ES2351203T3

ES2351203T3 - Sobrenadante procedente de células madre mesenquimáticas para la prevención y el tratamiento de respuestas inmunitarias en trasplantes.

Info

Publication number: ES2351203T3
Application number: ES00974007T
Authority: ES
Inventors: Joseph D. Mosca; Kevin R. Mcintosh; Elena N. Klyushenkova
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1999-10-26
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2011-02-01
Anticipated expiration: 2020-10-26
Also published as: WO2001032189A1; AU1244501A; EP1223956B1; CA2387542C; US20020085996A1; DE60045034D1; EP1223956A1; CA2387542A1; US6875430B2; WO2001032189A9; EP2269616A3; US6368636B1; PT1223956E; ATE482712T1; AU782064B2; EP2269616A2; JP2004506598A

Abstract

Utilización de un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas para la preparación de un medicamento destinado a reducir una respuesta inmunitaria de las células efectoras contra un aloantígeno.

Description

La presente invención se refiere a la inhibición de una respuesta de linfocitos T a un aloantígeno y se refiere además a la inhibición y/o prevención de la reactivación de los linfocitos T previamente activados. Más específicamente, la presente invención se refiere al campo de la prevención, reducción o tratamiento de una respuesta inmunitaria producida por células efectoras inmunitarias para tejido extraño y/o células y/o órganos. La invención se refiere además a la prevención, reducción o tratamiento del rechazo del trasplante y/o de la reacción injerto contra el hospedador.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La tolerancia es la falta de sensibilidad específica adquirida a un antígeno al que se produciría normalmente una respuesta inmunitaria. Por lo general, para provocar tolerancia, debe existir una exposición a un antígeno tolerante, lo que produce la muerte o la inactivación funcional de determinados linfocitos. La tolerancia completa se caracteriza por la falta de una respuesta inmunitaria detectable, a la segunda prueba de provocación antigénica. La tolerancia parcial está tipificada por la reducción cuantitativa de una respuesta inmunitaria.

La función del sistema inmunitario consiste en eliminar cuerpos extraños que pueden contener patógenos y en mantener insensibilidad o tolerancia contra el propio antígeno. La tolerancia a los linfocitos T se consigue 1) en el timo en el que los timocitos reactivos para autopéptidos se eliminan por eliminación clonal (tolerancia central), y 2) en la periferia por exposición a los propios antígenos en condiciones tolerógenas (tolerancia periférica). La eliminación clonal puede proceder también de la expresión de moléculas de células muertas en las células presentadoras de antígeno. Ejemplos clásicos de moléculas mortales son el ligando Fas (FasL) y el ligando TRAIL, que ligan sus receptores, Fas y DR4, respectivamente, en linfocitos T activados, que provocan la apoptosis de los linfocitos T. La interacción de CD27, miembro de la superfamilia TNFR, y el ligando CD27 (CD70) también provoca la apoptosis de linfocitos T.

Desgraciadamente, el sistema inmunitario no distingue los intrusores útiles, tal como tejido trasplantado, de los perjudiciales, y por lo tanto el sistema inmunitario rechaza los tejidos o los órganos trasplantados. El rechazo de los órganos trasplantados está mediado significativamente por los linfocitos T alorreactivos presentes en el hospedador que reconoce aloantígenos o xenoantígenos del donante.

Actualmente, con el objetivo de evitar o reducir una respuesta inmunitaria contra un trasplante, los pacientes se tratan con fármacos inmunosupresores potentes. La infusión de personas con fármacos que evitan o suprimen la respuesta inmunitaria de los linfocitos T no inhibe el rechazo del trasplante, pero pueden producir además supresión inmunitaria general, toxicidad e incluso la muerte debido a infecciones oportunistas. A causa de la toxicidad y de la tasa de respuesta incompleta al tratamiento convencional del rechazo del tejido del donante se necesitan métodos alternativos para tratar a los pacientes que no pueden resistir o que no responden a los modos actuales de terapia con fármacos.

Klyushnenkova, E. et al.(Blood 92(10), resumen 2652 (1998) describen que las células madre mesenquimáticas humanas suprimen las respuestas alógenas de los linfocitos T in vitro.

Por consiguiente, existe la necesidad de prevenir y/o de reducir una respuesta inmunitaria no deseada por un hospedador a un trasplante por las células efectoras inmunitarias como medio para desviar el rechazo del hospedador del tejido del donante. Además sería ventajoso eliminar o reducir una respuesta inmunitaria no deseada por un tejido del donante contra un tejido receptor, conocido como enfermedad del injerto frente al hospedador.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se ha descubierto que el sobrenadante procedente de cultivos MSC y los cultivos de la reacción de MSC/linfocitos mezclados presentan un efecto supresor sobre una respuesta de linfocitos T a un aloantígeno.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una utilización de un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas para la preparación de un medicamento destinado a reducir una respuesta inmunitaria de las células efectoras contra un aloantígeno. En una forma de realización, las células efectoras son linfocitos T. El sobrenadante puede obtenerse de células madre mesenquimáticas cultivadas conjuntamente con linfocitos T que experimentan una reacción entre linfocitos mezclados.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento in vitro, para evitar o reducir la reactivación de linfocitos T activados que han sido activados previamente por un aloantígeno que comprende poner en contacto los linfocitos T activados con un sobrenadante de un cultivo de células madre mesenquimáticas.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una utilización de un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas para la preparación de un medicamento destinado a reducir en un receptor una respuesta inmunitaria a un trasplante del donante tal como de piel o un órgano sólido (p. ej., corazón, páncreas, riñón, pulmón o hígado). Las células madre mesenquimáticas pueden ser autólogas (extraídas del mismo hospedador) o alógenas al receptor. Si las células madre mesenquimáticas son alógenas al receptor, las células madre mesenquimáticas pueden extraerse del donante del trasplante. Las células madre mesenquimáticas pueden ser alógenas o xenógenas tanto para el donante del trasplante como para el receptor. En las formas de realización preferidas, el medicamento es para evitar el rechazo del trasplante por el receptor, para reducir la gravedad del rechazo del trasplante por el receptor o para tratar el rechazo del trasplante por el receptor. El medicamento puede formar parte del trasplante. En una forma de realización, el medicamento está destinado a administrarse junto con un agente inmunosupresor.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una utilización de un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas para la preparación de un medicamento destinado a reducir en un receptor del trasplante una respuesta inmunitaria contra el receptor por el trasplante. Las células madre mesenquimáticas pueden ser autólogas al receptor o al donante del trasplante. Las células madre mesenquimáticas pueden ser alógenas tanto al donante como al receptor. En una forma de realización, el medicamento es para ser administrado junto con un agente inmunosupresor.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para reducir una respuesta inmunitaria desfavorable contra un trasplante del donante, que comprende un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas en una cantidad eficaz para inhibir o reducir una respuesta inmunitaria desfavorable contra un trasplante del donante, y un vehículo farmacéutico.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para reducir una respuesta inmunitaria desfavorable contra un receptor de trasplante producida por un trasplante, que comprende un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas y un vehículo farmacéutico.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una utilización de un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas para la preparación de una composición destinada a reducir una respuesta inmunitaria de células efectoras contra un aloantígeno mediante la cual dichas células efectoras en contacto con un aloantígeno tienen una respuesta inmunitaria reducida contra dicho aloantígeno. En una forma de realización, dichas células efectoras son linfocitos T previamente activados y dicha respuesta inmunitaria es la reactivación de dichos linfocitos T. La respuesta inmunitaria que debe reducirse puede ser una respuesta inmunitaria in vitro o una respuesta inmunitaria in vivo. Además, la respuesta inmunitaria que debe reducirse puede ser una respuesta inmunitaria a un trasplante del donante en la que el trasplante del donante puede ser un trasplante de donante xenógeno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1. Las células madre mesenquimáticas alógenas no provocan una respuesta inmunitaria. Los linfocitos T procedentes de A proliferaron en función de la dosis cuando se mezclabann con diferentes cantidades de los PBMC de B. Los linfocitos T procedentes de A no proliferaron en respuesta al contacto con las células madre mesenquimáticas procedentes de B, aún cuando las células madre mesenquimáticas se manipulaban para proporcionar activación total de los linfocitos T (las células madre mesenquimáticas se trataron con IFN-γ y se transdujeron con moléculas B7-1 o B7-2 coestimulantes).

La figura 2. Las células madre mesenquimáticas suprimieron activamente la reacción entre linfocitos mezclados (RLM) entre los linfocitos de dos personas diferentes. Las hMSC alógenas al receptor (tercera parte o donante) eran incompatibles tanto para las células estimulantes como para las que responden al tratamiento en la (RLM) (barras en blanco); o las hMSC eran incompatibles (donante) para las células estimulantes en la RLM (barras con trama). Por lo tanto, las células madre mesenquimáticas suprimieron la RLM sin especificidad como para el tipo MHC. Las células madre mesenquimáticas suprimieron la RLM en función de la dosis.

La figura 3. Muestra la respuesta secundaria de los linfocitos T que responden al tratamiento cebadas por las PBMC (alógenas) estimulantes, no expuestas a las MSC, y expuestas a continuación a las PBMC autólogas, PBMC alógenas (estimulante o parte tercera) o a ninguna célula.

La figura 4. Muestra la respuesta secundaria de los linfocitos T que responden al tratamiento activadas por las PBMC (alógenas) estimulantes, y cultivadas posteriormente con las MSC (estimulantes) alógenas, y expuestas a continuación a PBMC autólogas, a PBMC alógenas (estimulantes o parte tercera) o a ninguna célula.

La figura 5 (figuras 5A-5D) demuestran que se suprimió la respuesta secundaria de los linfocitos T que responden al tratamiento previamente activados por las PBMC estimulantes alógenas y después de activación cultivados con alógenas (mismo donante) (figura 5B) o tercera parte (figura 5D) o las MSC autólogas (figura 5C) y expuestas a continuación a células estimulantes autólogas o alógenas (mismo donante o tercera parte).

La figura 6 (figuras 6A-6D) presenta la supresión de una RLM primaria en el modelo canino por las MSC. autol. = autólogas; ident = compañeros de camada idénticos DLA, unrel. = no relacionadas.

La figura 7 presenta la supresión de una RLM primaria por MSC no adherentes.

La figura 8 presenta un mapa esquemático del plásmido pOT24 de EGFP utilizado en el Ejemplo 8.

La figura 9 presenta el efecto supresor de sobrenadantes de MSC generados a partir de células madre mesenquimáticas humanas o de cultivos de reacción entre linfocitos mezclados sin células madre mesenquimáticas humanas en una reacción primaria entre linfocitos mezclados.

La figura 10 presenta el efecto supresor de sobrenadantes de MSC generados a partir de células madre mesenquimáticas humanas o de cultivos de reacción entre linfocitos mezclados sin células madre mesenquimáticas humanas en una reacción entre linfocitos mezclados continua.

La figura 11 presenta la supresión por células madre mesenquimáticas de papión de una reacción entre linfocitos mezclados entre linfocitos T humanos que responden al tratamiento y células PBMC estimulantes humanas.

La figura 12 presenta la supresión por células madre mesenquimáticas de papión o humanas de una reacción entre linfocitos mezclados entre linfocitos T humanos que responden al tratamiento y células PBMC estimulantes de papión (donante 5957).

La figura 13 presenta la supresión por células madre mesenquimáticas de papión o humanas de una reacción entre linfocitos mezclados entre linfocitos T humanos que responden al tratamiento y células PBMC estimulantes de papión (donante 5909).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Tal como se define en la presente memoria, una célula madre mesenquimática alógena se extrae de un individuo diferente de la misma especie que el receptor. Antígeno donante se refiere a los antígenos expresados por el tejido del donante que han de ser trasplantados en el receptor. Los aloantígenos son antígenos que se diferencian de los antígenos expresados por el receptor. El tejido, los órganos o células del donante que han de trasplantarse es el trasplante. Como ejemplo de trasplantes pueden incluirse la piel, la médula ósea y los órganos sólidos tales como el corazón, el páncreas, los riñones, los pulmones y el hígado. Por lo tanto, un aloantígeno es un antígeno que es extraño al receptor.

Normalmente, las células que se cultivan conjuntamente de diferentes individuos producen una respuesta a los linfocitos T, manifestada por la activación y proliferación de los linfocitos T, conocida como una reacción entre linfocitos mezclados (RLM).

Los inventores descubrieron que los sobrenadantes procedentes de cultivos de células madre mesenquimáticas pueden suprimir una RLM entre células alógenas. Tal como se utiliza en la presente memoria, los sobrenadantes procedentes de cultivos de células madre mesenquimáticas, denominados también en la presente memoria “sobrenadante de MSC”, puede extraerse de las células madre mesenquimáticas cultivadas solas o de las células madre mesenquimáticas cultivadas junto con las células que experimentan una respuesta inmunitaria, es decir, los linfocitos T que experimentan una reacción entre linfocitos mezclados.

Los sobrenadantes de las células madre mesenquimáticas redujeron activamente la respuesta a los linfocitos T alógenos en las reacciones de linfocitos mezclados en función de la dosis. Los sobrenadantes de los cultivos de células madre mesenquimáticas de diferentes donantes no presentaron especificidad de respuesta reducida con respecto al tipo MHC.

Además, los sobrenadantes procedentes de las reacciones de linfocitos mezclados en contacto con las células madre mesenquimáticas pueden suprimir también una RLM entre células alógenas. Estos sobrenadantes de células madre mesenquimáticas/RLM redujeron activamente la respuesta a los linfocitos T alógenos en las reacciones de linfocitos mezclados en función de la dosis y no presentaron especificidad de la respuesta reducida con respecto al tipo MHC.

Se cree que puede segregarse un factor soluble o un compuesto dentro del medio del cultivo de células madre mesenquimáticas que ejerce un efecto supresor sobre las reacciones de linfocitos mezclados. Se observa un efecto supresor más potente utilizando los sobrenadantes de las MSC expuestas a una reacción entre linfocitos mezclados.

Aunque la invención no se limita a éstas, las células madre mesenquimáticas pueden aislarse, preferentemente de la médula ósea, purificarse y expandirse en el cultivo, es decir, in vitro. Las células madre mesenquimáticas, los blastocitos pluripotentes formativos encontrados en los huesos, están normalmente presentes con poca frecuencia en la médula ósea (1:100.000) y en otros tejidos mesenquimáticos. Véase Caplan y Haynesworth, patente de EE.UU. nº 5.486.359. La transducción génica de las células madre mesenquimáticas, se da a conocer en Gerson et al.. patente de EE.UU. nº

5.591.625.

A menos que se indique lo contrario , las manipulaciones genéticas se realizan tal como se describe en Sambrook y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

EJEMPLO 1 (Ejemplo comparativo)

Ausencia de alorreactividad de células madre mesenquimáticas

La reacción entre linfocitos mezclados mide la compatibilidad de los antígenos de superficie del donante y es una indicación de la probabilidad de rechazo del tejido del donante. Los antígenos de superficie celular responsables de producir el rechazo del trasplante son antígenos MHC de clase I y clase II. Los linfocitos T son aloreactivos para los antígenos MHC extraños. Las moléculas MHC de clase I y de clase II, estimulan la reacción entre linfocitos mezclados.

Se practicó leucocitaféresis en voluntarios humanos normales en un sistema de aféresis COBE SPECTRATM (COBE, Lakewood, CO). Se cultivaron 1 x 105 linfocitos T de A individuales (TA) en pocillos de microvalorador de fondo plano con PBMC alógenas tratadas con mitomicina C (para evitar la proliferación de las PBMC a linfocitos T) de B individuales (mPBMCB) durante 7 días. Las mPBMCB se sembraron a razón de 20 K y 100

K. Se pulsaron los cultivos con 3H-timidina durante las últimas 18 horas del período del cultivo para medir la proliferación de linfocitos T. Los resultados mostrados en la figura 1 indican que los linfocitos TA reconocieron que las PBMCB son extrañas. (Véase las barras bajo “TA + mPBMCB “). Cuantas más PBMCB hay presentes más proliferaron los linfocitos

T.

Se incubaron 2 x 104 células madre mesenquimáticas humanas (MSCh) del mismo donante a medida que las PBMC se incubaban junto con 1 x 105 linfocitos T de A individuales (TA). Las células se cultivaron en pocillos de microvalorador de fondo plano durante un total de 7 días. Se pulsaron los cultivos con 3H-timidina durante las últimas 18 horas del período de cultivo para medir la proliferación de linfocitos T. Dos días antes de cultivar junto con los linfocitos T, se sembraron células madre mesenquimáticas humanas en los pocillos del microvalorador en el número dado anteriormente (confluente) y se trataron con IFN-γ (50 unidades/ml) para estimular la expresión del antígeno de superficie en las MSC. Las hMSC no transducidas o las hMSC transducidas con moléculas de coestimulación B7-1 humana o B7-2 humana se incubaron con linfocitos T. Se transdujeron células de referencia con Neo.

Los resultados en la figura 1 (véase la figura 1 “TA + hMSC transducidas” ) demuestran que los linfocitos T fueron insensibles (no proliferaron) a las células madre mesenquimáticas humanas, es decir, no fueron reconocidos como extrañas.

Los resultados demuestran también que la falta de respuesta a las células madre mesenquimáticas no era debida a la compatibilidad genética entre los individuos ya que los linfocitos T no reconocían a las células mononucleadas de la sangre periférica (PBMCB) del donante de hMSC como extrañas.

EJEMPLO 2 (Ejemplo comparativo)

Supresión de la reacción entre linfocitos mezclados

Para determinar si células madre mesenquimáticas suprimían activamente la respuesta alógena, reacciones entre linfocitos mezclados (RLM) se establecieron en las placas de cultivo tisular, con o sin células madre mesenquimáticas adherentes extraídas de 2 donantes diferentes: un donante emparejó las células estimulantes en la RLM y el otro donante no estaba relacionado con las células del estimulante o las que responden al tratamiento.

Se mezclaron 105 PBMC del individuo A (PBMCA) con 105 PBMC diana del individuo B (PBMCB). Las PBMCB se irradiaron con 3000 rads x irradiación para evitar su proliferación de vida a la activación por las PBMCA. De este modo, solamente proliferarían las PBMCA. Cuando se mezclaron las PBMCA y las PBMCB, se produjo una reacción entre linfocitos mezclados, en la que las células de PBMCA (células que responden al tratamiento) fueron activadas por los antígenos de superficie en las PBMCA (células estimulantes). Se incubaron los cultivos durante un intervalo de 7 días y se pulsaron con 3H-timidina durante las 18 horas finales. En presencia de las PBMCB, las PBMCA, proliferaron proporcionando recuentos de 40.000. Véase la figura 2, 1ª barra, (“NINGUNA” se refiere a que no hay ninguna célula madre mesenquimática presente).

Sin embargo, cuando se mezclaron las PBMCA y las PBMCB en presencia de células madre mesenquimáticas, se suprimió la reacción entre linfocitos mezclados. Se mezclaron 105 de PBMCA con 105 de PBMCB en los pocillos de la placa de microvalorador recubiertos con una monocapa adherente de células madre mesenquimáticas humanas. Las células madre mesenquimáticas se colocaron en los pocillos de las placas en cantidades que oscilan entre 7.500 y 22.500 de células madre mesenquimáticas por pocillo. Se ensayaron dos poblaciones con células madre mesenquimáticas: las células madre mesenquimáticas humanas se extrajeron de un individuo B y las células madre mesenquimáticas humanas que se extrajeron de un individuo que no emparejaba el tipo MHC del individuo A ni del individuo B (tercera parte). Los cultivos se incubaron durante un intervalo de 7 días y se pulsaron con 3H-timidina durante las 18 horas finales. En presencia de las las células madre mesenquimáticas humanas, se suprimió la RLM. Véase la figura 2. De este modo, independientemente del origen de la MHC de las células madre mesenquimáticas, las células madre mesenquimáticas suprimieron la reacción entre linfocitos mezclados.

Los resultados mostrados en la figura 2 indican además que las células madre mesenquimáticas humanas disminuyeron la reacción entre linfocitos mezclados en función de la dosis. Las células madre mesenquimáticas procedentes de uno de los donantes suprimieron la proliferación igualmente bien, lo que indica que no había especificidad de supresión con respecto al tipo MHC. Estos resultados demuestran que las células madre mesenquimáticas suprimieron activamente la reacción entre linfocitos mezclados cuando

las células se cultivaron conjuntamente.

EJEMPLO 3 (Ejemplo comparativo)

Insensibilidad en la reacción secundaria de linfocitos mezclados

Estos experimentos se realizaron para determinar si la supresión de los linfocitos T preactivados por las MSC producía insensibilidad específica durante la estimulación secundaria.

A. Los linfocitos T del donante 248 (d 248) se cebaron mediante las PBMC alógenas del donante 273 (d 273) durante 7 días, a continuación se cultivaron durante 3 días más solas o en presencia de las MSC tratadas con IFN-γ del mismo donante (d. 273). Las células se volvieron a estimular a continuación por el mismo donante (d 273), autólogo (d 248) o las PBMC de la “tercera parte” (d 244).

Preparación de linfocitos

Se prepararon células mononucleadas de la sangre periférica (PBMC) por centrifugación con gradiente de densidad en Ficoll-Paque (Pharmacia). Se congelaron alícuotas de las células en 90% de FCS con 10% de DMSO y se guardaron en nitrógeno líquido. Tras la descongelación, las células se lavaron dos veces con medio MSC (DMEM con poca glucosa y FCS al 10%) y se volvieron a poner en suspensión en medio de ensayo (ISCOVE’S con Hepes 25 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales 100 µM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 0,25 µg/ml de anfotericina B, 2-mercaptoetanol 5,5 x 10-5 M (todos los reactivos de Gifco BLR) y suero AB humano al 5% (Sigma, RLM ensayada)).

Para preparar la fracción enriquecida en linfocitos T, se eliminaron las PBMC de los monocitos y linfocitos B por selección inmunomagnética negativa. Las PBMC se incubaron con los mAb CD19 y CD14 anti-humanos de ratón (formato sin azida/poca endotoxina (NA/LE)) seguido de Ab de IgG (adsorción múltiple) anti-ratón de cabra conjugado con biotina (todos los reactivos de Pharmingen) y microperlas de estreptavidina (Miltenyi Biotec). Se separaron a continuación las células utilizando un clasificador magnético de células (MACS, Miltenyi Biotec). La fracción enriquecida con linfocitos T contenía aproximadamente 70 a 90% de células CD3+.

Cultivo de MSC

Se aislaron MSC humanas de la médula ósea tal como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.486.359, se mantuvieron en cultivo con medio MSC y se utilizaron en los pasos 3 a 6. Las células se elevaron utilizando solución de tripsina/EDTA al 0,05%, se lavaron una vez con medio MSC y se colocaron en placas a una densidad confluente del 70 al 80% que era 1 x 106/placa para una placa de cultivo tisular de 10 cm. El día después de la colocación en la placa se añadió IFN-γ (Boehringer Mannheim) a razón de 500 U/ml y las células se incubaron 3 días más. Antes de transferir los linfocitos T, se lavaron las placas MSC 4 veces con HBSS, 1 vez con ISCOVES, y se añadió medio de ensayo a razón de 10 ml/pocillo en placas de cultivo tisular de 10 cm.

RLM primaria (1ª)

Se activaron linfocitos T (d 248) con PBMC (D 273) irradiadas. Las PBMC utilizadas para la estimulación se irradiaron con rayos X con 3.000 rad utilizando el sistema de rayos X Cabinet (Faxitron X ray, Buffalo Grove, IL). Para la estimulación primaria, se mezclaron 2 x 107 que respondieron al tratamiento con 2 x 107 estimulantes en 20 ml de medio de ensayo en placas de cultivo de tejido de 10 cm. Se incubaron las células a 37ºC en atmósfera de CO2 al 5% durante 7 días.

Cultivos de linfocitos T/MSC activados

Se recogieron linfocitos T activados en la 1ª RLM, se lavaron una vez con medio MSC, se volvieron a poner en suspensión en medio de ensayo a razón de 106/ml en 10 ml y se añadieron a placas de cultivo de tejido de 10 cm que contenían las MSC autólogas o alógenas o medio solo, y se incubaron durante 3 días más.

Ensayo de reestimulación

Los linfocitos T cultivados con MSC o medio se recogieron, se lavaron una vez con medio MSC y se volvieron a estimular con las PBMC irradiadas del donante original, un donante no emparejado o las PBMC autólogas. Para el ensayo, 5 x 104 que responden al tratamiento cebados y 5 x 104 estimulantes irradiados, se incubaron en placas de 96 pocillos. Los ensayos se realizaron por triplicado. Los cultivos se pulsaron con 1 µCi de [3H]-timidina (Amersham) durante 18 horas antes de la recogida. Se recogieron los cultivos utilizando Harvester 96 (Tomtec), se analizaron los filtros utilizando líquido de centelleo MIcrobeta Trilux y contador de luminiscencia (E.G. & G. Wallac). Los datos se presentan como cpm media ± SD de las tres réplicas.

Los linfocitos T cultivados solos (referencia positiva) presentaban una respuesta acelerada a la reestimulación del “mismo donante” con pico del día 2. La respuesta de la “tercera parte” se aceleró también, prácticamente con la misma cinética que “el mismo donante”, pero con un máximo menor y un comienzo ligeramente retardado (figura 3) Los linfocitos T cultivados en las MSC alógenas no presentaron posteriormente ninguna respuesta a las PMC del “mismo donante” o de la “tercera parte” durante los 6 días de cultivo (figura 4).

EJEMPLO 4 (Ejemplo comparativo)

Insensibilidad en la reacción secundaria entre linfocitos mezclados

Los linfocitos T del donante 413 se estimularon con las PMC irradiadas procedentes del donante 273 durante 7 días (1, 5 x 106 ml de cada uno, cultivos de 20 ml de volumen). Las MSC de diferentes donantes 413, 418 y 273 se colocaron en placas de cultivo tisular de 10 cm a razón de 1 x 106/placa, se pretrataron con IFN-γ durante 3 días y se lavaron antes de mezclarlas con linfocitos T preactivados.

Los linfocitos T preactivados en la RLM durante 7 días se incubaron solos o con las MSC durante 3 días más (1,0 x 106/ml de linfocitos T, 10 ml/placa). Después de 3 días de incubación con las MSC, se recogieron los linfocitos T y se volvieron a estimular con PBMC 273 irradiadas (donante original), 413 (autólogo), PBMC 10 (tercera parte) o PHA (5 µg/ml) en presencia o ausencia de PBMC autóloga (d413). Se añadieron las células a razón de 5 x 104/pocillo, se pulsaron los cultivos con [3H]-timidina en los puntos de tiempo indicados durante 18 horas más.

Los resultados indican que el tratamiento de los linfocitos T activados con las MSC autólogas (d413) (figura 5C), el mismo donante (d 273) (figura 5B) y tercera parte (d418) (figura 5E) provocaron insensibilidad a la estimulación antigénica en los linfocitos T. El cultivo de referencia (figura 5A) sin ningún tratamiento de MSC presentaba reestimulación de las células durante la exposición a las PBMC alógenas.

EJEMPLO 5 (Ejemplo comparativo)

Supresión de la RLM primarias por las MSC caninas

Se purificaron las PBMC caninas de la sangre periférica por centrifugación en gradiente de Ficoll-Paque (1.077). Las PBMC estimulantes se irradiaron con rayos X 2200 rad (7 min. 70 kV). S mezclaron 105 estimulantes irradiados con 105 PBMC que responden al tratamiento en placas de 96 pocillos en presencia o ausencia de MSC canina previamente en placa (E647, 2 x 104/pocillo). Se incubaron los cultivos durante 6 días y se pulsaron con [3H]TdR (5 Ci/mmol, 1 µCi/pocillo) durante 16 horas más. Los resultados se muestran en las figuras 6A-6B). E647 y R645 eran compañeros de camada (DLA idéntico). Los resultados demuestran que las MSC autólogas así como las alógenas suprimieron la RLM primaria.

EJEMPLO 6 (Ejemplo comparativo)

Supresión de la RLM primaria por las MSC no adherentes

Los linfocitos T del d273 (2 x 105/pocillo) se mezclaron con las PBMC irradiadas del d244 (2 x 105/pocillo) y diferentes cantidades de MSC. Las MSC de d244 o d273 se pretrataron con IFN-γ (900 U/ml durante 3 días) o se dejaron sin tratar, se trataron con tripsina el día del experimento y se añadieron al mismo tiempo que los linfocitos T y las PBMC. Los cultivos se incubaron durante 7 días, [3H]TdR (5 Ci/mmol, 1 µCi/pocillo) se añadieron durante 16 a 18 horas más. Los resultados se presentan en la figura 7 y demuestran que las MSC no adherentes suprimían también una RLM primaria.

EJEMPLO 7 (Ejemplo comparativo)

Supervivencia del alotrasplante de piel en soporte de MSC alógenas

Población del estudio

Se estudiaron papiones jóvenes (Papio anubis). Los papiones macho y hembra no preñada pesaban 7 a 20 kilos y tenían entre 3 y 16 años de vida. Se les identificó el virus del papiloma de la tuberculosis, valorado por citomegalovirus (CMV) y se ensayó con identificación vírica para primates consistente en el análisis del virus de simio, e incluyendo flotación fecal y frotis. Se determinaron parejas de donante y receptor mediante disparidad del complejo de histocompatibilidad mayor (CHM) por tipado de RCP. Durante el período de estudio, los papiones se enjaularon en un área individual al lado de un animal de compañía.

Recogida de médula ósea del donante para aislamiento de MSC y expansión del cultivo

Se extrajeron materiales aspirados de médula ósea con aguja hipodérmica de la cresta ilíaca para el aislamiento y la expansión del cultivo de las MSC. Se extrajo material aspirado de la médula de un lado alternativo una vez a la semana durante cuatro semanas consecutivas. El volumen del material aspirado se determinó mediante una estimación del 10% del volumen de la sangre del animal. El volumen de la sangre (litros) se estima que es el 7% del peso del cuerpo. Un papión de 10 kg entonces, tendría un volumen de sangre estimado de 0,7 litros. Un material aspirado del 10% del volumen de sangre sería entonces 700 ml.

Antes del procedimiento, se administró por vía intramuscular (IM) 500 mg de cefazolina para la profilaxis perioperativa antibacteriana. Se sedaron los papiones y se anestesiaron para el procedimiento con ketamina a razón de 10 mg/kg IM y 1 mg/kg de xilazina IM. Los puntos de inserción de la aguja se lavaron con povidona-yodo y a continuación se enjuagaron con alcohol. Se obtuvieron materiales aspirados de la cresta ilíaca utilizando un aguja hipodérmica de 2 pulgadas, calibre 16 en la médula ósea. La jeringuilla se acopló a la aguja y se aplicó succión para extraer la médula. Para el dolor posoperatorio, se administró el analgésico Buprenorfina a razón de 0,03 mg/kg IM Q12 x 2 dosis.

Transporte de materiales aspirados de médula ósea del donante

Los materiales aspirados de médula ósea se transfirieron desde la jeringuilla a un Vacutainer® esterilizado que contenía heparina sódica. Se colocaron los tubos en un recipiente StyrofoamTM y se transportaron a temperatura ambiente (t.a.) por administración durante la noche al dispositivo de tratamiento celular.

Aislamiento y creación del cultivo de las MSC

Se diluyeron alícuotas de 5 a 10 ml de médula ósea hasta 50 ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) en un tubo de cultivo de polipropileno. La suspensiones celulares se centrifugaron a 2200 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). Se determinaron los recuentos totales de las células nucleadas en ácido acético al 4%. Las células se diluyeron a continuación en DPBS hasta una concentración final de 20 x 106 células/ml. Se cargaron 10 ml o 200 x 106 células en 20 ml de Percoll (p. esp. 1,073 gm/ml) en un tubo cónico de 50 ml y se sometieron a centrifugación a 1300 rpm durante 20 minutos. La interfase celular que contenía células mononucleadas se lavó en DPBS, se volvió a poner en suspensión en medio completo y se hizo el recuento para obtener una recuperación. Las células mononucleadas lavadas obtenidas en la interfase Percoll eran células que se crearon a continuación en matraces T-185 que

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contenían 30 ml de medio completo y 15-20 x 10células/matraz (8,1 x 10MSC/cm) y se colocaron en una incubadora a 37ºC en CO2 al 5%.

Recogida de MSC

Se decantó el medio en matraces triples y se enjuagaron los matraces con 50 ml de DPBS. Después de decantar la DPBS, se añadieron 23 ml de tripsina al 0,05% a cada matraz triple. Los matraces se colocaron en una incubadora a 37ºC durante 3 minutos. Después del desprendimiento de las células se añadieron 23 ml de medio completo a cada matraz. Las suspensiones celulares se transfirieron a tubos cónicos de 50 ml y los matraces se lavaron con 30 ml de HBSS. Se centrifugaron los tubos a 2200 rpm durante 5 minutos a t.a.

Formulación/envasado

Las MSC recogidas se formularon a razón de aproximadamente 10 x 106 células/ml de solución crioprotectora consistente en 85% de Plasma-Lyte A (Baxter IV Therapy), 10% de DMSO y 5% de MSC-suero de donante y se crioconservó en bolsas que contenían 15 a 20 ml.

Etiquetado/almacenamiento/transporte

Se crioconservaron las células utilizando un congelador de caudal controlado (Cryomed, Forma Scientific) a 1-2º por minuto hasta -90ºC. Las muestras se transfirieron a continuación a un congelador de almacenamiento de nitrógeno líquido en fase vapor (-120 a -150ºC).

Dosis

Para conseguir una dosis de MSC de 20 x 106 células/kg, el producto final se preparó a 115% de la dosis requerida el día de la infusión.

Recogida de piel

Antes de la intervención quirúrgica se administró al papión 500 mg IM de cefazolina como profilaxis antibacteriana perioperativa. El papión se sedó con 10 mg/kg IM de ketamina y se anestesió por inducción de Tiopental intravenoso, anestésico de inhalación con 1-2% de isofluorano. Se recogió piel de la pared abdominal anterior, se colocó en una almohadilla de gasa humedecida con solución salina etiquetada previamente. El papión se devolvió a la colonia una vez despertado. Para el dolor posoperatorio, se administró el analgésico Buprenorfina a razón de Q12 x 2 dosis, y a diario Ancef durante 2 días.

Trasplante de piel del receptor e infusión de MSC

Antes de la intervención quirúrgica, se administraron al papión 500 mg IM de cefazolina como profilaxis antibacteriana perioperativa. El papión se sedó y se anestesió con 10 mg/kg IM de ketamina e inducción intravenosa de Tiopental, anestésico de inhalación con 1-2% de isofluorano. Se recogió piel de la pared abdominal anterior y se colocó en una almohadilla de gasa humedecida con solución salina etiquetada previamente. La piel se dividió en dos injertos; uno se utilizó como referencia de la tercera parte para otro papión receptor y la otra se utilizó como referencia autóloga para este mismo animal. El animal se colocó a continuación en posición prono. Se retiraron, tres secciones de 3 x 2 cm de piel del dorso, a lo largo de la columna vertebral, entre los omóplatos. Los injertos de piel recogidos anteriormente del donante de MSC, un donante de la tercera parte y se desengrasaron, se recortaron para acomodar los defectos creados en la piel y se suturó in situ.

Después del injerto, el papión recibió una infusión intravenosa de MSC a una dosis de 20 x 106 MSC del donante/kg. Se extrajeron muestras de sangre periférica a pre-MSC, a la hora, y los días 1 a 3 pos-MSC; se extrajeron materiales aspirados de la médula el día 0 pos-MSC, los días 3, 14 y 30.

Para el dolor posoperatorio, se administró analgésico Buprenorfina a Q12 x 2 dosis y Ancef a diario durante 2 días. Se observó el animal a diario y se fotografiaron los injertos cada dos días comenzando el día 7 después del injerto.

Exámenes físicos y prueba de diagnóstico

Se sedó cada papión con 10 mg/kg IM de ketamina para el examen. Mientras estaba sedado se extrajeron dos a tres mililitros de médula de la cresta ilíaca por aspiración con aguja hipodérmica y se recogieron los días en heparina sódica los días 4,13 y 30 al final del estudio. Se recogió una biopsia de piel el mismo día que se extrajeron los materiales aspirados de la médula.

RESULTADOS

Efectos de la infusión de MSC sobre la supervivencia de aloinjerto de piel

Los animales de referencia sin tratar (N = 2) tenían un tiempo de supervivencia medio del aloinjerto de piel de 8,0 ± 0 días. La infusión de donante de MSC desemparejado (N = 2) dio como resultado una prolongación del tiempo de supervivencia del trasplante de piel hasta un tiempo medio de supervivencia 11,5 ± 0,71 días (prueba U de Mann-Whitney, P<0,05). La infusión de MSC del donante de la tercera parte desemparejado en aloinjertos del donante (n = 4) produjo una prolongación significativa de los tiempo de supervivencia del injerto de piel hasta un tiempo medio de supervivencia de 12,3 ± 0,96 días (prueba U de Mann-Whitney, P < 0,003).

Los receptores 6140 y 6200 recibieron aloinjertos del donante 6243 de MSC, de sí mismo (injerto de la tercera parte) y de sí mismos (autoinjerto). Veinticuatro horas antes de la recogida del injerto de piel del donante 6243 de MSC, las MSC del 6243 se injertaron bajo la piel abdominal anterior que se había delineado para injertar. Después del injerto, se administró a los receptores una infusión intravenosa de 20 x 106 MSC/kg (6243). Ambos aloinjertos de la tercera parte fueron rechazados el día 13. Los aloinjertos del donante (6243) de MSC se observó que eran hemorrágicos el día 4, una observación atribuida habitualmente a un fallo técnico. En el examen patológico, se observó que la queratina se había insinuado de modo similar a una huella, debajo de la dermis: la naturaleza de estas huellas sugiere que fueron formadas por la aguja hipodérmica en el momento de la inyección subcutánea de MSC. La presencia de estas células ha provocado una tremenda respuesta inflamatoria. Esta respuesta inflamatoria excluyó la capacidad de los injertos de piel para adherirse/”prender” apropiadamente y estos injertos se necrosaron completamente el día 7. Los autoinjertos no fueron rechazados.

Los receptores 6654 y 6659 recibieron aloinjertos del donante 6593 de MSC, uno del otro (injerto de la tercera parte) y de sí mismos (autoinjerto). Después del injerto, se administró a los receptores infusiones intravenosas de 20 x 106 MSC/kg. Los aloinjertos del donante de MSC fueron rechazados los días 11 y 12, y los aloinjertos del donante de la tercera parte fueron rechazados los días 11 y 12. Los autoinjertos no fueron rechazados.

Asimismo, los receptores 6663 y 6658 recibieron aloinjertos del donante 6656 de MSC, uno del otro (injerto de la tercera parte) y de sí mismos (autoinjerto). Después del injerto, se administró a los receptores infusiones intravenosas de 20 x 106 MSC/kg. Los aloinjertos del donante de MSC fueron rechazados el día 11, y los aloinjertos del donante de la tercera parte fueron rechazados los días 10 y 12. Los autoinjertos no fueron rechazados.

Los receptores 6532 y 6720 en la sección de referencia del estudio recibieron autoinjertos y aloinjertos sin administración de MSC por infusión o inyección. Sus aloinjertos fueron rechazados el día 8. Los autoinjertos no fueron rechazados.

No habían toxicidades identificables asociadas a la infusión de MSC alógena ni a secuelas clínicas adversa en los 30 días posteriores de intervalo de seguimiento. Se extrajeron muestras de sangre a pre-MSC, 1 y 2 horas, y los días 1, 2 y 3 después del injerto y de la infusión de MSC. Se extrajeron materiales aspirados de la médula los días 4 y 13 después del injerto y de la infusión de MSC.

Los resultados demuestran que una sola infusión de las MSC de papión alógenas puede retardar el rechazo de injertos de piel alógenos. No se administró ninguna otra terapia inmunosupresora. Una dosis de las MSC alógenas o de la tercera parte aumentó el tiempo para el rechazo en el 50% (el tiempo de rechazo normal en este modelo es de 8 días) (véase Goodman et al., Am. Surg. 62 (6): 435-42 (1996)).

EJEMPLO 8 (Ejemplo comparativo)

La finalidad del estudio era demostrar la fiabilidad y seguridad de la infusión en perros de una dosis moderadamente alta de células madre mesenquimáticas caninas (cMSC) de camada idéntica del antígeno de leucocitos de perro (DLA) donante a razón de 10 x 106 células/kg en un escenario de injerto de médula alogenoico. Un objetivo secundario consistía en examinar la distribución y función de las cMSC marcadas con neo y GFP del donante a los 50 y 100 días después del injerto.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Animales experimentales

Se utilizaron sabuesos para el estudio. Se utilizaron dos camadas idénticas al DLA macho y dos hembra, de 7 o 9 meses de vida el día 0. El procedimiento para el tipado utilizado implica la utilización de marcadores microsatélite muy polimórficos para seguir la descendencia de la zona DRB de clase II en el antígeno de leucocitos de perro (DLA), el equivalente canino del complejo de mayor histocompatibilidad. Los microsatélites son pequeñas repeticiones de di-, tri-o tetranucleótido, que presentan suficiente variación de longitud en los alelos que pueden utilizarse para seguir la descendencia de los segmentos cromosómicos mediante cruces multigeneracionales. La segregación de los alelos se controla por lo general utilizando una reacción en cadena de la polimerasa de una sola etapa con los cebadores procedentes de las secuencias exclusivas de ADN que circundan cada repetición. Además, se realizaron reacciones entre leucocitos mezclados en las parejas de camadas idénticas de DLA seleccionadas para estudiar proporcionar confirmación de los resultados del ensayo del marcador microsatélite de RCP.

Diseño del estudio

Los perros se sometieron a trasplante con cMSC y médula ósea del mismo donante de la camada idéntica DLA. El trasplante de médula se recogió de cada uno de las dos camadas idénticas de DLA el día 0 antes de la irradiación en el cuerpo total (TBI) y se intercambiaron. Se provocó mieloablación exponiendo los perros el día 0 a una sola dosis de TBI de 920 centigray (cGy) (exposición al aire en la línea media de dos fuentes de 60Co oponentes suministradas a una velocidad de 7 cGy (9,3 R/min). Las cMSC expandidas en el cultivo aisladas de un material aspirado de médula ósea del donante a las 4 o más semanas antes del trasplante, se transdujeron con Papp@OT-24, que contenía los genes para la proteína verde de fluorescencia (GFP) y la neomicina fosfotransferasa (neo). Las cMSC se crioconservaron después del paso 1 (P1) o del paso 2 (P2). Después del TBI, las cMSC se descongelaron y se administraron por vía intravenosa a una bomba de infusión portátil durante un período de tiempo de 15 minutos. En una a dos horas después de la infusión de cMSC, el injerto de médula ósea se infundió por vía intravenosa a una dosis de ≥ 1 x 108 células nucleadas totales (TLC)/kg.

Se administró ciclosporina a los cuatro perros para la profilaxis de la enfermedad del injerto contra el hospedador (GVHD) por vía intravenosa los días 0 a 5 a una dosis de 10 mg/kg de BID (20 mg/kg/día) (Sandimmune® Injection Solution, Sandoz Pharmaceuticals Corporation). El día 6 hasta el 50 (fin del estudio) para el grupo I.1.a, ó 6 por 100 para el grupo I.1.b, se administró ciclosporina a razón de 10 mg/kg de BID PO, (20 mg/kg/día) (Neoral® Soft Gelatin Capsules, Sandoz Pharmaceuticals Corporation). La atención complementaria habitual con antibióticos bucales para el receptor comenzó el día -5 y los antibióticos generales comenzaron el día 0 y continuaron hasta que se consiguió el injerto. El soporte fluido se suministró según a medida que era necesario. No se necesitaron transfusiones de plaquetas para ninguno de los cuatro perros durante la recuperación. Los procedimientos caninos habituales requieren que se administre una transfusión total de sangre si el recuento de plaquetas cae continuamente por debajo de 10.000/mm3, o si el personal del tratamiento observa síntomas de hemorragia. Las transfusiones de plaquetas, si es necesario, eran para administrarse a 50 ml de la sangre total irradiada (2000 cGy) para un donante al azar. El injerto se creó en el momento de la primera de las tres mediciones consecutivas de > 500 células neutrófilas absolutas mm3, > 1.000/mm3, y plaquetas > 10.000/mm3, 50.000/mm3 y > 100.000.

Para seguir la recuperación hematopoyética, se obtuvieron recuentos de sangre completa (CBC) desde el día 0 hasta el día 50, y quincenalmente después para el grupo de estudio de 100 días. Se llevó a cabo análisis químico del suero los días 0, 2 y semanalmente después. Se tomaron muestras de sangre periférica el día 0 antes de la infusión de MSC, 5 y 15 minutos, 1 y 2 horas y 1, 2, 3 y 4 puntos de tiempo del día para el aislamiento del ADN. En el ADN se evaluó la presencia de células marcadas con GFP por un ELISA de RCP de ADN anti-EGFP con digoxigenina incorporada en el producto y un ensayo colorimétrico de antidigoxigenina en la segunda etapa. Se obtuvo un material aspirado de médula cuando los recuentos de plaquetas alcanzaron continuamente 50.000/mm3 y se examinó la presencia de células marcadas con GFP utilizando el mismo método de la RCP. Se crearon cultivos de CMSC para examinar las unidades formadores de colonias (UFC) y para expandir la cMSC para el análisis adicional del RCP anti-EGFP. En la necropsia, la sangre periférica, los materiales aspirados de médula ósea y biopsias de médula ósea se obtuvieron para el análisis RCP de anti-EGFP. Se realizaron análisis de CFU en los materiales aspirados de médula ósea y los análisis de RCP de anti-EGFP se realizaron en cultivo expandido de cMSC. Un análisis histológico se llevó a cabo por la presencia de GFP en varios tejidos.

Aislamiento de cMSC, expansión en el cultivo, transducción y crioconservación

Se obtuvieron materiales aspirados de médula ósea bilateral para aislamiento de cMSC y creación de cultivo en la semana -4 para perros CAN-07-01 y CAN-07-02 y en semana -9 para perros CAN-07-03 y CAN-07-04. Se extrajeron de cada perro 15 ml de médula (7 ml de cada húmero). Se anestesiaron los perros mediante la inyección de Butorfanol, seguido de la inyección de una mezcla de Diazepam e hidrocloruro de ketamina (Aveco Co., Inc., Fort Dodge, IA). Los puntos de inserción de la aguja se lavaron con povidona-yodo y a continuación se lavaron con alcohol. Se extrajeron materiales aspirados de cada cóndilo humeral de cada perro utilizando una aguja para médula ósea de 2 pulgadas, calibre 16. Una jeringuilla se acopló a la aguja y se aplicó la succión para extraer 8 ml de medula de cada uno de los húmeros. Los materiales aspirados de médula ósea se transfirieron a tubos cónicos de polipropileno de 15 ml utilizando la técnica estéril. Siguiendo el procedimiento, el perro se colocó a continuación en una almohadilla caliente para su recuperación.

Se diluyeron alícuotas de 5 a 10 ml de médula ósea hasta 50 ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) en un tubo de cultivo de polipropileno. Las suspensiones celulares se sometieron a centrifugación a 2200 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). Se determinaron los recuentos totales de las células nucleadas en ácido acético al 4%. Las células se diluyeron a continuación en DPBS hasta una concentración final de 20 x 106 células/ml. Se cargaron 10 ml o 200 x 106 células en 20 ml de Percoll (p. esp. 1,073 gm/ml) en un tubo cónico de 50 ml y se sometieron a centrifugación a 1300 rpm durante 20 minutos. La interfase celular que contenía células mononucleadas se lavó en DPBS, se volvió a poner en suspensión en medio completo y se hizo el recuento para obtener un porcentaje de recuperación. Las células se diluyeron a continuación en medio completo, se crearon cultivos como se describe a continuación y se colocaron en una incubadora a 37ºC en CO2 al 5%.

Construcción del vector retrovírico bicistrónico MuLV

Se construyó el retrovirus con proteína verde fluorescente (EGFP), aislando el gen EGFP-1 de la medusa Aequorea victoria (Clontech, CA). El gen EGFP se clonó en el vector retrovírico pJM573-neo (el plásmido resultante se denominó pOT-24). El plásmido pJM573-neo procedía del pN2 (Keller et al., 1985, Nature 318:149) con las modificaciones siguientes: el punto de inicio gag retrovírico murino se sustituyó con un codón de terminación en el marco; se construyeron 5’LTR y 3’LTR en la misma casete; el gen de neomicina fosfotransferasa (neo) y el punto de introducción ribosómico interno (IRES) se insertaron en el pN2. En la figura 8 se muestra una cartografía esquemática del plásmido pOT24 de EGFP.

Preparación de retrovirus recombinante

El pOT-24 se transfectó en las células productoras ecótropas GP y E86 utilizando DOTAP (Boehringer Manheim) como sugirió el fabricante. Las células transfectadas se cultivaron en medio de glucosa rico en DMEM (HG) enriquecido con un 10% de FBS inactivada térmicamente, penicilina-estreptomicina (Life Technologies) y 0,5 mg/ml de sulfato de protamina-G418 (Sigma) como marcador selectivo. Se mantuvieron los cultivos hasta el 70% de confluencia en cuyo punto medio se remplazó con medio retrovírico reciente (sin G418) y las células se mantuvieron a 32ºC durante 2 días. El medio de cultivo que contiene el retrovirus se recogió, se filtró a través de un filtro de 0,45 µm y se almacenó a -70ºC. Se preparó retrovirus anfótropo transduciendo células PA317 dos veces con virus ecótropo utilizando un procedimiento de transducción centrífuga seguido de selección con G418 (0,5 mg/ml). Se recogió sobrenadante retrovírico. El valor del retrovirus EGFP mezclado en las células 3T3 fue de 1,2 x 106 CFU/ml. Los sobrenadantes retrovíricos de GFP se conservaron en frío a -70ºC.

CAN-07-01 y CAN-07-02

Las células mononucleadas lavadas obtenidas en la interfase de Percoll se crearon en 10 matraces T-185 que contenían 30 ml de medio completo y 10 x 106 células/matraz.

Los días 2, 6 y 9 de cultivo, el medio en los matraces se sustituyó completamente por medio completo reciente. El día 12 del cultivo primario se tomaron fotografías, y se tomaron células del paso 0 (P0) al paso 1 (P1). Se aspiró el medio y se lavaron los frascos dos veces con 8 ml de DPBS. Se añadieron 8 ml de tripsina y se colocaron los matraces en una incubadora a 37ºC durante 3 minutos. Cuando las células se hincharon, se interrumpió la reacción mediante la adición de 8 ml de medio completo. Se transfirieron las células y se mezclaron en tubos cónicos de 50 ml. Se lavaron los matraces con DPBS y las células mezcladas se centrifugaron a t.a. a 2000 rpm durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y los sedimentos celulares se volvieron a poner en suspensión en medio completo. Se mezclaron las células, se hizo el recuento y se examinó la viabilidad. Se colocaron las células en 15 matraces T80 que contenían 18 ml de medio completo y 0,4 x 106 células por matraz.

El día 15 de cultivo, se realizó la primera transducción en 15 de los 18 matraces. Se eliminó el medio. Se descongelaron alícuotas del sobrenadante retrovírico y se añadió polibreno hasta una concentración final de 8 µg/ml para hacer la mezcla de transducción. El medio celular se reemplazó con 10 ml de la mezcla de transducción y se centrifugaron los matraces a 3000 rpm durante 1 hora a 32ºC. Después de la centrifugación, se añadieron a cada matraz (con la mezcla de transducción) 10 ml de medio completo preparado utilizando suero bovino fetal inactivado térmicamente (FBS) y los matraces se devolvieron a la incubadora. Tres matraces no se transdujeron y se sustituyó el medio reciente. El día 16 de cultivo, el medio se sustituyó con medio completo reciente. El día 17 de cultivo se repitió el procedimiento de transducción.

El día 18 de cultivo, se recogieron las células tal como se describió anteriormente y se tomaron desde P1 a P2. Se añadieron 3 x 106 células a 100 ml de medio completo, y se vertieron en matraces triples (500 cm2). Se prepararon quince matraces triples con células transducidas y se prepararon tres con células no transducidas. Algunas células restantes se conservaron en frío. Se preparó una solución congelada que contenía 10% de DMSO y 90% de FBS. 10 x 106 células se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de solución de congelación. Se marcaron los viales y se conservaron en frío en un recipiente Nalgene Cryo durante un mínimo de 4 horas a -70ºC y se guardaron a -70ºC.

El día 22 de cultivo P2, se tomaron fotografías para registrar la distribución y la morfología celular y las células P2 se recogieron y se conservaron en frío tal como se describe a continuación.

CAN-07-03 y CAN-07-04

Las células mononucleadas lavadas obtenidas en la interfase de Percoll se crearon en 15 matraces T-75 que contenían 20 ml de medio completo y 12 x 106 células/matraz.

El día 2 de cultivo, los medios en los matraces y en las placas se sustituyeron completamente con medio completo reciente. El día 6 de cultivo primario para cMSC, se realizó la primera transducción tal como se describió anteriormente. Tres matraces no se transdujeron, y el medio reciente se remplazó el día 6. El día 7 de cultivo, los medios se remplazaron con medio reciente.

El día 8 de cultivo, se repitió el procedimiento de transducción. El día 9 de cultivo, se tomaron fotografías y las células se pasaron desde P0 hasta P1 como se describió anteriormente. Se añadieron 3 x 106 células a 100 ml de medio completo, y se vertieron en matraces triples. Se prepararon 15 matraces triples con células transducidas y se prepararon tres con células no transducidas.

Los 15 ml de materiales aspirados de médula ósea proporcionaron 910, 1212, 856 y 1948 x 106 células nucleadas para los donantes CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03 y CAN-07-04, respectivamente. Los recuentos de células mononucleadas obtenidos en la interfase Percoll, fueron 612, 666, 588 y 462 x 106, produciendo recuperaciones del 67,2, 55, 68,7 y 23,7%. En P1, la viabilidad celular era una media de 97,1 (intervalo de 93,3 al 100%). En las células P2 para los donantes CAN-07-01 y CAN-07-02, y en las células P1 para los donantes CAN-07-03 y CAN-07-04, la viabilidad celular de las células transducidas era una media de 96,7 (intervalo de 96,3 a 97,9%). Las células no transducidas eran 95,4 (intervalo de 93,3 a 96,9%) viables. En la recogida para la crioconservación de la cMSC, la viabilidad de las células transducidas fue una media de 99,4% (intervalo 97,4 a 100%) y la de las células no transducidas fue de 99,4% (intervalo 97,6 a 100%) viable (Tabla 4).

La cMSC transducida dio por matraz para los donantes CAN-07-01 y CAN-07-02, recogidos 4 días después del paso 2 y colocados en placas a razón de 3 x 106 por matraz fue 5,9 y 6,7 x 106, y el rendimiento de cMSC no transducidas por matraz fue 8,4 y 7,5 x 106. La cMSC transducida dio por matraz para los donantes CAN-07-03 y CAN-07-04, recogidos 4 días después del paso 1 (transducción y diseño del paso diferentes) y colocadas en placas a razón de 3 x 106 por matraz fue 20,0 y 14,0 x 106, y el rendimiento de cMSC no transducida por matraz fue 25,3 y 18,0 x 106.

Ensayos de CFU en cMSC procedente de cultivos P0

Se prepararon análisis de colonias CFU en el tiempo de la creación del cultivo primario, colocando en placas 0,5 x 106 células por triplicado en placas de 100 mm que contenían 10 ml de medio completo. Las placas se incubaron a 37ºC y CO2 al 5%. El medio se reemplazó con medio reciente cada 2 a 4 días. El día 10 de cultivo, las placas del análisis CFU se enjuagaron con HBSS dos veces, se fijaron con gluteraldehído al 1% durante 15 minutos, se enjuagaron con HBSS dos veces, y se secaron con aire. Las cMSC en las placas se tiñeron a continuación con violeta cristal al 0,1%, se enjuagaron con agua desionizada tres veces y se secaron con aire. Se hizo el recuento de colonias para calcular el número de colonias que se forman por x 106 células en la placa.

Los ensayos CFU colocados en placa el día del aislamiento de células mononucleadas y de la creación del cultivo y recogidos el día 10 proporcionaron 56, 46,7, 114 y 72 colonias x 106 células para los perros CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03 y CAN-07-04, respectivamente.

El día 13 del cultivo P1, se tomaron fotografías para registrar la distribución celular y la morfología y las células P1 se recogieron por tripsinización y se conservaron en frío tal como se describe a continuación.

Se decantó el medio en los matraces triples, y se enjuagaron los matraces con 50 ml de DPBS. Después de decantar la DPBS, se añadieron 23 ml de tripsina al 0,25% a cada matraz triple. Se colocaron los matraces en una incubadora a 37ºC durante 3 minutos. Después del desprendimiento celular, se añadieron a cada matraz 23 ml de medio completo. Las suspensiones celulares se transfirieron a tubos cónicos de 50 ml, y los matraces se lavaron con 30 ml de HBSS. Se centrifugaron los tubos a 2200 rpm durante 5 minutos a t.a. Se mezclaron los sedimentos que contenían las células transducidas o no transducidas, respectivamente, y se hizo el recuento. Se colocó al lado una alícuota de 1 x 107 células para la determinación del porcentaje de transducción por un ensayo Elisa de RCP de ADN anti-EGFP.

Después de la recogida, las P1 o P2 recuperadas se transdujeron y se centrifugaron las cMSC expandidas en el cultivo a 1300 rpm durante 5 minutos, y se volvieron a poner en suspensión en alícuotas de 1 ml con 1 x 107 cMSC/ml en solución crioprotectora enfriada en hielo que contenía 85% de plasma-Lyte A (Baxter IV Therapy), 10% de DMSO y 5% de suero autólogo canino. Las alícuotas celulares se distribuyeron en crioviales independientes que contenían 1 ml cada uno. Se marcaron los tubos con el número de donante canino y se hizo el recuento de células viables totales. Los cMSC se crioconservaron colocando los viales de las células en un recipiente para congelación Nalgene, y se colocaron en un congelador a -70ºC durante 4 horas, a continuación se llevaron a almacenaje a -70ºC.

En la recogida celular para la crioconservación del producto, se obtuvieron alícuotas de 1 x 107 para la determinación de la eficacia de la transducción. La eficacia de la transducción se analizó mediante un Elisa RCP para ADN anti-EGFP con incorporación de digoxigenina en el producto y una segunda etapa del análisis colorimétrico con antidigoxigenina.

Producto de infusión de cMSC

Una a dos horas antes de la infusión, se descongelaron los viales de cMSC agitando en un baño de agua a 37ºC, atomizado con etanol al 70%, y abierto en una cabina de bioseguridad. El producto cMSC se puso en suspensión en 50 ml de medio de infusión que contenía DMEM-LG más 30% de suero autólogo para el donante de células. La viabilidad del producto cMSC, se determinó por exclusión del azul de tripano para determinar la dosis viable real. Una alícuota de cada producto cMSC se propuso para cultivo de cepa de levadura, aeróbico y no aeróbico. Se evaluó la capacidad de las cMSC para acoplarse al plástico del cultivo tisular y para proliferar en el cultivo P2 (P3 para CAN07-01 y CAN-07-02). Se colocaron en placas alícuotas de 1 x 106 y 0,16 x 106 cMSC en medio de cultivo canino completo por triplicado en matraces de cultivo de plástico T-25. Después de 24 horas, los matraces colocados en placa con 1 x 106 cMSC y el día 3, los matraces colocados en placa con 0,16 x 106 cMSC se recogieron por tripsinización y se hizo el recuento.

Después de TBI, la suspensión de cMSC se infundió mediante un catéter insertado en la vena cefálica utilizando un mini infusor Harvard Bard manual para administrar los 50 ml durante un período de 15 a 20 minutos.

Dosis moderadamente altas de 7,49, 7,35, 10,0 y 10,0 (media de 8,7) x 106 cMSC viables/kg se infundieron el día 0 a los perros CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03 y CAN07-04, respectivamente. Estas dosis representan un aumento de 4 a 10 veces sobre la dosis típica que recibiría un paciente. Las cMSC viables totales se infundieron por orden desde 67,7 hasta 129 (media de 93,9) x 106 cMSC. La viabilidad de las células ordenadas desde 92,1 hasta 97,6 (media de 94,9) determinada por exclusión de azul de tripano. Se administraron infusiones de CMSC entre 71 y 146 (media de 110) minutos después de TBI.

Toma de muestras de sangre tras la infusión

Se extrajeron muestras de sangre (2 ml) antes (pre) y durante la infusión de cMSC y 5 y 15 minutos después del comienzo de la infusión así como en los tiempos puntuales de 1 y 2 horas, y 1, 2, 3 y 4 días. Se prepararon lisados celulares utilizando el kit de aislamiento de ADN PuregeneTM (Gentra Systems, Inc.) para su utilización en un Elisa RCP de ADN anti-EGFP con digoxigenina incorporada en el producto y una segunda etapa del análisis colorimétrico con anti-digoxigenina, para detectar el nivel de cMSC marcado con GFP en el torrente sanguíneo.

Recogida de médula de hueso e infusión para trasplante

La médula ósea que debe utilizarse como injerto del trasplante se recogió de la camada idéntica a DLA antes de TBI. SE extrajeron materiales aspirados de cada húmero utilizando una aguja de acero inoxidable ball-top de 4 a 6 pulgadas, calibre 11, de recogida de medula, acoplada a un entubado de polivinilo que tiene su origen en un matraz de vacío que contenía 100 ml de medio de cultivo tisular 199 y 4 ml (4000 U) de heparina. La médula se pasa a través un poro de 300 y 200 µm de tamaño y se guarda a 4ºC en un recipiente del paquete de transferencia marcado con el donante y el recipiente, hasta la infusión después de este día. El recuento de células nucleadas totales de médula ósea (BM-TNC) de la médula se corrige para excluir cualquier célula nucleada que pudiera estar presente en el volumen de sangre periférica obtenida durante la recogida de la médula.

El recuento de células nucleadas totales (TNC) de la médula ósea se corrigió para excluir cualquier TNC que podría estar presente en el volumen de sangre periférica obtenida durante la recogida de la médula. Las dosis corregidas de médula fueron 4,3, 3,5 3,1 y 2,0 (media de 3,2) x 108 TNC/kg a los perros CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03 y CAN-07-04, respectivamente. Las dosis de médula ósea no corregidas fueron 5,6, 4,2, 4,5 y 2,7 (4,3 de media) x 108 TNC/kg.

Veinte minutos antes de la infusión, se colocó la médula a temperatura ambiente. Una hora después la infusión de cMSC, la médula se infundió por vía intravenosa a través de una aguja de mariposa insertada en la vena cefálica, ejerciendo presión sobre la bolsa durante 1 a 2 minutos.

Atención complementaria

El día 5, se administraron tres veces al día antibióticos orales (sulfato de neomicina y sulfato de polimixina). Estos antibióticos orales se administraron hasta que los recuentos neutrófilos absolutos alcanzaron 500 ml/mm3. El día 0, el antibiótico general Baytril se administró por vía intravenosa dos veces al día y se continuó hasta que los recuentos neutrófilos absolutos alcanzaron 1.000/mm3 continuamente. El fluido y los electrolitos perdidos como resultado de la toxicidad de la radiación temporal, fueron remplazados por administración subcutánea de 500 ml de solución Ringer, dos veces al día hasta que el alimento y el agua fueron aceptados.

Fórmula leucocítica

Se recogieron muestras de sangre (2 ml) de la vena yugular o de la cefálica en las mañanas de aspiración de la médula para aislamiento de cMSC, los días 0 a 50 y después quincenalmente hasta el final del estudio. Se transfirió la sangre a un recipiente en vacío que contenía EDTA. Se determinaron los glóbulos blancos totales (WBC) y las plaquetas en recuentos por mm 3 utilizando un Sysmex E2500 y se determinó la fórmula leucocítica manualmente después de la fijación y tinción con colorante de Wright.

Necropsia

Se obtuvieron muestras de sangre para CBC, análisis químico 23 y evaluación por RCP. Los perros se sedaron con Butorfanol seguido de una mezcla de Diazepam e hidrocloruro de ketamina. Tras la sedación, se obtuvieron biopsias y materiales aspirados de médula ósea bilaterales procedentes de los húmeros, fémur y crestas ilíacas. Se completó a continuación la eutanasia con una sobredosis del sedante pentobarbital sódico. Al grupo de perros del día 50 (CAN-07-01 y CAN-07-02) se les practicó la eutanasia el día 43 del estudio; al grupo de perros del día 100 (CAN-07-03 y CAN-07-04) se les practicó la eutanasia el día 100 del estudio. Se recogieron conjuntos completos de los tejidos en la necropsia de los animales.

La recogida de tejidos para el examen histológico siguió a continuación. Un subconjunto de tejidos se utilizó para análisis Elisa RCP de ADN anti-EGFP. Se utilizaron materiales aspirados de médula ósea y biopsia para análisis Elisa RCP de ADN anti-EGFP, expansión en el cultivo para análisis RCP posterior y análisis CFU.

Los tejidos se recortaron en piezas de aproximadamente 1 pulgada cuadrada, y se colocaron en tubos cónicos de 50 ml marcados por separado, rellenos con 10% de formalina tamponada neutra (pH 6,8-7,2) los tejidos se empaparon en parafina, se seccionaron y se tiñeron hematoxilina y eosina. Se tiñeron muestras de médula ósea con colorante de Schiff con ácido peryódico.

Los materiales aspirados de médula ósea obtenidos antes de la necropsia se recogieron en tubos de 15 ml marcados de los húmeros izquierdo y derecho, fémures y crestas ilíacas de cada perro. Se obtuvo un subconjunto de las muestras tisulares durante la necropsia y se recortó en aproximadamente piezas de ¼ de pulgada cuadrada, se envolvió en gasa empapada en PBS y colocada por separado en una bolsa de cierre cremallera marcada. Los materiales aspirados de médula ósea se mantuvieron en hielo.

Preparación de materiales aspirados de médula ósea para análisis CFU

Alicuotas de los materiales aspirados de médula ósea de los húmeros izquierdo y derecho, de fémur y de cresta ilíaca de cada perro obtenidos por análisis RCP se dividieron en tubos de 15 ml marcados por separado. Las muestras de médula ósea se mantuvieron en hielo.

Ensayo CFU en cMSC de médula ósea obtenidos en necropsia

Los ensayos de colonias CFU realizados en cMSC obtenidos de médula ósea obtenida en necropsia se prepararon colocando en placas 0,5 x 106 células por triplicado en placas de 100 mm que contienen 10 ml de medio completo. Las placas se incubaron a 37ºC y CO2 al 5%. El medio se reemplazó con medio reciente cada 2 a 4 días. El día 10 de cultivo, las placas de análisis CFU se enjuagaron con HBSS dos veces, se fijaron con glutaraldehído al 1% durante 15 minutos, se enjuagaron con HBSS dos veces y se secaron con aire. Las cMSC en las placas se tiñeron a continuación con violeta cristal al 0,1%, se enjuagaron con agua desionizada tres veces y se secaron con aire. Se hizo el recuento de colonias para calcular el número de colonias por 106 células en placa.

Aislamiento y purificación de ADN

Se aisló ADN de una parte de cada tejido. La pieza restante de la muestra se conservó en frío y se almacenó en un congelador a -70ºC. Se aisló el ADN colocando las muestras en solución salina tamponada con fosfato (PBS), añadiendo solución de proteinasa K e incubando a 55ºC durante 3 h, o hasta que se haya disuelto el tejido. Las muestras se trataron posteriormente con RNasa a 37ºC durante 60 min. Se enfriaron las muestras a temperatura ambiente y se precipitó la proteína. Se centrifugaron las muestras y la fase acuosa se recogió suavemente en isopropanol al 100%. Se mezclaron las muestras y se centrifugaron y se lavó el sedimento en etanol al 70%. Se centrifugaron los tubos y se drenó el sobrenadante y los sedimentos se dejaron secar durante aproximadamente 1 a 6 h. Se dejó hidratar el ADN durante la noche a temperatura ambiente y se guardó posteriormente a 4ºC.

Muestras de sangre periférica y de médula ósea se lisaron en primer lugar con solución de lisis RBC (tampón de cloruro amónico). El ADN se aisló a continuación de los lisados tal como se describió anteriormente. Se cuantificó el ADN por adición de 998 µl de H2O desionizada y 2 µl de ADN procedente de la muestra en una cubeta y se agitó. Se utilizó el espectrofotómetro para determinar la densidad óptica (D.O.). La D.O. se leyó a 260 y 280, y se calculó la concentración de ADN por µg/ml. La concentración de ADN se ajustó a 1 µg/ml utilizando agua desionizada.

Elisa RCP de ADN anti-EGFP

El análisis Elisa RCP de ADN anti-EGFP utilizado en estos estudios detecta las cMSC infundidas utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos para GFP. Para análisis de la expresión génica los inventores utilizaron el kit para PCR-Elisa (marcado/detección de DIG) (Boehringer Mannheim). En resumen, se realizó la RCP en presencia de nucleótidos marcados con digoxigenina para marcar el producto ampliado. A continuación, se desnaturalizaron 25 µl del producto de la RCP y se dejaron hibridar en solución para la sonda de oligonucleótido biotinilada en 5’ a 37ºC en la placa del microvalorador revestida con estreptavidina. Se detectó el producto de PCR unido con sonda mediante un conjugado de anti-digoxigenina peroxidasa y mediante la utilización del sustrato colorimétrico 2, 2’-azinobis (ácido3-etilbenzotiazolina-sulfónico) (ABTS). Se generaron curvas patrón de valoración utilizando la referencia cMSC transfectada a la concentración aproximada de ADN por la cantidad de ADN utilizada en el ensayo. Correlacionando en primer lugar un patrón interno para RCP del ADN genómico, DLA de clase II y luego correlacionando la concentración de ADN con los equivalentes celulares, y suponiendo un caso de integración de retrovirus por célula transducida, puede obtenerse una estimación del número de células.

Mediciones cuantitativas de ADN para GFP se observaron en todas las cucharas/biopsias de médula ósea

Recuperación de glóbulos después del trasplante

El día medio para un umbral (para 3 valores consecutivos) de plaquetas para 10.000/mm3 fue de 12,8 (intervalo 11-17), para 50.000/mm3 fue de 19,8 (intervalo 16-25), y para 100.000/mm3 fue de 23,0 (intervalo 20-27). El día medio para un valor umbral (para 3 días consecutivos) de células neutrófilas absolutas para 500/mm3 fue de 9,3 (intervalo 811) y para 1.000/mm3 fue de 10,5 (intervalo 9-13).

Materiales aspirados de médula ósea provisionales

Cuando se recuperaban plaquetas continuamente a valores superiores a 50.000 por mm 3 se recogió un material aspirado provisional de médula ósea de la cresta ilíaca. Este procedimiento se desarrolló el día 27 del estudio para CAN-07-01 y CAN-07-02 y el día 29 para CAN-07-03 y CAN-07-04.

RESULTADOS

En la evaluación histopatológica procedentes de CAN-07-01 y CAN-07-02, se practicó la eutanasia el día 43, los descubrimientos fueron negativos para el tejido conectivo ectópico y para GVHD subagudo.

La señal de ADN detectable podría encontrarse dentro de 1 hora de infusión y de nuevo a los 2 días. Una muestra podría medirse cuantitativamente a los 3 días después de la infusión para el ADN de GFP. Este tiempo puntual es coherente con las observaciones anteriores en el estudio de trasplante canino autólogo en el que la señal se observó a los 2 y 3 días.

Los datos de la necropsia del día 100 en CAN-07-03 y CAN-07-04 para las células GFP+ presentaban señal de GFP (1 GFP + equivalente celular por 10 microgramos de ADN de entrada a RCP) en el fémur y húmero de CAN-07-03 y CAN-07-04.

En este modelo fue posible detectar la enfermedad de injerto de piel frente al huésped (GVHD) observando el enrojecimiento de los ojos y orejas de los animales. Utilizando este indicador se determinó que los animales que recibieron células madre mesenquimáticas presentaban una frecuencia menor y/o gravedad menor de GVHD en comparación con los animales de referencia que no se trataron con células madre mesenquimáticas.

Estos resultados demuestran que los MSC alógenos pueden soportar el injerto de células hematopoyéticas de médula ósea. No fue necesario ningún soporte de transducción. No existen pruebas clínicas de GVHD. La recuperación de plaquetas fue más rápida que en los controles históricos. No había evidencia de hibridación en las células de estroma tras el trasplante alógeno. La opción de trasplantar tejido alógeno utilizando las MSC alógenas amplía la gama de material de trasplante utilizable en los escenarios de trasplante clínico.

EJEMPLO 9

Supresión de la reacción entre linfocitos mezclados por el sobrenadante de MSC (RLM95)

Generación de sobrenadantes: Se purificaron linfocitos T del donante 155 de las PBMC por selección inmunomagnética negativa con MicroBeads anti-CD19 y anti-CD14 (Miltenyi Biotec). Las PBMC del donante 413 se irradiaron con rayos X con 3600 rad (12 min. a 70 kV). En placas de cultivo tisular de 24 pocillos se mezclaron linfocitos T (9 x 105/pocillo) con las PBMC irradiadas durante 3 días, a continuación con las MSC de diferentes donantes (219, 459, 461, todos en el Paso 5) se añadieron a los cultivos a razón de 1,2 x 105 células/pocillo durante 3 días más. En los cultivos de referencia, se añadió el mismo volumen de medio en lugar de las MSC. En pocillos separados, el mismo número de MSC se colocaron en placas solas y se cultivaron durante 3 días más. Después de 3 días de cultivo (el día 6 tras el inicio de la RLM primaria), se volvieron a poner en suspensión las células pipeteando, y se transfirieron 200 µl de las suspensiones celulares a una placa de 96 pocillos por triplicado, y se pulsaron con [H3]TdR (5 Ci/mmol, 1 µCi/pocillo) durante 18 horas para determinar el nivel de proliferación. Las células restantes se centrifugaron a 1250 rpm durante 10 minutos, se recogieron los sobrenadantes se dividieron en alícuotas y se mantuvieron congelados a -80ºC.

Supresión de la RLM primaria por sobrenadantes: Se purificaron linfocitos T del donante 155 de las PBMC por selección inmunomagnética negativa con MicroBeads antiCD19 y anti-CD14 (Miltenyi Biotec). Las PBMC del donante 413 o del donante 273 se irradiaron con rayos X con 3600 rad (12 min. a 70 kV). En placas de cultivo tisular de 96 pocillos se mezclaron linfocitos T (1,5 x 105/pocillos) con las PBMC (1,5 x 105/pocillos) en presencia o ausencia de diferentes sobrenadantes que se añadieron al inicio de los cultivos a las diluciones (1/8, 1/32, 1/28, 1/512, 1/2048 y 1/8192). En los cultivos de referencia se añadió el mismo volumen de medio en lugar de los sobrenadantes. Se incubaron los cultivos durante 6 días, a continuación se pulsaron con [H3]TdR (5 Ci/mmol, 1 µCi/pocillo) durante 18 horas.

La figura 9 muestra los resultados de la RLM entre T 155 x PBMC 413. Se suprimieron las RLM primarias en presencia de sobrenadantes de MSC + RLM, (nº 1) RLM

+ MSC219 (nº 2) RLM + MSC459 (nº 3) RLM + MSC461, y MSC solas (nº 8) MSC219 sola (nº 9) MSC459 sola (nº 10) MSC461 sola. La RLM primaria en presencia de sobrenadante

o la RLM sola (n 5) no se suprimió.

Supresión de una RLM continua: Se purificaron linfocitos T del donante 155 de las PBMC por selección inmunomagnética negativa con MicroBeads anti-CD19 y anti-CD14 (Miltenyi Biotec). Las PBMC del donante 413 (1,5 x 105/pocillo) se irradiaron con rayos X con 3600 rad (12 min. a 70 kV). En placas de cultivo tisular de 96 pocillos se mezclaron linfocitos T (1,5 x 105/pocillo) con las PBMC (1,5 x 105/pocillo) durante 4 días, a continuación se añadieron sobrenadantes en los cultivos a diferentes diluciones (1/8, 1/32, 1/28, 1/512, 1/2048 y 1/8192). En los cultivos de referencia, se añadió el mismo volumen de medio en lugar de los sobrenadantes. Se incubaron los cultivos durante 2 días más (6 días después del comienzo de la RLM), a continuación se pulsaron con [H3]TdR (5 Ci/mmol, 1 µCi/pocillo) durante 18 horas.

La figura 10 muestra los resultados de la RLM entre T 155 x PBMC 413. Los sobrenadantes de todas las MSC + RLM, (nº 1) RLM + MSC219 (nº 2) RLM + MSC459 (nº 3) RLM + MSC461 mostraban supresión acusada de las RLM continua. Los sobrenadantes de las MSC solas (nº 8) MSC219 sola (nº 9) MSC459 sola (nº 10) MSC461 sola suprimidas en función de la dosis con un efecto significativo hasta la dilución 1/512. No se suprimió la RLM continua en presencia de sobrenadante de RLM sola (nº 5).

EJEMPLO 10 (Ejemplo comparativo)

Supresión de la reacción entre linfocitos mezclados por las células madre mesenquimáticas xenógenas

Supresión de las RLM humanas por las MSC de papión. Las PBMC que responden al tratamiento de varios donantes humanos (R4, R6, R7, R11) se mezclaron con las PBMC humanas alógenas irradiadas (3000R) (S4, S6, S7, S11) en pocillos de microvalorador son 1,5 x 105 células/pocillo para cada población. Se realizaron los cultivos en medio de cultivo celular patrón que contenía suero AB humano al 5%. Las MSC de papión (bMSC) del donante 86243 se añadieron a razón de 2 x 104/pocillo al inicio de la RLM. Las MSC no se trataron con IFN-γ. Se determinó la linfoproliferación el día 7 de cultivo pulsando las

5 células con 3H-timidina durante las 18 horas finales antes de la recogida de las células para recuento por centelleo. Los resultados ilustrados en la figura 11 demuestran que las MSC de papión suprimieron las RLM robustas humanas en más del 50%.

Supresión de la RLM xenógena por las MSC humanas o de papión. Linfocitos T

10 humanos (hT) que responden al tratamiento del donante 273 se cultivaron con PBMC de papión (bPBMC) irradiadas (3000 R) del donante 5957 o del donante 5909 en medio de cultivo celular patrón que contenía suero AB humano al 5%. Las MSC humanas (hMSC) del donante 244 o las MSC de papión (bMSC) del donante 6243 se añadieron a los cultivos al inicio. Se determinó la linfoproliferación el día 7 de cultivo pulsando las células

15 con 3H-timidina durante las 18 horas finales antes de la recogida de las células para recuento por centelleo. Los resultados ilustrados en la figura 12 (bPBMC DONANTE 5957) Y figura 13 (bPBMC 5909) demuestran que tanto las MSC humanas como de papión pueden suprimir las RLM humana x papión xenógena.

Claims

Reivindicaciones

1.

Utilización de un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas para la preparación de un medicamento destinado a reducir una respuesta inmunitaria de las células efectoras contra un aloantígeno.
2.

Utilización según la reivindicación 1, en la que las células efectoras son linfocitos T.
3.

Procedimiento in vitro, para evitar o reducir la reactivación de linfocitos T activados que han sido activados previamente por un aloantígeno que comprende poner en contacto los linfocitos T activados con un sobrenadante de un cultivo de células madre mesenquimáticas.
4.

Utilización de un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas para la preparación de un medicamento destinado a reducir en un receptor una respuesta inmunitaria a un trasplante del donante.
5.

Utilización según la reivindicación 4, en la que las células madre mesenquimáticas son autólogas para el receptor.
6.

Utilización según la reivindicación 4, en la que las células madre mesenquimáticas son alógenas para el receptor.
7.

Utilización según la reivindicación 6, en la que las células madre mesenquimáticas se extraen del donante del trasplante.
8.

Utilización según la reivindicación 4, en la que las células madre mesenquimáticas son alógenas tanto para el donante del trasplante como para el receptor.
9.

Utilización según la reivindicación 4, en la que las células madre mesenquimáticas son xenógenas tanto para el donante del trasplante como para el receptor.
10.

Utilización según la reivindicación 4, en la que en la que el trasplante es de piel.
11.

Utilización según la reivindicación 4, en la que el medicamento está destinado a prevenir el rechazo del trasplante por el receptor.
12.

Utilización según la reivindicación 4, en la que el medicamento es una parte del trasplante.
13.

Utilización según la reivindicación 4, en la que el medicamento está destinado a reducir la gravedad del rechazo del trasplante por el receptor.
14.

Utilización según la reivindicación 4, en la que el medicamento está destinado a tratar el rechazo del trasplante por el receptor.
15.

Utilización según la reivindicación 4, en la que el medicamento está destinado a ser administrado junto con un agente inmunosupresor.
16.

Utilización según la reivindicación 4, en la que el trasplante es un órgano sólido.
17.

Utilización según la reivindicación 16, en la que el órgano sólido se selecciona de entre corazón, páncreas, riñón, pulmón o hígado.
18.

Utilización de un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas para la preparación de un medicamento destinado a reducir en un receptor del trasplante una respuesta inmunitaria contra el receptor por el trasplante.
19.

Utilización según la reivindicación 18, en la que las células madre mesenquimáticas son autólogas para el receptor.
20.

Utilización según la reivindicación 18, en la que las células madre mesenquimáticas son autólogas para el donante del trasplante.
21.

Utilización según la reivindicación 18, en la que las células madre mesenquimáticas son alógenas tanto para el donante como para el receptor.
22.

Utilización según la reivindicación 18, en la que el medicamento está destinado a ser administrado junto con un agente inmunosupresor.
23.

Composición farmacéutica para reducir una respuesta inmunitaria desfavorable contra un trasplante del donante, que comprende un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas en una cantidad eficaz para inhibir o reducir una respuesta inmunitaria desfavorable contra un trasplante del donante, y un vehículo farmacéutico.
24.

Composición farmacéutica para reducir una respuesta inmunitaria desfavorable contra un receptor de trasplante producida por un trasplante, que comprende un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas y un vehículo farmacéutico.
25.

Utilización según la reivindicación 1, en la que el sobrenadante se obtiene de células madre mesenquimáticas cultivadas junto con linfocitos T que experimentan una reacción entre linfocitos mezclados.
26.

Utilización de un sobrenadante procedente de un cultivo de células madre mesenquimáticas para la preparación de una composición destinada a reducir una respuesta inmunitaria de células efectoras contra un aloantígeno mediante la cual dichas células efectoras en contacto con un aloantígeno tienen una respuesta inmunitaria reducida contra dicho aloantígeno.
27.

Utilización según la reivindicación 26, en la que dichas células efectoras son linfocitos T previamente activados y dicha respuesta inmunitaria es la reactivación de dichos linfocitos T.
28.

Utilización según la reivindicación 26, en la que dicha respuesta inmunitaria que debe reducirse es una respuesta inmunitaria in vitro.
29.

Utilización según la reivindicación 26, en la que dicha respuesta inmunitaria que debe reducirse es una respuesta inmunitaria in vivo.
30.

Utilización según la reivindicación 26, en la que dicha respuesta inmunitaria que debe reducirse es una respuesta inmunitaria a un traplante del donante.
31.

Utilización según la reivindicación 30, en la que dicho trasplante del donante es un trasplante de donante xenógeno.