ES2304647T3

ES2304647T3 - Celulas inductoras de aceptacion de trasplantes de origen monocitico y su preparacion y uso.

Info

Publication number: ES2304647T3
Application number: ES05009317T
Authority: ES
Inventors: Bernd Karl Friedrich Kremer; Fred Fandrich; Maren Schulze
Original assignee: Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH
Current assignee: Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH
Priority date: 2002-07-12
Filing date: 2003-07-11
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2023-07-11
Also published as: EP1492869B9; EP1557462A2; PT1644484E; DE60302231T2; WO2004007701A1; SI1644484T1; ZA200501054B; AU2003250939B2; PT1557462E; EP1557462A3; CN100523176C; RU2005103627A; DK1492869T3; DE10231655A1; DK1557462T3; EP1492869A1; AU2003250939A1; DE60320009D1; DE60302231D1; EP1492869B1

Abstract

Un proceso para preparar una preparación farmacéutica que contiene células inductoras de aceptación de trasplantes de origen monocítico, caracterizado porque a) los monocitos se aíslan de la sangre; b) los monocitos se multiplican en un medio de cultivo adecuado que contiene el factor de crecimiento celular M-CSF; c) los monocitos se cultivan simultáneamente con o después de la etapa b), en un medio de cultivo que contiene IFN-gamma; d) las células inductoras de aceptación de trasplantes formadas en la etapa c) se obtienen separando las células del medio de cultivo; y e) las células obtenidas en la etapa d) se formulan en una preparación farmacéutica.

Description

Células inductoras de aceptación de trasplantes de origen monocítico y su preparación y uso.

La invención se refiere a células inductoras de aceptación de trasplantes de origen monocítico y su preparación, así como a su uso para producir la aceptación de un trasplante.

Preferiblemente, la invención se refiere a células inductoras de aceptación de trasplantes (en lo sucesivo también denominadas TAIC) que proceden de monocitos humanos.

La invención describe además el anticuerpo monoclonal GM-7, que reconoce específicamente a las células inductoras de aceptación de trasplantes según la invención que proceden del hombre.

Además, la invención describe el uso del anticuerpo GM-7 para detectar y/o seleccionar células inductoras de aceptación de trasplantes.

El término "trasplante" se usa en el campo de la inmunología para la transferencia de células, tejidos u órganos desde un cuerpo a otro. La necesidad de trasplantes surge del hallazgo de que numerosas enfermedades pueden curarse mediante la transferencia (trasplante) de órganos, tejidos o células sanos desde un individuo que está sano a este respecto - el donante - a un individuo que padece la enfermedad en cuestión - el receptor u hospedador.

Dependiendo de la relación entre el donante y el receptor pueden distinguirse los siguientes tipos de trasplantes:

1. Trasplantes autólogos: son tejidos o células que son trasplantados en un mismo individuo desde un área de su cuerpo a otra.

2. Trasplantes isólogos: implican la transferencia entre individuos genéticamente idénticos. Algunos ejemplos de éstos son variedades de ratas o de ratones endogámicos. En el hombre, los trasplantes isólogos (singénicos) pueden considerarse entre gemelos genéticamente idénticos (monocigóticos).

3. Trasplantes alogénicos: éste término designa a los trasplantes entre miembros genéticamente diferentes de la misma especie, tal como, por ejemplo, desde un individuo humano a otro o, en el caso de animales experimentales, desde una variedad endogámica a otra.

4. Trasplantes xenogénicos: éste implica la transferencia entre diferentes especies, tales como, por ejemplo, la transferencia del corazón de un mono a un ser humano.

Como norma, los trasplantes autólogos e isólogos no provocan problemas inmunológicos en el sentido de una respuesta de rechazo. Sin embargo, esto no es cierto en el caso de los trasplantes alogénicos y xenólogos. Dichos trasplantes son reconocidos como extraños por el sistema inmune del receptor, y rechazados después de un tiempo relativamente corto. En el caso de la respuesta de rechazo alogénica/xenologa, los linfocitos T (denominados en lo sucesivo células T) juegan una parte central. Estas células reconocen las células extrañas mediante sus complejos mayores de histocompatibilidad (MHC). El complejo MHC extraño sensibiliza a las células T reactivas al antígeno del receptor y, posteriormente, las células T así activadas dan lugar a la destrucción de las células del donante o del tejido del donante, respectivamente. Las células con diferentes complejos MHC también se denominan "MHC diferentes".

El trasplante de células, tejidos u órganos alogénicos o xenogénicos da lugar necesariamente a una situación en la que las células de dos individuos diferentes, es decir, células MHC diferentes, están presentes en la sangre del receptor al mismo tiempo. Este fenómeno se denomina "quimerismo". Hay que distinguir entre microquimerismo y macroquimerismo. El microquimerismo se refiere al estado en el que las células procedentes del donante, por ejemplo, tras una transfusión sanguínea o de médula ósea o tras el trasplante de órganos ricos en linfocitos, tal como el intestino delgado o el hígado, permanecen persistentes en el hospedador MHC diferente pero sólo son detectables en unos pocos casos aislados. El término macroquimerismo se usa cuando más del 5% de las células detectadas en el receptor proceden del donante, siendo necesario realizar una distinción en ambos casos entre el quimerismo de la sangre y del órgano con la correspondiente detección de las células del donante en la sangre o en los órganos del receptor.

El quimerismo puede, hasta cierto punto, dar lugar a una tolerancia con respecto a los trasplantes. En el caso de personas que, como resultado de una enfermedad de leucémica o de un linfoma, por ejemplo, tuvieron que sufrir un trasplante halogénico de médula ósea con un patrón de MHC ampliamente correspondiente entre el donante y el receptor, se observó por tanto un "quimerismo del donante" tras el correspondiente acondicionamiento mieloablativo (destrucción de la propia médula ósea de un individuo y de las células sanguíneas procedentes de la misma) y el subsiguiente trasplante de células madre. En el caso de estos pacientes, más del 99% de las células detectables en la sangre proceden de las células madres del donante, y éste quimerismo forma la base para la tolerancia con respecto a todos los órganos trasplantados desde este donante. Ésta observación se confirmó en una serie de ejemplos clínicos de subsiguientes donaciones de segmentos de riñón, de hígado y del pulmón [Dey B., y col., "Outcomes of Recipients of both bone marrow and solid organ transplants: A review". Medicine (Baltimore) 77, 355-369 (1989)]. Para que se produzca la inducción de tolerancia no es decisivo que en esta relación exista quimerismo completo del donante - definido como la presencia de más del 90% de células del donante en la sangre periférica de un receptor alogénico; en cambio, se ha averiguado que una fracción del 5% de células del donante- denominado quimerismo "mixto" - es suficiente para inducir tolerancia [cotéjese el estudio de Acholonu I. N. e Ildstad S. T., "The role of bone marrow transplantation and tolerance: Organ-specific and cellular grafts", Curr. Opin. Organ. Transplant 4, 189-196 (1999)].

Aunque, básicamente, se han proporcionado por tanto pruebas de que el quimerismo del donante que acompaña a un trasplante de médula ósea (BMTx) induce tolerancia, no ha sido posible no obstante hasta ahora llevar a cabo un BMTx alogénico con éxito en el caso de constelaciones completamente MHC diferentes del donante y el receptor. Esto es debido al hecho de que el preacondicionamiento requerido para esto, es decir, el acondicionamiento del receptor (véase anteriormente) supone tres tipos de riesgos considerables para el receptor. En primer lugar, la toxicidad de médula ósea de los agentes quimioterapéuticos usados, que se administran con o sin un tratamiento adicional de radiación, da lugar a una significativa morbilidad; en segundo lugar, existe el riesgo de que la médula ósea trasplantada sea rechazada a pesar del acondicionamiento previo; y, finalmente, existe el riesgo de una enfermedad del injerto contra el hospedador (GvHD) en el caso de que las células T transferidas al hospedador junto con el trasplante se vuelvan en contra del organismo del hospedador [cotéjese Wolff S. N., "Hematopoietic cell transplant from volunteer unrelated or partially matched related donors: Recent developments". Curr. Opin. Organ. Transplant 5, 372-381 (2000)]. Esta enfermedad se produce siempre que el sistema inmune del receptor haya sido debilitado por un acondicionamiento previo, hasta tal punto que las células T transferidas con la médula ósea son capaces de provocar un rechazo letal en el receptor.

Para evitar los problemas detallados anteriormente, se están realizando esfuerzos actualmente para diseñar un acondicionamiento del receptor que sea lo más leve posible. Sin embargo, cuanto mayor sea la diferencia MHC entre el donante y el receptor, debe dirigirse un tratamiento acondicionador más potente con objeto de evitar el rechazo de la médula ósea trasplantada; esto da lugar de nuevo a un aumento del riesgo de una enfermedad del injerto contra el hospedador (GvHD).

Hasta el momento no se ha llevado a cabo una investigación detallada relativa al tiempo durante el cual el quimerismo inducido debe permanecer detectable en la sangre del receptor con objeto de garantizar una situación de tolerancia estable para un órgano donante. Sin embargo, datos fiables procedentes de un modelo de ratón indican que un macroquimerismo detectable durante dos semanas ya es suficiente para que aparezca tolerancia [Weckerle, T. y col, "Allogeneic bone marrow transplantation with co-stimulatory blockade induces macro-chimerism and tolerance without cytoreductive host treatment". Nat. Med. 6, 464-469 (2000)].

La necesidad de desarrollar alternativas a los inmunodepresores disponibles actualmente para producir tolerancia surge desde el ángulo de dos puntos de vista principales. Por un lado, los inmunodepresores disponibles clínicamente hasta ahora no han sido capaces de evitar el rechazo crónico en los trasplantes y, por otro lado, el tomar inmunodepresores permanentemente está acompañado por unos considerables efectos secundarios que hacen al paciente propenso a infecciones víricas, bacterianas y micóticas, y que producen un riesgo considerable por la formación de malignomas y enfermedades del sistema cardiovascular, en particular por infarto de miocardio y por insuficiencia cardíaca [véase Wheeler, D. C. y Steiger, J. "Evolution and Etiology of Cardiovascular Diseases in Renal Transplant Recipients" Transplantation 70, 41-45 (2000)].

Munn y col. han descrito una supresión de células T inducida por macrófagos, que se basa en la eliminación selectiva de triptófano y/o un aumento en uno o más metabolitos de triptófano en el entorno que rodea a las células [véase Munn y col. "Inhibition of T Cell Proliferation by Macrophage Tryptophan Catabolism" J. Exp. Med. 189, 1363-1372 (1999)]. Partiendo de esta observación, los autores sugieren modificar las reacciones inmunes mediadas por células T mediante la modificación de la concentración extracelular local de triptófano, en particular inhibiendo o aumentando el metabolismo de triptófano mediado por la IDO, véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.482.416 y 6.451.840. Por lo tanto, esta metodología sólo proporciona un antígeno independiente más y una inmunodepresión inespecífica dirigida contra las células T.

Sin embargo, lo que se necesita urgentemente es un concepto aplicable clínicamente para inducir una tolerancia específica del donante, es decir, un concepto según el cual la respuesta inmune del hospedador con respecto a los antígenos tisulares presentes en el órgano transferido desde el donante sea suprimida específicamente, pero en el caso en el que, por lo demás, la inmunocompetencia del hospedador se conserve completamente.

Con el objetivo de dicho concepto, surgiría una reducción sustancial en la desproporción entre la demanda de órganos y el suministro de órganos a medio plazo, dado que, de este modo, pocos órganos más se perderían como resultado de procesos de rechazo agudos y crónicos. La carencia de órganos adecuados puede explicarse mediante las estadísticas a partir de los datos de EE.UU. desde febrero de 2001:

TABLA 1 Datos actualizados procedentes del "UNOS (United Nations Organ Share Registry) lista nacional de pacientes en espera para un trasplante de órgano (febrero de 2001)"

1

Esto explica los inmensos esfuerzos nacionales e internacionales que se están realizando para desarrollar conceptos para inducir una tolerancia específica del donante.

Por consiguiente, el problema subyacente en la invención es proporcionar un medio para influir sobre las células T del organismo receptor de una forma tal que toleren y/o acepten las células, tejidos u órganos extraños en cuestión a largo plazo sin rechazo. La constitución de estos medios y su preparación o uso no deberían provocar ningún problema ético ni/o legal, y debería ser posible prepararlos rápidamente para el uso terapéutico pretendido en las cantidades requeridas para el propósito y con unos costes de elaboración aceptables.

Para la solución del problema se proporcionan células inductoras de aceptación de trasplantes de origen monocítico (TAIC) según la invención procedentes de vertebrados, en particular procedentes de mamíferos, y más preferiblemente procedentes de seres humanos. Sorprendentemente se ha averiguado que los monocitos procedentes de la sangre del donante (donante de órganos), modificados según la invención, son capaces de proteger al organismo receptor, en el caso de su administración preoperatoria y/o postoperatoria, frente a sus propias células T corporales activadas por el complejo MHC extraño, evitando así el rechazo del trasplante. Cuando se usan como "agentes terapéuticos celulares" para inducir tolerancia a un trasplante, las células modificadas no provocan efectos secundarios o no son apreciables, en el sentido de rechazo celular, inducción de tumores, en particular de tumores malignos, ni una enfermedad del injerto contra el hospedador en el paciente en cuestión.

Sorprendentemente se ha averiguado que el proceso según la invención da lugar a la modificación in vitro de monocitos de una forma tal que las células que se obtienen, tras su inyección en un receptor alogénico no inmunodeprimido, son capaces de evitar la respuesta inmune natural contra las células o los tejidos del donante y que son por tanto capaces de circular en la sangre periférica durante al menos tres semanas.

Tras la administración de aproximadamente 10^{5} células/kg de peso corporal (BW), el quimerismo resultante de células GM-7 positivas, véase a continuación, está en la región del 5-20%. Este quimerismo transitorio induce

a) aceptación a largo plazo para sus siguientes trasplantes de órganos procedentes del mismo donante, preferiblemente en los 10 días siguientes a la administración intravenosa de las células y

b) aceptación a largo plazo en combinación con un tratamiento inmunodepresor a corto plazo cuando las células se usan con posterioridad al trasplante de un órgano.

Según se muestra en el Ejemplo 10, el efecto inmunodepresor de las células de la invención no está relacionado con la supresión de células T inducida por macrófagos mediante la expresión de la enzima degradativa de triptófano Indolamina-2,3-Diogenasa (IDO), según observaron Munn y col., (véase anteriormente). En cambio, las TAIC de la invención inducen una tolerancia específica frente al donante en el receptor inactivando las células T alorreactivas por un lado e induciendo la formación de células T reguladoras en el receptor por otro, véanse en los Ejemplos 12 y 13.

Los macrófagos procedentes de los monocitos, que inhiben la proliferación de las células T mediante una eliminación mediada por la IDO de triptófano en el entorno que rodea a las células, no están por lo tanto incluidos en la invención.

Descripción de las figuras

Figura 1: determinación citométrica de flujo de la capacidad de unión del GM-7 a células monocíticas originales antes (gráfico del lado izquierdo) y después (gráfico del lado derecho) de la modificación de las células según la invención. El eje x indica el número de células unidas.

Figura 2A: curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de trasplantes cardíacos tras un trasplante heterotópico de corazón con y sin la administración preoperatoria de TAIC procedentes del donante en el modelo de rata (n = 10 animales por grupo).

Figura 2B: preparación histológica de un trasplante LEW alogénico en el POD (día postoperatorio) 150 tras el trasplante heterotópico en el abdomen de una rata DA receptora que había sido pretratada en el día -7 con 10^{6} TAIC procedentes de LEW. Factor de aumento: 40.

Figura 2C: preparación histológica del timo de una rata DA pretratada con 10^{6} TAIC procedentes de LEW tras el marcaje de la preparación con el anticuerpo monoclonal I1.69 específico para LEW-MHC de clase I. factor de aumento: 40.

Figura 2D: detección citométrica de flujo de células procedentes del donante en cuatro ratas receptoras DA no sometidas a inmunodepresión tras la inyección de TAIC procedentes de LEW (ratas 1-3: 10^{6} células/kg x BW; rata 4: 10^{4} células/kg x BW).

Figura 3: curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de trasplantes cardíacos tras un trasplante heterotópico de corazón con y sin la administración postoperatoria de TAIC procedentes del donante en combinación con una administración inicial de 4 ciclos de ciclosporina A (CSA; 5 mg/kg x BW) en el modelo de rata (n = 6-10 animales por grupo).

Figuras 4A-C: curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de trasplantes de corazón (A), de hígado (B) y del riñón (C) tras un trasplante heterotópico (A y C) u ortotópico (B), respectivamente, con y sin la administración preoperatoria de TAIC procedentes del donante(n = 6 animales por grupo).

Figuras 4D-F: preparaciones histológicas de trasplantes DA de riñón (D), de hígado (E) y de piel (F) tras un trasplante heterotópico en una rata LEW receptora.

Figura 5A: curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de trasplantes cardíacos tras trasplantes heterotópicos de corazón de diferentes combinaciones de variedades endogámicas con y sin la administración postoperatoria de TAIC procedentes del donante en combinación con una administración inicial de 4 ciclos de CSA; (5 mg/kg x BW) en el modelo de rata (n = 6 animales por grupo).

Figura 5B: curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de trasplantes cardíacos tras un trasplante heterotópico de corazón 7 días después de la administración de monocitos sanguíneos tratados de modo diferente procedentes de animales donantes LEW (n = 6 animales por grupo).

Figura 6A: curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de trasplantes de pulmón tras trasplantes ortotópicos de pulmón izquierdo en cerdos ("cerdos enanos no consanguíneos") usando una triple inmunodepresión de CSA, azatioprina (AZA) y esteroides (STE). (n = 4 animales por grupo).

Figura 6B: imagen de rayos X del tórax (técnica posterior-anterior) de dos cerdos trasplantados unilateralmente de pulmón ("cerdos enanos no consanguíneos") en los POD (día postoperatorio) 41 y 55. La inmunodepresión triple de CSA, AZA y esteroides se interrumpió en el día 28 tras el trasplante.

Figura 7: cultivo mixto de linfocitos de monocitos CD14^{+} procedentes de un individuo B (GM-7^{-}: columna gris; GM-7^{+}: columna negra), células respondedoras procedentes de un donante A MHC-discordante y células irradiadas procedentes de un donante B para comparar la actividad supresora de las células CD14^{+}/GM-7^{+} y CD14^{+}/GM-7^{-}.

Figura 8: cultivo mixto de linfocitos de linfocitos estimulados con PHA (PhaLy) y TAIC ("Mo+Ly" o "Mo"), preincubados en dos experimentos con un inhibidor (1-MT) de la indolamina-2, 3-dioxigenasa (IDO) para determinar la influencia del 1-MT sobre la actividad supresora de las TAIC.

Figura 9: determinación citométrica de flujo de la cantidad de monocitos CD14^{+} y de linfocitosCD2^{+} en la fracción monocítica, así como la cantidad de células CD-14^{+}/CD3^{+} eficaces como TAIC, para determinar la influencia de la purificación de las células para enriquecer los monocitos al comienzo de cultivo sobre la formación de células CD14^{+}/CD3^{+} inmunodepresoras.

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Figura 10: determinación citométrica de flujo de la expresión de GM-7 en la sangre de pacientes postoperatoriamente antes (Figura izquierda) y después (Figura derecha) de la inyección de las TAIC, para determinar la influencia de las TAIC sobre la expresión in vivo del GM-7 en las células sanguíneas.

Resumen de la invención

Las principales etapas del proceso según la invención para la preparación de TAIC de origen monocítico comprenden:

(a): aislar los monocitos de la sangre, preferiblemente de sangre humana;

(b): propagar los monocitos en un medio de cultivo adecuado que contiene factor estimulante de las colonias de macrófagos (denominado en lo sucesivo M-CSF) como agente promotor del crecimiento;

(c): estimular los monocitos con interferón \gamma (denominado en lo sucesivo IFN-\gamma); y

(d): obtener las células inductoras de aceptación de trasplantes formadas en la etapa c) separando las células del medio de cultivo.

Según la invención, se ha demostrado que la estimulación con IFN-\gamma representa una etapa decisiva en la preparación de las TAIC (véase el Ejemplo 7).

En relación con la presente invención, el término "TAIC" (células inductoras de aceptación de trasplantes de origen monocítico) designa a la población celular que se obtiene a partir de la etapa (d) del proceso descrito anteriormente. Esta población celular comprende, junto con las células procedentes de los monocitos, que son eficaces según la invención, también linfocitos, véase el Ejemplo 11, así como opcionalmente otras células adicionales procedentes de la capa leucocítica, como por ejemplo los granulocitos. La cantidad de células procedentes de monocitos dentro de la población de TAIC es preferiblemente del 50 al 90%, más preferiblemente del 60 al 70% con respecto al número total de células.

En relación con la presente invención, el término "número total de células" se refiere a la cantidad de células vitales en la población celular en consideración. Esta cantidad puede determinarse mediante la "técnica de exclusión mediante el pigmento trypan blue", dado que éste pigmento permite distinguir a las células vitales de las células no vitales mediante medios ópticos.

Las TAIC según la invención pueden usarse habitualmente en una cantidad de 10^{4}-10^{6} células por kilogramo de peso corporal, preferiblemente de 10^{5} células por kilogramo de peso corporal, para inducir una aceptación del trasplante. La administración de las TAIC puede llevarse a cabo repetidamente, en el caso de una gran diferencia de MHC, preferiblemente tres veces a intervalos de aproximadamente 10 días, en el que la administración de las células puede tener lugar antes o después del trasplante (véase a continuación). El número total de células necesarias para este propósito puede proporcionarse dentro de los 6 a 8 días después de la extracción sanguínea.

Se ha demostrado que las células según la invención (TAIC) no presentan ningún riesgo relativo a la formación de malignomas, tanto en la prueba animal como en cultivo; este es un resultado que no podría haberse esperado de cualquier otro modo debido a la naturaleza de las células monocíticas originales de las cuales proceden las células según la invención.

Como se explica a continuación, pueden aislarse subpoblaciones de células adicionales con una eficacia optimizada según la invención a partir de la fracción de células presente en las TAIC, que proceden de los monocitos.

Tras el cultivo in vitro y la estimulación de las células originales (monocitos) con interferón \gamma, se forman las TAIC, que comprenden una subpoblación de células, véase el Ejemplo 9, que se unen al anticuerpo monoclonal GM-7, que es expresado por la línea celular de hibridoma DSM ACC2542. El anticuerpo monoclonal GM-7 es un anticuerpo del isotipo inmunoglobulina IgG_{2a}, cuya cadena ligera muestra el isotipo kappa. La propiedad característica de este anticuerpo es su estricta capacidad para unirse a los monocitos modificados mediante las condiciones de cultivo según la invención, dado que las células monocíticas originales no son reconocidas, es decir, no se produce la unión del anticuerpo a las células originales (véase el Ejemplo 9). Además, se demostró con 20 voluntarios que el GM-7 no se une a las células humanas en la sangre periférica, véase la Figura 10.

El anticuerpo se preparó inmunizando ratones con TAIC procedentes de monocitos humanos usando los procedimientos conocidos por la persona experta en la materia (Davis, W. C. "Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols", Nueva York: Humana Press Inc. Totowa, 1995). Entonces se produjo una línea celular de hibridoma mediante la fusión de una célula B productora del anticuerpo y una célula de mieloma del ratón. Los procedimientos usados para la preparación de dichas líneas celulares son conocidos en el estado de la técnica (Davis, W. C. "Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols", Nueva York: Humana Press Inc. Totowa, 1995; Kohler, G., Milstein, C. "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of pre-defined specificity", Nature 256, 495-497 (1975)). La línea celular de hibridoma productora del anticuerpo GM-7 se deposito según las normas de la Convención de Budapest en el DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zeilkultur GmbH, Braunschweig, Alemania) con el nº de acceso DSM ACC2542 (fecha de depósito: 13 de mayo de 2002).

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La Figura 1 muestra la capacidad de unión, determinada mediante citometría de flujo, del GM-7 a las células monocíticas tras su modificación in vitro según la invención. Puede observarse que los monocitos CD14 positivos obtenidos directamente a partir de la capa leucocítica no se unen al anticuerpo GM-7 (la zona oscurecida en gris es congruente con el control de anticuerpo no oscurecido). Por el contrario, tras el cultivo en presencia de M-CSF y la estimulación con IFN-\gamma, parte de los monocitos expresan un antígeno que es reconocido por el anticuerpo monoclonal GM-7. El anticuerpo monoclonal GM-7 se caracterizó como el isotipo K-IgG_{2a}. El proceso según la invención da lugar consecuentemente a un cambio en el patrón fenotípico de expresión del antígeno en la membrana celular de los monocitos modificados (Figura 1).

El anticuerpo monoclonal GM-7 se une específicamente a aquella población celular que, de entre las células producidas mediante el proceso según la invención, inducen la aceptación más eficaz del trasplante (véase la Figura 9).

Por lo tanto, la invención describe dichas TAIC, que son capaces de unirse al anticuerpo GM-7. Estas células se designaron posteriormente como TAIC_{GM7}.

El anticuerpo GM-7 representa por tanto una forma extraordinariamente eficaz y fácil de agente de manipulación para seleccionar y purificar las células inductoras de aceptación de trasplantes (TAIC). Por medio del anticuerpo es posible producir una población homogénea y altamente eficaz de TAIC.

Las células inductoras de aceptación de trasplantes formadas en la etapa c) del proceso de la invención descrita anteriormente, que expresan la unión de antígeno al anticuerpo GM-7, pueden seleccionarse bien directamente a partir del medio de cultivo después de la etapa c), o bien pueden seleccionarse a partir de la población celular obtenida tras la separación de las células del medio de cultivo según la etapa d) del proceso de la invención mencionada anteriormente, mediante la unión del anticuerpo GM-7 producido por la línea celular de hibridoma DSM ACC2542.

Para seleccionar las TAIC, el anticuerpo se pone en contacto con la muestra en unas condiciones que permitan la unión del anticuerpo a las células inductoras de aceptación de trasplantes presentes en la muestra. Los complejos de reacción resultantes de la reacción de unión son posteriormente separados de la muestra. Para este propósito, el anticuerpo puede ser inmovilizado sobre un material vehicular antes de entrar en contacto con la muestra; por ejemplo, puede unirse a una matriz adecuada para fines cromatográficos o a las denominadas "perlas magnéticas". Este procedimiento permite seleccionar y concentrar las células inductoras de aceptación de trasplantes a partir de grandes volúmenes de muestra.

Para obtener las células inductoras de aceptación de trasplantes, la unión entre el anticuerpo y las células inductoras de aceptación de trasplantes es separada tras el aislamiento del complejo de reacción de la muestra. Esto puede efectuarse mediante los procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo, mediante un desplazamiento competitivo o mediante un lavado con disoluciones salinas. Algunos procedimientos correspondientes se describen en, por ejemplo, Utz U. y col. ("Analysis of the T-cell Receptor repertoire of human T-cell leukemia virus type-1 (HTLV-1) Tax-specific CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes from patients with HTLV-1 associated disease: Evidence for the oligoclonal expansion" J. of Virology febrero de 1996, 843-851).

Además, el anticuerpo monoclonal GM-7 permite la detección cualitativa y cuantitativa in vitro de las células inductoras de aceptación de trasplantes de origen monocítico en muestras sanguíneas y/o tisulares del paciente. Este paciente puede ser, por ejemplo, el receptor de un órgano que se va a trasplantar o ya trasplantado. La formación de los complejos de reacción en la muestra, que indica la presencia y, si fuera aplicable, la cantidad de células inductoras de aceptación del trasplante, se detecta mediante procedimientos conocidos.

Para detectar los complejos de reacción, es posible en este caso acoplar ("marcar") el anticuerpo GM-7, por ejemplo, directamente con una molécula detectable que está, por ejemplo, unida covalentemente al anticuerpo. Algunas moléculas detectables adecuadas se describen en gran número en el campo del diagnóstico molecular, e incluyen, entre otras, pigmentos fluorescentes tales como isotiocianato de fluoresceína o rodamina-5-isotiocianato de tetrametilo, pigmentos luminescentes, moléculas marcadas radioactivamente y enzimas tales como peroxidasas (cotéjese Lottspeich, F., Zorbas, H, "Bio- analytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlín, 1998).

La detección del anticuerpo tiene lugar dependiendo de la molécula seleccionada para el marcaje del anterior. En relación con la presente invención, el anticuerpo GM-7 se acopló con la molécula fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC) de forma que la detección del anticuerpo pudiera llevarse a cabo mediante citometría de flujo y/o microscopía de fluorescencia. Los procedimientos para el marcaje de anticuerpos con FITC son conocidos por la persona experta en la materia que ejerce en la técnica.

Alternativamente, el complejo de reacción también puede detectarse en un proceso de dos etapas usando anticuerpos secundarios. En esta relación, el anticuerpo GM-7 no marcado puede ser detectado en el complejo de reacción con un anticuerpo adicional marcado (cotéjese Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlín, 1998). Este procedimiento de detección en dos etapas es considerablemente más sensible que la detección directa de la unión del anticuerpo, dado que pueden unirse en varios anticuerpos secundarios a un anticuerpo GM-7 (amplificación de la señal).

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El anticuerpo GM-7 permite, por consiguiente, la detección de TAIC en la sangre periférica del paciente tratado con TAIC, por ejemplo, en forma de una "monitorización", durante la cual se determina el número de células en sangre periférica a unos intervalos de tiempo específicos. Según la invención, se ha averiguado que la presencia de TAIC preparadas a partir de monocitos del donante se correlaciona en el animal de prueba en la sangre periférica del receptor del trasplante, con la tolerancia al órgano trasplantado. Este hallazgo permite por consiguiente al médico disminuir gradualmente o reducir la dosis de inmunodepresores que se están administrando opcionalmente poco a poco. Previamente, no había sido posible desde el punto de vista clínico proporcionar una prueba precisa de si el sistema inmune de un paciente mostraba tolerancia en un punto temporal dado después del trasplante.

Como es obvio para la persona experta la materia, es posible preparar anticuerpos monoclonales contra las TAIC a partir de monocitos, también a partir de vertebrados no humanos, en particular a partir de monocitos de primates y de cerdos modificados según la invención. A este respecto, la inmunización de los correspondientes animales hospedadores y la producción de la correspondiente línea celular de hibridoma se llevan a cabo según se describió anteriormente para las TAIC de origen humano. La producción de poblaciones de TAIC eficaces a partir de otras especies proporciona una importante contribución en el campo de la medicina de trasplantes xenogénicos.

La invención también desvela una subpoblación de las TAIC, que coexpresa los antígenos CD3 y CD14 en su superficie celular. Estas células se indican posteriormente como TAIC_{CD3+/CD14+}. Hasta la fecha no se han referido dichas células en el estado de la técnica. Los monocitos y las células conocidas procedentes de los monocitos portan el marcador de superficie CD14, sin embargo, no portan adicionalmente el marcador de superficie CD3 al mismo tiempo.

Las TAIC que coexpresan los antígenos de superficie CD3 y CD14 pueden seleccionarse bien directamente a partir de las células inductoras de aceptación de trasplantes formadas en la etapa c) del proceso de la invención descrita anteriormente, o bien pueden seleccionarse a partir de la población celular obtenida después de separar las células del medio de cultivo según la etapa d) del proceso de la invención mencionada anteriormente, o alternativamente pueden seleccionarse a partir de la población de TAIC_{GM7}.

Además, se ha demostrado que las TAIC_{CD3+/CD14+} expresan fuertemente los genes Foxp3, CTLA4 y la integrina \alpha_{E}\beta_{7} (véase el Ejemplo 12). Por el contrario, estos genes no son expresados, o sólo hasta cierto punto, por los monocitos originales. La regulación por incremento de la expresión de los genes Foxp3, CTLA4 y la integrina \alpha_{E}\beta_{7} es por lo tanto una característica de las células TAIC_{CD3+/CD14+}.

Según se discute en el Ejemplo 12, la expresión de los marcadores FoxP3, CTLA4 y la integrina \alpha_{E}\beta_{7} sólo fue descrita previamente para los linfocitos T reguladores. Los linfocitos T, que coexpresan los antígenos de superficie CD4 y CD25 son una subpoblación de los linfocitos T reguladores, que también se indican como "células supresoras". Su función es suprimir la respuesta inmune corporal. En particular, Foxp3 se percibe como un factor de transcripción específico que sirve como un gen de control para el desarrollo de las células T reguladoras, y que es expresado específicamente por éstas células. Las células TAIC_{CD3+/CD14+} expresan al menos 1 x 10^{-9}, más preferiblemente al menos 5 x 10^{-9}, y de una forma particularmente preferible al menos 1 x 10^{-8} \mug de ARN de Foxp3 por \mug de ARN total.

El CTLA4 se percibe de forma similar como un marcador para la detección de la función reguladora de los linfocitos T, en particular de los linfocitos T CD4/CD25 positivos (véase la bibliografía mencionada en el Ejemplo 12). Las células TAICCD3_{+/CD14+} deberían expresar preferiblemente al menos 5 x 10^{-7}, más preferiblemente al menos 3 x 10^{-6} y de una forma particularmente preferible al menos 5 x 10^{-6} \mug de ARN de CTLA4 por \mug de ARN total.

La integrina \alpha_{E}\beta_{7}, que reconoce la cadherina epitelial, fue descrita recientemente por Lehmann y col. en PNAS 99, páginas 13031-13036 (2002) como un nuevo marcador para una subpoblación de linfocitos T reguladores altamente potentes que interactúan con el entorno epitelial. La expresión del ARN de la integrina \alpha_{E}\beta_{7} debería, según la invención, suponer en las células TAIC_{CD3+/CD14+} hasta preferiblemente al menos 1 x 10^{-12}, más preferiblemente hasta al menos 1 x 10^{-11}, y de una forma particularmente preferible hasta al menos 1 x 10^{-10}, y muy preferiblemente hasta al menos 1 x 10^{-9} \mug por 1 \mug de ARN total.

Según se muestra en la Tabla del Ejemplo 12, el cocultivo directo de las TAIC de la invención con linfocitos da lugar a un aumento significativo en el número de linfocitos T reguladores, en particular de células CD4/CD25 doble positivas en la población de linfocitos, con una expresión fuertemente regulada por incremento en los genes Foxp3, CTLA4 la integrina \alpha_{E}\beta_{7}. El Ejemplo demuestra además que este efecto no se observa si las TAIC se cocultivan indirectamente con linfocitos.

Estos resultados indican que la estimulación de la formación y/o la propagación de linfocitos T reguladores por parte de las TAIC está implicada en la inducción de una aceptación del trasplante por las TAIC de la invención.

El Ejemplo 13 confirma esta hipótesis. En este Ejemplo, los linfocitos de los animales receptores de los Ejemplos 3, 4, 5, 6 y 7 se incubaron in vitro con TAIC procedentes de los respectivos animales donantes. Para la inducción de la tolerancia, se inyectaron en los animales las TAIC que se preincubaron con los linfocitos de los receptores, en lugar de las TAIC. De este modo también pudo ser inducida una tolerancia específica para el donante, mientras que los animales a los que se les administraron los linfocitos del receptor no cocultivados con las TAIC procedentes del donante no desarrollaron tolerancia.

Las TAIC de la invención pueden usarse como tales como preparación farmacéutica. Las células obtenidas a partir de la etapa d) del procedimiento de la invención, según se describió anteriormente, pueden usarse directamente. Aproximadamente el 10 - 50% de las células totales de las poblaciones así obtenidas está formado por linfocitos y granulocitos, que descienden del aislado de monocitos inicial (capa leucocítica). Estas células ayudan a la formación de las TAIC de la invención procedentes de los monocitos en la etapa de cultivo (véase el Ejemplo 11); no interfieren en la inducción de la tolerancia si las TAIC de la invención se usan como preparación farmacéutica.

Sin embargo, las subpoblaciones de TAIC_{GM7} y/o de TAIC_{CD3+/CD14+} pueden aislarse a partir de la totalidad de la población de TAIC obtenida a partir del proceso de la invención (véase anteriormente) y pueden usarse para la inducción de tolerancia.

En el medio de cultivo (véase el Ejemplo 2), las TAIC o las TAIC_{GM7} y/o las TAIC_{CD3+/CD14+} pueden mantenerse durante al menos_{ }48 horas sin que se pierda su defecto inductor de tolerancia.

Para su uso como preparación farmacéutica, las TAIC o las subpoblaciones TAIC_{GM7} y/o TAIC_{CD3+/CD14+} suspendidas en, por ejemplo, suero AB humano (de uso universal) pueden administrarse por vía intravenosa como una transfusión corta. Para la inducción de aceptación de trasplantes en el caso del trasplante alogénico, las TAIC producidas a partir de los monocitos del donante o de las subpoblaciones TAIC_{GM7} y/o las TAIC_{CD3+/CD14+} pueden inyectarse en el receptor MHC diferente bien preoperatoriamente o bien postoperatoriamente. En el caso de una administración preoperatoria, las TAIC deberían inyectarse de una a tres veces aproximadamente 1 semana antes de la operación. En el caso de una administración postoperatoria, el período entre la operación y la administración única de las células no debería ser mayor de 7 días. Las TAIC según la invención o las subpoblaciones TAIC_{GM7} y/o TAIC_{CD3+/CD14+} son entonces capaces de repeler la respuesta de las células T del sistema inmune del receptor contra el trasplante, y de persistir en la sangre del receptor durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo como para garantizar una aceptación del trasplante a largo plazo.

La inyección intravenosa preoperatoria puede considerarse en relación con las donaciones procedentes de individuos vivos; sin embargo, si la donación en cuestión es de un cadáver (sangre y órganos de un cuerpo muerto), puede ser preferible la administración postoperatoria de las TAIC según la invención o de las subpoblaciones TAIC_{GM7} y/o TAIC_{CD3+/CD14+}. En el caso de una donación de un cadáver, el cuerpo del donante se inunda con un medio de perfusión mediante la canalización de la arteria principal con el propósito de conservar los órganos. En este caso, la sangre venosa se extrae normalmente a través de la vena cava y se desecha. Para obtener las TAIC que van a usarse según la invención, la sangre venosa puede recogerse y tratarse según se describe en el Ejemplo 1. Como alternativa, en el caso de la donación de un cadáver, las TAIC también pueden obtenerse a partir de las células (linfocitos y monocitos) del bazo del donante.

En el caso de una aplicación postoperatoria de las TAIC según la invención en relación con la donación de un cadáver, el intervalo entre trasplante y la aplicación de las células puede superarse mediante la combinación con inmunodepresores, con objeto de evitar un rechazo agudo del órgano en el intervalo entre el trasplante y el suministro de las TAIC obtenidas a partir de la sangre del donante. En esta relación pueden considerarse las combinaciones terapéuticas con inmunodepresores convencionales tales como, por ejemplo, inhibidores de la calcineurina tales como ciclosporina A (CSA) o tacrólimo, o con azatioprina (AZA), micofenolato mofetilo, rapamicina, anticuerpos monoclonales (ATG, ALG, pero ni con Dicliziuinab ni con Basiliximab) o esteroides (STE). La presencia de inmunodepresores (excepto para los conocidos anticuerpos monoclonales IL-2-receptor-\alpha tales como Dicliziunab y Basiliximab) en la sangre del receptor no tiene un efecto negativo sobre la eficacia de los inmunodepresores, por un lado, ni de las TAIC, por otro lado.

En este sentido, las células de origen monocítico que han sido modificadas según la invención pueden usarse como "vehículo para la transferencia de tolerancia" para cualquier trasplante celular (tales como células insulínicas, hepatocitos, células madre adultas y para cualquier otro tipo celular o tipo tisular programado) y de órganos (tales como, por ejemplo, riñón, hígado, corazón) hasta tal punto que son genéticamente idénticas a las células que se van a trasplantar (órganos), es decir, deben proceder del propio donante o de gemelos idénticos del mismo. Las TAIC cumplen su función protectora permitiendo que las células/órganos trasplantados se vuelvan cohesivas con su nuevo entorno, librando así al receptor de padecer los efectos secundarios de una terapia inmunodepresora a largo plazo.

Descripción detallada de la invención

Las células de partida para el proceso según la invención son monocitos sanguíneos. Éstos son preferiblemente monocitos procedentes de sangre humana. Para el propósito de inducir aceptación al trasplante, las células deben proceder del donante del trasplante (o de su gemelo idéntico). En el caso de trasplantes xenogénicos de, por ejemplo, órganos de mono o de cerdo al hombre, las TAIC según la invención deben proceder por consiguiente de los monocitos del animal donante en cuestión.

Para obtener los monocitos, puede separarse en primer lugar la sangre, tras el tratamiento habitual con un anticoagulante, en plasma y en glóbulos blancos y rojos usando los procedimientos conocidos en la materia, preferiblemente mediante centrifugación. Después de la centrifugación, el plasma estará presente en el sobrenadante; por debajo de él hay una capa que contiene los glóbulos blancos en su totalidad. Esta capa también se denomina capa leucocítica. Por debajo de ésta está la fase que contiene los glóbulos rojos (hematocrito).

En relación con el proceso según la invención, en primer lugar se aísla la capa leucocítica y se separa para obtener los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación según los procedimientos conocidos. Según una forma de realización preferible del proceso, la capa leucocítica se aplica a un medio de separación de linfocitos (Ficoll-Hypaque) y se centrifuga (véase el Ejemplo 1). El Ejemplo 1 describe la forma de realización preferible de la invención, en la que los eritrocitos y las células muertas que todavía están en la capa leucocítica se separan mediante centrifugación, y los glóbulos blancos, incluyendo los monocitos, están presentes como un aislado en el medio de separación. A continuación, la fase blanca de los monocitos puede ser cuidadosamente pipeteada y, para enriquecer los monocitos dentro del aislado, se centrifuga y se lava repetidamente. En el transcurso de este proceso, los monocitos se agruparán en el fondo del recipiente de centrifugación junto con una parte de los linfocitos.

Según una forma de realización particularmente preferible del procedimiento de la invención, las condiciones para obtener el aislado que contiene los monocitos están controladas de tal forma que el aislado contiene aproximadamente el 10 - 50% de los linfocitos adyacentes a los monocitos, con respecto al número total de células. Preferiblemente, el aislado contiene aproximadamente el 50 - 90%, de un modo particularmente preferible el 60 - 70% de los monocitos y aproximadamente el 10 - 50%, de un modo particularmente preferible el 20 - 50% de los linfocitos, cada uno con respecto al recuento celular total, en el que la diferencia vendrá dada opcionalmente por los granulocitos.

Según se muestra en el Ejemplo 11, la presencia de linfocitos en una cantidad del 20 - 30%, con referencia al recuento celular total, durante el cultivo de los monocitos originales con M-CSF e interferón \gamma dará lugar a la producción de una cantidad significativamente mayor de TAIC CD3/CD14 doble positivas, cómo será el caso si solo hay presentes unos pocos linfocitos (aproximadamente el 5%).

Para preparar una cantidad suficiente de TAIC, es necesario en primer lugar permitir la propagación de los monocitos. Con este propósito pueden usarse medios de crecimiento adecuados conocidos para los monocitos; sin embargo, el medio debe contener el factor de crecimiento M-CSF (factor estimulante de las colonias de macrófagos). El M-CSF (denominado también CSF-1) es producido por monocitos, fibroblastos, linfocitos y células endoteliales. La concentración del M-CSF en el medio de cultivo puede suponer preferiblemente desde 2 hasta 20 \mug/l de medio, más preferiblemente desde 4 hasta 6 \mug/l y de un modo particularmente preferible 5 \mug/l.

Posteriormente o simultáneamente, las células deben ser estimuladas con IFN-\gamma, es decir, cultivadas en presencia de IFN-\gamma. La estimulación de los monocitos con IFN-\gamma tiene lugar después de una fase inicial de propagación que dura entre 3 y 6 días en el medio de cultivo que contiene el factor de. Preferiblemente, en el día 4 tras el comienzo del cultivo, se lleva a cabo la estimulación con IFN-\gamma, y esta estimulación se extiende durante un periodo de preferiblemente 24 a 72
horas, más preferiblemente de 48 horas en condiciones de incubación, es decir, a 37ºC y con una atmósfera de CO_{2}

\hbox{al 5%.}

La concentración de IFN-\gamma en el medio puede ser de 0,1 a 20 ng/ml, preferiblemente de 1 a 10 ng/ml y particularmente preferiblemente de 5 ng/ml.

La estimulación con IFN-\gamma puede comenzar simultáneamente con la propagación de los monocitos en el medio que contiene el factor de crecimiento. Sin embargo, es preferible una estimulación después de una fase de propagación inicial de 3 a 6 días de duración. La propagación de las células y la estimulación con IFN-\gamma no debería durar, en conjunto, preferiblemente más de 8 días. En cualquier caso, el tratamiento con IFN-\gamma debería llevarse a cabo de una forma tal que después de la fase de propagación, dure al menos 24 horas, como máximo 72 horas, preferiblemente 48 horas. El periodo de propagación y de estimulación de las células debería durar por consiguiente un total de preferiblemente 4 a 8 días.

Según una forma de realización preferible de la invención, la propagación y la estimulación con interferón \gamma se lleva a cabo según se indica en el Ejemplo 2, de una forma tal que los monocitos son propagados en primer lugar en un medio de cultivo que contiene el factor de crecimiento y que el IFN-\gamma se añade al medio de cultivo después de 3 a 6 días en una cantidad tal que se obtiene en el medio una concentración de 0,1 a 20 ng/ml, preferiblemente de 1 a 10 ng/ml y particularmente preferiblemente de 5 ng/ml.

Preferiblemente, el proceso según la invención se lleva a cabo en recipientes de cultivo cuya superficie ha sido previamente recubierta con suero bovino fetal (FCS) o alternativamente con suero AB humano (véase el Ejemplo 2). El recubrimiento con FCS puede tener lugar recubriendo la superficie de los recipientes de cultivo con FCS antes de su uso y, después de un periodo de interacción de unas pocas horas, en particular de 4 a 72 horas, preferiblemente de 12-48 horas y en particular de 24 horas, se elimina el FCS no adherido a la superficie de una forma
adecuada.

Durante la etapa de cultivo las células sedimentarán en el fondo del recipiente de cultivo después de aproximadamente 24 horas. Debido a sus propiedades adhesivas, los monocitos y las TAIC procedentes de los monocitos durante el proceso, se adherirán al fondo de los respectivos recipientes de cultivo. Si, según se describe en el Ejemplo 2, el medio de cultivo se cambia durante el cultivo, el sobrenadante se elimina inicialmente cuidadosamente, por ejemplo, mediante pipetetado o decantación, y posteriormente se rellena con medio de cultivo nuevo. Sin embargo, preferiblemente, las células que se adhieren al fondo no se lavan, o sólo cuidadosamente, de forma que los linfocitos presentes no sean eliminados.

La eliminación de las células adheridas puede tener lugar mecánicamente, por ejemplo, mediante un raspador celular fino o una espátula.

Sin embargo, según una forma de realización preferible del proceso según la invención, la completa eliminación de las células tiene lugar mediante el tratamiento con una enzima adecuada, por ejemplo, con tripsina (véase el Ejemplo 2). La disolución de tripsina (de 0,1 a 0,025, preferiblemente 0,05 g/l) puede dejarse actuar sobre las células durante entre 2 y 10 minutos a entre 35ºC y 39ºC, preferiblemente a 37ºC, en presencia de CO_{2} al 5%.

Entonces la actividad enzimática se bloquea del modo habitual, y las TAIC que ahora flotan libremente pueden obtenerse de la forma habitual mediante centrifugación. Están disponibles para su uso inmediato, opcionalmente en suspensión en un medio adecuado, por ejemplo, en PBS. Sin embargo, también pueden ser conservadas durante varios días, en particular durante aproximadamente de 2 a 3 días, en un medio nutriente (véase el Ejemplo 2); en el que este medio de conservación no debería contener ni el factor de crecimiento ni IFN-\gamma. Las células pueden observarse en dicho medio nutriente como TAIC durante al menos 48 horas.

Para su almacenamiento durante períodos más largos, las células pueden ultracongelarse. Los protocolos para la ultracongelación de células vivas son conocidos en el estado de la técnica, cotéjese Griffith M. y col., ("Epithelial Cell Culture, Cornea", en Methods of tissue engineering, Atala A. y Lanza R. P., Academic Press 2002, capítulo 4, páginas 131-140). Un medio de suspensión preferible para la ultracongelación de las células según la invención es FCS que contiene DMSO.

La suspensión de células que contiene las células inductoras de aceptación de trasplantes procedentes de las etapas c) o d) puede purificarse adicionalmente con respecto a estas células, que se unen al anticuerpo GM-7, de forma que se obtenga una subpoblación de TAIC_{GM7}. Los procedimientos para dicha purificación se describen detalladamente a continuación.

Dichas células se seleccionan a partir de la población de TAIC que coexpresan los antígenos CD3 y CD14 en su superficie celular. Los procedimientos para la selección de dichas células son conocidos en la materia. Algunos ejemplos de dichos procedimientos son la "separación de células activadas por fluorescencia -Fluorescent-Activating Cell Sorting"(FACS), la "selección con perlas inmunomagnéticas - Immuno Magnetic Bead Sorting" y la "separación de células activadas magnéticamente - Magnetic Activated Cell Sorting" (MACS), o el denominado "Método del Rosetting" [véase Gmelig-Meyling F. y col. "Simplified procedure for the separation of human T- and non-T-cells", Vox Sang. 33, 5-8 (1977)).

La selección de la subpoblación de TAIC TAIC_{CD3+/CD14+} puede tener lugar directamente a partir de la población de TAIC obtenida partir de las etapas c) o d) del proceso de la invención descrito anteriormente, o a partir de la subpoblación de TAIC_{GM7}. Esta última forma de proceder significar que tendrá lugar un enriquecimiento paso a paso de las TAIC_{CD3+/CD14+}.

En una forma de realización preferible de la invención, las TAIC se usan como tales para la producción de una composición farmacéutica para la supresión in vivo del rechazo de trasplantes.

Dicha composición farmacéutica puede contener TAIC vitales según la invención, que se obtienen a partir de la etapa d) del proceso de la invención, suspendidas en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 1 x 10^{5} a 1 x 10^{7} células/ml y más preferiblemente de aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml de la preparación.

Las células de la subpoblación TAIC_{GM7} se usan como tales para la producción de una composición farmacéutica para la supresión in vivo del rechazo de trasplantes.

Dicha composición farmacéutica puede contener células TAIC_{GM7} vitales, que se unen al anticuerpo GM-7, suspendidas en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 1 x 10^{6} a 1 x 10^{8} células/ml, y más preferiblemente de aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml de la preparación.

Las células de la subpoblación TAIC_{CD3+/CD14+} se usan como tales para la producción de una composición farmacéutica para la supresión in vivo del rechazo de trasplantes.

Dicha composición farmacéutica puede contener células TAIC_{CD3+/CD14+} vitales, que coexpresan los antígenos CD3 y CD14, en una cantidad de preferiblemente aproximadamente 5 x 10^{3} a 5 x 10^{7} células/ml y más preferiblemente de aproximadamente 5 x 10^{6} células/ml de la preparación.

Las preparaciones farmacéuticas descritas anteriormente pueden contener las células según la invención suspendidas en un medio fisiológicamente bien tolerado. Algunos medios adecuados son, por ejemplo, disolución de Ringer, disolución salina fisiológica o una disolución de albúmina humana a entre el 5 y el 20%, y similares.

Las preparaciones de células según la invención pueden contener TAIC vitales, que se obtienen a partir de la etapa d) del proceso de la invención. Alternativamente, las preparaciones pueden contener células pertenecientes a subpoblaciones de células TAIC_{GM7}, que se unen al anticuerpo GM-7, o de células TAIC_{CD3+/CD14+}, que coexpresan los antígenos CD3 y CD14 en su superficie celular. Las preparaciones pueden contener las respectivas células en una cantidad de preferiblemente al menos 1 x 10^{5}, más preferiblemente al menos 5 x 10^{5} y muy preferiblemente al menos 1 x 10^{6} células por ml, suspendidas en un medio vehicular líquido. El medio puede ser un cultivo celular o un medio de transporte bien tolerado por las células, tal como una disolución de albúmina humana a entre el 5 y el 20%. Alternativamente, las células de la preparación pueden ultracongelarse y depositarse en un medio de almacenamiento adecuado, tal como, por ejemplo, RPMI con una disolución de albúmina humana al 50% y DMSO al 10%.

Finalmente, la invención también se refiere a un procedimiento en el que las células inductoras de aceptación de trasplantes de la invención (TAIC, TAIC_{GM7} o TAIC_{CD3+/CD14+}) se usan para producir o expandir linfocitos T reguladores in vitro. Según se muestra en el Ejemplo 12, el cocultivo directo in vitro de TAIC con linfocitos da lugar a una significativa proliferación de linfocitos T reguladores, en particular de linfocitos CD4^{+}/CD25^{+}, véase Wood y Sakaguchi: "Regulatory Cells in Transplantation Tolerance", Nature Review Immunology 3, 199-210 (2003). Por lo tanto es posible producir y/o expandir linfocitos T reguladores, en particular linfocitos CD4^{+}/CD25^{+} entre el cocultivo directo de las TAIC con linfocitos, según se describe en el Ejemplo 12.

El cultivo directo in vitro significa, según la invención, que las TAIC y los linfocitos se cocultivan en contacto físico directo dentro del mismo medio, como en el Ejemplo 12.

En este procedimiento el medio contiene preferiblemente las respectivas células, es decir, TAIC y linfocitos, en un número de células aproximadamente igual, y cada una en una cantidad de aproximadamente preferiblemente al menos 1 x 10^{5}, más preferiblemente al menos 5 x 10^{5} y muy preferiblemente al menos 1 x 10^{5} células por ml suspendidas en un medio vehicular líquido; el medio puede ser un cultivo celular o un medio de transporte bien tolerado por las células, tal como una disolución de albúmina humana al 5-20%. El cocultivo debería tener lugar preferiblemente en unas condiciones fisiológicas, a aproximadamente 37ºC, por ejemplo, en una estufa de incubación, durante preferiblemente aproximadamente entre 3 y 5, más preferiblemente, 4 días.

Según se muestra en el Ejemplo 13, la aceptación del trasplante no sólo puede ser inducida administrando al receptor las TAIC producidas a partir de los monocitos del donante, sino también readministrando linfocitos del receptor al receptor, que han sido previamente cocultivados directamente in vitro con las TAIC preparadas a partir de los monocitos del donante, según se describió anteriormente.

Según una forma de realización adicional de la invención, los linfocitos T reguladores pueden por tanto prepararse in vitro a partir de linfocitos procedentes del receptor de un trasplante, mediante el cocultivo directo de los linfocitos procedentes del receptor con las TAIC procedentes del donante de ese trasplante. La readministración de los linfocitos cocultivados al receptor dará lugar a la aceptación del trasplante de por vida en el receptor, según se muestra en el Ejemplo 13.

Los linfocitos T reguladores procedentes del receptor así preparados pueden aislarse mediante FACS según se describe en este documento (véase anteriormente) y pueden usarse en una preparación farmacéutica para evitar el rechazo del trasplante en el receptor, en la que las células están suspendidas en un vehículo farmacéuticamente aceptable, según se describió anteriormente.

La invención se ilustrará adicionalmente en detalle mediante los ejemplos.

Si no estuviera definida en los ejemplos, la composición de los medios y sustancias usadas es como sigue:

\vskip1.000000\baselineskip

1. Disolución de penicilina/estreptomicina

10.000 unidades de penicilina como sal sódica de penicilina G y 1000 \mug de estreptomicina como sulfato de estreptomicina por ml de disolución fisiológica de cloruro sódico (NaCl al 0,85%) (Gibco, nº de catálogo 15140122).

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2. Tripsina-EDTA

0,5 g de tripsina y 0,2 g de EDTA (4 Na)/l

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3. RPMI 1640 (1x, líquido (11875)) Contiene L-Glutamina

Los medios RPMI (Roswell. Park Memorial Institute) 1640 son formulaciones enriquecidas, que pueden usarse extensamente para células de mamífero.

2

3

Referencia: Moore G. E., y col., J.A.M.A. 199: 519 (1967).

4. PBS (disolución salina de Dulbecco tamponada con fosfato) cotéjese J. Exp. Med. 98: 167 (1954)

4

5. Ficoll-Hypaque

Medio de separación de linfocitos (copolimerizado de sacarosa/epiclorhidrina Mg 400.000; Densidad 1,077, ajustada con diatrizoato sódico).

\vskip1.000000\baselineskip

6. L-Glutamina

Líquida: 29,2 mg/ml

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7. Factor estimulante de las colonias de macrófagos (M-CSF)

M-CSF humano recombinante procedente de E. coli; contiene como monómero (18,5 kD) 135 residuos de aminoácidos que incluyen la metionina N terminal; está presente como un homodímero con una masa molecular de 37 kD: (SIGMA, nº de catálogo M 6518)

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8. Interferón \gamma (IFN-\gamma)

IFN-\gamma humano recombinante procedente de E. coli; proteína de 16,7 kD que contiene 143 residuos de aminoácidos (CHEMICON nº de catálogo 1F002)

Ejemplo 1 Separación de monocitos a partir de sangre completa

Para evitar la coagulación de la sangre y para alimentar las células, se mezclaron 450 ml de sangre humana completa en un conjunto de bolsas de cámara triple con 63 ml de una disolución estabilizante que contenía, por litro de H_{2}O, 3,27 g de ácido cítrico, 26,3 g de citrato trisódico, 25,5 g de dextrosa y 22,22 g de dihidroxifosfato sódico. El pH de la disolución era de 5,6-5,8.

Para separar los componentes de la sangre, se llevó a cabo posteriormente un "centrifugado preciso" de esta mezcla a 4000 rpm durante 7 minutos a 20ºC. Esto dio como resultado la estratificación de los componentes corpusculares y no corpusculares en tres capas. Usando el conjunto de bolsas en una máquina de compresión preparada para este propósito, los eritrocitos se presionaron entonces hacia la bolsa inferior, el plasma se presionó hacia la bolsa superior y la denominada capa leucocítica permaneció en la bolsa central, y contenía un volumen de aproximadamente 50 ml.

La cantidad de 50 ml de capa leucocítica recién obtenida se dividió en 2 porciones de 25 ml cada una y se estratificaron respectivamente en 25 ml de medio de separación de Ficoll-Hypaque que había sido previamente introducido en dos tubos Falcon de 50 ml.

Esta preparación se centrifugó durante 30 minutos a 2500 rpm sin frenar. A continuación, cualquier eritrocito y célula muerta que hubiera aún presente en la capa leucocítica estaría por debajo de la fase Ficoll, mientras que los glóbulos blancos, incluyendo los monocitos, se separaron en el Ficoll como una interfase blanca.

Posteriormente, la interfase blanca que incluía los monocitos se retiró cuidadosamente mediante pipeteado y se mezcló con 10 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS).

Esta preparación se centrifugó entonces tres veces durante 10 minutos a 1800 rpm sin frenar, siendo retirado el sobrenadante mediante pipeteado después de cada proceso de centrifugado, e introduciendo PBS nuevo.

Los sedimentos celulares se agruparon en el fondo del recipiente de centrifugación (tubos Falcon) que contenía la fracción de células mononucleares, es decir, los monocitos.

Para preparar los monocitos requeridos para el experimento con ratas se aislaron 25 ml de sangre completa a partir de 4 ratas donantes genéticamente idénticas respectivamente y cada uno se estratificó en 25 ml de medio de separación de Ficoll-Hypaque. El procedimiento continuó entonces de la misma forma a la descrita anteriormente. Alternativamente, también pueden aplicarse etapas de separación análogas en Ficoll a suspensiones de células

\hbox{de bazo.}

Ejemplo 2 Propagación y modificación de los monocitos

El cultivo y la propagación de los monocitos se llevaron a cabo en un medio nutriente con la siguiente composición:

6

El medio nutriente contenía 2,5 \mug/500 ml de M-CSF.

Los monocitos aislados en el Ejemplo 1 se suspendieron en una cantidad total de 10^{6} células en 10 ml de medio nutriente, y se transfirieron a una placa de Petri (100 mm de diámetro). La placa de Petri había sido previamente llenada con FCS puro inactivado, y el FCS se había vertido después de 24 horas con objeto de obtener, de esta forma, una placa recubierta con FCS.

La placa de Petri se recubrió con la cubierta adecuada y se mantuvo durante 3 días en una estufa de incubación a 37ºC. Las células sedimentaron en el fondo de la placa de Petri después de 24 horas. En el día dos se pipeteó el sobrenadante y la placa de Petri se llenó otra vez con 10 ml de medio nutriente nuevo.

En el día 4 se añadieron 50 ng de interferón \gamma en 10 ml de medio nutriente, y la placa se cerró otra vez y se mantuvo durante 48 horas adicionales de la estufa de incubación a 37ºC.

Posteriormente se pipetearon 10 ml de una disolución de tripsina diluida cada una a 1:10 con PBS en la placa de Petri. La placa de Petri cerrada se mantuvo durante 10 minutos en la estufa de incubación a 37ºC.

A continuación se llevó a cabo la separación de las células adheridas al fondo de la placa de Petri con un raspador celular, de una forma tal que la mayor parte (>90%) de las células flotaba en el sobrenadante.

El sobrenadante total (10 ml de disolución de tripsina + 10 ml de medio) se pipeteó, se combinó en un tubo Falcon de 50 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 1800 rpm. Entonces el sobrenadante se desechó y se añadió medio nutriente nuevo (véase anteriormente) al precipitado (el sedimento celular remanente), añadiéndose 1 ml de nutriente por 10^{6} células. La determinación del recuento celular para la determinación de la dosis exacta tuvo lugar según los procedimientos conocidos, cotéjese Hay R. J., "Cell Quantification and Characterisation", en Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, capítulo 4, S. 55-84.

Esta suspensión celular se centrifugó (1800 rpm, 10 minutos, véase anteriormente) y el sedimento celular se incorporó bien en PBS o bien, para su aplicación en el hombre, en NaCl (fisiológico). Posteriormente puede tener lugar la administración intravenosa directamente o en 48 horas.

Alternativamente, después de centrifugar y de desechar el sobrenadante que contiene la tripsina, se añadió a las células FCS/DMSO como medio de congelación, y éstas se ultracongelaron en un volumen de 10 ml.

El medio de congelación contenía un 95% de FCS y un 5% de DMSO. En cada caso se incorporaron aproximadamente 10^{6} células en1 ml de medio, y se enfriaron en las siguientes etapas:

30 minutos en hielo;

2 horas a -20ºC en la caja de estiropor pre- refrigerada;

24 horas a -80ºC en estiropor;

Almacenamiento en tubos pequeños en nitrógeno líquido (N_{2}) a -180ºC.

La Figura 1 muestra los cambios fenotípicos en la expresión del antígeno, determinados mediante citometría de flujo, en los monocitos usados tras el cultivo y la estimulación con IFN-\gamma de las células monocíticas originales.

Ejemplo 3 Uso de las células inductoras de aceptación de trasplantes (TAIC) para el preacondicionamiento del sistema inmune del receptor del trasplante

El uso de las TAIC para tratar un potencial receptor antes del trasplante ofrece, por sí mismo, por ejemplo, en el caso de una donación en vivo en la que se ha aclarado antes del trasplante del órgano, quién será el donante y quién recibirá el órgano donado.

Para este caso, el trasplante heterotópico de corazón se llevó a cabo en un modelo de rata sobre ratas macho endogámicas de la combinación de variedades LEW[RT1.^{1}] (en relación con la presente invención, denominada
"LEW") -> DA.[RT1.^{av1}] (en relación con la presente invención, denominada "DA") usando la técnica descrita por Ono y Lindsey [Ref. Ono, K. y Lindsey, E. S. "Improved technique of heart transplantation in rats". J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969)]. En el día -7 antes del trasplante, las ratas DA receptoras recibieron 10^{6} TAIC procedentes de monocitos LEW por vía intravenosa en 1 ml de PBS. Posteriormente, el trasplante tuvo lugar siete días más tarde con un corazón tomado de la rata de la variedad LEW, que se implantó heterotópicamente en el abdomen (cavidad abdominal) del animal DA receptor. Dado que las variedades de rata usadas eran variedades endogámicas, las TAIC según la invención expresaron antígenos tisulares idénticos a los del corazón LEW trasplantado.

Con fines de control se llevó a cabo un denominado tercer trasplante de variedad. Con este fin se inyectaron las TAIC (10^{6}) procedentes de mismo animal LEW donante por vía intravenosa en animales DA, de nuevo en el día -7 (es decir, 7 días antes de la intervención quirúrgica). 7 días después, se llevó a cabo el trasplante de un corazón extraído de una variedad de rata endogámica CAP[RT1.^{c}] (en relación con la presente invención, denominada "CAP"). Las ratas CAP expresan el haplotipo RT1.^{c}, por lo tanto eran completamente MHC-discordantes (MHC-diferentes) de los animales LEW donantes. A continuación se detallan los grupos de prueba individuales en los que tuvo lugar un trasplante heterotópico de corazón (n = 10):

1. LEW ->: DA; sin tratar;

2. LEW ->: DA; 10^{6} TAIC procedentes de LEW i.v., día -7 antes del trasplante de corazón LEW;

3. CAP: DA; 10^{6} TAIC procedentes de LEW i.v., día -7 antes del trasplante de corazón LEW;

4. CAP ->: DA; sin tratar;

5. LEW ->: LEW, sin tratar;

6. LEW ->: LEW, 10^{6} TAIC procedentes de LEW i.v., día -7 antes del trasplante de corazón LEW.

Como puede observarse a partir de las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los órganos cardíacos (Figura 2A), 9 de los 10 corazones LEW fueron aceptados a largo plazo (>150 días) por los animales DA receptores, mientras que los corazones de la tercera variedad CAP fueron rechazados de forma aguda después de 6,7 \pm 0,8 días. Cuando no tuvo lugar una administración previa de TAIC, los corazones LEW también fueron rechazados de forma aguda después de 7,2 \pm 1,0 días.

El rechazo de los corazones CAP por parte de la respuesta inmune estimulada del animal DA después de 6,7 \pm 0,8 días tuvo lugar en el mismo lapso de tiempo que en el grupo de control sin tratar en el que los corazones CAP de las ratas DA fueron rechazados después de 6,9 \pm 1,0 días, cotéjense el grupo 3 y el grupo 4, respectivamente. Todos los corazones trasplantados singénicamente en el esquema LEW -> LEW sobrevivieron a largo plazo (>150 días) independientemente de si habían tenido lugar o no pretratamientos con TAIC. A partir de esto puede extraerse la conclusión de que las TAIC no ponen en peligro el organismo receptor en el sentido de una enfermedad del injerto contra el hospedador. Además, a partir de éste resultado es posible extraer la conclusión de que la administración por vía intravenosa de 10^{6} TAIC 1 semana antes del trasplante abre la posibilidad de inducir la aceptación de órganos a largo plazo. La tolerancia inducida es específica para el donante, dado que el correspondiente pretratamiento de ratas DA con TAIC procedentes de LEW induce tolerancia para los trasplantes de corazón de la tercera variedad CAP. En el esquema singénico LEW > LEW, la administración adicional de TAIC no influye ni en la supervivencia de los animales receptores ni en la de los trasplantes.

La Figura 2B muestra la evaluación histológica de un trasplante alogénico LEW en el día postoperatorio (POD) 150, tras el trasplante heterotópico en el abdomen de una rata DA receptora. La rata receptora había sido pretratada en el día -7 con 10^{6} TAIC procedentes de LEW. El trasplante estaba funcionando satisfactoriamente (fuerte latido cardíaco) hasta el momento de su extracción de la rata receptora (POD) 150. La preparación histológica (x 40) mostró una morfología sana del músculo cardíaco, un tejido endotelial vascular normal y únicamente una mínima infiltración por células mononucleares, sin ninguna indicación de procesos de rechazo agudos ni crónicos.

En esta relación también es notable el hecho de que las células procedentes del donante (detectadas mediante una detección inmunohistoquímica usando anticuerpos específicos para LEW-MHC de clase I I1.69) podían ser detectadas a largo plazo en el transcurso de un año en el timo de las ratas DA receptoras. La Figura 2C muestra una preparación histológica de un timo extraído en el POD 150, de una rata DA pretratada con 10^{6} TAIC procedentes de LEW. La preparación se marcó con el anticuerpo monoclonal I1.69 específico para LEW-MHC de clase I. Según se muestra en la Figura, la administración de las TAIC da lugar a la colonización del timo, en el que tiene lugar la presentación de los antígenos MHC procedentes del donante a las células T en maduración: pueden reconocerse claramente pequeños nidos de células que pueden marcarse con el anticuerpo.

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Ejemplo 4 Detección de los monocitos modificados procedentes del donante en el receptor

La inducción de un quimerismo mixto por la inyección intravenosa de las TAIC procedentes de LEW en el animal DA en cuestión puede considerarse como una posible causa de la tolerancia inducida, según la invención. Por lo tanto se llevó a cabo una prueba para comprobar si, tras la inyección de las TAIC procedentes de LEW, más del 5% de las células podían ser detectadas en la sangre del animal receptor mediante citometría de flujo a largo plazo (>45 días). La citometría de flujo se llevó a cabo según se describe en el estado de la técnica [Ref. Preffer F. I., "Flow cytometry" En: Diagnostic Immunopathology, Colvin RB, Bhan AK, McCluskey, RT (eds.), Ravan Press Nueva York, págs. 725-449 (1994)]. La detección de las células LEW del donante en la sangre del receptor DA tuvo lugar usando el anticuerpo monoclonal I1.69 que detecta específicamente los antígenos del LEW-MHC de clase I [véase Fandrich F., y col. Nature Med. 8, 171-178, (2002)]. Los datos del quimerismo que se determinaron para 4 de los trasplantes
LEW -> DA descritos en el Ejemplo 3, tras la administración de 10^{6} o 10^{4} TAIC/kg x BW respectivamente, en la sangre periférica de los animales receptores, se muestran en la Figura 2D.

Tras la inyección de las TAIC procedentes de LEW en cuatro ratas DA receptoras no sometidas a inmunodepresión (10^{6} células/kg x BW en las ratas 1-3 y 10^{4} células/kg x BW en la rata 4), las ratas 1-3 mostraron un quimerismo a largo plazo (60-80 días) en la sangre del receptor DA, que pudo ser atribuido a las células procedentes del donante. La detección de las células procedentes del donante tuvo lugar mediante una determinación mediante citometría de flujo usando el anticuerpo específico LEW-MHC de clase I I1.69 (un anticuerpo monoclonal que se une únicamente a las células MHC de clase I positivas de la variedad LEW de rata, y no presentan reacciones cruzadas con las células de rata de la variedad DA). Dado que casi todas las células de la sangre periférica expresan el antígeno MHC de clase I en su superficie celular, la proporción de células del donante en la sangre periférica de la rata DA puede determinarse con una alta precisión con el I1.69. Según se muestra en los gráficos de la Figura 20, en 3 de los 4 animales, más del 10% de las células expresan el antígeno del donante marcado por I1.69 en las primeras 6 semanas posteriores a la inyección intravenosa de las TAIC. Después de 60 días tras la inyección, esta proporción de quimerismo en la sangre periférica de estas ratas DA disminuye considerablemente, y desaparece completamente en el día 100. Sin embargo, este quimerismo transitorio se correlaciona estrechamente con la supervivencia del trasplante de corazones LEW trasplantados después del doble de tiempo (es decir, 7 días después de la inyección de las TAIC), que ya no son rechazados a pesar de la ausencia de quimerismo en el donante (después del día 100) (ratas 1-3 del ejemplo). Por otro lado, la inducción de un quimerismo a corto plazo tras la administración de 10^{4} células/kg x BW (Rata 4; <20 días) no garantiza la aceptación del trasplante a largo plazo del corazón transferido.

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Ejemplo 5 Administración de células procedentes del donante después del trasplante

Entonces tuvo que llevarse a cabo una evaluación del caso clínico de la donación de un cadáver (cuerpo muerto) para determinar hasta qué punto la administración postoperatoria de las TAIC era capaz de inducir la correspondiente aceptación a largo plazo del órgano trasplantado en el receptor. Con este propósito se llevaron a cabo trasplantes heterotópicos de corazón en el modelo de rata de la variedad endogámica LEW -> DA. Las ratas DA receptoras recibieron 4 ciclos de ciclosporina A (CEA) por vía intravenosa en dosis de 5 mg de CSA/kg x BW en los días 0, 1, 2 y 3 después del trasplante. En el día 7, tuvo lugar la administración por vía intravenosa de 10^{6} TAIC procedentes de LEW en la vena de la cola de las ratas DA receptoras. Los siguientes grupos experimentales se sirvieron como controles (n = 6-10).

1. LEW ->: DA; sin tratar;

2. LEW ->: DA; 5 mg de CSA/kg x BW, i.v., días 0, 1, 2 y 3

3. LEW ->: DA; 5 mg de CSA/kg x BW, i.v., días 0, 1, 2 y 3 más 10^{6} TAIC procedentes de LEW, i.v., día 7

4. LEW ->: DA; 10^{6} TAIC procedentes de LEW i.v., día 7

5. CAP ->: DA; 5 mg de CSA/kg x BW, i.v., días 0, 1, 2 y 3 más 10^{6} TAIC procedentes de LEW i.v., día 7

El tratamiento intravenoso postoperatorio de las ratas DA receptoras con 10^{6} TAIC procedentes de LEW en el día POD (día postoperatorio) 7 da lugar a una tolerancia a largo plazo si la administración inicial de 4 ciclos de CSA (5 mg/kg x BW, i.v.) se ha efectuado desde el día 0-3. La administración inicial de CSA es necesaria, dado que el tratamiento sólo con una única administración de 10^{6} TAIC en el día POD 7 (día postoperatorio) evita el rechazo agudo sólo en 1 de cada 6 casos. La dosis de CSA elegida en este caso sólo tiene un efecto subterapéutico, dado que no puede inducirse aceptación a largo plazo mediante la administración exclusiva de CSA, aunque sí se prolonga la supervivencia del trasplante. La aceptación inducida del trasplante es específica para el donante, dado que un tratamiento correspondiente de ratas DA con TAIC procedentes de LEW no induce ninguna tolerancia para los trasplantes de corazón de la tercera variedad CAP.

Según se muestra en la Figura 3, los corazones del grupo experimental 1 fueron rechazados de forma aguda después de 7,0 \pm 0,8 días. Los corazones del grupo 2 fueron rechazados con retraso, después de 14,4 \pm 7,0 días. Los corazones del grupo 3 fueron aceptados durante más 150 días en 5 de cada 6 casos. En el sistema de rata, la aceptación de órganos durante más de 100 días se considera una aceptación a largo plazo, dado que la esperanza media de vida de una rata endogámica es sólo de aproximadamente 2 años. La administración postoperatoria sólo de TAIC (10^{6} células) fue capaz de evitar el rechazo agudo sólo en 1 de cada 6 casos, dado que los órganos cardíacos dejaron de latir después de 22,6 \pm 31,6 días (grupo 4). La tercera variedad de control con corazones CAP mostró la especificidad de la aceptación inducida del trasplante, dado que los corazones de la tercera variedad fueron rechazados de nuevo de forma aguda después de 7,4 \pm 2,2 días. Estos resultados también prueban que la aplicación adicional de las TAIC no puede producir ninguna inmunodepresión general, que no evitó el rechazo agudo de los corazones CAP.

Ejemplo 6 Investigación relativa a la especificidad de órganos para la aceptación a largo plazo inducida por las TAIC

Para excluir la posibilidad de que las TAIC fueran capaces de proporcionar un efecto protector frente a la respuesta inmune alogénicamente específica dirigida por el receptor contra el antígeno del donante únicamente para trasplantes cardíacos, se trasplantaron los siguientes órganos en los siguientes grupos experimentales (n = 6) en el sistema de ratas endogámicas fuertemente rechazante DA -> LEW:

1. DA (riñón) ->: LEW; sin tratar

2. DA (riñón) ->: LEW; 10^{6} TAIC procedentes de DA, i.v., días -7 y -1 antes del trasplante

3. LEW (riñón) ->: LEW; sin tratar

4. DA (hígado) ->: LEW; sin tratar

5. DA (hígado) ->: LEW; 10^{6} TAIC procedentes de DA, i.v., días -7 y -1 antes del trasplante

6. LEW (hígado) ->: LEW; sin tratar

7. DA (piel) ->: LEW; sin tratar

8. DA (piel) ->: LEW; 10^{6} TAIC procedentes de DA, i.v., días -7 y -1 del trasplante

9. LEW (piel) ->: LEW; sin tratar

Según se muestra mediante los gráficos de Kaplan-Meier ilustrados en la Figura 4A-C, 6 de cada 6 órganos renales, 5 de cada 6 órganos hepáticos y 5 de cada 6 injertos de piel fueron aceptados a largo plazo (>150 días) por las ratas LEW receptoras. Todos los trasplantes singénicos de órganos sirvieron como control de la ejecución técnica sin complicaciones, y fueron aceptados por el animal donante sin limitación (no mostrado en las curvas de supervivencia). Por consiguiente, estos esquemas de prueba también muestran que la inyección intravenosa previa de 2 x 10^{6} TAIC induce una aceptación del órgano a largo plazo para más del 80% de los órganos trasplantados.

Los trasplantes de riñón, de hígado y de piel enumerados anteriormente que se trasplantaron con y sin la administración previa de TAIC fueron examinados después histológicamente. La Figura 4D muestra que, como resultado de la inyección intravenosa, administrada dos veces, de 10^{6} TAIC por kg de peso corporal en los días -7 y -1 antes del trasplante, puede demostrarse que la morfología del riñón trasplantado está intacta (cotéjense el riñón de control y el del trasplante singénico LEW -> LEW), mientras que en el grupo de control alogénico no tratado DA -> LEW puede reconocerse una clara infiltración del trasplante en el intersticio (en el día postoperatorio 14). El trasplante alogénico de hígado (Figura 4E), que había sido completamente rechazado en el POD 12 sin un pretratamiento con TAIC
(DA -> LEW sin TAIC), se comporta de una forma análoga, mientras que la administración previa de las TAIC permite que el parénquima de los trasplantes hepáticos aparezca completamente homogéneo e intacto en comparación con el trasplante singénico. El trasplante alogénico de piel (DA) también cicatriza sin complicaciones (cotéjese la comparación con el trasplante singénico LEW), mientras que el injerto de la tercera variedad CAP trasplantado simultáneamente fue rechazado de forma aguda tan pronto como en el día postoperatorio 12. Este ejemplo prueba la especificidad de la tolerancia inducida por las TAIC, dado que el pretratamiento del animal LEW receptor con TAIC procedentes de DA en los días -7 y -1 da lugar a la aceptación del trasplante DA, mientras que el injerto de piel de CAP trasplantado simultáneamente en el día 0 es rechazado de forma aguda (Figura 4F).

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Ejemplo 7A Investigaciones relativas a la especificidad de haplotipo para la aceptación a largo plazo inducida por las TAIC

Con objeto de excluir la posibilidad de que las TAIC indujeran una aceptación del órgano a largo plazo únicamente en la combinación de variedades endogámicas de rata seleccionada LEW -> DA, se examinaron las siguientes combinaciones adicionales de variedades endogámicas en el modelo de trasplante heterotópico de corazón (n = 5). Con este propósito también se usó, entre otras, la variedad endogámica BN[RT1.^{n}] (denominada también "BN" en relación con la presente invención).

1. DA ->: LEW; sin tratar

2. DA ->: LEW; 5 mg de CSA/kg x BW, i.v., días 0, 1, 2 y 3 más 10^{6} TAIC procedentes de DA/kg x BW, i.v., días 7 y 10 postoperatorios

3. CAP ->: LEW; sin tratar

4. CAP ->: LEW; 5 mg de CSA/kg x BW, i.v., días 0, 1, 2 y 3 más 10^{6} TAIC procedentes de DA/kg x BW, i.v., días 7 y 10

5. BN ->: LEW; sin tratar

6. BN->: LEW; 5 mg de CSA/kg x BW, i.v., días 0, 1, 2 y 3 más 10^{6} TAIC procedentes de DA/kg x BW, i.v., días 7 y 10

A partir de experimentos preliminares, ya se sabía que en la denominada combinación "altamente respondedora" (DA -> LEW), que está relacionada con la respuesta de rechazo más fuerte conocida en el modelo de rata endogámica, no puede conseguirse una aceptación a largo plazo con una única administración postoperatoria por vía intravenosa de 10^{6} TAIC. Por lo tanto, se realizó un intento de aumentar la presencia de las TAIC en el animal receptor administrándolas dos veces. Según se muestra mediante las correspondientes curvas de supervivencia ilustradas en la Figura 5A, la administración de las TAIC dos veces en los días postoperatorios 7 y 10 proporcionó una aceptación del órgano a largo plazo en 4 de cada 6 casos del grupo 2 y en 5 de cada 6 casos en el grupo experimental 4. En la combinación de variedades BN -> LEW, todos los órganos trasplantados sobrevivieron a largo plazo sin ninguna indicación de un rechazo agudo. En todos los casos en los que los corazones trasplantados habían sido aceptados a largo plazo (>150 días), pudo detectarse un quimerismo mixto en los animales receptores durante los primeros 20-45 días tras la administración de las TAIC. Sin embargo, un fallo temprano del órgano siempre estaba acompañado por una carencia de células del donante en la sangre periférica del receptor. A partir de estos datos puede extraerse la conclusión de que la administración por vía intravenosa de las TAIC da lugar a una aceptación a largo plazo del órgano únicamente si las células inducen un quimerismo mixto en el donante que pueda ser detectado durante al menos 21 días. Esto también confirma los resultados experimentales mostrados en la Figura 2D.

Mediante la administración postoperatoria de 10^{6} TAIC por kg de peso corporal por vía intravenosa a los animales receptores en los días 7 y 10, fue posible, por consiguiente, inducir una tolerancia a largo plazo en las 3 combinaciones de variedades endogámicas en más del 80% de los casos si, adicionalmente, se administraban inicialmente 4 ciclos de CSA.

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Ejemplo 7B Investigaciones relativas a la significación de la estimulación con IFN-\gamma de monocitos tratados con M-CSF para la inducción de tolerancia in vivo

Con objeto de ser capaces de caracterizar la eficacia de la estimulación adicional con interferón \gamma de los monocitos sanguíneos tratados con M-CSF sobre el desarrollo de tolerancia in vivo con más detalle, se examinaron los siguientes grupos de prueba en el modelo de rata endogámica LEW -> DA para un trasplante heterotópico de corazón (n = 5 animales por grupo):

1. LEW ->: DA; 10^{6}/kg x BW monocitos sanguíneos procedentes de LEW (monocitos no cultivados), i.v., día -7 antes del trasplante cardíaco

2. LEW ->: DA; 10^{6}/kg x BW monocitos sanguíneos procedentes de LEW (tratados con M-CSF), i.v., día -7 antes del trasplante cardíaco

3. LEW ->: DA; 10^{6}/kg x BW monocitos sanguíneos procedentes de LEW (estimulados con IFN-\gamma), i.v., día -7 antes del trasplante cardíaco

4. LEW ->: DA; 10^{6}/kg x BW monocitos sanguíneos procedentes de LEW (tratados con M-CSF y estimulados con IFN-\gamma), i.v., día -7 antes del trasplante cardíaco

Según se muestra mediante las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de la Figura 5B, la administración intravenosa de nuevos monocitos sanguíneos procedentes de LEW no cultivados, 7 días antes del trasplante cardíaco, no pudo evitar el rechazo agudo del trasplante alogénico de los corazones LEW en el animal DA donante. Los trasplantes de este grupo experimental fueron rechazados (\pm DT) después de una media de 7,8 \pm 0,8 días. Sin embargo, la administración previa de monocitos cultivados durante 6 días con M-CSF dio como resultado una significativa extensión en el tiempo de supervivencia del órgano, dado que en este grupo experimental sólo se observó rechazo después de una media de 35,0 \pm 51,5 días. La estimulación de monocitos sanguíneos nuevos sólo con IFN-\gamma durante 48 horas en medio RPMI que no contenía M-CSF no pudo evitar el rechazo agudo de los trasplantes de corazón, que cesaron de latir después de una media de 7,8 \pm 1,2 días. Sólo el tratamiento de monocitos sanguíneos nuevos con M-CSF durante 6 días y la estimulación adicional de estas células con IFN-\gamma durante 48 horas (en los días 5 y 6) dio lugar a una tolerancia del órgano a largo plazo (> 150 días) en 4 de cada 6 trasplantes. Los resultados muestran una importancia decisiva de la estimulación con IFN-\gamma adicional de los monocitos tratados con M-CSF para la producción de tolerancia in vivo.

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Ejemplo 8 Investigaciones relativas a la especificidad de especies para la aceptación a largo plazo inducida por las TAIC

Con objeto de excluir la posibilidad de que las TAIC indujeran eficazmente una aceptación del órgano a largo plazo únicamente en las especies animales seleccionadas de rata, se aislaron células de origen monocítico a partir del cerdo donante de una forma análoga al procedimiento detallado en el Ejemplo 2, mediante lo cual se efectuó la estimulación con IFN-\gamma añadiendo 1000 U/10 ml de nutriente durante 24 horas. Posteriormente se llevó a cabo la investigación para comprobar la eficacia de las TAIC para suprimir el rechazo agudo en el modelo de trasplante de pulmón izquierdo en "cerdos enanos SLA incompatibles" que tenían un potencial para el rechazo de sus órganos comparable al del hombre. En este caso, se extrae el pulmón izquierdo de un cerdo donante que se trasplanta ortotópicamente en un cerdo receptor genéticamente diferente (a saber, en la cavidad torácica izquierda tras la extracción del pulmón izquierdo del cerdo receptor). En el momento de la extracción del pulmón se extrajeron simultáneamente 500 ml de sangre del donante que sirvieron para preparar las TAIC a partir de los monocitos de este cerdo.

Todos los animales donantes tenían un peso de 30-35 kg.

Se establecieron los siguientes grupos experimentales en el cerdo (n = 4):

1. CSA, 5 g/día, 50 mg de azatioprina/día, 25 mg de metilprednisolona/día, durante un total de 28 días

2. Como en el grupo 1, más l0^{8} células de médula ósea (BM) del cerdo donante/kg x BW del cerdo receptor más 4,5 Gy de radiación corporal completa (WBI) del cerdo receptor

3. Como en el grupo 1, más 10^{6} TAIC procedentes del cerdo donante/kg x BW en los días postoperatorios 7 y 10 tras del trasplante de pulmón

Según se muestra en la Figura 6A, el rechazo de los trasplantes de pulmón en el grupo 1 tuvo lugar en una media de 50,3 \pm 9,9 días tras la finalización de la inmunodepresión. Los animales del grupo 2, por otro lado, rechazaron sus órganos después de 102,3 \pm 81,0 días.

La inmunodepresión triple en combinación con el tratamiento con TAIC repetido dos veces prolonga la supervivencia del órgano hasta 292 \pm 135,5 días, mostrando 3 de cada 4 animales una aceptación del órgano a largo plazo (>350 días) de sus órganos. En todos los casos del grupo 3 pudo observarse un quimerismo mixto del donante en la sangre del receptor durante >21 días, mientras que los animales del grupo 1 y 2 sólo mostraron un quimerismo mixto a corto plazo durante 6-8 días. La Figura 6B muestra los trasplantes de pulmón de un cerdo del grupo experimental 1 (POD 41) y un cerdo tratado con TAIC del grupo experimental 3 (55 días después del trasplante; B). Mientras que en una proyección de la pared torácica izquierda alrededor de la silueta cardíaca puede observarse una visible reducción en la transparencia (oscurecimiento) como una indicación del trasplante de pulmón rechazado en el cerdo del grupo experimental 1, la imagen por rayos X del animal tratado con TAIC muestra por rayos X unos signos poco llamativos del pulmón y del trasplante, respectivamente, con una buena delimitación con respecto a la silueta
cardíaca.

Ejemplo 9 Unión del anticuerpo GM-7 a las TAIC

El anticuerpo monoclonal GM-7 se produjo inmunizando ratones con TAIC humanas que habían sido preparadas según se describe en el Ejemplo 2. Las células de hibridoma productoras del anticuerpo se depositaron en el "Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen" con el nº de acceso DSM ACC2542. Los resultados referidos a continuación demuestran que el anticuerpo se une específicamente a un antígeno que es expresado únicamente por las células CD14^{+} que habían sido sometidas a la modificación ex situ de 6 días con M-CSF y a la estimulación de 2 días con IFN-\gamma según la invención.

La Figura 1 muestra la capacidad de unión, determinada mediante citometría de flujo, del GM-7 a las células monocíticas después de su modificación in vitro, es decir, después de su transformación en TAIC. Puede observarse que los monocitos CD14 positivos obtenidos directamente a partir de la capa leucocítica no se unen al anticuerpo GM-7 (la nube sombreada en gris corresponde al control de anticuerpo). Por el contrario, parte de los monocitos expresan un antígeno después del cultivo en M-CSF y la estimulación con IFN-\gamma, antígeno que es reconocido por el anticuerpo monoclonal GM-7. Después del cultivo según se describe en el Ejemplo 2, aproximadamente el 80% de los monocitos transformados eran capaces de unirse al anticuerpo monoclonal GM-7.

En un experimento adicional se comparó la actividad supresora de las células CD14^{+}/GM-7^{+} con la de las células CD14^{+}/GM-7^{-}, en un cultivo mixto de linfocitos (MLC). El MLC se llevó a cabo según describen Kurnick, J. T. "Cellular Assays" en: Diagnostic Immunopathology, [Colvin R. B., Bean A. K., McCluskey, R. U. (ed.), Raven Press, Nueva York, páginas 751-771 (1994)].

En este ejemplo, las TAIC descienden de un individuo B. Según se muestra en la Figura 7, existe una diferencia significativa entre la actividad supresora de las TAIC GM-7 positivas y la de las GM-7 negativas. Sólo la fracción GM-7 positiva de la población de TAIC obtenida después de 6 días de tratamiento con M-CSF y 2 días de estimulación con IFN-\gamma muestra un efecto inhibidor significativo sobre la actividad proliferativa de las células T de entre las células respondedoras en el individuo A tras su estimulación con células de B.

Estos datos indican que, con fines clínicos, puede aislarse una población celular con una función supresora optimizada a partir de la población de TAIC obtenida tras el cultivo de monocitos originales con M-CSF y la estimulación con IFN-\gamma, mediante la disponibilidad del anticuerpo monoclonal GM-7.

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Ejemplo 10 Determinación de la influencia del inhibidor de la IDO, 1-metiltriptófano, sobre la actividad inmunodepresora de las TAIC

Con objeto de clarificar si el inhibidor de la enzima indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO), el 1-metiltriptófano (1-MT), influye en la función supresora de las TAIC producidas en los conjuntos "Mo" y "Mo+Ly" (véase el Ejemplo 11), se estableció una variedad de cultivos mixtos de linfocitos (MLC) con células T estimuladas con PHA (fitohemaglutinina) en presencia y en ausencia de 1-MT.

En estos cultivos mixtos de linfocitos se transfirieron 50.000 linfocitos con 2 \mug de PHA a los pocillos de una placa de 96 pocillos, seguido de un período de proliferación durante 144 horas (indicado como "PhaLy"). Los linfocitos cultivados únicamente en medio, sin la adición de PHA, se analizaron como un control adicional (indicado como "Ly").

Con objeto de determinar la proliferación de los linfocitos estimulados con PHA en los diferentes cocultivos, se analizaron y examinaron los siguientes 4 conjuntos:

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PhaLy + "Mo+Ly": linfocitos y TAIC estimulados con PHA [10^{5} células del conjunto "Mo+Ly" según el Ejemplo 11].

PhaLy + "Mo+Ly" + 1-MT: linfocitos y TAIC estimulados con PHA en presencia de 2 \mumol de 1-MT [10^{5} células del conjunto "Mo+Ly" según el Ejemplo 11].

PhaLy + "Mo": linfocitos y TAIC estimulados con PHA [10^{5} células del conjunto "Mo" según el Ejemplo 11].

PhaLy + "Mo"+ 1-MT: linfocitos y TAIC estimulados con PHA en presencia de 2 \mumol de 1-MT [10^{5} células del conjunto "Mo" según el Ejemplo 11].

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Después de 144 horas de cultivo, todos los controles o los cocultivos se cultivaron adicionalmente durante 24 horas en presencia de ^{3}[H]-timidina ("pulsada") y a continuación se midió la cantidad de timidina marcada radioactivamente incorporada como recuentos por minuto (cpm), véase la Figura 8. En esta configuración, la cantidad de radioactividad determinada es una medida de la cantidad de timidina marcada incorporada al ADN, y por lo tanto, una medida de la tasa de proliferación de los linfocitos. Los valores referidos en la Figura 8 corresponden a los valores medios a partir de determinaciones por triplicado de 3 experimentos, cada uno con una indicación de la desviación típica.

Los resultados demuestran que los linfocitos no estimulados con PHA ("Ly") no proliferan significativamente, siendo la radioactividad media observada de 367 cpm (véase la Figura 8). Como contraste, la estimulación con 2 \mug de PHA da lugar a un significativo aumento en la tasa de proliferación de los linfocitos ("PhaLy"), midiéndose la incorporación más alta a un valor medio de 18459 cpm en estas muestras.

La adición de las TAIC a los cultivos de linfocitos disminuyó clara y fuertemente la tasa de proliferación si se añadían las células del conjunto "Mo+Ly" del Ejemplo 11 (PhaLy + "Mo+Ly", valor determinado 1498 cpm), y menos fuertemente cuando se añadían las células del conjunto "Mo" del Ejemplo 11 (PhaLy + "Mo", valor medido 3369 cpm).

Los resultados obtenidos tras la adición de 2 \mumol de 1-metiltriptófano (1-MT) a los conjuntos que contenían "Mo+Ly" y "Mo" con linfocitos estimulados demostró que el 1-metiltriptófano (1-MT) aumenta sinérgicamente la función supresora de las TAIC, mediante lo cual el descenso fue más fuerte con las TAIC del conjunto "Mo+Ly" (valor medido 267cpm) que con las TAIC del conjunto "Mo" (valor medido 390 cpm).

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Ejemplo 11 Influencia de los linfocitos sobre la formación de células CD3^{+}/CD14^{+} durante el cultivo de monocitos

Se determinó la influencia de los linfocitos presentes en la fracción monocítica sobre la producción de células CD14^{+}/CD3^{+} eficaces como TAIC mediante la comparación de dos conjuntos diferentes.

Para el primer conjunto (posteriormente indicado como "Mo") se tomó inicialmente la fracción monocítica a partir de la interfase de la capa leucocítica, según se describe en el Ejemplo 1. Según se describe en el Ejemplo 2, las células se transfirieron posteriormente a la etapa de cultivo con M-CSF. En la primera hora después del punto de partida del cultivo, los monocitos adheridos al fondo del matraz de cultivos se lavaron cinco veces con 10 ml de PBS cada una, y la cantidad de linfocitos presentes en el cultivo disminuyó así hasta < 5% (4,8 \pm 2,4%), mientras que la cantidad de monocitos enriquecidos (CD14^{+}) así obtenidos estuvo por encima del 90% (92 \pm 5,6%). Los componentes celulares adicionales dentro del conjunto eran linfocitos B y granulocitos.

Las células del segundo conjunto (posteriormente indicadas como "Mo+Ly") también se tomaron a partir de la interfase de la capa leucocítica como la fracción monolítica, según se describe en el Ejemplo 1. Sin embargo, a diferencia del conjunto "Mo", las células que se adhirieron al fondo del matraz cultivo tisular sólo se lavaron una vez después de 24 horas partiendo del comienzo de la fase del cultivo, según se describe en el Ejemplo 2. Como resultado se obtuvo una población celular que estaba formada por un 45 \pm 5,3% de monocitos CD14^{+} y un 23,5 \pm 8,9% de linfocitos CD2^{+}. Como en el conjunto "Mo", los linfocitos y los granulocitos también estaban presentes en este conjunto.

La determinación de las cantidades de los respectivos tipos celulares en la población celular total por conjuntos se llevó a cabo mediante citometría de flujo de cada uno de los tres conjuntos experimentales (véase la Figura 9). Los resultados se refieren como los valores medios, incluyendo la desviación típica.

Las células CD14^{+}/CD3^{+} no pueden determinarse en el conjunto "Mo" ni en el conjunto "Mo+Ly" al inicio del cultivo (d 0 = día 0). Después de un período de cultivo de cinco días se finalizó el experimento, y las células se caracterizaron mediante un análisis de FACS después de desprender las células del fondo del matraz de cultivo tisular, según se describe en el Ejemplo 2. Se averiguó que la cantidad relativa de células CD14^{+} disminuye en estos conjuntos, desde el 92% hasta el 42% en el conjunto "Mo" y desde el 45% hasta el 28% en el conjunto "Mo+Ly". Al parecer, los linfocitos proliferan más rápidamente que los monocitos; la cantidad relativa de linfocitos aumentó en el conjunto "Mo" desde el 4,8% hasta el 69,8% y en el conjunto "Mo+Ly" desde el 23,5% hasta el 50,6%. Durante el cultivo, las células CD14^{+}/CD3^{+} eficaces como TAIC se forman en ambos cultivos. En este contexto es importante el hecho de que se observa un aumento significativamente mayor en las células CD14^{+}/CD3^{+} en el conjunto "Mo+Ly", con una cantidad del 32,0 \pm 5,3% frente al conjunto "Mo", con sólo el 7,2 \pm 3,2%.

Estos resultados demuestran que la purificación de las células para enriquecer los monocitos hasta una cantidad relativa de más del 90% al comienzo del cultivo tiene una influencia negativa sobre la producción de las células inmunosupresoras CD14^{+}/CD3^{+} en la población de TAIC, mientras que el procedimiento descrito en los Ejemplos 1 y 2 da lugar a un rendimiento significativamente mayor de células CD14^{+}/CD3^{+}.

Ejemplo 12 Cocultivo in vitro de TAIC humanas con linfocitos alogénicos para producir células T reguladoras

Para examinar si las TAIC inducen la formación de células T reguladoras, es decir, linfocitos CD4^{+}/CD25^{+}, en el receptor, se realizaron varios cultivos in vitro diferentes de TAIC con linfocitos, y se analizó la formación de las células T reguladoras resultantes de los mismos.

Con este fin se cocultivaron in vitro directa o indirectamente las TAIC del donante A junto con linfocitos de un donante B. En el cocultivo directo se hizo posible el contacto directo de célula a célula entre las TAIC (del donante A) y los linfocitos (del donante B), mientras que en el cocultivo indirecto una membrana ("inserto de cultivo celular", 0,4 \mum de tamaño del poro, Falcon, nº de orden 353090) permitió el intercambio de medio pero inhibió el contacto físico entre las dos poblaciones celulares. El cocultivo directo o indirecto se lleva a cabo preferiblemente durante de 3 a 5 días, más preferiblemente durante 4 días en condiciones de estufa de incubación, es decir, a 37ºC y en una atmósfera de CO_{2} al 5%.

Después del cultivo se determinaron las respectivas cifras de células T reguladoras (CD4^{+}/CD25^{+}) en ambos conjuntos, así como en los controles, en los que las TAIC o los linfocitos fueron respectivamente cultivados solos. Además, se determinó el número de células CD3^{+}/CD14^{+}, que representa el componente de la población celular TAIC con la función supresora más significativa en el cultivo mixto de linfocitos, en el conjunto de control, en el que las TAIC se cultivaron solas.

En todos los conjuntos se determinaron los antígenos de superficie de las células mediante un análisis de FACS, y se analizó la cantidad de poblaciones celulares respectivas en la cantidad total de células.

Además, se determinó la expresión relativa de los tres nuevos genes maestros expresados específicamente por las células T reguladoras (Foxp3, CTLA-4 y la integrina \alpha_{E}\beta_{7}) mediante PCR en la respectiva población celular (véase la Tabla). El Foxp3 es un factor de transcripción específico, que se percibe como un gen de control para el desarrollo de células T reguladoras y que es expresado específicamente por estas células [véase Hori, S. y col., "Control of Regulatory T-cell Development by the Transcription Factor Foxp3", Science 299, 1057 - 1061 (2003)].

El CTLA-4 es un factor adicional, que se usa como un marcador para determinación de la función reguladora de las células T CD4^{+}/CD25^{+} (véase Khattri, R. y col., "An essential role for Scurfin in CD4^{+}/CD25^{+} T regulatory cells", Nature Immunology, online publication, doi:10.1038/ni909 (2003); Shimizu, J. y col. "Stimulation of CD25^{+}/CD4^{+} regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance", Nature Immunology, publicación en línea, doi:10.1038/ni759 (2003); Cobbold, S. P. y col. "Regulatory T cells in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance", Transpl. Int. 16(2), 66-75 (2003)].

La integrina \alpha_{E}\beta_{7} es una integrina que se une a la cadherina epitelial y que puede usarse como marcador para la subpoblación más potente de células T CD25 reguladoras [véase Lehmann, J. y col. "Expression of the integrin \alpha_{E}\beta_{7} identifies unique subsets of CD25^{+} as well as CD25^{-} regulatory T cells" PNAS 99(20), 13031-13036 (2002).

La determinación de la expresión de Foxp3, CTLA-4 y la integrina \alpha_{E}\beta_{7} se llevó a cabo mediante una PCR cuantitativa usando GAPDH y \beta-actina, dos genes "housekeeping", como controles; por un lado, los valores determinados se colocaron en relación con el otro, estableciéndose el valor obtenido para las células CD14^{+}/CD3^{+} en 1; por otro lado, las cantidades absolutas de ARN se indicaron en \mug por \mug de ARN total, con objeto de correlacionar la supresión medida efectuada por las TAIC in vitro y la formación de las células CD4^{+}/CD25^{+} doble positivas, con la tasa de expresión de los respectivos genes. Para la PCR cuantitativa se usaron procedimientos estándar, que son conocidos por la persona experta (véase Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlín, 1998).

La Tabla muestra que, dentro de la población de linfocitos obtenida a partir del cocultivo directo, el porcentaje de células CD4^{+}/CD25^{+} doble positivas se multiplica hasta un valor del 8,7% en comparación con la cantidad de linfocitos CD4^{+}/CD25^{+} obtenida a partir delcocultivo indirecto o de control, que es prácticamente idéntica al 2,38% y al 2,65% respectivamente.

La subpoblación de células CD4^{+}/CD25^{+} expresa las cantidades relativas mas altas de ARNm de todos los genes maestros probados en comparación con la expresión de las células CD4^{+}/CD25^{-} (véase la Tabla). Mientras que la expresión de Foxp3 está aumentada en aproximadamente un factor de 10 (37 frente a 3,75), la expresión de CTLA-4 alcanza una expresión máxima incluso mayor (4699 frente a 0,376). El aumento de la expresión del tercer gen maestro de la integrina \alpha_{E}\beta_{7} en las células CD4^{+}/CD25^{+} durante el cocultivo es casi tan alto como para CTLA-4, dado que la cantidad absoluta del ARNm de la integrina \alpha_{E}\beta_{7} está elevada hasta 1,4 x 10^{-9} en células CD4^{+}/CD25^{+} en comparación con 3,4 x 10^{-12} \mug de ARNm/\mug de ARN total en las células CD4^{+}/CD25^{-}.

Después del cocultivo indirecto, la cantidad relativa de ARNm de Foxp3 en la subpoblación CD4^{+}/CD25^{+} asciende sólo hasta 10 y es casi tan baja como la cantidad relativa expresada por los linfocitos del control, que expresan una cantidad relativa de ARNm de Foxp3 de 15.

La cantidad relativa de ARNm de CTLA-4 expresada por los linfocitos del control es tan baja como 0,375 en la población CD4^{+}/CD25^{+} y de 0,1 en la población CD4^{+}/CD25^{-}.

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TABLA Determinación de las cantidades de poblaciones celulares específicas en la cantidad total de células después del cocultivo directo e indirecto con respecto a sus marcadores de superficie CD3, CD4, CD14, CD25, y determinación de la expresión relativa y de las cantidades absolutas de ARN de tres genes (Foxp3, CTLA-4 y la integrina \alpha_{E}\beta_{7}) en estas poblaciones celulares

9

La expresión de CTLA-4 en la población CD14^{+}/CD3^{+} de las células TAIC fue similar a la expresión de Foxp3, y también fue significativamente mayor que en todas las demás poblaciones celulares.

A este respecto, es digno de mención que la expresión de CTLA-4 (valor relativo de 12.500) fue varias veces más fuerte en la su población CD14^{+}/CD3^{+} que la expresión de Foxp3, que mostró un valor relativo de 50.

No hubo una expresión detectable de la integrina \alpha_{E}\beta_{7} en la subpoblación_{ }CD14^{+}/CD3^{-} de las TAIC, mientras que, de forma similar al comportamiento de la expresión de los otros dos genes analizados, la expresión de la integrina en la subpoblación CD14^{+}/CD3^{+} de las TAIC, medida como valor absoluto en \mug de ARN por \mug de ARN total, alcanzó el valor más alto (3,4 x 10^{9} \mug/\mug de ARN total).

La significativamente aumentada expresión de los tres marcadores de linfocitos Foxp3, CTLA-4 y la integrina \alpha_{E}\beta_{7} en las TAIC procedentes de monocitos en comparación con los linfocitos normales es totalmente inesperada, y hasta la fecha nunca se había observado en monocitos ni en células procedentes de monocitos.

En conclusión, los resultados de este Ejemplo, según se demostró anteriormente, demuestran lo siguiente: si se parte de la suposición de que el nivel de expresión de Foxp3, CTLA-4 y la integrina \alpha_{E}\beta_{7} se correlaciona con las propiedades inmunoreguladoras de las respectivas células, aquí se ha demostrado que la actividad supresora de la subpoblación CD3^{+}/CD14^{+} de las TAIC está relacionada con una alta expresión de estos tres genes. Esto es incluso más sorprendente si se considera que estos tres marcadores sólo se han descrito hasta la fecha para los linfocitos, pero nunca en células de origen monocítico.

Adicionalmente se ha demostrado que el cocultivo directo de TAIC con linfocitos da lugar a una cantidad significativamente mayor de linfocitos CD4^{+}/CD25^{+} en comparación con el cocultivo indirecto y con el cultivo sólo de linfocitos. Esto apoya la suposición de que también se forman in vivo (es decir, en un paciente) células T reguladoras tras la administración de TAIC. Estos resultados están de acuerdo con la función inmunoreguladora conocida de los linfocitos CD4^{+}/CD25^{+} y con el hecho de que el contenido de los ARNm de Foxp3, CTLA-4 y la integrina \alpha_{E}\beta_{7} en estas células sea significativamente mayor que en los linfocitos cocultivados indirectamente o en los linfocitos de control.

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Ejemplo 13 Inducción in vivo de tolerancia a trasplantes mediante linfocitos cocultivados con TAIC in vitro

Los resultados y las conclusiones presentadas en el Ejemplo 12 fueron confirmados in vivo en un experimento con animales. A diferencia del procedimiento descrito en los Ejemplos 3, 4, 5, 6 y 7, a los animales de las combinaciones endogámicas seleccionadas LEW->DA no se les inyectaron TAIC procedentes de LEW para la inducción de tolerancia, sino que los linfocitos DA del receptor que, durante un período de 5 días, habían sido previamente cocultivados directamente TAIC procedentes de (LEW) del donante, o que se cultivaron solos en medio como controles, fueron inyectados a los animales de este ejemplo.

Los animales, que recibieron linfocitos DA autólogos cocultivados antes de un trasplante alogénico de corazón, desarrollaron una tolerancia específica del donante, mientras que los animales de control, que recibieron linfocitos DA de control sin tratamiento previo no cocultivados, rechazaron de forma aguda el corazón trasplantado en entre 10 y 14 días.

Estos resultados indican que la interacción física de célula a célula entre las TAIC del donante y los linfocitos del receptor induce la producción de células T reguladoras, que por sí mismas, son capaces de modificar el sistema inmune singénico de los receptores, de forma que las células T potencialmente alorreactivas son eliminadas, y por lo tanto se evita el rechazo del órgano.

Claims

1. Un proceso para preparar una preparación farmacéutica que contiene células inductoras de aceptación de trasplantes de origen monocítico, caracterizado porque

a): los monocitos se aíslan de la sangre;

b): los monocitos se multiplican en un medio de cultivo adecuado que contiene el factor de crecimiento celular M-CSF;

c): los monocitos se cultivan simultáneamente con o después de la etapa b), en un medio de cultivo que contiene IFN-\gamma;

d): las células inductoras de aceptación de trasplantes formadas en la etapa c) se obtienen separando las células del medio de cultivo; y

e): las células obtenidas en la etapa d) se formulan en una preparación farmacéutica.

2. Un proceso según la reivindicación 1 caracterizado porque los monocitos son de origen humano.

3. Un proceso según las reivindicaciones 1 ó 2 caracterizado porque los monocitos se aíslan de la sangre de una forma tal que junto con los monocitos también hay presentes linfocitos, en una cantidad de al menos el 10% con respecto al número total de células en el aislado.

4. Un proceso según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las células inductoras de aceptación de trasplantes formadas en la etapa c) u obtenidas en la etapa d) se eligen mediante su unión al anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma DSM ACC2542, y las células así seleccionadas se formulan en una preparación farmacéutica.

5. Un proceso según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la concentración de M-CSF en el medio de cultivo es de 1 a 20 \mug/l.

6. Un proceso según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, después de la etapa b), los monocitos se cultivan durante entre 24 y 72 horas en un medio de cultivo que contiene IFN-\gamma, comenzando el cultivo en presencia de IFN-\gamma de 3 a 6 días después del comienzo de la etapa de cultivo b).

7. Un proceso según la reivindicación 6, caracterizado porque la concentración de IFN-\gamma en el medio de cultivo es de 0,1 a 20 ng/ml.

8. Un proceso según las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque el período total de cultivo de las etapas b) y c) es de 4 a 8 días.

9. Preparación farmacéutica para la supresión de las reacciones de rechazo a trasplantes obtenida por el proceso de las reivindicaciones 1 a 8.

10. El uso de células inductoras de aceptación de trasplantes obtenidas mediante las etapas a) a c) del proceso de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción y/o la propagación in vitro de linfocitos T reguladores.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que los linfocitos T reguladores coexpresan los antígenos CD4 y CD25 en su superficie celular.

12. Un proceso para la producción y/o la propagación de linfocitos T reguladores, caracterizado porque

a): las células inductoras de aceptación de trasplantes obtenidas mediante las etapas a) a c) del proceso de las reivindicaciones 1 a 8 se cocultivan con una preparación de linfocitos T, y

b): los linfocitos T reguladores se obtienen opcionalmente del medio de cultivo.

13. Un proceso según la reivindicación 12, caracterizado porque los linfocitos T reguladores coexpresan los antígenos CD4 y CD25 en su superficie celular.

14. Un proceso según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque los linfocitos T reguladores se obtienen del medio de cultivo mediante separación de células activadas por fluorescencia.