copolimeros bloco EO/PO particulares, em particular o copolimero bloco com o nome comercial Pluronic® F 68. Fenóis alquila alcoxilados e, em particular, etoxilados tais como o t-octilfenóis etoxila- dos da série Triton® X, em particular Triton® X100, 3-(3- colamidopropildimetilamônio)-1-propanossulfonato (CHAPS®) ou alcoxilados e, em particular, ésteres graxos de sorbi- tano etoxilados tais como aquelas da série Tween®, em par- ticular Tween® 20, em faixas de concentração em torno ou acima da concentração de micela critica particular, podem ser igualmente usados.

Subseqüentemente, a solução é incubada até que globulômero Αβ(X-Y) suficiente da invenção seja produzido. Tempos de ação na faixa de diversas horas, preferivelmen- te na faixa de cerca de 10 a 30 horas e em particular na faixa de cerca de 15 a 25 horas são suficientes, quando à temperatura de ação é cerca de 20 a 50 0C e em particular cerca de 35 a 40 °C. A solução pode em seguida ser con- centrada e possíveis resíduos podem ser removidos por centrifugação. Aqui também, poucos minutos a 10.000 g mos- tram-se convenientes. O sobrenadante obtido após centrifu- gação contém um globulômero Αβ(X-Y) da invenção.

Um globulômero Αβ (X-Y) da invenção pode ser fi- nalmente recuperado de uma maneira conhecida per se, por exemplo, por ultrafiltração, diálise, precipitação ou centrifugação.

É adicionalmente preferido que a separação ele- troforética dos globulômeros Αβ(X-Y) em condições desnatu- rantes, por exemplo, por SDS-PAGE, produção uma banda du- pla (por exemplo, com um peso molecular aparente de 38/48 kDa para Αβ(1-42)), e prefere-se especialmente que, medi- ante tratamento de glutardialdeído dos globulômeros antes da separação, essas duas bandas sejam fundidas em uma. Prefere-se também que cromatografia de exclusão de tamanho dos globulômeros resulte em um pico único (por exemplo, correspondente a um peso molecular de aproximadamente 100 kDa para globulômero Αβ(1-42) ou de aproximadamente 60 kDa para globulômero Αβ(1-42)) reticulado com glutardialdeí- do, respectivamente.

Começando pelo peptideo Αβ(1-42), peptideo Αβ(12- 42) e peptideo Αβ(20-42), os ditos processos são em parti- cular adequados para obter globulômeros Αβ(1-42), globulô- meros Αβ(12-42), e globulômeros Αβ(20-42).

Em uma modalidade particular da invenção, globu- lômeros Αβ (X-Y) , em que X é selecionado do grupo que con- siste nos números 2.. 24 e Y é da maneira definida ante- riormente, são aquelas que são obteniveis truncando globu- lômeros Αβ(I-Y) em formas menores, em que X é selecionado do grupo que consiste nos números 2.. 24, com X preferi- velmente sendo 20 ou 12, e Y é da maneira definida anteri- ormente, que podem ser obtidas por tratamento com protea- ses apropriadas. Por exemplo, um globulômero Αβ(20-42) po- de ser obtido submetendo um globulômero Αβ(1-42) a proteó- lise de termolisina, e um globulômero Αβ(12-42) pode ser obtido submetendo um globulômero Αβ(1-42) a proteólise GluC endoproteinase. Quando o grau desejado de proteólise é atingido, a protease é inativada de uma maneira geral- mente conhecida. Os globulômeros resultantes podem em se- guida ser isolados seguindo os procedimentos já descritos aqui e, se exigido, processados adicionalmente por etapas de trabalho e e purificação posteriores. Uma descrição de- talhada dos ditos processos é revelada em WO 20041067561, que está incorporada aqui pela referência.

Com os propósitos da presente invenção, um globu- lômero Αβ(1-42) é em particular o globulômero Αβ(1-42) da maneira descrita aqui no exemplo la; um globulômero Αβ(20- 42) é em particular o globulômero Αβ(20-42) da maneira descrita aqui nos exemplos lc, e um globulômero Αβ(12-42) é em particular o globulômero Αβ(12-42) da maneira descri- ta aqui nos exemplos ld.

Preferivelmente, o globulômero mostra afinidade com células neuronais. Preferivelmente, o globulômero tam- bém apresenta efeitos neuromoduladores.

De acordo com um outro aspecto da invenção, o globulômero consiste em 11 a 16, e ainda mais preferivel- mente em 12 a 14 peptideos Αβ(X-Y).

De acordo com um outro aspecto da invenção, o termo "globulômero Αβ(X-Y)" refere-se aqui a um globulôme- ro consistindo essencialmente em subunidades Αβ(X-Y), onde é preferível que, em média, pelo menos 11 de 12 subunida- des forem do tipo Αβ (X-Y) , mais preferível que menos que 10 % dos globulômeros compreendam quaisquer peptideos não Αβ (X-Y), e mais preferível que o conteúdo de peptideos não Αβ (X-Y) seja abaixo do patamar de detecção.

Mais especificamente, o termo "globulômero Αβ(1- 42)" refere-se aqui a um globulômero consistindo essencial- mente em unidades Αβ(1-42) da maneira definida anterior- mente; o termo "globulômero Αβ(12-42)" refere-se aqui a um globulômero consistindo essencialmente em unidades Αβ(12- 42) da maneira definida anteriormente; e o termo "globulô- mero Αβ (20-42)" refere-se aqui a um globulômero consistin- do essencialmente em unidades Αβ(20-42) da maneira defini- da anteriormente.

O termo "globulômero Αβ (X-Y) reticulado" refere- se aqui a uma molécula obtenivel de um globulômero Αβ(X-Y) da maneira descrita anteriormente reticulando, preferivel- mente reticulando quimicamente, mais preferivelmente reti- culando aldeido, ainda mais preferivelmente reticulando glutardialdeido das unidades constituintes do globulômero. Em um outro aspecto da invenção, um globulômero reticulado é essencialmente um globulômero em que as unidades são pe- lo menos parcialmente unidas por ligações covalentes, em vez de ser mantidas juntas apenas por interações não cova- lentes. Com os propósitos da presente invenção, um globu- lômero Αβ(1-42) reticulado é em particular o oligômero. Αβ(1-42) reticulado da maneira descrita aqui no exemplo 1b.

O termo "derivado de globulômero Αβ(X-Y)" refere- se aqui em particular a um globulômero que é classificado por ser ligado covalentemente com um grupo que facilita a detecção, preferivelmente um fluoróforo, por exemplo, iso- tiocianato de fluoresceina, ficoeritrina, proteína fluo- rescente Aequorea victoria, proteína fluorescente Dic- tyosoma ou qualquer combinação ou derivado ativo de fluo- rescência destes; um cromóforo; um quimioluminóforo, por exemplo, luciferase, preferivelmente luciferase Photinus pyralis, luciferase Vibrio fischeri, ou qualquer combina- ção ou derivado ativo quimiolumínescente destes; um grupo enzimaticamente ativo, por exemplo, peroxidase, por exem- plo, peroxidase do rábano silvestre, ou qualquer derivado enzimaticamente ativo destes; um grupo denso de elétron, por exemplo, um grupo contendo metal pesado, por exemplo, um grupo contendo ouro; um hapteno, por exemplo, um hapteno derivado de fenol; um estrutura fortemente antigênica, por exemplo, seqüência de peptideo prevista a ser antigênica, por exemplo, prevista como antigênica pelo algoritimo de Kolaskar e Tongaonkar; um aptâmero para uma outra molécu- la; um grupo quelante, por exemplo, hexaistidinila; uma es- trutura de proteína natural ou derivada da natureza median- do interações proteina-proteina específicas adicionais, por exemplo, um membro do par fos/jun; um grupo magnético, por exemplo, um grupo ferromagnético; ou um grupo radioativo, por exemplo, um grupo compreendendo 1H, 14C 32P, 35S ou 125I ou qualquer combinação destes; ou de um globulômero sina- lizado por ser ligado covalentemente ou por interação de alta afinidade não covalente, preferivelmente covalente- mente a um grupo que facilita a inativação, seqüestração, degradação e/ou precipitação, preferivelmente sinalizado com um grupo que promove degradação in vivo, mais preferi- velmente com ubiquitina, onde é particularmente preferido que este oligômero sinalizado seja montado in vivo; ou com um globulômero modificado por qualquer combinação do ante- rior. Tais grupos e métodos de marcação e sinalização para anexá-los às proteínas são conhecidos na tecnologia. Mar- cação e/ou sinalização pode ser realizado antes, durante ou após globulomerização. Em um outro aspecto da invenção, um derivado de globulômero é uma molécula obtenível de um globulômero por uma reação de marcação e/ou sinalização. Correspondentemente, termo derivado de monômero "Αβ(X-Y)" refere-se aqui em particular a um monômero Αβ que é marcado ou sinalizado da maneira descrita para o globu- lômero.

Apropriadamente, o anticorpo da presente invenção se liga a um globulômero Αβ(20-42) com um K0 na faixa de 1 χ IO-6 Malx IO-12 M. Preferivelmente, o anticorpo se li- ga a um globulômero Αβ(20-42) com alta afinidade, por e- xemplo, com um K0 de 1 χ IO-' M ou maior afinidade, por e- xemplo, com um Kd de 3 χ 10 M ou maior afinidade, com um Kd de 1 χ 10 M ou maior afinidade, por exemplo, com um Kd de 3 χ IO-9 M ou maior afinidade, com um Kd de 1 χ IO-9 M ou mai- or afinidade, por exemplo, com um K0 de 3 χ IO-10 M ou mai- or afinidade, com um K0 de 1 χ IO-10 M ou maior afinidade, por exemplo, com um Kd de 3 χ IO-11 M ou maior afinidade, ou com um Kd de 1 χ IO"11 M ou maior afinidade.

O termo "maior afinidade" refere-se aqui a um grau de interação onde o equilíbrio entre anticorpo não ligado e globulômero não ligado de um lado e complexo anticorpo- globulômero do outro é ainda mais a favor do complexo an- ticorpo-globulômero. De outra forma, o termo "menor afini- dade" refere-se aqui a um grau de interação onde o equilí- brio entre anticorpo não ligado e globulômero não ligado de um lado e complexo anticorpo-globulômero do outro é ainda mais a favor do anticorpo não ligado e globulômero não li- gado. 0 termo "maior afinidade" é sinônimo do termo "afini- dade mais alta" e termo "menor afinidade" é sinônimo do termo "afinidade mais baixa". De acordo com uma modalidade particular, a inven- ção diz respeito a um anticorpo que se liga ao globulômero Αβ (20-42) com um K0 na faixa de 1 χ 10"6 Malx 10"12 Μ, ao globulômero Αβ(1-42) com um Kd de 10-12 M ou menor afinida- de, a afinidade de ligação com o globulômero Αβ(20-42) sendo maior que a afinidade de ligação com o globulômero Αβ (1-42) .

Prefere-se que a afinidade de ligação do anticor- po da presente invenção com o globulômero Αβ(20-42) seja pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pe- lo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes, e ainda mais preferivelmente pelo menos 1.000 vezes, por exemplo, pelo menos 2.000 vezes, pelo menos 3.000 vezes ou pelo menos 5.000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10.000 vezes, por exemplo, pelo menos 20.000 vezes, pelo menos 30.000 ou pelo menos 50.000 vezes, e ainda mais preferivelmente pelo menos 100.000 vezes maior que a afinidade de ligação do anticor- po com o globulômero Αβ(1-42) .

De acordo com uma modalidade particular, a inven- ção diz respeito a um anticorpo que se liga ao globulômero Αβ (12-42) com um Kd de 10"12 M ou menor afinidade, a afini- dade de ligação com o globulômero Αβ(20-42) sendo maior que a afinidade de ligação com o globulômero Αβ(2-42).

Prefere-se também que a afinidade de ligação do anticorpo da presente invenção com o globulômero Αβ(20—42) seja pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 ve- zes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais pref erivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes, e ainda mais preferi- velmente pelo menos 1.000 vezes, por exemplo, pelo menos 2.000 vezes, pelo menos 3.000 vezes ou pelo menos 5.000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10.000 vezes, por exemplo, pelo menos 20.000 vezes, pelo menos 30.000 ou pelo menos 50.000 vezes, e ainda mais preferivelmente pelo menos 100.000 vezes maior que a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Αβ(12-42).

Preferivelmente, os anticorpos da presente inven- ção se ligam a pelo menos um globulômero Αβ, da maneira definida anteriormente, e têm uma afinidade relativamente menor por pelo menos uma forma não globulômero de Αβ.

Anticorpos da presente invenção tendo uma afini- dade por pelo menos uma forma não globulômero de Αβ rela- tivamente menor do que por pelo menos um globulômero Αβ in- cluem anticorpos tendo uma afinidade de ligação com o glo- bulômero Αβ (20-42) que é maior do que com um monômero Αβ(1-42). Adicionalmente, prefere-se que, alternativa ou adicionalmente, a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Αβ(20-42) seja maior do que com um monômero Αβ (1-40).

Em uma modalidade preferida da invenção, a afini- dade do anticorpo com o globulômero Αβ(20-42) é maior sua afinidade tanto com o monômero Αβ(1-40) quanto com o monô- mero Αβ(1-42).

O termo "monômero Αβ(X-Y)" refere-se aqui à forma isolada do peptideo Αβ(X-Y), preferivelmente uma forma do peptideo Αβ(X-Y) que não é engajado em interações essenci- almente não covalente com outros peptideos Αβ. Praticamen- te, o monômero Αβ(X-Y) é geralmente fornecido na forma de uma solução aquosa. Em uma modalidade particularmente pre- ferida da invenção, o solução aquosa de monômero contém 0,05 % a 0,2 %, mais pref erivelmente cerca de 0,1 % de NH4OH. Em uma outra modalidade particularmente preferida da invenção, o solução aquosa de monômero contém 0,05 % a 0,2 %, mais pref erivelmente cerca de NaOH 0,1 %. Quando usado (por exemplo, para determinar as afinidades de liga- ção dos anticorpos da presente invenção), pode ser conve- niente diluir a dita solução de uma maneira apropriada. Adicionalmente, é geralmente conveniente usar a dita solu- ção em 2 horas, em particular em 1 hora, e especialmente em 30 minutos após sua preparação.

Mais especificamente, o termo "monômero Αβ(1-40)" refere-se aqui a uma preparação de monômero Αβ(1-40) da ma- neira descrita aqui no exemplo 2, e o termo "Αβ(1-42) mo- nômero" refere-se aqui a uma preparação Αβ(1—42) da manei- ra descrita aqui no exemplo 2.

Apropriadamente, o anticorpo da presente invenção se liga a um ou, mais preferivelmente, ambos monômeros com baixa afinidade, ainda mais preferivelmente com um K0 de 1 xl O"8 M ou menor afinidade, por exemplo, com um K0 de 3 χ 10 M ou menor afinidade, com um K0 de 1 χ IO-7 M ou menor afinidade, por exemplo, com um K0 de 3 χ 10~7 M ou menor afinidade, ou com um K0 de 1 χ 10 -8 M ou menor afinidade, por exemplo, com um K0 de 3 χ IO-5 M ou menor afinidade, ou com um K0 de 1 χ 1 0 M ou menor afinidade.

Prefere-se especialmente que a afinidade de liga- ção do anticorpo da presente invenção com o globulômero Αβ (20-42) seja pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais pref erivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes, e ainda mais pre- ferivelmente pelo menos 1.000 vezes, por exemplo, pelo me- nos 2.000 vezes, pelo menos 3.000 vezes ou pelo menos 5.000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10.000 vezes, por exemplo, pelo menos 20.000 vezes, pelo menos 30.000 ou pelo menos 50.000 vezes, e ainda mais preferi- velmente pelo menos 100.000 vezes maior que a afinidade de ligação do anticorpo com um ou, mais pref erivelmente, am- bos monômeros .

Anticorpos da presente invenção tendo uma afini- dade por pelo menos uma forma não globulômero de Αβ rela- tivamente menor do que por pelo menos um Αβ globulômero incluem ainda mais anticorpos tendo uma afinidade de liga- ção com o globulômero Αβ(20-42) que é maior do que com fi- brilas Αβ(1-42). Adicionalmente, prefere-se que, alternati- va ou adicionalmente, a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Αβ(20-42) seja maior do que com fibrilas Αβ (1-40) .

termo "fibrila" refere-se aqui a uma estrutura molecular que compreende conjuntos de peptideos Αβ(X-Y) individuais, não covalentemente associados, que apresenta estrutura fibrilar no microscópio eletrônico, que liga vermelho Congo e em seguida apresenta bi-refringência sob luz polarizada e cujo padrão de difração de raios X é uma estrutura β cruzada.

Em um outro aspecto da invenção, uma fibrila é uma estrutura molecular obtenivel por um processo que com- preende o agregação polimérica alto induzida de um ade- quados Αβ peptideo na ausência de detergentes, por exem- plo, em 0,1 M HCl, levando a formação de agregados de mais que 24, preferivelmente mais que 100 unidades. Este pro- cesso é bem conhecido na tecnologia. Apropriadamente, Αβ(X-Y) fibrilas são usado na forma de um solução aquosa. Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, a solução fibrila aquosa é feita dissolvendo o peptideo Αβ em 0,1 % de NH4OH, diluindo-o 1 : 4 com 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCl, pH 7,4, seguido por ré ajustamento do pH a 7,4, incubando a solução a 37 0C for 20 h, seguido por centrifugação a 10.000 g for 10 min e ré-suspensão em 20 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCl, pH 7,4.

0 termo "fibrila Αβ(X-Y)" refere-se aqui a uma fibrila consistindo essencialmente em Αβ(X-Y) subunidades, onde it é preferido se em média pelo menos 90 % de o su- bunidades são de o Αβ (X-Y) tipo, mais preferido se pelo menos 98% de o subunidades são de o Αβ (X-Y) tipo, e mais preferido se o conteúdo de não Αβ(X-Y) peptideos é abaixo do patamar de detecção.

Mais especificamente, o termo "fibrila Αβ(1-42) " refere-se aqui a uma preparação de fibrila Αβ(1-42) da ma- neira descrita aqui no exemplo 3.

Apropriadamente, o anticorpo da presente invenção se liga a uma ou, mais preferivelmente, ambas as fibrilas com baixa afinidade, ainda mais preferivelmente com um K0 de 1 χ 10 M ou menor afinidade, por exemplo, com um K0 de 3 χ 10 M ou menor afinidade, com um Kd de 1 χ IO-M ou me- nor afinidade, por exemplo, com um K0 de 3 χ IO-7 M ou me- nor afinidade, ou com um K0 de 1 χ IO-6 M ou menor afini- dade, por exemplo, com um K0 de 3 χ 1 0 M ou menor afini- dade, ou com um K0 de 1 χ 10 M ou menor afinidade.

Prefere-se especialmente que a afinidade de li- gação do anticorpo da presente invenção com globulômero Αβ (20-42) seja pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, pref eri velmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes, mais pref erivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes, e ainda mais preferivelmente pelo menos 1.000 vezes, por exemplo, pelo menos 2.000 vezes, pelo menos 3.000 vezes ou pelo menos 5.000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10.000 vezes, por exemplo, pelo menos 20.000 vezes, pelo menos 30.000 ou pelo menos 50.000 vezes, e ainda mais preferi- velmente pelo menos 100.000 vezes maior que a afinidade de ligação do anticorpo com uma ou, mais preferivelmente, ambas fibrilas.

De acordo com uma modalidade particular, a inven- ção diz respeito a anticorpos tendo um afinidade de liga- ção com o Αβ(20-42) globulômero que é maior que sua afini- dade de ligação tanto com fibrilas Αβ(1-40) quanto Αβ(1- 42).

De acordo com uma modalidade particularmente preferida, a presente invenção diz respeito a anticorpos tendo uma afinidade relativamente menor tanto para as formas Αβ monoméricas quanto fibrilares que por pelo menos um globulômero Αβ, em particular globulômero Αβ(20-42). Es- tes anticorpos a seguir são referidos to anticorpos espe- cíficos de globulômero.

Anticorpos da presente invenção incluem ainda mais anticorpos tendo uma afinidade de ligação com o Αβ 20-42) globulômero que é maior que to um reticulado AB (1- 20 42) globulômero, em particular to um glutardialdeido reti- culado Αβ(1-42) globulômero, tais como que descrito aqui no exemplo 1 b.

Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, a afinidade de ligação do anticorpo to Αβ(20-42) globulômero é pelo menos 2 vezes, por exemplo, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 ve- zes ou pelo menos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, por exemplo, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes ou pelo menos 500 vezes, e ainda mais preferi- velmente pelo menos 1.000 vezes, por exemplo, pelo menos 2.000 vezes, pelo menos 3.000 vezes ou pelo menos 5.000 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10.000 vezes, por exemplo, pelo menos 20.000 vezes, pelo menos 30.000 ou pelo menos 50.000 vezes, e ainda mais preferivelmente pelo menos 100.000 vezes maior que a afinidade de ligação do an- ticorpo com globulômero Αβ(1-42) reticulado.

Os anticorpos da presente invenção são preferi- velmente isolados, em particular monoclonais e mais parti- cularmente recombinantes.

A presente invenção também diz respeito a anti- corpo monoclonal (5F7) que é obtenivel de um hibridoma de- signado por depósito de American Type Culture Collection número PTA-7241.

A presente invenção também diz respeito a um an- ticorpo monoclonal (10F11) que é obtenivel de um hibridoma designado por depósito de American Type Culture Collection número PTA-7239.

A presente invenção também diz respeito a um an- ticorpo monoclonal (7C6) que é obtenivel de um hibridoma designado por depósito de American Type Culture Collection número PTA-7240.

A presente invenção também diz respeito a um an- ticorpo monoclonal (4B7) que é obtenivel de um hibridoma designado por depósito de American Type Culture Collection número PTA-72 42. A presente invenção também diz respeito a um an- ticorpo monoclonal (6A2) que é obtenivel de um hibridoma designado por depósito de American Type Culture Collection número PTA-7409.

A presente invenção também diz respeito a um an- ticorpo monoclonal (2F2) que é obtenivel de um hibridoma designado por depósito de American Type Culture Collection número PTA-7408.

A presente invenção também diz respeito a um an- ticorpo monoclonal (4D10) que é obtenivel de um hibridoma designado por depósito de American Type Culture Collection número PTA-7405.

A presente invenção também diz respeito a um anti- corpo monoclonal (7E5) que é obtenivel de um hibridoma de- signado por depósito de American Type Culture Collection nú- mero PTA-7809.

A presente invenção também diz respeito a um anti- corpo monoclonal (IOCl) que é obtenivel de um hibridoma de- signado por depósito de American Type Culture Collection nú- mero PTA-7810.

A presente invenção também diz respeito a um anti- corpo monoclonal (3B10) que é obtenivel de um hibridoma de- signado por depósito de American Type Culture Collection nú- mero PTA-7 8 51.

Estes anticorpos da presente invenção, 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 e 3B10, são caracteriza- dos por ter uma afinidade de ligação com um globulômero Αβ (20-42) que é maior que a afinidade de ligação do anticor- po com um globulômero Αβ(1-42).

A presente invenção também diz respeito a anticor- pos tendo um perfil de ligação similar ao de qualquer um dos ditos anticorpos monoclonais, 5F7, 10F11, 7C6, 4B7 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, IOCl e 3B10. Deve-se entender que anticorpos ten- do um perfil de ligação similar ao de qualquer um dos ditos anticorpos monoclonais não são limitados a anticorpos tendo uma afinidade de ligação com um globulômero Αβ(20-42) que é maior que a afinidade de ligação do anticorpo com um globu- lômero Αβ(1-42).

Anticorpos tendo um perfil de ligação similar ao de qualquer um dos ditos anticorpos monoclonais, 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, IOCl e 3B10, incluem anticor- pos que se ligam ao mesmo epitopo como anticorpo monoclonal 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, IOCl e 3B10.

Todos os anticorpos monoclonais do grupo que con- siste em 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 e 3B10 se ligam a um epitopo contido na faixa de seqüência Αβ 20 e 42, em particular na faixa de seqüência Αβ 20-30. Sem se ligar a nenhuma teoria, acredita-se que o dito epitopo seja um epitopo estrutural, não linear em entre subunidades na região de aminoácidos 20 e 42, em particular na região de aminoácidos 20 e 30.

A presente invenção também diz respeito a anticor- pos que são capazes de competir com pelo menos um, preferi- velmente todos, anticorpos selecionados do grupo que consis- te em 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 35 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 e 3B10 . O termo "anticorpos competitivos" refere-se aqui a qualquer número de anticorpos que visa a mesma entidade mo- lecular ou supermolecular estavelmente, mas não covalente- mente ligada, preferivelmente a mesma molécula, em que pelo menos uma é capaz de especificamente reduzir a ligação men- surável de uma outra, preferivelmente atrasando estericamen- te o acesso da outra ao seu epitopo visado ou induzindo e/ou estabilizando uma conformação na entidade visada que reduz a afinidade do alvo com o outro anticorpo, mais preferi- velmente bloqueando diretamente o acesso ao epitopo visa- do do outro, ligando a um epitopo em proximidade suficien- temente imediata do primeiro, sobrepondo com o primeiro ou idêntico ao primeiro, ainda mais preferivelmente sobrepon- do ou idêntico, em particular idêntico. Diz-se aqui que dois epitopos estão "sobrepondo" se eles compartilharem parte de suas estruturas químicas, preferivelmente sua se- qüência de aminoácidos, e a ser "idêntico", se suas estru- turas químicas, preferivelmente sua seqüência de aminoáci- dos, for idêntica.

Assim, a presente invenção também diz respeito a anticorpos cujos epitopos visados estão sobrepondo com, preferivelmente idêntico a, o epitopo visado de pelo menos um dos anticorpos selecionados do grupo que consiste em 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 e 3B10.

Anticorpos tendo um perfil de ligação similar ao de qualquer um dos ditos anticorpos monoclonais, 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2. 2F2, 4D10. 7E5, 10C1 e 3B10, incluem assim ainda mais anticorpos que compreendem pelo menos uma porção da fração de ligação de antigeno de qualquer um dos ditos anticorpos monoclonais, 5F7, 10F11, 7C6, 467, 6A2, 2F2, 4Dl0, 7E5, 10Cl e 3B10. Preferivelmente, a dita por- ção compreende pelo menos um região determinante comple- mentar (CDR) de qualquer um dos ditos anticorpos monoclo- nais, 5F7, 10 Fl 1, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 e 3B10.

Assim, de acordo com uma modalidade particular adicional, a presente invenção diz respeito a anticorpos compreendendo a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada CDR3 e/ou a seqüência de aminoácidos da cadeia leve CDR3 do anticorpo monoclonal 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 ou 3B10. Exemplos específicos de tais an- ticorpos incluem aqueles que também compreendem a seqüên- cia de aminoácidos da cadeia pesada CDR2 e/ou a seqüência de aminoácidos da cadeia leve CDR2 do anticorpo monoclo- nal 5F7, 10 Fl 1, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 ou 3B10, respectivamente. Ainda mais especificamente, tais anticorpos incluem aqueles que também compreendem a se- qüência de aminoácidos da cadeia pesada CDRl e/ou a se- qüência de aminoácidos da cadeia leve CDRl do anticorpo monoclonal 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 ou 3B10, respectivamente.

Em um aspecto, a presente invenção diz respeito assim a anticorpos compreendendo uma cadeia pesada em que o domínio CDR3, CDR2 e/ou CDRl compreende a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada CDR3, CDR2 e/ou CDRl do an- ticorpo monoclonal 5F7, 10F11, 7C6, 4Β7, 6Α2, 2F2, 4D10, 7Ε5, 10Cl ou 3Β10.

Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito assim a anticorpos compreendendo uma cadeia leve em que o domínio CDR3, CDR2 e/ou CDRl compreende a se- qüência de aminoácidos da cadeia leve CDR3, CDR2 e/ou C- DRl, respectivamente, do anticorpo monoclonal 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, IOCl ou 3B10.

Preferivelmente, o anticorpo compreende pelo menos um CDR compreendendo uma seqüência de aminoácidos seleciona- da do grupo que consiste em: resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO: 3, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID N0:3, resíduos de aminoácido 99-109 de SEQ ID NO:3, resíduos de aminoácido 24-39 de SEQ ID NO:4, resíduos de aminoácido 55- 61 de SEQ ID NO: 4, resíduos de aminoácido 94-102 de SEQ ID NO: 4, resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:7, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:7, resíduos de aminoácido 97-109 de SEQ ID NO:7, resíduos de aminoácido 24-39 de SEQ ID NO:8, resíduos de aminoácido 55-61 de SEQ ID NO:8, resí- duos de aminoácido 94-102 de SEQ ID NO:8, resíduos de amino- ácido 31-35 de SEQ ID NO:11, resíduos de aminoácido 50-65 de SEQ ID NO:11, resíduos de aminoácido 98-107 de SEQ ID NO:11, resíduos de aminoácido 24-39 de SEQ ID NO:12, resíduos de aminoácido 55-61 de SEQ ID NO:12, resíduos de aminoácido 94- 102 de SEQ ID NO:12, resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:15, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:15, resí- duos de aminoácido 99-107 de SEQ ID NO:15, resíduos de ami- noácido 24-40 de SEQ ID NO:16, resíduos de aminoácido 56-62 de SEQ ID NO: 16, resíduos de aminoácido 95-103 de SEQ ID NO:16, resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:19, resí- duos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:19, resíduos de amino- ácido 99-109 de SEQ ID NO:19, resíduos de aminoácido 24-39 de SEQ ID NO: 20, resíduos de aminoácido 55-61 de SEQ ID NO:20, resíduos de aminoácido 94-102 de SEQ ID N0:20, resí- duos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:23, resíduos de amino- ácido 50-66 de SEQ ID NO:23, resíduos de aminoácido 99-109 de SEQ ID NO:23, resíduos de aminoácido 24-39 de SEQ ID NO: 24, resíduos de aminoácido 55-61 de SEQ ID NO:24, resí- duos de aminoácido 94-102 de SEQ ID NO:24, resíduos de ami- noácido 31-35 de SEQ ID NO:27, resíduos de aminoácido 50-65 de SEQ ID NO: 27, resíduos de aminoácido 98-101 de SEQ ID NO:27, resíduos de aminoácido 24-39 de SEQ ID NO:28, resíduos de aminoácido 55-61 de SEQ ID NO:28, resíduos de aminoácido 94-102 de SEQ ID NO: 28, de resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:31, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO: 31, resíduos de aminoácido 99-107 de SEQ ID NO:31, resíduos de aminoácido 24-40 de SEQ ID NO: 32, resíduos de aminoácido 56-62 de SEQ ID NO:32, resíduos de aminoácido 95-103 de SEQ ID NO:32, resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:35, re- síduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:35, resíduos de ami- noácido 99-107 de SEQ ID NO:35, resíduos de aminoácido 24-40 de SEQ ID NO: 36, resíduos de aminoácido 56-62 de SEQ ID NO:36, resíduos de aminoácido 95-103 de SEQ ID NO:36, resí- duos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:38, resíduos de amino- ácido 50-66 de SEQ ID NO:38, e resíduos de aminoácido 98-109 de SEQ ID NO:38. Em um modalidade preferida, o anticorpo compreende pelo menos 3 CDRs selecionados do grupo que consiste nas se- qüências reveladas anteriormente. Mais preferivelmente os 3 CDRs selecionados são dos conjuntos de CDRs de domínio vari- ável selecionados do grupo que consiste em:

<table>table see original document page 37</column></row><table> <table>table see original document page 38</column></row><table> <table>table see original document page 39</column></row><table> <table>table see original document page 40</column></row><table> <table>table see original document page 41</column></row><table> Em uma modalidade o anticorpo da invenção compre- ende pelo menos dois conjuntos CDR de domínio variável. Mais preferivelmente, os dois conjuntos CDR de domínio va- riável são selecionados do grupo que consiste em: Conjunto VH 5F7 CDR & Conjunto VL 5F7 CDR; Conjunto VH IOFll CDR & Conjunto VL 10F11 CDR; Conjunto VH 7C6 CDR & Conjunto VL 7C6 CD; Conjunto VH 4B7 CDR & Conjunto VL 4B7 CDR; Con- junto VH 2F2 CDR & Conjunto VL 2F2 C DR; Conjunto VH 6A2 CDR & Conjunto VL 6A2 CDR; Conjunto VH 4010 CDR & Conjun- to VL 4Dl0 CDR; Conjunto VH 7E5 CDR & Conjunto VL 7E5 C- DR; e Conjunto VH 10C1 CDR & Conjunto VL 10C1 CDR.

Em uma outra modalidade o anticorpo revelado an- teriormente compreende adicionalmente uma estrutura acep- tora humana.

Em um modalidade preferida o anticorpo é um anti- corpo montado CDR. Preferivelmente o anticorpo montado CDR compreende um ou mais dos CDRs revelados anteriormente.

Preferivelmente o anticorpo montado CDR compre- ende um human acceptor estrutura.

Em uma modalidade preferida o anticorpo é um an- ticorpo humanizado. Preferivelmente o anticorpo humaniza- do compreende um ou mais dos CDRs revelados anteriormente. Mais preferivelmente o anticorpo humanizado compreende três ou mais dos CDRs revelados anteriormente. Ainda mais preferivelmente o anticorpo humanizado compreende seis C- DRs revelados anteriormente. Em uma modalidade particular, os CDRs são incorporados into um domínio variável de an- ticorpo humano de um estrutura acceptor humano. Preferi- velmente o domínio variável de anticorpo humano é um con- senso do domínio variável humano. Mais preferivelmente o estrutura acceptor humano compreende pelo menos um subs- tituição de aminoácido da Região Estrutura em um resíduo chave, em que o resíduo chave é selecionado do grupo que consiste em um resíduo adjacente de um CDR; um resíduo do sítio de glicosilação; um resíduo raro; um resíduo capaz de interagir com globulômero Αβ (20-42); um resíduo capaz de interagir com um CDR; um resíduo canônico; um resíduo de contato entre região variável de cadeia pesada e regi- ão variável de cadeia leve; um resíduo em uma zona Verni- er; e um resíduo em uma região que sobrepõe entre um CDRl de cadeia pesada variável definida Chothia e um estrutura de cadeia pesada primeiramente definido Kabat. Preferivel- mente a estrutura acceptor humano estrutura acceptor huma- no compreende pelo menos uma substituição de aminoácido da Região Estrutura, em que a seqüência de aminoácidos do estrutura é pelo menos 65 % idêntico à seqüência do dito estrutura acceptor humano e compreende pelo menos 70 re- síduos de aminoácido idênticos ao dito estrutura acceptor humano.

Ainda em um aspecto adicional, a presente inven- ção diz respeito a anticorpos compreendendo tanto a cadeia pesada quanto a cadeia leve da maneira definida anterior- mente.

Preferivelmente, o anticorpo compreende pelo menos um domínio variável tendo uma seqüência de aminoácidos sele- cionada do grupo que consiste em: SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID Ν0:8, SEQ ID Ν0:11, SEQ ID Ν0:12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID Ν0:16, SEQ ID Ν0:19, SEQ ID Ν0:20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID ΝΟ:24, SEQ ID ΝΟ:27, SEQ ID Ν0:28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID ΝΟ:32, SEQ ID ΝΟ:35, SEQ ID ΝΟ:36, e SEQ ID Ν0:38. Mais preferivelmente, ο anticorpo compreende dois do- mínios variáveis, em que os ditos dois domínios variáveis têm seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que con- siste em: SEQ ID N0:3 & SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:7 & SEQ ID NO: 8 & SEQ ID N0:11 & SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:15 & SEQ ID NO: 1 β, SEQ ID N0:19 & SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:23 & SEQ ID NO: 2 4, SEQ ID NO:27 & SEQ ID NQ:28, SEQ ID N0:31 & SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:35 & SEQ ID NO:36.

Em um outro aspecto, os anticorpos da presente in- venção compreendem uma região constante de cadeia pesada se- lecionada do grupo que consiste em IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE e regiões constantes mutantes IgGl Ala234 Ala235 humano. Em particular, os anticorpos compreendem um região constante humana. Mais preferivelmente, os anticorpos compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 39-42. Anticorpos compreen- dendo uma região constante IgGl de cadeia pesada são prefe- ridos .

Em uma outra modalidade o anticorpo é glicosilado. Preferivelmente o padrão de glicosilação é um padrão de gli- cosilação humano ou um padrão de glicosilação produzido por qualquer uma das células eucarióticas aqui reveladas, em particular células CH0.

A presente invenção também diz respeito a uma fra- ção de ligação de antígeno de um anticorpo da presente in- venção. Tais frações que se ligam a antigeno incluem, mas sem limitações, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 e frag- mentos Fv de cadeia única do anticorpo. Frações adicionais que se ligam a antigeno são fragmentos Fab', fragmentos Fv, e fragmentos Fv ligados a dissulfeto.

A invenção também fornece um ácido nucléico isola- do que codifica qualquer um dos anticorpos aqui revelados. Uma modalidade adicional fornece um vetor compreendendo o ácido nucléico isolado aqui revelado. O dito vetor pode em particular ser selecionado do grupo que consiste em pcDNA; pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No.2); pTT3 (pTT com sítios de clonagem múltiplos adicio- nais; pEFBOS (Mizushima, S. And Nagata, S., (1990) Nucleic Acids Research Vol 18, No. 17); pBV; pJV; e pBJ. Em um ou- tro aspecto uma célula hospedeira é transformada com o vetor aqui revelado. Preferivelmente a célula hospedeira é uma cé- lula procariótica. Mais preferivelmente a célula hospedeira é E.coli. Em um modalidade relacionada a célula hospedeira é uma célula eucariótica. Preferivelmente a célula eucariótica é selecionada do grupo que consiste em uma célula protista, uma célula animal (por exemplo, uma célula mamífera, uma cé- lula de aves, e uma célula de inseto), uma célula de planta e uma célula fúngica. Mais preferivelmente a célula hospe- deira é uma célula mamífera incluindo, mas sem limitações, CHO e COS; ou uma célula fúngica, por exemplo, uma célula de levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae; ou uma célula de inseto tal como Sf9. Um outro aspecto da invenção fornece um método de produzir um anticorpo da invenção, compreendendo cultivar qualquer uma das células hospedeiras ou um hibridoma aqui revelados em um meio de cultura em condições adequadas pa- ra produzir o anticorpo. Uma outra modalidade fornece um anticorpo que é obtenivel pelo método aqui revelado.

Anticorpos da presente invenção podem ser obtidos de uma maneira conhecida per se.

Linfócitos B que, na totalidade, contêm um reper- tório de anticorpo composto de centenas de bilhões de es- pecificidades de anticorpo diferentes são uma parte de o sistema imune de mamífero. Uma resposta imune normal a um seleção média de antigeno particular de um ou mais anti- corpos do dito repertório que especificamente se ligam ao dito antigeno, e o sucesso de uma resposta imune é baseado pelo menos parcialmente na capacidade dos ditos anticorpos de reconhecerem especificamente (e essencialmente elimi- nar) o antigeno estimulante e ignorar outras moléculas no ambiente dos ditos anticorpos.

A utilidade de anticorpos que especificamente re- conhecem um antigeno visado particular tem levado ao de- senvolvimento da tecnologia do anticorpo monoclonal. Tec- nologia de hibridoma padronizada permite agora a produção de anticorpos com uma especificidade única para um antige- no de interesse. Mais recentemente, técnicas de anticorpo recombinante tais como classificação in vitro das biblio- tecas de anticorpo foram desenvolvidas. Estas técnicas de outra forma permitem anticorpos tendo uma especificidade única para um antígeno de interesse a ser produzido.

No método da invenção, o antígeno de interesse pode agir naturalmente no repertório de anticorpo tanto in vivo quanto in vitro.

De acordo com uma modalidade, o antígeno age na- turalmente no repertório imunizando um animal in vivo com o dito antígeno. Esta abordagem in vivo pode além disso compreender estabelecimento dos linfócitos de um animal de inúmeros hibridomas e selecionar um hibridoma particular que secreta um anticorpo especificamente ligando ao dito antígeno. O animal a ser imunizado pode ser, por exemplo, um camundongo, rato, coelho, galinha, camelídeos ou car- neiro ou pode ser um versão transgênica de qualquer dos animais mencionado anteriormente, por exemplo, um camun- dongo transgênico com genes de imunoglobulina humanos, que produz anticorpos humanos após um estímulo antigênico. Ou- tros tipos de animais que podem ser imunizados incluem ca- mundongos com imunodeficiência combinada severa (SCID) que foram reconstituídos com células sangüíneas mononucleares periféricas humanas (camundongos hu-PBMC SCID quiméricos) ou com células linfóides ou precursores destes, bem como camundongos que foram tratados com um irradiação corpórea total letal, em seguida protegidos contra radiação com cé- lulas da medula óssea de um camundongo com imunodeficiên- cia combinada severa (SCID) e subseqüentemente transplan- tados com linfócitos humanos funcionais (o sistema "Trime- ra"). Um outro tipo de um animal a ser imunizado é um ani- mal (por exemplo, um camundongo) em cujo genoma um gene endógeno que codifica o antigeno de interesse foi desliga- do (nocauteado), por exemplo, por recombinação homóloga, de maneira que, após imunização com o antigeno, o dito a- nimal reconheça o dito antigeno como estranho. É óbvio aos versados na tecnologia que os anticorpos policlonais ou mo- noclonais produzidos por este método são caracterizados e selecionados usando métodos de classificação conhecidos que incluem, mas sem limitações, técnicas ELISA e dot blot.

De acordo com uma outra modalidade, o antigeno pode agir naturalmente no repertório do anticorpo in vitro selecionando uma biblioteca recombinante de anticorpo com o dito antigeno. A biblioteca recombinante de anticorpo pode ser expressa, por exemplo, na superfície de bacteriófagos ou na superfície de célula de leveduras ou na superfície de células bacterianas. Em uma variedade de modalidades, a biblioteca recombinante de anticorpo é uma biblioteca scFv ou uma biblioteca Fab, por exemplo. De acordo com uma ou- tra modalidade, bibliotecas de anticorpo são expressas co- mo fusões RNA-proteína.

Uma outra abordagem para produzir anticorpos da invenção compreende um combinação de abordagens in vivo e in vitro. Por exemplo, o antigeno pode agir naturalmente no repertório de anticorpo imunizando um animal in vivo com o dito antigeno e em seguida classificar in vitro com o di- to antigeno uma biblioteca recombinante de anticorpo pre- parada a partir de células linfóides do dito animal ou uma biblioteca de anticorpo de domínio único (por exemplo, contendo cadeias pesadas e/ou leves). De acordo com uma ou- tra abordagem, o antigeno age naturalmente no repertório de anticorpo imunizando um animal in vivo com o dito anti- geno e em seguida submetendo uma biblioteca recombinante de anticorpo ou biblioteca de domínio único produzida a partir de células linfóides do dito animal para maturação de afinidade. De acordo com uma outra abordagem, o antigeno age naturalmente no repertório de anticorpo imunizando um animal in vivo com o dito antigeno, em seguida selecionan- do células produtoras de anticorpo individuais que secre- tam um anticorpo de interesse e obtidas dos ditos cDNAs de células selecionadas para a região variável das cadeias pesadas e leves (por exemplo, por meio de PCR) e expres- sando as ditas regiões variáveis das cadeias pesadas e Ie- ves em célula mamíferas hospedeiras in vitro (isto sendo referido como método de anticorpo de linfócito selecionado ou SLAM), sendo assim capaz de selecionar e manipular adi- cionalmente as seqüências de gene de anticorpo seleciona- das. Além disso, anticorpos monoclonais podem ser selecio- nados por clonagem de expressão expressando o genes de an- ticorpo para as cadeias pesadas e leves em célula mamífe- ras e selecionando aquelas célula mamíferas que secretam um anticorpo tendo a afinidade de ligação desejada.

A presente invenção fornece antígenos definidos para classificação e contra classificação. Assim é possí- vel, de acordo com a invenção, selecionar aqueles anticor- pos policlonais e monoclonais que se ligam a um globulôme- ro Αβ(20-42) com as afinidades de ligação da maneira defi- nida anteriormente.

O métodos da invenção para produzir anticorpos podem ser usados para produzir vários tipos de anticorpos. Estes incluem monoclonal, em particular anticorpos recom- binantes, especialmente anticorpos essencialmente humanos, anticorpos quiméricos, anticorpo humanizados e anticorpos de enxerto de CDR, e também frações que se ligam a antíge- no destes.

A presente invenção diz respeito adicionalmente a um hibridoma que é capaz de produzir (que secretam) um an- ticorpo monoclonal da presente invenção. Hibridomas da presente invenção incluem aquelas designadas por um depó- sito de American Type Culture Collection número seleciona- da do grupo que consiste em PTA-7241, PTA-7239, PTA-7240, PTA-7 2 4 2, PTA-7408, PTA-7409, PTA-7405, PTA-7809, PTA-7810 e PTA-7851.

Nota-se que os anticorpos da presente invenção podem também ser reativos com, isto é, se ligam a, outras formas Αβ em comparação aos globulômeros Αβ aqui descrito. Estes antigenos podem ou não ser oligoméricos ou globulo- méricos. Assim, os antigenos aos quais os anticorpos da presente invenção se ligam, incluem qualquer forma Αβ que compreende o epitopo do globulômero com os quais os anti- corpos da presente invenção são reativos. Tais formas Αβ incluem formas Αβ(X-Y) truncadas e não truncadas (com X e Y sendo definidos anteriormente), tais como formas Αβ(20- 42), Αβ(20-40) , Αβ (12-42) , Αβ(12-40), Αβ(1-42), e Αβ(1- 40), uma vez que as ditas formas compreendem o epitopo do globulômero.

A presente invenção também diz respeito a uma composição compreendendo um anticorpo da invenção ou uma fração de ligação de antigeno destes, da maneira definida anteriormente.

De acordo com uma modalidade particular, a dita composição é uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo da invenção ou a fração de ligação de antigeno e um veiculo farmacêutico aceitável.

O anticorpo da invenção ou a fração de ligação de antigeno da maneira definida anteriormente é preferivel- mente capaz de neutralizar, tanto in vitro quanto in vivo, a atividade de globulômero Αβ ou um derivado destes ao qual ele se liga. O dito anticorpo ou fração de ligação de antigeno podem então ser usados para inibir a atividade do dito globulômero ou derivado deste, por exemplo, em uma preparação contendo o dito globulômero ou derivado deste ou em indivíduos humanos ou outros mamíferos nos quais o dito globulômero ou derivado deste está presente.

De acordo com uma modalidade, a invenção diz res- peito a um método de inibir a atividade do dito globulômero ou derivado deste, cujo método compreende um anticorpo da invenção ou uma fração de ligação de antigeno destes agir naturalmente em um globulômero ou derivado deste de manei- ra que iniba a atividade do dito globulômero ou derivado deste. A dita atividade pode ser inibida in vitro, por e- xemplo. Por exemplo, o anticorpo da invenção ou a fração de ligação de antigeno pode ser adicionado a uma preparação tal como uma amostra derivada de um sujeito ou uma cultu- ra de célula que contém ou é suspeito de conter o dito globulômero ou derivado deste, a fim de inibir a atividade do dito globulômero ou derivado deste na dita amostra. Al- ternativamente, a atividade do globulômero ou derivado des- te pode ser inibida em um indiduo in vivo.

Assim a presente invenção diz respeito adicional- mente ao uso de um anticorpo ou uma fração de ligação de antigeno da maneira definida anteriormente para preparar uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir um a- miloidose, em particular uma amiloidose selecionada do grupo que consiste em doença de Alzheimer e a amiloidose de sindrome de Down. Um aspecto do dito uso da invenção é então um método de tratar ou prevenir uma amiloidose, em particular doença de Alzheimer ou a amiloidose de sindrome de Down, em um sujeito que necessita destes, que compreen- de administrar um anticorpo ou uma fração de ligação de antigeno da maneira definida anteriormente ao sujeito. U- sar o dito anticorpo ou fração de ligação de antigeno para tratar e especialmente prevenir a amiloidose, em particu- lar doença de Alzheimer ou a amiloidose de sindrome de Down, é em particular para imunização passiva. Consequen- temente, no método de tratar ou prevenir uma amiloidose, em particular doença de Alzheimer ou a amiloidose de sin- drome de Down, em um sujeito que necessita destes um pro- pósito de administrar o anticorpo ou fração de ligação de antigeno ao sujeito é imunizar passivamente o sujeito con- tra a amiloidose, em particular doença de Alzheimer ou a amiloidose de sindrome de Down.

O anticorpo da invenção ou a fração de ligação de antigeno da maneira definida anteriormente é preferivel- mente capaz de detectar, tanto in vitro quanto in vivo, um Αβ globulômero Αβ ou derivado deste ao qual ele se liga. O dito anticorpo ou a fração de ligação de antigeno pode en- tão ser usado para detectar o dito globulômero ou derivado deste, por exemplo, em uma preparação contendo o dito glo- bulômero ou derivado deste ou em indivíduos humanos ou ou- tros mamíferos nos quais o dito globulômero ou derivados destes está presente.

De acordo com uma modalidade, a invenção diz res- peito a um método de detectar o dito globulômero ou deri- vado deste, cujo método compreende um anticorpo da invenção ou uma fração de ligação de antigeno destes agir natural- mente em um globulômero ou derivado deste de maneira a se ligar ao dito globulômero ou derivado deste (e dessa ma- neira preferivelmente formar um complexo compreendendo o anticorpo ou fração de ligação de antigeno destes e o glo- bulômero ou derivado deste). O dito globulômero pode ser detectado in vitro, por exemplo. Por exemplo, o anticorpo da invenção ou a fração de ligação de antigeno pode ser adicionado a uma preparação, por exemplo, uma amostra de- rivada de um sujeito ou uma cultura de célula que contém ou é suspeita de conter o dito globulômero ou derivado deste, a fim de detectar o dito globulômero ou derivado deste na dita preparação. Alternativamente, o globulômero ou derivado deste pode ser detectado em um indivíduo in vivo.

Assim a presente invenção diz respeito adicional- mente ao uso de um anticorpo ou uma fração de ligação de antigeno da maneira definida anteriormente para preparar uma composição para diagnosticar uma amiloidose, em parti- cular doença de Alzheimer ou a amiloidose de sindrome de Down. Um aspecto do dito uso da invenção é um método de diagnosticar uma amiloidose, em particular doença de Al- zheimer ou a amiloidose de sindrome de Down, em um sujeito suspeito de ter a amiloidose, em particular doença de Al- zheimer ou a amiloidose de sindrome de Down, que compreen- de administrar ao sujeito um anticorpo ou uma fração de ligação de antigeno da maneira definida anteriormente e detectar a formação de um complexo compreendendo o anti- corpo ou a fração de ligação de antigeno com o antigeno, a presença do complexo indicando a amiloidose, em particu- lar doença de Alzheimer ou a amiloidose de sindrome de Down, no sujeito. Um segundo aspecto do dito uso da inven- ção é um método de diagnosticar uma amiloidose, em parti- cular doença de Alzheimer ou a amiloidose de sindrome de Down, em um sujeito suspeito de ter a amiloidose, em par- ticular doença de Alzheimer ou a amiloidose de sindrome de Down, que compreende fornecer uma amostra do sujeito, fazer contato com a amostra com um anticorpo ou uma fração de ligação de antigeno da maneira definida anteriormente e detectar a formação de um complexo compreendendo o anti- corpo ou a fração de ligação de antigeno com o antigeno, a presença do complexo indicando a amiloidose, em particular doença de Alzheimer ou a amiloidose de sindrome de Down, no sujeito.

Descrição detalhada da invenção

As afinidades de ligação dos anticorpos da inven- ção podem ser avaliadas usando imunoensaios in vitro pa- dronizados tais como análises ELISA, dot blot ou BlAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) . Para descrições adicionais, ver Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

De acordo com uma modalidade particular, as afi- nidades definidas aqui referem-se aos valores obtidos re- alizando um dot blot da maneira descrita no exemplo 8 e avaliando-o por densitometria. De acordo com uma modalida- de particular da invenção, determinar a afinidade de li- gação por dot blot compreende o seguinte: um certa quanti- dade do antigeno (por exemplo, o globulômero Αβ(X-Y), mo- nômero Αβ(X-Y) ou fibrilas Αβ(X-Y), da maneira definida anteriormente) ou, apropriadamente, uma diluição apropria- da destes, por exemplo, em NaH2PO4i 20 mM de NaCl 140 mM, pH 7,4, 0,2 mg/mL BSA em uma concentração de antigeno de, por exempl o, 100 pmol/]jL, 10 pmol/pL, 1 pmol/jjL, 0, 1 pmol/pL e 0,01 ρπιοΐ/μΐϋ, é analisada em dot blot em uma membrana de nitrocelulose, a membrana é em seguida bloque- ada com leite para impedir ligação não especifica e lava- da, em seguida colocada em contato com o anticorpo de in- teresse seguido por detecção do último por meio de um an- ticorpo secundário conjugado com enzima e um reação colo- rimétrica; em concentrações de anticorpo definidas, a quantidade do anticorpo ligado permite determinação de a- finidade. Assim a afinidade relativa de dois diferentes anticorpos com um alvo, ou de um anticorpo com dois dife- rentes alvos, é aqui definida como a relação das quanti- dades respectivas de anticorpo ligado ao alvo observado com as duas combinações alvo do anticorpo de outra forma em condições idênticas de dot blot. A menos que uma abor- dagem similar baseada no Western blotting, a abordagem dot blot determinará uma afinidade do anticorpo com um da- do alvo na conformação natural do último; a menos que a abordagem ELISA, a abordagem dot blot não sofra das dife- renças nas afinidades entre alvos e a matriz diferente, permitindo dessa maneira comparações mais precisas entre alvos diferentes.

O termo "Kd", da maneira aqui usada, é para refe- rir-se a dissociação constante de uma interação anticorpo- 20 antigeno particular como é conhecido na tecnologia.

Os anticorpos da presente invenção são preferi- velmente anticorpos isolados. Um "anticorpo isolado signi- fica um anticorpo tendo as afinidades de ligação da manei- ra descrita anteriormente e que é essencialmente livre de outros anticorpos tendo afinidades de ligação diferentes. 0 termo "essencialmente livre" refere-se aqui a um preparação do anticorpo em que pelo menos 95 % dos anticorpos, prefe- rivelmente pelo menos 98 % dos anticorpos e mais preferi- velmente pelo menos 99% dos anticorpos têm a afinidade de ligação desejada. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outros material celular e/ou substâncias químicas.

Os anticorpos isolados da presente invenção in- cluem anticorpos monoclonais. Um "anticorpo monoclonal" da maneira aqui usada é para referir-se a uma preparação das moléculas do anticorpo, anticorpos que compartilham uma se- qüência de aminoácidos de cadeia pesada comum e cadeia le- ve comum, ao contrário de preparações de anticorpo "poli- clonal" que contém uma mistura de anticorpos de diferente seqüência de aminoácido. Anticorpos monoclonais podem ser gerados por diversas tecnologias inéditas tipo fago, bac- téria, levedura ou ribossomal display, bem como por méto- dos clássicos exemplificados por anticorpos derivados de hibridoma (por exemplo, um anticorpo secretado por um hi- bridoma preparado por tecnologia de hibridoma, tais como o standard Kohler and Milstein hibridoma metodology ((1975) Nature 256:495-497). Assim, um anticorpo derivado não hi- bridoma com seqüência uniforme é ainda referido aqui como um anticorpo monoclonal embora ele possa ser obtido por metodologias não clássicas, e o termo "monoclonal" não es- teja restrito a anticorpos derivados de hibridoma, mas u- sado para referir-se a todos os anticorpos derivado de um clone de ácido nucléico.

Assim, os anticorpos monoclonais da presente in- venção incluem anticorpos recombinantes. 0 termo "recombi- nante" refere-se aqui a qualquer combinação artificial de dois segmentos de outra forma separados de seqüência, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmen- tos isolados de ácidos nucléicos por técnicas de engenharia genética. Em particular, o termo "anticorpo recombinante" refere-se aos anticorpos que são produzidos, expressos, gerados ou isolados por meios recombinante, tais cornos an- ticorpos que são expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira; anti- corpos isolados de uma biblioteca de anticorpo combinató- rio recombinante; anticorpos isolados a partir de um ani- mal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico por causa de genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor, I.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295); ou anticorpos que são produzido, expressos, gerados ou i- solados de qualquer outra meneira na qual seqüências de gene de imunoglobulina particular (tais como seqüências de gene de imunoglobulina humano) são montadas com outras se- qüências de DNA. Anticorpos recombinantes incluem, por e- xemplo, quiméricos, enxerto de CDR e anticorpo humaniza- dos. Versados na tecnologia saberão que expressão de um anticorpo monoclonal derivado de hibridoma convencional em um sistema heterólogo exigirá a geração de um anticorpo recombinante mesmo se a seqüência de aminoácidos do prote- ína do anticorpo resultante não for trocada ou prentendi- do a ser trocada.

Em uma modalidade particular da invenção, o an- ticorpo é um anticorpo humanizado.

De acordo com uma multiplicidade de modalidades, o anticorpo pode compreender uma seqüência de amxnoacidos derivado inteiramente de uma espécie única, tais como um anticorpo humano ou um anticorpo de camundongo.

De acordo com outros modalidades, o anticorpo pode ser um quiméricos anticorpo ou um enxerto de CDR an- ticorpo ou another forma de um anticorpo humanizado.

O termo "anticorpo" é para referir-se a moléculas de imunoglobulina consistindo em 4 cadeias de polipeptí- deo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (1). As cadeias são geralmente ligadas umas com as outras por meio de ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta de uma região variável da dita cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante da dita ca- deia pesada. A região constante de cadeia pesada consiste em três domínios CHI, CH2 e CH3. Cada ,.cadeia leve é com- posta de uma região variável da dita cadeia leve (abrevia- da aqui como LCVR ou VL) e uma região constante da dita cadeia leve. A região constante de cadeia leve consiste em um domínio CL. As regiões VH e VL podem ser adicional- mente divididas em regiões hipervariáveis referidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e entre- meadas com regiões conservadas referidas como regiões es- trutura (FR) . Cada região VH e VL consiste assim em três CDRs e quatro FRs que são arranjadas a partir do N término para o C término na seguinte ordem: FRl, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Esta estrutura é bem conhecida pelos ver- sados na tecnologia.

O termo "fração de ligação de antígeno" de um an- ticorpo (ou simplesmente "fração de anticorpo") refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo da invenção, o(s) dito(s) fragmento (s) tendo ainda as afinidades de ligação da maneira definida anteriormente. Fragmentos de um anti- corpo completo mostraram ser capaz de realizar o função de ligação de antigeno de um anticorpo. De acordo com o termo "fração de ligação de antigeno" de um anticorpo, fragmen- tos de exemplos de ligação incluem (i) um fragmento Fab, isto é, um fragmento monovalente composto dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, isto é, um frag- mento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados uns com os outros na região de dobradiça por meio de uma ligação de dissulfeto; (iii) um fragmento Fd composto dos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv composto dos do- mínios FL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et at. , (1989) Nature 341:544-546) consistindo em um domínio VH ou de VH, CH1 , CH2, DH3, ou VH, CH2, CH3; e (vi) uma região determinante de complemen- taridade isolada (CDR) . Embora os dois domínios do frag- mento Fv, denominado VL e VH, são codificado por genes separados, eles podem adicionalmente ser ligados uns com os outros usando um ligante sintético, por exemplo, uma seqüência poli-G4S de aminoácido, e métodos recombinantes, tornado possível prepará-los como um cadeia de proteína única em que as regiões VL e VH combinem a fim de formar moléculas monovalentes (conhecidas com a cadeia Fv única (ScFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl.' Acad. Sei. USA 85:5879-5883). O termo "fração de ligação de antígeno" de um anticorpo é também para compreender tais anticorpos de cadeia única. Outras formas de anticorpos de cadeia única tais como "diacorpos" são de outra forma aqui incluídos. Di- acorpos são anticorpos biespecificos bivalente, em que domí- nios VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo úni- ca, mas usando um ligante que é muito curto para os dois do- mínios sendo capazes de combinar na mesma cadeia, forçando dessa maneira os ditos domínios a unir com domínios comple- mentares de uma cadeia diferente e a formar dois sítios de ligação de antígeno (ver, por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Estrutura 2:1121-1123). Um domínio constante de imunoglobulina refere-se a um domínio constante de cadeia pesada ou leve. Seqüência de aminoácídos de domí- nio constante cadeia pesada IgG e cadeia leve humano são co- nhecidos na tecnologia e são representados na Tabela 1.

Tabela 1: Seqüência de domínio constante de cadeia pesada IgG humano e domínio constante de cadeia leve.

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Além disso, um anticorpo da presente invenção ou fração de ligação de antigeno destes pode ser parte de um molécula de imunoadesão grande formada por associação cova- lente ou não covalente do dito anticorpo ou fração de anti- corpo com um ou mais proteínas ou peptídeos adicionais. O uso de tais moléculas de imunoadesão é relevante a da re- gião do núcleo de es treptavidina a fim de preparar uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., at al. (1995) human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e o uso de um sinalizador do resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e um poliistidinila C-terminal, por exemplo, hexaistidinila, a fim de produzir molécula scFvs bivalentes e biotinila- das (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058) .

O termo "anticorpo humano' refere-se aos anti- corpos cujas regiões variáveis e constantes correspondem ou são derivados de seqüências de imunoglobulina da linha germinal humano, da maneira descrita, por exemplo, por Ka- bat et al. (ver Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicação No. 91- 3242). Portanto, os anticorpos humanos da invenção podem conter resíduos de aminoácido não codificados pelas se- qüências de imunoglobulina da linha germinal humano (por exemplo, mutações que foram introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, no CDRs, e em particular no CDR3. Anticorpos recombinantes humanos da invenção têm regiões variáveis e podem também conter regiões constantes derivadas das seqüências de imunoglobulina da linha germi- nal humano (ver Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicação No. 91-3242) : De acordo com modalidades particulares, portanto, tais anticorpos recombinantes humanos são sub- metidos a mutagênese in vitro (ou a um mutagênese somáti- ca in vivo, se for usado um animal que é transgênico por causa de seqüências Ig humanas) de maneira que a seqüência de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombi- nantes são seqüências que embora relacionadas ou derivadas de seqüências VH e VL da linha germinal humano, não exis- tem naturalmente in vivo no repertório da linha germinal do anticorpo humano. De acordo com modalidades particula- res, anticorpos recombinantes desta espécie são o resulta- do de mutagênese seletiva ou retro mutação ou de ambos. Preferivelmente, mutagênese leva a uma afinidade com o al- vo que é maior, e/ou uma afinidade com estruturas não alvo que é menor que do anticorpo pai.

O termo "anticorpo quimérico" refere-se aos an- ticorpos que contêm seqüências para a região variável das cadeias pesadas e leves de uma espécie e seqüências de re- gião constante de uma outra espécie, tais como anticorpos tendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve murina ligadas as regiões constantes humanas.

O termo "anticorpo enxertado CDR" refere-se aos anticorpos que compreendem seqüências de região variável de cadeia pesada e leve de uma espécie, mas em que as se- qüências de um ou mais das regiões CDR de VH e/ou VL são substituídas com seqüências CDR de uma outra espécie, tais como anticorpos tendo regiões variáveis de cadeia pe- sada e leve murina em que um ou mais dos CDRs murina (por exemplo, CDR3) foi substituído com seqüências CDR humano.

O termo "anticorpo humanizado" refere-se aos an- ticorpos que contêm seqüências da região variável de ca- deias pesadas e leves de um espécie não humana (por exem- plo, camundongo, rato, coelho, galinha, camalideos, car- neiro ou cabra), mas em que pelo menos uma parte da se- qüência VH e/ou VL foi alterada a fim de ser mais "similar a humano", isto é, a ser mais similar as seqüências vari- áveis da linha germinal humano. Um tipo de um anticorpo humanizado é um enxerto de anticorpo CDR em que seqüências CDR humano foram inseridas em seqüências VH e VL não hu- mano para substituir as seqüências CDR não humano corres- pondentes.

Os termos "numeração Kabat", "definições Kabat" e "marcação Kabat" são usados indiferentemente aqui. Estes termos, que são reconhecidos na tecnologia, referem-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácido que são mais variáveis (isto é, hipervariáveis) que outros resí- duos de aminoácido nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo, ou uma porção de ligação de antí- geno destes (Kabat et al. (1971) Ann. NYAcad, Sei. 190:382- 391 and Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicação No. 91-3242). Para a região variável de cadeia pesada, as faixas variá- veis da hiper-região das posições do aminoácido 31 a 35 para CDR1, posições do aminoácido 50 a 65 para CDR2, e po- sições do aminoácido 95 a 102 para CDR3. Para a região variável de cadeia leve, as faixas variáveis da hiper- região das posições do aminoácido 24 to 34 para CDR1, po- sições do aminoácido 50 a 56 para CDR2, e posições do ami- noácido 89 a 97 para CDR3.

Da maneira aqui usada, os termos "aceptor" e "an- ticorpo do aceptor" referem-se ao anticorpo ou seqüência de ácido nucléico fornecer ou codificar pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou 100 % da seqüência de aminoácidos de um ou mais da regiões da estrutura. Em algumas modalidades, o termo "aceptor" refere-se à seqüência de aminoácidos do anticorpo ou ácido nucléico fornecer ou codificar a(s) re- gião (s) constante (s) . Ainda em uma outra modalidade, o termo "aceptor" refere-se à seqüência de aminoácidos do anticorpo ou ácido nucléico fornecer ou codificar um ou mais da regiões da estrutura e da(s) região(s) constan- te (s) . Em uma modalidade especifica, o termo "aceptor" re- fere-se a um seqüência de aminoácido do anticorpo humano ou de ácido nucléico que fornece ou codifica pelo menos 80 %, preferivelmente, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % da seqüência de ami- noácidos de um ou mais da regiões da estrutura. De acordo com esta modalidade, um aceptor podem conter pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 10 resíduos de aminoácido não ocorrendo em uma ou mais posições específicas de um anticorpo humano. Uma região da estrutura do aceptor e/ou região(s) constan- te (s) do aceptor pode ser, por exemplo, derivada ou obti- da de um gene da linha germinal do anticorpo, um gene do anticorpo maduro, um anticorpo funcional (por exemplo, an- ticorpos bem conhecidos na tecnologia, anticorpos em de- senvolvimento, ou anticorpos comercialmente disponíveis).

Da maneira aqui usada, o termo "CDR" refere-se a o região determinante de complementaridade nas seqüências variáveis do anticorpo. Existem três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que são designados CDRl, CDR2 e CDR3, para cada uma das regi- ões variáveis. O termo "conjunto CDR" da maneira aqui usa- da refere-se aqui a um grupo de três CDRs que ocorrem em um região variável única capaz de ligar o antígeno. Os li- mites exatos destes CDRs foram definidos de forma diferen- te de acordo com sistemas diferentes. 0 sistema descrito por Kabat (Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immu- nological Interest (National Institutes of Health, Be- thesda, Md. (1987) and (1991)) não fornece apenas um sis- tema de numeração de resíduo não ambíguo aplicável a qual- quer região variável de um anticorpo, mas também fornece limites de resíduo precisos definindo os três, CDRs. Estes CDRs podem ser referidos como CDRs Kabat. Chothia e equi- pe (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) and Chothia et al. , Nature 342:877-883 (1989)) observaram que certas sub porções nos CDRs Kabat adotam conformações da espinha dorsal de peptídeo praticamente idêntico, a des- peito da grande diversidade no nível de seqüência de ami- noácido. Estas sub porções foram designadas como LI, L2 e L3 ou Hl, H2 e H3 onde o "1" e o "H"designam as regiões de cadeia leve e as de cadeias pesadas, respectivamente. Es- tas regiões podem ser referidas como CDRs Chothia, que têm limites que se sobrepõem com CDRs Kabat. Outros limites definindo CDRs sobrepondo-se com os CDRs Kabat foram des- critos por Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) and MacCal- lum (J Mol Biel 262 ( 5):732-45 (1996)). Ainda outras defi- nições de limite de CDR podem não seguir rigorosamente um dos sistemas anteriores, mas no entanto não se sobreporão com os CDRs Kabat, embora eles possam ser reduzidos ou au- mentados sob a luz da previsão ou observações experimen- tais que resíduos particulares ou grupos de resíduos ou mesmo todos os CDRs não afetam significativamente a Iiga- ção de antígeno. 0 métodos aqui usado pode utilizar CDRs definidos de acordo com qualquer desses sistemas, embora modalidades preferidas usem Kabat ou CDRs definidos por Chothia.

Da maneira aqui usada, o termo resíduo "canôni- co" refere-se a um resíduo em um CDR ou estrutura que de- fine uma estrutura de CDR canônica particular da maneira definida por Chothia et al. (J. Mel. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992), am- bos são incorporados aqui pela referência). De acordo com Chothia et al., porções críticas dos CDRs de muitos anti- corpos têm conformações da espinha dorsal de peptídeo pra- ticamente idêntico, a despeito da grande diversidade no nível de seqüência de aminoácido. Cada estrutura canônica especifica primeiramente um conjunto de ângulos de torção da espinha dorsal do peptideo para um segmento continuo de resíduos de aminoácido formando um laço.

Da maneira aqui usada, os termos "doador" e "an- ticorpo de doador" referem-se a um anticorpo fornecendo um ou mais CDRs. Em uma modalidade preferida, o anticorpo de doador é um anticorpo a partir de uma espécie diferente do anticorpo do qual as regiões da estrutura são obtidas ou derivadas. No contexto de um anticorpo humanizado, o termo "anticorpo de doador" refere-se a um anticorpo não humano fornecendo um ou mais CDRs.

Da maneira aqui usada, o termo "estrutura" ou "seqüência de estrutura" refere-se as seqüências remanes- centes de uma região variável menos o CDRs. Em virtude da definição exata de uma seqüência de CDR poder ser determi- nada usando sistemas diferentes, o significado de uma se- qüência de estrutura é submetido a interpretações corres- pondentemente diferentes. O seis CDRs (CDR-L1, -L2, e -L3 de cadeia leve e CDR-H1, -H2, e -H3 de cadeia pesada) tam- bém divide regiões da estrutura na cadeia leve e na ca- deia pesada em quatro sub-regiões (FR1, FR2, FR3 e FR4) na cada cadeia, em que CDRl é posicionado entre FRl e FR2, CDR2 entre FR2 e FR3, e CDR3 entre FR3 e FR4 . Sem especificar as sub-regiões particulares como FRl, FR2, FR3 ou FR4, uma região da estrutura, da maneira referida por outros, representa o FR' s combinado na região variá- vel de um única cadeia de imunoglobulina de ocorrência natural. Da maneira aqui usada, um FR representa uma das quatro subregiões, e FRs representa duas ou mais das qua- tro subregiões constituindo uma região da estrutura.

Seqüências de aceptor de cadeia pesada e cadeia leve humanas são conhecidas na tecnologia.

Da maneira aqui usada, o termo "gene da linha germinal do anticorpo" ou "fragmento do gene" refere-se a um seqüência de imunoglobulina codificada por células não linfóides que não foi submetido ao processo de maturação que leva a ré arranjo e mutação genética para expressão de uma imunoglobulina particular. (Ver, por exemplo, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marcha- lonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). Uma das vantagens fornecidas por várias modalidades da pre- sente invenção decorre da observação de que genes de an- ticorpos da linhas germinal mais provavelmente conservam característica de estruturas da seqüência de aminoácidos essencial de indivíduos na espécie do que genes de anti- corpo maduro, consequentemente menos provavelmente são re- conhecido como não próprio quando usado nestas espécies.

Da maneira aqui usada, o termo resíduos "chave" refere-se a certos resíduos na região variável que têm mais impacto no especificidade de ligação e/ou afinidade de um anticorpo, em particular um anticorpo humanizado. Um resíduo chave inclui, mas sem limitações, um ou mais dos seguintes: um resíduo que é adjacente a um CDR, um sítio de glicosilação potencial (que pode ser tanto sítio de glicosilação N- quanto 0-), um resíduo raro, um resíduo capaz de interagir com o antígeno, um resíduo capaz de in- teragir com um CDR, um resíduo canônico, um resíduo de contato entre região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve, um resíduo na zona Vernier, e um resíduo na região que sobrepõe entre a definição Chothia de um CDRl de cadeia pesada variável e a definição Kabat da primeira estrutura de cadeia pesada.

Da maneira aqui usada, o termo "anticorpo huma- nizado" especificamente refere-se a um anticorpo ou um variante, derivado, análogo ou fragmento destes que imuno especificamente se liga a um antígeno de interesse e que compreende uma região de estrutura (FR) tendo substancial- mente a seqüência de aminoácidos deum anticorpo humano e uma região determinante complementar (CDR) tendo substan- cialmente a seqüência de aminoácidos de um anticorpo não humano. Da maneira aqui usada, o termo "substancialmente" no contexto de um CDR refere-se a um CDR tendo uma se- qüência de aminoácidos pelo menos 80 %, preferivelmente pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % idêntico à seqüência de ami- noácidos de um anticorpo CDR não humano. Um anticorpo hu- manizado compreende substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) em que todos ou substancialmente todos das regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo de doador) e todos ou subs- tancialmente todos das regiões da estrutura são aqueles de uma seqüência de consenso de imunoglobulina humana. Prefe- rivelmente, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Em algu- mas modalidades, um anticorpo humanizado contém tanto a cadeia leve bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. 0 anticorpo também pode incluir as regiões CH1, dobradiça, CH2, CH3, e CH4 da cadeia pesada. Em algu- mas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas um cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anti- corpo humanizado contém apenas um cadeia pesada humaniza- da. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio variável humanizado de uma ca- deia leve e/ou cadeia pesada humanizada.

O anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer subclasse, incluindo sem limi- tação, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

A estrutura e regiões CDR de um anticorpo huma- nizado não necessita corresponder precisamente às seqüên- cias parentais, por exemplo, o anticorpo de doador CDR ou o estrutura de consenso pode ser mutagenizada por substi- tuição, inserção e/ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido de maneira que o CDR ou resíduo de estrutura cujo sítio não corresponde exatamente tanto ao anticorpo de doador quanto a estrutura de consenso. Em uma modalida- de preferida, tais mutações, portanto, não serão extensi- vo. Geralmente, pelo menos 80 %, preferivelmente pelo me- nos 85 %, mais pref erivelmente pelo menos 90 %, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % dos resíduos do anti- corpo humanizado corresponderão àqueles das seqüências pa- rentais FR e CDR. Da maneira aqui usada, o termo "estru- tura de consenso" refere-se à região da estrutura no se- qüência de consenso de imunoglobulina. Da maneira aqui usada, o termo "seqüência de consenso de imunoglobulina" refere-se à seqüência formada dos aminoácidos que ocorrem mais freqüentemente (ou nucleotideos) em uma família de seqüências de imunoglobulina relacionadas (ver por exem- plo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987) . Em uma família de imunoglobuli- nas, cada posição na seqüência de consenso é ocupada pelo aminoácido que ocorrem mais freqüentemente nesta posição na família. Onde dois. aminoácidos ocorrem de maneira igual freqüentemente, ambos podem ser incluídos na seqüência de consenso.

Da maneira aqui usada, zona "Vernier" refere-se a um subconjunto de resíduo de estruturas que pode ajustar estrutura de CDR e fazer o ajuste fino no encaixe do antí- geno da maneira descrita por Foote and Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, que está incorporada aqui pela re- ferência) . Resíduos da zona Vernier formam uma camada sub- jacente dos CDRs e podem interferir na estrutura de CDRs e na afinidade do anticorpo.

O termo "epítopo" inclui qualquer polipeptídeo determinante capazes de especificar ligação com uma imuno- globulina. Em certas modalidades, determinantes epítopo incluem agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais açúcar, fosforila, ou sulfonila, e, em certas modalidades, pode ter características estruturais tri dimensionais específi- cas, e/ou características de carga específicas. Um epíto- po é uma região de um antígeno que é ligada por um anti- corpo. Em certas modalidades, acredita-se que um anticor- po se liga especificamente a um antígeno quando ele pre- ferencialmente reconhece seu antígeno visado em um mistu- ra complexa de proteínas e/ou macromoléculas.

0 termo "polinucleotídeo" da maneira referida aqui significa forma polimérica de dois ou mais nucleotí- deos, tanto ribonucleotídeos quanto deoxinucleotídeos ou um forma modificado de qualquer tipo de nucleotídeo. 0 termo inclui formas de fita simples e dupla de DNA, mas preferivelmente é DNA de fita dupla.

0 termo "polinucleotídeo isolado", da maneira a- qui usada deve significar um polinucleotídeo (por exem- plo, de origem genômico, cDNA, ou sintético, ou qualquer combinação destes) que, em virtude de sua origem, o "poli- nucleotídeo isolado" não é associado com todos ou uma por- ção de um polinucleotídeo com o qual o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza; é operacionalmente li- gado a um polinucleotídeo ao qual ele não é ligado na na- tureza; ou não ocorre na natureza como parte de uma se- qüência grande .

0 termo "vetor", da maneira aqui usada, é para referir-se a um molécula de ácido nucléico capaz de transportar um outro ácido nucléico ao qual ele foi liga- do. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a um DNA de fita dupla circular em cujo segmentos de DNA adi- cional pode ser ligado. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser liga- do no genoma viral. Certos vetores são capazes de repli- cação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo um origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero e- pissomal). Outros vetores (por exemplo, vetores não epis- somais de mamífero) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedei- ra, e dessa maneira são replicados junto com o genoma hos- pedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dire- cionar a expressão de genes ao qual elas são operativa- mente ligadas. Tais vetores são referidos aqui como "ve- tor de expressão recombinantes"(ou simplesmente, "vetores de expressão"). De um modo geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantes são freqüente- mente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" pode ser usado indiferentemente como o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. Por- tanto, a invenção é para incluir outras formas de vetores de expressão como essas, tais como vetores virais (por e- xemplo, replicação de retrovírus defeituosos, adenovírus e vírus associado com adeno), que serve funções equivalen- tes.

O termo "ligado operacionalmente" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em um relacionamento que os permite funcionar em sua maneira vi- sada. Uma seqüência de controle "ligado operacionalmente" a uma seqüência de codificação é conectada de uma maneira tal que expressão da seqüência de codificação é obtida em condições compatíveis com as seqüências de controle. Se- qüências "ligado operacionalmente" incluem tanto seqüên- cias de controle de expressão que são contínuos com o ge- ne de interesse quanto seqüências de controle de expressão que agem in trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse. O termo "seqüência de controle de expres- são" da maneira aqui usada refere-se aqui a seqüências de polinucleotídeo que são necessárias realizar a expressão e processamento de seqüências de codificação ao qual elas são ligadas. Seqüências de controle de expressão incluem seqüências de iniciação de transcrição, terminação, promo- tora e raelhoradora apropriadas; sinais processamento de RNA eficientes tais como sinais de junção e poliadenila- ção; seqüências que estabilizam mRNA citoplásmico; se- qüências que melhoram eficiência de translação (isto é, seqüência de consenso Kozak); seqüências que melhoram a estabilidade da proteína; e quando desejado, seqüências que melhoram a secreção da proteína. A natureza de tais seqüências de controle difere dependendo do organismo hos- pedeiro; em procariotes, tais seqüências de controle de um modo geral incluem seqüência promotora, sítio de ligação ribossomal, e terminação de transcrição; em eucariotes, de um modo geral, tais seqüências de controle incluem se- qüência promotora e terminação de transcrição. 0 termo "seqüências de controle" é para incluir componentes cuja presença é essencial para expressão e processamento, e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências lider e seqüências parceiras de fusão.

"Transformação", da maneira aqui definida, refe- re-se a qualquer processo pelo qual DNA exógeno entra em uma célula hospedeira. Transformação pode ocorrer em con- dições naturais ou artificiais usando vários métodos bem conhecidos na tecnologia. Transformação pode basear-se em qualquer método conhecido para inserção de seqüência de ácido nucléicos estranha em uma célula hospedeira procari- ótica ou eucariótica. O método é selecionado baseado na célula hospedeira sendo transformada e pode incluir, mas sem limitações, infecções virais, eletroporação, lipofec- ção, e bombardeamento de partícula. Tais células "trans- formadas" incluem células estavelmente transformadas em que o DNA inserido é capaz tanto de replicação como um plasmídeo que replica autonomamente quanto como parte do cromossosmo hospedeiro. Eles também incluem células que expressam temporariamente o DNA ou RNA inserido por perí- odos de tempo limitado.

O termo "célula hospedeira recombinante" (ou sim- plesmente "célula hospedeira"), da maneira aqui usada, é para referir-se a uma célula em que o DNA exógeno foi in- troduzido. deve-se entender que tais termos são para refe- rir-se não apenas à célula em questão particular, mas, também a progênie de uma célula como esta. Em virtude de certas modificações poder ocorrer em gerações sucessivas por causa tanto da mutação quanto influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntico à célula pai,mas são ainda incluídos no escopo do termo "célula hospedeira" da maneira aqui usada. Preferivelmente células hospedeiras incluem células procariótica e eucarióticas selecionadas de qualquer dos reinos de vida. Células eu- carióticas preferidas incluem protiste, fúngicas, planta e células animais. Ainda mais preferivelmente células hospe- deiras incluem, mas sem limitações, E.coli de linha celu- lar procariótica; linhas celulares mamíferas CHO, HEK 293 e COS; a linha celular de inseto Sf9; e a célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.

Técnicas padrões podem ser usadas para DNA r.ecom- binante, síntese de oligonucleotídeo, e cultura e trans- formação de tecido (por exemplo, eletroporação, lipofec- ção) . Técnicas de reações e purificação enzimáticas podem ser realizadas de acordo com especificações do fabricante ou como geralmente realizada na tecnologia ou da maneira aqui descrita. As técnicas e procedimentos anteriores po- dem ser de um modo geral realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na tecnologia e da maneira descrita em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas por toda a presente especifi- cação. Ver por exemplo, Sambrook et al. , Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor La- boratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que está incorporado aqui pela referência com qualquer propósito.

"Organismo transgênico", como conhecido na tecno- logia e da maneira aqui usada, refere-se a um organismo tendo células que contêm um transgene, em que o transgene introduzido no organismo (ou um ancestor do organismo) ex- pressa um polipeptideo não naturalmente expresso no orga- nismo. Um "transgene" é uma construção de DNA, que é está- vel e operacionalmente integrado no genoma de uma célula da qual um organismo transgênico desenvolve, direcionando a expressão de um produto do gene codificado em um ou mais tipos de célula ou tecidos do organismo transgênico.

Métodos de produzir anticorpos da invenção são descritos a seguir. Uma distinção é feita aqui entre abor- dagens in vivo, abordagens in vitro ou uma combinação de ambas.

Alguns métodos de produzir anticorpos da invenção são descritos a seguir. Uma distinção é feita aqui entre in abordagens vivo, abordagens in vitro ou uma combinação de ambas.

Abordagens in vivo

Dependendo do tipo do anticorpo desejado, vários animais hospedeiros podem ser usados para imunização in vivo. Um hospedeiro expressando por si próprio uma versão endógena do antigeno de interesse pode ser usado. Alterna- tivamente, é possível usar um hospedeiro que tornou-se deficiente em um versão endógena do antigeno de interesse. Por exemplo, camundongos que tornou-se deficiente em uma proteína endógena particular por meio de recombinação ho- móloga no gene endógeno correspondente (isto é, camundon- gos knockout) foram mostraram gerar uma resposta humoral à proteína com a qual eles foram imunizados e então ser ca- paz de ser usado para produção de anticorpos monoclonais de alta afinidade com a proteína (ver, por exemplo, Roes, J. et al. (1995) J. Immunol. Methods 183:231-237; Lunn, M.P. et al. (2.000) J. Neurochem. 75:404-412).

Uma multiplicidade de mamíferos não humano são hospedeiros adequados para produção de anticorpo a fim de produzir anticorpos não humanos da invenção. Eles incluem camundongos, ratos, galinhas, camelídeos, coelhos, car- neiro e cabras (e versões knockout destes), embora seja dada preferência a camundongos para a produção de hibrido- mas. Além disso, um hospedeiro animal não humano expres- sando um repertório de anticorpo humano pode ser usado pa- ra produzir anticorpos essencialmente humanos com um antí- geno humano com dupla especificidade. Animais não humano desta espécie incluem animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que produzem transgenes de imunoglobulina humana (camundongos quiméricos hu-PBMC SCID) e quimeras de irradiação humano/camundongo que são descritas com mais detalhes a seguir. De acordo com uma modalidade, o animal imunizado com globulômero Αβ(20-42) ou derivado deste é um mamífero não humano, preferivelmente um camundongo, que é transgê- nico por causa de genes de imunoglobulina humana de manei- ra que o dito mamífero não humano produz anticorpos huma- nos mediante estímulo antigênico. Tipicamente, transgenes de imunoglobulina para cadeias pesadas e leves com confi- guração da linha germinal humana são introduzidos em tais animais que foram alterados de maneira tal que seu Ioci de cadeia pesada e leve endógena seja inativa. Se tais a- nimais são estimulados com antigeno (por exemplo, com um antigeno humano), anticorpos derivados das seqüências de imunoglobulina humana (anticorpos humanos) são produzidos. É possível preparar a partir dos linfócitos de tais ani- mais, anticorpos monoclonais humanos por meio de tecnolo- gia de hibridoma padronizada, para uma descrição adicional de camundongos transgênicos com imunoglobulina humanas e seu uso na produção de anticorpos humanos, ver, por exem- plo, US 5.939.598, WO 96/33735, WO 96134096, WO 98/24893 e WO 99/53049 (Abgenix Inc.), e US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, US 5.770.429, US 5.814.318, US 5.877.397 e WO 99/45962 (Gen- pharm Inc.); ver também MacQuitty, J.J. And Kay, R.M. (1992) Science 257:1188; Taylor,l.D. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 2 0:6287-6295; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368:856-859; Lonberg, N. And Huszar, D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding, F. A. And Lon-berg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sei. 764:536-546; Fishwild, D. M. et al. (1996) Nature Biothecnology 14:845-851; Mendez, M. J. et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Green, 1.1. And Ja- kobovits, A. (1998) J. Exp. Med. 188:483-495; Green, 1.1. (1999) J. Immunol. Methods20231:11-23; Yang, X.D. et al. (1999) J. Leukoe. Biol. 66:401-410; Gallo, M.l. et al. (2.000) Eur. J. Immunol. 30:534-540.

De acordo com uma outra modalidade, o animal que é imunizado com globulômero Αβ(20-42) ou derivado deste pode ser um camundongo com imunodeficiência combinada se- vera (SCID), que foi reconstituído com células sangüíneas mononucleares periféricas humanas ou células linfóides ou precursores destas. Tais camundongos que são referidos co- mo camundongos quiméricos hu-PBMC SCID produzem respostas a imunoglobulina humana mediante estímulo antigênico, co- mo foi mostrado· Para uma descrição adicional destes ca- mundongos e de seu uso para gerar anticorpos, ver, por exemplo, Leader, K.A. et al. (1992) Immunology 76:229- 234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol.195:360-375; Murfi, W.J. et al. (1996) Semin. Immunol. 8:233-241; Herz, U. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:150-152; Albert, S.E. et al. (1997) J. Immunol 15 9:1393-1403; Nguyen, H. et al. (1997) Microbial. Immunol. 41:901-907; Arai, K. et al. (1998) J. Immunol. Methods 217:79-85; Yo- shinari, K. And Arai, K. (1998) Hybridoma 17:41-45; Hut- chins, W.A. et al. (1999) Hybridoma 18:121-129; Murfi, W.J. et al.. (1999) Clin. Immunol. 90:22-27; Smithson, S.l. et al. (1999) Mol. Immunol. 36:113-124; Chamat, S. et al. (1999) J. Infect. Diseases 180:268-277; and Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5:35-45.

De acordo com uma outra modalidade, o animal que é imunizado com globulômero Αβ(20-42) ou um derivado des- te é um camundongo que foi tratado com um dose letal de irradiação corpórea total, em seguida protegido da radia- ção com células da medula óssea de camundongos com imuno- deficiência combinada severa (SCID) e subseqüentemente transplantados com linfócitos humanos funcionais. Este tipo de quimera, referido como o sistema Trimera, é usado a fim de produzir anticorpos monoclonais humanos imuni- zando os ditos camundongos com o antigeno de interesse e em seguida produzindo anticorpos monoclonais usando tecno- logia de hibridoma padronizada. Para uma descrição adi- cionaldestes camundongos e de seu uso para gerar anticor- pos, ver, por exemplo, Eren, R. et al. (1998) Immunology 93:154-161; Reisner, Y and Dagan, S. (1998) Trends Biotech- nol. 16:242-246; llan, E. et al. (1999) Hepatology 29:553- 562; and Bocher, W.O. et al. (1999) Immunology 96:634-641.

Partindo das células produtoras de anticorpo ge- radas in vivo, anticorpos monoclonais podem ser produzi- dos por meio de padronizados técnicas tais como as técni- cas de hibridoma originalmente descritas por Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497) (ver também Brown at al. (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown at al. (1980) J Biel Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; e Yeh et al. (1982) Int. J. Câncer 29:269-75). A tecnolo- gia de produzir anticorpo monoclonal hibridomas é sufi- cientemente conhecida (ver de um modo geral R. H. Kenneth, in Mono-clonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; Μ. 1. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36). Resumidamente, uma linha celular imortalizada (tipicamente um mieloma) é fundida com linfócitos (tipicamente células de esplenócitos ou linfonodo ou linfócitos sangüíneos pe- riféricos) de um mamífero imunizado com o globulômero Αβ da invenção ou derivado destes, e os sobrenadantes da cul- tura das células de hibridoma resultantes são classifica- das a fim de identificar um hibridoma que produz um anti- corpo monoclonal da presente invenção. Qualquer dos mui- tos protocolos bem conhecidos para fundir linfócitos e linhas celulares imortalizadas podem ser aplicados com este propósito (ver também G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet., cited su- pra; Lerner, Yale J. Biol. Med., cited supra; Kenneth, An- tibodies monoclonais, cited supra). Além disso, os versados na tecnologia perceberão que existem diversas variações de tais métodos, que são de outra forma usados. Tipicamente, a linha celular imortalizada (por exemplo, um linha celu- lar de mieloma) é derivada da mesma espécie de mamífero como os linfócitos. Por exemplo, hibridomas de murina po- dem ser estabelecidas fundindo linfócitos de um camundon- go imunizado com uma preparação imunogênica da invenção com um linha celular de camundongo imortalizado. Linhas celulares imortalizada preferidas são linhas celulares de mieloma de camundongo que são sensíveis ao meio de cultu- ra contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). Qualquer das inúmeras linhas celulares de mieloma podem ser usadas espontaneamente como parceiro de fusão, por exemplo, as linhas de mieloma P3-NS1/l-Ag4-1, P3-x63- Ag8.653 ou Sp2/0-Ag14. Estas linhas celulares de mieloma encontram-se disponíveis pela American Type Culture Col- lection (ATCC), Rockville, MD. Tipicamente, células de mieloma de camundongo sensíveis a HAT são fundidas com esplenócitos de camundongo usando polietileno glicol (PEG). Células de hibridoma resultantes da fusão são em seguida selecionadas usando meio HAT, dessa maneira ma- tando células não fundidas e improdutivamente fundidas de mieloma (morte dos esplenócitos não fundidos após diversos dias em virtude de eles não serem transformados). Células de hibridoma produzindo anticorpos monoclonais da inven- çãosão identificadas selecionando o sobrenadantes da cul- tura de hibridoma para tais anticorpos, por exemplo, usan- do um ensaio dot blot da maneira descrita anteriormente e no exemplo 8 a fim de selecionar aqueles anticorpos que têm as afinidades de ligação da maneira definida anteri- ormente.

Os anticorpos monoclonais 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1, e 3B10 todos foram gerados u- sando o abordagem in vivo descrita anteriormente·e destes são obteniveis a partir de um hibridoma da maneira aqui definida.

De outra forma, o dito hibridoma pode ser usado como uma fonte de ácido nucléico que codifica cadeias leve e/ou pesada a fim de produzir recombinantemente anticor- pos da presente invenção, da maneira descrita a seguir com mais detalhes.

Abordagens in vitro

Como uma alternativa para produzir anticorpos da invenção por imunização e seleção, anticorpos da invenção podem ser identificados e isolados selecionando bibliote- cas de imunoglobulina combinatória recombinante com globu- lômero Αβ(20-42) ou derivado deste para dessa maneira i- solar membros de biblioteca de imunoglobulina que têm a afinidade de ligação exigida. Conjuntos para geração e classificação de bibliotecas de exibição são comercialmen- te disponíveis (por exemplo, o Pharmacia Recombinant Pha- ge Antibodie System, catalog No. 27-9400-01; and the S- tratagene SurfZAP® Phage Display Kit, catalog No. 240612). Em muitas modalidades, a biblioteca de exibição é uma bi- blioteca scFv ou uma biblioteca Fab. As técnicas de apre- sentação de fago para classificação da biblioteca recom- binante de anticorpos foram adequadamente descritas. E- xemplos de métodos e compostos que podem ser usados par- ticularmente de forma vantajosa para gerar e classificar as bibliotecas de exibição de anticorpo podem ser encon- trados, por exemplo, em McCafferty et al. WO 92/01047, US 5.969. 108 and EP 589 877 (descreve em particular exibição de s c Fv) , Ladner et al. US 5.223.409, US 5.403.484, US 5.571.698, US 5.837.500 and EP 436 597 (descreve fusão de pílula, por exemplo); Dower et al. WO 91/17271, US 5.427.908, US 5.580.717 and EP 527 839 (descreve em parti- cular exibição de Fab); Winter et al. International Publi- cation WO 92/20791 and EP 368,684 (descreve em particular clonagem de seqüências para domínios de imunoglobulina variáveis); Griffiths et al . US 5.885.793 and EP 589877 (descreve em particular isolamento de anticorpos humanos dos antígenos humanos usando bibliotecas recombinante); Garrard et al. WO 92/09690 (descreve em particular técni- cas de expressão de fago); Knappik at al. WO 97/08320 (descreve a biblioteca recombinante de anticorpo humano HuCal); Salfeld et al. WO 97/29131, (descreve a produção de um anticorpo humano recombinante para um antigeno hu- mano (fator alfa de necrose tumoral humano) e também ma- turação de afinidade in vitro do anticorpo recombinante) e pedido de patente provisório U.S. Salfeld et al. U. No. 60/126.603 e os pedidos de patente com base nele (de outra forma descrito na produção de anticorpos recombinantes hu- manos para antigeno humano (interleucina-12 humano), e também maturação in vitro de afinidade do anticorpo recom- binante) .

Descrições adicionais de classificações de bibli- oteca recombinante de anticorpos podem ser encontradas em publicações cientificas tais como Fuchs et al. (1991) Bio/TechnoIogy 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hy- bridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982; McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554; and Knappik et al. (2.000) J. Mol. Biol. 296:57-86.

Como uma alternativa para usar sistemas de exibi- ção de bacteriófago, biblioteca recombinante de anticorpos pode ser expressa na superfície de célula de leveduras ou de células bacterianas. WO 99/36569 descreve métodos de preparação e classificação de bibliotecas expressas na su- perficie de célula de leveduras. WO 98/49286 descreve com mais detalhes métodos de preparação e classificação de bibliotecas expressas na superfície de células bacteria- nas .

Em todas abordagens in vitro, um processo de se- leção para enriquecer anticorpos recombinantes com as propriedades desejadas forma um parte integral do proces- so, que é de um modo geral referido como "panning" e fre- qüentemente toma a forma de cromatografia de afinidade sobre colunas em cuja matriz a estrutura alvo foi anexada. Moléculas candidatas promissoras são em seguida submetidas a determinação individual de sua afinidade absoluta e/ou relativa, preferivelmente por meio de um ensaio dot blot padronizado, da maneira descrita anteriormente e no exem- plo 8.

Uma vez que um anticorpo de interesse de uma bi- blioteca combinatória foi identificada e suficientemente caracterizada, as seqüências de DNA que codificam as ca- deias leve e pesada do dito anticorpo são isoladas por meio de técnicas biológicas moleculares padronizadas, por exemplo, por meio de amplificação PCR de DNA da embalagem de exibição (por exemplo, o fago) que foi isolado durante classificação da biblioteca. Seqüências de nucleotídeo de genes para cadeias de anticorpo leve e pesada, que pode ser usado para preparar iniciadores PCR, são conhecidos pelos versados na tecnologia. Uma multiplicidade de tais seqüências é descrita, por exemplo, em Kabat, E.A., et al.

(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publicação No. 91-3242 e na base de dados de seqüências da linha germinal humano VBASE.

Um anticorpo ou fração de anticorpo da invenção pode ser produzido expressando recombinantemente os genes para cadeias de imunoglobulina leve e pesada em uma célu- la hospedeira. A fim de expressar recombinantemente um an- ticorpo, uma célula hospedeira é transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinantes carregando frag- mentos de DNA que codificam aa cadeias de imunoglobulina leve e pesada do dito anticorpo, expressando dessa maneira as cadeias leve e pesada na célula hospedeira e que se- cretam-nas preferivelmente no meio em que as ditas célu- las hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser isolados deste meio. Métodos de DNA recombinante padroni- zados são usado a fim de obter genes para cadeias de an- ticorpo pesada e leve, para inserir os ditos genes em ve- tores de expressão recombinantes e para introduzir os di- tos vetores em células hospedeiras. Métodos desta espécie são descritos, por exemplo, em Sambrook, Fritsch and Mani- atis (eds . ) , Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocolos in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) and in US 4.816.397 by Boss at al..

Uma vez que fragmentos de DNA que codificam seg- mentos VH e VL do anticorpo de interesse foram obtidos, os ditos fragmentos de DNA pode ser adicionalmente mani- pulado usando técnicas de DNA recombinantes padronizadas, por exemplo, a fim de converter os genes para regiões va- riáveis em genes para cadeias de anticorpo de comprimento total, em genes para fragmentos Fab ou em um gene scFv.

Estas manipulações compreendem ligar um fragmento de DNA que codifica VL- ou VH- operat ivamente a um outro frag- mento de DNA que codifica uma outra proteína, por exemplo, uma região de anticorpo constante ou um ligante flexível. Deve-se entender aqui que o termo "operativãmente ligado" significa que os dois fragmentos de DNA são ligados de uma maneira tal que a seqüência de aminoácidos codifica- dos pelos dois ditos fragmentos de DNA permanece no qua- dro .

O DNA isolado que codifica o região VH pode ser convertido em um gene para uma cadeia pesada de compri- mento total ligando operativamente a região VH que codifi- ca DNA com uma outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As seqüên- cias de genes de região constante de cadeia pesada humana são bem conhecidas (ver, por exemplo, Kabat, E.A., et ai. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicação No. 91-3242), e fragmentos de DNA que cobrem as ditas regiões podem ser obtidos por meio de amplificação PCR padronizadas. A região constante de cadeia pesada po- de ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgE ou IgD, sendo dada preferência a uma região constante de IgG, em particular IgGl ou IgG4 . Para obter um gene para um fragmento Fab de cadeia pesada, o DNA que codifica VH pode ser opera ti vãmente ligada a uma outra molécula de DNA que codifica somente a região constante de cadeia pesada CHl.

O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene para uma cadeia leve de comprimento total (e um gene para um cadeia leve Fab) ligando opera- tivamente o DNA que codifica VL a uma outra molécula de DNA que codifica a região CL constante de cadeia leve. As seqüências de genes da região constante de cadeia leve hu- mana são bem conhecidas (ver Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edi- tion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Pu- blicação No. 91-3242), e fragmentos de DNA que cobrem as ditas regiões podem ser obtidos por meio de amplificação PCR padronizada. A região constante de cadeia leve pode ser uma região kapa ou lambda constante, uma região kapa constante sendo preferida.

A fim de gerar um gene scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH e VL podem ser operativamente ligados a um outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, a seqüência de aminoácido (Glya-Ser)3 de maneira que as seqüências VH e VL sejam expressas como uma proteí- na de cadeia simples contínua, com as regiões VL e VH sen- do ligadas umas com as outras por meio do dito ligante flexível (ver Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879- 5883; McCafferty et al., Nature (1990) 34 8:552-554). Domínio único VH e VL tendo as afinidades de li- gação da maneira descrita anteriormente pode ser isolado de bibliotecas de domínio único pelos métodos descritos anteriormente. Duas cadeias de domínio simples VH (com ou sem CH1) ou duas cadeias VL ou um par de uma cadeia VH e uma cadeia VL com a afinidade de ligação desejada podem ser usadas da maneira descrita aqui para os anticorpos da in- venção.

A fim de expressar os anticorpos recombinantes ou frações de anticorpo da invenção, os DNAs que codificam ca- deias leve e pesada de comprimento total ou parcial podem ser inseridos em vetores de expressão de maneira a ligar opera.t ivamente os genes às seqüências de controle trans- cripcional e de tradução apropriadas. Neste contexto, de- ve-se entender que o termo "operativamente ligado" signi- fica que um gene do anticorpo é ligado em um vetor de uma maneira tal que seqüências de controle transcripcional e de tradução no vetor realize sua função visada de regular transcrição e translação do dito gene do anticorpo.

Apropriadamente, o vetor de expressão e as se- qüências de controle de expressão são escolhidas de manei- ra a ser compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene para a cadeia leve de anticorpo e o gene para a cadeia pesada de anticorpo pode ser inserido em vetores separados ou ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão, sendo isto o caso usual. Os genes de anti- corpo são inseridos no vetor de expressão por meio de mé- todos padronizados (por exemplo, por ligação de sítios de clivagem de restrição complementar no fragmento e o vetor do gene do anticorpo, ou por ligação de pontas rombas, se nenhuns sítios de clivagem de restrição estão presentes). 0 vetor de expressão pode já levar seqüências para regiões constantes do anticorpo antes da inserção das seqüências para as cadeias leve e pesada. Por exemplo, uma abordagem é converter as seqüências VH e VL aos genes de anticorpo de comprimento total inserindo-as em vetores de expressão já que codificam as regiões constantes de cadeia pesada e, respectivamente, leve, dessa maneira ligando operativamente o segmento VH ao(s) segmento(s) CH no vetor e também ligan- do operativamente o segmento VL ao segmento CL no vetor.

Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilita secreção do cadeia de anticorpo da célula hos- pedeira. O gene para a dita cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor, dessa maneira ligando o peptídeo de sinal no quadro ao N término do gene oara a cadeia de anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imu- noglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína não imunoglobulina). Além dos genes para a cadeia de anticorpo, os vetores de ex- pressão da invenção pode ter expressão de controle de se- qüências regulatórias dos genes para a cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira.

O termo "seqüência regulatória" é para incluir promotores, melhoradores e elementos de controle de ex- pressão adicionais (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam transcrição ou translação dos genes para a cadeia de anticorpo. Seqüências regulatórias desta espécie são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Tecnologia.: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diégo, CA (1990). Os versados na tecnologia percebe- rão que o o projeto de vetor de expressão que inclui se- leção de seqüências regulatórias pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transforma- da, a intensidade desejada de expressão da proteína, etc. Seqüências regulatórias preferidas para expressão em célu- las hospedeiras mamíferas incluem elementos virais resul- tando em expressão de proteína constitutiva e forte em cé- lula mamíferas, tais como promotores e/ou melhoradores de- rivados de citomegalovírus (CMV) (tais como o promo- tor /melhorador CMV) , vírus simiano 40 (SV40) (tais como o promotor/melhorador SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor posterior principal de adenovírus (AdMLP)) e po- lioma. Para uma descrição adicional de elementos regula- tórios virais e seqüências destes, ver, por exemplo, US 5.168.062 a Stinski, US 4.510.245 a Bell et al. e US 4.968.615 a Schaffner et al.

Além dos genes para a cadeia de anticorpo e as seqüências regulatórias, os vetores de expressão recombi- nantes da invenção podem ter seqüências adicionais tais como aquelas que regulam replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. Os genes marcadores selecioná- veis facilitam a seleção de células hospedeiras na qual o vetor foi introduzido (ver, por exemplo, patente US 4.399.216, 4.634.665 e 5.179,017, todos to Axel et al. ) . Por exemplo, é comum para o gene marcador selecionável render uma célula hospedeira na qual o vetor foi inserido resistente aos medicamentos citotóxicos tais como G418, higromicina ou metotrexato. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene para diidrofolato redutase (DH- FR) (for uso em células hospedeiras dhfr" com sele- ção/amplificação de metotrexato) e o neo gene (para sele- ção de G418).

Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(s) de expressão(s) que codifica(s) as ditas cadeias pesadas e leves é (são) transfectado(s) em uma célula hos- pedeira por meio de técnicas padronizadas. As várias for- mas do termo "transfecção" devem compreender uma multipli- cidade de técnicas normalmente usadas para introduzir DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucarió- tica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção DEAE-dextrano, e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da in- venção tanto em células hospedeiras procariótica quanto eucariótica, é dada preferência para expressar os anticor- pos em células eucarióticas e, em particular, em células hospedeiras mamíferas, uma vez que a probabilidade de um anticorpo corretamente dobrado e imunologicamente ativo ser montado e secretado é maior em tais células eucarió- ticas e em particular célula mamíferas do que em célula procarióticas. Expressão procariótica dos genes de anti- corpo foi reportada como sendo ineficiente para produção de altos rendimentos do anticorpo ativo (Boss, M.A. And Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Células hospedeiras mamíferas preferidas para expressar anticorpos recombinantes da invenção incluem cé- lulas CHO (incluindo célula dhfr" CHO da maneira descrita em Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl.' Acad. Sei. USA 77:4216-4220, que são usadas juntamente com um marcador selecionável de DHFR, da maneira descrita, por exemplo, em R. J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601- 621), células de mieloma NOS, células COS e células SP2. Durante a introdução de vetores de expressão recombinan- tes que codificam os genes de anticorpo em células hospe- deiras mamíferas, os anticorpos são produzido cultivando as células hospedeiras até o anticorpo ser expresso nas ditas células hospedeiras ou, preferivelmente, o anticorpo ser secretado no meio de cultura em que as células hospe- deiras crescem. Os anticorpos podem em seguida ser isola- dos do meio de cultura usando métodos de purificação pro- teína padronizados.

De outra forma é possível usar células hospedei- ras a fim de produzir frações de anticorpos intactos, tais como fragmentos Fab ou molécula scFvs. Variações do pro- cedimento descrito anteriormente são incluídos é claro na invenção. Por exemplo, pode-se desejar transfectar uma cé- lula hospedeira com DNA que codifica tanto a cadeia leve quanto a cadeia pesada (mas não ambas) de um anticorpo da invenção. Se tanto cadeias leves quanto pesadas estão pre- sentes que não são exigidas para ligação do antigeno de interesse, em seguida o DNA que codifica tanto uma cadeia leve como essa quanto uma pesada como essa ou ambas podem ser removidas parcial ou completamente por meio de tecno- logia de DNA recombinante. Moléculas expressas por tais moléculas de DNA truncada são de outra forma incluídas nos anticorpos da invenção. Além do mais, é possível produzir anticorpo bifuncionais em que uma cadeia pesada e uma ca- deia leve são um anticorpo da invenção e a outra cadeia pesada e a outra cadeia leve tem especificidade para um antigeno diferente do antigeno de interesse, reticulando um anticorpo da invenção com um segundo anticorpo por meio de métodos químicos padronizados.

Em um sistema preferido para recombinante expres- são de um anticorpo da invenção ou uma fração de ligação de antigeno deste, um vetor de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia pesada de anticorpo quanto a ca- deia leve de· anticorpo é introduzido em células dhfr" CHO por meio de transfecção mediada por fosfato de cálcio. No vetor de expressão recombinante, os genes para as cadeias de anticorpo pesada e leve são em cada caso operativamente ligadas aos elementos melhoradores CMV/promotores AdMLP regulatórios a fim de realizar forte transcrição do dito genes. O vetor de expressão recombinante também leva um gene DHFR que pode ser usado para selecionar células dh- fr- CHO transfectadas com o vetor usando sele- ção/amplificação de metotrexato. As células hospedeiras transformadas selecionadas são cultivadas de maneira que as cadeias de anticorpo pesada e leve são expressas, e o anticorpo intacto é isolado do meio de cultura. Técnicas biológicas moleculares padronizadas são usadas a fim de preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar os transformantes, culti- var as ditas células hospedeiras, e obter o anticorpo do meio de cultura. Assim a invenção diz respeito a um méto- do de sintetizar um anticorpo recombinante da invenção cultivando uma célula hospedeira da invenção em um adequa- dos meio de cultura até um anticorpo recombinante da in- venção ser sintetizado. 0 método pode além disso compreen- der isolar o dito anticorpo recombinante do dito meio de cultura.

Como uma alternativa para classificar biblioteca recombinante de anticorpos pela apresentação de fago, ou- tros métodos conhecidos pelos versados na tecnologia podem ser usados para classificar grandes bibliotecas combinató- rias para identificar os anticorpos da invenção. Basica- mente, qualquer sistema de expressão na qual uma ligação física próxima entre um ácido nucléico e o anticorpo codi- ficado dessa maneira é estabelecido, e pode ser usado para selecionar uma seqüência de ácido nucléico adequada em virtude das propriedades do anticorpo que ele codifica po- der ser empregado.

Em um tipo de um sistema de expressão alternati- vo, a biblioteca recombinante de anticorpo é expressa na forma de fusões de proteína RNA, da maneira descrita em WO 98/31700 to Szostak and Roberts, and in Roberts, R.W. And Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:122 97-12302. Neste sistema, translação in vitro de mR- NAs sintéticos levam no sua extremidade 3' de puromicina, um antibiótico aceptor de peptidila, gera uma fusão cova- lente de um mRNA e o peptideo ou proteína codificada por ela. Assim um mRNA específico de um mistura complexa de mRNAs (por exemplo, uma biblioteca combinatória) pode ser concentrada na base das propriedades do peptideo ou pro- teínacodifiçado (por exemplo, do anticorpo ou uma fração deste), tais como ligação do dito anticorpo ou a dita fração deste com globulômero Αβ(20-42) ou um derivado des- te. Seqüência de ácido nucléicos que codifica anticorpos ou frações destes e que são obtidos por classificação de tais bibliotecas podem ser expressos por meios recombi- nante da maneira anteriormente descrita (por exemplo, em células hospedeiras mamíferas) e podem, além disto, ser submetidos a maturação de afinidade adicional tanto por classificação em rodadas adicionais de fusões mRNA- peptídeo, introduzindo mutações nas seqüência(s), origi- nalmente selecionada(s) quanto usando outros métodos de maturação de afinidade in vitro de anticorpos recombinan- tes da maneira descrita anteriormente.

Combinações de abordagens in vivo e in vitro

Os anticorpos da invenção podem de outra forma ser produzidos usando uma combinação de abordagens in vi- vo e in vitro tais como métodos em que globulômero Αβ(20- 42) ou um derivado deste é age naturalmente primeiramente em um repertório de anticorpo em um animal hospedeiro in vivo para estimular produção de anticorpos de ligações de globulômero Αβ(20-42) ou derivado e em seguida seleção de anticorpo e/ou maturação anticorpo adicional (isto é, Oti- mização) são realizados com a ajuda de uma ou mais técni- cas in vitro. De acordo com uma modalidade, um método combinado desta espécie pode compreender primeiramente imunizar um animal não humano (por exemplo, um camundon- go, rato, coelho, galinha, camalideos, carneiro ou cabra ou um versão transgênica destes ou um camundongo quiméri- co) com o dito Αβ(20-42) globulômero ou derivado deste pa- ra estimular uma resposta do anticorpo ao antigeno e em seguida preparar e classificar uma biblioteca de anticorpo de apresentação de fago usando seqüências de imunoglobu- lina de linfócitos que foram estimulados in vivo pela ação de dito globulômero Αβ(20-42) ou derivado. A primeira eta- pa deste procedimento combinado pode ser realizada da ma- neira descrita anteriormente em conexão com as abordagens in vivo, ao passo que a segundo etapa deste procedimento pode ser realizada da maneira descrita anteriormente em conexão com as abordagens in vitro. Métodos preferidos de hiper imunizar animais não humanos com subseqüente classi- ficação in vitro de bibliotecas de apresentação de fago preparada a partir dos ditos linfócitos estimulados inclu- em aquela da maneira descrita por BioSite Inc., ver, por exemplo, WO 98147343, WO 91117271, US 5.427.908 e US 5.580.717 .

De acordo com uma outra modalidade, um método combinado compreende primeiramente imunizar um animal não humano (por exemplo, um camundongo, rato, coelho, gali- nha, camalideos, carneiro, cabra ou um knockout e/ou ver- são transgênica deste, ou um camundongo quimérico) com um globulômero .Aβ (20-42) da invenção ou derivado deste para estimular uma resposta do anticorpo ao dito globulômero Αβ (20-42) ou derivado deste e selecionar os linfócitos que produzem os anticorpos tendo a especificidade desejada selecionando hibridomas (preparada, por exemplo, dos ani- mais imunizados). Os genes para os anticorpos ou anticor- pos de domínio único são isolados a partir dos clones se- lecionados (por meio de métodos de clonagem padronizados tais como reação de cadeia de polimerase transcriptase re- versa) e submetidos a' maturação de afinidade in vitro a fim de melhorar dessa maneira as propriedades de ligação do anticorpo selecionado ou os anticorpos selecionados. A primeira etapa deste procedimento pode ser conduzida da maneira descrita anteriormente em conexão com as aborda- gens in vivo, ao passo que a segundo etapa deste procedi- mento pode ser conduzida da maneira descrita anteriormente em conexão com as abordagens in vitro, em particular usan- do métodos de maturação de afinidade in vitro, tais como aqueles da maneira descrita em WO 97/29131 e WO 00156772.

Em um método combinado adicional, os anticorpos recombinantes são gerados a partir de linfócitos indivi- duais isolados usando um procedimento que é conhecido pe- los versados na tecnologia como método de anticorpo de linfócito selecionado (SLAM) e que é descrito em US 5.627.052, WO 92/02551 and Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 7843-7848. Neste método, um animal não humano (por exemplo, um camundongo, rato, coe- lho, galinha, camalídeos, carneiro, cabra, ou uma versão transgênica destes, ou um camundongo quimérico) é primei- ramente imunizado in vivo com globulômero Αβ(20-42) ou um derivado deste para estimular uma resposta imune ao dito oligômero ou derivado, e em seguida células individuais que secretam anticorpos de interesse são selecionadas u- sando um ensaio de placa hemolítica especifica de antíge- no. Com esta finalidade, o globulômero ou derivado deste ou moléculas de interesse estruturalmente relacionadas podem ser acopladas aos eritrócitos de carneiro, usando um ligante tal como biotina, tornado dessa maneira possí- vel identificar células individuais que secretam anticor- pos com adequados especificidade usando o ensaio de placa hemolítica. Após a identificação de células que secretam anticorpos de interesse, cDNAs para as regiões variáveis das cadeias leve e pesada são obtidos a partir das células por PCR de transcriptase reversa, e as ditas regiões va- riáveis podem em seguida ser expressas em associação com regiões constantes de imunoglobulina adequadas (por exem- plo, regiões constantes humanas) em células hospedeiras mamíferas tais como células COS ou CHO. As células hospe- deiras transfectadas com o seqüências de imunoglobulina amplificadas derivadas de linfócitos selecionados in vivo podem em seguida ser submetidas a seleção de análise in vitro e in vitro adicional espalhando as células trans- fectadas, por exemplo, a fim de isolar células que ex- pressam anticorpos com a afinidade de ligação. As seqüên- cias de imunoglobulina amplificadas podem além disso ser manipuladas in vitro.

Anticorpos tendo as afinidades exigidas aqui de- finidas podem ser selecionados realizando um dot blot es- sencialmente da maneira descrita anteriormente. Resumida- mente, o antigeno é anexado a uma matriz sólida, preferi- velmente analisada em dot blot em uma membrana de nitroce- lulose, em diluições em série. O antigeno imobilizado é em seguida colocado em contato com o anticorpo de interesse seguido por detecção do último, por meio de um anticorpo secundário conjugado com enzima e uma reação calorimétri- ca; em anticorpo definido e concentrações de antigeno, a quantidade do anticorpo ligado permite determinação de afinidade. Assim, a afinidade relativa de dois diferentes anticorpos com um alvo, ou de um .anticorpo com dois alvos diferentes, é aqui definida como a relação das quantida- des respectivas de anticorpo ligado ao alvo observado com as duas combinações alvo do anticorpo de outra forma em condições idênticas de dot blot.

Anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo como an- ticorpo monoclonal 5F7, 10F11, 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1, ou 3810 podem ser obtidos de uma maneira co- nhecida per se.

Da mesma maneira descrita anteriormente, que an- ticorpos podem ser competitivos, diferentes estruturas al- vos são considerados "competitivos" para um anticorpo par- ticular se pelo menos uma dessas estruturas for capaz de reduzir especificamente a ligação mensurável de uma outra, preferivelmente oferecendo um epitopo de sobreposição ou idêntico, mais preferivelmente um epitopo idêntico.

Entidades competitivas alvos são usadas para se- lecionar diretamente anticorpos em virtude de sua afini- dade relativa com tais estruturas alvos. Afinidade relati- vas podem assim ser determinadas diretamente usando um en- saio de competição em que formas distinguiveis das enti- dades competitivas, por exemplo, estruturas competitivas marcadas de forma diferente, são colocadas em contato com o anticorpo de interesse, e a afinidade relativa do anti- corpo com cada uma dessas entidades é deduzida das quan- tidades relativas destas entidades que são ligadas pelo anticorpo.

Tal competição pode ser usada para enriquecer diretamente os anticorpos possuindo um afinidade relativa desejada com a entidade visada, anexando a entidade nos sentido que afinidade maior é desejada para um suporte de matriz sólida e adicionando uma quantidade adequada, pre- ferivelmente um excesso de molar, da entidade competitiva no sentido de que menor afinidade é desejada ao meio. As- sim, os anticorpos que exibem a afinidade relativa deseja- da tenderão a se ligar ã matriz mais fortemente do que os outros e podem ser obtidos após lavar as formas menos de- sejáveis, por exemplo, lavando em baixas concentrações de sal e em seguida colhendo o anticorpo ligado deslocando-o reversivelmente do seu alvo usando altas concentrações de sal. Se desejado, diversas rodadas de enriquecimento po- dem ser realizadas. Em uma modalidade particular da in- venção, onde o genótipo subjacente um anticorpo é fisica- mente ligado a este anticorpo, por exemplo, em um agrupa- mento de hibridomas ou fagos que exibem antigeno ou célula de leveduras, o correspondente fenótipo pode ser resgatado.

Em uma outra modalidade da invenção, um dot blot modificado é usado onde o antigeno imobilizado compete com um entidade resolvida para ligação de anticorpo, de ma- neira que a afinidade relativa do anticorpo pode ser de- duzida da porcentagem ligada ao antigeno imobilizado.

Frações de anticorpo tais como fragmentos Fab e F(ab')2 podem ser produzidas de todos os anticorpos usando técnicas convencionais tais como digestão com papaina ou pepsina. Além do mais, anticorpos, frações de anticorpo e moléculas de imunoadesão podem ser obtidos usando técnicas de DNA recombinantes padronizadas.

A presente invenção também diz respeito a agentes farmacêuticos (composições) compreendendo um anticorpo da invenção e, opcionalmente, um veiculo farmaceuticamente adequado. Composições farmacêuticas da invenção podem a- lém disso conter pelo menos um agente terapêutico adicio- nal, por exemplo, um ou mais agentes terapêuticos adicio- nais para o tratamento de uma doença para cujo alivio os anticorpos da invenção são usados. Se, por exemplo, o an- ticorpo da invenção se liga a um globulômero da invenção, a composição farmacêutica pode adicionalmente conter mais um ou mais agentes terapêuticos adicionais usados para o tratamento de desordens em que a atividade do dito globu- lômero é importante.

Veículos farmaceuticamente adequados incluem qualquer solventes, meio de dispersão, revestimentos, a- gentes antibacterianos e antifungos, agentes isotônicos e de absorção atrasada, e similares, desde que eles sejam fisiologicamente compatíveis. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, água, salina, salina tam- ponada de fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, e combinações destes. Em muitos casos, é dada preferência ao uso de agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poli álcoois tais como manitol ou sorbitol, ou cloreto de sódio além disso. Veículos farmaceuticamente adequados podem a- lém disso conter quantidades relativamente pequenas de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou e- mulsificantes, conservantes ou tampões, que aumentam o meia vida ou eficácia dos anticorpos.

As composições farmacêuticas podem ser adequadas para administração parenteral, por exemplo. Aqui, os an- ticorpos são preparados preferivelmente como soluções in- jetáveis com um conteúdo do anticorpo de 0,1 - 250 mg/mL. As soluções injetáveis podem ser preparadas em forma lí- quida ou liofilizada, a forma de dosagem sendo um vidro ou frasco de sílex, um ampola ou um seringa cheia. 0 tam- pão pode conter 1-histidina (1 - 50 mM, preferivelmente 5 - 10 mM) e tem um pH de 0,5 - 7,0, pref erivelmente de 6,0. Tampões adequados adicionais incluem, sem se limitar a isto, tampões de succinato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio. Cloreto de sódio pode ser usado a fim de ajustar a tonicidade da solução a uma concentração de 0 - 300 mM (pref erivelmente 150 mM para um forma de dosagem liquida) . Crioprotetores, por exemplo, sacarose (por exemplo, 0 - 10 %, preferivelmente 0,5 -1,0 %) também pode ser incluído para uma forma de do- sagem liofilizada. Outros crioprotetores adequados são trealose e lactose. Cargas, por exemplo, manitol (por e- xemplo, 1 - 10 %, preferivelmente 2 - 4 %) podem também ser incluídas para um forma de dosagem liofilizada. Esta- bilizadores, por exemplo, 1-metionina (por exemplo, 51 - 50 mM, pref erivelmente 5-10 mM) podem ser usados tanto em forma de dosagem líquida quanto liofilizada. Cargas adequados adicionais são glicina e arginina. Agentes ten- soativos, por exemplo, polisorbato 80 (por exemplo, 0 0,05 %, preferivelmente 0,005 - 0,01 %), podem também ser usados. Agentes tensoativos adicionais são polisorbato 20 e agentes tensoativos BRIJ.

As composições da invenção podem ter uma multi- plicidade de formas. Estas incluem formas de dosagem lí- quida, semi-sólida e sólida, tais como soluções líquida (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), disper- sões ou suspensões, comprimidos, pílulas; pós, lipossomos e supositórios. A forma preferida depende do tipo de admi- nistração visado e da aplicação terapêutica. Tipicamente, é dada preferência ás composições na forma de soluções in- jetáveis ou infusíveis, por exemplo, composições que são similar aos outros anticorpos para imunização passiva de humanos. A via de administração preferida é parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitonial ou intramuscular). De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo é administrado por infusão ou injeção intraveno- sa. De acordo com uma outra modalidade preferida, o anti- corpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

Composições terapêuticas devem tipicamente ser estéreis e estáveis em condições de preparação e armazena- mento. As composições podem ser formuladas como soluções, microemulsões, dispersões, lipossomos ou outros estruturas adequados ordenadas para altas concentrações de substância ativa. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas introduzindo o composto ativo (isto é, o anticorpo) na quantidade exigida em um solvente adequado, onde com um dos ingredientes supramencionados apropriados ou uma combina- ção deles, da maneira exigida, e em seguida filtrar por esterilização a dita solução. Dispersões são geralmente preparadas introduzindo o composto em um veiculo estéril contendo um meio de dispersão básico e, onde apropriado, outros ingredientes exigidos. No caso de um pó liofilizado estéril para preparar soluções injetáveis estéreis, seca- gem a vácuo e secagem por aspersão são métodos preferidos de preparação, que produzem um pó de o ingrediente ativo e, onde apropriado, de ingredientes adicionalmente deseja- dos de uma solução previamente filtrada por esterilização. A escoabilidade correta de um solução pode ser mantida u- sando, por exemplo, um revestimento tal como lecitina, mantendo, no caso de dispersões o tamanho de partícula e- xigido ou usando agentes tensoativos. Uma absorção prolon- gada de composições injetáveis pode ser obtida introduzin- do adicionalmente na composição um agente que atrasa a ab- sorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Os anticorpos da invenção podem ser administrados por uma multiplicidade de métodos conhecidos pelos versados na tecnologia, embora o tipo de administração preferido pa- ra muitas aplicações terapêuticas seja injeção subcutânea, injeção intravenosa ou infusão. Os versados na tecnologia perceberão que a via e/ou tipo de administração depende de resultado desejado. De acordo com modalidades particulares, o composto ativo pode ser preparado com um veículo que protege o composto contra liberação rápida, tal como, por exemplo, uma formulação com liberação sustentada ou con- trolada, que inclui sistemas de implantes, emplastros transdérmicos e liberação micro encapsulada. Polímeros bi- ocompatíveis biologicamente degradáveis tais como acetato de vinil etileno, polianidretos, ácido poliglicólico, co- lágeno, poliortoésteres e ácido polilático podem ser usa- dos. Os métodos de preparar tais formulações são bem conhe- cidos pelos versados na tecnologia; ver, por exemplo, Sus- tained and Cont rol Ied Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.

De acordo com modalidades particulares, um anti- corpo da invenção pode ser administrado oralmente, por e- xemplo, em um diluente inerte ou um veículo comestível me- tabolizável. 0 anticorpo (e ingredientes adicionais, se desejado) também pode ser encerrado em uma cápsula de ge- latina dura ou macia, compactada em comprimidos ou adicio- nada diretamente ao alimento. Para administração terapêu- tica oral, os anticorpos podem ser misturados com excipi- entes e usados na forma de comprimidos orais, comprimidos bucais, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes e simila- res. Se for programado administrar um anticorpo da invenção por meio de uma outra via que aquela parenteral, pode ser necessário escolher um revestimento de um material que pre- vina sua inativação.

A presente invenção também diz respeito a um mé- todo de inibir a atividade de globulômeros da invenção em um indivíduo que sofre de uma desordem na qual a proteína β amilóide é envolvida e em que, em particular a atividade dos ditos globulômeros da invenção seja importante. O dito método compreende a administração de pelo menos um anti- corpo da invenção ao individual com objetivo de inibir a atividade do globulômero ao qual o anticorpo se liga. O di- to indivíduo é preferivelmente um humano. Um anticorpo da invenção pode ser administrado com propósito terapêutico a um indivíduo humano. Além do mais, um anticorpo da inven- ção pode ser administrado a um humano não mamífero com pro- pósitos veterinários ou na estrutura de um modelo animal para uma desordem particular. Tais modelos animais podem ser usados para avaliar a eficácia terapêutica de anticor- pos da invenção (por exemplo, para testar dosagens e curso de tempo de administração).

Desordens em que os globulômeros da invenção e- xerce um parte incluem em particular desordens em cujo de- senvolvimento e/ou progresso um globulômero da invenção é envolvido, estas são em particular aquelas desordens nas quais globulômeros da invenção são evidentemente ou Presu- midamente responsáveis pela patofisiologia da dita desor- dem ou são um fator que contribui com o desenvolvimento e/ou progresso da dita desordem. Consequentemente, aquelas desordens são aqui incluídas em que inibição da atividade de globulômeros da invenção podem aliviar sintomas e/ou progresso da desordem. Tais desordens podem ser verifica- das, por exemplo, por uma maior concentração de globulôme- ros da invenção em um fluido biológico de um indivíduo que sofre de uma desordem particular (por exemplo, maior con- centração em soro, plasma, CSF, urina, etc.). Isto pode ser detectado, por exemplo, usando um anticorpo da inven- ção. Os globulômeros da invenção exerce uma importante par- te na patologia associada com uma multiplicidade de desor- dens nas quais elementos neurodegenerativos, deficiências cognitivas, elementos neurotóxicos e elementos inflamató- rios são envolvidos.

Em um outro aspecto da invenção, desordens que podem ser tratados ou prevenidos incluem aquelas associa- das com amiloidoses. O termo "amiloidoses" aqui denota inúmeras desordens caracterizadas por dobra anormal, a- grupamento, agregação e/ou acúmulo de proteínas particu- lares (amilóide, proteínas fibrosas e seus precursores) em- vários tecidos do corpo. Em doença de Alzheimer e síndrome de Down, tecido nervoso é afetado, na angiopatia de ami- lóide cerebral (CAA) vasos sangüíneos são afetados.

As composições farmacêuticas da invenção podem incluir um "quantidade terapeuticamente efetiva" ou uma "quantidade profilaticamente efetiva" de um anticorpo ou fração de anticorpo da invenção. Uma "quantidade terapeu- ticamente efetiva" refere-se a uma quantidade efetiva, nas dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcan- çar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade te- rapeut icamente efetiva do anticorpo ou fração de anticor- po pode ser determinada por um versado na tecnologia e pode variar de acordo com fatores tais como o estágio da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou fração de anticorpo para elicitar uma res- posta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeutica- mente efetiva é também uma na qual qualquer efeito tóxico ou detrimental do anticorpo ou porção do anticorpo são sa- lientados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente efetiva" refere-se a uma quantidade efetiva, nas dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático deseja- do. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é usada em sujeitos antes de, ou em um estágio precoce da doença, a quantidade profilaticamente efetiva será menos que a quantidade terapeuticamente efetiva.

Além disso, a presente invenção inclui um método adicional de prevenir ou tratar doença de Alzheimer em um paciente que necessita de tal prevenção ou tratamento. Es- te método compreende a etapa de administrar a vacina su- pranotada ao paciente em uma quantidade suficiente reali- zar a prevenção ou tratamento.

Adicionalmente, a presente invenção engloba um método de identificar compostos adequados para imunização ativa de um paciente previstos para desenvolver uma ami- loidose, por exemplo, doença de Alzheimer. Este método compreende: 1) expor um ou mais compostos de interesse a um ou mais dos anticorpos descritos anteriormente por um tempo e em condições suficiente para um ou mais compostos que se ligam ao anticorpo ou anticorpos; 2) identificar aqueles compostos que se ligam ao anticorpo ou anticorpos, o compostos identificados a ser usados na imunização ativa em um paciente predisposto a desenvolver uma amiloidose, por exemplo, doença de Alzheimer.

No contexto de uso do diagnóstico dos anticor- pos, determinação de globulômero especifico qualitativo ou quantitativo serve em particular para diagnosticar re- levantes a doença formas de β amilóide. Neste contexto, especificidade significa a possibilidade de ser capaz de detectar um globulômero particular ou um derivado deste, ou uma mistura deste com sensibilidade suficiente. Os an- ticorpos da invenção vantajosamente têm concentrações de patamar de detecção de menos que 10 ng/mL de amostra, pre- ferivelmente de menos que 1 ng/mL de amostra e de um modo particular preferivelmente de menos que 100 μg/mL de amos- tra, significando que pelo menos a concentração de globu- lômero per mL de amostra, indicada em cada caso, vantajo- samente também menores concentrações, podem ser detectadas pelos anticorpos da invenção.

A detecção é realizada imunologicamente. Isto po- de ser realizado a principio usando qualquer método de en- saio analítico ou diagnóstico em que anticorpos são usa- dos, incluindo técnicas de aglutinação e precipitação, i- munoensaios, métodos imuno-histoquímicos e técnicas imu- noblot, por exemplo, Western blotting ou, preferivelmente, métodos dot blot. Métodos im vivo, por exemplo, métodos de imageamento, também são aqui incluídos.

O uso em imunoensaios é vantajoso. Imunoensaios competitivos, isto é, ensaios onde antígeno e antígeno marcado (marcador) compete com a ligação de anticorpo, e imunoensaios sanduíches, isto é, ensaios onde ligação de anticorpos específicos ao antígeno é detectado por um se- gundo, geralmente anticorpo marcado, são ambos adequados.

Estes ensaios podem ser tanto homogêneos, isto é, sem se- paração em fases sólidas e líquida, quanto heterogêneas, isto é, marcadores ligados são separados daqueles não li- gados, por exemplo, por meio de anticorpo ligados de fase sólida. Dependendo da marcação e método de medição, os vá- rios formatos de imunoensaio heterogêneos e homogêneos podem ser classificados em classes particulares, por exem- plo, RIAs (radioimunoensaios) , ELISA (ensaio imunosorvente ligado a enzima), FIA (imunoensaio de fluorescência), LIA (imunoensaio de luminescência) , TRFIA (FIA resolvido no tempo), IMAC (imunoativação) , EMIT (imune teste multipli- cado por enzima), TIA (imunoensaio turbidimétrico) , I-PCR (PCR imuno). Para a quantificação de globulômero da invenção, é dada preferência a imunoensaios competitivos em que uma quantidade definida de derivado de globulômero marcado servindo como marcador compete com o globulômero da amos- tra (contendo uma quantidade desconhecida de globulômeros não marcados) a ser quantificado para ligação com o anti- corpo usado. A quantidade de antigeno, isto é, a quanti- dade de globulômero, na amostra pode ser determinada a partir da quantidade do marcador deslocado com a ajuda de uma curva padrão.

Dos marcadores disponíveis com este propósito, enzimas têm se mostrado vantajosas. Sistemas baseados em peroxidases, em particular peroxidase do rábano silves- tre, fosfatase alcalina e β-D-galactosidase, pode ser u- sado, por exemplo. Substratos específicos cuja conversão pode ser monitorada fotometricamente, por exemplo, são disponíveis para estas enzimas. Sistemas de substrato ade- quados são baseados em fosfato p-nitrofenila (p-NPP), fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila /nitroblue tetrazó- lio (BCIP/NPT), Fast-Red/naftol-AS-TS fosfato para fosfa- tase alcalina; ácido 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6- sulfônico) (ARTS), ofenilenodiamina (OPT), 3,3',5,5'-tetra- metilbenzidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5-aminosa- licílico, ácido 3-dimetilaminobenzóico (DMAB) e 3-metil-2- benzotiazolineidrazona (MBTH) para peroxidases; o- nitrofenila-p-D-galactosídeo (o-NPG), p-nitrofenila-β-Ο- galactosídeo e 4-metilumbelifenil-p-D-galactosídeo (MUG) para β-D-galactosidase. Em muitos casos, estes sistemas de substrato são comercialmente disponíveis em um pronta pa- ra o uso forma, por exemplo, na forma de comprimidos que também pode conter reagentes adicionais tais como tampões apropriados e similares.

Os marcadores usados podem ser globulômeros mar- cados. Beste sentido, um globulômero particular pode ser determinado marcando o globulômero a ser determinado e usando-o como marcador.

O acoplamento de marcadores com globulômeros pa- ra preparar marcadores pode ser realizado de uma maneira conhecida per se. Os comentários anteriores na derivati- zação de globulômeros da invenção são referidos por ana- logia. Além do mais, inúmeros marcadores apropriadamente modificado para conjugação com proteínas são disponíveis, por exemplo, enzimas conjugadas com biotina, avidina, ex- travidina ou estreptavidina, enzimas ativadores por malei- mida e similares, estes marcadores podem reagir diretamen- te com o oligômero ou, se exigido, com o globulômero apro- priadamente derivatizado para dar o marcador. Se, por e- xemplo, um conjugado de estreptavidina-peroxidase é usa- do, em seguida isto primeiramente exige biotinilação do globulômero. Isto se aplica correspondentemente á ordem reversa. Métodos adequados com esta finalidade também são conhecidos pelos versados na tecnologia.

Se um formato de imunoensaio heterogêneo é esco- lhido, o complexo antígeno-anticorpo pode ser separado ligando-o ao suporte, por exemplo, por meio de um anti- corpo anti idiotípico acoplado ao dito suporte, por exem- pio, um anticorpo direcionado contra IgG de coelho. Supor- tes apropriados, em particular placas microtituladoras re- vestidas com anticorpos apropriados, são conhecidos e de forma parcial comercialmente disponíveis.

A presente invenção diz respeito adicionalmente a conjuntos de imunoensaio tendo pelo menos um anticorpo da maneira descrita anteriormente e componentes adicio- nais. Os ditos conjuntos são, geralmente na forma de uma unidade de embalagem, uma combinação de dispositivo para realizar uma determinação de globulômero da invenção. Com o propósito de facilitar o máximo possível o manuseio, os ditos dispositivos são preferivelmente fornecidos de uma forma essencialmente pronta para o uso. Um arranjo vanta- joso oferece o imunoensaio na forma de um estojo. Um esto- jo geralmente compreende múltiplos recipientes para sepa- rar arranjo de componentes. Todos componentes podem ser fornecidos em uma diluição pronta para o uso, como um concentrado para diluição ou como uma substância seca ou liofilisato para dissolução ou suspensão; componentes in- dividuais ou todos, podem ser congelados ou armazenados à temperatura ambiente até o uso. Soros são preferivelmente congelados com choque, por exemplo, a -20 0C de maneira que nesses casos um imunoensaio tem que ser mantido pre- ferivelmente à temperaturas abaixo do congelamento antes do uso.

Componentes adicionais supridos com o imunoensaio dependem do tipo do dito imunoensaio. Geralmente, proteína padrão, marcador que pode ou não ser exigido e soro de controle são supridos juntamente com o anti-soro. Além disso, placas microtituladoras, preferivelmente tampões revestidos com anticorpo, por exemplo, para testar, para lavar ou para conversão do substrato, e o substrato da en- zima por si próprio também pode ser incluído.

Princípios gerais de imunoensaios e geração e uso de anticorpos como auxiliares em laboratório e hospi- tal podem ser encontrados, por exemplo, em Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow, E., e Rota, D., Ed., Cold S- pring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988).

Assim, a presente invenção também inclui um mé- todo de diagnosticar uma amiloidose, por exemplo, doença de Alzheimer, em um paciente suspeito de ter esta doença. Este método compreende as etapas de: 1) isolar uma amostra biológica do paciente; 2) colocar a amostra biológica em contato com pelo menos um dos anticorpos descritos ante- riormente por um tempo e em condições suficiente para formação de complexos antígeno/anticorpo; e 3) detectar presença dos complexos antígeno/anticorpo na dita amostra, presença dos complexos indica um diagnóstico de uma ami- loidose, por exemplo, doença de Alzheimer, no paciente. O antígeno pode ser, por exemplo, um globulômero ou uma porção ou fragmento deste que tem as mesmas propriedades funcionais como o globulômero total (por exemplo, ativida- de de ligação).

Adicionalmente, a presente invenção inclui um ou- tro método de diagnosticar uma amiloidose, por exemplo, doença de Alzheimer em um paciente suspeito de ter esta doença. Este método compreendendo as etapas de: 1) isolar uma amostra biológica do paciente; 2) colocar a amostra biológica em contato com um antigeno por um tempo e em condições suficientes para a formação de complexos anti- corpo/antígeno; 3) adicionar um conjugado com os complexos anticorpo/antigeno resultantes por um tempo e em condições suficiente para permitir o conjugado se ligar ao anticor- po ligado, em que o conjugado compreende um dos anticor- pos descritos anteriormente, anexado a um composto de ge- ração de sinal capaz de gerar um sinal detectável; e 4) detectar a presença de um anticorpo que pode estar presen- te na amostra biológica, detectando um sinal gerado pelo composto de geração de sinal, o sinal indicando um diag- nóstico de uma amiloidose, por exemplo, doença de Alzhei- mer no paciente. O antigeno pode ser um globulômero ou uma porção ou fragmento deste tendo as mesmas proprieda- des funcionais como o globulômero total (por exemplo, a- tividade de ligação).

A presente invenção inclui um método adicional de diagnosticar uma amiloidose, por exemplo, doença de Alzheimer em um paciente suspeito de ter uma amiloidose, por exemplo, doença de Alzheimer. Este método compreende as etapas de: 1) isolar uma amostra biológica do dito pa- ciente; 2) colocar a amostra biológica em contato com an- ti-anticorpo, em que o anti-anticorpo é especifico para um dos anticorpos descritos anteriormente, por um tempo e em condições suficiente para permitir a formação de comple- xos anti anticorpo/anticorpo, os complexos contendo anti- corpo presentes na amostra biológica; 2) adicionar um con- jugado ao complexos anti anticorpo/anticorpo resultante por um tempo e em condições suficiente para permitir o conjugado se liga ao anticorpo ligado, em que o conjugado compreende um antigeno, que se liga a um composto de ge- ração de sinal capaz de gerar um sinal detectável; e 3) detectar um sinal gerado pelo composto de geração de si- nal, o sinal indicando um diagnóstico de uma amiloidose, por exemplo, doença de Alzheimer no paciente.

Também, a presente invenção inclui um estojo com- preendendo: a) pelo menos um dos anticorpos descritos an- teriormente e b) um conjugado compreendendo um anticorpo anexado a um composto gerador de sinal, em que o anticorpo do conjugado é diferente do anticorpo isolado.

A presente invenção também engloba um estojo com- preendendo: a) um ant i-ant icorpo com um dos anticorpos descritos anteriormente e b) um conjugado compreendendo um antigeno anexado a um composto gerador de sinal. O antige- no pode ser um globulômero ou um fragmento ou porção deste tendo as mesmas características funcionais como o globulô- mero (por exemplo, atividade de ligação).

Em uma modalidade de diagnóstico da presente in- venção, um anticorpo da presente invenção, ou uma porção deste, é revestido em uma fase sólida (ou está presente em uma fase líquida). 0 teste ou amostra biológica (por exem- plo, todo o sangue, fluido cerebroespinhal, soro, etc.) é em seguida colocada em contato com a fase sólida. Se o an- tigeno (por exemplo, globulômero) estiver presente na a- mostra, tais antígenos se ligam aos anticorpos na fase só- lida e são em seguida detectados tanto por um método dire- to quanto indireto. O método direto compreende simplesmen- te detectar presença do complexo por si próprio e assim presença dos antigenos. No método indireto, um conjugado é adicionado ao antigeno ligado. O conjugado compreende um segundo anticorpo, que se liga ao antigeno ligado, anexado a um composto geração de sinal ou marcador. Caso o segundo anticorpo se ligue ao antigeno ligado, o composto gerador de sinal gera um sinal mensurável. Tal sinal em seguida indica a presença do antigeno na amostra de teste.

Exemplos de fases sólidas usados em imunoensaios de diagnóstico são materiais porosos e não porosos, partí- culas de látex, partículas magnéticas, micropartícuias (ver Patente U.S. No. 5.705.330), contas, membranas, poços microtituladores e tubos plásticos. A escolha de material da fase sólida e método de marcação o antigeno ou anticor- po presentes no conjugado, se desejado, são determinados baseado nas características de desempenho de formato de ensaio desejado.

Da maneira supranotada, o conjugado (ou reagente indicador) compreenderá um anticorpo (ou possivelmente an- ti-anticorpo, dependendo do ensaio), anexado a um composto gerador de sinal ou marcador. Este composto gerador de si- nal ou "marcador" é por si próprio detectável ou pode rea- gir com um ou mais compostos adicionais para gerar um pro- duto detectável. Exemplos de composto gerador de sinais in- cluem cromagens, radioisótopos (por exemplo, 1251, 1311, 32Ρ, 3Η, 35S e 14C), compostos quimioluminescente (por e- xemplo, acridínia), partículas (visíveis ou fluorescen- tes), ácidos nucléicos, agentes complexantes, ou catalisa- dores tal como enzimas (por exemplo, fosfatase alcalina, ácido fosfatase, peroxidase do rábano silvestre, beta- galactosidase e ribonuclease) . No caso de uso de enzima (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase do rábano silvestre), adição de um substrato cromogênico, fuorgêni- co, ou lumogênico resulta na geração de um sinal detectá- vel. Outros sistemas de detecção tais como fluorescência resolvida no tempo, fluorescência de reflecção interna, amplificação (por exemplo, reação de cadeia de polimerase) e espectroscopia Raman também são usados.

Exemplos de fluidos biológicos que podem ser testados pelos imunoensaios anteriores incluem plasma, todo o sangue, todo o sangue seco, soro, fluido cerebro- espinanhal ou extratos aquosos ou organo aquosos de teci- dos e células.

A presente invenção também engloba um método para detectar a presença de anticorpos em uma amostra de teste. Este método compreende as etapas de: (A) colocar a amostra de teste suspeita de conter anticorpos em contato com an- ti-anticorpo específico para os anticorpos na amostra do paciente em tempo e condições suficientes para permitir a formação de complexos antíanticorpo/anticorpo, em que o anti-anticorpo é um anticorpo da presente invenção que se liga a um anticorpo na amostra do paciente; (b) adicionar um conjugado aos complexos anti anticorpo/anticorpo re- sultantes, o conjugado compreendendo um antígeno (que se liga ao anti-anticorpo) anexado a um composto de geração de sinal capaz de detectar um sinal detectável; e (d) de- tectar a presença dos anticorpos que podem estar presentes na amostra de teste detectando o sinal gerado pelo compos- to de geração de sinal. Pode-se usar um controle ou cali- brador que compreende anticorpo para o anti-anticorpo.

Estojos também são incluídos no escopo da pre- sente invenção. Mais especificamente, a presente invenção inclui estojos para determinar a presença de antígenos (por exemplo, globulômeros) em um paciente suspeito de ter doença de Alzheimer ou umaoutra condição caracterizada por deficiência cognitiva. Em particular, um estojo para determinar a presença de antígenos em uma amostra de tes- te compreende a) um anticorpo da maneira aqui definida ou fração deste; e b) um conjugado compreendendo um segundo anticorpo (tendo especificidade para o antígeno) anexado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável. 0 estojo também pode conter um controle ou ca- librador que compreende um reagente que se liga ao antí- geno .

A presente invenção também inclui um estojo para detectar anticorpos em uma amostra de teste. 0 estojo pode compreender a) um anti-anticorpo específico (por exemplo, um da invenção em questão) para o anticorpo de interesse, e b) um antígeno ou porção deste da maneira definida ante- riormente. Um controle ou calibrador compreendendo um rea- gente que se liga ao antígeno também pode ser incluído. Mais especificamente, o estojo pode compreender a) um an- ti-anticorpo (tal como aquele da presente invenção) espe- cifico para o anticorpo e b) um conjugado compreendendo um antigeno (por exemplo, globulômero) anexado a um composto de geração de sinal capaz de gerar um sinal detectável. Novamente, o estojo também pode compreender um controle de calibrador compreendendo um reagente que se liga ao anti- geno.

0 estojo também pode compreender um recipiente tais como frasco, garrafas ou lâmina, com cada recipiente com uma fase sólida pré estabelecida, e outros recipientes contendo oa respectivas conjugados. Estes estojos podem também conter frascos ou recipientes de outros reagentes necessários para realizar o ensaio, tais como lavagem, processamento e reagentes indicadores.

Deve-se notar também que a invenção em questão não somente inclui os anticorpos de comprimento total des- critos anteriormente, mas também frações ou fragmentos destes, por exemplo, a porção Fab destes. Adicionalmente, a invenção em questão engloba qualquer anticorpo tendo as mesmas propriedades do anticorpos presentes, por exemplo, em termos de especificidade de ligação, estrutura, etc.

Vantagens da invenção:

Pode-se obter por imunização com globulômero Αβ (20-42) diferentes anticorpos monoclonais que diferem em sua tolerância ou reconhecimento de diferentes oligômeros Αβ(1-42) e Αβ oligômeros (X-42), da maneira determinada por dot blotting comparativo da maneira descrita anterior- mente. Isto permite o desenvolvimento de um anticorpo di- recionado a oligômeros Αβ N-terminalmente truncados que possuem uma relação ideal entre efeito de melhor cognição, especificidade desejada sobre outras formas e perfil míni- mo do efeito colateral. De modo surpreendente, os globulô- meros Αβ(1-42) e Αβ(12-42), a despeito de conter o elemen- to estrutural, são apenas parcialmente reconhecidos por an- ticorpos obtidos usando o globulômero Αβ(20-42) truncado adicional como antígeno.

Por restrição da forma Αβ oligomérica específica com o princípio estrutural básico (isto é, uso dos globu- lômeros Αβ N-terminalmente truncados) um perfil do anti- corpo é gerado em imunização ativa que é altamente especí- fica para formas Αβ oligoméricas. O mesmo é verdade para anticorpos monoclonais para uso em imunização passiva. A vantagem de uma estratégia específica como essa para imu- nização (ativa e passiva) é que não induzirá uma resposta imune contra monômeros Αβ, peptídeos Αβ em estados fibri- lares de agregação ou sAPPoí. Isto é vantajoso em diversas maneiras :

1) Na forma de peptídeos Αβ de placas Αβ insolú- veis em estados fibrilares de quantidade de agregação com a parte principal de todo o agrupamento de peptídeo Αβ nos cérebros AD. Uma liberação massiva de Αβ para dissolução de placas Αβ induzida por reação de anticorpos anti- Αβ com estas placas é para ser considerado como detrimental. Esta liberação massiva de Αβ cruzaria em seguida a barreira sangue-cérebro, entraria na barreira da corrente sangüínea e potencialmente aumentaria o risco de micro-hemorragias. Além do mais, no teste ELAN esta estratégia extrema de i- munização com formas de peptideo Αβ fibrilares exige can- celamento do teste por causa de 6 % dos casos com um ini- cio de ação de meningoencefalite.

2) Respostas imunes direcionadas a formas de pep- tideo Αβ monoméricas são indesejáveis, já que foi possível mostrar que o último pode exercer efeitos melhoradores de cognição

3) Respostas imunes direcionados a sAPPa são de outra forma indesejáveis, como isto pode levar a uma rea- ção com o APP de proteína precursora ocorre fisiologica- mente e assim a uma reação autoimune. Além disso, sAPPa mostrou também exercer efeitos melhoradores de cognição.

4) Uma resposta direcionada a peptideo Αβ vascu- lar na forma de CAA deve ser evitada a fim de evitar o efeito colateral indesejável de micro-hemorragias (anti- corpos contra a porção central de Αβ e que além de não se ligar a peptídeos Αβ agregados na forma de CAA induz menos micro-hemorragias quando comparado como tal contra o N- término, ver acima).

5) Anticorpos que reagem especificamente com o- ligômeros Αβ terão maior biodiponibilidade com relação à espécie Αβ patofisiologicamente relevante, como elas não serão ligadas por exemplo, a Αβ fibrilar e assim tornam- se indisponíveis para efeito terapêutico.

Informação de depósito: 0 hibridoma que produz anticorpo monoclonal 5F7 foi depositado com o American Ty- pe Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manas- sas, Virgínia 20110 on December 01, 2005 nos termos do tratado de Budapeste e receberam designação PTA-7241. A- dicionalmente, o hibridoma que produz anticorpo monoclo- nal 10F11 foi depositado com o American Type Culture Col- lection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 10801 on December 01, 2005 nos termos do Tratado de Buda- peste e receberam designação PTA-7239. Adicionalmente, o hibridoma que produz anticorpo monoclonal 4B7 foi deposi- tado com o American Type Culture Collection, 10801 Uni- versity Boulevard, Manassas, Virgínia 10801 em 01 de de- zembro de 2005 nos termos do Tratado de Budapeste e rece- beram designação PTA-7242, e o hibridoma que produz anti- corpo monoclonal 7C6 foi .depositado com o American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 10801 em 01 de dezembro de 2005 nos termos de o Tratado de Budapeste e receberam designação PTA-7240. A- dicionalmente, o hibridoma que produz anticorpo monoclo- nal 6A2 foi depositado com o American Type Culture Col- lection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 10801 em 28 de fevereiro de 2006 nos termos do Tratado de Budapeste e receberam designação PTA-7409, e o hibridoma que produz anticorpo monoclonal 2F2 foi depositado com o American Type Culture Collection, 10801 University Boule- vard, Manassas, Virgínia 10801 em 28 de fevereiro de 2006 nos termos do Tratado de Budapeste e receberam designação PTA-7408. O hibridoma que produz anticorpo monoclonal 4D10 foi depositado com o American Type Culture Collecti- on, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 10801 em 28 de fevereiro de 2006 nos termos do Tratado de Buda- peste e receberam designação PTA-7405. O hibridoma que produz anticorpo monoclonal 7E5 foi depositado com o Ame- rican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 10801 em 16 de agosto de 2006 nos ter- mos do Tratado de Budapeste e receberam designação PTA- 7809. O hibridoma que produz anticorpo monoclonal 10C1 foi depositado com o American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 10801 em 16 de agosto de 2006 nos termos de o Tratado de Budapeste e re- ceberam designação PTA-7810. O hibridoma que produz anti- corpo monoclonal 3B10 foi depositado com o American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 10801 em 01 de setembro de 2006 nos termos do Tratado de Budapeste e receberam designação PTA-7851. To- dos depósitos foram feitos a favor de Abbott Laboratori- es, 100 Abbott Park Road, Abbott Park, Illinois 60064 (US).

Nos desenhos:

Figura lmostrou cromatogramas de exclusão de ta- manho de Αβ(1-42) e Αβ(1-40). Monômero Αβ(1-42) foi dis- solvido em A) 0,1 % de NH4OH, B) 70 % de ácido fórmico C) NaOH 0,1 % e em D) Αβ(1-40) foi dissolvido em NaOH 0,1 %. Subseqüentemente, as amostras foram adicionalmente diluí- das 1:10 em NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4. Estas amos- tras foram incubadas por 5 minutos (coluna esquerda) ou 1 hora (coluna direita) após dissolução em temperatura ambi- ente, em seguida aplicadas à coluna de exclusão de tama- nho;

Figura 2A) mostrou um SDS PAGE de proteínas pa- drões (proteínas marcadoras moleculares, rota 1); prepara- ção de fibrila Αβ(1-42); controle (rota 2); preparação de fibrila Αβ(1-42) + mAb 5F7, 20 horas, 37 0C, sobrenadante (rota 3); preparação de fibrila AB (1-42) + mAb 5F7, 20 horas, 37 °C, precipitado (rota 4); preparação de fibrila Αβ(1-42) + mAb 6E10, 20 horas, 37 °C, sobrenadante (rota 5); preparação de fibrila Αβ(1-42) + mAb 6E10, 20 horas 37 °C, precipitado (rota 6); );

B) mostra os resultados da análise quantitativa de mAbs ligada a fibrilas Αβ em porcentagem de anticorpo total;

Figura 3é um diagrama bar que mostra os resulta- dos do teste de reconhecimento de objetos com camundongos APP/1 transgênicos após imunização ativa com Αβ(1-42) mo- nômeros em 0,1 % de NH4OH, globulômeros Αβ(1-42) e globu- lômeros Αβ(20-42) comparado aos camundongos tipo selvagem (controle positivo) e camundongos APPIL tratados com PBS (controle negativo), onde círculos indicam diferenças sig- nificativas de camundongos APPIL tratados com PBS e aste- riscos indicam diferenças altamente significativas do chance nível (50 %) de acordo com t-teste post-hoc depois de P<0,05 em ANOVA para diferenças entre grupos;

Figura 4mostra dot blots da reatividade de 100 pmol/VL (fileira A); 10 pmol/^L (fileira Β) ; 1 pmol/pL (fileira C) ; 0,1 pmol/>L (fileira D) e 0,01 pmol/pL (fi- leira Ε) de globulômero Αβ(1-42) (coluna 1); de monômero pré-tratado com HFIP Αβ(1-42) em F68 Plurônico (coluna 2); de globulômero Αβ(20-42) (coluna 3); de globulômero Αβ(12- 42) (coluna 4); de monômero Αβ(1-40) pré-tratados com HFIP em DMSO (coluna 5); de monômero Αβ(1-2), NH4OH (colu- na 6); de uma preparação de fibrila Αβ(1-42) (coluna 7); e de sAPPa do Sigma (coluna 8) com vários anti-soros obtidos após um imunização ativa de camundongos APPIL Tg com glo- bulômero Αβ (20-42);

Figura 5é um diagrama bar que mostra as concen- trações de peptideo Αβ(1-42) e Αβ(1-40) solúvel e insolú- vel no cérebro extraídos de camundongos Tg APPIPSI ativa- mente imunizados tanto com monômero Αβ(1-42) (0,1 % de NH4QH), globulômero Αβ(1-42), Αβ(20-42) globulômero quanto veículo como controle;

Figura 6é um diagrama bar que mostra os resulta- 10 dos do teste de reconhecimento de objetos com camundongos APP/1 transgênicos após imunização passiva com anticorpos de globulômeros anti Αβ(20-42) 5F7, 10F11, e 7C6 comparado aos camundongos de controle para A) cada anticorpo separa- damente e B) for todos os anticorpos juntamente tomados;

Figura 7A) mostra uma análise dot blot de especi- ficidade de diferente anticorpos anti- Αβ(-6Ε10, -5F7, 4B7, -10F11, -6A2, -4D10, -3B10, -2F2, -7C6, -IEb, -10C1). Os anticorpos monoclonais testados aqui foram obtidos por imunização ativa de camundongos com globulômero Αβ(20-42) seguido por seleção das células de hibridoma fundidas (ex- ceto pelo 6E10 comercial disponíveis, Signet No 9320). As formas Αβ individuais foram aplicadas em diluições em sé- rie e incubadas com os anticorpos monoclonais respectivos para reação imune:

1. Monômero Αβ(1-42), 0,1 % de NH4OH

2. Monômero Αβ(1-40), 0,1 % de NH4OH

3. Monômero Αβ(1-42), NaOH 0,1 %

4. Monômero Αβ(1-40), NaOH 0,1 %

5. Globulômero Αβ(1-42)

6. Globulômero Αβ(12-42)

7. Globulômero Αβ(20-42)

8. Preparação de fibrila Αβ(1-42)

9. sAPPa (Sigma) (primeiro dot: 1 pmol)

B) Avaliação quantitativa foi feita usando um a- nálise densitométrica da intensidade. For cada forma Αβ, apenas o dot correspondente à concentração mais baixa de antigeno foi avaliado uma vez que ele tem uma densidade relativa maior que 20 % da densidade relativa do último dot identificado oticamente de forma inequivocada do glo- bulômero Αβ(20-42) (patamar). Este valor de patamar foi determinado independentemente para cada dot-blot. 0 valor indica a relação entre reconhecimento de globulômero Αβ(20-42) e a forma Αβ respectiva para o dado o anticorpo;

Figura 8 mostra a ligação de anticorpos em con- centrações diferentes com seções transversais de o noe- córtex de pacientes com doença de Alzheimer (AD) ou camun- dongos transgênicos APP velhos:

A) Verificação de depósitos de amilóide para manchamento com vermelho Congo como placas no tecido ce- rebral e como angiopatia de amilóide cerebral (CAA) nos vasos cerebrais na linha de camundongos transgênicos APP Tg257 6 e em um paciente AD (RZ55);

B) manchamento forte de depósitos parenquimais de Αβ (placas de amilóide) em um paciente AD (RZ16) ocor- re apenas com 6G1 e o anticorpo 6E10 comercialmente dispo- nível (coluna esquerda) ao passo que anticorpos 5F7, 2F2, e 6A2 (segundo coluna), 4D10, 10F11, e 3B10 (terceira co- luna) e 7C6, 7E5, e IOCl (coluna direita) não apresenta manchamento. Todos os anticorpos foram usado a um concen- tração de 0,7 pg/mL;

C) manchamento forte de depósitos parenquimais de Αβ (placas de amilóide) em Tg2576 de 19 meses de idade ocorre apenas com 6G1 e o anticorpo 6E10 comercialmente disponíveis (coluna esquerda) ao passo que anticorpos 5F7, 2F2, e 6A2 (segundo coluna), 4D10, 10F11, e 3B10 (terceira coluna) e 7C6, 7E5, e IOCl (coluna direita) não apresenta manchamento. Todos os anticorpos foram usado a uma concentração de 0,7 pg/mL;

D)-G) Quantificação da análise de manchamento de placa Αβ nas imagens histológicas usando análise de ima- gem. Valores de densidade óticos (0 % = nenhum manchamen- to) foram calculados a partir dos valores da escala cinza de placas subtraídas por valores de escala de cinza de te- cido de fundo:

D) Manchamento a 0,7 pg/mL de anticorpo em ca- mundongos Tg2576 velhos,

E) manchamento em 3 diferentes concentrações de anticorpos em camundongos APPIL,

F) manchamento a 0,7 pg/mL de anticorpo em um paciente AD (RZ55),e

G) manchamento em 3 diferentes concentrações de anticorpos em um paciente AD (RZ16) . As diferenças entre manchamento dos anticorpos 6E10 comercialmente disponíveis (asteriscos) e 4G8 (círculos) e todos outros anticorpos (três asteriscos/círculos: controle em função de p<0,001; t-teste post-hoc de Bonferroni depois de ANOVA com p<0,001) foram estatisticamente avaliados (D,F). Em E) e G) todos os anticorpos exceto 6G1 mostraram sempre man- chamento significativamente menor do que os anticorpos 6E10 e 4G8 comercialmente disponíveis (p<0,001 em t-teste post-hoc depois de p<0,001 em ANOVA).

H) Manchamento forte de depósitos vasculares de Αβ (setas) ocorre apenas com 6G1 e o anticorpo 6E10 comer- cialmente disponível (coluna esquerda) ao passo que anti- corpos 5F7, 2F2, e 6A2 (segundo coluna), 4010, 10F11, e 3B10 (terceira coluna) e 7C6, 7E5, e 10C1 (coluna direi- ta) não apresenta manchamento. Todos os anticorpos foram usados a uma concentração de 0,7 μg/mL. Uma situação qua- litativamente similar foi encontrada em camundongos Tg2576 (não mostrada aqui);

Figura 9 Titulador de anticorpo anti-Αβ e perfil de seletividade dot-blot em plasma de camundongos TG2576 aproximadamente um ano após a imunização ativa. Amostras de plasma de camundongos Tg2576 aproximadamente um ano a- pós a última imunização com A) globulômero Αβ (20-42), Β) globulômero Αβ (12-42), C) monômero Αβ (1-42) e D) veículo, foram avaliados por anticorpos anti- Αβ produzidos e ainda presentes pelo dot-blot.

1. globulômero Αβ (1-42)

2. monômero Αβ (1-42), pré-tratado com HFIP, em 0,F68 Plurônico 1 %

3. globulômero Αβ (20-42)

4. globulômero Αβ (12-42)

5. monômero Αβ (1-40), pré tratados com HFIP, 5 mM em DMS06. monômero Αβ (1-42), 0,1 % de NH4OH

7. preparação de fibrila Αβ (1-42)

8. Αβ (Sigma); (primeiro dot: 1pmol);

Figura 10mostra uma tabela sumarizando os níveis de globulômero Αβ (20-42) no tecido cerebral de seres huma- nos tendo doença de Alzheimer e um controle não demente;

Figura 11 ilustra nucleotídeo e seqüência de ami- noácidos das cadeias pesadas e leves variáveis de anticorpos monoclonais (mAbs) da maneira a seguir (regiões determinan- tes de complementaridade (CDRs) são sublinhados em cada se- qüência de aminoácido):

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Os exemplos seguintes são para ilustrar a inven- ção, sem limitar seu escopo.

Exemplo 1: Preparação de globulômeros A) globulômero Αβ (1-42)

O peptideo Αβ (1-42) sintético (H-1368, Bachem, Bubendorf, Switzerland) foi suspenso em 100 % 1,1,1,3,3,3- hexaflúor-2-propanol (HFIP) em 6 mg/mL e incubado para so- lubilização completa sob agitação a 37 0C por 1,5 hora. 0 HFIP age como um hidrogênio-separador de ligação e é usa- do para eliminar inomogeneicidades estruturais pré exis- tentes no peptideo Αβ. HFIP foi removido por evaporação em um SpeedVac e Αβ (1-42) ré-suspenso a uma concentração de 5 mM em dimetilsulfóxido e sonicado por 20 segundos. O Αβ (1-42) pré tratado com HFIP foi diluído em salina tampona- da de fosfato (PBS) (NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) para 400 μΜ evolume 1/10 de dodecil sulfato de sódio 2 % (SDS) (em H2O) adicionado (concentração final de SDS 0,2 %). Uma incubação por 6 horas a 37 0C resultou no globulô- mero Αβ (1-42) 16120-kDa (forma pequena para oligômero globular) intermediário, o globulômero Αβ(1-42) 38148-kDa foi gerado por uma diluição adicional com três volumes de H2O e incubação por 18 horas a 37 °C. Após centrifugação a 3.000 g por 20 minutos a amostra foi concentrada por ul- trafiltração (30-kDa cortados), dializado contra NaH2PO4 5 mM, NaCl 35 mM, pH 7,4, centrifugado a 10.000 g por 10 mi- nutos e o sobrenadante compreendendo a extração do globu- lômero Αβ (1-42) 38148-kDa. Como uma alternativa para diá- lise o globulômero Αβ (1-42) 38148-kDa também pode ser pre- cipitado por um excesso de nove vezes (v/v) de solução me- tanol/ácido acético resfriada em gelo (metanol 33 %, ácido acético 4 %) por 1 hora a °C. o globulômero Αβ (1-42) 38148-kDa é em seguida precipitado (10 minutos a 16.200 g), ré-suspenso em NaH2PO4 5 mM, NaC135 mM, pH 7,4, e o pH ajustado a 7,4.

b) globulômero Αβ (1-42) reticulado O peptideo Αβ (1-42) sintético (H-1368, Bachem, Bubendorf, Switzerland) foi suspenso em 100 % 1,1,1,3,3,3- hexaflúor-2-propanol (HFIP) em 6 mg/mL e incubado para so- lubilização completa sob agitação a 37 0C por 1,5 hora. 0 HFIP age como um separador de ligação de hidrogênio e foi usado para eliminar inomogeneicidades estruturais pré exis- tente no peptideo Αβ. HFIP foi removido por evaporação em um Speed Vac e Αβ (1-42) ré-suspenso a uma concentração de 5 mM em dimetilsulfóxido e sonicado por 20 segundos. 0 pré Αβ (1-42) tratado com HFIP foi diluído em salina tamponada de fosfato (PBS) (NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) para 400 μΜ e volume 1/10 de dodecil sulfato de sódio 2 % (SDS) (em H2O) adicionado (concentração final de SDS 0,2 %). Uma incubação por 6 horas a 37°C resultou no globulômero Αβ (1-42) 16120-kDa (forma pequena para oligômero globular) intermediário, o globulômero Αβ (1-42) 38148-kDa foi gerado por uma diluição adicional com três volumes de H2O e incu- bação por 18 horas a 37°C. Reticulação do globulômero Αβ (1-42) 38148-kDa foi agora realizada por incubação com glutaraldeido 1 mM por 2 horas à temperatura ambiente de 21° (RT) seguido por etanolamina (5 mM) tratamento por 30 minutos a RT.

c) globulômero Αβ (20-42)

1,59 mL de preparação de globulômero Αβ (1-42) preparados de acordo com exemplo 1a foram misturados com 38 mL de tampão (MES/NaOH 50 mM, pH 7,4) e 200 uL de um solução de termolisina de 1 mg/mL (Roche) em água. A mis- tura da reação foi agitada a RT por 20 horas. Em seguida 80 μL de uma solução de EDTA 100 mM, pH 7,4, em água foram adicionados e a mistura foi além disso ajustada a um con- teúdo de SDS de 0,01 % com 400 pL de um solução de SDS in- tensidade 1 %. A mistura da reação foi concentrada a apro- ximadamente 1 mL por meio de um tubo Centriprep 30 kDa de 15 mL. O concentrado foi misturado com 9 mL de tampão (MES/NaOH 50 mM, SDS 0,02 %, pH 7,4) e novamente concen- trada a 1 mL. O concentrado foi dializado a 6°C contra 1 1 de tampão (fosfato de sódio 5 mM, NaCl 35 mM) em um tubo de diálise por 16 horas. O dialisato foi ajustado a um conteúdo de SDS de 0,1 % com uma solução de SDS intensida- de 2 % em água. A amostra foi centrifugada a 10.000 g por 10 minutos e o sobrenadante de globulômero Αβ (20-42) foi extraído.

d) globulômero Αβ (12-42) 2 mL de uma preparação do globulômero Αβ (1-42) preparado de acordo com exemplo Ia foram misturados com tampão 38 mL (fosfato de sódio 5 mM, cloreto de sódio 35 mM, pH 7,4) e 150 μL, de um GluC endoproteinase 1 mg/mL (Roche) em água. A mistura da rea- ção foi agitada por 6 horas a RT, e um mais 150 μί de um GIuC endoproteinase 1 mg/mL (Roche) em água foram subse- qüentemente adicionados. A mistura da reação foi agitada a RT por mais 16 horas, seguido por adição de 8 μΐϋ de uma solução de DIFP 5 Μ. A mistura da reação foi concentrada a aproximadamente 1 mL por meio de um tubo Centriprep 30 kDa de 15 mL. 0 concentrado foi misturado com 9 mL de tampão (fosfato de sódio 5 mM, cloreto de sódio 35 mM, pH 7,4) e novamente concentrado a 1 mL. 0 concentrado foi dializado a 6 0C contra 1 de tampão (fosfato de sódio 5 mM, NaCl 35 mM) em um tubo de diálise por 16 horas. 0 dialisato foi ajustado a um conteúdo de SDS de 0,1 % com uma solução de SDS intensidade 1 % em água. A amostra foi centrifugada a 10.000 g por 10 minutos e o sobrenadante de globulômero Αβ (12-42) foi extraído.

Exemplo 2: Cromatografia de exclusão de tamanho de diferentes preparações de monômero Αβ (1-42) e monômero Αβ (1-40)

Αβ (1-42), 0,1 % de NH4OH:

1 mg de Αβ (1-42) (Bachem, catalogue no. H-1368) foi dissolvido em 500 μL de 0,1 % de NH4OH em H2O e agitado por 1 minutos à temperatura ambiente. A amostra foi cen- trifugada por 5 minutos a 10.000 g. 0 sobrenadante foi co- letado. Concentração Αβ (1-42) no sobrenadante foi deter- minada de acordo com método de Bradford (BIO-RAD). amostra de 5 minutos:

20 uL de Αβ (1-42) no 0,1 % de NH4OH contendo sobrenadante foram diluídos com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 com uma concentração Αβ (1-42) de 0,2 mg/mL. A amostra foi incubada por 5 minutos à temperatura ambien- te. Em seguida 100 μΐ. foram analisados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

amostra de 1 hora:

20 uL de Αβ (1-42) no 0,1 % de NH4OH contendo sobrenadante foram diluídos com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 com um concentração Αβ (1-42) de 0,2 mg/mL. A amostra foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida 100 μί foram analisados por cromatografia de ex- clusão de tamanho (SEC).

Αβ (1-42), HCOOH 70 %:

1 mg de Αβ (1-42) foi dissolvido em 50 μL de HCO- OH 70 % em H2O e agitado 1 minutos à temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada por 5 minutos a 10.000 g. O sobrenadante foi coletado. Concentração Αβ (1-42) no so- brenadante é determinada de acordo com método de Bradford (BIO-RAD).

amostra de 5 minutos:

2 uL de Αβ (1-42) em HCOOH 70 % foram diluídos com uma concentração de 0,2 mg/mL Αβ (1-42) com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 e ajustado ao pH 7,4 com NaOH 1 M. A amostra foi incubada por 5 minutos à temperatura ambi- ente. Em seguida 100 μL foram analisados por cromatogra- fia de exclusão de tamanho. amostra de 1 hora:

2 μL de Αβ (1-42) em HCOOH 70 % foram diluídos com uma concentração de 0,2 mg/mL Αβ (1-42) com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 e ajustado ao pH 7,4 com NaOH 1 M. A amostra foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida 100 pL foram analisados por cromatografia de exclusão de tamanho.

Αβ (1-42), NaOH 0,1% :

1 mg de Αβ (1-42) (Sachem, catalogue no. H-1368) foi dissolvido em 500 μΐ, de NaOH 0,1 % em H2O e agitado 1 minutos à temperatura ambiente. A amostra foi centrifuga- da por 5 minutos a 10.000 g. 0 sobrenadante foi coletado. Concentração Αβ (1-42) no sobrenadante é determinada de acordo com método de Bradford (BIO-RAD).

amostra de 5 minutos:

20 μl de Αβ (1-42) em NaOH 0,1 % foram diluídos com uma concentração de 0,2 mg/mL Αβ (1-42) com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4. A amostra foi incubada por 5 mi- nutos à temperatura ambiente. Em seguida 100 pL foram a- nalisados por cromatografia de exclusão de tamanho.

amostra de 1 hora:

20 uL de Αβ (1-42) em NaOH 0,1 % foram diluídos com uma concentração de 0,2 mg/mL Αβ (1-42) com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4. A amostra foi incubada por 1 ho- ra à temperatura ambiente. Em seguida 100 μL foram anali- sados por cromatografia de exclusão de tamanho.

Αβ (1-40), NaOH 0,1%:

1 mg de Αβ (1-40) (Bachem, catalogue no. H-1194) foi dissolvido em 500 μL de NaOH 0,1 % em H2O e agitado 1 minutos à temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada por 5 minutos a 10.000 g. 0 sobrenadante foi coletado. Concentração Αβ (1-42) no sobrenadante foi determinada de acordo com método de Bradford (BIO-RAD).

amostra de 5 minutos:

20 μL, de Αβ (1-40) em NaOH 0,1 % foram diluídos com uma concentração de 0,2 mg/mL Ap (1-40) com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4. A amostra foi incubada por 5 mi- nutos à temperatura ambiente. Em seguida 100 μL foram a- nalisados por cromatografia de exclusão de tamanho,

amostra de 1 hora:

20 uL de Αβ (1-40) em NaOH 0,1 % foram diluídos com uma concentração de 0,2 mg/mL Αβ (1-40) com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4. A amostra foi incubada por 1 ho- ra à temperatura ambiente. Em seguida 100 μΙ. foram anali- sados por cromatografia de exclusão de tamanho.

Condições para cromatografia de exclusão de ta- manho (SEC) :

SEC coluna: Superose 12 HR 10/300 GL (Amersham, catálogo no. 17-5173-01)

Vazão: 0,5 mL/minutos

Alimentação de papel: 0,2 cm/minutos

Extinção a 214 nm: 0-0,2 unidades de absorção

Fase móvel: NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7, 4

Resultados estão mostrados na Figura 1.

A preparação de uma solução Αβ puramente monomé- rica é um grande desafio por causa da forte tendência do peptídeo Αβ, especialmente o monômero Αβ (1-42), de agre- gar nas fibrilas. No entanto, para a classificação e ca- racterização de globulômeros anti- Αβ (20-42) que discri- minam monômeros Αβ (1-42) e monômeros Αβ (1-40) a melhor preparação Αβ monomérica tecnicamente obtenivel pode ser usada. Aqui o efeito do solvente inicial do peptideo Αβ no efeito de agregação após diluição adicional em NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 foi testado. Os fornecedores de peptideo Αβ (Bachem) declaram em sua informação técnica que o Αβ (1-42) deve ser solubilizado em 0,1 % de NH4OH. Cinco minutos à temperatura ambiente (RT) após solubili- zar o Αβ (1-42) em NH4OH e diluição 1:10 adicional imedia- ta em NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 uma cromatografia de exclusão de tamanho mostrou primeiros os sinais de a- gregação Αβ (1-42) com precursores fibrilares com um pico secundário a 74kD. Αβ (1-42) monoméricas correm em um pico principal com 11 K0 e um patamar a 6kD. Após incubação por uma hora à temperatura ambiente (RT) o peptideo Αβ (1-42) em NH4OH já agregou a um alto grau com fibrilas Αβ (1-42) levando a uma perda de material detectável que não entra na coluna cromatográfica de exclusão de tamanho. Se 70 % de ácido fórmico é usado como o solvente inicial para pep- tideo Αβ (1-42) um alto grau de agregação após 1 hora a RT ocorre com apenas uma fração secundária de monômero Αβ (1-42) restante (note que o ácido fórmico por si próprio leva a uma alta absorção de fundo na comprimento de onda de detecção de proteína). O melhor solvente inicial para Αβ (1-42) para impedir agregação é NaOH 0,1 % que mesmo após 1 hora de incubação de solubilização e diluição adi- cional mostra apenas uma fração secundária de Αβ (1-42) agregado com a maioria dos Αβ (1-42) sendo ainda monoméri- cos. Um Αβ(1-40) solubilizado inicialmente em NaOH 0,1 % não mostrou sinais em todas as agregações mesmo após 1 hora a incubação RT.

Exemplo 3: Análise semi quantitativa visualizada por SDS-PAGE da discriminação de anticorpos seletivos de globulômero Αβ (20-42) para fibrilas Αβ (1-42). preparação de fibrila Αβ (1-42) :

1 mg de Αβ (1-42) (Bachem, Cat. no.: H-1368) foi dissolvido em 500 μΐι de 0,1 % de NH4OH em H2O e agitado por 1 minuto à temperatura ambiente. A amostra foi centri- fugada por 5 minutos a 10.000 g. O sobrenadante foi cole- tado. Concentração Αβ (1-42) no sobrenadante foi determi- nada de acordo com método de Bradford (BIO-RAD).

100 pL de Αβ (1-42) em 0,1 % de NH4OH foram mis- turados com 300 μ!· de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 e ajustados ao pH 7,4 com HCl 2 %. A amostra foi em seguida incubada a 37 0C por 20 horas. Depois que a amostra foi centrifugada por 10 minutos a 10.000 g. 0 sobrenadante foi descartado, e o resíduo foi misturado com 400 μί de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4, ré-suspenso por agita- ção vigorosa ("vortexando") por 1 minutos e centrifugado por 10 minutos a 10.000 g. O sobrenadante foi descartado e o resíduo foi misturado com 400 μΐϋ de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4, ré-suspenso por agitação vigorosa ("vorte- xando") por 1 minutos e centrifugado por 10 minutos a 10.000 g uma vez mais. O sobrenadante foi descartado. 0 resíduo foi ré-suspenso em 380 pL de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 e ficou pronto por agitação vigorosa ("vortexando").

Ligação de anticorpos anti- Αβ com fibrilas Αβ (1-42) :

40 μL de preparação de fibrila Αβ (1-42) foram diluídos com 160 μL de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, Tween 20 0,05 %, pH 7,4 e agitados 5 minutos à temperatura ambien- te, em seguida a amostra foi centrifugada por 10 minutos a 10.000 g. O sobrenadante foi descartado, e o resíduo foi ré-suspenso em 95 μL de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, Tween 20 0, 05 %, pH 7,4. Ré-suspensão foi ficou pronta por agitação vigorosa ("vortexando").

Alíquotas de 10 pL da preparação de fibrila fo- ram cada misturadas com:

a) 10 μL de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4

b) 10 μL de 0,5 pg/uL de 5F7 em NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4

c) 10 μL de 0,5 pg/uL de 6E10 (Signet Nr.: 9320) em NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4

As amostras foram incubadas a 37°C por 20 ho- ras, em seguida centrifugadas por 10 minutos a 10.000 g. Os sobrenadantes foram coletados e misturados com 20 μι de tampão de amostra SDS-PAGE. Os resíduos foram mistura- dos com 50 μL de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, 0,025 % Tween 20, pH 7,4 e ré-suspenso "vortexando", em seguida as amos- tras foram centrifugadas por 10 minutos a 10.000 g. Os so- brenadantes foram descartados, e os resíduos foram mistu- rados com 20 μΐϋ de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, 0, 025 % Tween 20, pH 7,4, em seguida com 20 pL de tampão de amos-

tra SDS-PAGE. As amostras foram aplicadas a um gel 5 Tris/glicina 4 - 20 % para eletroforese.

Parâmetros para SDS-PAGE: tampão de amostra SDS: 0,3 g SDS

4 mL de 1 M Tris/HCl pH 6,8 8 mL de glicerina 1 mL de bromfenol blue 1 % em etanol

Encher com H2O adicionar 50 mL de Gel Tris/glicina 4-20 %: (Invitrogen, Cat. no.: EC6025BOX) tampão de eletroforese:7,5 g de Tris 36 g de Glicina 2,5 de g SDS

Encher com H2O adicionar 2,5 I

O gel é corrido a uma corrente constante de 20 mA.

Manchamento dos géis: Azul de Coomassie R250 Resultados estão mostrados na Figura 2.

Análise semi quantitativa de diferentes anticor- pos anti-Αβ e sua discriminação de fibrilas Αβ (1-42). Po- sições de anticorpos, fibrilas Αβ (1-42) e monômeros Αβ (1-42) são marcados na borda do gel. Por causa de seu ta- manho, fibrilas Αβ (1-42) não podem entrar no gel SDS-PAGE e podem ser vistos no segmento do gel.

1. Marcador

2. Αβ (1-42) preparação de fibrila; controle 3. preparação de fibrila Αβ (1-42); + mAb 5F7; 20 °C; sobrenadante

4. preparação de fibrila Αβ (1-42); + mAb 5F7; 20 °C; precipitado

5. preparação de fibrila Αβ (1-42); + mAb 6E10; 37 °C; sobrenadante

6. 6. Αβ (1-42) preparação de fibrila; + mAb horas 37 0C; precipitado

A ligação relativa com fibrila tipo Αβ foi ava- liada a partir de análise SDS-PAGE medindo os valores de densidade ótica (OD) da cadeia pesada dos anticorpos na fibrila ligada (precipitado-fração) e nas frações sobrena- dantes após centrifugação. Anticorpos que foram ligados com as fibrilas Αβ devem ser coprecipitados com as fibrilas Αβ e então são encontrados na fração de precipitado ao pas- so que anticorpos ligados a fibrila não Αβ (livre) são en- contrados nos sobrenadante. A porcentagem do anticorpo li- gado com fibrilas Αβ foi calculada de acordo com a seguin- te fórmula:

Porcentagem de anticorpo ligado a fibrilas Αβ = ODfração de fibrila Xl00 %/ (0DFfração de fibrila + ODfragao sobrenadante)

Este procedimento foi realizado pelos mAbs 6E10 (Signet, Cat. no.: 9320), 5F7, 2F2, 6A2, 4010, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 e 10C1.

No cérebro com doença de Alzheimer as fibrilas Αβ são um componente principal do agrupamento peptideo Αβ to- tal. Combatendo estas fibrilas por anticorpos anti Αβ o risco de efeitos colaterais negativos é elevado por causa de uma liberação de altas quantidades de Αβ que subseqüen- temente podem aumentar o risco de micro-hemorragias. Um maior risco para micro-hemorragias foi observado em uma abordagem de imunização ativa com agregados fibrilares do peptideo Αβ (Bennett and Holtzman, 2005, Neurology, 64, 10-12; Orgogozo J, Neurology, 2003, 61,46-54; Schenk et al., 2004, Curr Opin Immunol, 16, 599-606).

Ao contrário do anticorpo comercialmente disponí- vel 6E10 (Signet 9320) que reconhece um epitopo Αβ linear entre AA1-17, o anticorpo seletivo do globulômero Αβ (20- 42) 5F7 (que atualmente tem o seletividade mais baixa para globulômeros Αβ (20-42) sobre outras formas Αβ) não se li- ga a fibrilas Αβ (1-42) em um experimento de co- precipitação. Isto é mostrado pelo fato de que o anticorpo 5F7 após uma incubação com fibrilas Αβ (1-42) permanece a- pós uma etapa de precipitação no sobrenadante e não é co- precipitado em virtude de estar ligado às fibrilas Αβ (1- 42) .

Exemplo 4: Análise de desempenho cognitivo em ca- mundongos por meio de um teste de reconhecimento de obje- tos após imunização ativa com monômero Αβ (1-42) (0,1 % de NH4OH), globulômero Αβ (1-42) ou globulômero Αβ (20-42) em comparação com tipo selvagem.

Nestes experimentos, camundongos que sobre ex- pressam APP humano com uma mutação do ponto foram usados. A mutação do ponto refere-se a aminoácido 717 (substituição de isoleucina por valina) e foi encontrado em uma família de Londres onde ela leva a inicio de ação de AD antes do inicio da sexta década de vida (Mullan et al., Nature Ge- netics 2 (1992) 340-342). O camundongos transgênicos, aqui referidos como APP/1, foram criados by e primeiramente descrito em Leuven (Moechars et al. , J. Biol. Chem. 274 (1999) 6483-6492) . Camundongos APPIL fêmeos foram submeti- dos a imunização ativa em 6 semanas de idade.

Os camundongos receberam tanto 100 pg de monômero Αβ (1-42) (0,1 % de NH4OH), globulômero Αβ (1-42) quanto globulômero Αβ (20-42) em salina tamponada de fosfato (PBS) misturado com uma quantidade igual de adjuvante de Freund intraperitonialmente completo, seguido por injeções intensificadoras com a mesma quantidade de antigeno e em adjuvante de Freund incompleto por toda terceira semana durante três meses. Por todo o curso de tempo do experi- mento o animais foram mantidos em condições padrões em um ciclo dia/noite revertido (14 horas de leve começando a 7 pm/10 horas de escuridão). 0 ganho de peso corpóreo sobre o tempo do experimento foi como esperado e não diferiu de um grupo de controle que recebeu PBS/adjuvante sozinho, sugerindo que o tratamentos com antigeno foram bem tolera- dos .

Aos 4,5 meses de idade a capacidade cognitiva dos camundongos foi testada por um teste de reconhecimento de objetos da maneira descrita na tecnologia (Dewachter et al. Journal of Neuroscience 22 (2002) 3445-3453). Com esta finalidade, camundongos foram acostumados a uma arena e em seguida expostos por 10 minutos a uma fase de aquisi- ção durante a qual eles foram individualmente colocados na arena que agora continha dois elementos idênticos (pirâmi- de azul, cubo verde, cilindro amarelo de tamanho similar, ca. 4 cm). A duração e freqüência com a qual o camundongo explorou os objetos foram registrados. Durante a fase de retenção, 2,5 horas depois, camundongos retornaram à are- na que agora continha, além do objeto conhecido, um objeto desconhecido selecionado aleatoriamente dos outros obje- tos. Reconhecimento do novo objeto foi registrado como o tempo durante o qual o camundongo foi explorando o objeto velho com relação ao tempo total (exploração de objeto ve- lho e novo). 0 "índice de reconhecimento" expressa esta relação (tempo para objeto novo/tempo total). Um camun- dongo que não lembra do objeto conhecido vai considerá-lo igualmente interessante como o objeto novo e gastará uma quantidade igual de tempo ao explorá-lo, em outras pala- vras, apresentará um índice de reconhecimento de 50 %. Um camundongo que lembra o objeto conhecido vai considerá-lo como não interessante e então mostrar um índice de reco- nhecimento significativamente maior. Camundongos APRIL são conhecidos por serem cognitivamente deficientes aos 4,5 meses de idade e apresentam um índice de reconhecimento na dimensão do nível aleatório, isto é, 50 %.

Os resultados estão mostrados na Figura 3.

Teste de reconhecimento de objetos em camundon- gos. 0 teste reporta reconhecimento de um objeto conhecido em comparação com um desconhecido, medido em termos de comportamento explorativo durante uma fase de teste de 10 minutos. 0 índice de reconhecimento é definido como a por- centagem de tempo que o camundongo gasta explorando o ob- jeto desconhecido com relação ao tempo gasto explorando ambos objetos. 0 objeto conhecido foi explorado pelo ca- mundongo durante um fase de aquisição de 10 minutos três horas antes da fase de teste. Cinco grupos de camundongos (número η dado abaixo nas colunas) foram comparados. Ca- mundongos C57BII6 normais (tipo selvagem) apresentam um alto RI significativamente diferente do nível aleatório (50 %, isto é, vezes igual de exploração gasto tanto em objeto conhecido quanto em objeto desconhecido) (*** = ρ < 0,001; teste t de Student) . Os outros quatro grupos de AΡΡ camundongos transgênicos foram submetidos a imuniza- ção ativa três meses antes. Os imunógenos usados foram mo- nômero Αβ(1-42), globulômero Αβ (1-42) e -globulômero Αβ (20-42). Salina tamponada de fosfato (PBS) foi usada como controle. Diferenças significativas entre PBS e os outros grupos são indicadas com círculos: ° = ρ < 0,05; 00 = ρ < 0,01 (teste t post-hoc depois de ρ < 0,05 em ANOVA).

camundongos APPIL são conhecidos por mostrar, ao contrário dos camundongos não transgênicos, um deficiência cognitiva a 4,5 meses de idade, resultados da classifica- ção próximos do nível aleatório (isto é, 50 % índice de reconhecimento) . De fato, os camundongos tratados com PBS mostraram comportamento aleatório, ao contrário dos ca- mundongos não transgênicos (tipo selvagem). Imunização com globulômero Αβ(1-42) nativo, bem como com globulômero Αβ(20-42) resultou em um reconhecimento de objetos signi- ficativamente melhorado em camundongos APPIL.

Como ambas as preparações de globulômero (nati- vos e truncados) resultaram em melhoria de memória em a- nimais transgênicos APP e mesmo superior reconhecimento em animais tratados com globulômero Αβ (20-42), é razoável considerar que indução de anticorpos contra globulômero Αβ (20-42) truncado produzirá o melhor resultado, e que i- munização passiva com anticorpos que reagem especificamen- te com esta espécie representa a estratégia de tratamento ideal.

Exemplo 5: Análise Dot-Blot do perfil de anticor- pos para diferentes formas Αβ após um imunização ativa de camundongos APPIL Tg com globulômero Αβ(20-42).

Após imunização de camundongos (comparar exemplo 4) de camundongos APPIL (Moechars at al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 6483-6492) com diferente formas de Αβ, amostras de plasma foram avaliadas com relação a anticorpos anti- Αβ. Com esta finalidade, séries de diluição da Formas Αβ(1-42) individuais variando de 100 pmol/uL a 0,01 pmol/uL em PBS suplementado com 0,2 mg/mL BSA foram fei- tas. 1 yL de cada amostra foi manchado em uma membrana de nitrocelulose. Para detecção, amostras de plasma de camun- dongo correspondentes foram usadas (diluídas 1:400). 0 i- muno manchamento foi feito usando fosfatase alcalina con- jugado anti-camundongo-IgG e o reagente de manchamento NBTIBCIP.

padrões Αβ para dot-blot:

1. globulômero Αβ(1-42) A preparação do globulômero Αβ(1-42) é descrita no exemplo la.

2. monômero Αβ(1-42) pré-tratado com HFIP em Plurônico F68

3 mg de Αβ (1-42), (Bachem Inc.; cat. no. H-1368 ) foram dissolvidos em 0,5 mL de HFIP (6 mg/mL suspensão) em um tubo Eppendorff de 1,7 mL e foi agitado (Misturado- ra Eppendorff Thermo, 1.400 rpm) por 1,5 hora a 37 0C até que uma solução clara fosse obtida. A amostra foi seca em um concentrador SpeedVac (1,5 h) e ré-suspenso em 13,2 μL DMS0, agitado por 10 segundos, seguido por sonificação (20 segundos), e agitação (por exemplo, em misturadora Ep- pendorff Thermo, 1.400 rpm) por 10 minutos. 6 mL de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; 0,F68 Plurônico 1 %; pH 7,4 foram adi- cionados e agitados por 1 hora à temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada por 20 minutos a 3.000 gramas. O sobrenadante foi descartado e o precipitado resolvido em 0,6 mL de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; F68 Plurônico 1 %, pH 7,4. 3,4 mL de H2O foram adicionados e agitados por 1 hora à temperatura ambiente seguido por 20 minutos de cen- trifugação a 3.000 gramas. Oito alíquotas de cada 0,5 mL do sobrenadante foram armazenadas a - 20° para uso poste- rior.

3. Globulômero Αβ(20-42) A preparação do globulômero Αβ(20-42) está des- crita no exemplo 1c.

4. Globulômero A β (12-42) está descrita no exem- plo 1d. 5. Monômero Αβ(1-40) pré-tratado com HFIP, 5 mM em DMSO

1 mg Αβ(1-4 0), (Bachem Inc, cat. no. H-1194) foi suspenso em 0,25 mL de HFIP (4 mg/mL suspensão) em um tu- bo Eppendorff. 0 tubo foi agitado (por exemplo, em mistu- radora Eppendorff Thermo, 1.400 rpm) por 1,5 hora a 37 0C para obter uma solução clara e em seguida seca em um aspi- rador de pó (1,5 h). A amostra foi ré dissolvida em 46 yL DMSO (21,7 solução mg/mL = 5 mM), agitada por 10 segundos e subseqüentemente sonicada por 20 segundos. Após 10 minu- tos de agitação (por exemplo, em uma misturadora Eppen- dorff Thermo, 1.400 rpm) a amostra é armazenada a -20 0C para uso posterior.

6. Monômero Αβ(1-42), 0,1 % de NH4OH

1 mg de Αβ (1-42) (Bachem Inc., cat. no. H-1368) foi dissolvida em 0,5 mL 0,1 % de NH4OH em H2O (recém- preparado) (2 mg/mL) e imediatamente agitada por 30 segun- dos à temperatura ambiente para obter uma solução clara. A amostra foi armazenada a -20 0C para uso posterior.

7. Fibrilas Αβ(1-42)

1 mg Αβ (1-42) (Bachem Inc. Catalog Nr.: H-1368) foi dissolvido em 500 pL de NH4OH 0,1 % aquoso (Tubo Ep- pendorff) e a amostra foi agitada for 1 minutos à tempe- ratura ambiente. 100 μί desta solução de Αβ(1-42) recém- preparado foram neutralizados com 300 μL de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM, pH 7,4. O pH foi ajustado ao pH 7,4 com HCl 1 %. A amostra foi incubada por 24 horas a 37 0C e centrifu- gada (10 minutos a 10.000 g). 0 sobrenadante foi descarta- do e a fibrila precipitada ré-suspensa com 400 pL de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM, pH 7,4 vortexando por 1 minu- tos .

8. sAPPa

Suprido pela Sigma (cat. no. S9564; 25 pg em NaH2PO4 20 mM/ NaCl 140 mM; pH 7,4). O sAPPa foi diluído com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4, 0,2mg/mL BSA em 0,1 mg/mL (= 1 pmol/pL) .

Dot blot de materiais: Padrões Αβ:

Diluição serial de antígenos Αβ em NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4+ 400,2 mg/mL BSA

1) 100 pmol/pL

2) 10 pmol/pL

3) 1 pmol/pL

4) 0,1 pmol/pL

5) 0,01 pmol / μ!. Nitrocelulose:

Meio de transferência Trans-Blot, Nitrocellulose Membrane Pure (0,45 pm) ; BIO-RAD AP Anti-Camundongo: AQ330A (Chemicon) Reagente de detecção: Comprimidos NBTIBCIP ( Roche) Albumina Sérica Bovina, (BSA):

A-7888 (SIGMA) Reagente de bloqueio: 5 % leite de baixa gordura em TBS Soluções de tampões:

TBS

Tris 25 mM / HCl - tampão pH 7,5

+ 150 mM de NaCl

TTBS

Tris 25 mM / HCl - tampão pH 7,5

+ 150 mM de NaCl

+ 0,05 % Tween 20

PBS + 0,2 mg/mL BSA

NaH2PO4 20 mM tampão pH 7,4

NaCl 140 mM

+ 0,2 mg/mL BSA

Solução de anticorpo I:

Amostras de plasma de camundongos de um estudo de imunização ativa com globulômero Αβ(20-42) (diluídas 1:400 em 20 mL leite de baixa gordura 1 % em TBS)

Solução de anticorpo II:

diluição 1:5.000

AP Anti-Camundongo em leite de baixa gordura 1 % em TBS

Procedimento Dot blot:

1) 1 μL; cada dos diferentes padrões AR (em suas 5 diluições em série) foi analisado em dot blot sobre a mem- brana de nitrocelulose em um distância de aproximadamente 1 cm uns dos outros.

2) Os pontos dos padrões de Αβ foram secos natu- ralmente na membrana de nitrocelulose em ar por pelo menos 10 minutos à temperatura ambiente (RT) (= dot blot) 3) bloqueio: 0 dot blot foi incubado com 30 mL leite de baixa gordura 5 % em TBS por 1,5 hora a RT.

4) Lavagem:

A solução de bloqueio foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL TTBS por 10 minutos a RT

5) Solução de anticorpo I:

O tampão de lavagem foi descartado e o dot blot foi incubado com a solução de anticorpo I por toda a noite à RT.

6) Lavagem:

O solução de anticorpo I foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL TTBS por 10 minu- tos a RT. O solução de lavagem foi descartada e o dot blot 15 foi incubado sob agitação com 20 mL TTBS por 10 minutos a RT. A solução de lavagem foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL TBS por 10 minutos a RT.

7) Solução de anticorpo II:

O tampão de lavagem foi descartado e o dot blot foi incubado com solução de anticorpo II por 1 hora à RT

8) Lavagem:

A solução de anticorpo II foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL TTBS por 10 minu- tos a RT. A solução de lavagem foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL TTBS por 10 minutos a RT. A solução de lavagem foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL TBS por 10 minutos a RT.

9) Desenvolvimento: A solução de lavagem foi descartada. Um comprimi- do NBT/BCIP foi dissolvido em 20 mL de H2O e o dot blot foi incubado por 5 minutos com esta solução. 0 desenvolvi- mento foi interrompido por lavagem intensiva com H2O.

Os resultados estão mostrados na Figura 4. Análise Dot blot de anticorpos anti-Αβ produzidos após imunização ativa de camundongos com globulômero Αβ (20-42) para avaliar sua especificidade no sentido de diferente formas de Αβ. As formas individuais de Αβ foram manchadas em diluições em série e incubadas com o plasma de camundongo correspondente contendo anticorpos anti-Αβ produzidos durante reação imune. 0 dot blots individuais correspondem a diferentes indivíduos camundongos imuniza- dos .

1. Globulômero Αβ(1-42)

2. Monômero Αβ(1-42), pré-tratado com HFIP, em 0,F68 Plurônico 1 %

3. Globulômero Αβ (20-42)

4. Globulômero Αβ(12-42)

5. Monômero Αβ(1-40), pré-tratado com HFIP, 5 mM em DMSO

6. Monômero Αβ(1-42), 0,1 % de NH4OH

7. Preparação de fibrila Αβ(1-42)

8. sAPPa (Sigma); (primeiro ponto 1 pmol)

No estudo de imunização ativa de camundongos Tg APP/1 demonstraram que imunização com globulômero Αβ(20- 42) leva ao melhor resultado no alívio de uma deficiência cognitiva nestes camundongos, comparado ao tratamento de PBS. Amostras de plasma de camundongos Tg ΆΡΡ/1 após serem ativamente imunizados com globulômero Αβ(20-42) apresentam um perfil do anticorpo (reconhecimento predominante de globulômero Αβ(20-42) e globulômero Αβ(12-42)) que se pa- rece com a do globulômero Αβ(20-42) mAbs aqui reivindica- do.

Exemplo 6: Concentração de solúvel e insolúveis Αβ (1-42) e Αβ (1-40) peptideo nos extratos de cérebro de camundongos APP/PS1 Tg ativamente imunizados tanto com mo- nômero Αβ (1-42), globulômero Αβ(1-42), globulômero Αβ(20- 42) quanto com veiculo como controle.

40 camundongos fêmeas de um modelo de camundongo transgênico duplo de doença de Alzheimer (camundongos Tg APP / PSI) em fundo de FVBxC57BI16J com uma idade de 4 me- ses foram usados para este estudo. Os camundongos Tg APP/PSI contêm a forma do aminoácido 695 de' APP humano com a Mutação V7171 (posição referindo-se à isoforma APP mais comprida) e além do mais o gene Presenilina 1 humano com a mutação A264E. Ambos os genes estão sob controle do promotor Thyl. Os camundongos foram gerados e caracteriza- dos em um dos laboratórios da fundação reMYND, o Experi- mental Genetics Group, Campus Gasthuisberg, Catholic Uni- versity Leuven, pelo Prof. Fred Van Leuven et al.

Todos camundongos foram genotipados por reação de cadeia de polimerase (PCR) na idade de 3 semanas e re- ceberam um número de identidade exclusivo, uma vez os re- sultados de PCR foram conhecidos.

Camundongos tiveram livre acesso a água pré- filtrada e estéril (lâmpada UV) e comida de camundongo pa- drão. 0 alimento foi armazenado sob condições secas e frias em uma sala de armazenamento bem ventilada. A quan- tidade de água e alimento foi verificada diariamente, su- prida quando necessária e espontaneamente refrescada duas vezes por semana.

Camundongos foram alojados sob um ritmo dia e noite invertido: 14 horas luz/10 horas escuridão, come- çando às 7 p.m., em gaiolas metálicas padrões tipo RVS T2 (área de 540 cm2). As gaiolas são equipadas com pisos só- lidos e camada de forragem. 0 números camundongos por gaiola foi limitado de acordo com a legislação sobre bem estar animal. Cinco dias antes do inicio de ação do teste de comportamento, camundongos foram novamente engaiolados em gaiolas macrolon Tipo 2 e transportado para o laborató- rio a fim de adaptarem ao ambiente do laboratório em pre- paração para o teste de comportamento.

Os camundongos receberam tanto 100 pg de monômero Αβ (1-42) (0,1 % de NH4OH), A3(l-42) globulômero quanto glo- bulômero Αβ(20-42) em salina tamponada de fosfato (PBS) misturados com um quantidade igual de adjuvante de Freund intraperitonialmente completo, seguido por injeções in- tensificadoras com a mesma quantidade de antigeno em ad- juvante de Freund incompleto por toda terceira semana du- rante quatro meses. Bioquímica β

0 Αβ (1-40) e Αβ(1-42) na fração solúvel de um hemisfério foi determinado por ELISA. Além do mais, o Αβ(1-40) e Αβ (1-42) da fração de membrana insolúvel de 1 hemisfério foram determinados por ELISA.

Os camundongos foram anestesiados com uma mistura 2:1:1 de Ketalar (ketamin), Rompun (xilazina 2 %) e atro- pina e lavados trans-cardialmente com soro fisiológico a 4°C. Isto foi realizado para remover sangue dos vasos ce- rebrais, um procedimento que não tem influência na inte- gridade do órgão.

Fluido cerebroespinhal (CSF) foi coletado por meio de um incisão nos músculos do pescoço, entre o crânio e a primeira vértebra cervical. Uma perfuração na cisterna magna foi feita com um agulha calibre 26 e 10-20 μL de CSF foram coletados com um pipeta de vidro fina.

Sangue foi coletado por meio de uma perfuração no coração e uma seringa de 1 mL em tubos Eppendorf re- vestidos de heparina. O sangue foi centrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 5 minutos. O soro foi armazenado a -70 °C.

Os camundongos foram lavados transcardialmente com soro fisiológico a 4°C.

O cérebro foi removido do crânio e metencéfalo e cérebro anterior foram separados por um corte no plano co- ronal/frontal. O cerebelo foi descartado. O metencéfalo foi dividido uniformemente em hemisfério direito e esquer- do usando um corte sagital da linha média.

Um hemisfério foi imediatamente imerso em nitro- gênio liquido e armazenado a -70 °C até análise bioquími- ca.

Homogeneização e fracionamento de um hemisfério do cérebro Cérebros foram homogeneizados usando um Potter, um tubo de vidro (sem detergente, 2 cm3) e um homogeneiza- dor mecânico (650 rpm). Um volume de 6,5 χ 1/2 peso de cé- rebro 20 mM tampão Tris/HCl recém-preparado (pH 8,5) com inibidores de proteinase (um comprimido por 50 mL de tam- pão Tris/HCl, Complete™, Roche, Mannheim, Alemanha) foi usado como tampão de homogeneização.

Amostras foram transferidas de -70°C para um suporte de amostra com nitrogênio liquido e cada amostra individual foi pré-aquecida por incubação em uma bancada por um alguns segundos antes da homogeneização. 0 homoge- natos foram coletados em tubos centrífugos Beckman TLX e coletados em gelo antes da centrifugação. Entre duas amos- tras, o Potter e o tubo de vidro foram rinsadas cuidado- samente com água destilada (AD) sem detergentes e secas com papel absorvente.

Amostras foram centrifugadas em uma ultra centrí- fuga pré-resfriada (Beckman, Mannheim, Alemanha) por 1 ho- ra e 20 minutos a 48.000 rpm (130, 500 χ g) a 4°C. Por causa de um número limitado de suportes de centrífuga (N=8), as amostras foram classificadas pelo peso do cére- bro (para equilibrar a centrífuga) e randomizadas a fim de dividir os diferentes grupos de tratamento sobre as diferentes sessões de centrifugação.

O sobrenadante (fração solúvel contendo peptí- deos de APP e amilóide secretado) foi separado do preci- pitado (fração de membrana contendo fragmentos APP liga- dos na membrana e peptídeos amilóide associados a placa no caso de camundongos idosos). 0 sobrenadante foi dividido sobre dois tubos dos quais um foi armazenado a -20 0C como reserva e os outros foram processados adicionalmente para cromatografia de coluna para concentrar os peptideos ami- lóide.

Os pesos dos cérebros, volume de tampão Tris/HCl usado, sessões de centrifugação (marcadas por cor) e fra- ção solúvel do volume usado para cromatografia de coluna são dados exemplarmente na tabela seguinte.

<table>table see original document page 163</column></row><table>

Colunas de fase reversa pequenas(cartuchos C18- Step-Pack Vac 3cc, Waters, Massachusetts, MA) foram mon- tados em um sistema de vácuo e lavadas com acetonitrila 80 % em ácido trif luoracético 0,1 % (A-TFA) seguido com TFA 0,1 % duas vezes. Em seguida, as amostras foram apli- cadas e as colunas foram lavadas sucessivamente com A-TFA 5 % e 25 %. Peptideos amilóide foram eluidos com A-TFA 75 % e os eluidos foram coletados em tubos de 2 mL em gelo. Eluidos foram liofilizados em um concentrador SpeedVac (Savant, Farmingdale, NY) por toda a noite e dissolvidos novamente em 330 μL da amostra do diluente fornecido com os estojos ELISA. Os precipitados foram adicionalmente fracionados em diferentes frações de membrana: fração de membrana A (MFA), fração de membrana B (MFB) contendo APP de compri- mento total e fração de membrana C (MFC) contendo amilói- de associado com placa. Então o precipitados foram dis- solvido em TBS tampão com inibidores de proteinase (1 com- primido por 50 mL de TBS tampão, Complete™, Roche, Man- nheim, Alemanha) e o MFA foi dividido sobre dois tubos, dos quais um foi armazenado a -20 0C como reserva. 60 % de MFA foram adicionalmente processados com adição de NP40 (2 % do volume final) e Triton X-IOO (2 % do volume final) em TBS com inibidores de proteinase e centrifuga- dos por uma hora a 27.000 rpm (98 1OOO χ g) em uma ultra centrifuga Beckman a 4°C usando um rotor oscilante (SW60). O sobrenadante (MFB) foi separado do precipitado (MFC) e ambos foram armazenados a -20 0C.

Os pesos do cérebro, 60 % do peso do cérebro, os volumes tampão TBS + PI + NP40 + Triton X-100 usado e as sessões de centrifugação (marcadas pela cor) são dados e- xemplarmente na tabela seguinte.

<table>table see original document page 164</column></row><table> ELISA de Αβ humano na fração solúvel de um hemis- fério

Para quantificar a quantidade de Αβ(1-40) humano e Αβ(1-42) um ano na fração solúvel dos homogenatos do cé- rebro e/ou em fluido cerebroespinhal (CSF), estojos Enzy- meLinked-Imunosorvent-Assay (ELISA) comercialmente dispo- níveis foram usados (h Amilóide β40 ou β42 ELISA alta sen- sibilidade, The Genetics Company, Zurich, Suiça). 0 ELISA foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Re- sumidamente, padrões (uma diluição de sintética Αβ(1-40) ou Αβ(1-42) e amostras foram preparados em uma placa de polipropileno de 96 poços sem capacidade de ligação de proteína (Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha). As diluições padrões com concentrações finas de 1.000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 e 15,6 pg/mL e as amostras foram pre- paradas na amostra diluente, fornecida com o estojo ELISA, a um volume final de 60 μL. Uma vez que os níveis de ami- lóide aumentam com a idade do camundongo e uma vez que a real avaliação exige que as leituras das amostras estejam dentro da parte linear da curva padrão, as amostras para análise de Αβ(1-40) foram diluídas 1:3, as amostras para análise de Αβ(1-42) foram diluídas 1:6.

Amostras, padrões e materiais brutos (50 yL) fo- ram adicionados à placa de polistirol revestida anti-Αβ (anticorpo de captura reconheça seletivamente a extremida- de C-terminal do antígeno) além de um conjugado anti-Αβ- anticorpo seletivo (anticorpo de detecção biotinilado) e incubadas por toda a noite a 4 0C a fim de permitir a for- mação do complexo anticorpo-amilóide-anticorpo. No dia se- guinte, um Conjugado Streptavidina-Peroxidase foi adicio- nado, seguido 30 minutos depois pela adição de uma Mistura TMB/peróxido, resultando na conversão do substrato em um produto colorido. Esta reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico (IM) e a intensidade dá cor foi medida por meio de fotometria com uma leitora ELISA com um filtro de 450 nm. A quantificação do conteúdo Αβ das amostras foi obtida comparando-se a absorbância com a curva padrão fei- ta com Αβ(1-40) ou Αβ(1-42) sintético.

ELISA Αβ humano nas frações insolúveis de um he- misfério

Para quantificar a quantidade de Αβ(1-40) humano e Αβ(1-42) humano na fração de membrana insolúvel dos ho- mogenatos do cérebro, as amostras MFC foram adicionalmente processadas e dissolvidas em Guanidina 8 M em 80 mM Tris/HCl. Subseqüentemente, amostras foram incubadas por 3 horas em uma termo misturadora a 25°C e pipetadas para cima e para baixo com uma pipeta de 100 uL a cada hora pa- ra dissolver o MFC precipitado no tampão de guanidina. Fi- nalmente, as amostras foram centrifugadas por apenas 1 mi- nuto a 4.000 rpm para remover sujeira.

Peso do cérebro, o peso do precipitado MFC e o volume de tampão de guanidina 8 M são dados exemplarmente na tabela seguinte.

<table>table see original document page 166</column></row><table> <table>table see original document page 167</column></row><table>

Para quantificar a quantidade Αβ(1-40) humano e Αβ(1-42) humano em amostras finais, estojos Enzime-Linked- Immunosorbent-Assay (ELISA) comercialmente disponíveis fo- ram usados (h Amilóide β40 ou β42 ELISA de alta sensibili- dade. 0 Genetics Company, Zurich, Suiça). 0 ELISA foi rea- lizado de acordo com o protocolo do fabricante, exceto pe- la preparação dos padrões (uma diluição de Αβ(1—40) ou Αβ(1-42) sintéticos. As amostras foram preparadas na amos- tra diluente, fornecida com o estojo ELISA, em um volume final de 60 pL. Uma vez que guanidina influencia os valo- res OD da curva padrão, as diluições padrões com concen- trações finais de 1,000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 e 15,6 ug/mL foram preparadas em amostra diluente com a mesma concentração de guanidina das amostras. Isto foi realizado em uma placa de polipropileno de 96 poços sem capacidade de ligação de proteína (Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha).

Uma vez que níveis de amilóide aumentam com a idade do camundongo e uma vez que a real avaliação exige que as leituras das amostras estão na parte da curva pa- drão, as amostras para análise de Αβ(1-40) insolúveis e Αβ (1-42) foram diluídas 1:500.

As amostras, padrões e materiais brutos (50 yL) foram adicionadas à placa de politirol anti-Ap-revestidas (anticorpo de captura reconhece seletivamente a extremida- de C-terminal do antígeno) além de um conjugado anti-Αβ- anticorpo seletivo (anticorpo de detecção biotinilado) e incubadas por toda a noite a 4°C a fim de permitir a for- mação do complexo anticorpo-amilóide-anticorpo. No dia se- guinte, um conjugado streptavidina-peroxidase foi adicio- nado, seguido 30 minutos depois pela adição de um mistura TMB/peróxido, resultando na conversão do substrato em um produto colorido. Esta reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico (IM) e a intensidade da cor foi medida por meio de fotometria com uma leitora ELISA com um filtro de 450 nm. A quantificação do conteúdo de Αβ das amostras foi obtida comparando-se a absorbância com a curva padrão feita com com Αβ(1-40) ou Αβ(1-42) sintética.

Os resultados estão mostrados na figura 5 A concentração de peptídeos Αβ(1-42) e Αβ(1 - 4 0) solúveis e insolúveis no extratos do cérebro de camundongos Tg APP/PSI imunizados tanto com monômero Αβ(1-42) (0,1 % de NH4OH), globulômero Αβ(1-42), globulômero Αβ(20-42) quanto veículo como controle.

Na fração solúvel e insolúvel de um extrato do cérebro de camundongos Tg APP/PSI ativamente imunizados com globulômero Αβ(20-42) o nível de peptídeo Αβ(1-40) e Αβ(1-42) não é significativamente diferente do controle de veículo. Ao contrário, imunização com globulômero Αβ(1-42) e monômero Αβ(1-42) leva a uma redução nos níveis de Αβ(1- 40) e Αβ(1-42) no cérebro. Isto mostra que uma abordagem de imunização direcionada para globulômero Αβ(20-42) não altera os níveis de Αβ do cérebro significativamente, mas, no entanto, é efetiva no alívio de deficiências cognitivas relacionadas a Αβ peptídeo (ver exemplo 4).

Exemplo 7: Análise de desempenho cognitivo pelo teste de reconhecimento de objetos em camundongos transgê- nicos APP/1 após imunização passiva com anticorpos de glo- bulômeros anti-Αβ(20-42)

Nesses experimentos, camundongos que sobre ex- pressam humano APP com uma mutação do ponto foram usados. A mutação do ponto refere-se ao aminoácido 717 (substitui- ção de isoleucina por valina) e foi encontrado em uma fa- mília de Londres onde leva ao início de ação de AD antes do início da sexta década vida (Mullan et al., Nature Ge- netics 2 (1992) 340-342). Os camundongos transgênicos, a- qui referidos como APP/1, foram criados e primeiramente descritos em Leuven (Moechars et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 6483-6492). Camundongos APPIL fêmeas foram submeti- dos a imunização passiva em 3 meses de idade. Camundongos receberam 250 pg de qualquer dos anticorpos de camundongos monoclonais 5F7, IOFll ou 7C6 em 100 pL de salina tampona- da de fosfato (PBS) . Por todo o curso de tempo do experi- mento os animais foram mantidos em condições padrões em um ciclo dia/noite revertido (14 horas de leve começando a 7 pm/10 horas de escuridão). Eles toleraram bem a imunização passiva, sem nenhum sinal de efeitos adversos. Após a terceira injeção (dia 15 de experimento) a capacidade cognitiva dos camundongos foi testada por um teste de reconhecimento de objetos da maneira descrita na tecnologia (Dewachter et ai. Journal of Neuroscience 22 (2002) 3445-3453). Com esta finalidade, camundongos foram acostumados a uma arena e em seguida expostos por 10 minu- tos a uma fase de aquisição durante o qual eles foram in- dividualmente colocados na arena que agora continha dois elementos idênticos (cubo verde ou cilindro laranja de ta- manho similar, ca. 4 cm) . A duração e freqüência com a qual o camundongo explorou os objetos foram registrados. Durante a fase de retenção, 2,5 horas depois, camundongos retornaram à arena que agora continha, além do objeto co- nhecido, os outros objetos. 0 reconhecimento do objeto no- vo foi registrado como o tempo durante o qual o camundongo ficou explorando o objeto velho com relação ao tempo total (exploração do objeto velho e novo). 0 "índice de reconhe- cimento" expressa esta relação (tempo para objeto no- vo/tempo total). Um camundongo que não lembra do objeto conhecido vai considerá-lo igualmente interessante ao ob- jeto novo e gastará uma quantidade igual de tempo ao ex- plorá-lo, em outras palavras, apresentará um índice de re- conhecimento de 50 %. Um camundongo que lembra do objeto conhecido vai considerá-lo como não interessante e então mostrará um índice de reconhecimento significativamente maior, camundongos APP/1 são conhecidos por ser cognitiva- mente deficientes aos 4,5 meses de idade e apresentar um índice de reconhecimento no dimensão do nível aleatório, isto é, 50 %.

Resultados estão mostrados na Figura 6. Teste de reconhecimento de objetos em camundon- gos. O teste reporta reconhecimento de um objeto conhecido em comparação com um desconhecido, medido em termos de comportamento explorativo durante uma fase de teste de 10 minutos. O índice de reconhecimento é definido como o por- centagem de tempo que o camundongo gasta explorando o ob- jeto desconhecido com relação ao tempo gasto explorando ambos objetos. 0 objeto conhecido foi explorado pelo ca- mundongo durante uma fase de aquisição de 10 minutos, 2,5 horas antes da fase de teste.

A) camundongos transgênicos APP foram imunizados uma vez um semana por três semanas por injeção intraperi- tonial de 250 μl. do anticorpo 5F7 (n=9), o anticorpo 10F11 (n=ll) ou o anticorpo 7C6 (n=ll); animais de controle re- ceberam PBS (n=6) . diferenças significativas do nível ale- atório (50 %, isto é, tempo igual de exploração gasto no conhecimento e o objeto desconhecido) são indicados com asteriscos* = ρ < 0,05 (teste t)

b) Comparação de todos camundongos tratados com anticorpos (5F7, 10F11 e 7C6; (n=31)) e camundongos trata- dos com salina tamponada de fosfato (PBS; n=6) O RI do grupo tratado com anticorpo significativamente diferente do nível aleatório (** = P<0,01; teste t).

camundongos APPIL são conhecidos por ser cogniti- vamente deficientes aos 4,5 meses de idade e apresentarem um índice de reconhecimento na dimensão do nível aleató- rio, isto é, 50 %.

Certamente os camundongos tratados com PBS mos- traram comportamento aleatório. Imunização passiva com to- dos os três anticorpos (5F7, 10F11 e 7C6) resultou em um índice de reconhecimento incrivelmente maior. Quando com- parado como um grupo unido contra o controles, o índice de reconhecimento é significativamente menor. Este efeito be- néfico no desempenho da memória de camundongos APPIL após administração de todos os três anticorpos sugere que um an- ticorpo contra globulômero Αβ(20-42) truncado é suficiente para alcançar melhora cognitiva.

Exemplo 8 : Perfil Dot-Blot da seletividade dos anticorpos de globulômeros anti-Αβ (20-42).

A fim de caracterizar a seletividade do anticor- pos anti Αβ (20-42) monoclonal de globulômeros eles foram experimentados para reconhecimento com diferentes formas Αβ. Com esta finalidade, foram feitas diluições em série do formas Αβ (1-42) individuais variando de 100 pmol/pL a 0,01 pmol/pL em PBS suplementado com 0,2 mg/mL BSA. 1 yL de cada amostra foi manchado em uma membrana de nitrocelu- lose. Para detectar o anticorpo correspondente foi usado (0,2 pg/mL). Imuno manchamento foi feito usando peroxidase conjugado anti-camundongo-IgG e o reagente de manchamento BM Blue POD Substrate (Roche).

Padrões de Αβ para dot-blot:

1. monômero Αβ (1-42), 0,1 % de NH4OH 1 mg de Αβ (1-42) (Bachem Inc., cat. no. H-1368) foi dissolvido em 0,5 mL de 0,1 % de NH4OH em H2O (recém- preparado) (= "2 mg/mL) e imediatamente agitado por 30 se- gundos à temperatura ambiente para obter uma solução cla- ra. A amostra foi armazenada a -20 0C para uso posterior.

2. monômero Αβ (1-40), 0,1 % de NH4OH

1 mg de Αβ (1-40) (Bachem Inc., cat. no. H-1368) foram dissolvido em 0,5 mL 0,1 % de NH4OH em H2O (recém- preparado) (= 2 mg/mL) e imediatamente agitada por 30 se- gundos à temperatura ambiente para obter uma solução cla- ra. A amostra foi armazenada a -20 0C para uso posterior.

3. Αβ(1-42) monômero, NaOH 0,1 % 2,5 mg de Αβ (1-42) (Bachem Inc., cat. no. H- 1368) foram dissolvidos em 0,5 mL de NaOH 0,1 % em H2O (recém-preparado) (= 5 mg/mL) e imediatamente agitados por 30 segundos à temperatura ambiente para obter uma so- lução clara. A amostra foi armazenada a -20 0C para uso posterior.

4. monômero Αβ (1-40), NaOH 0,1 % 2,5 mg de Αβ (1-40) (Bachem Inc., cat. no. H- 1368) foram dissolvidos em 0,5 mL de NaOH 0,1 % em H2O (recém-preparado) (= 5 mg/mL) e imediatamente agitados por 30 segundos à temperatura ambiente para obter uma solução clara. A amostra foi armazenada a -20 0C para uso poste- rior.

5. globulômero Αβ(1-42) A preparação do globulômero Αβ(1—42) é descrito no exemplo 1 a.

6. globulômero Αβ (12-42) A preparação do globulômero Αβ (12-42) é descri- to no exemplo Id.

7. globulômero Αβ(20-42)

A preparação do globulômero Αβ(20-42) é descrito no exemplo Ic.

8. fibrilas Αβ (1-42)

1 mg de Αβ(1-42) (Bachem Inc. cat. no.: H-1368) foi solvido em 500 μl de NH4OH 0,1 % aquoso (Tubo Eppen- dorff) e a amostra foi agitada por 1 minuto à temperatura ambiente. 100 μl; desta solução Αβ (1-42) recém preparada foram neutralizados com 300 μL de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 raM, pH 7,4. O pH foi ajustado ao pH 7,4 com HCl 1 %. Aa- mostra foi incubada por 24 horas a 37 °C e centrifugado (10 minutos a 10.000 g) . O sobrenadante foi descartado e a fibrila precipitada ré-suspensa com 400 μl, de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM, pH 7,4 vortexando por 1 minutos.

9. sAPPa

Suprido por Sigma (cat.no. S9564; 25 μg em NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4). O sAPPa foi diluído com 0,1 mg/mL ( = 1 ριηοΙ/μΙΟ com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4, 0,2 mg/mL BSA.

Materiais para dot blot:

padrões Αβ:

Diluição em série de antígenos Αβ em NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 + 0,2 mg/mL BSA

1) 100 pmol/μl

2) 10 pmol/μl

3) 1 pmol/μl

4) 0,1 pmol/μl 5) 0,01 pmol/pL

Nitrocelulose:

Meio de Trans-Blot Transfer, Nitrocellulose Mem- brane Pure (0,45 pm); BIO-RAD

Anti-Camundongo-POD:

Cat no: 715-035-150 (Jackson Imuno Research) Reagente de detecção:

BM Blue POD Substrate, precipitação (Roche) Albumina Sérica Bovina, (BSA):

Cat no: A-7888 (SIGMA)

Reagente de bloqueio:

leite de baixa gordura 5 % em TBS Soluções de tampões:

TBS

Tris/tampão HCl 25 mM pH 7,5

+ 150 mM de NaCl TTBS

Tris/tampão HCl 25 mM pH 7,5 + 150 mM de NaCl

Tween 20 0,05 %

PBS + 0,2 mg/mL BSA NaH2PO4 20 mM tampão pH 7,4 + NaCl 140 mM +0,2 mg/mL BSA

Solução de anticorpo I

0,2 μg/mL de anticorpo diluído em 20 mL de leite de baixa gordura 1 % em TBS

Solução de anticorpo II: diluição 1:0,500

Anti-Camundongo-POD em leite de baixa gordura 1 %

em TBS

procedimento Dot blot:

1) cada 1 pL dos diferentes padrões de Αβ (em su- as 5 diluições em série) foi analisada em dot blot sobre a membrana de nitrocelulose em uma distância de aproximada- mente 1 cm um dos outro.

2) Os dots Αβ padrões foram secos naturalmente na membrana de ni trocelulose no ar por pelo menos 10 minutos à temperatura ambiente (RT) (= dot blot)

3) bloqueio:

Odot blot foi incubado com 30 mL de leite de baixa gordura 5 % em TBS por 1,5 hora a RT.

4) Lavagem:

A solução de bloqueio foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com TTBS 20 mL por 10 minutos a RT .

5) Solução de anticorpo I:

tampão de lavagem foi descartado e o dot blot foi incubado com solução de anticorpo I por 2 horas à RT

6) Lavagem:

A solução de anticorpo I foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com TTBS 20 mL por 10 minu- tos a RT. A solução de lavagem foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com TTBS 20 mL por 10 minutos a RT. A solução de lavagem foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL TBS por 10 minutos à RT. 7) Solução de anticorpo II:

O tampão de lavagem foi descartado e o dot blot foi incubado com solução de anticorpo II por toda a noite à RT

8) Lavagem:

A solução de anticorpo II foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com TTBS 20 mL por 10 minu- tos a RT. A solução de lavagem foi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com TTBS 20 mL por 10 minutos a RT. A solução de lavagemfoi descartada e o dot blot foi incubado sob agitação com 20 mL TBS por 10 minutos a RT.

9) Desenvolvimento:

A solução de lavagem foi descartada. O dot blot foi desenvolvido com BM Blue POD Substrate 10 mL por 10 minutos. O desenvolvimento foi interrompido por lavagem intensa do dot blot com H2O. Avaliação quantitativa foi feita usando uma análise densitométrica (densitômetro GS800 (BioRad) e embalagem software Quantity one, Versão 4,0,5 (BioRad)) da intensidade do dot. Foram avaliados apenas dots que têm uma densidade relativa maior que 20 % da densidade relativa do último dot identificado otica- mente de forma inequivocada do globulômero A Αβ(20-42). Este valor de patamar foi determinado para cada dot blot independentemente. O valor calculado indica a relação en- tre reconhecimento de globulômero Αβ (20-42) e as respec- tivas formas Αβ para o dado anticorpo.

Resultados estão mostrados na Figura 7.

Análise Dot blot da especificidade de diferentes anticorpos anti-Αβ (6E10, 5F7, 4B7, 10F11, 6A2, 4D10, 2F2; 3B10, 7C6, 7E5, 10C1) no sentido de diferentes formas de Αβ. Os anticorpos monoclonais testados foram obtidos (ex- ceto por 6E10) por imunização ativa de camundongos com globulômero Αβ (20-42), seguido por seleção das células de hibridoma fundidas. As formas Αβ individuais foram aplica- das em diluições em série e incubadas com os respectivos anticorpos para reação imune.

1. Monômero Αβ(1-42), 0,1 % de NH4OH

2. Monômero Αβ(1-40), NaOH 0,1 %

3. Monômero Αβ(1-42), NaOH 0,1 %

4. monômero Αβ (1-40), NaOH 0,1 %

5. globulômero Αβ (1-42)

6. globulômero Αβ (12-42)

7. globulômero Αβ (20-42)

8. preparação de fibrila Αβ (1-42)

9. sAPPa (Sigma); (primeiro dot: 1 pmol)

O mAbs seletivo do globulômero anti Αβ (20-42) pode ser dividido em 3 classes com relação a discriminação de globulômero Αβ(1-42) e globulômero Αβ (12-42). A pri- meira classe compreendendo os anticorpos 6A2, 5F7 e 2F2 reconhece preferencialmente globulômero Αβ (20-42) e até certo ponto globulômero Αβ (1-42) (e também globulômero Αβ (12-42)). A segundo classe compreendendo os anticorpos 10F11, 4010 e 3B10 reconhece preferencialmente globulôme- ro Αβ (20-42) e também reconhece globulômero Αβ (12-42) mas com menor intensidade e não reconhecem significativa- mente globulômero Αβ(1-42). A terceira classe compreen- dendo os anticorpos 7C6, 4B7, 7E5 e 10C1 reconhece globu- lômero Αβ (20-42) mas não mostrou reconhecimento signifi- cativo dos outros. Todas as três classes não reconhecem significativamente Αβ (1-42) monomérico, Αβ (1-40) raonomé- rico, fibrilas Αβ(1-42) ou sAPPa

O perfil de seletividade dos anticorpos de globu- lômeros anti- Αβ (20-42) mostrou que o índice significati- vamente elevado de reconhecimento na imunização passiva (na figura 6) pode ser principalmente por causa de um re- conhecimento seletivo de globulômero Αβ (20-42) e globu- lômero Αβ (12-42) truncados e por uma intensidade muito menor de globulômero Αβ (1-42) e Αβ(1-42) não monomérico, Αβ (1-40) monoméricas, fibrilas Αβ(1-42) ou sAPPa.

Exemplo 9: Análise in situ da reação específica de anticorpos Αβ (20-42) seletivos com peptídeo Αβ fibri- lar na forma de placas Αβ em camundongos TG2576 velhos e Αβ amilóide em vasos meningeais.

Para estes experimentos, foi usado material de cérebro de camundongos TG2576 de 19 meses de idade (Hsiao et al., 1996, Science; 274(5284), 99-102) ou camundongos APP/LxPSl de 9 meses de idade (descrição anterior; Re- MYND, Leuven, Belgium) ou material de autópsia de dois pa- cientes com doença de Alzheimer (RZ16 e RZ55; obtido de BrainNet, Munich). Os camundongos que sobre expressam APP humano com a assim chamada mutação da Suécia (K670N/M671L; Tg2576) ou como a assim chamada mutação de Londres (V7171) além do gene 1 de Presenilina humana com a mutação A264E (APPILxPS1) e formou depósitos β amilóide no parênquima cerebral a cerca de 7-11 meses de idade e depósitos β amilóide em vasos cerebrais grandes a cerca de 18 meses de idade (Tg2576). Os animais foram profundamente anestesiados e perfusados transcardialmente com salina tamponada de fosfato (PBS) 0,1 M para fluxar o sangue. Em seguida o cérebro foi removido do crânio e dividido longi- tudinalmente. Um hemisfério do cérebro foi congelados com choque, o outro fixado por imersão em paraformaldeido 4 %. O hemisfério fixado em imersão foi crioprotegido enxaguan- do em sacarose 30 % em PBS e montado em um micrótomo con- gelado. Todo o cérebro dianteiro foi cortado em seções de 40 μπι que foram coletadas em PBS e usadas para o procedi- mento de manchamento subseqüente. O material de cérebro humano foi cerca de um bloco congelado profundamente de 1 cm3 de o neocórtex. Uma pequena parte do bloco foi fixado em imersão em paraformaldeido 4 % e tratada adicionalmente como o material do cérebro de camundongo.

Seções individuais foram manchadas com vermelho Congo usando o seguinte protocolo:

Material:

- Estojo de corante amilóide vermelho Congo (Sig- ma-Aldrich; HT-60), consistindo em solução de NaCl alcoó- lica, solução de NaOH e solução de vermelho Congo

- cubetas de manchamento

- lâminas de microscópio SuperfrostPlus e cober- turas de lâmina

- Etanol, Xilol, meio de fixação

Reagentes: - NaOH diluído 1 : 100 com solução de NaCl rende salina alcalina

- salina alcalina diluída 1 : 100 com solução de vermelho Congo rende solução de vermelho Congo alcalina (preparar não mais que 15 minutos antes do uso, filtrar)

- montar seções na lâmina e permite que elas se- quem

- incubar a lâmina em manchamento cuvette, pri- meiro por 30 - 40 minutos em salina alcalina, em seguida por 30 - 40 minutos em solução de vermelho Congo alcalina

- rinsar três vezes com etanol fresco e fixar sobre xilol

Manchamento foi primeiro fotografado usando um microscópio Zeiss Axioplan e avaliado qualitativamente. A cor vermelha indicou depósitos de amilóide tanto em forma de placas quanto em vasos meningeais grandes. Estes Resul- tados estão mostrados na Fig. 8A. Por último, avaliação do manchamento de anticorpo focou nestas estruturas.

Manchamento de anticorpo foi realizado incubando as seções com uma solução contendo 0,07-7,0 μg/mL do res- pectivo anticorpo de acordo com o seguinte protocolo:

Materiais:

- Solução de lavagem TBST (Salina tamponada Tris com Tween 20; 10 χ concentrado; DakoCytomation; S3306 1:10 em Aqua bidest)

- H2O2 0,3 % em metanol

- soro de burro (Serotec), 5 % em TBST

- anticorpo de camundongo-anti-globulômero mono- clonal diluído em TBST

- anticorpo secundário: anticorpo de burro-anti- camundongo biotinilado (Jackson Immuno; 715-065-150; di- luído 1:500 em TBST)

- StreptABComplex (DakoCytomation; K 0377)

Peroxidase Substrato Estojo diaminobenzidina (=DAB; Vetor Laboratories; SK-4100)

- lâminas SuperFrost Plus de microscópio e co- berturas de lâmina

- meio de fixação sem xilol (Medite; X-tra Kitt) Procedimento:

- transferir seções flutuantes em H2O2 resfriado em gelo 0,3 % e incubar por 30 minutos

- lavar por 5 minutos em tampão TBST - incubar com soro de burro/TBST por 20 minutos

- incubar com anticorpo primário por 24 horas à temperatura ambiente

- lavar em tampão TBST por 5 minutos

- incubar com soro de bloqueio a parir do estojo de peroxidase Vectastain Elite ABC por 20 minutos

- lavar em tampão TBST por 5 minutos - incubar com anticorpo secundário por 60 minu- tos à temperatura ambiente

- lavar em tampão TBST por 5 minutos

- incubar com StreptABComplex por 60 minutos à temperatura ambiente

- lavar em tampão TBST por 5 minutos

- incubar com DAB a partir do estojo de peroxi- dase Vectastain Elite ABC por 20 minutos

- montar as seções em lâminas, secá-las no ar, desidratá-las com álcool e fixá-las.

Com base na inspeção visual do manchamento, o manchamento da placa foi adicionalmente quantificado cor- tando graficamente 10 placas selecionadas aleatoriamente das imagens histológicas usando o sistema de análise de imagem ImagePro 0.5 e determinando seu valor de escala de cinza médio. Valores de densidade ótica foram calculados a partir dos valores de escala de cinza subtraindo o densi- dade média de fundo do material manchado a partir da den- sidade de placas de amilóide (0 % - nenhum manchamento da placa acima do fundo em volta, 100 % - nenhuma transmis- são/manchamento máximo), e as diferenças entre controle e anticorpos e entre 6G1 e os anticorpos seletivos para Αβ (20-42), respectivamente, foram testados com relação a significância estatística com ANOVA.

Resultados do manchamento em camundongos Tg2576 e APP/LXPS1 são mostrados na Figura 8 B-D e H.

Ligação de diferentes anticorpos a uma concentra- ção de 0,7 pg/mL em seções transversais dos neocórtices de camundongos TG 2576 transgênicos aos 19 meses de idade:

C) Depósitos Αβ parenquimais (placas de amilói- de) foram manchados apenas com 6G1 e 6E10 mas não com os anticorpos seletivos do globulômero (isto é, 5F7, 2F2, 6A2, 4010, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 e 10C1).

D) Todos anticorpos seletivos do globulômero (isto é, 5F7, 2F2, 6A2, 4010, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 e 10C1) mostraram significativamente menos manchamento da placa parenquimais comparado aos anticorpos 6E10 e 4G8 co- mercialmente disponíveis.

Ligação de diferentes anticorpos a uma concentra- ção de 0,07-7,0 μg/mL em seções transversais dos noecórtex de camundongos APP/LxPSl transgênicos aos 11 meses de idade:

E) Depósitos Δβ parenquimais (placas de amilói- de) foram significativamente mais e em menores concentra- ções, manchadas com 6G1, 6E10 e 4G8 do que com os anti- corpos seletivos do globulômero (isto é, 5F7, 2F2, 6A2, 4Dl0, 10Fl1, 3810, 7C6, 7E5 e 10C1).

Todos os depósitos de amilóide foram verificados por manchamento congofílico antes (vermelho Congo; ver Fig. 8A). Bar = 100 pm.

Avaliação de depósitos DAB marrom mostrou que os anticorpos 6G1 e 6E10 Αβ não seletivo mancharam placas e vasos meningeais, ao passo que os anticorpos seletivos Αβ (20-42) do globulômero 5F7, 2F2, 6A2, 4010, 10F11, 3610, 7C6, 7E5 e 10C1 não mancharam. Esta revelação demonstra que não existe, ou que existe notavelmente menos ligação desses anticorpos com fibrilas Αβ ou outras espécie Αβ presentes nas estruturas de amilóide in vivo. Esta liga- ção reduzida é suposta para reduzir o perigo de efeitos colaterais induzidos por dissolução muito rápida de pla- cas e subseqüente aumento em Αβ solúvel ou neuroinfIama- ção por causa da interação de anticorpo ligados a placa com microglia. Resultado do manchamento em cérebro de doença de Alzheimer humano são mostrados na Figura 8 B, F-H.

Ligação de diferentes anticorpos a uma concentra- ção de 0,7 μg/mL em seções transversais do neocórtex de paciente RZ55:

B) Depósitos Αβ parenquimais (placas de amilói- de) foram manchados apenas com 6G1 e 6E10 mas não com os anticorpos seletivos do globulômero (isto é, 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10 Fl1, 3B10, 7C6, 7E5 e 10C1) .

F) Todos os anticorpos seletivos do globulômero (isto é, 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 e 10C1) mostraram significativamente menos manchamento com- parado aos anticorpos 6E10 e 4G8 comercialmente disponí- veis.

H) Depósitos Αβ vasculares (setas) foram mancha- dos apenas com 6G1 e 6E10, mas não com anticorpos seleti- vos do globulômero (isto é, 5F7, 2F2, 6A2, 4010, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 e 10C1).

Ligação de diferentes anticorpos a uma concentra- ção de 0,07-7,0 pg/mL em seções transversais do noecórtex de camundongos APP/LxPSI transgênicos aos 11 meses de i- dade :

G) Depósitos Αβ parenquimais (placas de amilói- de) foram significativamente mais e em menores concentra- ções manchadas com 6G1, 6E10 e 4G8 do que com os anticor- pos seletivos do globulômero (isto é, 5F7, 2F2, 6A2, 4010, 10Fl1, 3B10, 7C6, 7E5 e 10C1) .

Todos os depósitos de amilóide foram verificados por manchamento congofílico antes (vermelho Congo; ver Fig. 8A).

Avaliação de depósitos DAB marrom mostrou que os anticorpos 6G1 e 6E10 Αβ não seletivo mancharam placas e vasos meningeais, ao passo que os anticorpos seletivos do globulômero Αβ(20-42) 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3810, 7C6, 7E5 e 10Cl não mancharam. Anticorpos 6E10 e 4G8 co- mercialmente disponíveis mostraram manchamento mais forte comparado aos anticorpos seletivos do globulômero, mas me- nos manchamento do que 601. Esta revelação confirma o manchamento padrão em camundongos transgênicos APP onde não existe, ou que existe notavelmente menos ligação des- ses anticorpos seletivos do globulômero com fibrilas Αβ ou outra espécie Αβ presente na estruturas de amilóide in vivo. Esta ligação» reduzida com amilóide humano é suposta para reduzir o perigo de efeitos colaterais induzidos por dissolução muito rápida de placas e subseqüente aumento em Αβ solúvel ou neuroinflamação por causa da interação de anticorpo ligados a placa com microglia.

Exemplo 10: Titulador de anticorpo anti-Αβ e perfil de seletividade. dot-blot em plasma de camundongos TG2576 aproximadamente um ano após imunização ativa. Aproximadamente um ano após a última imunização (com globulômero Αβ(20-42), globulômero Αβ (12-42), monô- mero Αβ -42) e veículo) de Camundongos Tg 2576 (do exem- plo 9) amostras de plasma foram avaliadas para anticorpos anti- Αβ produzidos e ainda presentes. Com esta finalida- de, foram feitas diluições em séries das diferentes formas de Αβ (1-42) na faixa de concentração de 100 pmol/pL a 0,01 ριηοΐ/μL. em PBS + BSA 0,2 mg/mL. De cada amostra, 1 μL, foi aplicado a uma membrana de nitrocelulose. A detecção foi realizada com amostras de plasma de camundongos ade- quadas (diluídas 1:400). Manchamento foi feito com fosfa- tase alcalina conjugado com anti-camundongo-IgG e adição do reagente de manchamento NBT/BCIP.

Padrões de Αβ para dot-blot:

1. globulômero Αβ(1-42)

A preparação do globulômero Αβ(1-42) é descrita no exemplo 1a.

2. Monômero Αβ (1-42) pré-tratado com HFIP em F68 Plurônico

3 mg de Αβ (1-42), (Bachem Inc.; cat. no. H- 1368) foram dissolvido em HFIP 0,5 mL (suspensão 6 mg/mL) em um Tubo Eppendorff de 1,7 mL e foram agitados (Mistura- dora Eppendorff Thermo, 1.400 rpm) por 1,5 hora a 37 ºC até que uma solução clara fosse obtida. A amostra foi se- ca em um concentrador SpeedVac (1,5 hora) e ré-suspensa em 13,2 pL DMSO, agitada por 10 segundos, seguido por so- nificação (20 segundos), e agitação (por exemplo, em Mis- turadora Eppendorff Thermo, 1.400 rpm) por 10 minutos. 6 mL de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; F68 Plurônico 0,1 %; pH 7,4 foram adicionados e agitados por 1 hora à temperatu- ra ambiente. A amostra foi centrifugada por 20 minutos a 3.000 gramas. 0 sobrenadante foi descartado e o precipita- do resolvido em 0,6 mL de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140. mM; F68 Plurônico 1 %, pH 7,4. 3,4 mL de H2O foram adicionados e agitados por 1 hora à temperatura ambiente seguido por 20 minutos de centrifugação a 3.000 gramas. Qualquer uma das alíquotas de cada 0,5 mL do sobrenadante foi armazenada a -20° para uso posterior.

3. globulômero Αβ(20-42) A preparação do globulômero Αβ(20-42) é descrita no exemplo Ic.

4. Globulômero Αβ(12-42) A preparação do globulômero Αβ(1-42) é descrita no exemplo ld.

5. Monômero Αβ (1-40), pré-tratado com HFIP, 5 mM em DMSO 1 mg de Αβ(1-40), (Bachem Inc, cat. no. H-1194) foi suspenso em HFIP 0,25 mL (suspensão 4 mg/mL) em um tu- bo Eppendorff. O tubo foi agitado (por exemplo, em mistu- radora Eppendorff Thermo, 1.400 rpm) por 1,5 hora a 37 °C para obter uma solução clara e em seguida seca em um aspi- rador de pó (por 1,5 hora). A amostra foi ré dissolvida em 46 μΙ, de DMSO (solução 21,7 mg/mL = 5 mM) , agitada por 10 segundos e subseqüentemente sonicada por 20 segundos. A- pós agitação (por exemplo, em misturadora Eppendorff Thermo, 1.400 rpm) por 10 minutos a amostra é armazenada a -20 0C para uso posterior.

6. monômero Αβ (1-42), 0,1 % de NH4OH 1 mg de Αβ (1-42) (Bachem Inc., cat. no. H-1368) foi dissolvido em 0,5 mL de 0,1 % de NH4OH em H2O (recém- preparado) ( = 2 mg/mL) e imediatamente agitado por 30 se- gundos à temperatura ambiente para obter uma solução cia- ra . A amostra foi armazenada a -20°C para uso posterior.

7. fibrilas Αβ(1-42)

-1 mg de Αβ (1-42) (Bachem inc. Catalog Nr.: H- 1368) foi resolvido em 500 μΐ de NH4OH 0,1 % aquoso (tubo Eppendorff) e a amostra foi agitada por 1 minutos à tempe- ratura ambiente. 100 μΐ. desta solução Αβ(1—42) recém pre- parada foram neutralizados com 300 μΐ, de NaH2PO4 20 mM; Na- Cl 140 mM, pH 7,4. 0 pH foi ajustado ao pH 7,4 com HCl 1 %. A amostra foi incubada por 24 horas a 37 0C e centrifu- gado (10 minutos a 10.000 g). 0 sobrenadante foi descarta- do e o precipitado de fibrila ré-suspenso com 400 μΐϋ de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM, pH 7,4 vortexando por 1 minu- to .

8. sAPPa

Suprido de Sigma (cat.no. S9564; 25 pg em NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4). 0 sAPPa foi diluído com NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4, BSA 0,2 mg/mL 0,1 mg/mL (30= 1 pmol/uL).

Materiais para dot blot:

padrões Αβ:

Diluição em série de antígenos Αβ em NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 + BSA 0,2 mg/mL

1) 00 pmol/μL.

2) 10 pmol/μL·

3) 1 pmol/μL

4) 0,1 pmol / μL

5) 0,01 pmol / μL

Nitrocelulose: Meio de Trans-Blot Transfer, Nitrocellulose Mem- brane Pure (0,45 pm); BIO-RAD Anti-Camundongo-AP: AQ330A (Chemicon) Reagente de detecção:

Comprimidos NBTIBCIP (Roche) Albumina Sérica Bovina, (BSA): A-7888 (Fa. SIGMA) Reagente de bloqueio: leite de baixa gordura 5 % em TBS

Soluções de tampões: TBS

Tris 25 mM/HCl - tampão pH 7,5 +150 mM de NaCl TTBS

Tris 25 mM/HCl - tampão pH 7, 5 +150 mM de NaCl + Tween 20 0,05 % PBS + 0,2 mg/mL BSA NaH2PO4 20 mM tampão pH 7,4

+NaCl 140 mM +0,2 mg/mL BSA Solução de anticorpo I:

Plasma dos camundongos TG2 57 6 ativamente imuni- zados 1/400 diluídos em 20 mL de leite de baixa gordura 1 % em TBS

Solução de anticorpo II: diluição 1:0,500 Anti-Camundongo-AP em leite de baixa gordura 1 % em TBS

Procedimento Dot blot:

1) 1 yL de cada um dos diferentes padrões Αβ (em suas 5 diluições em série) foi analisado em dot blot sobre a membrana de nitrocelulose em aproximadamente 1 cm de distância uns dos outros.

2) Os dots dos padrões Αβ são secos naturalmente na membrana de nitrocelulose em ar por pelo menos 10 minu- tos à temperatura ambiente (RT) (= dot blot)

3) bloqueio:

0 dot blot é incubado com 30 mL de leite de baixa gordura 5 % em TBS por 1,5 hora a RT.

4) Lavagem:

A solução de bloqueio é descartado e o dot blot incubado sob agitação com TTBS 20 mL por 10 minutos a RT.

5) Solução de anticorpo I:

0 tampão de lavagem é descartado e o dot blot in- cubado com solução de anticorpo I por toda a noite à RT

6) Lavagem:

A solução de anticorpo I é descartado e o dot blot incubado sob agitação com TTBS 20 mL por 10 minutos a RT. A solução de lavagem é descartada e o dot blot incubado sob agitação com TTBS 20 mL por 10 minutos a RT. A solução de lavagem é descartada e o dot blot incubado sob agitação com TBS 20 mL por 10 minutos a RT.

7) Solução de anticorpo II:

0 tampão de lavagem é descartado e o dot blot in- cubado com solução de anticorpo II por 1 hora à RT.

8) Lavagem:

A solução de anticorpo II é descartado e o dot blot incubado sob agitação com TTBS 20 mL por 10 minutos a RT. A solução de lavagem é descartado e o dot blot incubado sob agitação com TTBS 20 mL por 10 minutos a RT. A solução de lavagem é descartada e o dot blot incubado sob agitação com TBS 20 mL por 10 minutos a RT.

9. Desenvolvimento:

A solução de lavagem é descartada. 1 comprimido de NBTIBCIP é dissolvido em H2O 20 m e o dot blot é incu- bado por 5 minutos com esta solução. 0 desenvolvimento é interrompido por lavagem intensiva com H2O.

Resultados estão mostrados na Figura 9.

Soro de diferentes grupos de imunização: a) glo- bulômeros Αβ(20-42); b) globulômeros Αβ (12-42); c) monôme- ro Αβ (1-42) , 0,1 % de NH4OH; d) controle de veiculo foram testados contra diferente formas Αβ em um dot blot para diferenciar perfis de anticorpo.

1. globulômero Αβ(1-42)

2. monômero Αβ(1-42), pré-tratado com HFIP, em 0,F68 Plurônico 1 %

3. globulômero Αβ(20-42)

4. globulômero Αβ (12-42)

5. monômero Αβ (1-40), pré-tratado com HFIP, 5 mM em DMSO

6. monômero Αβ(1-42), dissolvido em 0,1 % de NH4OH 7. preparação de fibrila Αβ (1-42)

8. sAPPa (Sigma); (primeiro dot: 1 pmol)

Ao contrário das imunizações ativas tanto com ve- iculo como controle quanto monômero Αβ(1-42) a imunização com globulômero Αβ (20-42) ou globulômero Αβ (12-42) apre- senta mesmo após aproximadamente um ano da última imuniza- ção um alto titulador de anticorpos. Estes anticorpos são seletivos para o globulômero Αβ (20-42) no caso de imuni- zação do globulômero Αβ (20-42) ou globulômero Αβ (20-42) e globulômero Αβ (12-42) seletivo no caso de imunização do globulômero Αβ (20-42). Isto mostrou que os globulômeros Αβ (20-42) e globulômero Αβ (12-42) truncados representam um antigeno muito bom e que anticorpos direcionados contra eles persistem muito tempo in vivo.

(Note que nos mesmos dot-blots um sinal de man- chamento não especifico é observado que é mais provável cruzar uma reação de anticorpos murina com o BSA usado nas diluições em série dos peptideos Αβ.)

Exemplo 11: Niveis Cerebrais de epítopo dos glo- bulômeros Αβ (20-42) em pacientes com doença de Alzheimer. extrato do cérebro SDS-DU:

Amostras cerebrais AD: RZ 16; RZ 52 e RZ 55 (ob- tidas de Brain Net, Munich) Amostra de controle: RZ 92 (obtidas de Brain Net, Munich)

Um comprimido de Complete Protease Inhibitor (Roche, Cat. No. 1697 498) é dissolvido em 1 mL de H2O (= solução inibidora de protease). 100 mg de amostra de cé- rebro AD são homogeneizados em 2,5 mL de NaH2PO4, NaCl 140 mM, Tween 20 0,05 %, 0,5 % BSA (suplementado com 25 μί de solução inibidora de protease) com 20 batidas em um pote de vidro. A suspensão é sonificada por 30 segundos em ge- lo, em seguida incubada a 37 0C por 16 horas. A suspensão é centrifugada a 100*000 g e 8 0C por uma hora, em segui- da o sobrenadante é coletado. 0 resíduo é dissolvido em 5 mM de NaH2PO4, 35 mM de NaCl, pH 7,4 e homogeneizado com 10 batidas em um pote de vidro. 75 μΐ, de SDS 10 % e 125 μΐϋ de DTT 0,16 mg/mL são adicionados e agitados por 20 minu- tos à temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada por 10 minutos a 10.000 g, e o sobrenadante é armazenada por toda a noite at -20 °C. Antes do uso o sobrenadante é de- gelado e centrifugado por mais 10 minutos a 10.000 g. O sobrenadante (=extrato de cérebro SOS/DTT) é usado para ELISA.

a) Sanduiche-ELISA para epítopo do globulômero

Αβ (20-42)

Lista de reagente:

1. F96 Sertã. Maxisorp NUNC-Imuno Plate (Cat.No. : 439454)

2. Anticorpo de ligação: 5F7, 7C6, 10F11

3. Tampão de acoplamento: 100 mM de hidrogeno carbonato de sódio, pH 9,6

4. Reagente de bloqueio para ELISA (Roche Diag- nostics GmbH Cat.No.: 1112589)

5. tampão de PBST: NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, Tween 20 0,05 %, pH 7,4

6. padrão de calibração Αβ(20-42) 7. Anticorpo primário:

anti- Αβ ρ RAb BA199; solução de IgG purificado por afinidade (por globulômero Αβ (1-42)-Sefarose) em PBS; Konz.: 0,22 mg/mL

8. Anticorpo secundário: anti-coelho-POD conjugado; (Jackson ImmunoResear- ch, Cat.No.: 111-036-045)

9. Desenvolvimento: -TMB; (Roche Diagnostics GmbH Cat.No.: 92817060) 42 mM em DMSO

- 3 % de H2O2 em H2O

- acetato de sódio 100 mM, pH 4,9

- Solução de parada: ácido sulfúrico 2 M

Preparação de reagentes:

1. Anticorpo de ligação:

Os anticorpos de ligação individuais 5F7, 7C6 e 10F11 são diluídos com um concentração final de 0,7 μg/mL em tampão de acoplamento.

2. Reagente de bloqueio:

Para preparação da solução de estoque de bloqueio o reagente de bloqueio é dissolvido em 100 mL de H2O e ar- mazenado a -20 °C em alíquotas de 10 mL cada. 3 mL da so- lução de estoque de bloqueio são diluídos com 27 mL de H2O para bloquear uma placa ELISA.

3. Αβ (20-42) padrão de calibração (CS1)

A preparação do globulômero Αβ(1—42) é descrita no exemplo Ia .

A concentração de proteína do globulômero Αβ(20- 42) foi determinada (6,81 mg/mL) após Bradford (BioRad). 14,68 ]iL de globulômero Αβ(20-42) (6,81 mg/mL) são diluí- dos em 10 mL de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM, Tween 0,05 %20, pH 7,4, 0,5 % BSA (= 10 ug/mL). 10 pL da solução 10 ug/mL são adicionalmente diluídos em 10 mL de NaH2PO4 20 mM, Na- Cl 140 mM, Tween 0,05 %20, pH 7,4, 0,5 % BSA ( 10 ng/mL = CS1)

Padrões de calibração para Αβ (20-42):

<table>table see original document page 196</column></row><table>

extratos de cérebro SDS/DTT:

extratos de cérebro SDS/DTT = E# (# representa as 4 amostras cerebrais humanas (1) RZ 16; (2) RZ 52; (3) RZ 55; (4) RZ 92)

<table>table see original document page 197</column></row><table>

4. Anticorpo primário:

A solução de estoque pRAb de anti-Αβ é diluída com 0,05 ug/mL em PBST + BSA 0,5 %. A solução do anticorpo é u- sada imediatamente.

5. Anticorpo secundário:

Conjugado POD anti-coelho liofilizado é dissolvido em 0,5 mL de H2O e misturado com 500 pL de glicerol. 0 anti- corpo concentrado é em seguida armazenado a -20 °C em alí- quotas de 100 μL. O concentrado é diluído 1:10.000 em tampão de PBST. A solução de anticorpo é usado imediatamente.

6. solução TMB:

20 mL de acetato de sódio 100 mM, pH 4,9, são mis- turados com 200 pL de solução de TMB e 29,5 pL de peróxido hidrogênio 3 %. Esta solução é usada imediatamente.

placa ELISA para Αβ (20-42):

Padrões de calibração (CSl.I-CSl.8) e extratos de cérebro SOS/DTT das 4 amostras cerebrais humanas (1) RZ 16; (2) RZ 52; (3) RZ 55; (4) RZ 92 ( E1-E4 em suas 4 diluições em série E#.l-E#.4) são determinadas em dobro:

<table>table see original document page 198</column></row><table>

Este ELISA é realizado com cada dos anticorpos de ligações monoclonais 5F7, 7C6, 10F11.

Procedimento

1. Adicionar 100 μl; de solução mAb por poço. In- cubar a placa ELISA por toda a noite a + 6°C (geladeira).

2 . Decantar a solução de anticorpo e lavar os poços três vezes com 250 μL de tampão de PBST cada.

3. Adicionar 250 μL/poço de solução de bloqueio. Incubar por 2 horas à temperatura ambiente.

4. Decantar a solução de bloqueio e lavar os po- ços três vezes com 250 μL tampão de PBST cada.

5. Adicionar 100 μL/poço cada um dos padrões de calibração e extratos de cérebro SDS/DTT. Incubar a placa por 2 horas à temperatura ambiente, em seguida por toda a noite a 6 °C.

6. Decantar as solução padrões de calibração e extratos de cérebro SDS/DTT e lavar os poços três vezes com 250 μl de tampão de PBST cada.

7. Adicionar 200 pL /poço de solução de anticor- po primário e incubar por 1 hora à temperatura ambiente.

8. Decantar a solução de anticorpo primário e la- var os poços três vezes com 250 μl de tampão de PBST cada.

9. Adicionar 200 μL /poço de solução de anticor- po secundário e incubar por 1 hora à temperatura ambiente.

10. Decantar a solução de anticorpo secundário e lavar os poços três vezes com 250 μL de tampão de PBST cada.

11. Adicionar 100 μL /poço de solução de TMB.

12. Monitorar a cor da placa durante o desenvol- vimento (5 - 15 minutos à temperatura ambiente) e termi- nar a reação adicionando 50 μL /poço de solução de parada quando uma cor apropriada for desenvolvida.

13. Medir a extinção a 450 nm.

14. Calcular os resultados usando calibração.

15. Avaliação: Se as extinções das amostras es- tiverem além a faixa de calibração linear, dilui-las nova- mente e repetir.

Resultados estão mostrados na Figura 10.

níveis cerebrais de epítopos do globulômero Αβ (20-42) no extratos de cérebro de Pacientes AD e sujei- tos de controle Um sanduíche ELISA foi usado para avaliar extra- tos de cérebro para seu truncado conteúdo de epítopo do globulôraero Αβ (20-42). ELISAs com os respectivos anticor- pos contra o globulômero Αβ (20-42) foram usados para ca- libração.

Extração de cérebro de tecido com doença de Al- zheimer mostrou que o conteúdo do epítopo do globulômero Αβ (20-42) é significativamente elevado comparado a um paciente de controle. Isto mostrou que certamente o epí- topo do globulômero Αβ (20-42) é um espécie Αβ relevante em cérebro de doença de Alzheimer humano e não somente re- levante para modelos animais com doença de Alzheimer. An- ticorpos direcionados contra o epítopo do globulômero Αβ (20-42) então são altamente desejáveis para o tratamento de doença de Alzheimer.

Exemplo 12 : Desenvolvimento de linhas celulares de hibridoma de globulômero anti- Αβ (20-42)

Anticorpos monoclonais podem ser preparados u- sando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na tec- nologia incluindo o uso de tecnologias de exibição de hi- bridoma, recombinante e fago, ou uma combinação destes. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na tecnologia e preceituadas, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al. , in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (El- sevier, N.Y., 1981) (as ditas referências incorporadas aqui pela referência na sua integra). O termo "anticorpo monoclonal" da maneira aqui usada não está limitado aos anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma. O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um clone único, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico, ou fago, e não o método pelo qual ele é produzido.

O protocolo particular usado para produzir os anticorpos aqui descritos é da maneira a seguir:

Imunização de camundongos: camundongos Balb/c e A/J (6-8 semanas de idade) foram imunizados subcutanea- mente com 50 ug de antigeno em CFA. Animais foram estimu- lados a cada três semanas com 50 ug de antigeno em Immune- asyTm (Qiagen) por um total de três estímulos. Quatro dias antes da fusão, camundongos foram estimulados com 10 ug de antigeno intravenosamente.

Fusão de célula e classificação de hibridoma: Células do baço de animais imunizados foram fundidas com células SP2/0-Agl4 de mieloma em uma razão de 5:1 usando técnicas padrões. Sete a dez dias após a fusão, quando co- lônias macroscópicas foram observadas, SN foram testados por ELISA para anticorpo com globulômero Αβ(20-42). Célu- las de poços positivos ELISA foram escalados e clonados limitando a diluição.

Determinação do isotipo do anticorpo: O isotipo do mAbs do globulômero anti- Αβ (20-42) foi determinado usando o estojo de isotipagem Zymed EIA.

Escala e purificação de anticorpos monoclonais: Hibridomas foram expandidos em meio contendo soro bovino fe- tal baixo IgG 5 %. (Hiclone) . 0 sobrenadante foi colhido e concentrado. mAb foi purificado usando cromatografia de Pro- teína A e dializado em PBS.

Tituladores de soro: Dez camundongos foram imuniza- dos com o globulômero Αβ (20-42) . Todos os camundongos soro convertidos com tituladores ELISA (1/2 Max OD 450 nm) de 1: 5.000-10.000.

Designações de hibridomas produzindo anticorpos monoclonais

Designações internas de Abbott Laboratories usadas para os depósitos.

Linhas celulares depositadas:

1) ML 13-7C6.1D4.4A9.5G8 (também referido aqui co- mo "7 C 6")

2) ML 15-5F7.5B10 (também referido aqui como VV5F7")

3) ML 15-10F11.3D9 (também referido aqui como "10F11")

4) ML 15-4B7,3A6 (também referidos aqui como " 4 B 7 " )

5) ML 15-2F2.3E12 (também referido aqui como "2F2")

6) ML 15-6A2.4B10 (também referido aqui como "6A2")

7) ML 13-4D10.3F3 (também referido aqui como " 4 D10 ")

8) ML 15-7E5.5E12 (também referido aqui como " 7 E 5 " )

9) ML 15-10C1,5C6.3H4 (também referidos aqui como "10C1")

10) ML 15-3B10.2D5.3F1 (também referido aqui como " 3 B10 ") 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 - Tel.: 703-365-2700/Fax: 703-365-2745 TRATADO DE BUDAPESTE DO RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MI- CROORGANISMOS PARA FINALIDADES DE PROCEDIMENTO DE PATENTE FORMULÁRIO INTERNACIONAL RECIBO NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL EMITIDO DE ACORDO COM A REGRA 7.3

E DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE EMITIDA DE ACORDO COM A REGRA 10. Para: (Nome e Endereço do Depositante ou Advogado) Abbott Laboratories Attn: Boris Labkovsky 100 Research Drive Worcester, MA 01605 Depositado em nome de: Abbott Laboratories Referência de Identificação pelo Depositante: Designação do

Depósito de Pa- tente PTA-7239 PTA-7240 PTA-7241 PTA-7242

Linhagem Celular: ML15-10F11.3D9

Linhagem Celular: ML13-7C6.1D4.4A9.5G8

Linhagem Celular: ML15-5F7.5B10

Linhagem Celular: ML15-4B7.3A6

Os depósitos foram acompanhados por: _ uma descrição cientifica _ uma

descrição taxonômica proposta, indicada acima. Os depósitos foram rece- bidos em 01 de dezembro de 2005 por esta Autoridade Depositória Interna- cional e foram aceitos.

AO SEU PEDIDO: X Nós lhe informaremos sobre solicitações das cepas por 30 anos.

As cepas tornar-se-ão disponíveis, se um escritório de patentes, signa- tário do Tratado de Budapeste, certificar o direito de alguém a receber, ou, se for depositada uma Patente U.S. citando as cepas e a ATCC for instruída, pelo United States Patent & Trademark Office ou pelo deposi- tante, a liberar as citadas cepas.

Se as culturas devem morrer ou serem destruídas durante o termo efetivo do depósito, será sua responsabilidade substituí-las por culturas vivas das mesmas. As cepas serão mantidas por um período de pelo menos 30 anos a partir da data de depósito, ou de cinco anos após a mais recente solicitação de uma amostra, o que for mais longo. Os Estados Unidos e muitos outros países são signatários do Tratado de Budapeste.

A viabilidade das culturas citadas acima foi testada em 02 de fevereiro de 2006. Nessa data, as culturas estavam viáveis.

Autoridade Depositória Internacional: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209 USA.

Assinatura da pessoa que possui autoridade para representar a ATCC: ATCC

10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 - Tel.: 703-365-2700/Fax: 703-365-2745 TRATADO DE BUDAPESTE DO RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MI- CROORGANISMOS PARA FINALIDADES DE PROCEDIMENTO DE PATENTE FORMULÁRIO INTERNACIONAL RECIBO NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL EMITIDO DE ACORDO COM A REGRA 7.3

E DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE EMITIDA DE ACORDO COM A REGRA 10. Para: (Nome e Endereço do Depositante ou Advogado) Abbott Laboratories Attn: Boris Labkovsky 100 Research Drive Worcester, MA 01605 Depositado em nome de: Abbott Laboratories Referência de Identificação pelo Depositante: Designação do

Depósito de Pa- tente

Hibridoma: ML13-4D10.3F3 PTA-7405

Hibridoma: ML15-2F2.3E12 PTA-7408

Hibridoma: ML15-6A2-4B10 PTA-7409

Os depósitos foram acompanhados por: _ uma descrição cientifica _ uma

descrição taxonômica proposta, indicada acima. Os depósitos foram rece- bidos em 28 de fevereiro de 2006 por esta Autoridade Depositória Inter- nacional e foram aceitos.

AO SEU PEDIDO: X Nós lhe informaremos sobre solicitações das cepas por 30 anos.

As cepas tornar-se-ão disponíveis, se um escritório de patentes, signa- tário do Tratado de Budapeste, certificar o direito de alguém a receber, ou, se for depositada uma Patente U.S. citando as cepas e a ATCC for instruída, pelo United States Patent & Trademark Office ou pelo deposi- tante, a liberar as citadas cepas.

Se as culturas devem morrer ou serem destruídas durante o termo efetivo do depósito, será sua responsabilidade substituí-las por culturas vivas das mesmas.

As cepas serão mantidas por um período de pelo menos 30 anos a partir da data de depósito, ou de cinco anos após a mais recente solicitação de uma amostra, o que for mais longo. Os Estados Unidos e muitos outros países são signatários do Tratado de Budapeste.

A viabilidade das culturas citadas acima foi testada em 31 de março de 2006. Nessa data, as culturas estavam viáveis.

Autoridade Depositória Internacional: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209 USA.

Assinatura da pessoa que possui autoridade para representar a ATCC:

Tanya Nummally, Especialista em Patente, Data: 07 de abril de 2006

Depositório de Patentes da ATCC cc: Cheryl L. Becker ATCC

10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 - Tel.: 703-365-2700/Fax: 703-365-2745 TRATADO DE BUDAPESTE DO RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MI- CROORGANISMOS PARA FINALIDADES DE PROCEDIMENTO DE PATENTE FORMULÁRIO INTERNACIONAL RECIBO NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL EMITIDO DE ACORDO COM A REGRA 7.3

E DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE EMITIDA DE ACORDO COM A REGRA 10. Para: (Nome e Endereço do Depositante ou Advogado) Abbott Laboratories Attn: Boris Labkovsky 100 Research Drive Worcester, MA 01605 Depositado em nome de: Abbott Laboratories Referência de Identificação pelo Depositante: Designação do

Depósito de Pa- tente

Linhagem Celular de Hibridoma de Camundongo: PTA-7809

MLl5-7E5.5E12

Linhagem Celular de Hibridoma de Camundongo: PTA-7810

MLl5—IOCl.5C6.3H4

Os depósitos foram acompanhados por: _ uma descrição cientifica _ uma

descrição taxonômica proposta, indicada acima. Os depósitos foram rece- bidos em 16 de agosto de 2006 por esta Autoridade Depositória Interna- cional e foram aceitos.

AO SEU PEDIDO: X Nós lhe informaremos sobre solicitações das cepas por 30 anos.

As cepas tornar-se-ão disponíveis, se um escritório de patentes, signa- tário do Tratado de Budapeste, certificar o direito de alguém a receber, ou, se for depositada uma Patente U.S. citando as cepas e a ATCC for instruída, pelo United States Patent & Trademark Office ou pelo deposi- tante, a liberar as citadas cepas.

Se as culturas devem morrer ou serem destruídas durante o termo efetivo do depósito, será sua responsabilidade substituí-las por culturas vivas das mesmas. As cepas serão mantidas por um período de pelo menos 30 anos a partir da data de depósito, ou de cinco anos após a mais recente solicitação de uma amostra, o que for mais longo. Os Estados Unidos e muitos outros países são signatários do Tratado de Budapeste.

A viabilidade das culturas citadas acima foi testada em 28 de agosto de 2006. Nessa data, as culturas estavam viáveis.

Autoridade Depositória Internacional: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209 USA.

Assinatura da pessoa que possui autoridade para representar a ATCC:

Dee Bishop, Depositório de Patentes da ATCC cc: Cheryl L. Becker, Abbott Laboratories

Data: 31 de agosto de 2006 ATCC

10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 - Tel.: 703-365-2700/Fax: 703-365-2745 TRATADO DE BUDAPESTE DO RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MI- CROORGANISMOS PARA FINALIDADES DE PROCEDIMENTO DE PATENTE FORMULÁRIO INTERNACIONAL RECIBO NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL EMITIDO DE ACORDO COM A REGRA 7.3

E DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE EMITIDA DE ACORDO COM A REGRA 10.2 Para: (Nome e Endereço do Depositante ou Advogado)

Abbott Laboratories Attn: Boris Labkovsky 100 Research Drive Depositado em nome de: Abbott Laboratories Referência de Identificação pelo Depositante: Designação do Depósi- to de Patente

Linhagem Celular de Hibridoma de Camundongo: PTA-7851 ML15-3B10.2D5.3F1

0 depósito foi acompanhado por: _ uma descrição cientifica _ uma des- crição taxonômica proposta, indicada acima. 0 depósito foi recebido em

01 de setembro de 2006 por esta Autoridade Depositória Internacional e foi aceito.

AO SEU PEDIDO: X Nós lhe informaremos sobre solicitação da cepa por 30 anos.

A cepa tornar-se disponível, se um escritório de patentes, signatário do Tratado de Budapeste, certificar o direito de alguém a receber, ou, se for depositada uma Patente U.S. citando as cepas e a ATCC for instruída, pelo United States Patent & Trademark Office ou pelo depositante, a li- berar a citada cepa.

Se a cultura deve morrer ou ser destruída durante o termo efetivo do depósito, será sua responsabilidade substituí-la por cultura viva da mesma.

A cepa é mantida por um período de pelo menos 30 anos a partir da data de depósito, ou de cinco anos após a mais recente solicitação de uma amostra, o que for mais longo. Os Estados Unidos e muitos outros países são signatários do Tratado de Budapeste. A viabilidade da cultura citada acima foi testada em 11 de setembro de 2006. Nessa data, a cultura estava viável.

Autoridade Depositória Internacional: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209 USA.

Assinatura da pessoa que possui autoridade para representar a ATCC:

Dee Bishop, Depositório de Patentes da ATCC Data: 13 de setembro de 2006 cc: Cheryl L. Becker, Abbott Laboratories Lista de Seqüencias <110> Abbott GmbH & Co.KG Abbott Laboratories

<120> "ANTICORPOS DE GLOBULÔMEROS ΑΝΤΙ Αβ, FRAÇÕES QUE SE LIGAM AO ANTÍ- GENO DESTES, HIBRIDOMAS CORRESPONDENTES, ÁCIDOS NUCLÉICOS, VETORES, CÉ- LULAS HOSPEDEIRAS, MÉTODOS DE PRODUZIR OS DITOS ANTICORPOS, COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO OS DITOS ANTICORPOS, USOS DOS DITOS ANTICORPOS E MÉTODOS DE USAR OS DITOS ANTICORPOS"

<130> M/46385

<150> US 60/740,866 <151> 2005-11-28

<150> US 60/779,171 <151> 2006-03-03

<150> US 60/787,361 <151> 2006-03-30

<150> US 60/842,400 <151> 2006-09-05

<160> 42

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 360 <212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> VH ML15-5F7

<400> 1

caggtccagc tgaagcagtc tggagctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcact accttctata tacactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggaatg attggtcctg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagatgt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctcac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagagcaaag 300 tcagctcggg cggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 2

<211> 339 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Lys Ser Ala Arg Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120

<210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> VL MLl5-5F7 <400> 4

t Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

15 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Val Gln Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg <210> 5 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> VH ML15-10F11 <400> 5

caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagagg 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat atttatcctt acaatgatgg tactaagtac 180

aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagtatat 240

atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctacagtct attactgtac agtagagggt 300

gctacctggg acgggtactt cgatgtctgg ggcacaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

<210> 6

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> VL ML15-10F11 <400> 6

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca atcagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaaag gaaaaaccta tttgaattgg 120 ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggtac acattttcct 300 cacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339

<210> 7 <211> 120 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> VH ML15-10F11 <400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Val Glu Gly Ala Thr Trp Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> VL ML15-10F11

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 15 10 15

Gln Ser Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Lys Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg

<210> 9 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> VH ML13-7C6 <4 00> 9

gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagcgaaga ggctagagtg ggtcgcgtcc attcataata gaggtactat cttctatcta 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg tcaggaacac cctgtacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatatatt actgtacaag aggccggagt 300 aactcctatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcg 354

<210> 10 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> VL MLl3-7C6

gatgttttgg tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca ggcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgcc gatctactca gacccttgta catcgtaatg gagacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag tccctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagcggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339

<210> 11 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> VH ML13-7C6 <400> 11

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Ala Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile His Asn Arg Gly Thr Ile Phe Tyr Leu Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> VL ML13-7C6 <400> 1 Asp Val 1

Asp Gln

Asn Gly

Pro Lys 50

Asp Arg 65

Ser Arg Ser His Arg

2

Leu Val Thr Gin Ser

Ala Ser Ile Ser Cys 20

Asp Thr Tyr Leu Glu 35

Ser Leu Ile Tyr Lys 55

Phe Ser Gly Ser Gly 70

Val Glu Ala Glu Asp 85

Val Pro Tyr Thr Phe 100

Pro Leu Ser Leu 10

Arg Ser Thr Gln 25

Trp Tyr Leu Gln 40

Val Ser Asn Arg

Ser Gly Thr Asp 75

Leu Gly Val Tyr 90

Gly Gly Gly Thr 105

Pro Val Arg Leu Gly 15

Thr Leu Val His Arg 30

Lys Pro Gly Gln Ser 45

Phe Ser Gly Val Pro 60

Phe Thr Leu Lys.Ile 80

Tyr Cys Phe Gln Gly 95

Lys Leu Glu Ile Lys 110 <210> 13 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> VH ML15-4B7 <400> 13

gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaggctc ccggaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactacgaaa tggtgtgggt tcgacaggct 120 ccaggggagg ggctggagtg ggttgcatac attagtagtg gcagtcgtac catccactat 180 gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aaggacatta 300 cta.cggctac actttgacta ctggggccaa ggcaccattc tcacagtctc ctca 354

<210> 14

<211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> VL ML15-4B7 <400> 14

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca ggtccagtca gagccttttc tataggagca atcaaaagaa cttcttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gg 342

<210> 15 <211> 118 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> VH ML15-4B7

<400> 15

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Arg Thr Ile His Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Leu Leu Arg Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ile Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial

<223> VL ML15-4B7

<400> 16

Asp Ile Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Arg

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gin

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110

Lys Arg <210> 17 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> VH ML15-2F2 <400> 17

caggtccagc tgaagcagtc tggagctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcact accttctata tacactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggaatg attggtcctg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagatgt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctcac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagagcaaag 300 tcagctcggg cggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 18 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> VL ML15-2F2 <4 00> 18

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc atctcttgca gatctagtca gagcgttgta tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt cccacgttcg gaggggggac caagctggaa <210> 19 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> VH ML15-2F2 <4 00> 19

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Gly Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 cagagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 tattactgct ttcaaggttc acatgttcct 300 ataaaacgg 339 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Lys Ser Ala Arg Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120

<210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> VL MLl5-2F2 <400> 20 Asp Val Leu 1

Asp Gln Ala

Asn Gly Asn 35

Pro Lys Leu 50

Asp Arg Phe 65

Ser Arg Val Ser His Val

Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

5 10 15

Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Val Gln Ser 20 25 30

Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

40 45

Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

70 75 80

Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 21 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> VH ML15-6A2 <400> 21

caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcact accttctata tacactgggt gaggcagagg 120

cctggacagg gccttgagtg gattggaatg attggtcctg gaagtggtaa tacttactac 180

aatgagatgt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctcac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagagcaaag 300

tcacatcggg cggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360

<210> 22

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> VL ML15-6A2 <400> 22

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcgttgta cagagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tttggggtcc cagacaggtt cagtggcagt agatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcct 300 cccacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339

<210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> VH ML15-6A2 <400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 15 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Gly Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Lys Ser His Arg Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120

<210> 24 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> VL ML15-6A2 <400> 24

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Val Gln Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Phe Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg

<210> 25

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> VH ML13-4D10 <400> 25

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctagc ctaatacagc cctcacagag cctgtccata 60 acctgcacag tctctggttt ctcattaact agctatggtg tacactgggt tcgccagtct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagag gtggaaggat agactataat 180 gcagctttca tgtccagact gagcatcacc aaggacaact ccaagagcca agttttcttt 240 aaaatgaaca gtctgcaagc tgatgacact gccatatact actgtgccag aaactccgat 300 gtctggggca cagggaccac ggtcaccgtc tcctca 336

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> VL ML13-4D10

<400> 26

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatattgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339

<210> 27

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> VH ML13-4D10

<400> 27

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Ser Leu Ile Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Arg Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Ser Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110

<210> 28 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> VL ML13-4DlO <400> 28

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 15 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ile

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg <210> 29 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> VH ML15-7E5 <400> 29

gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaggctc ccggaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactacgaaa tggtgtgggt tcgacaggct 120

ccaggggagg ggctggagtg ggttgcatac attagtagtg gcagtcgtac catccactat 180

gcagacacag tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240

ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aaggacatta 300

ctacggctac actttgacta ctggggccaa ggcaccattc tcacagtctc ctca 354

<210> 30

<211> 342

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> VL ML15-7E5 <400> 30

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca ggtccagtca gagccttttc tataggagca atcaaaagaa cttcttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcq cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gg 342

<210> 31 <211> 118 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> VH ML15-7E5 <400> 31

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val

35 .40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Arg Thr Ile His Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Leu Leu Arg Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ile Leu Thr Val Ser Ser 115

<210> 32 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> VL ML15-7E5 <400> 32 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Arg

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110

Lys Arg

<210> 33

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> VH ML15-10C1 <400> 33

gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggt ttagtgcagc ctggaggctc ccggaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactacgaaa tggtgtgggt tcgacaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttgcatac attaatagtg gcagtggtac catccactat 180 gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240 ctgcaaatga gcagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aaggacatta 300 ctacggctac actttgacta ctggggccaa ggcaccattc tcactgtctc ctca 354 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> VL ML15-10C1 <400> 34

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60

atgagctgca agtccagtca gagccttttc tatagtcgca atcaaaagaa cttcttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactggg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttttagctat 300

ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gg 342

<210> 35

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> VH ML15-10C1 <400> 35

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Gly Thr Ile His Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Leu Leu Arg Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ile Leu Thr Val Ser Ser 115

<210> 36 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> VL ML15-10C1 <4 00> 36

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser

20 25 30

Arg Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Phe Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg

<210> 37

<211> 360

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> VH ML15-3B10

<400> 37

caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta tacactgggt gaagcagaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactcagtac 180 aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagtctac 240 atggagctca gcagtctgac ctctgaggac tctacagtct actactgtac agtagagggt 300 ggtacctggg acgggtattt cgatgtctgg ggcacaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

<210> 38 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> VH ML15-3B10 <400> 38

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Val Glu Gly Gly Thr Trp Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 39 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Ig gamma-1 região constante <400> 39

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Phe Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 40

<211> 330

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Ig gamma-1 região constante mutante

<400> 40

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 41 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ig Kappa região constante <400> 41

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

<210> 42 <211> 105 · <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Ig Lambda região constante <400> 42

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

Claims (37)

1. Anticorpo monoclonal tendo uma afinidade de ligação com um globulômero Αβ (20-42), CARACTERIZADO pelo fato de que é maior que a afinidade de ligação do anticorpo com um globulômero Αβ (1-42).

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Αβ (20-42) é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10000 vezes ou 100000 vezes maior que a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Αβ (1-42).

3. Anticorpo, de acordo a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga ao globulômero Αβ (20-42) com um K0 de 1x 10"7 M ou maior afinidade, com um Kd de 1x 10"8 M ou maior afinidade, com um Kd de 1x 10"9 M ou maior afinidade, com um K0 de 1x 10"10 M ou maior afinidade ou com um K0 de 1x 10"11 M ou maior afinidade.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Αβ (20-42) é maior que a afinidade de ligação do anticorpo com um globulômero Αβ(12-42).

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Αβ (20-42) é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10000 vezes ou 100000 vezes maior que a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Δβ(12-42).

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Αβ (20-42) é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10000 vezes ou 100000 vezes maior do que com um monômero Αβ(1- 42).

7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga ao monômero Αβ (1-42) com um K0 de -1 χ 10-8 M ou menor afinidade, com um K0 de 1 x 10-7 M ou menor afinidade, com um KD de 1 x 10-6 M ou menor afinidade ou com um K0 de 1 x 10-5 M ou menor afinidade.

8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a afinidade de ligação do anticorpo com globulômero Αβ (20- -42) é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10000 vezes ou 100000 vezes maior que a afinidade de ligação do anticorpo com um monômero Αβ (1-40).

9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga ao monômero Αβ (1-40) com um Kd de -1 x 10-8 M ou menor afinidade, com um Kd de 1 x 10-7 M ou menor afinidade, com um K0 de 1 x 10-6 M ou menor afinidade ou com um K0 de Ix IO"5 M ou menor afinidade.

10. Anticorpo, de acordo cora qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Αβ (20-42) é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10000 vezes ou 100000 vezes maior que a afinidade de ligação do anticorpo com fibrilas Αβ(1-42).

11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações Ia 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga a fibrilas Αβ(1-42) com um K0 de -1 x 10-8 M ou menor afinidade, com um K0 de 1 x 10-7 M ou menor afinidade, com um K0 de 1 x 10-6 M ou menor afinidade ou com um Kd de 1 x 10-5 M ou menor afinidade.

12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a afinidade de ligação do anticorpo com o globulômero Αβ (20-42) é pelo menos 10 vezes maior, 100 vezes, 1000 vezes, -10000 vezes ou 100000 vezes que a afinidade de ligação do anticorpo com fibrilas Αβ (1-40).

13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga a fibrilas Αβ (1-40) com um com um Kd de -1 x 10-8 M ou menor afinidade, com um Kd de 1 x 10-7 M ou menor afinidade, com um K0 de 1 x 10-6 M ou menor afinidade ou com um Kd de 1 x 10- M ou menor afinidade.

14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo recombinante.

15. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é humano ou humanizado.

16. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste no anticorpo monoclonal 5F7 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7241, o anticorpo monoclonal IOFll obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7239, o anticorpo monoclonal 7C6 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7240, o anticorpo monoclonal 4B7 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7242, o anticorpo monoclonal 2F2 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7408, o anticorpo monoclonal 6A2 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7409, o anticorpo monoclonal 4D10 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7405, o anticorpo monoclonal 7E5 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7809, o anticorpo monoclonal IOCl obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7810, e o anticorpo monoclonal 3B10 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7851.

17. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada CDR3 e/ou a seqüência de aminoácido da cadeia leve CDR3 de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste no anticorpo monoclonal 5F7 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7241, o anticorpo monoclonal 10F11 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7239, o anticorpo monoclonal 7C6 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7240, o anticorpo monoclonal 4B7 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA 7242, o anticorpo monoclonal 2F2 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7408, o anticorpo monoclonal 6A2 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7409, o anticorpo monoclonal 4D10 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7405, o anticorpo monoclonal 7E5 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7809, o anticorpo monoclonal 10Cl obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7810, e o anticorpo monoclonal 3B10 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7851.

18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada CDR2 e/ou a seqüência de aminoácidos da cadeia leve CDR2 de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste no anticorpo monoclonal 5F7 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7241, o anticorpo monoclonal 10Fll obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7239, o anticorpo monoclonal 7C6 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7240, o anticorpo monoclonal 4B7 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7242, o anticorpo monoclonal 2F2 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7408, o anticorpo monoclonal 6A2 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7409, o anticorpo monoclonal 4D10 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7405, o anticorpo monoclonal 7E5 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7809, o anticorpo monoclonal 1OCl obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7810, e o anticorpo monoclonal 3B10 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7851.

19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada CDRl e/ou a seqüência de aminoácido da cadeia leve CDRl de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste no anticorpo monoclonal 5F7 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7241, o anticorpo monoclonal -1OFll obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7239, o anticorpo monoclonal 7C6 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7240, o anticorpo monoclonal 4B7 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7242, o anticorpo monoclonal 2F2 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7408, o anticorpo monoclonal 6A2 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7409, o anticorpo monoclonal 4D10 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA- -7405, o anticorpo monoclonal 7E5 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7809, o anticorpo monoclonal 10C1 obtenivel de um hibridoma designado pelo número dê depósito da American Type Culture Collection PTA-7810, e o anticorpo monoclonal 3B10 obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA- -7851.

20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos uma CDR compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: resíduos de aminoácido -31-35 de SEQ ID NO:3, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:3, resíduos de aminoácido 99-109 de SEQ ID NO:3, resíduos de aminoácido 24-39 de SEQ ID NO:4, resíduos de aminoácido -55-61 de SEQ ID NO: 4, resíduos de aminoácido 94-102 de SEQ ID NO: 4, resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO: 7, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:7, resíduos de aminoácido 97-109 de SEQ ID NO:7, resíduos de aminoácido 24- -39 de SEQ ID NO: 8, resíduos de aminoácido 55-61 de SEQ ID NO:8, resíduos de aminoácido 94-102 de SEQ ID NO:8, resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:11, resíduos de aminoácido -50-65 de SEQ ID NO:11, resíduos de aminoácido 98-107 de SEQ ID NO:11, resíduos de aminoácido 24-39 de SEQ ID NO:12, resíduos de aminoácido 55-61 de SEQ ID NO:12, resíduos de aminoácido 94-102 de SEQ ID NO:12, resíduos de aminoácido -31-35 de SEQ ID NO: 15, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:15, resíduos de aminoácido 99-107 de SEQ ID NO:15, resíduos de aminoácido 24-40 de SEQ ID NO:16, resíduos de aminoácido 56-62 de SEQ ID NO:16, resíduos de aminoácido 95- -103 de SEQ ID NO:16, resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:19, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:19, resíduos de aminoácido 99-109 de SEQ ID NO:19, resíduos de aminoácido 24-39 de SEQ ID NO:20, resíduos de aminoácido 55- -61 de SEQ ID N0:20, resíduos de aminoácido 94-102 de SEQ ID NO:20, resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:23, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:23, resíduos de aminoácido 99-109 de SEQ ID NO:23, resíduos de aminoácido -24-39 de SEQ ID NO: 24, resíduos de aminoácido 55-61 de SEQ ID NO: 24, resíduos de aminoácido 94-102 de SEQ ID NO:24, resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:27, resíduos de aminoácido 50-65 de SEQ ID NO:27, resíduos de aminoácido 98- -101 de SEQ ID NO:27, resíduos de aminoácido 24-39 de SEQ ID NO:28, resíduos de aminoácido 55-61 de SEQ ID NO:28, resíduos de aminoácido 94-102 de SEQ ID NO:28, resíduos de aminoácido 31-535 de SEQ ID NO:31, resíduos de aminoácido -50-66 de SEQ ID NO:31, resíduos de aminoácido 99-107 de SEQ ID NO:31, resíduos de aminoácido 24-40 de SEQ ID NO:32, resíduos de aminoácido 56-62 de SEQ ID NO:32, resíduos de aminoácido 95-103 de SEQ ID NO:32, resíduos de aminoácido -31-35 de SEQ ID NO: 35, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:35, resíduos de aminoácido 99-107 de SEQ ID NO:35, resíduos de aminoácido 24-40 de SEQ ID NO:36, resíduos de aminoácido 56-62 de SEQ ID NO:36, resíduos de aminoácido 95- - 103 de SEQ ID NO: 36, resíduos de aminoácido 31-35 de SEQ ID NO:38, resíduos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO:38, e resíduos de aminoácido 98-109 de SEQ ID NO:38.

21. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos 3 CDRs são selecionados de um conjunto de CDR de domínio variável consistindo em: <table>table see original document page 250</column></row><table> residues 50-66 of SEQ ID NO:7 VH IOFll CDR-H3 TVEGATWDGYFDV: residues 97-109 of SEQ ID NO:7 VL 10FI1 CDR Set VL 10F11 CDR-Ll KSSQSLLYSKGKTXLN: residues 24-39 of SEQ ID NO:8 VL 10F11 CDR-L2 LVSKLDS: residues 55-61 of SEQ ID NO:8 VL 10F11 CDR-L3 VQGTHFPET: residues 94-102 of SEQ ID NO:8 VH 7C6 CDR Set VH 7C6 CDR-Hl SYAMS: residues 31-35 of SEQ ID NO:11 VH 7C6 CDR-H2 SIHNRGTIFYLDSVKG: residues 50-65 of SEQ ID NO:11 VH 7C6 CDR-H3 GRSNSYAMDY: residues 98-107 of SEQ ID NO: 11 VL 7C6 CDR Set VL 7C6 CDR-Ll RSTQTLVHRNGDTYLE: residues 24-39 of SEQ ID NO:12 VL 7C6 CDR-L2 KVSNRFS: residues 55-61 of SEQ ID NO:12 VL 7C6 CDR-L3 FQGSHVPYT: residues 94-102 of SEQ ID NO:12 VH 4Β7 CDR Set VH 4Β7 CDR-Hl DYEMV: residues 31-35 of SEQ ID NO:15 VH 4Β7 CDR-H2 YISSGSRTIHYADTVKG: residues 50-66 of SEQ ID NO:15 VH 4Β7 CDR-H3 TLLRLHFDY: residues 99-107 of SEQ ID NO:15 VL 4Β7 CDR Set VL 4Β7 CDR-Ll RSSQSLFYRSNQKNELA: residues 24-40 of SEQ ID NO:16 VL 4Β7 CDR-L2 WASTRES: residues 56-62 of SEQ ID NO:16 VL 4Β7 CDR-L3 QQYYSYPWT: residues 95-103 of SEQ ID NO:16 VH 2F2 CDR Set VH 2F2 CDR-Hl TFYIH: residues 31-35 of SEQ ID NO:19 VH 2F2 CDR-H2 MIGPGSGNTYYNEMFKD: residues 50-66 of SEQ ID NO:19 VH 2F2 CDR-H3 AKSARAAWFAY: residues 99-109 of SEQ ID NO:19 VL 2F2 CDR Set VL 2F2 CDR-Ll RSSQSVVQSNGNTYLE: residues 24-39 of SEQ ID N0:20 VL 2F2 CDR-L2 KVSNRFS: residues 55-61 of SEQ ID N0:20 VL 2F2 CDR-L3 FQGSHVPPT: residues 94-102 of SEQ ID N0:20 VH 6Α2 CDR Set VH 6Α2 CDR-Hl TFYIH: residues 31-35 of SEQ ID N0:23 VH 6Α2 CDR-H2 MIGPGSGNTYYNEMFKD: 13 residues 50-66 of SEQ ID ΝΟ:23 VH 6Α2 CDR-H3 AKSHRAAWFAY: residues 99-109 of SEQ ID Ν0:23 VL 6Α2 CDR Set VL 6Α2 CDR-Ll RSSQSVVQSNGNTYLE: residues 24-39 of SEQ ID Ν0:24 VL 6Α2 CDR-L2 KVSNRFF: residues 55-61 of SEQ ID Ν0:24 VL 6Α2 CDR-L3 FQGSHVPPT: residues 94-102 of SEQ ID Ν0:24 VH 4D10 CDR Set VH 4D10 CDR-Hl SYGVH: residues 31-35 of SEQ ID Ν0:27 VH 4D10 CDR-H2 VIWRGGRIDYNAAFMS: residues 50-65 of SEQ ID ΝΟ:27 VH 4D10 CDR-H3 NSDV: residues 98-101 of SEQ ID ΝΟ:27 VL 4D10 CDR Set VL 4D10 CDR-Ll KSSQSLLDIDGKTYLN: residues 24-39 of SEQ ID Ν0:28 VL 4D10 CDR-L2 LVSKLDS: residues 55-61 of SEQ ID Ν0:28 VL 4D10 CDR-L3 WQGTHFPYT: residues 94-102 of SEQ ID Ν0:28 VH 7Ε5 CDR Set VH 7Ε5 CDR-Hl DYEMV: residues 31-35 of SEQ ID NO:31 VH 7Ε5 CDR-H2 YISSGSRTIHYADTVKG: residues 50-66 of SEQ ID NO:31 VH 7Ε5 CDR-H3 TLLRLHFDY: residues 99-107 of SEQ ID NO:31 VL 7Ε5 CDR Set VL 7Ε5 CDR-Ll RSSQSLFYRSNQKNFLA: residues 24-40 of SEQ ID N0:32 VL 7Ε5 CDR-L2 WASTRES: residues 56-62 of SEQ ID NO:32 VL 7Ε5 CDR-L3 QQYYSYPWT: residues 95-103 of SEQ ID N0:32 VH IOCl CDR Set VH IOCl CDR-Hl DYEMV: residues 31-35 of SEQ ID N0:35 VH IOCl CDR-H2 YINSGSGTIHYADTVKG: residues 50-66 of SEQ ID NO:35 VH IOCl CDR-H3 TLLRLHFDY: residues 99-107 of SEQ ID NO:35 VL IOCl CDR Set VL IOCl CDR-Ll KSSQSLFYSRNQKNFLA: residues 24-40 of SEQ ID N0:36 VL IOCl CDR-L2 WASTGES: residues 56-62 of SEQ ID NO:36 VL IOCl CDR-L3 QQYYSYPWT: residues 95-103 of SEQ ID NO:36 VH 3Β10 CDR Set VH 3Β10 CDR-Hl DYVIH: residues 31-35 of SEQ ID N0:38 VH 3Ε10 CDR-H2 YINPYNDGTQYNEKFKG: <table>table see original document page 255</column></row><table>

22. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos 2 conjuntos CDR de domínio variável.

23. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que os pelo menos 2 conjuntos CDR de domínio variável são selecionados do grupo que consiste em: conjunto VH 5F7 CDR & Conjunto VL 5F7 CDR; Conjunto VH IOFll CDR & Conjunto VL 10F11 CDR; Conjunto VH 7C6 CDR & Conjunto VL 7C6 CDR; Conjunto VH 4B7 CDR & Conjunto VL 4B7 CDR; Conjunto VH 2F2 CDR & Conjunto VL 2F2 CDR; Conjunto VH 6A2 CDR & Conjunto VL 6A2 C DR; Conjunto VH 4D10 CDR & Conjunto VL 4D10 CDR; Conjunto VH 7E5 CDR & Conjunto VL 7E5 CDR; e Conjunto VH 10C1 CDR & Conjunto VL IOCl CDR.

24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um domínio variável tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, e SEQ ID NO:38.

25. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 24, compreendendo dois domínios variáveis, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos dois domínios variáveis têm seqüências de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:3 & SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7 & SEQ ID NO:8 & SEQ ID NO:11 & SEQ ID NO: 12, SEQ ID N0:15 & SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:19 & SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:23 & SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:27 & SEQ ID NO:28, SEQ ID N0:31 & SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:35 & SEQ ID NO:36.

26. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que selecionado dentre: Anticorpo monoclonal (5F7) obtenível de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7241; Anticorpo monoclonal (IOFll) obtenível de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7239; Anticorpo monoclonal (7C6) obtenível de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7240; Anticorpo monoclonal (4B7) obtenível de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7242; Anticorpo monoclonal (2F2) obtenível de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7408; Anticorpo monoclonal (6A2) obtenível de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7409; Anticorpo monoclonal (4D10) obtenível de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7405; Anticorpo monoclonal (7E5) obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7809; Anticorpo monoclonal (IOCl) obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7810; e Anticorpo monoclonal (3B10) obtenivel de um hibridoma designado pelo número de depósito da American Type Culture Collection PTA-7851.

27. Fração de um anticorpo que se liga ao antigeno, CARACTERIZADA pelo fato de que é conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.

28. Ácido nucléico isolado, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica uma seqüência de aminoácidos de anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-27.

29. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucléico isolado conforme definido na reivindicação 28.

30. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um vetor conforme definido na reivindicação 29.

31. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que é um hibridoma designado por um número de depósito da American Type Culture Collection selecionado do grupo que consiste em PTA-7241, PTA-7239, PTA-7240, PTA-7242, PTA-7408, PTA-7409, PTA-7405, PTA-7809, PTA-7810 e PTA-7851.

32. Método de produzir um anticorpo monoclonal, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 30 ou um hibridoma conforme definido na reivindicação 31, em meio de cultura sob condições adequadas para produzir o anticorpo.

33. Anticorpo monoclonal, CARACTERIZADO pelo fato de ser obtenivel pelo método definido na reivindicação 32.

34. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um anticorpo ou uma fração que se liga ao antigeno conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 33 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

35. Uso de um anticorpo ou de uma fração que se liga ao antigeno, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de ser para preparar uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma amiloidose.

36. Uso de um anticorpo ou de uma fração que s liga ao antigeno, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de ser para preparar uma composição para diagnosticar uma amiloidose tal como doença de Alzheimer ou Sindrome de Down.

37. Método para diagnosticar uma amiloidose, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende fornecer uma amostra do sujeito suspeito de ter a amiloidose, tal como doença de Alzheimer ou Sindrome de Down, contatar a amos- tra com um anticorpo ou uma fração que se liga ao antige- no, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 33, e detectar a formação de um complexo compreen- dendo o anticorpo ou a fração que se liga ao antigeno com um antigeno, a presença do complexo indicando uma amiloi- dose no sujeito.