ES2304252T3 - Derivados sustituidos en posicion 4 de pirazolo(3,4-d)pirimidina y utilizaciones de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Derivados de pirazolo[3,4-d]pirimidina 4-sustituidos que tienen la fórmula (Ver fórmula) en la que X=N; R=H, alquiltio o aminoalquiltio; R1=NHciclopropilo o NHC3H7 o NHC4H9 o N(CH2CH3)2, o bien NHCH2CH2OC2H5 o 1-pirrolidinilo o 1-piperidinilo o 4-morfolinilo o NHciclohexilo o 1-hexahidroacepinilo o NHCH2C6H5 o NHCH2CH2C6H5; (Ver fórmula) en la que R3=H, halógeno, alquilo; (Ver fórmula) R 5=Cl, Br o OH.
Description
Derivados sustituidos en posición 4 de pirazolo
[3,4-d]pirimidina y utilizaciones de los
mismos.
La presente invención se refiere a derivados de
pirazolo[3,4-d]pirimidina sustituidos
en posición 4. Además, la patente se refiere a la utilización de
compuestos, que se describen en esta descripción, como agentes
especialmente destinados a la terapia de tumores y leucemia pero
sin limitación a la misma, a su utilización para la preparación de
compuestos farmacéuticos, métodos para síntesis de compuestos y sus
intermediarios.
A lo largo de las tres últimas décadas, las
enfermedades neoplásicas han sido la segunda causa más habitual de
muerte entre la población occidental y las tasas de incidencia han
ido aumentando a lo largo del tiempo ^{1}. En el entretanto, si
bien las tasas de supervivencia de pacientes de cáncer están
aumentando sustancialmente los porcentajes de incidencia son
todavía muy elevados. El desplazamiento de fenotipo desde el
estándar al neoplásico es un evento biológico sustancialmente
complejo que comporta muchas alteraciones en la fisiología celular.
Entre ellas, la sobreexpresión del factor de transducción tiene un
papel crítico, y una de las modificaciones más estudiadas y más
interesantes son las que se refieren a la sobreexpresión de Src
tirosina kinasa (TK)^{2}. Este TK es el miembro prototipo
de la familia de Src no-receptor de proteína
tirosina kinasas (PTK)^{3}. La Src es activada después de
la aplicación de muchas clases distintas de receptores celulares y
participa como punto de convergencia en diferentes rutas de
señalización ^{4,5}. A este respecto, la Src es un componente
crítico de las cascadas de señalización iniciadas por receptores
enlazados por TK, tales como el receptor del factor de crecimiento
epidérmico (EGFR) y los receptores acoplados a
proteína-G, y está directamente asociada con EGFR a
la que puede regular con intermedio de señalización y con el
receptor HER-2/neu PTK ^{6,7}, estando ambos
involucrados en el cáncer. Finalmente, la sobreexpresión y
activación de Src ha sido correlacionada con un gran número de
procesos reguladores del crecimiento en los que participa Src. El
proceso de activación de Src es mediado por la fosforilación de la
tirosina 416; en base a ello, inhibidores del proceso de
fosforilación de Src pueden interrumpir el crecimiento de las
células tumorales sin control y pueden jugar un importante papel
como nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer.
Los autores han diseñado y sintetizado una nueva
clase de derivados de
pirazolo[3,4-d]pirimidina. También
han descubierto que algunos de estos compuestos eran inhibidores de
la proliferación celular en A431, 8701-BC y en
líneas de células de leucemia. Por lo tanto, los nuevos compuestos
pueden ser considerados como potenciales agentes antitumorales y
antileucémicos.
Por lo tanto, es un objetivo de la invención un
derivado sustituido en posición 4 de
pirazolo[3,4-d]pirimidina que tiene
la fórmula
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\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
X=N;
R=H, alquiltio o
aminoalquiltio;
R_{1}=NHciclopropil o
NHC_{3}H_{7} o NHC_{4}H_{9} o
N(CH_{2}CH_{3})_{2}, o
bien
NHCB_{2}CH_{2}OC_{2}H_{5} o
1-pirrolidinilo o 1-piperidinilo o
4-morfolinilo o NHciclohexilo o
1-hexahidroacepinilo o NHCH_{2}
C_{6}H_{5} o NHCH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5};
C_{6}H_{5} o NHCH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5};
R_{2}=H, o
bien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{3}=H, halógeno,
alquilo;
R_{5}=Cl, Br o
OH.
Preferentemente X=N; R=H o SCH_{3} o
SC_{2}H_{5}; R_{t}=NHC_{3}H_{7} o NHC_{4}H_{9} o
N(CH_{2}CH_{3})_{2} o
NHCH_{2}CH_{2}OC_{2}H_{5} o 1-pirrolidinilo
o 1-piperidinilo o 4-morfolinilo o
NHciclohexilo o 1-hexahidroacepinilo o
NHCH_{2}C_{6}H_{5} o NHCH_{2}CH_{2}
C_{6}H_{5};
C_{6}H_{5};
R_{2}=H;
R_{3}=H;
R_{5}=Cl, Br,
OH.
Preferentemente X=N, R=SCH_{3}, R_{1} es uno
de los residuos siguientes: N-HC_{4}H_{9} o
1-piperidinilo o 4-morfolinilo o
NHCH_{2}C_{6}H_{5} o NHCH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5},
R_{2}=R_{3}=H,
R_{4}=2-cloro-2-feniletilo.
Preferentemente X=N, R=SC_{2}H_{5}, R_{1}
es uno de los residuos siguientes: NHC_{3}H_{7} o
NHC_{4}H_{9} o NHCH_{2}C_{6}H_{5}, R_{2}=R_{3}=H,
R_{4}=2-cloro-2-feniletilo.
Preferentemente X=N, R=H, R_{1} es uno de los
residuos siguientes: NHC_{4}H_{9} o NHciclohexilo.
R_{2}=R_{3}=H,
R_{4}=2-bromo-2-feniletilo.
Preferentemente X=N, R=H, R_{1} es uno de los
siguientes residuos: 1-piperidinilo o
NHCH_{2}C_{6}H_{5} o NHCH_{2}CH_{2}C_{6}
H_{5}. R_{2}=R_{3}=H, R_{4}=2-hidroxi-2-feniletilo.
H_{5}. R_{2}=R_{3}=H, R_{4}=2-hidroxi-2-feniletilo.
Preferentemente X=N, R=H, R_{1} es uno de los
residuos siguientes: NHCH_{2}CH_{2}OC_{2}H_{5} o
NHCH_{2}C_{6}H_{5} o NHCH_{2}CH_{2}
C_{6}H_{5}. R_{2}=R_{3}=H, R_{4}=estirilo.
C_{6}H_{5}. R_{2}=R_{3}=H, R_{4}=estirilo.
En una realización de la invención, el compuesto
de la invención es utilizado como medicamento, preferentemente como
agente antitumoral y/o agente antileucemia.
Es otro objetivo de la invención un compuesto
farmacéutico que comprende, como mínimo, uno de los compuestos de
la invención o una o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
y excipientes y/o diluyentes adecuados.
Se pueden administrar compuestos de la invención
o sus sales como componentes puros o como formulaciones
farmacéuticas, es decir adecuadas para administración parenteral,
oral o rectal. Cada una de dichas formulaciones puede contener
excipientes y/o cargas y/o aditivos y/o aglutinantes, recubrimientos
y/o agentes de suspensión y/o agentes de emulsión, agentes
preservantes y/o de control de la liberación, adecuados para la
forma farmacéutica seleccionada.
La invención se describirá con referencia a las
siguientes figuras:
- Figura 1. Ruta sintética de los compuestos
1-5.
- Figura 2. Efectos inhibidores de los
compuestos 1a, 1e, 1f y 2c sobre el crecimiento
8701-BC de células medidas por medio de ensayo MTT
^{21}. Los valores son medios \pm SEM de tres experimentos
independientes llevados a cabo de forma duplicada.
- Figura 3. Inhibición fosfo-Src
por los compuestos 1a, 1e, 1f y 2c hacia las células
8701-BC con respecto al compuesto de referencia PP2.
Se llevó a cabo análisis de inmunotransferencia utilizando
anticuerpos fosfo-específicos con respecto a Src
(Tyr416). Los filtros fueron sometidos adicionalmente a nueva prueba
con anticuerpos específicos no-fosfo
anti-Src después de extracción. Día 1: control
celular; día 2: células tratadas durante 15 min EGF (100 nM); días
3 y 7: células atacadas durante 3 h en presencia de 10 \muM del
compuesto especificado y tratadas luego durante 15 min EGF (100
nM). Los resultados son representativos de tres experimentos
independientes.
- Figura 4. Efectos inhibitorios de los
compuestos 2c, 1b y 1e sobre el crecimiento de células A431 medidas
por el ensayo MTT ^{21}.
Los valores son medios \pm SEM de tres
experimentos independientes llevados a cabo de forma duplicada.
- Figura 5. Inhibición fosfo-Src
por los compuestos 1b, 2c y 1e hacia células A431, en comparación
con el compuesto de referencia PP2. Las células fueron cultivadas
con una concentración de 20^{3} células/mL en presencia de 10
\muM del compuesto específico durante 3 h a 37ºC. Se añadió EGF
(0,1 \muM, Cell Signaling Technology, MA, U.S.A.) 10 min antes de
lisis. Los lisados de células (40 \mug de proteína) fueron
sometidos a SDS-PAGE y se transfirieron
electroforéticamente a una membrana de fluoruro de polivinilideno.
La inmunotransferencia fue llevada a cabo utilizando el anticuerpo
específico. Las membranas fueron visualizadas con sustratos
luminiscentes. La figura es un gel representativo de tres
experimentos similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Los compuestos 1-2 (figura 1)
fueron preparados empezando del etil ester del ácido
5-amino-1-(2-hidroxi-2-feniletilo)-1H-pirazol-4-carboxílico,
obtenido siguiendo el proceso de los inventores que se ha indicado
^{8}. La reacción de 5 con benzoil isotiocianato en THF en
reflujo durante 8 h proporcionó el intermediario 6, que fue
ciclificado a la pirazolo[3,4-d] pirimidina
7 por tratamiento con 1M NaOH a 100ºC durante 10 min, seguido de
acidificación con ácido acético (rendimiento 80%). La alquilación
del grupo tio en posición 6 con ioduro de metilo o de etilo en THF
en reflujo facilitó los derivados o de 6-tiolquilo,
que a su vez fueron tratados con el complejo de Vilmeier
(POCl_{3}: DMF, 4 equiv) en CHCl_{3} para obtener los
compuestos dialogenados 9 que tienen el átomo de cloro tanto en la
posición 4 del núcleo pirimidina como en la cadena lateral en N1.
Los compuestos 9 fueron purificados con un rendimiento
satisfactorio por cromatografía sobre columna de Gel de Sílice.
Finalmente, la sustitución regioselectiva del átomo de cloro C4 con
un exceso de varias aminas facilitó los compuestos deseados
1-2 con rendimientos comprendidos entre 60 y 80%.
De forma notable, el átomo de cloro en la cadena lateral no ha sido
sustituido en ningún caso por la amina a pesar de su posición
bencílica, tal como se ha mostrado por los desplazamientos químicos
^{1}H NMR de la cadena lateral CH_{2}-CH, que
proporcionó un modelo de complejo ABX que es similar al del
material inicial.
La reacción de 5 con formamida en exceso a 190ºC
durante 8 h facilitó la
pirazolo[3,4-d]pirimidinona 10 que
fue purificada por solución del crudo en 2M NaOH, ebullición con
carbón, seguido de precipitación con ácido acético (rendimiento
70%, p.f. 271-272ºC).
El compuesto 11 fue preparado con un rendimiento
de 44% siguiendo el proceso Beal and Véliz^{9} por tratamiento de
10 con una mezcla de HMPT/NBS en acetonitrilo a -20ºC seguido de la
adición de LiBr y reflujo. Es interesante indicar que el OH
secundario en la cadena lateral permaneció sin alteración por este
procedimiento tal como se muestra por su espectro ^{1}H NMR. El
tratamiento de 11 con morfolina, butilamina o piperidina proporcionó
los compuestos deseados 3a-c.
La reacción de 10 en reflujo con POCl_{3}
facilitó el derivado de 1-estirilo 12 que fue
obligado a reaccionar con un exceso de varia aminas en tolueno
proporcionando 4a-d con un rendimiento
satisfactorio.
Los materiales iniciales fueron adquiridos
Aldrich-Italia (Milan, Italy).
Los puntos de fusión fueron determinados por un
aparato Büchi 530 y no se han corregido. Los espectros IR fueron
medidos en KBr con un espectrofotómetro
Perkin-Elmer 398. Los espectros ^{1}H MNR fueron
registrados en una solución de (CD_{3})_{2}SO en un
instrumento Varian Gemini 200 (200 MHz). Los desplazamientos
químicos se ha indicado en forma de \delta (ppm) con respecto a
TMS como estándar interno, J en Hz. Los modelos ^{1}H se
describen utilizando los siguientes abreviaturas: s = simple, d =
doble, t = triple, q = cuádruple, sx = séxtuple, m = múltiple, br =
amplio.
Todos los compuestos fueron comprobados en
cuanto pureza mediante TLC (Merk, Silica gel 60 F_{254},
CHCl_{3} como eluyente).
Los análisis para C, H y N se encontraban dentro
de \pm 0,3% del valor teórico.
Se muestra un esquema en la figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Una suspensión de 5(2,7 g, 10 mmol) y
benzoilo isotiocianato (1,7 g, 11 mmol) en tetrahidrofurano anhidro
(THF) (20 mL) fue sometido al reflujo durante 12 h. El disolvente
fue evaporado a presión reducida; el residuo aceitoso fue
cristalizado con añadidura de dietil éter (30 mL) facilitando el
producto puro 6(4,07 g, 93%) en forma de sólido blanco; p.f.
171-172ºC. ^{1}H NMR: \delta 1,29 (t, J=7,0, 3H,
CH_{3}), 3,97-4,20 (m, 5H, 2CH_{2} + OH, 1H
desaparece con D_{2}O), 4,58-4,68 (m, 1H, CHO),
7,05-7,98 (m, 10 H Ar), 8,02 (s, 1H,
H-3), 8,70 (s, 1H, NH, desaparece con D_{2}O),
12,05 (s, 1H, NH, desaparece con D_{2}O). IR cm^{-1}: 3221
(NH), 3190-2940 (OH), 1708 y 1671 (2 CO). Anal.
(C_{22}H_{22}N_{4}O_{4}S) C, H, N, S.
Una solución de 6(4,38 g, 10 mmol) en 2 M
NaOH (40 mL) fue sometida a reflujo durante 10 min y a
continuación, fue diluida con H_{2}O (40 mL). La solución fue
acidificada con ácido acético glacial. Permaneciendo en un
refrigerador durante 12 h, cristalizó un sólido, y se filtró y
recristalizó a partir de etanol absoluto consiguiendo 7 (2,3 g,
80%) en forma de sólido blanco; p.f. 264-265ºC.
^{1}H NMR: \delta 4,15-4,30 y
4,55-4,72 (2m, 2H, CH_{2}N),
4,85-5,00 (m, 1H, CHO), 5,66 (br s, 1H, OH,
desaparece con D_{2}O), 7,20-7,51 (m, 5H Ar),
8,02 (s, 1H, H-3), 12,20 (s, 1H, NH, desaparece con
D_{2}O), 13,40 (s, 1H, NH, desaparece con D_{2}O). IR
cm^{-1}: 3362 (NH), 3142-2773 (OH), 1681 (CO).
Anal. (C_{13}H_{12}N_{4}O_{2}S)C, H, N, S.
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de 7(2,88 g, 10 mmol) y
ioduro de metilo (7,10 g, 50 mmol) en THF anhidro (20 mL) fue
sometida a reflujo durante 12 h. El disolvente y el exceso de
ioduro de metilo fueron eliminados por destilación a presión
reducida; el residuo aceitoso fue cristalizado por añadidura de
CHCl_{3} (10 mL) y se purificó por recristalización con etanol
absoluto proporcionando 8a (2,17 g, 72%) en forma de sólido blanco;
p.f. 208-209ºC. ^{1}H NMR: \delta 2,51 (s, 3H,
CH_{3}), 4,27-4,50 (m, 2H, CH_{2}N),
5,04-5,18 (m, 1H, CHO), 5,68 (d, 1H, OH, desaparece
con D_{2}O), 7,20-7,42 (m, 5H Ar), 7,79 (s, 1H,
H-3). IR cm^{-1}: 3544 (NH),
3450-3350 (OH), 1678 (CO). Anal.
(C_{14}H_{14}N_{4}O_{2}S)C, H, N, S.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 8b fue preparado de acuerdo con la
secuencia sintética descrita para el compuesto 8a, utilizando
ioduro de etilo como agente alquilante. En este caso, el producto en
bruto fue purificado por cromatografía de columna (Gel de Sílice,
Malla 100) utilizando una mezcla de CHCl_{3}:MeOH (9:1) como
eluyente, consiguiendo producto en bruto 8b (2,05 g, 65%) en forma
de sólido amarillento: p.f. 199-200ºC. ^{-1}H NMR:
\delta 1,45 (t, J=7,6, 3H, CH_{3}), 3,22 (q, J= 7,4, 2H,
CH_{2}), 4,44-4,68 (m, 2h, CH_{2}N),
5,21-5,30 (m, 1H, CHO), 7,26-7,47
(m, 5H Ar), 8,10 (s, 1H, H-3). IR cm^{-1} 3470
(NH), 3450-3340 (OH), 1670 (CO). Anal.
(C_{15}H_{16}N_{4}O_{2}S)C, H, N, S.
\vskip1.000000\baselineskip
El complejo de Vilsmeier, previamente preparado
a partir de POCl_{3} (6,13 g, 40 mmol) y de dimetilformamida
anhidra (DMF) (2,92 g, 40 mmol) fue añadido a una suspensión de 8a
(3,02 g, 10 mmol) en CHCL_{3} (20 ml).
La mezcla fue sometida a reflujo durante 4 h. La
solución fue lavada con H_{2}O (2 x 20 mL), secada (MgSO_{4}),
filtrada y concentrada a presión reducida. El producto aceitoso en
bruto fue purificado por cromatografía de columna (Gel de Sílice,
malla 100), utilizando una mezcla de dietil éter/éter de petróleo
(p.e. 40-60ºC) (1:1) como eluyente, para conseguir
el producto puro 9a(2,2 g, 65%) en forma de sólido blanco,
p.f. 95-96ºC. ^{1}H NMR: \delta 2,62(s,
3H, CH_{3}), 4,77-5,05 (m, 2H, CH_{2}N),
5,45-5,56 (m, 1H, CHCl), 7,29-7,46
(m, 5H Ar), 8,02 (s, 1H, H-3). Anal.
(C_{14}H_{12}N_{4}SCl_{2})C, H, N, S.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 9b fue preparado según la secuencia
sintética descrita para el compuesto 9a, empezando de 8b, para
conseguir el producto puro 9b (2,12 g, 60%) en forma de sólido
blanco, p.f. 89-90ºC.
^{1}H NMR: \delta 1,49 (t, J= 7,2, 3H,
CH_{3}), 3,23 (q, J= 7,2, 2H, CH_{2}), 4,75-5,03
(m, 2H, CH_{2}N), 5,43-5,57 (m, 1H, CHCl),
7,28-7,47 (m, 5H Ar), 8,04 (s, 1H,
H-3). Anal.
(C_{15}H_{14}N_{4}SCl_{2})C, H, N, S.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 9a o 9b (10 mmol) en tolueno
anhidro (20 mL), se añadió la amina apropiada (40 mmol) y la
mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 24 h.
La mezcla fue lavada con H_{2}O, la fase orgánica fue secada
(MgSO_{4}) y evaporada a presión reducida, el residuo aceitoso
cristalizado por añadidura de éter de petróleo (p.e.
40-60ºC) (10 mL), proporcionó los productos
1a-f y 2a-c.
- 1a.
- Sólido de color blanco, rendimiento 60%. ^{1}H NMR: \delta 1,60-1,82 (m, 6H, 3CH_{2}pip), 2,57 (s, 3H, CH_{3}), 3,82-3,98 (m, 4H, 2CH_{2}Npip), 4,70-4,97 (m, 2H, CH_{2}N), 5,53-5,64 (m, 1H, CHCl), 7,28-7,49 (m, 5H Ar), 7,81 (s, 1H, H-3). Anal. (C_{19}H_{22}N_{s}SCL)C, H, N, S.
- 1b.
- Sólido de color blanco, rendimiento 75%. ^{1}H NMR: \delta 2,57 (s, 3H, CH_{3}), 3,77-3,87 y 3,89-3,98 (2m, 8H, 4CH_{2}morph), 4,71-4,98 (m, 2H, CH_{2}N), 5,51-5,61 (m, 1H, CHCl), 7,26-7,49 (m, 5H Ar), 7,82 (s, 1H, H-3). Anal. (C_{18}H_{20}N_{5}OSCl)C, H, N, S.
- 1c.
- Sólido de color blanco, rendimiento 68%. ^{1}H NMR: \delta 1,21 (t, J= 7,0, 3H, CH_{3}), 2,56 (s, 3H, CH_{3}S), 3,53 (q, J= 7,0, 2H, OCH_{2}CH_{3}), 3,55-3,85 (m, 4H, 2CH_{2}), 4,66-4,97 (m, 2H, CH_{2}N), 5,45-5,60 (m, 1H, CHCl), 5,72 (br s, 1H, NH, desaparece con D_{2}O), 7,27-7,44 (m, 5H Ar), 7,77 (s, 1H, H-3). IR cm^{-1}: 3441 (NH). Anal. (C_{18}H_{22}N_{5}OSCl)C, H, N, S.
- 1d.
- Sólido de color blanco, rendimiento 62%. ^{1}H NMR: \delta 0,97 (t, J= 7,0, 3H, CH_{3}), 1,33-1,84 (m, 4H, 2CH_{2}), 2,57 (s, 3H, CH_{3}S), 3,59 (q, J= 7,0, 2H, CH_{2}NH), 4,70-4,95 (m, 2H, CH_{2}N), 5,49-5,60 (m, 1H, CHCl), 7,23-7,49 (m, 5H Ar), 7,78 (s, 1H, H-3). IR cm^{-1}: 3413 (NH). Anal. (C_{18}H_{22}N_{5}SCl)C, H, N, S.
- 1e.
- Sólido de color blanco, rendimiento 81%. ^{1}H NMR: \delta 2,58 (s, 3H, CH_{3}), 4,70-4,94 (m, 4H, CH_{2}NH), 5,50-5,60 (m, 1H, CHCl), 7,24-7,96 (m, 10H Ar), 7,72 (s, 1H, H-3). IR cm^{-1}: 3442 (NH). Anal. (C_{21}H_{20}N_{5}SCl)C, H, N, S.
- 1f.
- Sólido de color blanco, rendimiento 76%. ^{1}H NMR: \delta 2,59 (s, 3H, CH_{3}), 2,98 (q, J= 6,0, 2H, CH_{2}Ar), 3,87 (q, J= 6,0, 2H, CH_{2}NH), 4,70-4,95 (m, 2H, CH_{2}N), 5,30 (br s, 1H, NH, desaparece con D_{2}O), 5,50-5,60 (m, 1H, CHCl), 7,19-7,48 (m, 10H Ar), 7,73 (s, 1H, H-3). IR cm^{-1}: 3445 (NH). Anal. (C_{22}H_{22}N_{5}SCl)C, H, N, S.
- 2a.
- Sólido de color blanco, rendimiento 65%. ^{1}H NMR: \delta 1,46 (t, J= 7,4, 3H, CH_{3}), 1,65-1,82 (m, 6H, 3CH_{2}pip), 3,18 (q, J= 7,4, 2H, CH_{2}), 3,84-3,96 (m, 4H, 2CH_{2}Npip), 4,70-4,97 (m, 2H, CH_{2}N), 5,53-5,64 (m, 1H, CHCl), 7,28-7,52 (m, 5H Ar), 7,84 (s, 1H, H-3). Anal. (C_{20}H_{24}N_{5}SCl)C, H, N, S.
- 2b.
- Sólido de color blanco, rendimiento 80%. ^{1}H NMR: \delta 1,46 (t, J= 7,4, 3H, CH_{3}), 3,15 (q, J= 7,4, 2H, CH_{2}), 3,73-3,88 y 3,90-4,08 (2m, 8H, 4CH_{2}morph), 4,69-5,00 (m, 2H, CH_{2}N), 5,51-5,62 (m, 1H, CHCl), 7,23-7,56 (m, 5H Ar), 7,82 (s, 1H, H-3). Anal. (C_{19}H_{22}N_{5}OSCl)C, H, N, S.
- 2c.
- Sólido de color blanco, rendimiento 60%. ^{1}H NMR: \delta 0,95 (t, J= 7,6, 3H, CH_{3}but), 1,44 (m, 5H, SCH_{2}CH_{3} + CH_{2}but), 1,60-1,67 (m, 2H, CH_{2}but), 3,18 (q, J= 7,6, 2H, CH_{2}S), 3,56 (q, J= 6,0, 2H, CH_{2}NH), 4,65-4,90 (m, 2H, CH_{2}N), 5,48-5,59 (m, 1H, CHCl), 7,21-7,49 (m, 5H Ar), 7,78 (s, 1H, H-3). IR cm^{-1}: 3400 (NH). Anal. (C_{19}H_{24}N_{5}SCl)C, H, N, S.
\vskip1.000000\baselineskip
Una suspensión de 5(2,75 g, 10 mmol) en
formamida (10 g, 333 mmol) fue calentada a 190ºC durante 8 horas y
a continuación vertida en H_{2}O (300 mL). El material resultado
en bruto fue filtrado y purificado por disolución en 2M NaOH (100
mL), ebullición con carbón, seguido de precipitación con ácido
cético glacial. El sólido fue filtrado y recristalizado a partir de
etanol absoluto para proporcionar 10 (1,79 g, 70%) en forma de
sólido de color blanco: p.f. 270-271ºC. ^{1}H NMR:
\delta 4,25-4,55 (m, 2H, CH_{2}),
5,05-5,15 (m, 1H, CHO), 5,65 (d, 1H, OH, desaparece
con D_{2}O) 7,25-7,45 (m, 5H Ar), 8,05 (s, 1H,
H-3), 8,10 (s, 1H, H-6), 12,15 (br
s, 1H, NH,desaparece con D_{2}O). IR cm^{-1}: 3400 (NH),
3245-2500 (OH), 1740 (CO). Anal.
(C_{13}H_{12}N_{4}O_{2}) C, H, N.
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión fría (-20ºC) de 10 (2,56 g, 10
mmol) y NBS (7,12 g, 40 mmol) en acetonitrilo seco (20 mL), se
añadió triamida hexametilfosforosa (HMPT) (6,53 g, 40 mmol) gota a
gota. Después de la adicción, el baño frío fue retirado y la mezcla
de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 0,5 horas. Se
añadió LiBr (3,44 g, 40 mmol) y la mezcla fue calentada a 70ºC
durante 5 horas. La mezcla fue evaporada a presión reducida. El
aceite de color oscuro fue purificado por cromatografía de columna
(Gel de Sílice, Maya 100) utilizando CHCl_{3} como eluyente,
facilitando el producto puro 11 (1,40 g, 44%) como sólido de color
blanco: p.f. 146-147ºC. ^{1}H NMR: \delta
3,46-3,53 (br s, 1H, OH, desaparece con D_{2}O),
4,57-4,79 (m, 2H, CH_{2}N),
5,18-5,29 (m, 1H, CHO), 7,30-7,52
(m, 5H Ar), 8,01 (s, 1H, H-3), 8,48 (s, 1H,
H-6). IR cm^{-1}: 3240-2500 (OH).
Anal. (C_{13}H_{11}N_{4}Obr)C, H, N.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos 3a,b fueron preparados de acuerdo
con las secuencias sintéticas descritas para los compuestos 1 y 2,
empezando del producto 11.
- 3a.
- Sólido de color blanco, rendimiento 75%. ^{1}H NMR:\delta 3,83-3,94 y 3,95-4,05 (2m, 8H, 4CH_{2}morph), 4,55-4,78 (m, 2H, CH_{2}N), 4,94 (s, 1H, OH, desaparece con D_{2}O) 5,20-5,29 (m, 1H, CHO), 7,25-7,51 (m, 5H, Ar), 7,95 (s, 1H, H-3), 8,38 (s, 1H, H-6). IR cm^{-1}: 3400-3000 (OH). Anal. (C_{17}H_{19}N_{5}O_{2}) C, H, N.
- 3b.
- Sólido de color blanco, rendimiento
80%. ^{1}H NMR: \delta 1,01 (t, J=7,6, 3H, CH_{3}), 1,45 (sx,
J=7,6, 2H, CH_{2}CH_{3}), 1,62-1,80 (m,
3H, CH_{2}CH_{2}CH_{3}+NH, 1H, desaparece con
D_{2}O), 3,65 (q, J=7,1, 2H, CH_{2}NH),
4,53-4,77 (m, 2H, CH_{2}N), 5,01 (br s, 1H, OH,
desaparece con D_{2}O), 5,21-5,32 (m, 1H, CHO),
7,25-7,54 (m, 5H Ar), 7,93 (s, 1H,
H-3), 8,37 (s, 1H, H-6).IR
cm^{-1}: 3400-2900
\hbox{(OH+NH). Anal. (C _{17} H _{21} N _{5} O) C, H, N.}
Se añadió POCl_{3} (14 g, 91 mmol) a 10 (2,56
g, 10 mmol) y la mezcla fue sometida a reflujo durante 12 horas y a
continuación se enfrió a temperatura ambiente.
El exceso de POCl_{3} fue retirado por
destilación a presión reducida. Se añadió cuidadosamente H_{2}O
(20 mL) al residuo y la suspensión fue extraída con
CHCl_{3}(3x20 mL). La solución orgánica fue lavada con
H_{2}O (10 mL), secada (MgSO_{4}), filtrada y concentrada a
presión reducida. El aceite en bruto de color marrón fue purificado
por columna de cromatografía (Florisil® Maya
100-200), utilizando CHCl_{3} como eluyente
consiguiendo el producto puro 12(1,66 g, 65%) como sólido de
color blanco: p.f. 139-140ºC. ^{1}H NMR:\delta
7,25-7,61 m, 6H, 5H Ar+CH=), 8,04 (d,
J_{trans}=14,6, 1H, CH=), 8,29(s, 1H, H-3),
8,85 (s, 1H, H-6). IR cm^{-1} 1658 (C=C). Anal.
(C_{13}H_{9}N_{4}Cl)C, H, N.
Los compuestos 4 a-d fueron
preparados de acuerdo con la secuencia sintética descrita para los
compuestos 1, 2 y 3 empezando del producto 12.
- 4a.
- Sólido blanco, rendimiento 80%. ^{1}H NMR: \delta 1,68-1,87 (m, 6H, 3CH_{2}), 3,89-4,07 (m, 4H, 2CH_{2}N), 7,20-7,60 (m, 6H, 5H, Ar+CH=), 8,08 (s, 1H, H-3), 8,09 (d, J_{trans}=14,4, 1H, CH=), 8,42 (s, 1H, H-6). IR cm^{-1} 1655(C=C). Anal. (C_{18}H_{19}N_{5})C, H, N.
- 4b.
- Sólido blanco, rendimiento 85%. ^{1}H NMR:\delta 3,85-3,93 y 3,96-4,05 (2m, 8HL, 4CH_{2}morph), 7,20-7,55 (m, 6H, 5H Ar + CH=), 8,06 (s, 1H, H-3), 8,07 (d, J_{trans}=14,3, 1H, CH=), 8,44 (s, 1H, H-6). IR cm^{-1} 1655 (C=C). Anal. (C_{17}H_{17}N_{5}O)C, H, N.
- 4c.
- Sólido blanco, rendimiento 64%. ^{1}H NMR: \delta 0,99 (t, J=7,2, 3H, CH_{3}), 1,38-1,58(sx, J=7,2, 2H, CH_{2}CH_{3}). 1,62-1,80(m, J= 7,2, 2H, CH_{2}), 3,65 (q, J=7,2, 2H, CH_{2}N), 5,35-5,60 (br, s, 1H, NH desaparece con D_{2}O), 7,20-7,58 (m, 6H, 5H Ar + CH=), 8,02 (s, 1H, H-3), 8,04 (d, J_{trans}=14,4, 1H, CH=), 8,42 (s, 1H, H-6). IR cm^{-1} 1650 (C=C). Anal. (C_{17}H_{19}N_{5})C, H, N.
- 4d.
- Sólido blanco, rendimiento 72%. ^{1}H NMR: \delta 1,53-1,73 (m, 4H, 2CH_{2}), 1,82-2,08 (m, 4H, 2CH_{2}), 3,80-4,08 (m, 4H, 2CH_{2}N), 7,20-7,62 (m, 6H, 5H Ar + CH=), 8,05 (s, 1H, H-3), 8,07 (d,J_{trans}=14,4, 1H, CH=), 8,43 (s, 1H, H-6). IR cm^{-1} 1655(C=C). Anal. (C_{19}H_{21}N_{5}) C, H, N.
A una suspensión de 10 (2,56 g, 10 mmol), en DMF
anhidro (20 mL), enfriado a 0ºC, se añadió gota a gota una
solución de tribromuro fosforoso (3,27 g, 12,1 mmol), piridina (0,5
mL) y tolueno (5 mL) preparada previamente. La mezcla fue agitada
a r.t. durante 3 días. El disolvente fue retirado a presión
reducida, el residuo fue vertido en agua y hielo (200 mL). El
sólido de color blanco fue filtrado y cristalizado a partir de
etanol absoluto facilitando el producto puro 3 (1,91 g; 60%): p.f.
230-231ºC. ^{1}H NMR: \delta
4,80-4,97 y 5,01 - 5,19 (2m, 2H, CH_{2}N),
5,68-5,72 (m, 1H, CHBr), 7,30-7,65
(m, 5H Ar), 7,97 (s, 1H, H-3), 8,13 (s, 1H,
H-6), 12,25 (br s, 1H, NH, desaparece con D_{2}O).
IR(KBr)cm^{-1}3440 (NH), 1665 (C=O).
El complejo de Vilsmeier previamente preparado a
partir de POCl_{3} (2,45 g, 16 mmol) y de dimetilformamida
anhidra (DMF) (1,16 g, 16 mmol) fue añadido a una suspensión de 3
(0,5 g, 1,56 mmol) en CHCl_{3}(10 mL).
La mezcla fue sometida a reflujo durante 12
horas. La solución fue lavada con H_{2}O (2x20 mL), secada
(MgSO_{4}), filtrada y concentrada a presión reducida. El aceite
en bruto fue purificado por cromatografía de columna (Florisil®,
Maya 100), utilizando CH_{2}Cl_{2} como eludiente, consiguiendo
el producto puro 4(0,41 g, 78%) en forma de sólido blanco,
p.f. 114-115ºC. ^{1}H NMR: \delta
4,95-5,38 (m, 2H, CH_{2}N),
5,58-5,78 (m, 1H, CHCl), 7,25-7,70
(m, 5H Ar), 8,17 (s, 1H, H-3), 8,77 (s, 1H,
H-6).
A una solución del producto 14(0,3 g, 1
mmol) en tolueno anhidro (5 mL), se añadió la amina apropiada (4
mmol), y la mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente
durante 36 horas. Después de su extracción con H_{2}O (10 mL),
la fase orgánica fue secada (MgSO_{4}), filtrada y concentrada a
presión reducida; el residuo aceitoso cristalizado por adición de
etanol absoluto (10 mL) proporciona los productos
5a-k.
- 5a.
- Sólido blanco, p.f. 136-137ºC rendimiento 60%. ^{1}H NMR \delta 1,06(t, J=7,6, 3H, CH_{3}), 1,75 (q, J=7,6, 2H, CH_{2}CH_{3}), 360 (q, J=7,4, 2H, NCH_{2}), 3,90 (br s, 1H, NH desaparece con D_{2}O), 4,85-5,20 (m, 2H, CH_{2}N), 5,60-5,72 (m, 1H, CHBr), 7,25-7,54 (m, 5H Ar), 7,90 (s, 1H, H-3), 8,17 (s, 1H, H-6). IR (KBr) cm^{-1}214 (NH).
\newpage
- 5b.
- Sólido blanco, p.f. 150-141ºC, rendimiento 65%. ^{1}H NMR \delta 1,36 (d, J=6,4, 6H, 2CH_{3}), 4,20 (m, 1H, NHCH), 4,84-5,20 (m, 2H, CH_{2}N), 5,60-5,70(m, 1H, CHBr), 7,24-7,56 (m, 5H Ar), 7,88 (s, 1H, H-3), 8,39 (s, 1H, H-6). IR (KBr) cm^{-1} 3219 (NH).
- 5c.
- Sólido blanco, p.f. 162-163ºC, rendimiento 70%. ^{1}H NMR \delta 0,68-0,88 (m, 2H, CH_{2}), 0,94-1,10 (m, 2H, CH_{2}), 2,88-3,03(m, 1H, NH-CH), 4,85-5,24 (m, 2H, CH_{2}N), 5,56-5,71 (m, 1H, CHBr), 7,08 (br s, 1H, NH, desaparece con D_{2}O), 7,22-7,58 (m, 5H Ar), 8,18 (s, 1H, H-3), 8,34 (s, 1H, H-6). IR (KBr) cm^{-1} 3214 (NH).
- 5d.
- Sólido blanco, p.f. 95-96ºC, rendimiento 70%. ^{1}H NMR \delta 0,99 (t, J=7,2, 3H, CH_{3}), 1,49 (sext, J=7,4, 2H, CH_{2}CH_{3}), 1,71(quint, J=7,2, 2H, CH_{2}CH_{2}CH_{3}, 3,61 (q, J=7,2, 2H, NHCH_{2}), 4,83-5,18 (m, 2H, CH_{2}N), 5,38 (br s, 1H, NH, desaparece con D_{2}O) 5,60-5,70 (m, 1H, CHBr), 7,28-7,58 (m, 5H Ar), 7,90 (s, 1H, H-3), 8,37 (s, 1H, H-6). IR (KBr) c,^{-1} 3227 (NH).
- 5e.
- Sólido blanco, p.f. 109-110ºC, rendimiento 60%. ^{1}H NMR \delta. 1,25 (t, J=7,0, 3H, CH_{3}), 3,57 (q, J=7,0, 2H, OCH_{2}CH_{3}), 3,69 (q, J=5,0, 2H, NHCH_{2}), 3,82 (t, J=5,0, 2H, OCH_{2}), 4,83-5,20 (m, 2H, CH_{2}N), 5,40-5,60 (m, 1H, CHBr), 5,80(br s, 1H, NH, desaparece con D_{2}O), 7,23-7,52 (m, 5H Ar), 7,90 (s, 1H, H-3), 8,40 (s, 1H, H-6). IR (KBr) cm^{-1} 3120 (NH).
- 5f.
- Sólido blanco, p.f. 127-128ºC, rendimiento 65%. ^{1}H NMR \delta. 1,89-2,16 (m, 4H, 2CH_{2} pyrr), 3,79 (t, J=6,8, 4H, 2CH_{2}N pyrr), 4,84-5,18 (m, 2H, CH_{2}N), 5,61-5,70 (m, 1H, CHBr), 7,25-7,56 (m, 5H Ar), 7,91 (s, 1H, H-3), 8,38 (s, 1H, H-6).
- 5g.
- Sólido blanco, p.f. 144-145ºC, rendimiento 68%. ^{1}H NMR \delta. 1,64-1,84 (m, 6H, 3CH_{2} pip), 3,86-4,01 (m, 4H, 2CH_{2}-N pip), 4,84-5,19 (m, 2H, CH_{2}N), 5,63-5,73 (m, 1H, CHBr), 7,25-7,54 (m, 5H Ar), 7,94 (s, 1H, H-3), 8,37 (s, 1H, H-6).
- 5h.
- Sólido blanco, p.f. 111-112ºC, rendimiento 67%. ^{1}H NMR \delta. 3,87 y 3,97 (2m, 8H, 4CH_{2} morph), 4,85-5,22 (m, 2H, CH_{2}N), 5,63-5,73 (m, 1H, CHBr), 7,28-7,55 (m, 5H Ar), 7,95 (s, 1H, H-3), 8,40 (s, 1H, H-6).
- 5i.
- Sólido blanco, p.f. 154-155ºC, rendimiento 70%. ^{1}H NMR \delta. 1,20-2,20 (m, 10H, 5CH_{2}), 3,38-4,18 (m, 1H, CH), 4,71-5,19 (m, 2H, CH_{2}N), 5,58-5,70 (m, 1H, CHBr), 7,23-7,57 (m, 5H Ar), 7,85 (s, 1H, H-3), 8,36 (s, 1H, H-6). IR (KBr) cm^{-1} 3251 (NH).
- 5j.
- Sólido blanco, p.f. 124-125ºC, rendimiento 64%. ^{1}H NMR \delta. 1,53-1,68 (m, 4H, 2CH_{2} hexamet), 1,82-2,02 (m, 4H, 2CH_{2} hexamet), 3,77-4,03 (m, 4H, 2CH_{2}N hexamet), 4,83-5,19 (m, 2H, CH_{2}N), 5,64-5,71 (m, 1H CHBr), 7,24-7,57 (m, 5H Ar), 7,88 (s, 1H, H-3), 8,38 (s, 1H, H-6).
- 5k.
- Sólido blanco, p.f. 157-158ºC, rendimiento 80%. ^{1}H NMR \delta 4,84 (d, 2H, CH_{2}Ar), 4,86-5,19 (m, 2H, CH_{2}N), 5,60-5,71 (m, 1H, CHBr), 7,26-7,54 (m, 10H Ar), 7,85 (s, 1H, H-3), 8,43 (s, 1H, H-3). IR (KBr) cm^{-1} 3214 (NH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El objetivo de estos experimentos era la
evaluación de la actividad antiproliferativa de los compuestos de
la invención. En particular, estos compuestos fueron evaluados en
cuanto a su capacidad en inhibir la proliferación de células
tumorales. Para demostrar las posibles aplicaciones de estos
compuestos hacia diferentes objetivos neoplásicos se escogieron
cuatro líneas celulares distintas. 1/ Células de carcinoma humano
epidermoide A431 nota ^{10} que se conoce que sobre expresan
tanto el receptor de factor de crecimiento epitelial (EGFR) como
células cancerosas de seno Src. 2/ 8701-BC nota
^{11}, establecidas a partir de carcinoma de infiltración ductal
primaria, es decir, antes de la selección clonal del proceso
metastático. Esta línea celular mantiene una serie de
características en cultivo que son típicas de las células de tumores
mamarios y se sabe que sobre expresa Src tirosina quinasa
(TK).^{12} 3/ Se estableció la línea celular K-562
a partir de la efusión pleural de una mujer de 53 años con leucemia
mielógena crónica en crisis de blastos terminal. Los blastos
K-562 son células malignas hematopoiéticas
multipotenciales que son capaces de diferenciación espontánea. 4/ La
línea celular MEG-01 fue derivada en 1983 de
células de tuétano de hueso tomadas de un paciente en crisis
megacarioblástica de leucemia mieloide crónica.
Las células K562 y MEG-01 son
positivas para Bcr-Abl, un par de quinasas
expresadas en las células mieloides y que pertenecen a los miembros
Lyn y Hck, respectivamente, de la familia de Src tiroxina
quinasa.
Los compuestos fueron disueltos en 0,1 M DMSO y
diluidos adicionalmente en la concentración apropiada en el medio
de cultivo celular apropiado. Se escogió PP2,
(1-(t-butil)-3(4-metilfenil)-4aminopirazolo[3,4-d]pirimidina,
como el compuesto de referencia por su potencia y efectos
selectivos hacia la familia
\hbox{Src de tiroxina quinasas
nota ^{13-18} .}
Se incubaron células A431 (2x10^{4}
células/mL) en 100 \muL de medio de cultivo DMEM (BioWhittaker,
Vallensbaek, DK). Por otra parte se incubaron células
8701-BC (2x10^{4} células/mL) en 100 \muL de
medio de cultivo RPMI 1640 (BioWhittaker, Vallensbaek, DK). Ambas
líneas celulares fueron suplementadas con 10% de suero fetal de
vaca (FCS; Bio Whittaker, Vallensbaek, DK) y antibióticos(100
U/mL penicilina y 100 \mug/mL estreptomicina), a 37ºC en 5%
CO_{2} durante 8 horas, permitiendo la adherencia. Después de la
adherencia el medio fue sustituido por 100 \muL de medio
suplementado con 0,5% FCS. Después de incubación durante una noche,
el medio fue sustituido y se añadieron a los cultivos celulares 100
\muL DMDM con 10% FCS con diferentes concentraciones
(0-100 \muM) de los compuestos estudiados.
Después de 72 horas, las células fueron tratadas
con 10 \muL de la solución de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfonil)-2H-tetrazolio
(MTT) y (5 mg/mL). Cuatro horas más tarde, se añadieron 100 \muL
de propan-2-ol en una solución 0,04
M de HCl para disolver el producto formado. Las micro placas fueron
leídas utilizando un lector de placas ELISA a 570 nm con una
longitud de referencia de 630 nm.
Se incubaron células MEG-01 Y
K562 (2X10^{4} células/mL)en 100 \muL de medio de cultivo
RPMI 1640 (Bio Whittaker, Vallensbaek, DK), suplementado con 10% de
suero fetal de vaca (FCS; Bio Whittaker, Vallensbaek, DK) y
antibióticos (100 u/ml penicilina y 100 \mug/mL estreptomicina), a
37ºC en 5% de CO_{2}. Después de incubación durante una noche con
100 \muL de medio suplementado con 0,5% de FCS, el medio fue
sustituido con 100 \muL de medio RPMI 1640 con 10% de FCS con
diferentes concentraciones (0-100 \muM)de
los compuestos, efectuándose la adición a cultivos celulares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo análisis de inmunotransferencia
utilizando anticuerpos fosfo-específicos con
respecto a Src(Tyr416). Los filtros fueron sometidos
adicionalmente a prueba repetida con anticuerpos específicos
no-fosfo anti-Src después de
extracción.
Análisis de inmunotransferencia
8701-BC. Las células fueron tratadas tal como se
ha indicado anteriormente pero fueron atacadas con los compuestos
durante 3 horas y a continuación tratadas con 100 nM EGF (Cell
Signaling Technology, MA, U.S.A). Cinco minutos más tarde, las
células fueron recogidas y sometidas a lisis en un tampón apropiado
conteniendo 1% de Tritón X-100. Las proteínas fueron
cuantificadas por el método BCA (Pierce Rockford, U.S.A). Se
resolvieron cantidades iguales de la proteína celular total por
electroforesis de SDS-poliacrilamida gel, se
transfirieron a filtros de nitrocelulosa y se sometieron a
inmunotransferencia utilizando anticuerpos
fosfo-específicos contra Src(Y416) y Src no
fosfo-específica como control (Cell Signaling
Technology, MA, U.S.A).
Análisis de inmunotransferencia de A431.
La fosforilación de Src Tyr416 es una etapa crucial en el mecanismo
de la activación de la enzima nota^{19}. Las células A431 han sido
bien caracterizadas con respecto a la transducción de señal
dependiente de EGF. De manera más detallada, estas células expresan
altos niveles de receptor EGF en su superficie y proliferan como
respuesta a la secreción autocrina del
factor-\alpha de crecimiento transformante nota
^{20}, pero también requieren fosforilación de Src para
proliferar. Para determinar si estos compuestos de
pirazolo-pirimidina son capaces de inhibir la
fosforilación de Src Tyr416, los inventores utilizaron un
anticuerpo anti Src(Tyr416) (Cell Signaling Technology, MA,
U.S.A). El PP2 utilizado como compuesto de referencia ha sido
identificado como inhibidor de tiroxina quinasa selectivo de Src y
ha sido utilizado extensamente para investigar rutas de
señalización involucrando Src quinasas, incluyendo eventos situados
más abajo del receptor c-Kit nota^{16} del factor
celular de células madre (SCF). Como resultado, los inventores han
descubierto que los compuestos 1b, 1e, y 2c eran capaces de inhibir
la Src fosforilación casi con la misma eficacia que PP2 (Figura 4,
Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto citotóxico del compuesto fue evaluado
por exclusión de azul tripano. Las células fueron estimuladas
durante una 1 h a 37ºC con concentraciones crecientes del compuesto
de prueba (10 nM-10 \muM) en un medio de 1% FCS.
Las células fueron sometidas a tinción con 0,4% de azul tripano en
solución salina de tampón fosfato (PBS) durante 5 min. Se efectuó
el conteo de células muertas y vivas al microscopio a ciegas. Se
calculó el porcentaje de células muertas con respecto al número
total de células. Ninguno de los compuestos indicados en la Tabla 1
mostró citotoxicidad (para las concentraciones de prueba) con
respecto a las líneas de células indicadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la actividad antiproliferativa
de los compuestos con respecto a células A431 y
8701-BC se indican en la Tabla 1 en comparación con
la actividad de PP2 escogido como compuesto de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar la actividad antiproliferativa
de estos compuestos se comprobó su efecto inhibitorio con respecto
a la fosforilación de Src (Tyr416), sobre células
8701-BC tratadas con EGF (factor decrecimiento
epitelial 100 nM). Muchos de los compuestos de nuevas síntesis (es
decir, 1b-g, 1i-k, 2c,d,f, 3f,g y
4b,e-h, correspondientes aproximadamente al 50% del
número total de compuestos) se caracterizaron por su actividad
antiproliferativa con respecto a células 8701-BC
comprendidas entre 31,2 (1f) y 64,2 \muM (1b), comparable o mejor
que el de PP2 (61,8 \muM, figura 2, Tabla 1).
Además, dado que uno de los posibles objetivos
(pero no solamente el único) estaba representado por la inhibición
de la fosforilación de la enzima Src, los inventores comprobaron la
inhibición de fosfo-Src por compuestos en ambas
células A431 y 8701-BC. El ensayo de
inmunotransferencia llevado a cabo utilizando anticuerpos
fosfo-específicos con respecto a Src (Tyr416),
mostró claramente la inhibición de la
activación-fosforilación Src de células
8701-BC expuestas a los compuestos de estudio, con
respecto al control. En particular, se observó que los compuestos
1a, 1e y 1f inhibían la fosforilación Src mejor que el compuesto de
referencia PP2 (figura 3). La aparición, al mismo tiempo, de una
reducción de la fosforilación Src y la inhibición de la
proliferación celular condujo a los inventores a suponer que los
compuestos eran capaces de inhibir la proliferación por la
inhibición de la fosforilación Src dado que esta última es
intermediaria de una cascada que conduce a la estimulación de la
proliferación y movilidad celular.
Con respecto a la actividad antiproliferativa
con respecto a células A431, se observó que once compuestos (es
decir, 1b-g, 1i, 3c,e y 4i,j Tabla 1) tenía valores
de actividad IC_{50} comparables o mejores a los del compuesto de
referencia PP2 (32 \muM). La figura 4 y la Tabla 3 muestran la
actividad antiproliferativa de unos compuestos más interesantes
(1b, 1e y 2c) con respecto a PP2.
Además, los resultados de un ensayo de
inhibición fosfo-Src demostró que los compuestos 1b,
2c y 1e eran capaces de inhibir Src fosforilación con casi la misma
eficacia que PP2 (figura 5).
La reducción de la fosforilación de Src es
realmente un mecanismo pero puede no ser el único, de inhibición de
proliferación celular. Los inventores conocen que el compuesto es
capaz de inhibir fosforilación Src dado que esta última es
intermediaria en una cascada de señalización que conduce
directamente a la estimulación de la proliferación y movilidad
celular.
Finalmente, varios compuestos mostraron también
efecto inhibitorio con respecto a dos líneas celulares de leucemia
mieloide crónica, Meg-01 y K562, con IC_{50} menor
que el del compuesto de referencia. En particular 2c y 2d mostraron
una actividad superior a 50 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (10)
1. Derivados de
pirazolo[3,4-d]pirimidina
4-sustituidos que tienen la fórmula
en la
que
X=N;
R=H, alquiltio o
aminoalquiltio;
R_{1}=NHciclopropilo o
NHC_{3}H_{7} o NHC_{4}H_{9} o
N(CH_{2}CH_{3})_{2}, o bien
NHCH_{2}CH_{2}OC_{2}H_{5} o 1-pirrolidinilo
o 1-piperidinilo o 4-morfolinilo o
NHciclohexilo o 1-hexahidroacepinilo o
NHCH_{2}C_{6}H_{5} o
NHCH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5};
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{3}=H, halógeno,
alquilo;
\vskip1.000000\baselineskip
R_{5}=Cl, Br o
OH.
2. Derivados de
pirazolo[3,4-d]pirimidina
4-sustituidos, según la reivindicación 1, en los que
X=N; R=H o SCH_{3} o SC_{2}H_{5}; R_{1}=NCH_{3}H_{7} o
NHC_{4}H_{9} o N(CH_{2}CH_{3})_{2} o
NHCH_{2}CH_{2}OC_{2}H_{5} o 1-pirrolidinilo
o 1-piperidinilo o 4-morfolinilo o
NHciclohexilo o 1-hexahidroacepinilo o
NHCH_{2}C_{6}4_{5} o NHCH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5};
R_{2}=H; R_{3}=H;
R_{5}=Cl, Br o
OH.
3. Derivados de
1-(2-cloro-2-feniletilo)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina
4-sustituidos, según la reivindicación 1, en los
que X=N, R=SCH_{3}, R_{1} es uno de los residuos siguientes:
NHC_{4}H_{9} o 1-piperidinilo o
4-morfolinilo o NHCH_{2}C_{6}H_{5} o
NHCH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5}. R_{2}=R_{3}=H,
R_{4}=2-cloro-2-feniletilo.
4. Derivados de
1-(2-cloro-2-feniletilo)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina
4-sustituidos, según la reivindicación 1, en los
que X=N, R=SC_{2}H_{5}, R_{1} es uno de los residuos
siguientes: NHC_{3}H_{7} o NHC_{4}H_{9} o
NHCH_{2}C_{6}H_{5}. R_{2}=R_{3}=H,
R_{4}=2-cloro-2-feniletilo.
5. Derivados de
1-(2-bromo-2-feniletilo)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina
4-sustituidos, según la reivindicación 1, en los
que X=N, R=H, R_{1} es uno de los residuos siguientes:
NHC_{4}H_{9} o NHciclohexilo. R_{2}=R_{3}=H,
R_{4}=2-bromo-2-feniletilo.
6. Derivados de
1-(2-hidroxi-2-feniletilo)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina
4-sustituidos, según la reivindicación 1, en los
que X=N, R=H, R_{1} es uno de los residuos siguientes:
1-piperidinilo o NHCH_{2}C_{6}H_{5} o
NHCH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5}. R_{2}=R_{3}=H,
R_{4}=2-hidroxi-2-feniletilo.
7. Derivados de
1-estirilo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina
4-sustituidos, según la reivindicación 1, en los
que X=N, R=H, R_{1} es uno de los residuos siguientes:
NHCH_{2}CH_{2}OC_{2}H_{5} o NHCH_{2}C_{6}H_{5} o
NHCH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5}. R_{2}=R_{3}=H, R_{4}=
estirilo.
8. Derivados de
pirazolo[3,4-d]pirimidina
4-sustituidos, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, para uso médico.
9. Derivados de
pirazolo[3,4-d]pirimidina
4-sustituidos, según las reivindicaciones 1 a 7,
para terapia antitumoral y antileucemia.
10. Compuesto farmacéutico que comprende un
derivado de pirazolo[3,4-d]pirimidina,
según las reivindicaciones 1 a 7, o una sal farmaceuticamente
aceptable del mismo y excipientes y/o diluyentes adecuados.
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